KR102150481B1 - 시알화 당단백질 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시알화된 당단백질 조성물 및, 다양한 병태 및 장애를 치료하는데 있어서 이들의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

시알화 당단백질 조성물 및 이의 용도{SIALYLATED GLYCOPROTEIN COMPOSITIONS AND USES THEREOF}

관련 출원의 교차-참조

본 출원은 2014년 3월 5일자로 출원된 미국 가특허원 일련번호 제61/948,421호, 및 2015년 2월 10일자로 출원된 미국 가특허원 일련번호 제62/114,313호에 대한 우선권을 청구하며, 이들 각각은, 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고로 본원에 포함되어 있다.

발명의 분야

본 발명은 시알화 당단백질 조성물 및 다양한 병태 및 장애를 치료하는데 있어서 이들의 사용 방법에 관한 것이다.

전자로 제출된 문서 파일의 설명

본원과 함께 전자로 제출된 문서 파일의 내용은, 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 포맷 복사본(파일명: ULPI_020_02WO_SeqList_ST25.txt, 기록된 날짜: 2015년 3월 2일, 파일 크기: 9 킬로바이트(kilobytes)).

상업적으로 이용가능한 치료학적 단백질의 수는 최근 수년 동안 급격하게 증가되어 왔으며 이들 단백질의 대부분은 당단백질이다. 당단백질내 시알산의 존재는 각각의 당단백질의 혈청으로부터의 흡수, 혈청 반감기, 및 청소, 및 물리적, 화학적 및 면역원성 특성에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있다. 특정의 상황에서, 이는 따라서 약리학적 적용에서 사용하기 위해 의도된 당단백질의 시알산 함량을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 부분적으로는, 혈청/단백질 유리된 배지의 사용을 통해 포유동물 세포로부터 생산된 재조합 당단백질이, 예를 들면, 재조합 당단백질의 M6P 함량을 감소시키기 않고, 재조합 당단백질의 시알화를 증진시킨다는 발견에 기초한다.

본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 0.05 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 0.1 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 0.5 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 0.7 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 1 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 1.5 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 2 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 5 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 10 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 시알산 함량이 20 mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 재조합 당단백질의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 갈락토즈 잔기가 시알화되어 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 재조합 당단백질은 인간 β-글루쿠로니다제이고 적어도 0.7mol/mol의 재조합 당단백질의 시알화 함량을 갖는다.

일부 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 재조합 당단백질은 인간 β-글루쿠로니다제이고 시알화 함량이 적어도 0.7mol/mol의 재조합 당단백질이며 고 수준의 만노즈-6-포스페이트(M6P) 모이어티를 갖는다.

일 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 재조합 당단백질은 인간 β-글루쿠로니다제이고 시알화 함량이 적어도 0.7mol/mol의 재조합 당단백질이고 재조합 당단백질의 총 글리칸 당 적어도 10몰%의 총 글리칸의 고 수준인 만노즈-6-포스페이트(M6P) 모이어티를 갖는다.

다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 재조합 당단백질은 인간 β-글루쿠로니다제이고 시알화 함량이 적어도 0.7 mol/mol의 재조합 당단백질이며 고 수준의 만노즈-6-포스페이트(M6P) 모이어티를 가지고, 예를 들면, K 흡수는 이의 60%, 70%, 80%, 90% 또는 최대, 예를 들면, 인간 섬유아세포(MPS7)에서 시험하는 경우 약 1nM 내지 약 3nM이다.

여전히 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 재조합 당단백질은 인간 β-글루쿠로니다제이고 시알화 함량이 적어도 0.7mol/mol의 재조합 당단백질이며 고 수준의 만노즈-6-포스페이트(M6P) 모이어티를 가지고, 예를 들면, 인간 섬유아세포에서 절반-최대 흡수, 예를 들어 당단백질(예를 들면, 인간 β-글루쿠로니다제)이 최대 흡수의 50%에 도달하는 농도는 약 1nM, 2nM, 3nM, 4nM, 또는 5nM 이하이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질 집단의 제제를 제공하며, 여기서 상기 집단의 적어도 50 퍼센트는 시알화되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질 집단의 제제를 포함하며, 여기서 상기 집단의 적어도 60 퍼센트는 시알화되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질 집단의 제제를 제공하며, 여기서 상기 집단의 적어도 70 퍼센트는 시알화되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질 집단의 제제를 제공하며, 여기서 상기 집단의 적어도 80 퍼센트는 시알화되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질 집단의 제제를 제공하며, 여기서 상기 집단의 적어도 90 퍼센트는 시알화되어 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물/제제를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 당단백질을 혈청이 들어있는 세포 배양물 또는 단백질 유리된 배지 속에서 발현시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질-유리된, 화학적으로 정의된 배지는 세포를 성장시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 배지는 갈락토즈, 프럭토즈, n-아세틸-만노스아민, 만노즈 및 이의 조합물로부터 선택된 당의 유효량을 포함하지 않는다. 예를 들면, 당의 유효량은 0.01mM, 0.05mM, 또는 0.1mM 초과이다.

일부 구현예에서, 세포 배양물은 포유동물 세포를 포함한다. 예시적인 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, 골수종(예를 들면, NSO, NSI), 또는 WI38 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

일부 다른 구현예에서, 세포 배양물은 식물 세포를 포함한다. 예시적인 식물 세포는 당근 세포 또는 임의의 다른 식물 세포계 세포 배양물, 예를 들면, 재조합 단백질 생산용으로 개발된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또한 본원에 기술된 바와 같은 조성물/제제의 치료학적 유효량을 리소좀 축적 장애(LSD)의 치료가 요구되는 개체에게 투여함을 포함하여, 리소좀 축적 장애(LSD)를 치료하는 방법이 제공된다. 예시적인 구현예에서, 상기 조성물/제제는 재조합 인간 β-글루쿠로니다제를 포함한다. 추가의 예시적인 구현예에서, LSD는 뮤코다당류 제7형(즉, MPS 7, MPS VII, 또는 슬라이(Sly) 증후군)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는, 시알산 함량이 증가되어 있고, LSD, 예를 들면, MPS 7을 치료하는데 특히 유용하다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조성물/제제의 투약방식을 투여함을 포함하여, 대상체에서 리소좀 축적 장애(LSD)를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 투여는 LSD의 치료를 위한 통계적으로 유의적인 치료학적 효과를 제공한다. 예시적인 구현예에서, 조성물/제제는 재조합 인간 β-글루쿠로니다제를 포함한다. 추가의 예시적인 구현예에서, LSD는 MPS 7이다.

정의

본원에 사용된 것으로서, 용어 "유효한"(예를 들면, "유효량")은 바람직하거나, 예측되거나, 의도된 결과를 달성하기에 적절함을 의미한다. 유효량은 치료학적 유효량일 수 있다. "치료학적 유효량"은 대상체에게 투여되는 경우 특수한 질환 또는 병태의 이러한 치료를 달성하기에 충분한 활성 성분의 양을 말한다. "치료학적 유효량"은 치료되는 대상체의 예를 들면, 질환 또는 병태, 질환 또는 병태의 중증도, 및 연령, 체중 등에 따라 변할 것이다.

일반적으로, 임의의 병태, 질환 또는 장애를 "치료하는" 또는 "치료"는, 일부 구현예에서, 병태, 질환 또는 장애를 완화시키는 것(즉, 질환 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나의 진행을 정지시키거나 감소시키는 것)을 말한다. 일부 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 적어도 하나의 육체적 매개변수를 완화시킴을 말하며, 이는 대상체에 의해 인식될 수 없다. 일부 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 병태, 질환 또는 장애를 육체적으로(예를 들면, 인식할 수 있는 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들면, 육체적 매개변수의 안정화) 또는 둘 다로 억제하는 것을 말한다. 일부 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 병태, 질환, 또는 장애의 발병을 지연시키는 것을 말한다.

오래된 특허법 조약이후, 용어 단수("a", "an", 및 "the")는 청구범위를 포함하는, 본 출원에 사용되는 경우 "하나 이상"을 말한다. 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대안만이 또는 대안들이 상호 배타적임을 언급하기 위해 명쾌하게 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용된다. 용어 "또는"을 사용하는 항목의 임의의 목록도, 이들 나열된 항목중의 어느 것이 또한 관련 구현예로부터 구체적으로 배제될 수 있음을 의미하는 것으로 구체적으로 고려된다.

본 출원 전체를 통해, 용어 "약"은, 값이 당해 값을 측정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준편차를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.

본원에 사용된 것으로서, 당단백질은 특히, 하나 이상의 당 잔기를 포함하는, 하나 이상의 탄수화물의 첨가에 의해 개질된 단백질이다.

본원에 사용된 것으로서, "GUS"는 본 발명에 따른 예시적인 당단백질인, β-글루쿠로니다제를 말한다.

본원에 사용된 것으로서, 시알화는 당단백질일 수 있는, 단백질에 시알산 잔기를 부가하는 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 시알산은 카복실 그룹을 포함하는, 9개 이상의 탄소 원자를 함유하는 당의 계열을 포함한다. 시알산의 모든 공지된 천연 형태를 포함하는 일반 구조는 하기 나타낸다.

단일 분자 상의 다양한 위치에서 R1 그룹은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. R1은 수소 또는 아세틸, 락틸, 메틸, 설페이트, 포스페이트, 안하이드로, 시알산, 푸코즈, 글루코즈, 또는 갈락토즈 그룹일 수 있다. R2는 N-아세틸, N-글리콜릴, 아미노, 하이드록실, N-글리콜릴-O-아세틸, 또는 N-글리콜릴-O-메틸 그룹일 수 있다. R3은, 시알산이 당단백질과 관련하여 부착되어 있는 올리고당에서 앞서의 당 잔기를 나타낸다. R3는 갈락토즈(이의 3, 4, 또는 5 위치에서 연결됨), N-아세틸-갈락토즈(이의 6 위치에서 연결됨), N-아세틸-글루코즈(이의 4 또는 6 위치에서 연결됨), 시알산(이의 8 또는 9 위치에서 연결됨), 또는 5-N-글리콜릴-뉴라민산일 수 있다[참고: Essentials of Glycobiology, Ch. 15, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999)]. 시알산의 40개 이상의 형태가 천연에서 발견되어 왔다[참고: Essentials of Glycobiology, Ch. 15, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999)]. 시알산의 일반적인 형태는 N-아세틸뉴라민산(NANA)이며, 여기서 R1은 모든 위치에서 수소이고 R2는 N-아세틸 그룹이다.

