CN108690119B - 一种伊文思蓝修饰的多肽类前药及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多肽类药物前药，它是单甲基澳瑞他类药物或者美坦新和伊文思蓝形成的前药，其结构式如式(I)；其中，R1为
Figure DDA0001683611300000011
或者‑CH2‑中的一种；R2为多肽类药物单甲基澳瑞他汀类或者美坦新结构中的一种；m和n为重复单元数，均为0‑4的整数。本发明的多肽类药物前药在体内外均具有优异的肿瘤细胞摄取，并且有一部分前药还体现出显著的癌细胞抑制效果。本发明还提供所述的前药的制备方法及所述前药在制备癌症治疗药物中的应用。

Description

一种伊文思蓝修饰的多肽类前药及其制备和应用
技术领域
本发明属于纳米医药、药物控制释放技术领域，尤其涉及一种伊文思蓝和单甲基澳瑞他汀类药物或者美坦新形成的前药、其制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
癌症是全球发病和死亡的主要原因之一。根据世界卫生组织统计，2012年全球约有1400万新病例，并预计在未来二十年新病例的数量将增加约70％。2015年癌症造成全球880万人死亡，其中约70％的癌症死亡发生在低收入和中等收入国家。目前，化疗是癌症的主要治疗方法之一。传统的化疗药物，如喜树碱(camptothecin)、紫杉醇(paclitaxel)、阿霉素(doxorubicin)等，往往面临着疗效不明显，而且有着不良严重的毒副作用。近年来，因为极强的细胞毒性，多肽类药物，如单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(Monomethyl auristatin F，MMAF)、美坦新(Mertansine,DM1)受到广泛的关注。然而，大多数多肽类药物在水中溶解度低，同时对正常的细胞造成非特异性杀伤，因而不可直接用于癌症治疗。目前，多肽类药物主要用于制备抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates，ADC)。ADC药物兼具抗体的高特异性和细胞毒药物对肿瘤的强效作用，代表了下一代抗体技术的发展方向。但是ADC依然存在局限性：首先，很多癌症没有特异性抗原，很难找到合适的抗体，从而导致ADC的适用癌症有限；其次，一些ADC的依然存在疗效低、价格昂贵、副作用大的特点。比如，首个被美国食品和药物管理局(FDA)批准的ADC-吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumabozogamicin，吉妥珠单抗奥酯)已经被辉瑞公司主动下市。因而有必要进一步开发多肽类药物的其他投递方式，并用于癌症治疗。
纳米药物已被广泛研究用于癌症治疗。纳米颗粒的使用不仅可以改善这些药物的水分散性，而且还可以增强它们的药代动力学和生物体内分布，改善治疗效果和减少副作用。小分子两亲性前药组装成的纳米颗粒受到广泛研究。小分子两亲性药物，一般由疏水性的化疗药物连接到亲水性小分子，例如低聚乙二醇、多肽序列、或另一种亲水性药物。与聚合物-药物偶联物(polymer-drug conjugates)相比，小分子两亲性前药可以比较容易地合成，具有特定的化学结构和高的药物负载能力。然而，由于临界聚集浓度较高，药物两亲物不能在体内维持其纳米结构，进而不能受益于纳米尺寸载体的增强的渗透性和保留(EPR)效应。
白蛋白是血液中最常见的蛋白质，约7纳米大小，具有约20天的长血液半衰期。由于比较大的尺寸，纳米结构的EPR效应最早就是通过使用白蛋白和伊文思蓝(Evans Blue)结合发现的。因此，有必要发明一种能够利用白蛋白做蛋白载体的多肽类药物，如单甲基澳瑞他汀(Monomethyl auristatin)类药物或者美坦新(Mertansine,DM1)，与伊文思蓝形成的两亲性小分子前药。目前，国内外对于单甲基澳瑞他汀类药物或者美坦新(Mertansine,DM1)的研究主要集中于抗体-药物偶联物，尚无单甲基澳瑞他汀类或者美坦新(Mertansine,DM1)两亲性小分子前药被报道。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种单甲基澳瑞他汀类或者美坦新(Mertansine,DM1)的前药，可作为小分子两亲性药物，在体内外均具有优异的肿瘤细胞摄取，并体现出显著的癌细胞抑制效果。
