JP6408555B2 - 融合タンパク質及びブロモドメイン阻害化合物の識別方法 - Google Patents
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Description
本特許出願は、2013年3月15日出願の米国出願第61/798,644号、及び2013年11月11日出願の米国出願第61/902,690号の優先権を主張し、これらの出願は参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
少なくとも1のクロマチン結合モジュール及び少なくとも1のレポーターモジュールを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる前記融合タンパク質。
(項目2)
少なくとも1のクロマチン結合モジュールを含む第1のクロマチン結合性ポリペプチドを含む項目1記載の融合タンパク質であって、第1のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも1の前記クロマチン結合モジュールが削除されている、第2のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも1のクロマチン結合モジュールによって置換されている及び/または置き換えられている、前記融合タンパク質。
(項目3)
少なくとも1のクロマチン結合モジュールを含む第1のクロマチン結合性ポリペプチドを含む項目1または2に記載の融合タンパク質であって、第1のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも1の前記クロマチン結合モジュールが、第2のクロマチン結合性ポリペプチドの少なくとも1のブロモドメインモジュールによって置き換えられている、前記融合タンパク質。
(項目4)
前記少なくとも1のレポーターモジュールが、少なくとも1の蛍光レポーターモジュールを含む、項目1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目5)
前記少なくとも1のレポーターモジュールが、EGFP、TurboGFP、dsRed2、dsRed−Express2またはZsGreenを含む、項目4記載の融合タンパク質。
(項目6)
核局在化シグナル(NLS)を含む、項目1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目7)
前記NSLがSV40ラージT抗原のNLSまたはヌクレオプラスミンのNLSである、項目6記載の融合タンパク質。
(項目8)
前記少なくとも1のクロマチン結合モジュールが、前記レポーターモジュールの5’に位置する、項目1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目9)
前記少なくとも1のクロマチン結合モジュールが、前記レポーターモジュールの3’に位置する、項目1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目10)
前記少なくとも1のクロマチン結合モジュールが、ブロモドメインモジュール、PHDフィンガーモジュール、クロモドメインモジュール、MBTドメインモジュール、チューダードメインモジュール、PWWPドメインモジュール、ADDドメインモジュール、Zf−CWドメインモジュール、アンキリンリピートモジュールまたはWD40モジュールである、項目1〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目11)
前記少なくとも1のクロマチン結合モジュールがブロモドメインモジュールである、項目10に記載の融合タンパク質。
(項目12)
前記少なくとも1のブロモドメインモジュールが、BRG1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、BRD1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24及び/またはZMYND8のいずれか1種の少なくとも1のブロモドメインを含む、項目11に記載の融合タンパク質。
(項目13)
前記少なくとも1のブロモドメインモジュールが、BRD2、BRD3、BRD4、BRD9、BRDT、及び/またはBRG1のいずれか1種の少なくとも1のブロモドメインを含む、項目11に記載の融合タンパク質。
(項目14)
前記少なくとも1のブロモドメインモジュールが、BRG1、BRPF1、CECR2、PCAF、及び/またはTAF1のいずれか1種の少なくとも1のブロモドメインを含む、項目11に記載の融合タンパク質。
(項目15)
前記少なくとも1のブロモドメインモジュールが、BRD4及び/またはBRD9の少なくとも1種のブロモドメインを含む、項目11に記載の融合タンパク質。
(項目16)
前記ブロモドメインポリペプチドが、BRG1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、BRD1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24、及び/若しくはZMYND8、または少なくとも1のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか1種のアミノ酸配列を含む、項目11〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目17)