도 1은 2-단계 주입을 통해 랫트(rat)에서 재조합 인간 β-글루쿠로니다제, GUS CR01 대 GUS Lot 43/44의 약동학을 비교하는 플롯이다. 데이타는, 보다 더 시알화된 CR01을 사용한 주입이 주입 동안 거의 신속하지 않은 청소 및 보다 높은 평균 농도를 생성하며, 이는 상기 효소에 대한 전체 노출을 증가시켜, 잠재적으로 치료하기 더 어려운 조직으로의 이의 침투를 잠재적으로 향상시킴을 나타낸다.
도 2는 t_1/2 값을 계산하는데 사용된 GUS CR01 대 GUS Lot 43/44의 주입후 청소 상만을 나타내는 플롯이다. 청소율에 있어서 이들 차이는 도 1에 나타낸 바와 같이 효소의 보다 높은 혈청 수준을 생성하기에 충분하다.
도 3은 GUS CR01 대 GUS Lot 43/44의 약동학적 연구에 대한 조직 GUS 수준을 나타내는 일련의 플롯이다. 인간 β-글루쿠로니다제의 조직 전달 및 흡수는, 시알화 인간 β-글루쿠로니다제(CR01)가 보다 낮은 시알화 효소(43-44)보다 모든 조직에서 더 높으므로, 향상된 것으로 입증된다. 내인성 글루쿠로니다제 활성을 감하는 경우, 치료학적 인간 β-글루쿠로니다제의 유효 전달은 2배 내지 거의 10배로 증가하며, 이는 예외적이고 놀랄만한 발견이다.
도 4는 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)로 처리된 3명의 대상체에서 36주에 걸친 뇨 글리코사미노글리칸(uGAG) 수준의 측정을 나타내는 플롯이다. uGAG 수준에 있어서 신속하고 지속적인 투여량-의존성 감소가 rhGUS로 처리한 대상체에서 관찰되었다.
도 5는 rhGUS로 처리한 3명의 대상체의 36주 평가 동안 각각의 투여 간격 말기에 뇨 글리코사미노글리칸(uGAG) 수준에 있어서 평균 감소를 나타낸다. 4mg/kg의 QOW 투여량은 uGAG 수준에 있어서 최대 감소를 생성하였다.
도 6은 rhGUS로 처리한 3명의 대상체에서 36주에 걸친 혈청 글루코사미노글리칸(GAG) 수준의 측정을 나타내는 플롯이다. 각각의 대상체는 36주의 치료 스케줄 말기에 혈청 GAG 수준에 있어서 적어도 25% 감소를 입증하였다.
도 7은 rhGUS로 처리한 대상체에서 간 크기의 측정을 나타내는 플롯이다. 36주 치료 프로토콜로부터 생성된 간비대에 있어서의 유의적인 감소가 관찰되었다.

본 발명은, 부분적으로는, 혈청/단백질 유리된 배지의 사용을 통해 포유동물 세포로부터 생산된 재조합 당단백질이 재조합 당단백질의 시알화, 및 추가적으로 재조합 당단백질의 만노즈-6-포스페이트 모이어티의 수준을 증진시킨다는 발견을 기초로 한다.

시알화 당단백질 조성물

본원에 기술된 조성물은 고 수준 또는 증가된 시알산 함량을 갖는 하나 이상의 당단백질을 포함한다.

시알산은 N-아세틸류라민산으로부터 유도된 50개 이상의 구성원을 지닌 9-탄소의 아미노당의 계열을 나타낸다. 시알산은 당단백질의 글리칸을 구성하는 수개의 단당류중 단지 하나의 성분이지만, 몇가지 이유로 임의의 치료학적 당단백질의 품질 및 안전성에 현저한 영향을 가진다: (I) 말단 갈락토즈 잔기는 당단백질의 혈청 반감기를 결정하는 주요 인자들 중 하나이다. 혈청 반감기는 간 아시알로-당단백질 수용체의 발현에 의해 조절된다. 이들 수용체는 비시알화 당단백질에 결합하며 결합된 아시알로-당단백질은 세포내섭취(endocytosis)에 의해 혈청으로부터 제거된다. 그 결과, 갈락토즈 잔기에서 말단 시알산의 발현은 혈청 당단백질을 분해로부터 방지한다; (II) 시알산은 항원 결정인자 또는 에피토프(epitope)를 차폐하는데 중요하다. 면역계의 수용체(T- 및 B-세포 수용체)는 흔히 비시알화 구조를 선호한다는 것이 알려져 있다. 따라서, 치료학적 당단백질에 대한 항체의 생성 가능성은 이의 시알화의 정도와 관련되어 있다; (III) 음성으로 하전된 시알산은 열 안전성, 단백분해성 분해에 대한 내성 및 이의 가용성과 같은 단백질-특이적인 매개변수에 영향을 미친다(참고: Bork et al., Increasing the Sialylation of Therapeutic Glycoproteins: The potential of the Sialic Biosynthetic Pathway, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 98, No. 10, October 2009).

일 국면에서, 본 발명은, 시알산 함량이 0.05mol/mol, 0.1mol/mol, 0.5mol/mol, 0.7mol/mol, 1mol/mol, 1.5mol/mol, 2mol/mol, 5mol/mol, 10mol/mol 또는 20mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 시알산 함량이 0.5mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은, 시알산 함량이 0.7mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정의 추가의 구현예에서, 본 발명은, 시알산 함량이 1mol/mol의 재조합 당단백질 초과인 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

특정의 구현예에서, 재조합 당단백질은 뮤코다당류의 비-환원 말단으로부터의 β-D-글루쿠론산 잔기의 가수분해를 촉진시키는데 관여하는 효소인, 인간 β-글루쿠로니다제의 재조합 형태이다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 0.1mol/mol, 0.5mol/mol, 0.7mol/mol, 1mol/mol, 1.5mol/mol, 2mol/mol, 또는 5mol/mol의 rhGUS 초과이다. 하나의 예시적인 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 0.7mol/mol의 rhGUS 초과이다. 다른 예시적인 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 1.0mol/mol의 rhGUS 초과이다. 여전히 다른 예시적인 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 약 1.2mol/mol의 rhGUS이다.

일부 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 약 0.5mol/mol 내지 약 2.0mol/mol의 rhGUS이다. 일 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 약 0.6 mol/mol 내지 약 1.5 mol/mol의 rhGUS이다. 다른 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제 (rhGUS)는, 시알산 함량이 약 0.7mol/mol 내지 약 1.4mol/mol의 rhGUS이다. 예시적인 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 약 0.8mol/mol 내지 약 1.3mol/mol의 rhGUS이다. 여전히 예시적인 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는, 시알산 함량이 약 1.0mol/mol 내지 약 1.2mol/mol의 rhGUS이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 시알화된 시알산 연결에 적합한 부위 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 갖는 재조합 당단백질을 포함한다. 일반적으로, 갈락토즈는 시알산 연결 또는 시알화에 적합한 부위이다. 특정의 구현예에서, 조성물은 재조합 당단백질을 포함하며, 여기서 재조합 당단백질의 갈락토즈 잔기 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 시알화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 재조합 당단백질을 포함하며, 여기서 재조합 당단백질의 갈락토즈 잔기의 적어도 50%는 시알화되어 있다. 추가의 구현예에서, 상기 조성물은 재조합 당단백질을 포함하며, 여기서 재조합 당단백질의 갈락토즈 잔기중 적어도 60%가 시알화된다. 특정의 추가의 구현예에서, 상기 조성물은 재조합 당단백질을 포함하며, 여기서 재조합 당단백질의 갈락토즈 잔기중 적어도 70%가 시알화된다.

특정의 구현예에서, 재조합 당단백질은 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)이다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)의 갈락토즈 잔기의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%는 시알화된다. 하나의 예시적인 구현예에서, rhGUS의 갈락토즈 잔기의 적어도 50%는 시알화된다. 다른 예시적인 구현예에서, rhGUS의 갈락토즈 잔기의 적어도 60%는 시알화된다. 여전히 다른 예시적인 구현예에서, rhGUS의 갈락토즈 잔기의 적어도 70%는 시알화된다. 여전히 다른 예시적인 구현예에서, rhGUS의 갈락토즈 잔기의 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 또는 약 75%는 시알화된다.

일부 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS) 중 적어도 약 40% 내지 적어도 약 90%의 갈락토즈 잔기가 시알화된다. 일 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS) 중 적어도 약 50% 내지 적어도 약 80%의 갈락토즈 잔기가 시알화된다. 다른 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS) 중 적어도 약 60% 내지 적어도 약 80%의 갈락토즈 잔기가 시알화된다. 예시적인 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS) 중 적어도 약 65% 내지 적어도 약 75%의 갈락토즈 잔기가 시알화된다.

다른 국면에서, 본 발명은 고 수준의 시알산 함량 및 또한 고 수준의 만노즈-6-포스페이트(M6P) 모이어티를 갖는 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 것으로서, M6P 모이어티는 어떠한 제한 없이 모노-포스포릴화되고 비스-포스포릴화된 만노즈-6-포스페이트를 포함하는 M6P 수용체에 결합하거나 이에 의해 인식될 수 있는 임의의 만노즈-6-포스페이트를 포함한다. 일 구현예에서, M6P 모이어티는 양이온-의존성 M6P 수용체(CI-MPR)에 결합하는 임의의 M6P를 포함한다. 다른 구현예에서, M6P 모이어티는 양이온-의존성 M6P 수용체(CD-MRP)에 결합하는 임의의 M6P를 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, M6P 모이어티는 임의의 비스-포스포릴화된 M6P를 포함한다.

본 발명에 따라서, 고 수준의 만노즈-6-포스페이트 모이어티는 예를 들면, 당해 분야의 숙련가에게 공지되거나 또는 이에 의해 후에 개발된 임의의 적합한 수단을 사용하여 측정된, 당해 분야의 숙련가에 의해 높은 것으로 고려된 임의의 수준의 M6P 모이어티를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 당단백질의 고 수준의 M6P 모이어티도 재조합 당단백질의 총 글리칸의 적어도 10몰%, 11몰%, 12몰%, 13몰%, 14몰% 또는 15몰%의 M6P 모이어티 수준을 포함한다. 예를 들면, 재조합 당단백질은 총 글리칸 피크 영역에 걸쳐 M6P 피크 영역의 퍼센트로 측정된 것으로서 고 수준, 예를 들면, 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14% 또는 15%의 M6P를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 당단백질은 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)이고 rhGUS의 총 글리칸의 적어도 10몰%, 11몰%, 12mol%, 13몰%, 14몰% 또는 15몰%의 M6P 모이어티 수준을 포함한다. 예시적인 구현예에서, rhGUS는 약 13% 내지 약 15%의 M6P 모이어티 수준을 포함한다.

다른 구현예에서, 재조합 당단백질의 고 수준의 M6P 모이어티는 인간 세포에 의한 재조합 당단백질의 고 수준의 흡수, 예를 들면 인간 섬유아세포에 의한 고 친화성 흡수량을 포함한다. 예를 들면, 재조합 당단백질은 임의의 적합한 인간 세포, 예를 들면, 인간 섬유아세포에 의해 1nM, 1.1nM, 1.2nM, 1.3nM, 1.4nM, 1.5nM, 1.6nM, 1.7nM, 1.8nM, 1.9nM, 2nM, 2.1nM, 2.2nM, 2.3nM, 2.4nM, 2.5nM, 2.6nM, 2.7nM, 2.8nM, 2.9nM, 3nM, 4nM, 또는 5nM의 M6P 의존성 K 흡수를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 당단백질은 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)이고 5nM 미만, 4nM 미만, 3nM 미만, 또는 2nM 미만의 M6P 의존성 K 흡수를 갖는다. 예시적인 구현예에서, rhGUS는 약 1.2nM 내지 약 1.8nM의 M6P 의존성 K 흡수를 갖는다.

