TWI753521B - 生物材料染色組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供了一種澄清組成物和利用所述澄清組成物使生物樣本透明的染色方法。澄清組成物包含：折射率吻合材料、包含介面活性劑的滲透劑、至少兩種染色物質和溶劑。所述染色方法包括以下步驟：（a）將樣本於固定液中固定；（b）將所述樣本包埋於包埋材料中；（c）將所述被包埋的樣本浸置於如請求項1中所述組成物而使得所述組成物可以滲透所述被包埋的樣本；以及（d）使用封片膠對所述被包埋的樣本進行密封。
Description
本揭露主張在西元2019年8月7日所申請之美國臨時申請案US62／883,656號作為優先權，並且援引所述美國臨時申請案所有內容。
本揭露涉及一種用於生物組織分析領域的組成物和方法，更具體地說，涉及一種用於將生物組織染色並使其透明的澄清組成物，以及利用該組成物的染色方法。
在擷取和分析生物組織影像的領域中，共軛焦顯微鏡比常規廣域光學顯微鏡具有較多優勢。例如包含控制景深的能力，消除或減少遠離焦距平面的背景信息的能力，以及從厚樣本中收集連續光學切片的能力。共軛焦顯微鏡的基礎重點是空間濾波，它可以消除厚度超過焦點所在平面的標本中的離焦光線或眩光。藉由共軛焦顯微鏡，可以獲得更佳的次微米螢光生物學影像。
於正常情況下，組織的厚度限制了光的穿透程度，因為組織的本質在未處理時是不透明的。而克服上述問題的一種方法是將大／厚組織切成較薄的樣本，使其適合使用顯微鏡觀察。另一種方法是將組織變透明化，使光可以穿透其本身。在某些情況下，為了藉由光學顯微鏡或共軛焦顯微鏡觀察非透明組織內的目標，需要將其進行預處理。一個典型的預處理被稱為澄清化處理（clearing treatment）。 基本上，為使用澄清劑使組織本身變得透明。
美國專利申請：US 2014/0087419 A1（下稱「419專利申請」）（Atsushi Miyawaki等人，2012）揭露了一種使生物材料變透明的方法。419專利申請中提到，在現有技術中，使用有機溶劑作為活性成分或類似物是進行澄清化處理的必要條件。然而，對應的澄清化方法主要僅適用於已固定的樣本，但絕大不適用於活體組織。這類方法還具有會造成生物材料萎縮之風險。為了解決上述問題，419專利申請教示了使用尿素來使生物材料變透明。由於尿素具有高生物親和性（bio-affinity）之特點，因此使用尿素或尿素衍生物作為活性成分進行透明化處理，可解決上述之問題。
419專利申請中所揭示的方法涉及分別用兩種滲透溶液浸漬組織樣本。此外，第一滲透溶液含有至少一種尿素或尿素衍生物的化合物，第二滲透溶液含有至少一種尿素或尿素衍生物的化合物，並且其濃度高於第一溶液中含有的化合物的濃度。
WO 2011/111876 A1專利申請（下稱「876專利申請」）（Atsushi Miyawaki等人，2010）揭示了一種用於使生物材料透明的試劑。更具體而言，該試劑含有活性成分和至少一種尿素或尿素衍生物的化合物。依876專利申請，在現有技術中，使用一種稱作FocusClear的溶液可使組織樣本變透明。然而，由於FocusClear溶液含有二甲基亞碸（DMSO）或類似物（例如，活性成分），因此其不適用於活體組織。因此，FocusClear溶液主要為用於已固定的樣本。此外，FocusClear溶液的成分複雜，故導致製備過程複雜且成本高。 FocusClear為強鹼性溶液，容易破壞生物標記物。在其他習知技術中，澄清劑的組成必須包含大量的有機溶劑，因此其幾乎破壞了所有的螢光蛋白。其產生結果是很難藉由螢光蛋白進行組織觀察。
為了解決上述問題，876專利申請揭示了一種使生物材料透明化的澄清劑，該澄清劑包含具有較高生物親和力的活性成分。簡而言之，876專利申請中的澄清劑包含具有至少一種尿素化合物或尿素衍生物的活性組分。然而，876專利申請所揭示的方法仍然需較長的處理時間和較高成本的等一些缺陷。