前記ブロモドメインポリペプチドが、BRD2、BRD3、BRD4、BRD9、BRDT、及び/若しくはBRG1、または少なくとも1のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか1種のアミノ酸配列を含む、項目11〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目18)
前記ブロモドメインポリペプチドが、BRG1、BRPF1、CECR2、PCAF、及び/若しくはTAF1、または少なくとも1のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのいずれか1種のアミノ酸配列を含む、項目11〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目19)
前記ブロモドメインポリペプチドが、BRD4及び/若しくはBRD9、または少なくとも1のブロモドメインモジュールを含むそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、項目11〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目20)
前記ブロモドメインポリペプチドが全長ブロモドメインポリペプチドを含む、項目16〜19のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目21)
多量体化することができる、項目1〜20のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目22)
二量体、三量体または四量体を形成することができる、項目1〜21のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目23)
二量体を形成することができる、項目22記載の融合タンパク質。
(項目24)
四量体を形成することができる、項目22記載の融合タンパク質。
(項目25)
項目1〜24のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
(項目26)
項目25記載の核酸配列を含む発現カセット。
(項目27)
項目1〜24のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む細胞。
(項目28)
CHO―K1、COS−7、HEK293、HEK293T、HEK293FT、HeLa、MDCKまたはU2OS細胞である、項目27記載の細胞。
(項目29)
COS−7、HeLaまたはU2OS細胞である、項目28記載の細胞。
(項目30)
試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、
(a)項目27〜29のいずれか1項に記載の細胞を前記試験化合物に接触させることと、
(b)前記試験化合物が融合タンパク質の局在化を変化させるか、及び/または融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することと
を含み、
局在化の変化及び/またはフォーカスの形成の増加が、前記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示す、前記判定方法。
(項目31)
項目1〜29のいずれか1項に記載の融合タンパク質、核酸配列、発現カセットまたは細胞を備えるキット。
別段の表示がない限りにおいて、本発明の実施においては、(組換え技術を含む)分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術が用いられることとなり、これらの技術は当業者の技量の範囲内である。かかる技術は、「分子クローニング:実験室便覧」(“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”)、第2版(Sambrookら、1989);「オリゴヌクレオチド合成」(“Oligonucleotide Synthesis”)(M.J.Gait編、1984);「動物細胞培養」(“Animal Cell Culture”)(R.I.Freshney編、1987);「酵素学の方法」(”Methods in Enzymology”)(Academic Press,Inc.);「分子生物学における最近のプロトコル」(Current Protocols in Molecular Biology”)(F.M.Ausubelら編、1987、及び定期的な改訂版);「PCR:ポリメラーゼ連鎖反応」(“PCR:The Polymerase Chain Reaction”)(Mullisら編、1994);「分子クローニングの実務手引」(“A Practical Guide to Molecular Cloning”)(Perbal Bernard V.、1988)などの文献に詳しく説明されている。