本发明的另一目的是提供制备单甲基澳瑞他汀类或者美坦新(Mertansine,DM1)前药的方法。
本发明的再一目的是提供所述的单甲基澳瑞他汀类或者美坦新(Mertansine,DM1)前药在制备癌症治疗药物中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
首先，本发明提供一种多肽类药物前药，它是单甲基澳瑞他汀类或者美坦新(Mertansine,DM1)和伊文思蓝形成的前药，其结构式如式(I)
Figure BDA0001683611280000021
其中，
R1为
Figure BDA0001683611280000022
或者-CH2-中的一种；
R2为多肽类药物，选自单甲基澳瑞他汀类或者DM1结构中的一种；
m和n为重复单元数，均为0-4的整数。
本发明优选的方案中，所述的多肽类药物是结构为式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)或者式(VI)所示的任意一种：
Figure BDA0001683611280000031
Figure BDA0001683611280000041
本发明优选的一种方案中，所述的式(I)中的m＝3，n＝2，R1为
Figure BDA0001683611280000042
本发明进一步优选的方案中，所述的伊文思蓝与单甲基澳瑞他汀类药物形成的前药是结构如下式(VII)或者(VIII)所示的任意一种：
Figure BDA0001683611280000051
本发明另一种优选的方案中，所述的式(I)中的m＝1，n＝0，R1为-CH2-。
本发明进一步优选的方案中，所述的伊文思蓝与单甲基澳瑞他汀类药物形成的前药是结构如下式(IX)：
Figure BDA0001683611280000052
本发明优选的方案中，所述的式(I)中的m和n均为1，R1为-CH2-：
本发明优选的方案中，所述的伊文思蓝与美坦新形成的前药是结构如下式(X)：
Figure BDA0001683611280000061
本发明还提供一种制备所述的伊文思蓝-单甲基澳瑞他汀类的前药的方法，是以含马来酰亚胺的单甲基澳瑞他汀为原料，在有机溶剂/磷酸盐缓冲液混合溶液中，通过与带有巯基的伊文思蓝反应，制成伊文思蓝-单甲基澳瑞他汀前药。
本发明所述的制备方法中，制备所述的式(VII)或(VIII)或(IX)的前药的方法，记作制备方法I，具体包括以下步骤：在有机溶剂/磷酸盐缓冲液混合溶液中，加入EB-SH或者EB1-SH，和VcMMAE或者VcMMAF，常温搅拌过夜，高效液相色谱纯化得到所述的式(VII)，(VIII)或(IX)前药；
本发明所述制备方法I优选的一种实施方式中，制备了式(VII)所示的前药，其合成路线如下：
Figure BDA0001683611280000062
具体包括如下步骤：
在有机溶剂/磷酸盐缓冲液混合溶液中，加入EB1-SH和VcMMAE，常温搅拌过夜，高效液相色谱纯化，制备得到式(VII)所示前药：EB1-VcMMAE。
本发明所述制备方法I优选的另一种实施方式中，制备了式(VIII)所示的前药，其合成路线如下：
Figure BDA0001683611280000071
具体包括如下步骤：
在有机溶剂/磷酸盐缓冲液混合溶液中，加入EB1-SH和VcMMAF，常温搅拌过夜，高效液相色谱纯化，制备得到式(VIII)所示前药：EB1-VcMMAF。
本发明所述制备方法I优选的再一种实施方式中，制备了式(IX)所示的前药，其合成路线如下：