本公開揭露了一種用於使生物材料呈現透明的澄清組成物。所述澄清組成物可以隨套組（kit）一起提供。所述澄清組成物包含折射率（Refractive Index；RI）吻合材料、包含介面活性劑的滲透劑、第一染色物質、第二染色物質和溶劑。
在某些實施例中，其中所述組成物之pH值為6.5至8.4。
在某些實施例中，所述折射率吻合材料包含：放射性對比劑、單醣、寡醣或上述任意之組合。
在某些實施例中，所述折射率吻合材料包含：碘克沙醇（iodixanol）、果糖（fructose）、蔗糖（sucrose）或上述任意之組合。
在某些實施例中，所述滲透劑包含：清潔劑（detergent）。
在某些實施例中，所述介面活性劑不包含任何離子物質。
在某些實施例中，所述介面活性劑包含：Triton X-100、Tween-20、Tween-80、十二烷基硫酸鈉（SDS）、DDM、尿素（Urea）、CHAPS、脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate）或上述任意之組合。
在某些實施例中，所述介面活性劑選自由Triton X-100和Tween-20所組成之群組。
在某些實施例中，所述介面活性劑之臨界微胞濃度（CMC）為0.01至0.025。
在某些實施例中，所述溶劑包含：磷酸鹽緩衝生理鹽水（PBS）、雙蒸水（ddH2
O）或上述之組合。
在某些實施例中，所述第一和第二染色物質是選自由促進劑（agonist）、拮抗劑（antagonist）、抗體（antibody）、蛋白質卵白素（avidin）、右旋糖酐（dextran）、脂質核苷酸（lipid nucleotide）或蕈類毒素（phallotoxin）所組成之群組。
在某些實施例中，所述第一染色物質包含：DAPI、Propidium Iodide、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。
在某些實施例中，所述第二染色物質包含：lipophilic tracers fluorescence dye。
在某些實施例中，所述折射率吻合材料相對於所述組成物之重量／體積百分比濃度為30～80%。
在某些實施例中，所述滲透劑相對於所述組成物之體積／體積百分比濃度為0.1～2%。
在某些實施例中，所述第一染色物質相對於所述組成物之濃度為100 ng/ml～1 mg/ml。
在某些實施例中，所述第二染色物質相對於所述組成物之濃度為1 μg/ml～1 mg/ml。
在某些實施例中，所述澄清組成物或所述套組還包含第三染色物質。
本揭露還公開了一種使生物材料透明化並進一步標記生物材料的方法。所述方法包含以下步驟：（a）將樣本於固定液中固定；（b）將所述樣本包埋於包埋材料中；（c）將所述被包埋的樣本浸置於如請求項1中所述組成物而使得所述組成物可以滲透所述被包埋的樣本；以及（d）使用封片膠（mounting solution）對所述被包埋的樣本進行密封。(a)用固定液固定試樣；(b)用嵌入材料嵌入試樣；(c)用上述透明成分浸泡試樣，並使透明成分滲透到試樣中；以及(d)用安裝液將滲透後的試樣安裝在玻片上。
在某些實施例中，所述固定液包含：甲醛（formaldehyde）、磷酸鹽緩衝福馬林（phosphate buffered formalin）、formal calcium、甲醛生理鹽水（formal saline）、鋅福馬林（zinc formalin）、Zenker’s fixative、Helly’s fixative、B-5 fixative、Bouin’s solution、Hollande’s、Gendre’s solution、Clarke’s solution、Carnoy’s solution、Methacarn、Alcoholic formalin、Formol acetic alcohol或上述任意之組合。
在某些實施例中，所述包埋材料包含：明膠（gelatin）、丙烯醯胺（acrylamide）或瓊脂膠（agarose gel）。
在某些實施例中，所述包埋材料為瓊脂膠溶液（agarose gel solution）