本明細書において用いられる用語「クロマチン結合モジュール」とは、クロマチンと相互作用するクロマチン結合性ポリペプチドの領域及び/またはドメインの配列をいう。クロマチン結合モジュールとしては、以下のドメイン:ADD、アンキリンリピート、ブロモドメイン、クロモドメイン、MBT、PHDフィンガー、PWWP、チューダー、WD40又はZf−CW(Miyong Yunら、Cell Research(2011)、21:564〜578も参照されたく、該文献は、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる。)の少なくとも1を挙げることができるが、これらに限定されない。
100×分率(X/Y)
式中、Xは当該プログラムのAとBとの配列アラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN−2によって同一の一致として点数付けされたアミノ酸残基の数であり、YはBにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対する%で表したアミノ酸配列同一性は、BのAに対する%で表したアミノ酸配列同一性とは等しくならないであろうことが認識されることとなろう。特に別段の記載がない限りにおいて、本明細書において用いられる全ての%で表したアミノ酸配列同一性の値は、直前の段落で説明したように、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。
本明細書においては、ブロモドメインモジュールを含むポリペプチドを調節する化合物を識別するための化合物のスクリーニング方法、及び該方法において有用な組成物が提供される。特に、本明細書においては、少なくとも1のクロマチン結合モジュール及び少なくとも1のレポーターモジュールを含む融合タンパク質、並びに少なくとも1のクロマチン結合モジュール及び少なくとも1のレポーターモジュールを含む融合タンパク質を用いる、化合物のスクリーニング方法が提供される。
表1 ブロモドメインポリペプチド及びブロモドメインモジュール
表2 蛍光レポートモジュール
クロマチン結合モジュール及びクロマチン結合性ポリペプチドの変異体が、本明細書記載の方法において、及び本明細書記載の融合タンパク質における使用に有用である。ポリペプチドの保存的置換を、表3に「好ましい置換」との見出しの下に示す。かかる置換によって生物学的活性が変化する場合には、表3に「代表的置換」と名付けられた、あるいはアミノ酸の種別に関連して更に後述のより実質的な変化を導入し、生成物を選別してもよい。
表3。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性:Asp、Glu
(4)塩基性:His、Lys、Arg
(5)連鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
(7)大きな疎水性:ノルロイシン、Met、Val、Leu、Ile
本明細書においては、本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸、及び本明細書記載の融合タンパク質を含む核酸を含む発現カセット、ベクターが提供される。本明細書においては、単離された及び/または実質的に精製された融合タンパク質、並びに本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸(例えば、DNAまたはRNA)が提供される。更に、本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター及び発現カセットが提供される。
本明細書記載の方法のいずれかによって識別されたクロマチン結合モジュール阻害化合物は、治療方法において有用であり得る。
本明細書においては、本明細書記載の融合タンパク質、核酸、発現カセット、ベクター、及び/または細胞を含む、クロマチン結合モジュール阻害化合物を識別するために有用な物質を収納する製品もまた提供される。上記製品は、容器及び該容器上のまたは該容器に同伴するラベル又は添付文書を備える。適当な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、静注用溶液バッグ等が挙げられる。上記容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。上記容器は、それ自体であるか、またはクロマチン結合モジュール阻害化合物を識別するために有効な別な組成物と組み合わせられた組成物を保持する。
以下は、本発明の融合タンパク質及び融合タンパク質の使用方法の実施例である。本明細書に提供される一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
ブロモドメイン阻害化合物によるクロマチンからの遊離に際しての、核内のFPタグ付けしたブロモドメイン含有タンパク質上の蛍光タグ(FP)の局在化の変化を理解するために、FP−BRD4のある融合構成によって、核内において、FPタグ付けしたタンパク質が阻害剤依存的に再局在化し、フォーカスが形成された。