Figure BDA0001683611280000081
本发明还提供一种制备所述的伊文思蓝-美坦新的前药的方法，是以美坦新为原料，在有机溶剂/磷酸盐缓冲液混合溶液中，通过与带有马来酰亚胺的伊文思蓝反应，制成伊文思蓝-美坦新前药。该方法记作制备方法II，具体包括以下步骤：在有机溶剂/磷酸盐缓冲液混合溶液中，加入EB-Mal，和DM1，常温搅拌过夜，高效液相色谱纯化得到所述的式(X)前药：EB-DM1；其合成路线如下：
Figure BDA0001683611280000082
本发明还提供所述的伊文思蓝-单甲基澳瑞他汀前药或者伊文思蓝-美坦新的前药在制备癌症治疗药物中的应用。
本发明设计和合成的伊文思蓝-单甲基澳瑞他汀前药或者伊文思蓝-美坦新的前药是新型药物两亲性前药，在体外能够自组装成纳米粒子，在体内和白蛋白结合，形成两亲性前药/白蛋白复合体。本发明所述的伊文思蓝-单甲基澳瑞他汀前药前药制备简单，具有确定的化学结构和固定的高药物量，而且可以直接重悬浮于水溶液中，并自组装成直径为100nm左右的纳米颗粒。纳米颗粒的形成提供了具有高水分散性的前药。试验证明本发明的多肽类两亲性前药能被癌细胞有效内吞，并且能够在多种类型的癌细胞中体现很强的细胞毒性。本发明中使用的链接基团结构在血液中循环稳定，从而降低了长时间血液循环带来的毒副作用。比如，本发明使用的缬氨酸-瓜氨酸(valine-citrulline，Vc)链接基团只在溶酶体中被酶降解，因而在血液循环中十分稳定。
现有技术中，与聚合物-药物形成的纳米颗粒相比，常规的小分子药物两亲性前药的一个潜在缺点是其在体内血液循环中在稀释条件下的相对低的稳定性。但是本发明中，通过EB与白蛋白结合，EB两亲性前药能够从114nm纳米颗粒转化为7nm的白蛋白/前药复合物。体内PET成像研究证实，本发明中的药物两亲性前药具有很长的血液循环，并能够在肿瘤中富集。在注射后48小时，EB-VcMMAE的半衰期和曲线下面积(AUC)比VcMMAE分别改善了10倍和23倍。24小时时，EB-VcMMAE的肿瘤积累相对于VcMMAE增加了17倍。本发明的小分子两亲性前药对人神经胶质瘤细胞系U87MG的荷瘤小鼠具有优异的抗癌功效。总体而言，本发明制备的小分子两亲性前药具有极强的临床转化价值，为小分子药物递送系统的开发开辟了一种新的途径。
附图说明
图1为实施例1中使用的EB-SH的LC-MS质谱图。
图2为实施例1中制得的EB-VcMMAE的LC-MS质谱图。
图3为实施例2中使用的EB1-SH的ESI-MS质谱图。
图4为实施例2制得的EB1-VcMMAE的ESI-MS质谱图。
图5为实施例3制得的EB-DM1的ESI-MS质谱图。
图6为实施例4所得EB-VcMMAE的水合直径分布图。
图7为实施例4所得EB-VcMMAE的TEM图像。
图8为实施例5所得EB-DM1的TEM图像。
图9为实施例6中EB-VcMMAE具有或不具有白蛋白的荧光光谱图。
图10为实施例6中EB-DM1具有或不具有白蛋白的荧光光谱图。
图11体现了实施例7实验中MMAE、VcMMAE和EB-VcMMAE对U87MG的体外细胞毒性。
图12体现了实施例7实验中MMAE、VcMMAE和EB-VcMMAE对HELA的体外细胞毒性。
图13体现了实施例7实验中MMAE、VcMMAE和EB-VcMMAE对HCT116的体外细胞毒性。
图14体现了实施例7实验中DM1和EB-DM1对U87MG的体外细胞毒性。
图15体现了实施例7实验中DM1和EB-DM1对HELA的体外细胞毒性。
图16体现了实施例7实验中DM1和EB-DM1对HCT116的体外细胞毒性。
图17为实施例8中共焦显微镜图像，显示了EB-VcMMAE的细胞内吞。其中蓝色(左上图)＝Hoechst(核染色)，绿色(右上图)＝Lyso Green跟踪剂(溶酶体)，红色(左下图)＝来自前药的EB，右下图为合成影像图。
图18为实施例9中使用的NOTA-EB-VcMMAE的合成路线图。
图19为实施例9中使用的NOTA-VcMMAE的合成路线图。
