ES2895034T3

ES2895034T3 - Anticuerpos anti-PD1 y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2895034T3
Application number: ES16774499T
Authority: ES
Inventors: Stefan Seeber; Valeria Lifke; Jens Fischer; Barbara Weiser; Ildiko Wuensche; Oliver Ploettner; Adrian Zwick; Guy Georges; Stefan Dengl; Viktor Levitski; Christian Klein; Deak Laura Codarri; Sebastian Fenn; Joerg Benz
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2022-02-17
Anticipated expiration: 2036-09-29
Also published as: CR20180151A; RU2746409C1; MY190297A; DK3356404T3; WO2017055443A1; US20230183349A1; IL257858B; HRP20211594T1; AU2016329251A1; AR106232A1; SI3356404T1; CO2018003477A2; MA43018A; UA123826C2; JP2018537951A; MX2018003629A; TWI625336B; EP3356404B1; TW201726727A; IL257858A

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a PD1 humana, en el que el anticuerpo i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:58, o ii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:59, o iii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:60, o iv) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:61.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PD1 y procedimientos de uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-PD1 y a procedimientos de uso de los mismos.

Antecedentes

PD-1

La coestimulación o la provisión de dos señales distintas a los linfocitos T es un modelo ampliamente aceptado de activación de linfocitos de linfocitos T en reposo por células presentadoras de antígeno (CPA) (Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)).

Este modelo proporciona además la discriminación entre lo propio y lo no propio y la tolerancia inmunológica (Bretscher et al., Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)). La señal primaria, o señal específica de antígeno, se transduce a través del receptor de linfocitos T (RLT) después del reconocimiento del péptido del xenoantígeno presentado en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La segunda señal o señal coestimuladora se envía a los linfocitos T por moléculas coestimuladoras expresadas en células presentadoras de antígeno (CPA) e induce a los linfocitos T a promover la expansión clonal, la secreción de citocinas y la función efectora (Lenschow et al., Ann Rev. Immunol. 14: 233 (1996)). En ausencia de coestimulación, los linfocitos T se pueden volver resistentes a la estimulación antigénica, no generar una respuesta inmunitaria eficaz y, además, pueden dar como resultado el agotamiento o la tolerancia a xenoantígenos.

El modelo simple de dos señales puede ser una simplificación excesiva porque la intensidad de la señal de RLT en realidad tiene una influencia cuantitativa en la activación y diferenciación de los linfocitos T (Viola et al., Science 273: 104-106 (1996); Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993)). Además, se puede producir la activación de los linfocitos T incluso en ausencia de señales coestimuladoras si la intensidad de señal del RLT es alta. Lo más importante, los linfocitos T reciben tanto señales coestimuladoras secundarias positivas como negativas. La regulación de dichas señales positivas y negativas es clave para maximizar las respuestas inmunitarias protectoras del huésped, mientras se mantiene la tolerancia inmunológica y se previene la autoinmunidad.

Las señales secundarias negativas parecen necesarias para la inducción de la tolerancia de linfocitos T, mientras que las señales positivas promueven la activación de linfocitos T. Si bien el modelo simple de dos señales todavía proporciona una explicación válida para los linfocitos indiferenciados, la respuesta inmunitaria de un huésped es un proceso dinámico, y también se pueden proporcionar señales coestimuladoras a linfocitos T expuestos a antígeno.

El mecanismo de coestimulación es de interés terapéutico porque la manipulación de las señales coestimuladoras ha demostrado proporcionar un medio para potenciar o bien poner fin a la respuesta inmunitaria basada en células. Recientemente se ha descubierto que la disfunción de los linfocitos T o anergia se produce simultáneamente con una expresión inducida y sostenida del receptor inhibidor, el polipéptido de muerte programada 1 (PD-1). Como resultado, el direccionamiento terapéutico de PD-1 es un área de gran interés.

La proteína de muerte programada 1 (PD-1) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y mielocitos (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). Los miembros iniciales de la familia, c D28 e ICOS, se descubrieron por efectos funcionales sobre el aumento de la proliferación de linfocitos T después de la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). PD-1 se descubrió a través del cribado de la expresión diferencial en células apoptóticas (Ishida et al. (1992) EMBO J 11: 3887-95). Los otros miembros de la familia, CTLA-4 y BTLA se descubrieron a través del cribado de la expresión diferencial en linfocitos T citotóxicos y células TH1, respectivamente. CD28, ICOS y CTLA-4 tienen todos un residuo de cisteína desapareado que permite la homodimerización. Por el contrario, se sugiere que PD-1 existe como un monómero, que carece de la característica del residuo de cisteína desapareado en otros miembros de la familia de CD28.

El gen PD-1 es una proteína transmembranaria de tipo I de 55 kDa que forma parte de la superfamilia del gen de Ig (Agata et al. (1996) bit Immunol 8:765-72). PD-1 contiene un motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) proximal de membrana y un motivo intercambiable basado en tirosina (ITSM) distal de membrana (Thomas, MX. (\995) J Exp A4edW,: 1953-6; Vivier, E y Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91). Aunque es estructuralmente similar a CTLA-4, PD-1 carece del motivo MYPPPY que es clave para la unión de B7-1 y B7-2. Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que se ha demostrado que regulan por disminución la activación de los linfocitos T tras su unión a PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Cárter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Tanto PD-L1 como PD-L2 son homólogos de B7 que se unen a PD-1, pero no a otros miembros de la familia de CD28. Un ligando para PD-1, PD-L1, es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de los linfocitos infiltrantes de tumor, una disminución de la proliferación mediada por el receptor de linfocitos T y una evasiva inmunitaria por las células cancerosas (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). La inmunodepresión se puede revertir inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).

PD1 es un miembro inhibidor de la familia de CD28 expresado en linfocitos B activados, linfocitos T y mielocitos (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol YWJ1 1-8). Los animales carentes en PD-I desarrollan diversos fenotipos autoinmunitarios, que incluyen miocardiopatía autoinmunitaria y un síndrome seudolúpico con artritis y nefritis (Nishimura et al. (1999) Immunity H: 141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22). Adicionalmente, se ha descubierto que PD1 desempeña un papel en la encefalomielitis autoinmunitaria, el lupus eritematoso diseminado, la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), la diabetes de tipo I y la artritis reumatoide (Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina y Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13_:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510). En una línea tumoral de linfocitos B murinos, se demostró que el ITSM de PD1 es esencial para bloquear el flujo de Ca2+ mediado por BCR y la fosforilación de tirosina de las moléculas efectoras corriente abajo (Okazaki et al. (2001) PNAS 98: 13866-71).

Diversas solicitudes de patente divulgan la producción de anticuerpos anti-PD-1 y/o procedimientos de potenciación de las respuestas inmunitarias con un agente (incluyendo un anticuerpo anti-PD-1) que interfiere con la unión de PD-L1 y/o la señalización de PD-1, incluyendo las siguientes: documentos US2003/0039653, US2004/0213795, US2006/0110383, US2007/0065427, US2007/0122378, US2012/237522, WO2004/072286, WO2006/121168, WO2006/133396, WO2007/005874, WO2008/083174, WO2008/156712, WO2009/024531, WO2009/014708, WO2009/114335, WO2010/027828, WO2010/027423, WO2010/036959, WO2010/029435, WO2010/029434, WO2010/063011, WO2010/089411, WO2011/066342, WO2011/110604, WO2011/110621 y WO2012/145493.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier otro aspecto expuesto en el presente documento que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones es solo para fines informativos.

La invención proporciona

La invención proporciona además un anticuerpo aislado que se une a PD1 humana, en la que el anticuerpo

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:58, o

ii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:59, o

iii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:60, o

iv) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:61.

En un modo de realización, el anticuerpo anti-PD1 es un anticuerpo IgG1 de longitud completa con las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración según el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, el anticuerpo anti-PD1 de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización, el anticuerpo anti-PD1 de acuerdo con la invención es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

En un modo de realización, el anticuerpo anti-PD1 de acuerdo con la invención es un fragmento de anticuerpo que se une a PD1.

En un modo de realización, el anticuerpo anti-PD1 de acuerdo con la invención es un fragmento Fab.

La invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

La invención proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico.

La invención proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de modo que se produzca el anticuerpo.

La invención proporciona dicho procedimiento de producción de un anticuerpo, que comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

La invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona el anticuerpo descrito en el presente documento para su uso como un medicamento. La invención proporciona el anticuerpo descrito en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: el bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico potencia intensamente la secreción de IFN-gamma por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos.

Figura 2: el bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico incrementa intensamente la secreción de interferóngamma (IFN-g) por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos.

Figura 3: el bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico incrementa intensamente la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF) por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos. Figura 4: 4A) frecuencia de linfocitos T CD4 que producen granzima B y 4B) cantidad de IFN-y detectada por absorbancia (densidad óptica, D.O.) en el sobrenadante de la RLM en presencia de concentraciones crecientes de diferentes anticuerpos anti-PD-1.

Figura 5: 5A) impacto del bloqueo de PD1/PD-L1 sobre la reactivación de la señalización del receptor de linfocitos T suprimido en presencia de diferentes anticuerpos anti-PD-1, 5B) impacto del bloqueo de PD1/PD-L1 sobre la reactivación de la señalización del receptor de linfocitos T suprimido en presencia de diferentes anticuerpos anti-PD-1.

Figura 6: estructura de PD1-DEC en complejo con Fab de PD1-0103.