여전히 다른 구현예에서, 재조합 당단백질 중 고 수준의 M6P 모이어티는 인간 세포에 의한 재조합 당단백질의 최대 흡수를 달성하는데 요구되는 보다 낮은 농도, 예를 들면, 보다 낮은 절반-최대 농도를 포함한다. 예를 들면, 재조합 당단백질은 인간 세포, 예를 들면 섬유아세포에 의해 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM 또는 1nM 미만의 농도에서 최대 흡수를 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 당단백질은 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)이고 인간 세포, 예를 들면, 섬유아세포에 의해 5nM 미만, 4nM 미만, 3nM 미만, 또는 2nM 미만의 농도에서 최대 흡수를 달성할 수 있다. 예시적인 구현예에서, rhGUS는 인간 세포, 예를 들면, 섬유아세포에 의해 약 1.2nM 내지 약 1.8nM의 농도에서 최대 흡수를 달성할 수 있다.

여전히 다른 구현예에서, 재조합 당단백질 중 고 수준의 M6P 모이어티는 재조합 당단백질의 천연 시알화 함량, 예를 들면, 본 출원에 개시된 방법을 사용하는 것과 같은 향상을 위한 임의의 수단 전에 재조합 당단백질의 천연 시알화 함량과 관련된 M6P 모이어티의 수준에 상응하는 M6P 모이어티의 하나 이상의 수준을 포함한다.

본 발명에 따라서, 일부 구현예에서 재조합 당단백질, 예를 들어, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제 또는 임의의 다른 리소좀 효소는, 적어도 1mol/mol의 시알화 함량 및 재조합 당단백질의 총 글리칸의 적어도 10몰%, 11몰%, 12몰%, 13몰%, 14몰% 또는 15몰%의 고 수준의 M6P 모이어티를 갖는다. 일 구현예에서, 재조합 당단백질, 예를 들어, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제 또는 임의의 다른 리소좀 효소는 적어도 1mol/mol의 시알화 함량 및 인간 세포, 예를 들면, 인간 섬유아세포에 의해 적어도 1nM, 1.1nM, 1.2nM, 1.3nM, 1.4nM, 1.5nM, 1.6nM, 1.7nM, 1.8nM, 1.9nM 또는 2nM의 흡수를 지닌 고 수준의 M6P 모이어티를 갖는다. 다른 구현예에서, 재조합 당단백질, 예를 들면, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제 또는 임의의 다른 리소좀 효소는 적어도 1mol/mol의 시알화 함량 및 인간 세포, 예를 들면, 인간 섬유아세포에 의해 재조합 당단백질의 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 또는 1nM 미만에서 최대 흡수를 지닌 고 수준의 M6P 모이어티를 갖는다.

여전히 다른 국면에서, 본 발명은 재조합 당단백질 집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 집단의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 시알화된다. 일 구현예에서, 상기 집단의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 예를 들면, 시알화 함량 및 M6P 수준과 관련하여, 본 발명에 따른 재조합 당단백질이다.

본 발명에 의해 제공된 재조합 당단백질은 임의의 당단백질일 수 있다. 예시적인 재조합 당단백질은 다음의 단백질 중 모두 또는 하나 중의 일부와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함한다: Flt3 리간드(제WO 94/28391호에 기술된 바와 같음), CD40 리간드(미국 특허 제6,087,329호에 기술된 바와 같음), 에리쓰로포이에틴, 트롬보포이에틴, 칼시토닌, 렙틴, IL-2, 안지오포이에틴-2(본원에 참고로 포함된 Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322):55-60에 기술된 바와 같음), Fas 리간드, NF-카파 B의 수용체 활성화제에 대한 리간드(RANKL, 제WO 01/36637호에 기술된 바와 같음), 종양 괴사 인자(TNF)-관련 세포자멸사(apoptosis)-유도 리간드(TRAIL, 제WO 97/01633호에 기술된 바와 같음), 흉선 기질-유도된 림포포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 호주 특허 제588819호에 기술된 바와 같음), 유방 세포 성장 인자, 줄기 세포 성장 인자(예를 들면, 본원에 참고문헌으로 포함된, 미국 특허 제6,204,363호에 기술된 바와 같음), 상피 성장 인자, 각질세포 성장 인자, 거핵구 성장 및 발달 인자, RANTES, 성장 호르몬, 인슐린, 인술리노트로핀, 인슐린-유사 성장 인자, 부갑상샘 호르몬, α 인터페론, γ 인터페론, 및 컨센서스(consensus) 인터페론을 포함하는 인터페론(예를 들면, 둘 다 참고로 본원에 포함된, 미국 특허 제4,695,623호 및 제4,897,471호에 기술된 것과 같음), 신경 성장 인자, 뇌-유도된 신경영양 인자, 시냅토타그민-유사 단백질(SLP 1-5), 뉴로트로핀-3, 글루카곤, 인터루킨 1 내지 18, 콜로니 자극 인자, 림프독소-β, 종양 괴사 인자(TNF), 림프구 억제 인자, 온코스타틴(oncostatin)-M, 및 세포 표면 분자 ELK 및 Hek에 대한 다양한 리간드(예를 들면, eph-관련 키나제 또는 LERKS에 대한 리간드). 본 발명의 방법에 따라 생산될 수 있는 단백질의 설명은 예를 들면, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Vol. II (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, Mass., 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); 및 The Cytokine Handbook (A. W. Thompson, ed., Academic Press, San Diego, Calif., 1991)에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 참고로 본원에 포함되어 있다.

본 발명의 재조합 당단백질은 리소좀 효소, 특히 효소 대체 요법(ERT)에 유용한 임의의 효소를 포함할 수 있다. 이러한 효소의 예는 어떠한 제한없이, 산 알파-글루코시다제, 산 베타-글루코시다제 또는 글루코세레브로시다제, 알파-갈락토시다제 A, 산 베타-갈락토시다제, 베타-헥소스아미니다제 A, 베타-헥소스아미니다제 B, 산 스핑고마이엘리나제, 갈락토세레브로시다제, 산 세라미다제, 아릴설파타제, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타제, 헤파란 N-설파타제, 알파-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-설페이트 설파타제, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제, 산 베타-갈락토시다제, 아릴설파타제 B, 산 알파-만노시다제, 산 베타-만노시다제, 산 알파-L-푸코시다제, 시알리다제, 및 알파-N-아세틸갈락토사미니다제를 포함한다.

특정의 예시적인 구현예에서, 본 발명의 재조합 당단백질은 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)이다. 인간 β-글루쿠로니다제는 고 만노즈, 복합체 및 하이브리드 유형인 다양한 쇄를 포함하는 분자당 16개 이하의 올리고당을 함유하는 당단백질이다.

또한, 단리되거나 정제된 당단백질 폴리펩타이드가 본원에 기술되어 있다. 예를 들면, 단리되거나 정제된 rhGUS 폴리펩타이드가 본원에 기술되어 있다. 기재된 단리되거나 정제된 rhGUS 폴리펩타이드는 본원에 개시된 조성물 또는 방법 중 하나 이상에서 사용될 수 있다.

rhGUS 폴리펩타이드는 rhGUS 펩타이드 서열 및 또한 이의 단편, 이의 천연 변이체, 및 이의 비천연 변이체를 포함할 수 있다. rhGUS 서열은 서열번호 1로 제공된다. 서열번호 1로 이루어진 단리되거나 정제된 폴리펩타이드가 본원에 개시되어 있다. 또한 서열번호 1을 포함하는 단리되거나 정제된 폴리펩타이드, 및 또한 이의 단편이 본원에 개시되어 있다. 단편은 적어도 약 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 이상의 연속된 아미노산일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지거나 포함하는 단리되거나 정제된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, rhGUS 폴리펩타이드는, 시알산 함량이 0.1mol/mol, 0.5mol/mol, 0.7mol/mol, 1mol/mol, 1.5mol/mol, 2mol/mol, 또는 5mol/mol의 rhGUS 폴리펩타이드 초과이다. 일부 구현예에서, rhGUS 폴리펩타이드는, 시알산 함량이 약 0.5mol/mol 내지 약 2.0mol/mol의 rhGUS 폴리펩타이드이다. 일 구현예에서, rhGUS 폴리펩타이드는 시알산 함량이 약 0.6mol/mol 내지 약 1.5mol/mol의 rhGUS 폴리펩타이드이다. 다른 구현예에서, rhGUS 폴리펩타이드는, 시알산 함량이 약 0.7 mol/mol 내지 약 1.4mol/mol의 rhGUS 폴리펩타이드이다. 예시적인 구현예에서, rhGUS 폴리펩타이드는, 시알산 함량이 약 0.8 mol/mol 내지 약 1.3 mol/mol의 rhGUS 폴리펩타이드이다. 다른 예시적인 구현예에서, rhGUS는, 시알산 함량이 약 1.0mol/mol 내지 약 1.2mol/mol의 rhGUS 폴리펩타이드이다.

추가의 구현예에서, rhGUS 폴리펩타이드 중 갈락토즈 잔기의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%가 시알화되어 있다. 예시적인 구현예에서, rhGUS 폴리펩타이드의 갈락토즈 잔기 중 적어도 약 65% 내지 적어도 약 75%가 시알화되어 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 당단백질은 재조합적으로 생산될 수 있다. 본 발명의 재조합 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 발현 벡터내로 도입될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 재조합 당단백질은 rhGUS이다. 따라서, 본 출원은 또한 rhGUS를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 일 구현예에서, 재조합 발현 벡터에 의해 생산된 rhGUS 단백질은 서열번호 1로 이루어지거나 이를 포함한다.

당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 재조합 벡터는 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포 시스템에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 rhGUS를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일 구현예에서, 숙주 세포에 의해 생산된 rhGUS 단백질은 서열번호 1로 이루어지거나 이를 포함한다. 본 발명의 rhGUS 단백질을 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 단백질을 글리코실화할 수 있는 임의의 세포주, 바람직하게는 단백질을 발현하도록 유전적으로 가공된 포유동물 세포주를 포함할 수 있다. 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, 골수종(예를 들면, NSO, NSI), 또는 WI38 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 재조합 당단백질을 생산하기 위해 사용된 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

여전히 다른 구현예에서, 본 발명은 고 수준의 또는 증가된 시알산 함량을 갖는 하나 이상의 당단백질을 포함하는 제형을 제공한다. 일반적으로 제형은 액체형(용액), 예를 들면 재구성된 동결건조물, 및 고체형, 예를 들면 동결건조된 형, 겔, 미세캡슐화된 입자 및 페이스트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일부 구현예에 따른 제형은 액체 제형, 동결건조물, 및 겔, 입자, 또는 페이스트와 함께 사용된 재구성된 동결건조물로부터 제조된 액체 용액의 조합일 수 있다.

일부 구현예에서, 제형은 수성 완충액 및 재조합 당단백질을 포함하는 용액이다. 완충액은 인산나트륨(Na-Pi), 히스티딘, 아르기닌, 글리실글리신, 타르타르산, 말산, 락트산, 아스파르트산, 석신산 또는 이의 임의의 조합를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 완충액은 Na-Pi 및 히스티딘을 포함한다. 다른 구현예에서, 완충액은 na-Pi, 히스티딘 및 아르기닌을 포함한다.