图20为实施例9中静脉注射放射性药物后不同时间U87MG肿瘤携带小鼠的代表性全身冠状(Coronal)和横向(Trans)的正电子发射计算机断层扫描(PET)图像。其中，左半部为静注[64Cu]标记的NOTA-EB-VcMMAE的图像，右半部为静注[64Cu]标记的NOTA-VcMMAE的图像
图21-图24体现了实施例9中在示踪剂注射后不同时间点的NOTA-EB-VcMMAE和NOTA-VcMMAE在肿瘤及其他器官的摄取情况。其中，图21体现的是NOTA-EB-VcMMAE和NOTA-VcMMAE注射后不同时间在肿瘤的摄取平均值；图22体现的是NOTA-EB-VcMMAE和NOTA-VcMMAE注射后不同时间在肿瘤的摄取的最高值；图23体现的是NOTA-EB-VcMMAE和NOTA-VcMMAE注射后不同时间在心脏(包括血液)的摄取，定量基于PET图像(n＝3/组)；图24体现的是在注射后48小时NOTA-EB-VcMMAE和NOTA-VcMMAE在小鼠各器官和组织的定量生物分布情况。
图25-图27为实施例10中治疗方案A所得肿瘤生长抑制图。其中，图25体现了U87MG肿瘤尺寸变化；图26体现了小鼠生存率；图27体现了小鼠体重变化。
图28-图30为实施例10中治疗方案B所得肿瘤生长抑制图。其中，图28体现了U87MG肿瘤尺寸变化；图29体现了小鼠生存率；图30体现了小鼠体重变化。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
实施例1：EB-VcMMAE的制备
按照以下合成路线合成EB-SH：
Figure BDA0001683611280000111
具体步骤包括：
在含有250乙腈的500mL烧瓶中分别投入3,3'-二甲基联苯胺(4.18g,2eq.)和和N-Boc-γ-氨基丁酸(2g，1eq)，并加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，7.47g，2eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA，6.3g，5eq)。室温搅拌下，反应24h后，将溶剂旋干，残留物过硅胶柱，纯化得褐色的中间体BT。在冰浴条件下，将15mL冰的2.0MHCl滴加至40mL BT(3.98g,10.0mmol)的乙腈溶液中。搅拌15min，再将20mL NaNO2(2.07g,30.0mmol)的冰水溶液缓慢滴加至烧瓶中，滴毕后继续搅拌30min生成黄色的重氮盐溶液，待用。将NaHCO3(3.36g,40.0mmol)和1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠水合物(3.19g,10.0mmol)分别溶于20mL冰水中，再缓慢滴加新制的重氮盐溶液，冰浴下继续搅拌60min得到紫色溶液，然后通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％三氟乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)纯化，并冷冻干燥得紫色固体BEB。BEB(0.5g)溶于30mL DMF中，并加入30mL三氟乙酸，常温下搅拌4小时，乙醚沉淀，干燥，得EB-NH2。在EB-NH2的5mL DMF溶液中，加入过量的N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP，2eq)和N,N-二异丙基乙基胺(5eq),反应12小时，加入5mL的0.5M的羟胺的PBS溶液(pH 7.4)，反应4小时，然后通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％三氟乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)纯化，并冷冻干燥得到EB-SH。LC-MS结果如图1所示，ESI-MS m/z：计算值715.82，实测值714.09(M-H)。