蛍光タンパク質(fluorescent protein)(FP)タグ(dsRed2、dsRed−Express2、EGFP、Emerald GFP、mCherry、mOrange2、TurboGFP、またはZsGreen)を、ヒトEF1プロモーターの制御下でTet−ON 3G転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトBRD4をコードするDNA配列(BRD4イソ型ショート(BRD4 isoform short)のアミノ酸残基1〜719;NCBI NP_055114.1)のインフレームの上流にクローニングした。誘導性TRE3Gプロモーターの下流にあるFP−BRD4タンパク質の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、U2OS骨肉腫細胞(ATCC、HTB−96)を感染させ、15μg/mlのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のNunc(商標)Lab−Tek(商標)IIチャンバースライドまたは高含有量顕微鏡観察用の96ウェルプレートに播種した。細胞を2μg/mlのドキシサイクリンで16時間処理し、その後DMSOまたはBRD4阻害剤のいずれかと共に2〜4時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するZeiss LSM510倒立型共焦点顕微鏡またはLSM780共焦点顕微鏡を用いて、FPタグ付けしたBRD4タンパク質の局在化を調べた。得られた画像をZeiss ZENソフトウェアを用いて解析した。高含有量顕微鏡観察に関しては、化合物で処理した細胞を4%ホルムアルデヒドで15分間固定化し、PBS緩衝液で2回洗浄した。画像をImageXpress Micro(Molecular Devices社)上で取得し、MetaXpress(登録商標)(Molecular Devices社)を用いて解析した。
異なる蛍光タンパク質(FP)でタグ付けした誘導性BRD4を安定して有するU2OS細胞株を作製した。N末端FPタグはdsRed2、dsRed−Express2、EGFP、Emerald GFP、mCherry、mOrange2、TurboGFP、またはZsGreenを含んでいた(図1)。FP−BRD4発現をドキシサイクリンによって誘導し、細胞を、ビヒクル(DMSO)またはBRD4ブロモドメイン阻害剤JQ1のいずれかで4時間処理し、その後共焦点顕微鏡を用いて生細胞を画像化した。JQ1(CAS番号126524−70−4)は、BRD2、BRD3、BRD4及びBRDTのブロモドメインを阻害する化合物である。DMSOで処理した場合には、FPでタグ付けしたBRD4タンパク質がクロマチンに結合し、核内に拡散して分布した(図2)。興味深いことに、JQ1処理により、EGFP−BRD4、ZsGreen−BRD4、DsRed−Express2、DsRed2−BRD4及びTurboGFP−BRD4のタンパク質が再局在化し、蛍光ドット/フォーカスが形成された。しかし、JQ1によるmOrange2−BRD4、mCherry−BRD4及びEmerald−GFP−BRD4のBRD4ブロモドメインの阻害は、核内のFPタグ付けした融合タンパク質の局在化を変化させなかった。これらの知見は、BRD4が、多量体(例えば、二量体または四量体)を形成する傾向を有する蛍光タンパク質でタグ付けされた場合に、蛍光BRD4融合タンパク質が、ブロモドメイン阻害剤に応答して凝集し、ドット/フォーカスを形成したことを示した。重要なことは、両方のブロモドメインにおいて点変異を有する変異体ZsGreen−BRD4タンパク質はクロマチンに結合することができず、従ってブロモドメイン阻害剤の効果と類似し、ブロモドメイン阻害剤の非存在下であっても、核内のドット/フォーカスに局在化した(図3B)。野生型BRD4融合タンパク質は、同じ条件下で拡散した局在化を示した(図3A)。ブロモドメイン阻害化合物の、クロマチンへのブロモドメインの結合の防止を更に分析するために、クロマチンをDNA結合色素ヘキスト33342でマークした。図4に示すように、ZsGreen−BRD4タンパク質とクロマチンとの有意な共局在化があった。一方、ブロモドメイン阻害化合物BDi−Aでの処理により、ZsGreen−BRD4の蛍光ドットが生成し、それらのドットはクロマチンと重なり合わなかった(図4)。まとめると、これらの結果は、ブロモドメインの結合活性が、ブロモドメイン阻害化合物によって阻害される、またはブロモドメイン内の点変異によって消失した場合に、FP−BRD4タンパク質が再局在してドット/フォーカスを形成したことを実証した。
ブロモドメインタンパク質はクロマチンと相互作用し、様々な翻訳後修飾を有するヒストン尾部に結合する能力をもつ。可能性のある、但し非限定的な一モデルを図7に示す。本明細書に示すように、BRD4ブロモドメイン阻害化合物及びBRD4のブロモドメインにおける変異によって、BRD4タンパク質がクロマチンから遊離した。BRD4を、多量体(例えば、二量体または四量体)を形成する能力を有するFPでタグ付けした場合には、FPタグの親和性が、核内でFPタグ付けしたBRD4の凝集を促進し、ドット/フォーカスを形成させた。更に、本明細書に示すように、単量体のFP(mOragne2及びmCherry)でタグ付けしたBRD4は、阻害剤依存性のドット/フォーカスの形成を示さなかった(図2)。加えて、結合能を無効にしたBRD4ブロモドメインの変異により、BRD4ブロモドメイン阻害剤の非存在下であっても、「ドット」表現型が生成する(図3)。阻害剤に応答したZsGreen−BRD4の再局在化、凝集及びドット/フォーカス形成は、ブロモドメインの結合親和性の阻害に起因していた。このシステムにおいて、上記FPタグは、タグ付けしたブロモドメインタンパク質の凝集及びフォーカスの形成を促進することを始めとする複数の目的を果たし、且つ検知方法としての役割を果たした。