일부 구현예에서, 완충액은 염화나트륨(NaCl), 폴리옥시에틸렌(트윈-20), 염화칼륨, 및 소르비톨(예를 들면, D-소르비톨)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 성분들을 추가로 포함한다. 예시적 구현예에서, 완충액은 Na-Pi, 히스티딘, NaCl 및 트윈 20을 포함한다.

당해 분야에 잘 인식되는 바와 같이, 단백질의 안전성은 제형의 pH 및/또는 이온 강도에 의존할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에 따라서, 제형의 pH는 약 9.0 내지 약 5.0, 예를 들면, 약 7.5 내지 약 6.0이다. 일부 구현예에서, pH는 약 9.0, 약 8.0, 약 7.5, 약 7.0, 약 6.5, 약 6.0, 약 5.5 또는 약 5.0이다. 제형의 보다 낮은 pH가 재조합 당단백질의 안전성을 증진시킬 수 있음을 최초로 인식한 것은 본 발명이다. 예를 들면, 실시예 2에서 표 6은, pH가 7.5로부터 6.0으로 변화한 경우 사량체의 퍼센트로 측정한 것으로서 증가된 안전성을 입증한다.

생산 방법

여전히 다른 국면에서, 본 발명은 당 단백질의 시알화 및 추가로 혈청 또는 단백질 유리된 배지를 사용한 세포 배양에 의해 생산된 당단백질의 M6P 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.

일반적으로, 배양 배지는 정의된 배지의 수준을 기준으로 하여 수개의 소세트로 분할될 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 1) 혈청-함유 배지(일반적으로 10-20%의 태아 소 혈청(FBS); 2) 감소된-혈청 배지(일반적으로 1-5% FBS); 3) 혈청-유리된 배지(규정된 배지와 동일); 4) 단백질-유리된 배지(단백질은 아니지만 식물 가수분해물로부터 규정되지 않은 펩타이드를 함유함); 5) 화학적으로 규정된 배지(재조합 단백질 및/또는 호르몬만을 지님); 6) 단백질-유리된, 화학적으로 규정된 배지(저분자량의 성분만을 함유하지만, 합성 펩타이드/호르몬을 함유할 수 있다); 및 7) 펩타이드-유리된, 단백질-유리된 화학적으로 규정된 배지(저 분자량 성분만을 함유함)일 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 감소된 혈청 배지를 사용하여 당단백질의 발현을 위해 세포를 성장시킬 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 혈청-유리된 배지를 사용하여 당단백질의 발현을 위한 세포를 성장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질-유리된 배지를 사용하여 당단백질의 발현을 위해 세포를 성장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적으로 규정된 배지를 사용하여 당단백질의 발현을 위해 세포를 성장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질-유리된, 화학적으로 규정된 배지를 사용하여 실시예 1에 입증된 바와 같이 세포를 성장시킬 수 있다. 또한, 일부 구현예에서, 펩타이드-유리된, 단백질-유리된 화학적으로 규정된 배지를 사용하여 당단백질의 발현을 위한 세포를 성장시킨다.

당해 분야에 잘 이해되는 바와 같이, 혈청-유리된 배지는 규정되지 않은 동물-유도된 생성물, 예를 들면, 혈청 알부민(혈액으로부터 정제됨), 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질, 및 부착 인자를 함유할 수 있다. 이들 규정되지 않는 동물-유도된 생성물은 복합체 오염물, 예를 들면 알부민의 지질 성분을 함유할 것이다. 대조적으로, 화학적으로 규정된 배지는 확인되어 이들의 정확한 농도가 공지된 성분들 모두로 정의된다. 일부 구현예에서, 화학적으로 규정된 배지는 동물-유도된 성분을 전적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 화학적으로 규정된 배지는 FBS, 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HAS) 또는 이의 조합을 포함하지 않는다. 이를 달성하기 위해, 화학적으로 규정된 배지는 일반적으로 벼 또는 이. 콜라이(E. coli)로부터 일반적으로 유도된, 알부민 및 성장 인자의 재조합 버젼, 또는 합성 화학물질, 예를 들면, BSA/HSA의 기능들 중 일부를 재생할 수 있는 중합체 폴리비닐 알코올과 같은 합성 화학물질로 보충된다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 단백질 유리된 배지는 생물학적 기원의 임의의 단백질 또는 성분도 함유하지 않는다. 배지 속에서 단백질의 부재는 혈액 기원의 또는 다른 병원체 또는 비-인간 단백질에 의한 오염으로부터의 위험을 제거한다. 또한, 이러한 단백질이 유리된 배지는 일반적으로 이의 성분들 모두를 확인하고 정량화하기 위해 완전히 규정되어 있으며, 이는 단백질-함유 배지보다 타의추종을 불허하는 생성물 일관성, 우수한 생성물 품질 조절 프로파일 및 우수한 생성물 안전성을 제공할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 사용된 배지는 갈락토즈, 프럭토즈, n-아세틸-만노사민, 만노즈 및 이의 조합으로부터 선택된 당의 유효량을 포함하지 않는다. 예를 들면, 당의 유효량은 0.01mM, 0.05mM, 또는 0.1mM 초과이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 혈청 또는 단백질이 유리된 배지 속에서 단백질, 예를 들면, 당단백질을 생산하기 위해 포유동물 세포를 배양물 속에서 성장시킴을 포함하여, 포유동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명을 실시하기에 적합한 세포는 단백질을 글리코실화할 수 있는 임의의 세포주, 바람직하게는 단백질을 발현하도록 유전적으로 가공된 포유동물 세포주를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 동질성 세포주이다. 다수의 적합한 세포주가 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, 골수종(예를 들면, NSO, NSI), 또는 WI38 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 재조합 당단백질을 생산하는데 사용된 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

본 발명의 일부 구현예에 따라서, 특히 유용한 세포는 CHO 세포이며, 이는 재조합 단백질, 예를 들면, 사이토킨, 응괴 인자, 및 항체를 생산하는데 광범위하게 사용된다(참고: Brasel et al. (1996), Blood 88: 2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6: 231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol 145: 3011-3016). 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)-결핍성 돌연변이체 세포주(참고: Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220), 예를 들어, DXB11 또는 DG-44가 유용한데, 이는, 효율적인 DHFR 선택가능한 및 증식가능한 유전자 발현 시스템이 이들 세포내에서 고 수준의 재조합 단백질 발현을 허용하기 때문이다(참고: Kaufman (1990), Meth. Enzymol. 185: 527-566). 또한, 이들 세포는 부착성 또는 현탁 배양물을 제작하고 비교적 우수한 유전적 안전성을 나타내는데 용이하다. CHO 세포 및 이들 속에서 발현된 재조합 단백질이 집중적으로 특성화되어 왔으며 관리 기관에 의해 임상적인 상업적 제조시 사용하기 위해 승인되어 왔다.

일부 구현예에서, 세포는 공급 뱃치 방식(fed batch mode)으로 성장시킨다. 공급-뱃치 공정은, 하나 이상의 영양물(기질)을 배양 배지에 가하여 생물반응기 속에서 성장을 증가시키고 고 세포 말도를 달성하는 작동 기술로 정의된다. 일반적으로, 조절된 방식으로 영양물을 가하는 것은 배양물 성장 속도 및 생산에 있어서 긍정적인 효과를 갖는다. 일부 구현예에서, 생물반응기 속에서 10⁶개의 세포/mL, 10⁷개의 세포/mL, 2x10⁷개의 세포/mL, 5x10⁷개의 세포/mL, 또는 10⁸개의 세포/mL 초과의 세포 농도가 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 공급 뱃치식 방식에서 사용된 생물반응기는 적어도 10L, 20L, 50L, 80L, 100L, 250L, 500L 또는 1000L의 용적을 가진다. 세포는 현탁액 또는 부착성 배양물 속에서 성장시킬 수 있다. 예시적인 구현예에서, 세포는 현탁액 속에서 성장된다. 포유동물 세포가 바람직하며, 특수한 예시적인 구현예에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다.

치료학적 치료

여전히 다른 국면에서, 본 발명은 병태 또는 장애의 치료가 요구되는 개체에게 본원에 기술된 바와 같은 조성물/제제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 병태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본원에 기술된 바와 같은 조성물/제제는 단독으로 또는 본원에 기술된 치료 방법에서와 같은, 다양한 목적의 임의의 치료학적 제제/조성물과 함께 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 조성물/제제는 약제학적으로 허용될 수 있다.

일부 구현예에서, 치료가 요구되는 병태 또는 장애는 효소 결핍증과 관련되어 있다. 골지체, 세망세포질, 및 리소좀과 같은 세포 구획내 효소 결핍증은 광범위하게 다양한 인간 질환을 유발한다. 예를 들면, 세망세포질의 관강 속에 일반적으로 존재하는 효소인, 라이실 하이드록실라제는 콜라겐의 적절한 프로세싱에 요구되며; 당해 효소의 부재는 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome) 제VI형, 심각한 연결 조직 장애를 유발한다. 골지체에서 일반적으로 발견된 GnT II는 단백질의 정상적인 글리코실화에 요구되며; GnT II의 부재는 뇌 발달에 있어서의 결함을 초래한다.

예시적인 구현예에서, 효소 결핍증과 관련된 병태 또는 장애는 리소좀 축적 장애(LSD)이다. 40개 이상의 리소좀 축적 질환(LSD)이 리소좀내에서 하나 이상의 단백질의 부재에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 유발된다. LSD는 글리코스핑고지질, 글리코겐, 뮤코다당류 및 당단백질을 포함하는 다양한 기질의 비정상적인 대사로부터 유발된다. 기질의 대사는 일반적으로 리소좀에서 발생하며 당해 공정은 다양한 분해성 효소에 의해 단계식 공정에서 조절된다. 따라서, 임의의 하나의 효소 활성에 있어서의 결함도 전체 공정을 파괴하여 특수한 기질의 축적을 초래할 수 있다. 하기에 다수의 리소좀 축적 장애 및 상응하는 결함 효소를 나열한다:

폼페 질환(Pompe disease): 산 알파-글루코시다제

고셰 질환(Gaucher disease): 산 베타-글루코시다제 또는 글루코세레브로시다제

파브리 질환(Fabry disease): 알파-갈락토시다제 A

GMI-강글리오사이드증: 산 베타-갈락토시다제

테이새크 질환(Tay-Sachs disease): 베타-헥소스아미니다제 A

샌드호프 질환(Sandhoff disease): 베타-헥소스아미니다제 B

니만-피크 질환(Niemann-Pick disease): 산 스핀고마이엘리나제

크라베 질환(Krabbe disease): 갈락토세레브로시다제

파버 질환(Farber disease): 산 세라미다제

이염색질이영양증: 아릴설파타제 A

헐러-쉐이 질환(Hurler-Scheie disease): 알파-L-이두로니다제

헌터 질환(Hunter disease): 이두로네이트-2-설파타제

산필리포 질환(Sanfilippo disease) A: 헤파란 N-설파타제

산필리포 질환 B: 알파-N-아세틸글루코사미니다제

산필리포 질환 C: 아세틸-CoA: 알파-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제

산필리포 질환 D: N-아세틸글루코사민-6-설페이트 설파타제

모르쿠어 질환(Morquio disease) A: N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제