在20mL的反应瓶中，称量VcMMAE(1.0mg，0.76μmol)并溶于2mL DMF中，然后加入EB-SH(3.4mg，4.8μmol，2mL PBS)。反应溶液用铝箔纸避光，并室温搅拌过夜，然后通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％三氟乙酸水溶液(图2)(梯度：5-95％乙腈)纯化，得到EB-VcMMAE。将收集的纯化产物冻干并储存在-20℃以备后用。产量：0.92mg(60％产率)。ESI-MSm/z：计算值2030.92，实测值1016.72(0.5M+H)(图2)。
实施例2：EB1-VcMMAE的制备
按照以下合成路线合成EB-SH：
Figure BDA0001683611280000121
具体步骤包括：
在20mL反应瓶中，加入10mg(1eq)按照实施例1方法制备的EB-NH2、3,3'-硫二丙酸(7.8mg,10eq),六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(吡咯烷并)磷(PyBOP，19mg，2eq),DIPEA(23.8,10eq)于5mL DMF中，反应24小时，然后通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％三氟乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)纯化，纯化以后的溶液直接加入过量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TECP)，反应4小时，然后通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％三氟乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)纯化，冷冻干燥，得到EB1-SH。LC-MS确认结构，如图3，ESI-MS m/z：计算值630.09，实测值629.17(M-H)。
在20mL的反应瓶中，称量VcMMAE(1.0mg，0.76μmol)并溶于2mL DMF中，然后加入EB1-SH(3.0mg，4.8μmol，2mL PBS)。反应溶液用铝箔纸避光，并室温搅拌过夜，然后通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％三氟乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)纯化，得到EB1-VcMMAE。将收集的纯化产物冻干并储存在-20℃以备后用。产量：0.81mg(57％产率)。ESI-MSm/z：计算值1946.87，实测值1945.75(M-H)(图4)。
实施例3：EB-DM1的制备
在20mL的反应瓶中，称量DM1(5.3mg，7.2μmol)并溶于2mL DMF中，然后加入EB-Mal(2.5mg，3.6μmol，2mL PBS)。反应溶液用铝箔纸避光，并室温搅拌过夜，然后通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％三氟乙酸水溶液(梯度：5-95％乙腈)纯化，得到EB-DM1。将收集的纯化产物冻干并储存在-20℃以备后用。产量：2.7mg(52％产率)。ESI-MS m/z：计算值1431.40，实测值1430.57(M-H)(图5)。
实施例4：EB-VcMMAE在水中的组装形成纳米粒子和相关表征
实施例1制得的冻干的EB-VcMMAE可以直接重悬在水或其他水溶液中，并且由于其内在的两亲性质而自发地自组装成纳米颗粒。由于EB的优异的水溶性和纳米颗粒的形成，EB-VcMMAE可以以很高的浓度(5mg/mL)分散在水溶液中。我们进一步用动态光散射测定了EB-VcMMAE水合直径。结果显示纳米颗粒具有114±27nm的数均平均流体动力学直径(图6)。透射电子显微镜(TEM)表明EB-VcMMAE纳米颗粒是球形的，具有约103±23nm的相对均匀的尺寸(图7)。稳定的纳米颗粒的形成不仅增强了MMAE的水分散性，而且保护了其不被水解。同时，EB-VcMMAE可以重复冻干并且再悬浮，使得本发明的药物两亲物作为药物递送平台具有高度吸引力。