全長ZsGreen及びBRD2を含有する融合タンパク質を細胞内で発現させて、BRD2ブロモドメイン阻害化合物に応答した局在化の変化を分析した。
蛍光タンパク質(ZsGreen)を、ヒトEF1プロモーターの制御下でTet−ON 3G転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトBRD2をコードするDNA配列(NP_001106653.1)のインフレームの上流にクローニングした。誘導性TRE3Gプロモーターの下流にあるZsGreen−BRD2をコードする領域の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、U2OS骨肉腫細胞(ATCC、HTB−96)を感染させ、15μg/mlのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のNunc(商標)Lab−Tek(商標)IIチャンバースライドに播種した。細胞を2μg/mlのドキシサイクリンで16時間処理し、その後DMSOまたはBRD2阻害剤のいずれかと共に4時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するZeiss LSM510倒立型共焦点顕微鏡またはLSM780共焦点顕微鏡を用いて、FPタグ付けしたBRD2の核内の局在化を調べた。得られた画像をZeiss ZENソフトウェアを用いて解析した。
N末端にZsGreenタグ付けした誘導性の全長BRD2(図8A)を安定的に有するU2OS細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。ZsGreen−BRD2タンパク質が、ブロモドメイン阻害剤によりクロマチンから遊離した後に、ドット/フォーカスを形成するか否かを試験するために、安定したU2OS/ZsGreen−BRD2細胞をドキシサイクリンで誘導し、10μΜのビヒクル(DMSO)またはブロモドメイン阻害剤JQ1(CAS番号126524−70−4)のいずれかで4時間処理した後に、共焦点顕微鏡を用いて生細胞を画像化した。JQ1処理により、核内でZsGreen−BRD2タンパク質が再局在化し、ドット/フォーカスが形成された(図8B)。この阻害剤依存性のフォーカス形成表現型は、二量体または多量体を形成するFPタグと融合したBRD4の場合に観察された凝集表現型と類似していた(図2)。
全長ZsGreen及びBRD3を含有する融合タンパク質を細胞内で発現させて、BRD3ブロモドメイン阻害化合物に応答した局在化の変化を分析した。
蛍光タンパク質(ZsGreen)を、ヒトEF1プロモーターの制御下でTet−ON 3G転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトBRD3をコードするDNA配列(NP_031397.1)のインフレームの上流にクローニングした。誘導性TRE3Gプロモーターの下流にあるZsGreen−BRD3をコードする領域の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、U2OS骨肉腫細胞(ATCC、HTB−96)を感染させ、15μg/mlのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のNunc(商標)Lab−Tek(商標)IIチャンバースライドに播種した。細胞を2μg/mlのドキシサイクリンで16時間処理し、その後DMSOまたはBRD3阻害剤のいずれかと共に4時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するZeiss LSM510倒立型共焦点顕微鏡またはLSM780共焦点顕微鏡を用いて、FPタグ付けしたBRD3の核内の局在化を調べた。得られた画像をZeiss ZENソフトウェアを用いて解析した。
N末端にZsGreenタグ付けした誘導性の全長BRD3(図9A)を安定的に有するU2OS細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。ZsGreen−BRD3タンパク質が、ブロモドメイン阻害剤によりクロマチンから遊離した後に、ドット/フォーカスを形成するか否かを試験するために、安定したU2OS/ZsGreen−BRD3細胞をドキシサイクリンで処理し、10μΜのビヒクル(DMSO)またはブロモドメイン阻害剤JQ1(CAS番号126524−70−4)のいずれかと共に4時間インキュベートした後に、生細胞を画像化した。ZsGreen−BRD2及びZsGreen−BRD4について得られた知見と類似して、ZsGreen−BRD3タンパク質は、BRD3ブロモドメイン阻害化合物JQ1に応答して蛍光ドット/フォーカスを形成した(図9B)。
BRD9ブロモドメインを阻害する化合物の細胞上の効果を判定するための方法を確立するために、この例における実験を設計し実施した。全長BRD9及び蛍光タンパク質を含有する融合タンパク質を細胞内で発現させて、ブロモドメイン阻害剤により引き起こされる局在化の変化及びフォーカスの形成を分析した。