Figura 7: estructura del complejo PD1-DEC con Fab de PD1-0103: la glucosilación en ASN58 en PD1 está implicada en la interacción.

Figura 8: estructura del complejo PD1-DEC. Estructura del complejo PD1-DEC con Fab de PD1-0103: vista en epítopo/parátopo.

Figura 9: contactos de la cadena lateral de glúcidos del núcleo de PD1 en Asn58 - cadena pesada de Fab de PD1-0103: contactos identificados por un valor de corte de distancia de 5 A.

Figura 10: residuos de PD1-DEC que interactúan con el anticuerpo, vista de secuencia con propiedades de contacto detalladas - PD-1.

Figura 11: residuos del anticuerpo que interactúan con PD1-DEC, vista de secuencia con propiedades de contacto detalladas - cadena pesada.

Figura 12: residuos del anticuerpo que interactúan con PD1-DEC, vista de secuencia con propiedades de contacto detalladas - cadena ligera.

Figura 13A: unión de diferentes anticuerpos a PD1 aglucosilada en Asn58 (izquierda) y a PD1 glucosilada en Asn58 (derecha) (sensogramas de Biacore).

Figura 13B: unión de diferentes anticuerpos a PD1 aglucosilada en Asn58 y a PD1 glucosilada en Asn58, tasa de asociación y disociación de mab determinada por Biacore.

Figura 14A: inhibición del crecimiento del tumor in vivo de PD1-0103-0312 (aPD-1) en comparación con nivolumab en combinación con un anticuerpo CEA-CD3 biespecífico, a dosis altas.

Figura 14B: inhibición del crecimiento del tumor in vivo de PD1-0103-0312 (aPD-1) en comparación con nivolumab en combinación con un anticuerpo CEA-CD3 biespecífico, a dosis altas. Descripción detallada de los modos de realización de la invención

Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.

Cuando se usa en el presente documento, el término "PD1", "PD1 humana", "PD-1" o "PD-1 humana" se refiere a la proteína humana PD1 (SEQ ID NO:68) (proteína sin secuencia señal) / (SEQ ID NO:70) (proteína con secuencia señal). Como se usa en el presente documento, un anticuerpo "que se une a PD1 humana", "que se une específicamente a PD1 humana", "que se une a PD1 humana" o "anticuerpo anti-PD1" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de PD1 humana o su dominio extracelular (DEC) con una afinidad de unión de un valor de K^dde 1,0 x 10^-8mol/l o menor, en un modo de realización de un valor de K^dde 1,0 x 10^-9mol/l o menor, en un modo de realización de un valor de K^dde 1,0 x 10^-9mol/l a 1,0 x 10^-13mol/l. La afinidad de unión se determina con un ensayo de unión estándar, tal como la técnica de resonancia de plasmón superficial (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suecia), por ejemplo, usando el dominio extracelular de PD1.

La PD1 humana tiene sitios de glucosilación unida a N en los residuos 49, 58, 74 de PD-1 de SEQ ID NO. 70 (véase, por ejemplo, D.Y. Lin et al., PNAS 105 (2008) 3011-3016)). El árbol de la cadena de glúcidos del núcleo (glucosilación unida a N) en la posición Asn58 de PD-1 tiene la siguiente estructura con respecto a los monosacáridos. En un modo de realización, la cadena de glúcidos del núcleo en Asn58 de PD1 se refiere a los primeros 5 glúcidos (monosacáridos) que están unidos a PD1 en Asn58.

Asn58-N-GlcNAc(FUC) - GlcNAc- - BMA - MAN (véase la figura 9) en la que se usan las siguientes abreviaturas.

[GlcNAc] = NGA = N-acetil-beta-D-galactosamina = 2-(acetilamino)-2-desoxi-beta-D-galactopiranosa

[FUC] = alfa-L-fucosa

[BMA] = beta-D-manopiranosa

[MAN] = alfa-D-manopiranosa

La primera GlcNAC en la cadena de glúcidos está fucosilada, que se abrevia como GlcNAc(FUC).

En un modo de realización, la cadena de glúcidos del núcleo en Asn58 de PD1 se refiere a los primeros 5 glúcidos (monosacáridos) GlcNAc, FUC, GlcNAc, BMA, MAN que están unidos a PD1 en Asn58.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')²; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y M, respectivamente.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fc" se usa en el presente documento para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos de la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que se producen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, vols. 1-3. En un modo de realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR" como se usa en el presente documento se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos que se ponen en contacto con el antígeno ("contactos con el antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:

(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26 32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) contactos con el antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48 56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-PD1" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica. (Incluir si la técnica anterior tiene inmunoconjugados)

"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dáltones, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, b La s T-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que, si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para su profilaxis o bien durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), página 91). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

I. Composiciones y procedimientos

En un aspecto, la invención se basa, en parte, en el hallazgo de que los anticuerpos anti-PD1 seleccionados de la invención se unen a determinados epítopos de PD1 y tienen la capacidad de incrementar la activación de diferentes células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK, células dendríticas (CD), monocitos y macrófagos). Por ejemplo, incrementan la liberación (secreción) de citocinas inmunomoduladoras (por ejemplo, interferón gamma y granzima B). Otras citocinas inmunomoduladoras que se incrementan o se pueden incrementar son, por ejemplo, la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) e IL-12. Como se usa en el presente documento, los términos secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) de interferón-gamma (IFN-gamma), IL-12, etc., se refieren a las citocinas humanas.

En determinados modos de realización se proporcionan anticuerpos que se unen a PD1. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento del cáncer.

A. Anticuerpos anti-PD1 ejemplares

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a PD1 humana.

En determinados modos de realización se proporciona un anticuerpo anti-PD1, en el que el anticuerpo:

i) compite por la unión a PD-1 con un anticuerpo anti-PD1 que comprende el VH y VL de PD1-0103, y

ii) se une a una PD-1 humana y de macaco cangrejero; y

iii) potencia la secreción de interferón-gamma (IFN-gamma) por linfocitos T estimulados alogénicos en un 85 % o más (en un modo de realización preferente en un 90 % o más, en un modo de realización preferente en un 95 % o más) a una concentración de anticuerpo de 10 |jg/ml (en el que la secreción sin anticuerpo se establece como 0 % (nivel basal de IFN gamma) y la secreción con 20 UE/ml de IL-2 humana recombinante se establece como 100 % (en un ensayo de reacción linfocítica mixta (RLM) (alogénica) de acuerdo con el ejemplo 3); y/o

iv) potencia la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) por los linfocitos T estimulados alogénicos en un 200 % o más (en un modo de realización preferente en un 250 % o más) a una concentración de anticuerpo de 10 |jg/ml (en la que la secreción sin anticuerpo se establece como 0 % (nivel basal de IFN gamma) y la secreción con 20 UE/ml de IL-2 humana recombinante se establece como 100 % (en un ensayo de reacción linfocítica mixta (RLM) (alogénica) de acuerdo con el ejemplo 3).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:3; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Un anticuerpo anti-PD1 de este tipo comprende

i) una secuencia de VH de SEQ ID NO:7 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:8;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un modo de realización, dicho anticuerpo anti-PD1 comprende

i) una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:58; o

ii) una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:59; o

iii) una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:60; o

iv) una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:61.

En un modo de realización, dicho anticuerpo anti-PD1 comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:58.

En un modo de realización, dicho anticuerpo anti-PD1 comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:59.

En un modo de realización, dicho anticuerpo anti-PD1 comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:60.

En un modo de realización, dicho anticuerpo anti-PD1 comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:61.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:11; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:11; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

Un anticuerpo anti-PD1 de este tipo comprende

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:15 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:16;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:19; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:19; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

Un anticuerpo anti-PD1 de este tipo comprende

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:23 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:24;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:27; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:27; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

Un anticuerpo anti-PD1 de este tipo comprende

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:31 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:32;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:35; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:35; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

Un anticuerpo anti-PD1 de este tipo comprende

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:39 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:40;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:43; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:43; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44, (ii) HVR L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

Un anticuerpo anti-PD1 de este tipo comprende

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:47 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:48;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anti-PD1 que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:49; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:51; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54.

En otro aspecto, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:51; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.

Un anticuerpo anti-PD1 de este tipo comprende

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 (por ejemplo, un anticuerpo que se une a PD1 humana) que comprende

A) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; o

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 (por ejemplo, un anticuerpo que se une a PD1 humana) que comprende

(a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:3; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:4; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6. En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une a PD1 humana que A)

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:7 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:8;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i);

o B)

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:58.

ii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:59.

iii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:60.

o C)

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i);

o D)

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i);.

o E)

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i);

o F)

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i);

o G)

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i);

o H)

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:55 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:56;

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i).

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une a PD1 humana que

ii) o variante humanizada de VH y VL del anticuerpo de i);

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une a PD1 humana que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de Se Q ID NO:58.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une a PD1 humana que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de Se Q ID NO:59.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une a PD1 humana que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de Se Q ID NO:60.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une a PD1 humana que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:61.

B) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14; o

C) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22; o

D) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 27; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; o

E) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38; o

F) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46; o

G) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54;

en el que el anticuerpo se caracteriza independientemente por una o más de las siguientes propiedades: el anticuerpo anti-PD-1

i) compite por la unión a PD-1 con un anticuerpo anti-PD-1 que comprende el VH y VL de PD1-0103 y/o

ii) se une a PD-1 humana y de macaco cangrejero; y/o

A) (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:3; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:4; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; o

B) (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:11; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14; o

C) (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:19; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22; o

D) (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:27; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; o

E) (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:35; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38; o

F) (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:43; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46; o

G) (a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:51; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54;

en el que el anticuerpo se caracteriza de forma independiente por una o más de las siguientes propiedades: el anticuerpo anti-PD-1

ii) se une a PD-1 humana y de macaco cangrejero; y/o

En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti-PD1 de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, un anticuerpo anti-PD1 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')². En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-PD1 de acuerdo con la divulgación puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las Secciones 1-7 a continuación:

1. Afinidad del anticuerpo

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación KD de < 1 ^|jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10^-8M o menos, por ejemplo, de 10^-8M a 10^-13M, por ejemplo, de 10^-9M a 10^-13M).

En un aspecto, KD se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE^®) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 |jg/ml (~0,2 ^|jM) antes de su inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (Ur ) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (t W e EN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Las velocidades de asociación (k^asoo ka) y velocidades de disociación (k^diso kd) se calculan usando un modelo simple de unión uno-a-uno de Langmuir (programa informático de evaluación BIACORE^®versión 3.2) con el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio KD se calcula como la proporción kd/ka (k^dis/k^aso). Véase, por ejemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881. Si la velocidad de asociación supera 10⁶M^{' 1}s^_1por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo (forma Fab) antiantígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con interrupción de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Fragmentos de anticuerpo

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')², Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, Nueva York (1994), págs. 269-315; véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de Ee . UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')²que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento de la semivida in vivo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0404097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med.

9 (2003) 129-134; y Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados aspectos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

3. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase de la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados aspectos, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen además, por ejemplo, en Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describe el injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol 28 (1991) 489-498 (que describe el "remodelado"); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 y Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describe el enfoque de "selección guiada" para reordenamiento de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619 1633); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 y Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996922611-22618).

4. Anticuerpos humanos

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en Van Dijk, M.A. y Van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 y Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnología Hu MAB®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M Mo Us E® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900 que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987), pp. 51-63 y Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocito B humano también se describen en Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM monoclonales humanos a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 y Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

5. Anticuerpos derivados de colecciones

Se pueden aislar anticuerpos cribando colecciones combinatorias para determinar los anticuerpos con la actividad o las actividades deseadas. Por ejemplo, son conocidos en la técnica una variedad de procedimientos para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 y se describen además, por ejemplo, en McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. y Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S., et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; y Lee, C.V., et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio indiferenciado (por ejemplo, de humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a una amplia gama de antígenos propios y no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones indiferenciadas clonando segmentos génicos de V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados a partir de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

6. Anticuerpos multiespecíficos

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados aspectos, una de las especificidades de unión es por PD1 y la otra es por cualquier otro antígeno. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de PD1. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos con respecto a las células que expresan PD1. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, el documento WO 93/08829 y Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659) y la genomanipulación de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticular dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); usar cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); usar la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y usar dímeros de Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

También se incluyen en el presente documento anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a PD1, así como a otro antígeno diferente (véase el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye anticuerpos multiespecíficos descritos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793, WO2011/117330, WO2012/025525, WO2012/025530, WO2013/026835, WO2013/026831, WO2013/164325 o WO 2013/174873.

7. Variantes de anticuerpo

En determinados aspectos, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados aspectos, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se proporcionan cambios ejemplares en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares", y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales aminoacídicas. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad o mejora en ADCC o CDC.

Tabla 1

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar con facilidad, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Se pueden realizar dichas alteraciones en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a una mutación con frecuencia alta durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196) y/o las SDR (a-CDR), sometiendo a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de la afinidad por la construcción y reselección de colecciones secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R. et al., en Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. En algunos ejemplos de maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una colección secundaria. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados aspectos, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de la HVR o las SDR. En determinados ejemplos de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se puede seleccionar para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham, B.C. y Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.

b) Variantes de la región Fc

En determinados aspectos, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.

Los anticuerpos con una reducción en la función efectora incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o disminución en la unión a los FcR. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

En un aspecto, dicho anticuerpo es una IgG1 con mutaciones L234A y L235A o con mutaciones L234A, L235A y P329G. En otro modo de realización, o IgG4 con mutaciones S228P y L235E o S228P, L235E o y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat et al., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Salud, Bethesda, MD, 1991).

Se describen anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 y Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) en el documento US 2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).

Véanse también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

c) Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína

En determinados aspectos, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En aspectos particulares, se producen los residuos sustituidos en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados aspectos, se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.

d) Derivados de anticuerpos

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro aspecto, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

B. Composiciones y procedimientos recombinantes

Se pueden producir anticuerpos usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de e E. UU. n.° 4.816.567. En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-PD1 descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En otro aspecto, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro aspecto, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En un aspecto de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En un aspecto, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-PD1, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-PD1, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gemgross, T.U., Nat. Biotech.

22 (2004) 1409-1414; y Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Vi rol.36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; y células FS4. otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

C. Ensayos

Los anticuerpos anti-PD1 proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar para determinar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

1. Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, un anticuerpo de la invención se somete a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.

En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con PD1-0103 (que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:7 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:8) por la unión a PD1 (o de forma alternativa con los anticuerpos variantes de PD1-0103 humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, con de 5 a 6 HVR idénticas). Un modo de realización de la invención es un anticuerpo que compite por la unión a PD1 humana con un anticuerpo anti-PD1 que comprende las 3 HVR de la secuencia de VH de SEQ ID NO:7 y las 3 HVR de la secuencia de VL de SEQ ID NO:8. Un modo de realización de la invención es un anticuerpo que compite por la unión a PD1 humana con un anticuerpo anti-PD1 que comprende las 3 HVR de la secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y las 3 HVR de la secuencia de VL de SEQ ID NO:58. En determinados modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que está unido por el anticuerpo anti-PD1 PD1-0103. Los procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, en: Methods in Molecular Biology, vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).

En un ensayo de competencia ejemplar, la PD1(-DEC) inmovilizada se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a PD1 (por ejemplo, el anticuerpo anti-PD1 PD1-0103 o el anticuerpo humanizado PD1-0103-0312) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a PD1. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba PD1 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a PD1, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con PD1 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con PD1 inmovilizada se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a PD1. Véase Harlow, E. y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988). Para otro ensayo de competencia ejemplar, véase el ejemplo 2 (ensayo de competencia de unión/ELISA para cartografía de epítopos).

2. Ensayos de actividad

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-PD1 de los mismos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la capacidad de potenciar la activación y/o proliferación de diferentes células inmunitarias, especialmente linfocitos T. Por ejemplo, potencian la secreción de citocinas inmunomoduladoras (por ejemplo, interferón-gamma (IFN-gamma) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa)). Otras citocinas inmunomoduladoras que se potencian o se pueden potenciar son, por ejemplo, IL12, granzima B, etc. La actividad biológica también puede incluir, reactividad cruzada de unión a la de macaco cangrejero, así como unión a diferentes tipos de células. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En determinados modos de realización, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar dicha actividad biológica como se describe, por ejemplo, en los ejemplos a continuación.

D. Inmunoconjugados (solo cáncer o modificar para la diana)

La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-PD1 en el presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.

En un modo de realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo, pero sin limitarse a, un maitansinoide (véanse los documentos US 5.208.020, US 5.416.064 y EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometil auristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse los documentos US 5.635.483, US 5.780.588 y US 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o un derivado de la misma (véanse los documentos US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 y US 5.877.296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; y Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (véase Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (200294336-4343; y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a, cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charanda, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc99m o I123, o un marcador de espín para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil a ácidos, un conector sensible a peptidasa, un conector fotolábil, un conector dimetilo o un conector que contiene disulfuro (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; patente de EE. UU. n.° 5.208.020).

Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).

E. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección

En determinados aspectos, cualquiera de los anticuerpos anti-PD1 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de PD1 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados aspectos, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como infiltrados de linfocitos T o células inmunitarias.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de PD1 en una muestra biológica. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-PD1 como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-PD1 a PD1, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-PD1 y PD1. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En un aspecto, se usa un anticuerpo anti-PD1 para seleccionar sujetos idóneos para el tratamiento con un anticuerpo anti-PD1, por ejemplo, donde PD1 es un biomarcador para la selección de pacientes.

En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos anti-PD1 marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

F. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-PD1 como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además, agentes de dispersión intersticial del fármaco tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar más. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

G. Procedimientos y composiciones terapéuticos

Cualquiera de los anticuerpos anti-PD1 (o proteínas de unión a antígeno) proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso como medicamento. En otros adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-PD1 o uso en el tratamiento del cáncer. En determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene cáncer que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-PD1.

En otros modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso como agente inmunoestimulante/ o que estimula la secreción de interferón-gamma (IFN-gamma). En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso en un procedimiento de inmunoestimulación/ o que estimula la secreción de interferón-gamma (IFN-gamma) en un individuo que comprende administrar al individuo una eficaz del anticuerpo anti-PD1 para la inmunoestimulación/ o que estimula la secreción de interferón-gamma (IFN-gamma).

En otros aspectos, la invención proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso como agente inmunoestimulante/ o que estimula la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa). En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-PD1 para su uso en un procedimiento de inmunoestimulación/ o que estimula la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) en un individuo que comprende administrar al individuo una eficaz del anticuerpo anti-PD1 para la inmunoestimulación/ o que estimula la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa).

Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores es preferentemente un ser humano. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-PD1 en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento del cáncer. En otro aspecto, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, que comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz del medicamento. En otro aspecto, el medicamento es para inducir la lisis mediada por células de células cancerosas. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inducción de la lisis mediada por células de células cancerosas en un individuo que padece cáncer que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inducir la apoptosis en una célula cancerosa/ o para inhibir la proliferación de células cancerosas. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los aspectos o modos de realización anteriores, puede ser un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz de un anti-PD1. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para inducir la lisis mediada por células de células cancerosas en un individuo que padece cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anti-PD1 para inducir la lisis mediada por células de células cancerosas en el individuo que padece cáncer. En un modo de realización, un "individuo" es un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-PD1 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-PD1 proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se puede administrar un anticuerpo (y cualquier agente terapéutico adicional) por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.

Los anticuerpos se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El anticuerpo no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra el anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,5 mg/kg - 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Una pauta posológica ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. La evolución de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que se puede llevar a cabo cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-PD1.

II. Artículos de fabricación

En otro aspecto, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-PD1.

Descripción de las secuencias de aminoácidos

SEQ ID NO:1 HVR-H1 de la cadena pesada, PD1-0103

SEQ ID NO:2 HVR-H2 de la cadena pesada, PD1-0103

SEQ ID NO:3 HVR-H3 de la cadena pesada, PD1-0103

SEQ ID NO:4 HVR-L1 de la cadena ligera, PD1-0103

SEQ ID NO:5 HVR-L2 de la cadena ligera, PD1-0103

SEQ ID NO:6 HVR-L3 de la cadena ligera, PD1-0103

SEQ ID NO:7 dominio variable de la cadena pesada VH, PD1-0103

SEQ ID NO:8 dominio variable de la cadena ligera VL, PD1-0103

SEQ ID NO:9 HVR-H1 de la cadena pesada, PD1-0098

SEQ ID NO:10 HVR-H2 de la cadena pesada, PD1-0098

SEQ ID NO:11 HVR-H3 de la cadena pesada, PD1-0098

SEQ ID NO:12 HVR-L1 de la cadena ligera, PD1-0098

SEQ ID NO:13 HVR-L2 de la cadena ligera, PD1-0098

SEQ ID NO:14 HVR-L3 de la cadena ligera, PD1-0098

SEQ ID NO 15 dominio variable de la cadena pesada VH, PD1-0098

SEQ ID NO 16 dominio variable de la cadena ligera VL, PD1-0098

SEQ ID NO 17 HVR-H1 de la cadena pesada, PD1-0050

SEQ ID NO 18 HVR-H2 de la cadena pesada, PD1-0050

SEQ ID NO 19 HVR-H3 de la cadena pesada, PD1-0050

SEQ ID NO : 20 HVR-L1 de la cadena ligera, PD1-0050

SEQ ID NO : 21 HVR-L2 de la cadena ligera, PD1-0050

SEQ ID NO : 22 HVR-L3 de la cadena ligera, PD1-0050

SEQ ID NO : 23 dominio variable de la cadena pesada VH, PD1-0050

SEQ ID NO : 24 dominio variable de la cadena ligera VL, PD1-0050

SEQ ID NO : 25 HVR-H1 de la cadena pesada, PD1-0069

SEQ ID NO : 26 HVR-H2 de la cadena pesada, PD1-0069

SEQ ID NO : 27 HVR-H3 de la cadena pesada, PD1-0069

SEQ ID NO : 28 HVR-L1 de la cadena ligera, PD1-0069

SEQ ID NO : 29 HVR-L2 de la cadena ligera, PD1-0069

SEQ ID NO : 30 HVR-L3 de la cadena ligera, PD1-0069

SEQ ID NO : 31 dominio variable de la cadena pesada VH, PD1-0069

SEQ ID NO : 32 dominio variable de la cadena ligera VL, PD1-0069

SEQ ID NO : 33 HVR-H1 de la cadena pesada, PD1-0073

SEQ ID NO : 34 HVR-H2 de la cadena pesada, PD1-0073

SEQ ID NO : 35 HVR-H3 de la cadena pesada, PD1-0073

SEQ ID NO : 36 HVR-L1 de la cadena ligera, PD1-0073

SEQ ID NO : 37 HVR-L2 de la cadena ligera, PD1-0073

SEQ ID NO : 38 HVR-L3 de la cadena ligera, PD1-0073

SEQ ID NO : 39 dominio variable de la cadena pesada VH, PD1-0073

SEQ ID NO : 40 dominio variable de la cadena ligera VL, PD1-0073

SEQ ID NO : 41 HVR-H1 de la cadena pesada, PD1-0078

SEQ ID NO : 42 HVR-H2 de la cadena pesada, PD1-0078

SEQ ID NO : 43 HVR-H3 de la cadena pesada, PD1-0078

SEQ ID NO : 44 HVR-L1 de la cadena ligera, PD1-0078

SEQ ID NO : 45 HVR-L2 de la cadena ligera, PD1-0078

SEQ ID NO : 46 HVR-L3 de la cadena ligera, PD1-0078

SEQ ID NO : 47 dominio variable de la cadena pesada VH, PD1-0078

SEQ ID NO : 48 dominio variable de la cadena ligera VL, PD1-0078

SEQ ID NO : 49 HVR-H1 de la cadena pesada, PD1-0102

SEQ ID NO : 50 HVR-H2 de la cadena pesada, PD1-0102

SEQ ID NO : 51 HVR-H3 de la cadena pesada, PD1-0102

SEQ ID NO : 52 HVR-L1 de la cadena ligera, PD1-0102

SEQ ID NO : 53 HVR-L2 de la cadena ligera, PD1-0102

SEQ ID NO : 54 HVR-L3 de la cadena ligera, PD1-0102

SEQ ID NO : 55 dominio variable de la cadena pesada VH, PD1-0102

SEQ ID NO : 56 dominio variable de la cadena ligera VL, PD1-0102

SEQ ID NO : 57 variante humanizada-dominio variable de la cadena pesada VH de PD1-0103_01

SEQ ID NO : 58 variante humanizada-dominio variable de la cadena ligera VL de PD1-0103_01 SEQ ID NO : 59 variante humanizada-dominio variable de la cadena ligera VL de PD1-0103_02 SEQ ID NO : 60 variante humanizada-dominio variable de la cadena ligera VL de PD1-0103_03 SEQ ID NO : 61 variante humanizada-dominio variable de la cadena ligera VL de PD1-0103_04 SEQ ID NO : 62 región constante de la cadena ligera kappa humana

SEQ ID NO: 63 región constante de la cadena ligera lambda humana

SEQ ID NO: 64 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG1

SEQ ID NO: 65 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG1 con

mutaciones L234A y L235A

SEQ ID NO: 66 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG1 con

mutaciones L234A, L235A y P329G

SEQ ID NO: 67 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG4

SEQ ID NO: 68 secuencia de PD1 humana ejemplar (sin secuencia señal)

SEQ ID NO: 69 dominio extracelular (DEC) de PD1 humana

SEQ ID NO: 70 secuencia de PD1 humana ejemplar (incluyendo la secuencia señal)

SEQ ID NO: 71: HVR1 mínima de PD1-0103 y variante humanizada de PD1-0103 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 y PD1-0103-0315

SEQ ID NO: 72: HVR2 mínima de PD1-0103 y variante humanizada de PD1-0103 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 y PD1-0103-0315

SEQ ID NO: 73: HVR3 mínima de PD1-0103 y variante humanizada de PD1-0103 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 y PD1-0103-0315

SEQ ID NO: 74: LVR1 mínima de PD1-0103 y variante humanizada de PD1-0103 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 y PD1-0103-0315

SEQ ID NO: 75: LVR2 mínima de PD1-0103 y variante humanizada de PD1-0103 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 y PD1-0103-0315

SEQ ID NO: 76: LVR3 mínima de PD1-0103 y variante humanizada de PD1-0103 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 y PD1-0103-0315

SEQ ID NO: 77: fragmento de FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos RDN en las

posiciones 71,72, 73 de acuerdo con la numeración de Kabat

A continuación se enumeran las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL, incluyendo las HVR marcadas (HVIgG1R en letras en negrita, subrayadas) de los anticuerpos anti-PD1 PD1-0016 (y sus versiones humanizadas PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1 -0103-0314 y PD1-0103-0315), PD1-0098, PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078 y PD1-0102:

PD1-0103 anti-PD1:

VH de PD1-0103:

EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSSYTMSWVRQTPEKRLDWVATISGGGRDIYYPDSVKGR FTISRDNAKNTLYLEMSSLMSEDTALYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTSVTVSS ’

VL de PD1-0103:

KIVLTQSPASLPVSLGQRATISCRASESVDTSDNSF1HWYQQRPGQSPKLLIYRSSTLESGVPARFS

GSGSRTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQNYDVPWTFGGGTKLEIK

Versiones de PD1-0103 humanizadas anti-PD1 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 y PD1-0103-0315:

VH de PD1-0103-0312 = VH de PD1-0103-0313 = VH de PD1-0103-0314 = VH de PD1-0103-0315:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS

VL de PD1-0103-0312:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASBSVDTSDNSF1HWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFS

GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK

VL de PD1-0103-0313:

DWMTQSPLSLPVTIiGQPAS ISCRASESVDTSDNSF1HWYQQRPGQSPRLLIYRSSTLESGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK VL de PD1-0103-0314:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLS CRASESVDTSDNSF1HWYQQKPGQSPRLLIYRSSTLESGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK VL de PD1-0103-0315:

EIVLTQSPATLSLS PGERATLS CRASESVDTSDNSF1HWYQQKPGQSPRLLIYRSSTLESGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK PD1-0098 anti-PD1:

VH de PD1-0098:

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGDKLEWLGYITYSGFTNYNPSLKSR ISISRDTSKNQFFLQLNSVATEDTATYYCARWHGSAPWYFDYWGRGTTLTVSS VL de PD1-0098:

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPNLLIYKVSRRFSGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPLTFGAGTKLELK V H :0050

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYTGRTSYNPSLKSR ISITRDTSKN QFFLQLNSVTTED TATYYCAR EMDYYGSTLDYW GQGTT LTVSS VL: 0050

KIVLTQSPASLAVSLRQRATISCRASESVDRYGNSF1HWYQQKPGQPPKVLIYRASNLBSGFPARFS GSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGSGTKLEIK V H :0069

QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQSHARTLEWIGVISTYSGDTNYNQKFKDK ATMTVDKSSSTAYLELARMTSEDSAIYYCARLGITTGFAYWGQGTLVTVSA VL: 0069

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKGVSTSSYSFMHWYQQKPRQPPKLLIKYASYLESGVPARFS GSGSGTDFTLN1HPVEEEDAATYYCHHSREFPWTFGGGTKLEIK

V H :0073

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWIRQTPEKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGR FTISRDNVKNNLYliQMSSLRSEDTAFYYCASYYYGIDYWGQGTSVTVSS

VL: 0073

DIVMTQPHKFMSTSVGDRVRITCKASQDVTTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGS

GTEFTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSIPWTFGGGTKLEIK

VH: 0078 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSTWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDPSDSYTTYNQKFKGK ATLTVDTSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSPFDYWGQGTTLTVSS VL: 0078 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGS GTDFTFAISSVQAEDLAVYYCQQHYSHPFTFGSGTKLEIK V H :0102 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGF1HSSGDTNYNPSLKSR ISFTRDTSKNQFFLQLSSLTDEDTATYYCATYRNWYFDVWGAGTTVTVSS VL: 0102 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMRCKSSQSLLNSGTQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPNR FTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLSVYYCQSDYTFPLTFGGGTKLELK III. EJEMPLOS

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención.

Ejemplo 1:

Generación de anticuerpos anti-PD-1

Inmunización de ratones

Se inmunizaron genéticamente ratones NMRI, usando un vector de expresión de plásmido que codifica PD-1 humana de longitud completa por aplicación intradérmica de 100 ug de ADN de vector (plasmid15300_hPD1-fl), seguido de electroporación (2 pulsos cuadrados de 1000 V/cm, duración 0,1 ms, intervalo 0,125 s; seguido de 4 pulsos cuadrados de 287,5 V/cm, duración 10 ms, intervalo 0,125 s. Los ratones recibieron cada uno 6 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 42, 56, 70 y 84. Se extrajo sangre los días 36, 78 y 92 y se preparó suero, que se usó para la determinación de valores por ELISA (véase a continuación). Se seleccionaron los animales con los mayores valores para el refuerzo el día 96, por inyección intravenosa de 50 ug de quimera de Fc humana frente a p D1 humana recombinante, y se aislaron los anticuerpos monoclonales por tecnología de hibridoma, por fusión de esplenocitos a la línea celular de mieloma 3 días después del refuerzo. Determinación de valores séricos (ELISA).

Se inmovilizó la quimera de Fc humana frente a PD1 recombinante humana en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 0,3 ug/ml, 100 ul/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con croteína C al 2 % en PBS, 200 ul/pocillo; aplicación de diluciones seriadas de antisueros, por duplicado, en croteína C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo; detección con anticuerpo anti-IgG murina de cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000). Para todas las etapas, se incubaron placas durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se desarrolló la señal por adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 ul/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 ul/pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.

Ejemplo 2:

Caracterización de anticuerpos anti-PD1

Unión de anticuerpos anti-PD1 a PD1 humana

ELISA para huPD1

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 |jl/podMo de PD1-DEC-AviHis biotinilado y se incubaron a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o de anticuerpos de referencia (anti-PDl humano; Roche/anti-PDI de ratón; Biolegend; cat.: 329912) y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-088)/ anti-POD murino de oveja (GE Healthcare; NA9310) en dilución 1:2000/1: 1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, n.° de catálogo 11835033001) y se incubó hasta una DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CE50 [ng/ml] en las tablas 2 y 3 de resumen a continuación.

ELISA celular para PD1

Se sembró la línea celular CHO-K1 adherida transfectada de forma estable con el plásmido 15311_hPD1-fl_pUC_Neo que codifica PD1 humana de longitud completa y la selección con G418 (marcador de resistencia a la neomicina en el plásmido) a una concentración de 0,01x10E6 células/pocillo en placas de fondo plano de 384 pocillos y se cultivó durante la noche.

Al día siguiente, se añadieron 25 jl/pocillo de muestra de PD1 o anticuerpo de referencia anti-PD1 humano (Roche)/anti-PD1 de ratón (Biolegend; cat.: 329912) y se incubó durante 2 h a 4 °C (para evitar la internalización). Después del lavado cuidadosamente (1x90 jl/pocillo de PBST), se fijaron las células añadiendo 30 jl/pocillo de glutaraldehído al 0,05 % (Sigma, n.° de cat.: G5882, 25 %) diluido en tampón 1xPBS y se incubó durante 10 min a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anticuerpo secundario para la detección: anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JlR109-036-088)/anti-POD murino de oveja (GE NA9310) seguido de 1 h de incubación a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de solución de sustrato TMB (Roche 11835033001) y se incubó hasta DO 1,0 - 2,0. Se midieron las placas a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA celular como valores de "CHO-PD1 CE50" [ng/ml] en la tabla 3 de resumen a continuación.

ELISA para PD1 de macaco cangrejero

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de PD1 de macaco cangrejero-DEC-biotina biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o de anticuerpos de referencia (anti-PD1 humano; Roche) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-088) en una dilución 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CE50 [ng/ml] en la tabla 2 y 3 de resumen a continuación.

Ensayo de reemplazo del ligando 1 de PD

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de PD1-DEC-AviHis biotinilado y se incubaron a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o de anticuerpos de referencia (anti-PD1 de ratón; Biolegend; cat.: 329912) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de PD-L1 (quimera de Fc B7-H1/PD-L1 humano recombinante; 156-B7, R&D) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, 109036088) en una dilución 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Los resultados de ELISA se enumeran como valores de CI50 [ng/ml] en la tabla 2 de resumen a continuación.

Ensayo de reemplazo del ligando 2 de PD

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de PD1-DEC-AviHis biotinilado y se incubaron a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o de anticuerpos de referencia (anti-huPD1 de ratón; Roche) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de PD-L2 (quimera de Fc B7-DC/PD-L2 humano recombinante; 1224-PL-100, R&D) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 |jl/podMo con tampón PBST) se añadieron 25 |jl/poc¡llo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, 109036088) en una dilución 1:2000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Ensayo de competencia de unión/ELISA para cartografía de epítopos

Se recubrieron placas Nunc maxisorp (Nunc n.° 464718) con 25 jl/pocillo de anticuerpo de captura (anti-IgG murina de cabra; JIR; 115-006-071) y se incubó durante 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se bloquearon las placas durante 1 h con tampón PBS que contenía BSA al 2 % a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 de ratón y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se bloqueó el anticuerpo de captura con 30 jl/pocillo de IgG de ratón (JIR; 015-000-003) durante 1 h a TA en un agitador. Al mismo tiempo, se preincubó PD1-DEC-AviHis biotinilado con un segundo anticuerpo de muestra de durante 1 hora a TA en un agitador. Después del lavado de la placa de ensayo (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se transfirió la mezcla de anticuerpos frente a PD1 a la placa de ensayo y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de estreptavidina-POD (Roche, n.° 11089153001) en una dilución 1:4000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, n.° 11089153001) y se incubó hasta DO 1,5 - 2,5. La medición tuvo lugar a 370/492 nm. Se definieron grupos de epítopos por agrupamiento jerárquico frente a anticuerpos de referencia.

Tabla 2: unión, inhibición de PD-L1 y grupos de regiones de epítopos de anticuerpos ejemplares (ELISA)

Tabla 3: unión bioquímica y celular de anticuerpos frente a PD1 humanizados derivados del anticuerpo de ratón original PD1-0103 (ELISA).

Caracterización con Biacore de los anticuerpos anti-PD-1 humanizados

Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar los parámetros cinéticos de la unión entre varias proteínas fijadoras de PD1 murinas así como referencias de unión a PD1 humana. Por lo tanto, se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huPD1-DEC a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.

Se acoplaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (UR) de 20 jg/m l de anticuerpo anti-IgG humana (GE Healthcare n.° BR-1008-39) sobre las cubetas de lectura 1 y 2 (de forma alternativa: 3 y 4) de un chip sensor CM5 en un Biacore T200 a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare.

La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP+ (HEPES 0,01 M, NaCI 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se estableció la temperatura de la cubeta de lectura en 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra en 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.