实施例5：EB-DM1在水中的组装形成纳米粒子和相关表征
实施例2冻干的EB-DM1可以直接重悬在水或其他水溶液中，并且由于其内在的两亲性质而自发地自组装成纳米颗粒。由于EB的优异的水溶性和纳米颗粒的形成，EB-DM1可以以很高的浓度(5mg/mL)分散在水溶液中。透射电子显微镜(TEM)表明EB-DM1纳米颗粒是球形的，具有约135±32nm的相对均匀的尺寸(图8)。稳定的纳米颗粒的形成不仅增强了DM1的水分散性，而且保护了其不被水解。同时，EB-DM1可以重复冻干并且再悬浮，使得本发明的药物两亲物作为药物递送平台具有高度吸引力。
实施例6：EB-VcMMAE和EB-DM1在水中的组装形成纳米粒子和白蛋白的相互作用
现有技术中，虽然有些小分子药物两亲性前药在水溶液中可能是稳定的，但它们可能不能在体内保持其完整性。本发明的EB-VcMMAE和EB-DM1两亲性前药的一个关键优点是通过伊文斯蓝与白蛋白结合，将它们转化为白蛋白与药物的复合物。新形成的白蛋白/药物复合物仍然是纳米结构，并利用白蛋白的长血液循环和EPR效应优先将药物积累在肿瘤。一系列研究验证了本发明的两亲性前药与白蛋白结合的能力。首先，我们发现在过量牛血清白蛋白(BSA)存在下EB-VcMMAE和EB-DM1的EB荧光强度分别增加了6.9和5.5倍(图9，图10)。通过动态光散射测量，在加入白蛋白后，EB-VcMMAE纳米组装体的数均平均流体动力学直径从114nm变为7nm，表明大多数EB-VcMMAE从较大纳米结构解离并转化为白蛋白/EB-VcMMAE复合物。
实施例7：体外细胞毒性测定
将人神经胶质瘤细胞系U87MG、人宫颈癌细胞细胞HELA、人结肠癌HCT116分别接种在96孔板中。将细胞在37℃下在含有5％二氧化碳的潮湿气氛中孵育。接种后24小时用新鲜培养基替换培养基。将实施例1制备的EB-VcMMAE、市售的VcMMAE、市售的MMAE、实施例3制备的EB-DM1和市售的DM1分别溶解在溶剂中，并使用细胞培养基稀释。对于每个孔，加入100μL具有上述几种不同指定药物浓度的细胞培养基。将细胞孵育72小时，然后与细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK-8)的溶液一起孵育2小时，并在BioTek Synergy H4混合读数器中在450nm的波长下测量吸光度。将空白减去测量的光密度(OD)值，并且基于对照未处理细胞的相对吸光度计算细胞活力。使用GraphPad Prism 5进行IC50值的计算和统计分析。
我们首先测试了实施例1制备的EB-VcMMAE、市售的VcMMAE、市售的MMAE对来自人神经胶质瘤细胞系U87MG的体外细胞毒性，结果见表1和图11。
表1
Figure BDA0001683611280000141
从表1中可见，作为ADC的药物成分，MMAE具有极强的细胞毒性，IC50值确定为0.1nM，仅为常见的抗癌药物百分之一至万分之一；VcMMAE的IC50值为58nM；而EB-VcMMAE的IC50值确定为9nM。由于MMAE与EB之间的链接基团缬氨酸-瓜氨酸(valine-citrulline，VC)需要在溶酶体中被酶降解，所以相对较低的毒性是与预期结果一致的。在HELA和HCT116细胞系中，我们证实了类似的细胞毒性趋势(表1，图12，图13)，尽管与U87MG细胞相比，所有制剂对HELA和HCT116细胞的敏感性相对较低。
作为另外一种常见的ADC药物成分，DM1同样具有很强的细胞毒性。我们同样进行了几种DM1与EB-DM1的细胞毒性对比实验，结果从表2可知，DM1对U87MG的IC50值为1nM，HELA细胞的IC50值为0.67nM，HCT116的IC50值为5.4nM(表2，图14-16)。同时，由于DM1与EB之间的链接基团稳定，EB-DM1的毒性降低了32-79倍。