모르쿠어 질환 B: 산 베타-갈락토시다제

마로테욱스-라미 질환(Maroteaux-Lamy disease): 아릴설파타제 B

슬라이 질환(Sly disease): 베타-글루쿠로니다제

알파-만노시도시스(alpha-Mannosidosis): 산 알파-만노시다제

베터-만노시도시스(beta-Mannosidosis): 산 베타-만노시다제

푸코시도시스(Fucosidosis): 산 알파-L-푸코시다제

시알리도시스(Sialidosis): 시알리다제

쉰들러-칸자키 질환(Schindler-Kanzaki disease): 알파-N-아세틸갈락토사미니다제

특정의 예시적인 구현예에서, 본 발명은 LSD의 치료가 필요한 개체에게 본원에 기술된 바와 같은 조성물/제제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, LSD를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 조성물/제제는 재조합 인간 β-글루쿠로니다제를 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, LSD는 뮤코다당류증(mucopolysaccharidosis) 제7형(즉, MPS 7, MPS VII, 또는 슬라이 증후군), β-글루쿠로니다제의 결핍으로부터 생성된 장애이다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 증가된 시알산 함량을 지니며 LSD, 예를 들면, MPS 7을 치료하는데 특히 유용하다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조성물/제제의 최적 투약 요법을 투여함을 포함하여, 대상체에서 병태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 투여는 병태 또는 장애의 치료를 위한 통계적으로 유의적인 치료학적 효과를 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 조성물/제제는 증가된 시알산 함량을 갖는 재조합 당단백질을 포함한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 재조합 당단백질은, 시알화 함량이 적어도 0.7 mol/mol의 재조합 당단백질이다. 다른 예시적인 구현예에서, 재조합 당단백질은, 시알화 함량이 적어도 1mol/mol의 재조합 당단백질이다. 일부 구현예에서, 병태 또는 장애는 효소 결핍증과 관련되어 있다. 예시적인 구현예에서, 효소 결핍증과 관련된 병태 또는 장애는 리소좀 축적 장애(LSD)이다.

따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조성물/제제의 투약 요법을 투여함을 포함하여, 대상체에서 리소좀 축적 장애(LSD)를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 투여는 LSD의 치료를 위한 통계적으로 유의적인 치료학적 효과를 제공한다. 예시적인 구현예에서, 조성물/제제는 증가된 시알산 함량을 갖는 재조합 인간 β-글루쿠로니다제를 포함한다. 추가의 예시적인 구현예에서, LSD는 뮤코다당류증 제7형(즉, MPS 7, MPS VII, 또는 슬라이 증후군)이다.

본 발명에 따라서, LSD의 치료는 LSD를 치료하는 임의의 형태, 예를 들면, LSD의 임의의 증상을 감소시키는 것, LSD의 임의의 증상의 중증도를 감소시키는 것, LSD의 하나 이상의 증상의 기간을 단축시키는 것, LSD와 관련된 임의의 원인 또는 병태를 치료하거나 억제하는 것, 또는 LSD의 임의의 임상 기준 또는 정도 또는 병태의 측정도 감소시키는 것을 포함한다.

본 발명에 따라서, 본 발명의 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 LSD를 치료하기 위한 투약 요법으로 투여된다. 일 구현예에서, LSD는 MPS 7이다. 이러한 레지멘은 1일당, 매 2주당 투여량, 및 또한 치료 주기당 투여량의 수, 또는 이의 조합을 포함한다.

일반적으로, 본 발명의 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)는 kg당 약 0.1mg 내지 20mg, 0.2mg 내지 15mg, 0.5 내지 12mg, 1mg 내지 10mg. 1.5mg 내지 8mg, 2mg 내지 6mg의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rhGUS는 kg당 약 0.1mg, 0.2mg, 0.5mg, 1mg, 2mg, 3mg, 4mg, 5mg, 6mg, 7mg, 8mg, 9mg, 10mg, 11mg, 또는 약 12mg의 투여량으로 투여될 수 있다. 예시적인 구현예에서, rhGUS는 kg당 약 4mg의 투여량으로 투여된다. 투여량은 각각의 환자의 병태 및 또한 환자가 섭취한 다른 약물에 대해 조절될 수 있다.

일부 구현예에서, 이러한 투여량은 시간당, 일당, 주당(즉, QW), 매 2주(즉, QOW), 또는 매달 투여된다.

일부 구현예에서, rhGUS는 시간당, 약 매 1 내지 24시간, 1 내지 20시간, 1 내지 16시간, 1 내지 12시간, 1 내지 8시간, 1 내지 6시간, 1 내지 4시간, 1 내지 2시간 또는 매시간 투여된다. 일부 구현예에서, rhGUS는 약 매 2, 3, 4, 5, 또는 6시간마다 투여되거나, 약 매 10분, 15분, 30분, 45분 또는 60분마다 투여된다.

일부 구현예에서, rhGUS는 연속 주입으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rhGUS는 적어도 약 2, 4, 6, 10, 12시간 이상의 기간 동안 환자에게 투여될 수 있으며, 이는 일부 구현예에서 효능을 증진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, rhGUS는 1 내지 24시간, 1 내지 20시간, 1 내지 16시간, 1 내지 12시간, 1 내지 10시간, 1 내지 8시간, 1 내지 6시간, 1 내지 4시간, 내지 1 내지 2시간 동안 연속 주입에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, rhGUS는 약 10분, 15분, 30분, 45분 또는 60분 동안 연속 주입에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, rhGUS는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 10시간, 12시간, 24시간 이상 동안 연속 주입에 의해 투여된다. 예시적인 구현예에서, rhGUS는 약 4시간 동안 연속 주입에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 연속 주입 기간은 비-주입의 기간(즉, rhGUS가 투여되지 않는 기간)으로 단리된다. 주입은 임의의 적합한 수단, 예를 들면, 미니펌프로 수행할 수 있다.

일부 구현예에서, rhGUS는 약 매 1 내지 30일, 매 1 내지 25일, 매 1 내지 20일, 매 1 내지 14일, 매 1 내지 10일, 매 1 내지 5일 또는 매일 투여된다.

일부 구현예에서, rhGUS는 약 1 내지 12주, 약 1 내지 24주, 약 1 내지 36주, 약 1 내지 48주, 약 1 내지 60주, 또는 약 1 내지 72주 마다 투여된다. 일부 구현예에서, rhGUS는 약 1개월, 4개월, 8개월, 12개월, 16개월, 20개월 이상 동안 투여된다. 일부 구현예에서, rhGUS는 약 1년, 2년, 5년, 10년 이상 동안 투여된다. 일부 구현예에서, rhGUS는 영구적으로(즉, 장기간 사용) 투여된다.

rhGUS는 동결건조된 형태로 제공될 수 있으며, 투여 전에 멸균(예를 들면, 수성) 희석액으로 재구성될 수 있다. rhGUS는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사 또는 주입, 및 경구를 포함하는 임의의 효과적인 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 특정의 예시적인 구현예에서, rhGUS는 정맥내 주입으로 투여된다. 일반적으로, rhGUS의 스케쥴화된 용량은 단일 용량(예를 들면, 주사)으로 투여될 수 있거나, 24시간 이하의 과정에 걸쳐, 예를 들면, 연속 주입 또는 반복된 소용량의 주사 등 또는 본원에 집중적으로 기술된 바에 의해 이격될 수 있다. 일 구현예에서, rhGUS의 스케쥴화된 용량은 단일 주사 또는 다수의 주사로서 투여될 수 있다.

일 구현예에서, 환자는 적절하게는 rhGUS의 매 격주(즉, QOW) 투여로, kg당 약 0.5 내지 12mg(예를 들면, 약 1, 2, 4, 8, 또는 12mg)의 용량으로 제공받아 LSD의 중증도를 감소시킬 수 있다. 예시적인 구현예에서, 환자는 rhGUS를 대략 매 격주로 kg당 약 4mg의 용량으로 제공받는다. 상기 레지멘은 일부 구현예에서 12, 24, 36, 48, 또는 60주 동안, 또는 영구적으로(즉, 장기간 사용) 지속될 수 있다.

본 발명에 따라서, 본 발명의 방법에 사용된 rhGUS는 단독으로 또는 LSD에 대한 보호 표준물과 함께, 또는 LSD에 대한 보호 표준물을 포함하는 치료 레지멘의 일부로서 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 rhGUS의 각각의 주입 전에 예방학적 항히스타민을 투여받을 수 있다. 추가의 구현예에서, 환자는 rhGUS의 각각의 주입 전에 해열제 의약(예를 들면, 이부프로펜 또는 아세트아미노펜)을 투여받을 수 있다.

본 발명이 일부 구현예에 따라서, rhGUS의 투여는 통계적으로 유의적인 치료 효과를 제공한다. 일 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료 효과는 미국에서 하나 이상의 규제 기관, 예를 들면, FDA 또는 다른 나라에서 제공한 하나 이상의 표준 또는 기준에 기초하여 측정된다. 다른 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 임상 시험 설정 및/또는 과정을 승인한 규제 기관으로부터 입수한 결과를 기초로 측정된다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 무작위처리된, 위약-조절된, 맹검-개시(blind-start), 단일의 교차 임상 시험 설정을 기준으로 측정된다. 일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 임상 시험 설계로부터의 데이타를 기준으로 하며, 이에 의해 대상체는 4개 그룹 중 하나로 무작위 분류되고, 각각의 그룹은 맹검 방식으로 상이한 소정의 시점에서 상이한 처리 순서를 나타낸다. 일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 적어도 4, 6, 8, 10, 또는 12명의 대상체의 환자 집단으로부터의 데이타를 기준으로 측정된다. 예시적인 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 12명의 대상체의 환자 집단으로부터의 데이타를 기준으로 측정된다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 4mg/kg의 rhGUS, 또는 위약을 매 격주(즉, QOW) 사용하는 처리를 시작하고 상이한, 소정의 시점에서 4mg/kg의 rhGUS QOW으로 바꾸는 4개의 처리 순서 중 하나에 대해 1:1:1:1로 무작위 분배된 12명의 대상체를 포함하는 연구를 기초로 하여 측정된다. 일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 4mg/kg의 rhGUS 또는 위약 QOW를 48주 동안 투여한 대상체에서의 연구를 기초로 측정된다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는, rhGUS가 느린 IV 주입에 의해 대략 4시간의 기간에 걸쳐 QOW로 투여되는 연구를 기준으로 측정된다. 일부 구현예에서, 환자는 rhGUS의 각각의 주입 전에 예방학적 항히스타민(예를 들면, 세티리진 또는 로라타딘)으로 예비-투약된다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 1차 종점으로서 뇨 글리코사미노글리칸(uGAG) 수준을 측정함으로써 측정한다. MPS 장애에서 지난 20년에 걸쳐 수행된 집중적인 연구는 임상적 이점을 합리적으로 예측하는 경향이 있는 생물마커로서 uGAG 수준의 자격조건을 허용하는 유의적으로 관련된 과학 데이타를 제공한다. MPS7에서 rhGUS에 대한 질환 공정 및 작용 메카니즘은 잘 이해되어 있으며 uGAG가 MPS 질환 공정의 직접적인 병리생리학적 및 용이하게 측정된 마커이고 uGAG가 MPS 장애에서 치료 효과 및 임상적 이점의 충분한 예측인자인 비교가능한 효소 대체 치료요법(ERT)을 사용한 다른 유사한 MPS 장애로부터의 데이타가 확립되어 있다. 예시적인 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 4mg/kg의 rhGUS 또는 위약을 QOW로 48주 기간에 걸쳐 처리받은 12명의 대상체를 포함하는 임상 연구에서 uGAG 수준의 측정을 기초로 하여 측정된다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 2차 효능 척도(즉, 2차 종점), 예를 들면, 다중-도메인 반응인자 지수 및 개별화된 임상 반응의 평가를 사용하여 측정된다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 다중-도메인 반응인자 지수를 사용하여 측정되며, 이는, 효능에 대한 보다 광범위한 기준이 자격을 갖춘 복합체 종점을 작제하기 위한 시도의 복잡성없이 평가될 수 있도록 보증하기 위해 독립된 다중-도메인 분석을 결합시킨다. 일부 구현예에서, 다중-도메인 반응인자 지수는 MPS 7 환자에서 일반적으로 관찰된 임상 특징의 광범위한 스펙트럼에 걸쳐 rhGUS 효능의 평가를 제공한다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 개별화된 임상 반응(ICR)을 평가함으로써 측정된다. 이는, 대상체/환자/간병인이 보고한 관심, 임상 결과 평가를 신뢰할 수 있도록 완료하는 대상체의 능력, 및 이러한 개체에 대한 손상 정도에 대한 결과 척도의 관련성을 기초로 선택된 처리에 대한 각각의 대상체의 반응의 척도이다. ICR의 사용은 각각의 대상체에 대해 가장 관련성있는 것으로 여겨지는 사전지정된 개별화된 임상 결과에 있어서의 변화를 평가한 후 연구 집단에 대한 전체 반응율을 측정함으로써 rhGUS의 임상적 이점의 평가를 가능하도록 한다. 일부 구현예에서, 2차 효능 척도(즉, 2차 종점)은 대상체의 일상 생활을 가장 방해하는 MPS7의 신호 및 증상의 평가(즉, 임상 문제점 평가)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 평가는 폐 기능의 시험, 도보 거리의 시험, 운동의 어깨 굴곡 범위의 시험, 및 미세 운동 기능의 시험을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 약 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 또는 0.01 이하인 알파 값을 갖는 데이타를 기초로 측정한다. 일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 신뢰 구간을 갖는 데이타를 기초로 측정한다. 일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 약 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 또는 0.01 이하의 p 값을 갖는 데이타를 기초로 측정된다. 일부 구현예에서, 통계적으로 유의적인 치료학적 효과는 예를 들면, 미국의 FDA에 의해 본 발명에 의해 제공된 조성물 및 방법의 III상 임상 시험의 승인으로 측정된다.