蛍光タンパク質(ZsGreenまたはmVenus)を、ヒトEF1プロモーターの制御下でTet−ON 3G転写因子を発現するレンチウィルスベクター中のヒトBRD9をコードするDNA配列(NCBI NP_076413.3)のインフレームの下流にクローニングした。誘導性TRE3Gプロモーターの下流にあるBRD9−ZsGreen及びBRD9−ZsGreenをコードする領域の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、U2OS骨肉腫細胞(ATCC、HTB−96)を感染させ、15μg/mlのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のNunc(商標)Lab−Tek(商標)IIチャンバースライドに播種した。細胞を2μg/mlのドキシサイクリンで16時間処理し、その後DMSOまたはBRD9阻害剤(BDi−B、BDi−C及びBDi−D)のいずれかと4時間インキュベートした後に画像化した。加熱ステージを有するZeiss LSM510倒立型共焦点顕微鏡またはLSM780共焦点顕微鏡を用いて、FPタグ付けしたBRD9の核内の局在化を調べた。得られた画像をZeiss ZENソフトウェアを用いて解析した。
C末端にZsGreenタグ付けした誘導性の全長BRD9(図10A)を安定的に有するU2OS細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。ブロモドメイン阻害のBRD9−ZsGreenの局在化に対する効果を更に調べるために、蛍光融合タンパク質の発現をドキシサイクリンによって誘導し、細胞を10μΜのビヒクル(DMSO)またはBRD9ブロモドメイン阻害剤(化合物BDi−CまたはBDi−D)のいずれかで4時間処理した後に、共焦点顕微鏡を用いて生細胞を画像化した。BRD9−ZsGreenの局在化は、両方のBRD9阻害剤に応答して、拡散した分布から蛍光ドット/フォーカスへと変化した(図10B)。これらの結果は、BRD9−ZsGreenがBRD9ブロモドメイン阻害剤によってクロマチンから排除され、その後蛍光ドット/フォーカスを形成したことを示した。更に、BRD9のブロモドメインに点変異(N216Y)を導入し、その結合能を無効にした場合には(図11A)、クロマチン阻害化合物の非存在下であっても、クロマチンに対する結合親和性のない変異体BRD9−ZsGreenが蛍光ドットを形成した(図11B)。まとめると、このブロモドメイン変異体タンパク質の「ドット」表現型もまた、化合物処理した野生型BRD9−ZsGreenの「ドット」表現型が、BRD9ブロモドメインの機能的破壊に起因することを示した。
ブロモドメイン含有タンパク質の他の領域の非存在下であり、レポーターモジュール(ここでは蛍光タンパク質タグ)を伴う、アッセイ方法を確立し且つ細胞内での阻害剤活性を測定するための、ブロモドメインモジュールの使用を検討した。
核局在化配列の3のコピー(DPKKKRKV)(配列番号1)を、CECR2ブロモドメインをコードするDNA配列(NCBI NP_113601.2のアミノ酸残基424〜538)であって、それにZsGreenコード化配列が続く上記配列のN末端に融合させた。この融合発現構築物を、ヒトEF1プロモーターの制御下でTet−ON 3G転写因子を発現するレンチウィルスベクター中にクローニングした。誘導性TRE3Gプロモーターによって制御されるNLS−CECR2.BD−ZsGreenの発現をドキシサイクリンにより誘導した。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、U2OS骨肉腫細胞(ATCC、HTB−96)を感染させ、15μg/mlのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を顕微鏡分析用の6ウェルまたは96ウェルプレートに播種した。細胞を2μg/mlのドキシサイクリンで16時間処理し、その後DMSOまたはCECR2阻害剤のいずれかと共に4時間インキュベートした後、4%ホルムアルデヒドで固定化した。ニコン社倒立型蛍光顕微鏡(Eclipse TS100)またはImageXpress Micro(Molecular Devices社)を用いて、NLS−CECR2.BD−ZsGreenの核内における局在化を調べた。
誘導性NLS−CECR2.BD−ZsGreen(図13A)を安定的に有するU2OS細胞株を、レンチウィルスの感染及びブラストサイジン選択により生成させた。融合タンパク質は、CECR2ブロモドメイン阻害剤の非存在下で、核内に拡散して局在化し、均一な分布を示した。CECR2阻害剤(化合物BDi−E)と共にインキュベートすることにより、ZsGreenタグ付けしたタンパク質の蛍光ドット/フォーカスが形成された(図13B)。このことは、CECR2.BDのクロマチンへの結合が上記阻害剤によって阻害され、核質に遊離されたことを示した。遊離のNLS−CECR2.BD−ZsGreen融合タンパク質はその後凝集し、蛍光体ドット(フォーカス)を形成した。
細胞における阻害活性を判定するためのアッセイ方法を確立するために、タンデムブロモドメインモジュールをタグ(例えば、蛍光タンパク質タグ)と共に用いるという概念であって、但しブロモドメイン含有タンパク質の他の領域は必ずしも用いないとの上記概念を探索するために、以下の実験を行った。