在某些實施例中，所述方法還包含在步驟（c）之前將樣本切成切片的步驟。
在某些實施例中，所述切片的厚度為約100-1000微米。
在某些實施例中，所述方法還包含於所述步驟（c）前將所述生物材料進行抗原回復（antigen retrieval）。
在某些實施例中，其中所述生物材料被浸泡於請求項1之所述澄清組成物中8～15小時。
在某些實施例中，其中所述生物材料被浸泡於所述澄清組成物中並進行離心1～8小時。
在某些實施例中，其中所述生物材料被浸泡於所述澄清組成物中並置於電場中1～8小時。
在某些實施例中，其中所述封片膠包含請求項1之所述澄清組成物。
在某些實施例中，所述方法還包含在步驟（d）之後進一步辨識所述樣本上的第一或第二染色物質的表現量之步驟。
以下內容詳細討論了本專利申請說明中實施例的相關製造和使用。然而，應當理解以下實施例提供了許多可實施的發明概念，此類概念可能體現在各類具體情況中。以下所討論的具體實施例僅說明了製造和使用實施例的具體方式，且未進一步限制本專利申請說明的範圍。
在各類視圖和說明性實施例中，類似的參考數位用於表示類似元件。接下來我們將詳細參考附圖中所示的典型實施例。附圖和描述中盡可能使用相同的參考數字來表示相同或相似部件。在附圖中，出於清晰和方便目的，形狀和厚度可能會放大。根據本專利申請說明，本專利申請說明的描述將特別針對構成裝置的一部分、或直接與裝置一同工作的元件。應當理解，對於未具體表示或描述的元件，其形式可能多種多樣。本專利申請說明中， 「 一項實施例」 或「 某一實施例」 的引用是指關於該實施例所描述的某一特定特徵、結構、或特性包含於至少一項實施例中。因此，本專利申請說明中不同位置出現的短語「 在一項實施例中」 或「 在某一實施例中」 不一定均指同一實施例。此外，上述特定特徵、結構或特性可通過任何適宜方式在一項或多項實施例中進行組合。應當理解，以下附圖未按比例繪製；更準確地說，此類附圖僅可用於說明。
在附圖的各類視圖中，類似參考編號用於標示相同或相似的元件，同時表示和描述了本專利申請說明的說明性實施例。附圖不一定按比例繪製，且在某些情況下，為達到說明目的，附圖已放大和/或簡化。本領域中的普通技術人員鬚根據本專利申請說明的以下說明性實施例來理解本專利申請說明的多種可能的應用和變體。
定義
應當理解，除非上下文另有明確指示，否則單數形式「 一」、「 某」、「 該」 、 「 所述」 也包含複數形式。
本文中所使用的「大約」和「約」為當涉及例如：數量、 持續時間等可測之值時， 其意味著涵蓋範圍為指定值之±10％， 且更佳地為指定值之±5％的範圍，因為這樣的範圍內適於達成所公開的方法。
如本文所使用的「標記材料」、「染料」、「染色材料」或「探針」可互換使用，並指能夠在生物樣本上標記特定分子的任何材料，其它包含化學成分物質或生物成分物質。
本文所用的「深度」，當指的是可測量的值，如焦距與樣品基線之間的距離。
本文所使用的「樣本」、「臨床樣本」、「標本」或「生物樣本 」可相互替換使用，並其可來自人類或人以外的任何生物樣本。它可以來自任何生物體或身體或組織的任何部分。
除非另有定義，否則本文使用的所有術語（包括科技術語）的意義與本專利申請說明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。應當進一步理解，常用詞典中定義的術語的含義應當與相關領域和本專利申請說明的上下文中的含義一致，且不會解釋地過於理想化或過於正式，除非本文中明確定義。
本揭露公開了一種用於使生物材料透明化的澄清組成物。所述澄清組成物也可被稱為「澄清液」、「澄清溶液」或「澄清組合物」。
表一：澄清組成物之成分
| 編號 | 成分 | 示例 | 最終濃度 |
| 1 | 折射率吻合材料 | 放射性對比劑、單醣、寡醣或其任意組合 | 30 to 80% (W/V) |
| 2 | 滲透劑 | surfactant | 0.1 to 2% (V/V) |
| 3 | 溶劑 | PBS, DMSO, Glycerol, ddH2 O or any combination | N/A |