일반적으로, 통계학적 분석은 규제 기관, 예를 들면, 미국에서의 FDA 또는 중국 또는 다른 임의의 나라의 규제 기관에 의해 허용된 임의의 적합한 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 통계학적 분석은 예를 들면, 카플란-마이어(Kaplan-Meier), 자콥슨-트루악스(Jacobson-Truax), 길리켄-로드-노빅(Gulliken-Lord-Novick), 에드워즈-눈날리(Edwards-Nunnally), 하겔만-아린델(Hageman-Arrindel) 및 히에라키칼 선형 모델링(Hierarchical Linear Modeling: HLM) 및 콕스 회귀 분석(Cox regression analysis)으로부터의 비-계층화된 분석, 로그-랭크 분석(log-rank analysis)을 포함한다.

일부 구현예에서, 리소좀 축적 생물마커는 치료 반응을 예측하고/하거나 치료 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 뇨 글루코사미노글리칸(uGAG) 수준이 측정될 수 있고 uGAG 수준에 있어서의 감소가 긍정적인 치료 반응의 지표로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, rhGUS의 투여시 후에 감소되는, uGAG 생물마커의 상승된 수준은 치료 반응의 예측치이다. 일부 구현예에서, 당해 정보는 rsGUS를 사용하는 리소좀 축적 장애(예를 들면, MPS7)의 치료를 위한 치료 레지멘(본원에 기술된 바와 같음)을 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 rhGUS로 처리된 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 LSD 생물마커의 수준에 있어서의 감소를 측정하고 생물학적 시료 속에서 하나 이상의 하나 이상의 LSD 생물마커의 수준에 있어서의 감소를 기초로 rhGUS의 치료 레지멘을 측정함을 포함하는 치료 레지멘을 측정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, LSD 생물마커는 uGAG이다. 일부 구현예에서, uGAG의 축소되거나 감소된 수준은 rhGUS를 사용한 처리의 치료 반응 및/또는 치료 효능의 지표이다. 일부 구현예에서, 소정의 표준 수준까지의 uGAG 수준의 감소는 rhGUS를 사용한 보다 우수한 치료 예후의 지표이다.

실시예

실시예 1: 총 시알산의 생산 및 정량화

본 발명에 따라 생산된 재조합 인간 β-글루쿠로니다제(rhGUS)를 GUS CR01로 표지하였다. 재조합 단백질은 생물반응기 배양 시스템을 사용하여 배양 배지 속에 효소를 발현하여 분비하도록 가공된 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 생산된다.

β-글루쿠로니다제(GUS Lot 43/44로서 표지됨)의 앞서의 배치는 세포를 연속 주입 시스템에서 미세담체에 부착시켜 성장시키는 공정에 의해 동일한 세포주를 사용하여 생산하였다. 세포는 태아 송아지 혈청(FBS)을 함유하는 성장 배지 속에서 일반적으로 증식시켰다. 이후에, FBS를 세척하고 가수분해물을 함유하는 배지로 교체하고 상층액을 관류 방식으로 수거하였다.

앞서 보고된 방법과는 대조적으로, GUS CR01은 공급 뱃치 방식으로 현탁액 속에서 성장시킨다. 다른 차이는, GUS CR01이 앞서 사용된 혈청 함유 배지와는 반대로 화학적으로 정의된 단백질이 유리된 배지 속에서만 배양되었다는 것이다.

GUS 속에서 총 시알산의 정량화를 위한 방법은 GUS 약물 물질의 방출-시험에 대한 렌츨러 바이오테크롤로기(Rentchler Biotechnologie: RB) 품질 조절 부서에서 개발되었다. 당해 방법에서, 시알산 잔기는 산 가수분해를 사용하여 rhGUS 글리칸 구조로부터 방출된다. 이후에, 방출된 시알산은 OPD(O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드)로 표지하고 역-상 HPLC 분석(RP-HPLC)으로 분석하였다. 지금까지, rhGUS의 Lot 43/44 및 6개의 RB-생산된 로트가 총 시알산에 대해 RB에서 분석되어 왔다. 이들 결과(표 1)는 당용액(GlycoSolution)에서 관찰된 결과와 일치한다.

GUS의 총 시알산 분석에 대한 결과

로트 GUS	생산 방법	시알산(mol/mol GUS 단량체)
Lot 43/44	앞서 보고된 바와 같음	0.04
PR01	본 발명에 따름	1.0
PR02	본 발명에 따름	0.7
CR01	본 발명에 따름	1.1
GMP1	본 발명에 따름	1.2
GMP2	본 발명에 따름	1.2
GMP3	본 발명에 따름	1.2

실시예 2: 수컷 스프라그 다울리 (Male Sprague Dawley ) 랫트에서 약동학

당해 실시예에서, 본 발명에 따라 생산된 재조합 인간 β-글루쿠로니다제를 당해 분야에서 앞서 보고된 바와 같이 생상된 것들과 비교하였다. 본 연구의 목적은 수컷 스플라그 다울리 랫트에서 단일의 2시간 주입으로서 정맥내 투여된 재조합 인간 β-글루쿠로니다제의 약동학 및 조직 분포를 평가하기 위한 것이었다. 주입 속도는 처음 1시간 동안 총 용적의 1/3이었고 이어서 두번째 1시간 동안 총 용적의 2/3이었다. 당해 투여하는 레지멘은 환자에서 사용될 투여 레지멘을 시뮬레이션하도록 설계되었다.

물질 및 방법

시험 제품 및 주입

3개의 시험 제품을 본 연구에서 사용하였다: 비-효소 대조군으로서 0.9% 염화나트륨, GUS CR01 및 GUS Lot 43/44. 시험 제품에 대한 완전한 명세는 표 2에서 찾을 수 있다.

시험 제품

시험 제품 1
명칭	주사용의 0.9% 염화나트륨, USP(염수)
공급원	Baxter Healthcare(노쓰캐롤라이나주 마리온 소재)
물리적 특성	투명한 액체
확인자/로트 번호	C883827
멸균 병태	멸균
저장 조건	실온
유효 기간	04/2014
시험 제품 2
명칭	GUS CR01
공급원	Ultragenyx Pharmaceutical Inc.(캘리포니아주 노바토 소재)
품질	~32.5mL
농도	2.0mg/mL
GUS 활성 단위/ml	10.75 Munits/ml
비 활성 단위/mg	5.35 Munits/mg
물리적 특성	투명한 액체
확인자/로트 번호	CR01
저장 조건	2 내지 8℃
유효 기간	제공되지 않음
시험 제품 3
명칭	GUS Lot 43/44
공급원	Ultragenyx Pharmaceutical Inc.(캘리포니아주 노바토)
양	~25 mL
농도	2.5mg/mL*(2.18 mg/ml)
GUS 활성 단위/ml	11.4 Munits/ml
비 활성 단위/mg	5.23 Munits/mg
물리적 특성	투명한 액체
확인자/로트 번호	43/44
저장 조건	-60 내지 -80℃
유효 기간	제공되지 않음

시험 제품은 2개의 1시간의 상으로 이루어진 단일의 주입 동안 ~2mg/Kg의 체중의 투여량에서 수컷 스프라그-다울리 랫트내로 주입되었다. 투여량의 1/3은 처음 1시간에 걸쳐 주입되었고 투여량의 2/3는 두번째 1시간 동안 주입되었다(표 3).

랫트 그룹 번호, 투여량 및 주입 속도

그룹 #	시험 제품	성별	n	투여 경로	투여 농도(mg/mL)	투여 속도(mL/분)		총 투여량 (mg/kg)	실제 투여량* (mg/kg)
1	염수	M	5	정맥내	n/a	처음 1시간: 0.99 두번째 1시간: 1.98		n/a	n/a
2	GUS 로트: CR01	M	5	정맥내	0.203	처음 1시간: 0.94 두번째 1시간: 1.87		~21	~21
3	GUS 로트: 43/44	M	5	정맥내	0.253	처음 1시간: 0.78 두번째 1시간: 1.57		~21	~1.71

¹투여량은 각각의 그룹에서 모든 5마리의 랫트의 평균 체중을 기초로 한다.

* GUS Lot 43/44에 대한 투여량은 기본적으로 BCA 검정으로 측정된 2.5mg/ml의 단백질 값을 기초로 한다. 단백질 농도가 OD280에서의 흡광도 및 2.12의 여기 계수를 기초로 하는 경우, 실제 투여량은 84.8% x 2 = 1.7 mg/Kg이었다.

혈액 샘플을 각각의 랫트로부터 처리 전 및 이후 느린 주입, 신속한 주입 및 표 4에 요약한 스케쥴에 의한 주입 후 상 동안의 간격에서 취하였다. 혈액을 응고되도록 하고, 혈청을 단리하여 분석용 드라이아이스 위에 -80℃ 발송 보류(pending shipment)에서 동결시켜 저장하였다.