Se inyectaron las muestras durante 20 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron a la segunda cubeta de lectura. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones de PD1 humana-DEC (144 nM, 48 nM, 16 nM, 5,33 nM, 1,78 nM, 0,59 nM, 0,20 nM y 0 nM) sobre cada muestra durante 120 s seguido de un tiempo de disociación de 30/300 s y dos etapas de regeneración de 20 s con MgCh 3 M, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración.

Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación Biacore T200. Los valores de K^d, k^ay k^dresultantes se muestran en la tabla 4.

Tabla 4: constantes de velocidad cinéticas y constante de equilibrio para PD1-0103 quimérico y PD1-Ab humanizados determinadas por Biacore (véase página siguiente).

Como se muestra en la tabla 4, todas las versiones humanizadas de PD1-0103 quimérico (generación, véase el ejemplo 6) presentan propiedades cinéticas similares al anticuerpo original (PD1-0103 quimérico).

Cinética

Se montó un sensor CM5 serie S en el sistema Biacore 4000 y se trataron hidrodinámicamente los puntos de detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se inmovilizó el anticuerpo IgG de conejo policlonal <IgGFCYM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) a 10 000 ur en los puntos de detección 1 y 5 en las cubetas de lectura 1, 2, 3 y 4. Se realizó el acoplamiento por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los puntos restantes en las cubetas de lectura sirvieron como referencia. El tampón de muestra fue el tampón del sistema complementado con 1 mg/ml de carboximetildextrano.

En un modo de realización, se llevó a cabo el ensayo a 25 °C. En otro modo de realización, se llevó a cabo el ensayo a 37 °C. Se capturaron 50 nM de cada anticuerpo monoclonal murino en la superficie del sensor por una inyección de 1 min a 10 |jl/min. Posteriormente, se inyectaron los respectivos antígenos en una serie de concentraciones de 100 nM, 2x 33 nM, 11 nM, 4 nM, 1 nM y tampón del sistema 0 nM a 30 jl/m in durante 4 min de tiempo de fase de asociación. Se siguió la disociación durante otros 4 min. Se regeneró el sistema de captura usando una inyección de 3 min de glicina 10 mM, pH 1,5 a 30 jl/min. Se calcularon los datos cinéticos pertinentes usando el programa informático de evaluación Biacore de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cartografía de epítopos

Se montó un instrumento Biacore 4000 con un sensor CAP de Biacore y se preparó como se recomendó por el fabricante. El tampón del instrumento fue HBS-ET (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0,005 % p/v). El instrumento funcionaba a 25 °C.

Se diluyeron todas las muestras en tampón del sistema. Se capturó un antígeno PD1-DEC-AviHis biotinilado de 35 kDa a 200 UR en la superficie del sensor CAP por una inyección de 1 min a 30 jl/m in en las cubetas de lectura 1, 2, 3 y 4 en los puntos 1 y 5. Los puntos 2, 3 y 4 sirvieron como referencia. En otro modo de realización, se capturó un antígeno PD1-DEC-AviHis biotinilado de 35 kDa a 200 UR en el sensor CAP de la misma manera.

Posteriormente se inyectó un anticuerpo primario a 100 nM durante 3 min a 30 jl/m in seguido de la inyección de un anticuerpo secundario a 100 nM durante 3 min a 30 jl/min. Se inyectó el anticuerpo primario hasta que la saturación total de la superficie presentó antígeno. Al final de las fases de inyección de anticuerpo primario y secundario, se establecieron los puntos de informe "unión tardía" (BL) para seguir la respuesta de unión de los respectivos anticuerpos. Se calculó la proporción molar, un cociente entre la respuesta de unión a anticuerpo secundario "BL2" y la respuesta de anticuerpo primario "BL1". Se usó la proporción molar como indicador de la accesibilidad a antígeno del anticuerpo secundario, cuando el antígeno ya estaba complejado por el anticuerpo primario.

Se retiraron por completo los complejos de la superficie del sensor por una inyección durante 2 min a 30 |jl/min de tampón de regeneración de guanidina-HCl 2 M NaOH 250 mM como se recomienda por el fabricante, seguido de una inyección de 1 min a 30 jl/m in de tampón del sistema.

Ejemplo 3:

Efecto de diferentes anticuerpos anti-PD-1 sobre la producción de citocinas en una reacción linfocítica mixta (RLM)

3A) La reacción linfocítica mixta (RLM) es un ensayo de células inmunitarias que mide la activación de linfocitos de un individuo (donante X) con respecto a linfocitos de otro individuo (donante Y). Se usó una reacción linfocítica mixta para demostrar el efecto de bloquear la vía de PD1 a las células efectoras linfocíticas. Se sometieron a prueba linfocitos T en el ensayo para determinar la activación y su secreción de IFN-gamma en presencia o ausencia de mAb anti-PD1.

Para realizar una RLM alogénica, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de al menos cuatro donantes sanos de tipo HLA desconocido por centrifugación por gradiente de densidad usando Leukosep (Greiner Bio One, 227288). En resumen, se diluyeron muestras de sangre heparinizada con el triple del volumen de PBS y se colocaron en capa alícuotas de 25 ml de la sangre diluida en tubos Leukosep de 50 ml. Después de la centrifugación a 800 x g durante 15 min a temperatura ambiente (sin rotura), se recogieron las fracciones que contenían linfocitos, se lavaron en PBS y se usaron directamente en un ensayo funcional o se resuspendieron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FCS al 90 %) a 1,0E+07 células/ml y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se prepararon reacciones RLM recíprocas individuales mezclando PBMC de dos donantes diferentes en una proporción 1:1 de células estimuladoras/respondedoras y se realizaron cocultivos al menos por duplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 6 días a 37 °C, CO2 al 5 %, en presencia o sin un intervalo de concentraciones diferentes de los anticuerpos monoclonales anti-PD1 purificados PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103. Como anticuerpos anti-PD1 de referencia, se sintetizaron anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) o bien pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) y se clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). No se usó ningún anticuerpo ni anticuerpo de control de isotipo como control negativo y se usó IL-2 hu rec (20 UE/ml) como control positivo. Después del día 6, se tomaron 100 j l de medio de cada cultivo para la medición de citocinas. Se midieron los niveles de IFN-gamma usando el kit de ELISA OptEIA (BD Biosciences).

Los resultados se muestran en la tabla 5 (secreción/liberación de IFN-g). Los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 promovieron la activación de linfocitos T y la secreción de IFN-gamma de manera dependiente de la concentración. Se calculó el valor del % de incremento de secreción de IFNg en relación con la producción de IFN-g de RLM sin adición de ningún mAb de bloqueo (valor de IFNg inducido por estimulación alogénica basal como E-c) y RLM con adición de 20 UE/ml de IL-2 hu rec (control positivo = un 100 % del valor de IFNg como E+c) y se calculó de acuerdo con la fórmula: Estimulación rel. [%] = ((Emuestra - E-c)/(E+c - E-c)*100

Tabla 5: porcentaje de secreción de IFN gamma después de estimulación alogénica y tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 en comparación con el efecto del tratamiento con IL-2 humana recombinante (20 UE/ml) (= incremento de un 100 %) como control positivo

Varios anticuerpos de bloqueo de PD1 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103 demostraron una fuerte actividad inmunomoduladora potenciando la secreción de interferón gamma (IFN-g) (datos no mostrados para todos los anticuerpos).

3B) En un experimento adicional se evaluó PD1-0103 quimérico (isotipo IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A y P329g (índice EU de Kabat)). El bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico potencia intensamente la secreción de IFN-gamma por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos. PD1-0103 quimérico es más potente que los anticuerpos anti-PD1 de referencia (véase la figura 1).

Para su comparación, se usaron los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de cualquiera de nivolumab (también conocido como MDX5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) se sintetizaron y clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)).

3C) En experimentos adicionales de la actividad inmunomoduladora de las variantes humanizadas del anticuerpo anti-PD-1 PD1-0103 (anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0314, en las figuras 2 y 3, véase también el ejemplo 6 a continuación) se evaluó a) la liberación (secreción) de IFN, b) la liberación (secreción) de TNF-alfa en RLM como se describe anteriormente. Se comparó el efecto del anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus versiones humanizadas con los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de cualquiera de nivolumab (también conocido como MDX5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09a ) con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). Después de 6 días de cultivo de RLM, se tomaron 50 |jl de sobrenadante y se midieron múltiples citocinas en un único cultivo usando el ensayo Th1/Th2 de citocinas humanas Bio-Plex Pro™ (Bio-Rad Laboratories Inc). (Datos no mostrados para todas las citocinas).

El anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus versiones humanizadas (PD1-0103 0312 y PD1-0103_0314) fueron más potentes en comparación con los anticuerpos anti-PD1 de referencia en la potenciación de la activación de linfocitos T y la secreción de IFN-gamma (véase la figura 2).

Además, el anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus variantes de humanización incrementan la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) (véase la figura 3) e IL-12 (datos no mostrados) por las células presentadoras de antígeno y potencian la capacidad de monocitos/macrófagos o células presentadoras de antígeno para estimular un linfocito T.