表2
Figure BDA0001683611280000151
实施例8：体外细胞摄取
使用共聚焦激光扫描显微镜研究EB-VcMMAE体外细胞摄取。将EB-VcMMAE与U87MG细胞孵育3小时，并用Lysotracker Green和10μg/mL Hoechst33342在细胞培养箱中37℃孵育0.5小时。然后将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，之后在Zeiss LSM 780共聚焦显微镜上成像。由于EB是荧光的，特别是在与白蛋白结合后，这些药物两亲性前药可以直接成像，而不需要另外的染料标记。在U87MG细胞的共聚焦显微镜中，细胞核通过Hoechst染色，溶酶体使用LysoTracker Green染色。孵育3小时后，EB-VcMMAE主要位于溶酶体和细胞质中(参见图17)，表明本发明的药物两亲物可通过内吞途径内化，从而有利于Vc链接基团的降解。
实施例9：HCT116肿瘤的体内正电子发射计算机断层扫描(PET)成像。
通过皮下注射5×106个U87MG细胞在磷酸盐缓冲盐水(100μL)中的悬浮液，制备裸鼠U87MG移植瘤(7周龄，雌性)。当肿瘤大小达到200-500mm3时，将小鼠用于PET成像。在示踪剂注射前使用异氟烷/氧气(2％v/v)麻醉小鼠。将麻醉的小鼠静脉内注射在磷酸盐缓冲盐水(100μL)中配置的64Cu标记的NOTA-EB-VcMMAE(图18)和NOTA-VcMMAE(图19)(4.44-5.55MBq/120-150μCi每只小鼠)。在注射后指定的时间点，在Inveon DPET扫描仪(SiemensMedical Solutions，Malvern，PA)上扫描小鼠。使用3D有序子集期望最大化算法重建没有衰减或散射的校正的正电子发射计算机断层扫描图像。使用ASI Pro VMTM软件进行图像分析。在任何感兴趣的器官上绘制感兴趣的区域(ROI)以计算％ID/g。
上述小鼠在注射后48小时处死。收集器官和血液并湿称重。将收集的器官和血液与一系列标准溶液一起在γ-计数器(Wallac Wizard 1480，PerkinElmer)上测量64Cu放射性。将器官和血液的放射性转换以计算目标器官中的注射剂量(％ID)的百分比和每克组织的注射剂量的百分比(％ID/g)。
通过PET成像(图20)，我们发现NOTA-EB-VcMMAE逐渐积累在肿瘤中(参见图20左半部、图21中圆点线)，并在24小时达到最高点7.0％ID/g，48小时稍微下降至6.0％ID/g(参见图21中圆点线)。而NOTA-VcMMAE没有明显积累(参见图20右半部、图21中的方点线)。我们进一步量化NOTA-EB-VcMMAE和NOTA-VcMMAE在心脏、肿瘤的分布。如图23所示，NOTA-EB-VcMMAE的浓度随时间逐渐降低，血液半衰期为～10.0小时；而NOTA-VcMMAE的半衰期约为1小时，相比之下NOTA-EB-VcMMAE的血液循环时间明显延长。NOTA-EB-VcMMAE的曲线下面积(AUC)为553h*％ID/g，比NOTA-VcMMAE的面积(24.3h*％ID/g)增大了23倍。更长的血液循环时间有利于NOTA-EB-VcMMAE在肿瘤中富集。我们发现NOTA-EB-VcMMAE的肿瘤摄取平均值从1小时的3.03±0.09％ID/g迅速增加到4小时的5.62±0.67％ID/g，然后24小时后逐渐增加至7.0±0.92％ID(参见图21中圆点线所示)，48小时后，稍微下降至6.1±0.77％ID/g。肿瘤积累的最高值约为15.4±2.2％ID/g(参见图22中圆点线所示)。对于NOTA-VcMMAE，观测到的则是相反的趋势：在注射后1小时达到最高浓度为1.77±0.11％ID/g，并且在注射后24小时衰减至0.40±0.19％ID/g，并接近零(不能被检测到)(参见图21中方点线)。此外定量的器官放射性还证实了注射后48小时5.1±0.33％ID/g浓度的NOTA-EB-VcMMAE摄取在肿瘤组织中，而NOTA-VcMMAE在肿瘤组织中几乎没有信号，约为0.0001％ID/g(参见图24，图中每组数据的左侧柱状对应NOTA-EB-VcMMAE的摄取，而右侧柱状对应NOTA-VcMMAE的摄取)。图24体现的生物分布清楚地表明本发明的药物两亲性前药具有较长的血液循环和较高的肿瘤富集。