주입 및 출혈 스케쥴

저장	명목 간격
	예비투여
느린 주입	주입 개시 후 2분
	주입개시 후 10분
	주입개시 후 30분
	주입개시 후 60분
신속한 주입	주입개시 후 120분
주입후	2분(주입 종결 후)
	10분(주입 종결 후)
	30분(주입 종결 후)
	60분(주입 종결 후)
	120분(주입 종결 후)
	240분(주입 종결 후)
	480분(주입 종결 후)
	24시간(주입 종결 후)

혈청 속에서의 GUS 활성

β-글루쿠로니다제 활성은 다음과 같이 측정하였다: 25μL의 혈청을 0.1M 아세트산나트륨, pH 4.8 속에서 1:4 내지 1:300으로 희석시키고, 1mg/mL의 결정성 BSA를 50μL의 10mM 4-MU-β-D-글루쿠로니드 기질과 0.1M 아세트산나트륨, pH 4.8, 1mg/mL 결정성 BSA 속에서 혼합하였다. 모든 용액을 37℃로 예비-가온시키고 혼합한 후 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 검정을 200μL의 글리신 카보네이트, pH 10.5를 첨가하여 중지시키고, 분자 장치(Molecular Devices) M2^e 플레이트 판독기 상에서 366/446nM의 여기/방출 파장에서 판독하였다. 활성은 1 단위 = 37℃에서 방출된 1nmole의 4MU/mL/hr로 나타내었다.

조직에서의 GUS 활성

조직을 부검에서 수집하고 동결바이알 속에 두어, 액체 질소 속에서 신속히 동결시키고, 분석용 드라이아이스에서 -80℃ 발송 보류로 저장하였다. 조직 속에서 GUS 활성의 분포는 다음과 같이 평가하였다. 전체 또는 부분 조직 표본을 해동시키고 10 내지 20용적의 25mM 트리스, 140mM NaCl, 1mM 페닐메틸 설포닐 플루오라이드, pH 7.2와 합하였다. 조직 균질물을 키네마티카 폴리트론 균질화기(Kinematica Polytron homogenizer)를 사용하여 빙상에서 30초 동안 제조하고; 수득되는 균질물을 1회(-80℃에서) 동결/해동시킨 후 빙상에서 냉각하여 20초 동안 초음파처리하였다. 각각의 균질물의 25μL의 총 용적을 4MU-β-글루쿠로나이드를 사용하여 앞서 기술된 바와 같이 β-글루쿠로니다제에 대해 분석하였다. 균질물의 단백질 농도는 비신코닌산 방법으로 측정하였다. 조직 β-글루쿠로니다제 수준은 가수분해된 4MU/hr/mg 단백질의 nmol로 나타내었다.

결과 및 논의

혈장 속에서의 GUS CR01 대 GUS 로트 43/44의 약동학

도 1은 느린 주입 단계, 신속한 주입 단계 및 주입 후 단계 동안 각각의 주입 그룹으로부터의 랫트의 혈청 속에서 β-글루쿠로니다제 활성을 나타낸다. 염수만을 주입한 그룹 1에 대한 곡선은 이들 랫트의 혈청 속에 존재하는 랫트 β-글루쿠로니다제의 낮은 내인성 수준을 나타낸다. 내인성 수준은 효소가 주입된 랫트로부터의 다른 2개의 플롯에서의 값으로부터 감하였다.

GUS CR01 및 GUS 로트 43/44 둘 다에 대한 플롯은 느린 주입 기간의 말기까지 정체-상 수준에 도달한 효소 활성 수준에 있어서의 시간 의존된 증가에 이어 신속한 주입 기간의 개시와 다시 일치하는 증가를 나타낸다. 그러나 대조적으로, GUS CR01은 GUS 로트 43/44과 비교하여 느린 주입의 말기에 2배 높은 혈청 속 수준 및 신속한 주입 기간의 말기에 3배 더 높은 혈청 속 수준에 도달한다. 도 1로부터 일반적으로 리소좀 효소에 대한 특징인, 주입 후 혈청으로부터 효소 둘다의 신속한 청소가 중지됨을 알 수 있다.

도 2에서, 본 발명자들은 t_1/2 값을 계산한 효소 둘 다에 대한 주입 후 청소 상을 나타낸다. GUS 로트 43/44은 4.50분의 제1 상 t_1/2를 지닌 순환으로부터 청소된다. 대조적으로, GUS CR01은 5.30분의 약간 더 느린 t_1/2에서 중지된다. 미가공 청소 데이타는 t_1/2 값을 재-계산하기 위한 상이한 방법으로 분석하였다(도 4a 및 4b). Cmax(GUS CR01의 경우 14800 대 GUS 로트 43/44의 경우 4300) 및 AUC-t(18700 대 5580)는 또한 GUS의 경우 3배 더 높음을 나타낸다(표 5). t_{1/ 2}은, 제2 상을 고려하였으므로 매우 상이하게 계산되었다. GUS CR01의 경우, 제2상 t_1/2은 1.1시간이고 GUS 로트 43/44의 경우 0.967 hr이다(표 5).

GUS CR01 대 GUS 로트 43/44의 조직 분포

2개의 효소의 청소 외에도, 본 발명자들은 간, 비장, 심장, 신장, 뇌 및 폐에서 GUS 로트 43/44와 비교하여 GUS CR01의 조직 분포를 평가하였다. 이들 조직 각각으로부터 제조된 조직 추출물을 방법에 기술된 바와 같이 β-글루쿠로니다제 및 단백질에 대해 분석하였다. 당해 검정의 결과는 β-글루쿠로니다제 활성의 단위/mg의 조직 단백질로 나타내었다. 이들 검정의 요약은 도 4에서 알 수 있다. 당해 도의 그래프 각각에서, 내인성 랫트 β-글루쿠로니다제를 포함하는 총 효소 수준은 좌측에 나타낸다. 각각의 그래프의 우측에서 평균 내인성 효소 수준을 총 효소 수준으로부터 감하였다. 각각의 조직으로부터 평균 내인성 β-글루쿠로니다제 수준을 염수 주입된 그룹 1으로부터의 모든 5마리의 랫트로부터의 값을 사용하여 계산하였다.

각각의 조직에서, GUS CR01 또는 GUS 로트 43/44가 주입된 랫트에서 GUS의 수준은 염수 주입된 랫트보다 더 높다. 내인성 GUS 수준을 감하는 경우, GUS CR01가 주입된 랫트는 GUS 로트 43/44를 주입한 랫트보다 적어도 2배 더 높은 GUS 수준을 함유한다.

당해 연구는 GUS CR01 및 GUS 로트 43/44의 β-글루쿠로니다제 약동학 및 조직 분포 특성을 평가하기 위해 설계하였다. 현재의 연구는, GUS CR01이 GUS 로트 43/44의 경우 4.50분의 보다 신속한 t_1/2과 비교하여, 5.30분의 제1상 t_1/2을 사용한 순환으로부터 청소되었다. 제2 상 t_1/2은 또한 GUS CR01보다 약간 더 크다.

2개 효소 사이의 보다 유의적인 차이는 Cmax, AUC-t 및 조직 분포에 대해 입증되었다. GUS CR01에 대한 2시간의 주입 기간의 말기에 혈청 속의 β-글루쿠로니다제 활성의 최대 농도(C_max)는 14,829 단위/ml이었고, GUS 로트 43/44에 의해 획득된 3537 단위/ml의 농도의 4.2배이었다. C_max에 있어서 이러한 증가는 주입 기간 동안 혈액 속에서 보다 높은 농도로 보다 느리게 청소하는 효소의 축적에 의해 설명될 수 있었다. AUC-t는 또한 도 1에 나타낸 바와 같이 GUS CR01 대 GUS 로트 43/44로 크게 증가(3배 이상)되었다.

마지막으로 그러나 중요하게는, 본 발명자들은, 시험한 조직 모두에서 GUS CR01이 GUS 로트 43/44보다 2배 이상까지의 수준에서 조직에 전달되었음을 관찰하였다. 순환으로부터 리소좀 효소의 청소 특성을 변화시키는 것은 조직 분포에 있어서의 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 순환에서 GUS CR01의 t_1/2를 늦추는 것은 선택된 조직으로 효소의 보다 효과적인 분포를 허용할 수 있음을 고려할 수 있다. 보다 중요하게는, 조직 분포에서의 변화는 Cmax 및 AUC-t의 변화와 매우 잘 관련되는 것으로 보인다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 오차 바아(error bar)는 매우 크며, 이는, 각각의 연구 그룹의 개개의 랫트에서 수득된 값의 큰 범위를 반영한다. 선택된 조직에서 3회의 반복된 β-글루쿠로니다제 검정은, 본 발명자들이 이들 랫트에서 관찰된 광범위한 값이 실제였음을 믿도록 이끄는 원래의 값을 확인하였다.

앞서, GUS CR01의 분석은, 만노즈 6 포스페이트의 수준 및 대부분의 다른 특성이 2개의 효소 사이에서 매우 유사한 반면, GUS CR01의 시알산 함량은 GUS 로트 43/44의 것의 28배(1.1mol/mol의 GUS 단량체 대 0.04mol/mol의 GUS 단량체)임을 나타낸다. 표 6을 참조한다.

GUS CR01 및 GUS 로트 43/44의 특성화

특성/검정	단위	GUS CR01	GUS 로트 43/44		GMP1	GMP2	GMP3*
역가	mg/L	~400	~50		~400	~400	~400
pH	-log[H+]	7.4	7.5		7.4	7.6	6.0
순도(환원 SDS-PAGE)	%	99.2	>95.0		99.2	98.8	99.3
사량체(SE-HPLC)	%	97.7	99.0		98.4	98.6	99.1
분자량 사량체	달톤	290,249	300,000		300,000	300,000	300,000
질량 여기 계수	(mg/mL)-1cm-1	2.08	---		2.0	2.0	2.1
전하 이질성(IEF)	pH 범위	비교가능	6.6-7.7		비교가능	비교가능	비교가능
M6P N-글리칸 분석(피크 15-17의 합)	몰-%	14.2	비교가능		14	14	12
시알산 함량	(moles/mole의 단량체)	1.1	0.04		1.2	1.2	1.2
비 활성	(MU/mg)	3.6	3.70		3.9	3.7	3.5
세포 흡수	K흡수 nM	1.2-1.7	1.4		1.8	1.6	1.4
MPS7 섬유아세포에서 반감기	0-21일 5-21일	20.0 21.6	18.9 20.5		NA	NA	NA

^*단당류 분석은, GMP3 GUS 상의 갈락토즈 잔기의 71%가 시알화되어 있음을 나타내고 있다.

상기 데이타를 함께 취하면, 시알산이 혈관의 내부 벽에서 내피 세포내에 위치한 만노즈 수용체에 의한 순환으로부터 당단백질 청소를 지연시키는 것으로 잘 공지되어 있으므로 본원에 입증된 GUS CR01의 보다 우수한 조직 분포가 시알산 함량에 있어서 이의 증가에 기인한다는 것이 매우 명백해진다. 고 시알산 수준과 고 친환성 만노즈-6-포스페이트 모이어티의 조합은 높은 시알산 함량으로 인하여 다른 탄수화물 수용체를 통해 조직 흡수를 감소시키기 위한 최적의 조합을 제공하며, 순환시 보다 높은 농도를 보증하고 이후 고 친화성 만노즈-6-포스페이트 수준으로 인하여 표적 조직내에서 탁월한 조직 흡수를 달성한다.