| 4-1 | 第一染色物質 | agonist, antagonist, antibody, avidin, dextran, lipid nucleotide, or phallotoxin | 100 ng/ml 至 1 mg/mL |
| 4-2 | 第二染色物質 | ||
| 4-3 | 第三染色物質 （選用） |
如上表所示，本揭露的澄清組成物包含四大成分，即折射率吻合材料、滲透劑、染色物質和溶劑。所述澄清組成物的最終pH值需在6.5～8.4範圍內，以避免強烈抑制抗體－抗原反應。由於市售的折射率吻合材料之產品（例如FocusClear和RapiClear）的pH值超出了上述範圍，因此能與抗體搭配使用的市售折射率吻合材料十分有限。折射率吻合材料包含：放射性對比劑、單醣、寡醣或其任意組合。放射性對比劑必須是非離子性的，以防止鈉離子和氯離子對抗體－抗原反應產生影響。放射性對比劑、單糖和寡醣的可能示例分別是碘克沙醇（iodixanol）、果糖和蔗糖。折射率吻合材料對染色的影響將在下面的實施例3中做進一步說明。滲透劑的主要成分是介面活性劑。通常用於厚組織的標準免疫螢光染色的滲透材料的臨界微胞濃度（critical micelle concentration；CMC）在0.04～0.08範圍內。與標準厚組織染色相比，本澄清組成物中滲透材料的臨界微胞濃度應在0.005～0.025的範圍內，較佳為0.01～0.015以使樣本具有滲透性，但同時保持樣本的表面脂質以進行膜染色。下面實施例4將進一步說明不同的臨界微胞濃度對膜染色的影響。在穩定的核染色下，以高臨界微胞濃度進行膜染色時則會造成信號明顯下降。另一方面，介面活性劑的示例包含：Triton X-100、Tween-20、十二烷基硫酸鈉（SDS）、n-Dodecyl-β-D-maltoside（DDM）、Tween-80、尿素、3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate（CHAPS）、去氧膽酸鈉、或上述任意之組合。於本揭露中，較佳的介面活性劑是Triton X-100、Tween-20或上述任意之組合。溶劑可包含：磷酸鹽緩衝生理鹽水（PBS）、二甲基亞碸（DMSO）、甘油、雙蒸水（ddH2
O）或上述任意之組合。
關於染色材料，本揭露的澄清液包含至少兩種染色材料，其用於在檢測生物樣本上標記至少兩種分子。染色材料可以選自促進劑（agonist）、拮抗劑（antagonist）、抗體（antibody）、蛋白質卵白素（avidin）、右旋糖酐（dextran）、脂質核苷酸（lipid nucleotide）或蕈類毒素（phallotoxin）。使用者可以依據不同試驗需求而選擇不同種類的染色材料來針對不同的分子， 例如對於標記細胞核，其較佳的染色材料是DAPI、碘化丙啶（Propidium Iodide）、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。在另一個例子中，用於觀察細胞形態則染色材料可以是親脂性螢光染料。值得注意的是，不同的染色材料需要不同的作用濃度以達到足夠的標記效果。在本揭露中，染色材料的最終作用濃度為約100 ng/ml至1 mg/ml。更具體而言，當使來標記細胞核則染色材料的作用濃度較佳為約100 ng/ml至1 mg/ml。當使用於標記細胞核以外的分子時，染色材料的較佳作用濃度為約1 1 µg/ml至10 mg/ml。
澄清液的折射率吻合材料和滲透劑的濃度或比例對最終染色圖像的品質至關重要。折射率吻合材料會影響樣本的透明程度，滲透劑會影響染色材料的標記效率。此外，當滲透劑過量時，會損壞待檢測生物樣本或染色材料。另一方面，當滲透劑不足時，滲透劑會降低染色材料標記至生物樣本上分子的效率。在本揭露中，折射率吻合材料與澄清液的較佳重量／體積百分比濃度為約30～80％(w/v)，滲透劑與清液的較佳體積／體積百分比濃度為約0.1～2％(v/v)。