实施例10：HCT116荷瘤小鼠的体内治疗
通过皮下注射5×106个U87MG细胞在磷酸盐缓冲盐水(100μL)中的悬浮液，制备U87MG荷瘤裸鼠(7周龄，雌性)。当在肿瘤接种后第10天建立肿瘤时，分别采用以下两种治疗方案治疗：
方案A：实验组通过静脉内注射一次100μL药物(EB-VcMMAE或者MMAE)或者磷酸盐缓冲盐水。注射剂量根据小鼠体重确定(按MMAE的剂量计算：1.0mg/kg)。对照组每4天通过静脉内注射一次100μL药物(EB-VcMMAE或者MMAE)或者磷酸盐缓冲盐水，注射3次。注射剂量根据小鼠体重确定(按MMAE的剂量计算：0.33mg/kg)。
每两天监测肿瘤体积和小鼠重量。当肿瘤的任何尺寸超过2cm或当小鼠体重减轻超过20％时，对小鼠实施安乐死。使用以下公式分别计算每种类型肿瘤的体积：体积＝(长度×宽度2)/2。
如图25-图27所示，EB-VcMMAE显示出最有效的抗肿瘤效果，能够显著延迟肿瘤发展(参见图25中接近横坐标的三角形标记的曲线)。MMAE也具有抗癌活性，能够显著抑制肿瘤生长，但是却很快复发。由于非常优异的抗肿瘤功效，在观察的56天以内，EB-VcMMAE没有任何老鼠死亡(参见图26)，而所有的PBS或者MMAE处理过的老鼠均在34天全部牺牲。此外，很重要的一点是，用EB-VcMMAE和MMAE治疗的小鼠在治疗过程中均出现了体重下降，但是MMAE体重下降更快，EB-VcMMAE处理的下降缓慢，但持续时间长一些(参见图27)。这种一次药物注射就能实现肿瘤完全抑制的效果在化疗中是十分罕见的，可以与昂贵的抗体-药物偶联物(ADC)媲美，但是却拥有合成简单、结构明确的优势。
为了进一步降低EB-VcMMAE的毒副作用，我们还进行了方案B的治疗实验，即将上述方案A中实验组的EB-VcMMAE的注射方案改为注射3次，每次为0.33mg/kg。修改方案后，尽管EB-VcMMAE的肿瘤抑制效果不如方案A(图28)，但是却有效地降低了它的毒副作用，在整个治疗过程中，EB-VcMMAE组的老鼠没有明显的体重变化，但是MMAE组的老鼠依然有明显的体重降低(图30)。

Claims (6)

1.一种多肽类药物前药，其特征在于：它是单甲基澳瑞他汀类和伊文思蓝形成的前药，其结构式如式(I)
Figure FDA0003548812780000011
其中，
R1为
Figure FDA0003548812780000012
或者-CH2-中的一种；
m和n为重复单元数，均为0-4的整数；
R2的结构为式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)所示的任意一种：
Figure FDA0003548812780000013
2.权利要求1所述的多肽类药物前药，其特征在于，所述的式(I)中的m为3、n为2，且R1为
Figure FDA0003548812780000021
3.权利要求2所述的多肽类药物前药，其特征在于，结构为下式(VII)或(VIII)所示的任意一种：
Figure FDA0003548812780000022
4.权利要求1所述的多肽类药物前药，其特征在于，所述的式(I)中的m为1且R1为-CH2-。
5.权利要求4所述的多肽类药物前药，其特征在于，结构如下式(IX)所示：
Figure FDA0003548812780000031
6.权利要求1所述的多肽类药物前药在制备癌症治疗药物中的应用。
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