Ejemplo 4:

Efecto del bloqueo anti-PD-1 sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IFN-y por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con células dendríticas maduras alogénicas

Para investigar además el efecto del tratamiento anti-PD-1 en un entorno alogénico, se desarrolló un ensayo en el que se cocultivan linfocitos T CD4 recién purificados durante 5 días en presencia de células dendríticas maduras (CDm) alogénicas derivadas de monocitos. Se aislaron monocitos a partir de PBMC recién obtenidas una semana antes a través de adherencia plástica seguido de la retirada de las células no adheridas. A continuación se generaron CD inmaduras a partir de los monocitos cultivándolos durante 5 días en medios que contenían GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (100 ng/ml). Para inducir la maduración de las CDi, se añadieron TNF-alfa, IL-1beta e IL-6 (50 ng/ml de cada una) a los medios de cultivo durante 2 días adicionales. A continuación se evaluó la maduración de CD midiendo su expresión en superficie del complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHCII), CD80, CD83 y CD86 a través de citometría de flujo (LSRFortessa, BD Biosciences).

El día de la reacción linfocítica mixta mínima (RLMm), se enriquecieron linfocitos T CD4 por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec) a partir de 108 PBMC obtenidas de un donante no relacionado. Antes del cultivo, se marcaron linfocitos T CD4 con 5 jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE). A continuación, se sembraron 105 linfocitos T CD4 en una placa de 96 pocillos conjuntamente con alo-CD maduras (5:1) en presencia o ausencia de anticuerpo anti-PD1 de bloqueo (PD1-0103, PD1-0103 quimérico o anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, abreviados como 0312, 0313, 0314, 0315 en las figuras 4A y 4 B), a la concentración de 10 jg/m l si no se indica de manera diferente en las figuras.

Cinco días después se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular, usados después para medir los niveles de IFN-gamma por ELISA (R&D Systems), y se dejaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (brefeldina A) y Golgi Stop (monensina). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Dye Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó la tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience), IFN-gamma e IL-2 (ambos de eBioscience). Los resultados se muestran en las figuras 4A y 4 B.

También se sometieron a prueba diferentes concentraciones de las variantes humanizadas de PD1-0103 (anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, abreviados como 0312, 0313, 0314, 0315 en las figuras, véase también el ejemplo 6 a continuación) y se descubrió que eran igualmente buenas en la potenciación de granzima B e interferón gamma. DP47 es una IgG humana que no se une con una mutación LALA en la porción Fc para evitar el reconocimiento por FcgammaR y se usó como control negativo.

Ejemplo 5:

Derivados de anticuerpos quiméricos

Se generaron anticuerpos frente a PD1 quiméricos amplificando las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos de ratón anti-PD1 PD1-0098, PD1-0103 por medio de PCR y clonándolos en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana / CH1-bisagrac H2-CH3 humana con mutaciones l234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)) (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras y vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión para C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos. Se renombraron los anticuerpos frente a PD1 quiméricos como chiPD1-0098 quimérico (chiPD1-0098) y PD1-0103 quimérico (chiPD1-0103). Para su comparación, se usaron los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de cualquiera de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) se sintetizaron y clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)).

Ejemplo 6:

Generación, expresión y purificación de variantes humanizadas del anticuerpo anti-PD1 PD-0103 (huMab PD-0103) y caracterización

Humanización de los dominios VH y VL del anticuerpo anti-PD1 murino 0103

En base a la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL murinos del anticuerpo anti-PD1 murino 0103 (SEQ ID NO: 7 y 8), se generaron variantes del anti-anticuerpo anti-PD1 humanizadas.

La variante VH humanizada se basa en la línea germinal humana IMGT_hVH_3_23 en combinación con la línea germinal del elemento J humano IGHJ5-01 con varias mutaciones. (Dando como resultado SEQ ID NO: 57).

Las variantes humanizadas de VL se basan en las líneas germinales humanas IMGT_hVK_4_1, IMGT_hVK_2_30, IMGT_hVK_3_11 e IMGT_hVK_1_39 en combinación con la línea germinal del elemento J humano IGKJ1-01. Diferentes mutaciones dieron como resultado variantes humanizadas de SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 61.

Se tradujeron de vuelta las secuencias de aminoácidos humanizadas para las regiones variables de la cadena pesada y ligera de PD1-0103 en ADN y se sintetizó el ADNc resultante (GenArt) y a continuación se clonó en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana/CH1-bisagra-CH2-CH3 humana con mutaciones LALA y PG (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras o en vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión a C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos. Los anticuerpos frente a PD1 humanizados resultantes se nombran como sigue:

Tabla 6: secuencias de VH y VL de anticuerpos variantes humanizados de PD1-0103

Tabla 7: secuencias de HVR de anticuerpos variantes humanizados de PD1-0103

Las variantes del anticuerpo PD1-0103 humanizado y PD1-0103 quimérico original se caracterizaron como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 8.

Tabla 8: resumen de resultados para variantes de anticuerpo PD1-0103 humanizado y PD1-0103 quimérico original

Ejemplo 7:

Anticuerpos frente a PD-1 de potencia neutralizante

Para someter a prueba la potencia neutralizante de los anticuerpos frente a PD-1 generados internamente para imitar un restablecimiento de una respuesta de linfocitos T suprimida in vitro, se usó un ensayo indicador PD1/PD-L1 disponible comercialmente (Promega). Este sistema consiste en células Jurkat NFAT PD1+ y un homólogo CHO PD-L1+, que también emite la señal de activación. En principio, el sistema indicador se basa en tres etapas: (1) activación de NFAT mediada por RLT, (2) inhibición de la señal de NFAT tras activación por el eje PD-1/PD-L1 y (3) recuperación de la señal de NFAT por anticuerpos de bloqueo de PD-1.

Material y procedimientos

• Medio para PD-L1: PAN Biotech (n.° P04-03609); FBS (10 %) y L-Gln (4 mM)

• Medio de ensayo: RPMI 1640 (n.° 31870; Invitrogen), HEPES 25 mM, L-Gln 2 mM, FBS (2 %)

• Células usadas para este ensayo (ambos tipos de células adquiridos de Promega):

células CHO PD-L1+ (n.° de lote 139147): 2-3x104 células/96 pocillos

células Jurkat NFAT PD-1+ (n.° de lote 133024: 3,5x104 células/pocillo

El día 1, se descongelaron células PD-L1+, se sembraron a la concentración celular indicada en el medio mencionado anteriormente y se cultivaron durante la noche a 37 °C y CO²al 5 %. Al día siguiente, se retiró el medio y se incubaron las células PD-L1+ con los anticuerpos preparados a las concentraciones indicadas (en medio de ensayo). En paralelo, se descongelaron células Jurkat NFAT PD-1+ y se transfirieron los números de células mencionados anteriormente a y se cocultivaron con las células PD-L1+. Después de una incubación de 6 h a 37 °C y CO²al 5 %, se calentó el sustrato Bio-Glo hasta temperatura ambiente (1-2 h antes de la adición). Se retiró la placa de cultivo celular de la estufa de incubación y se ajustó a temperatura ambiente (10 min) antes de añadir 80 |jl de solución Bio-Glo por pocillo, se incubó durante 5-10 min antes de medir la luminiscencia en un lector Tecan Infinite de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del kit. Los resultados se pueden ver en las figuras 5A y 5 B donde se muestra el restablecimiento de una supresión mediada por PD-1/PD-L1 de la señal de NFAT por diferentes anticuerpos frente a PD-1 tras la estimulación con RLT: figura 5 A: PD1_0103 quimérico mostró un efecto reproduciblemente superior cuando se compara con un anticuerpo de referencia. Como referencia, se sintetizó un anticuerpo anti-PD1 que comprende los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) y se clonó con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). Figura 5B: las cuatro variantes humanizadas de PD1_0103 demostraron una potencia in vitro similar al anticuerpo principal y también fueron ligeramente superiores al anticuerpo de referencia.

Ejemplo 8:

Cristalización de Fab de PD1-0103 con ectodominio de PD-1:

Para la formación del complejo, se mezcló Fab de PD1-0103 en un exceso de 1,1 molar con el ectodominio de PD-1. Después de la incubación en hielo durante 1 hora, se desglucosiló el complejo por una etapa de PNGasa para retirar los glucanos que no están implicados en la formación del complejo. El cribado de cristalización para obtener cristales complejos del fragmento Fab de PD1-0103 (con CH1 y CL humanos) con el DEC de PD-1 se realizó a una concentración de 15 mg/ml. Las gotículas de cristalización se prepararon a 21 °C mezclando 0,1 |jl de solución de proteína con 0,1 j l de solución de depósito en experimentos de difusión de vapor por gota sedente. Aparecieron cristales en diversas condiciones que contenían PEG como agente de precipitación. Los cristales usados para determinar la estructura aparecieron en un plazo de 4 días con PEG1500 al 30 % y crecieron hasta un tamaño final de 0,03 x 0,06 x 0,02 jm en un plazo de 7 días.

Se transfirieron los cristales a una solución de depósito complementada con glicerol al 20 % como crioprotector y a continuación se enfriaron instantáneamente en N2 líquido. Las imágenes de difracción se recogieron con un detector Pilatus 6M a una temperatura de 100 K en la línea de haz X1 OSA de Swiss Light Source y se procesaron con el paquete XDS [Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Apl. Cryst. 26, 795-800 (1993)]. Se fusionaron los datos de un cristal para proporcionar un conjunto de datos de resolución de 1,9 A en el grupo espacial P1 con dos moléculas complejas por unidad asimétrica cristalográfica (véase la tabla 1).