실시예 3: 효소 대체 치료요법을 사용한 MPS VII의 치료

당해 실시예의 목적은, 재조합적으로 생산된 인간 β-글루쿠로니다제 (rhGUS)를 사용한 점액다당류증 제VII형(즉, MPS VII; 슬리 증후군)에 대한 효소 대체 치료요법이 36주의 임상 연구에서 리소좀 저장을 감소시킴을 입증하기 위한 것이다.

본 실시예에서 MPS VII으로 진단된 3명의 대상체에게 증가된 시알산 함량과 함께 rhGUS를 투여하였다. 투여량은 다음의 36주 스케쥴에 따라 수행하였다:

1-12주: 매 격주마다 2mg/kg;

13-20주: 매 격주마다 1mg/kg;

21-28주: 매 격주마다 4mg/kg; 및

29-36주: 매 격주마다 2mg/kg.

rhGUS의 안전성 및 효능을 36주 치료 스케줄 동안 평가하였다. rhGUS 화합물은 안전하고 잘 견디어지는 것으로 여겨졌다. 중요하게도, 심각한 부작용은 36주까지 관측되지 않았으며 3명의 대상체 중 누구에서도 약물-관련되거나 고민감성 주입-관련 반응이 없었다.

GAG의 리소좀 축적은 GUS 결핍증의 특징이므로, 효능을 측정하기 위하여 글루코사미노글리칸(GAG)의 뇨 및 혈청 수준을 먼저 평가하였다. 뇨 글리코사미노글리칸(uGAG)에 있어서 신속하고 지속적인 투여량-의존성 감소가 rhGUS로 처리한 대상체에서 관측되었다. 도 4를 참조한다. 각각의 투여 간격의 말기에 uGAG에 있어서의 평균 감소는 도 5에 나타내며 4mg/kg의 투여량은 uGAG 수준의 최대 감소를 초래하였음을 나타낸다.

혈청 글리코사미노글리칸(GAG)에 있어서 진행성 감소는 rhGUS로 처리한 모든 3명의 대상체에서 또한 관찰되었다. 주목하게도, 각각의 대상체는 36주 치료 스케줄의 말기에 혈청 GAG 수준에 있어서 적어도 25% 감소를 입증하였다. 도 6을 참고한다.

마지막으로, 확장된 간 크기는 MPS VII로 고생하는 환자에서 흔히 관측되므로, 간 크기를 rhGUS로 처리한 대상체에서 평가하였다. 36주 치료 프로토콜로부터 생성되는 간 비대에 있어 유의적인 감소가 존재하였다. 도 7을 참조한다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은, 본 출원이 속한 당해 분야의 통상의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 출원의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 대표적인 방법 및 물질이 본원에 기술되어 있다.

본 발명은 이의 특정 구현예와 함께 기술되었지만, 이는 추가로 변형될 수 있고 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 수반하고 본 발명이 속한 당해 분야내에 공지되거나 통상의 실시내에서 오고 앞서 설정된 필수적인 특징에 적용될 수 있으며 첨부된 청구범위의 영역에 따르는 본 개시내용으로부터의 이러한 벗어남을 포함하는 임의의 변화, 용도, 또는 적용도 포괄하는 것으로 의도됨이 이해될 것이다.

본원에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허원, 및 공보의 청구범위, 도 및/또는 도면을 포함하는 개시내용은, 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 인용된 참고문헌과 당해 명세서 사이에 임의의 충돌이 존재하는 경우, 본 명세서가 통제할 것이다. 본 출원의 구현예를 설명함에 있어서, 특정 기술용어는 명확성을 위해 사용된다. 그러나, 본 발명은 이렇게 선택된 특정 기술용어에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 당해 명세서의 어느 것도 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 나타낸 모든 실시예는 대표적이고 비-제한적이다. 위에서 기술한 구현예는 상기 교시내용의 측면에서 당해 분야의 숙련가가 인식하는 바와 같이, 본 발명으로부터 벗어남이 없이 변형되거나 변화될 수 있다.

<110> ULTRAGENYX PHARMACEUTICAL INC. <120> SIALYLATED GLYCOPROTEIN COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> 2016-FPA-7696 <150> US 62/114,313 <151> 2015-02-10 <150> US 61/948,421 <151> 2014-03-05 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 629 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human beta-glucuronidase <400> 1 Leu Gln Gly Gly Met Leu Tyr Pro Gln Glu Ser Pro Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Lys Glu Leu Asp Gly Leu Trp Ser Phe Arg Ala Asp Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Arg Arg Arg Gly Phe Glu Glu Gln Trp Tyr Arg Arg Pro Leu Trp Glu 35 40 45 Ser Gly Pro Thr Val Asp Met Pro Val Pro Ser Ser Phe Asn Asp Ile 50 55 60 Ser Gln Asp Trp Arg Leu Arg His Phe Val Gly Trp Val Trp Tyr Glu 65 70 75 80 Arg Glu Val Ile Leu Pro Glu Arg Trp Thr Gln Asp Leu Arg Thr Arg 85 90 95 Val Val Leu Arg Ile Gly Ser Ala His Ser Tyr Ala Ile Val Trp Val 100 105 110 Asn Gly Val Asp Thr Leu Glu His Glu Gly Gly Tyr Leu Pro Phe Glu 115 120 125 Ala Asp Ile Ser Asn Leu Val Gln Val Gly Pro Leu Pro Ser Arg Leu 130 135 140 Arg Ile Thr Ile Ala Ile Asn Asn Thr Leu Thr Pro Thr Thr Leu Pro 145 150 155 160 Pro Gly Thr Ile Gln Tyr Leu Thr Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Lys Gly 165 170 175 Tyr Phe Val Gln Asn Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Asn Tyr Ala Gly Leu 180 185 190 Gln Arg Ser Val Leu Leu Tyr Thr Thr Pro Thr Thr Tyr Ile Asp Asp 195 200 205 Ile Thr Val Thr Thr Ser Val Glu Gln Asp Ser Gly Leu Val Asn Tyr 210 215 220 Gln Ile Ser Val Lys Gly Ser Asn Leu Phe Lys Leu Glu Val Arg Leu 225 230 235 240 Leu Asp Ala Glu Asn Lys Val Val Ala Asn Gly Thr Gly Thr Gln Gly 245 250 255 Gln Leu Lys Val Pro Gly Val Ser Leu Trp Trp Pro Tyr Leu Met His 260 265 270 Glu Arg Pro Ala Tyr Leu Tyr Ser Leu Glu Val Gln Leu Thr Ala Gln 275 280 285 Thr Ser Leu Gly Pro Val Ser Asp Phe Tyr Thr Leu Pro Val Gly Ile 290 295 300 Arg Thr Val Ala Val Thr Lys Ser Gln Phe Leu Ile Asn Gly Lys Pro 305 310 315 320 Phe Tyr Phe His Gly Val Asn Lys His Glu Asp Ala Asp Ile Arg Gly 325 330 335 Lys Gly Phe Asp Trp Pro Leu Leu Val Lys Asp Phe Asn Leu Leu Arg 340 345 350 Trp Leu Gly Ala Asn Ala Phe Arg Thr Ser His Tyr Pro Tyr Ala Glu 355 360 365 Glu Val Met Gln Met Cys Asp Arg Tyr Gly Ile Val Val Ile Asp Glu 370 375 380 Cys Pro Gly Val Gly Leu Ala Leu Pro Gln Phe Phe Asn Asn Val Ser 385 390 395 400 Leu His His His Met Gln Val Met Glu Glu Val Val Arg Arg Asp Lys 405 410 415 Asn His Pro Ala Val Val Met Trp Ser Val Ala Asn Glu Pro Ala Ser 420 425 430 His Leu Glu Ser Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys Met Val Ile Ala His Thr 435 440 445 Lys Ser Leu Asp Pro Ser Arg Pro Val Thr Phe Val Ser Asn Ser Asn 450 455 460 Tyr Ala Ala Asp Lys Gly Ala Pro Tyr Val Asp Val Ile Cys Leu Asn 465 470 475 480 Ser Tyr Tyr Ser Trp Tyr His Asp Tyr Gly His Leu Glu Leu Ile Gln 485 490 495 Leu Gln Leu Ala Thr Gln Phe Glu Asn Trp Tyr Lys Lys Tyr Gln Lys 500 505 510 Pro Ile Ile Gln Ser Glu Tyr Gly Ala Glu Thr Ile Ala Gly Phe His 515 520 525 Gln Asp Pro Pro Leu Met Phe Thr Glu Glu Tyr Gln Lys Ser Leu Leu 530 535 540 Glu Gln Tyr His Leu Gly Leu Asp Gln Lys Arg Arg Lys Tyr Val Val 545 550 555 560 Gly Glu Leu Ile Trp Asn Phe Ala Asp Phe Met Thr Glu Gln Ser Pro 565 570 575 Thr Arg Val Leu Gly Asn Lys Lys Gly Ile Phe Thr Arg Gln Arg Gln 580 585 590 Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Arg Glu Arg Tyr Trp Lys Ile Ala 595 600 605 Asn Glu Thr Arg Tyr Pro His Ser Val Ala Lys Ser Gln Cys Leu Glu 610 615 620 Asn Ser Leu Phe Thr 625

Claims (27)

1. 재조합 당단백질을 포함하는 조성물로서,
   상기 재조합 당단백질은 인간 β-글루쿠로니다제이고, 상기 재조합 당단백질은 적어도 0.7 mol/mol의 시알화 함량을 갖는 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 재조합 당단백질은 적어도 1mol/mol의 시알화 함량 및 상기 재조합 당단백질의 총 글리칸의 적어도 10몰%의 고 수준의 만노즈-6-포스페이트(M6P) 모이어티를 갖는 조성물.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 서열번호 1을 포함하는 조성물.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 0.8mol/mol 내지 1.3mol/mol의 시알화 함량을 갖는 조성물.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 1.0mol/mol 내지 1.2mol/mol의 시알화 함량을 갖는 조성물.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
   이를 필요로 하는 개체에서 리소좀 축적 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 개체는 인간인 조성물.
8. 청구항 6에 있어서,
   상기 리소좀 축적 장애는 뮤코다당류 제7형인 조성물.
9. 청구항 6에 있어서,
   상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 적어도 0.5mg/kg의 용량으로 투여되는 조성물.
10. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 1mg/kg 내지 8mg/kg의 용량으로 투여되는 조성물.
11. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 매주 투여되는 조성물.
12. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 매 격주 투여되는 조성물.
13. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 정맥내 투여되는 조성물.
14. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 연속 주입에 의해 투여되는 조성물.
15. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 항히스타민 치료요법과 동시에 또는 이후에 투여되는 조성물.
16. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 2mg/kg 내지 6mg/kg의 용량으로 투여되는 조성물.
17. 청구항 6에 있어서,
    상기 재조합 인간 β-글루쿠로니다제는 4mg/kg의 용량으로 투여되는 조성물.
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