核局在化配列の3のコピー(DPKKKRKV)(配列番号1)を、TAF1(NCBI_NP 004597.2のアミノ酸残基1406〜1640)の2のタンデムのブロモドメインのコード化DNA配列であって、それにZsGreenコード化配列が続く上記配列のN末端に融合させた。Q5(登録商標)部位特異性変異誘発キット(Site−Directed Mutagenesis Kit)(New England BioLabs社)を用いて、1481及び1604の位置のアスパラギン残基がチロシンに変異したブロモドメイン変異体対立遺伝子を生成させた。野生型及び変異体融合発現構築物の両方を、ヒトEF1プロモーターの制御下でTet−ON 3G転写因子を発現するレンチウィルスベクター中にクローニングした。誘導性TRE3Gプロモーターによって制御されるNLS−TAF1.BD−ZsGreenの発現をドキシサイクリンにより誘導した。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、U2OS骨肉腫細胞(ATCC、HTB−96)を感染させ、15μg/mlのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を顕微鏡観察用の6ウェルまたは96ウェルプレートに播種した。細胞を2μg/mlのドキシサイクリンで16時間処理し、その後DMSOまたはCECR2阻害剤のいずれかと共に4時間インキュベートした後、4%ホルムアルデヒドで固定化した。加熱ステージを有するZeiss LSM510倒立型共焦点顕微鏡またはLSM780共焦点顕微鏡を用いて、核内の蛍光タンパク質の局在化を調べた。得られた画像をZeiss ZENソフトウェアを用いて解析した。
誘導性NLS−TAF1.BD1.BD2−ZsGreen(図15A)を安定して有するU2OS細胞株をドキシサイクリンと共にインキュベートし、蛍光タンパク質の発現を誘導し、その後ビヒクル(DMSO)またはTAF1ブロモドメイン阻害剤で4時間処理した。ビヒクル比較対照においては、ZsGreenタグ付けしたTAF1ブロモドメインが核内に拡散して分布し、これは融合タンパク質がクロマチンに結合したことを示していた。一方、TAF1ブロモドメイン阻害化合物(BDi−F)の存在下では、タグ付けしたタンパク質が再局在化し、蛍光ドット/フォーカスを形成した(図15B)。これらの結果は、ブロモドメイン阻害剤が、FPタグ付けしたブロモドメインタンパク質のクロマチンへの結合を破壊し、FPタグ付けしたブロモドメインタンパク質が、クロマチンから遊離した後に蛍光ドット/フォーカスを形成したことを示した。更に、ブロモドメインの結合能を消失させる点変異が、NLS−TAF1.BD1.BD2−ZsGreenの両方のTAF1ブロモドメインに導入され(図16A)、得られたレンチウィルス構築物を用いて安定したU2OS細胞を作製した場合に、ブロモドメイン変異体タンパク質は、ブロモドメイン阻害化合物の非存在下であっても、蛍光ドット/フォーカスを形成した(図16B)。従って、2のブロモドメインモジュールを含有するFP融合タンパク質は、ブロモドメイン阻害化合物に応答して蛍光ドット/フォーカスを形成し、この型式の改質された細胞系を用いて、潜在的なブロモドメイン阻害化合物の細胞内活性を測定することができる。
この実施例における実験は、全長ブロモドメインのブロモドメインモジュールをキメラブロモドメインモジュールで置換することにより、別なブロモドメインについての蛍光の再局在化/ドット形成アッセイを開発するためのタンパク質を含有する、全長ブロモドメインの骨格を用いることの実現可能性を判定するために設計し実行した。
蛍光タンパク質(ZsGreen)を、ヒトBRD9をコードするDNA配列(NCBI NP_076413.3)であって、当該ブロモドメインをコードするDNA配列(アミノ酸残基114〜253)が、ヒトBAZ2Bのブロモドメイン配列(NCBI NP_038478.2、アミノ酸残基2039〜2166)またはヒトPCAF/KAT2B(NCBI NP_003875.3、アミノ酸残基696〜820)によって置換された上記DNA配列のインフレームの下流にクローニングした。キメラBAZ2B−BRD9−ZsGreenまたはPCAF−BRD9−ZsGreen融合配列を、ヒトEF1プロモーターの制御下でTet−ON 3G転写因子を発現するレンチウィルスベクター中にクローニングした。誘導性TRE3Gプロモーターの下流にあるZsGreenタグ付けしたキメラタンパク質の発現を、ドキシサイクリンにより誘導することができた。これらの発現プラスミド構築物を用いて生成されたレンチウィルスを用いて、U2OS骨肉腫細胞(ATCC、HTB−96)を感染させ、15μg/mlのブラストサイジン選択下で安定した細胞を形成した。安定した細胞を共焦点顕微鏡観察用のNunc(商標)Lab−Tek(商標)IIチャンバースライドに播種した。細胞を2μg/mlのドキシサイクリンで16時間処理し、キメラ蛍光タンパク質の発現を誘導した。BAZ2B−BRD9−ZsGreenを発現する細胞を、DMSOまたはBAZ2B阻害剤のいずれかと共に4時間インキュベートし、その後画像化した。PCAF−BRD9−ZsGreenを発現する細胞を、DMSOまたはPCAF阻害剤のいずれかと共に16時間インキュベートし、その後画像化した。加熱ステージを有するZeiss LSM510倒立型共焦点顕微鏡またはImgaeXpress Micro(Molecular Devices社)を用いてZsGreenタグ付けしたキメラタンパク質の局在化を調べた。得られた画像をZeiss ZENソフトウェアを用いて解析した。