Se determinó la estructura por reemplazo molecular usando las coordenadas de un fragmento Fab de PDB-ID 3UTZ como modelo de búsqueda. Como coordenadas de búsqueda para el DEC de PD-1 se usó el PDB-ID 3RRQ. Se dividió el Fab en los dominios constante y variable y con ambas búsquedas separadas en el programa CCP4 se realizaron PHASER CCP4 [CCP4 (Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs forprotein crystallography. Acta Crystallogr. D, 760-763 (1994)] para tener en cuenta los posibles cambios en el ángulo de acodadura. El modelo se reconstruyó en COOT (Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 486-501 (2010)) y se refinó con el programa CCP4 REFMAC. Las etapas finales de refinamiento se realizaron con el programa BUSTER (Bricogne G., Blanc E., Brandi M., Flensburg C., Keller P., Paciorek W, Roversi P, Sharff A., Smart O.S., Vonrhein C., Womack T.O. (2016). BUSTER versión 2.11.6. Cambridge, Reino Unido: Global Phasing Ltd.).

Tabla 9: recogida de datos y estadísticas de refinamiento de estructura para el cristal de DEC de Fab de

PD1-0103-PD-1

Determinación de la estructura de Fab de PD1-0103 en complejo con el ectodominio de PD-1

Para caracterizar el epítopo y el parátopo en detalle, se determinó la estructura cristalina del ectodominio de PD-1 en complejo con Fab de PD1-0103 a una resolución de 1,9 A. La estructura revela que Fab de PD1-0103 reconoce un epítopo formado por las regiones de bucle BC y FG y por residuos de hebras p CC'FG de la lámina p frontal del dominio de Ig de tipo V de PD-1. Además, el epítopo incluye el árbol de glucosilación unido a N en la posición Asn58 que es parte del bucle BC de PD-1. Todas las CDR excepto CDR2 de la cadena ligera de Fab de pDl-0103 contribuyen al parátopo.

Un área de superficie de 1063 A2 de PD-1 está cubierta por Fab de PD1-0103 con 743 A2 contribuidos por la cadena pesada y 320 A2 por la cadena ligera. El análisis de la interfaz de unión con el programa PISA revela un patrón de interacción de Fab de PD1-0103 con el DEC de PD-1 por medio de 6 enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals. Los enlaces de hidrógeno de la cadena lateral se forman entre los residuos de CDR1 (Thr33) y CDR2 (Ser52, Arg56, Asp57) de la cadena pesada con Glu61 y Ser62 del bucle BC de PD-1. Los contactos de Van der Waals son impulsados principalmente por CDR3 de la cadena ligera y pesada, en particular Phe105 de HCDR3, y por Tyr32 de HCDR1 que están cerca de los residuos Val64 del bucle BC, Pro83 y de Ile126 y Leu128 del bucle FG . Se observan contactos de Van der Waals adicionales entre los residuos del bucle FG Pro130, Ala132, Ile134 con la CDR2 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera de Fab de PD1-0103. La cadena ligera de Fab de PD1-0103 se pone en contacto exclusivamente con el bucle FG de PD-1. No se proporciona ningún contacto por la CDR2 de la cadena ligera para la formación del complejo.

El árbol de glucosilación unido a N en la posición Asn58 de PD-1 es parte del epítopo e interactúa únicamente con residuos de la cadena pesada de Fab de PD1-0103.

El árbol de la cadena de glúcidos del núcleo (glucosilación unida a N) en la posición Asn58 de PD-1 tiene la siguiente estructura con respecto a los monosacáridos

[GlcNAc]= NGA = N-acetil-beta-D-galactosamina = 2-(acetilamino)-2-desoxi-beta-D-galactopiranosa

[FUC] = alfa-L-fucosa

[BMA] = beta-D-manopiranosa

[MAN] = alfa-D-manopiranosa

En la estructura, los glucanos del núcleo están bien definidos en la densidad de electrones, excepto una unidad de manosa. El resto de fucosa apunta a un bolsillo hidrófilo formado por PD-1 con CDR1 y CDR2. La unión de la fucosa está coordinada por una red de enlaces de hidrógeno con Ser30 y Ser31 de c DR1 conjuntamente con Glu61 y Gln99 de PD-1. Se proporcionan contactos adicionales por enlaces de hidrógeno de la primera GlcNac a Arg56 y los residuos de la región estructural Arg72, Asp73, Asn74 a Man.

Tabla 10: lista de contactos de PD1 - cadena pesada de Fab de PD1-0103

Tabla 11: lista de contactos de PD1 - cadena ligera de Fab de PD1-0103

Tabla 12: lista de contactos de PD1 de la cadena de glúcidos del núcleo en Asn58-cadena pesada de Fab de PD1-0103

Resumen

• El epítopo en PD1 se asemeja a una superficie plana

-> Unión principalmente por lámina b frontal y CDR3 de PD1

• Las interacciones implican contactos polares y de Van der Waals

• Gran área de superficie de interacción de PD1 con la cadena pesada de Fab

• La glucosilación en la posición Asn 58 participa en la unión de PD1 al fragmento Fab

• La unidad de fucosa ocupa el bolsillo formado por PD1 y la cadena pesada de Fab de PD1-0103 Ejemplo 9:

Reducción de la unión de anticuerpos a PD1 humana que no está glucosilada en Asn58 en comparación con la unión a PD1 humana que está glucosilada en Asn58 (caracterización por Biacore de anticuerpos anti-PD-1 para PD1 recombinante glucosilada y no glucosilada)

Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar los parámetros cinéticos de la unión entre PD1 glucosilada y PD1 humana recombinante no glucosilada. Por lo tanto, se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huPD1-DEC a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.

Se acoplaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (UR) de 20 |jg/ml de anticuerpo anti-IgG humana (GE Healthcare n.° BR-1008-39) sobre las cubetas de lectura 1 y 2 (de forma alternativa: 3 y 4) de un chip sensor CM5 en un Biacore T200 a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare.

La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se estableció la temperatura de la cubeta de lectura en 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra en 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.

Se inyectaron las muestras durante 20 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron a la segunda cubeta de lectura. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones de PD1 humana-DEC (glucosilada o no glucosilada) (200 nM, 66,6 nM, 22,2 nM, 7,4 nM, 2,46 nM y 0 nM) sobre cada muestra durante 200 s seguido de un tiempo de disociación de 0/2000 s (66,6 nM y 22,2 nM) y dos etapas de regeneración de 20 s con MgCl²3 M, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración.

Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación Biacore T200. Los valores de K^d, k^ay k^dresultantes se muestran en la tabla 13.

Tabla 13: constantes de velocidad cinéticas y constante de equilibrio determinadas por Biacore.

Existe una clara diferenciación entre la unión de PD-103-0312 a PD-1 aglucosilada y glucosilada en contraste con pembrolizumab y nuvolumab (véanse también las figuras 13A y 13 B).

Ejemplo 10:

Eficacia antitumoral in vivo de los anticuerpos frente a PD1 en combinación con un anticuerpo biespecífico de linfocitos T frente a CEA

Se produjeron los animales humanizados acondicionando ratones NOG con la posterior transferencia adoptiva de células madre hematopoyéticas humanas. Los ratones resultantes presentan una proporción quimérica entre leucocitos humanos y de ratón que varía de un 20 a un 85 % de las células derivadas humanas. En dicho modelo, los linfocitos T son funcionales y se pueden activar para destruir células tumorales por el anticuerpo biespecífico que se une a CEA y CD3 (que se describe en el documento WO2014/131712). A continuación, a dichos animales humanizados se les inyectó un millón de células tumorales positivas para CEA, carcinoma gástrico MKN45, por vía subcutánea en la localización lateral. El crecimiento del tumor se pudo evaluar midiendo el eje tridimensional del tumor por un compás calibrador dirigido por un operario, 3 veces a la semana (figura 14A y B). El día 9 después de la inyección del tumor, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en base al tamaño del tumor para tener grupos de animales homogéneos y se inició el tratamiento terapéutico. Con la excepción de los grupos de vehículo (figura xA y XB, círculos), a todos los grupos de ratones se les administró por vía intravenosa CEACD3TCB a una dosis de 2,5 mh/kg dos veces por semana. Además, cada grupo de ratones también se trató con un compañero de combinación: anti-PD1 (PD1-0103-0312) a 0,15 mg/kg semanalmente (figura 14A, cuadrados) o bien 1,5 mg/kg (figura 14B, cuadrados) semanalmente por vía intraperitoneal; nivolumab a 0,15 mg/kg semanalmente (figura 14A, rombos) o bien 1,5 mg/kg (figura 14B, rombos) semanalmente por vía intraperitoneal. Se presenta la media del tamaño del tumor dentro de un grupo de tratamiento a lo largo del tiempo. El grupo estaba compuesto por 9-10 ratones cada uno y la medición continuó hasta que hubo al menos 3 ratones por grupo. Se ha calculado el área bajo la curva estandarizada (ABCe) y se usó el análisis ANOVA de unidireccional para calcular la significación estadística.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une a PD1 humana, en el que el anticuerpo

i) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:58, o ii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:59, o iii) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:60, o iv) comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:61.

2. Un anticuerpo aislado que se une a PD1 humana, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:58.

3. Un anticuerpo aislado que se une a PD1 humana, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:59.

4. Un anticuerpo aislado que se une a PD1 humana, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:60.

5. Un anticuerpo aislado que se une a PD1 humana, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO:57 y una secuencia de VL de SEQ ID NO:61.

6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo IgG1 de longitud completa con mutaciones L234A, L235A y P329G de acuerdo con la numeración del índice EU.

7. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 de modo que se produzca el anticuerpo.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

11. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso como medicamento.

13. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento del cáncer.