他のブロモドメインについてのアッセイシステムを確立するためにBRD9−ZsGreen再局在化アッセイ(実施例4に記載)を用いることの可能性を探索するために、BRD9ブロモドメインがBAZ2Bのブロモドメインで置換されたキメラBRD9−ZsGreen発現構築物(BAZ2B−BRD9−ZsGreenと呼ぶ)を生成させた。誘導性BAZ2B−BRD9−ZsGreen(図17A)を安定して有するU2OS細胞をドキシサイクリンと共にインキュベートして蛍光タンパク質の発現を誘導し、続いてビヒクル(DMSO)またはブロモドメイン阻害化合物で処理した。ブロモドメインの上流に位置するBRD9の核局在化配列が、ZsGreenタグ付けしたキメラタンパク質を核に導いた。ビヒクルの比較対象においては、このキメラタンパク質の分布は核内に拡散した。一方、BAZ2Bブロモドメイン阻害化合物(BDi−G)による処置はキメラタンパク質の局在化を変化させ、蛍光ドット/フォーカスを形成した(図17B)。これらの結果は、BAZ2B阻害剤がBAZ2B−BRD9−ZsGreenタンパク質とクロマチンとの間の相互作用を破壊し、続いて、ZsGreenタグの凝集特性に起因して、蛍光ドット/フォーカスが形成されたことを示した。
Claims (11)
- 試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、
(a)融合タンパク質を含む細胞を前記試験化合物に接触させることであって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる、ことと、
(b)前記試験化合物が融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することと
を含み、
フォーカスの形成の増加が、前記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示し、各融合タンパク質が、少なくとも1のブロモドメイン及び多量体化することができる蛍光タンパク質であるレポーターモジュールを含む前記判定方法。 - 前記細胞がCHO―K1、COS−7、HEK293、HEK293T、HEK293FT、HeLa、MDCKまたはU2OS細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞がCOS−7、HeLaまたはU2OS細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記レポーターモジュールが、EGFP、TurboGFP、dsRed2、dsRed−Express2またはZsGreenである、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が核局在化シグナル(NLS)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記NSLがSV40ラージT抗原のNLSまたはヌクレオプラスミンのNLSである、請求項5に記載の方法。
- 前記ブロモドメインが、BRG1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、BRD1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24及び/またはZMYND8のいずれか1種の少なくとも1のブロモドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ブロモドメインが、BRD2、BRD3、BRD4、BRD9、BRDT、及び/またはBRG1のいずれか1種の少なくとも1のブロモドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ブロモドメインが、BRG1、BRPF1、CECR2、PCAF、及び/またはTAF1のいずれか1種の少なくとも1のブロモドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ブロモドメインが、BRD4及び/またはBRD9の少なくとも1種のブロモドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であるかの判定方法であって、
(a)融合タンパク質を含む細胞を前記試験化合物に接触させることであって、複数の融合タンパク質がフォーカスを形成することができる、ことと、
(b)前記試験化合物が融合タンパク質フォーカスの形成を増加させるかを判定することと
を含み、
フォーカスの形成の増加が、前記試験化合物がブロモドメイン阻害化合物であることを示し、各融合タンパク質が、少なくとも1のブロモドメイン及び多量体化することができる蛍光タンパク質であるレポーターモジュールを含み、前記レポーターモジュールがEGFP、TurboGFP、dsRed2、dsRed−Express2またはZsGreenである、前記判定方法。
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