本揭露還公開了一種用於使生物材料透明的套組。所述套組的主要成分是澄清組成物。所述套組還可包含：抗凍劑、保濕劑或上述兩者。圖1a和圖1b公開的是示意性的流程圖。圖1A和1B揭露了一個流程示意圖，其比較了本揭露與習知樣本澄清和染色方法之不同。具體而言，圖1A是利用本領域中習知常規澄清溶液進行染色，而圖1B則是利用本揭露的澄清溶液進行染色。如圖1A中所揭示，當我們想要製備一個透明的生物樣本，並進一步使用不同的染劑標記至少兩個不同的目標時，則其方法至少需要六個步驟。具體來說，所述五個必要步驟包括：固定、包埋、滲透、第一次染色、第二次染色和進行澄清。其中，滲透、第一次染色、第二次染色和進行澄清這幾個步驟是用來使樣本透明化，並將樣本上的目標用藉由不同的染色物質進行標記。值得一提的是，當藉由習知方法並搭配不同的染色物質標記多個分子／目標時則需要延長整體方法時間，而所延長時間取決於要標記的目標有多少個。如圖1A中所揭示，在每個染色反應中，只有一種單一染色材料與樣本一起進行反應。因此，如果要在樣本上標記多個分子／目標（例如兩種不同的蛋白質），那麼染色過程所需的時間消耗就變成了兩倍。上述情況還進一步導致後續的澄清流程需要額外的作用時間。此外，每一輪染色程序的總時間還受到過程中所使用的染色材料的影響。一些染色材料（例如化學合成染色物質或螢光共軛探針）能夠直接與目標分子結合，因此相較於與使用抗體的進行染色程序其所消耗的時間較少。化學合成染料或螢光共軛探針可以包含：促進劑、拮抗劑、抗體、蛋白質卵白素、右旋糖酐、脂質核苷酸或蕈類毒素。對於習知技藝者而言，其可理解使用抗體進行標記比使用化學合成染料或螢光共軛探針需要更多的時間。其主要原因為，抗體染色方法是一種利用三明治夾心法進行標記之方法。在第一輪反應中使用一抗進行標記目標／分子，然後使用與螢光材料共軛的二抗與一抗進行連接，使其在顯微鏡下變得可被偵測。簡單總結一下，傳統的標記多個目標並使樣本透明化的程序是相當耗時的，而且對於醫院等醫療機構來說是不理想的。本揭露公開了一種澄清組成物和其使用方法，因此，醫療機構可以在較短時間內製備出具有標記目標的透明樣本。因此，醫生更能夠辨別目標的醫療狀況，且更及時地為患者提供建議和治療。
圖1B為本揭露的高通量染色程序／方法。 在本染色方法中，滲透、染色和澄清化之三個步驟合併為一個步驟。換句話說，在我們的方法中，滲透、染色和澄清化是在一個步驟中同時進行的。因此，比較圖1A和1B中的方法過程，本揭露用於在生物樣本上對目標進行染色並使其透明的澄清組成物和方法比習知方法更有效率。此外，本揭露之方法仍然可以獲得期望的結果（即較佳影像的品質和最終的診斷評價）。
表二：不同染色程序所需消耗的時間
| 程序 | 染色種類 | |||
| H&E 染色 | 標準澄清化螢光染色 | 本揭露之方法 | ||
| 時間 (小時) | 固定 | ＞6 | ＞6 | ＞6 |
| 製備 | 17 | 54-72 | 8-15 | |
| 成像 | 0.1 | 2 | 2 | |
| 總計 | 23.1 | 62-80 | 16-23 |
圖2是示意性的柱狀圖，其用以說明H&E染色、標準澄清化螢光染色和本揭露方法的耗時差異。表2為圖2的統計結果。圖2和表2還揭示了三種染色方法中不同程序（即固定、製備和成像）之所需時間。值得注意的，表二中本揭露的整個染色過程之時間比H&E染色或標準螢光染色的時間還要來的少。更明確地，本方法所需時間少於標準澄清化螢光染色所需總時間的百分之五十。更具體地說，三種染色程序中固定所需的時間是非常相似的。即使本揭露中的成像步驟似乎比H&E染色中的成像步驟需要更多的時間，但它被製備時間相抵消。總之，本揭露之染色所需的總時間減少。此外，最終的顯微鏡分析結果也是較佳的，因為由於製備時間的縮短，而使得組織得到了更好的保存。
綜上所述，利用本公開的內容，醫院的病理科可以更有效地將多個目標呈現在臨床樣本 上，並使其透明化，以便進一步進行顯微鏡分析。 因此，醫生可以在更短的時間內，更清晰地識別出臨床樣本(如患者樣本)上特定分子的表達譜，而且單一步驟的製備過程也降低了人工作業成本。 同時也方便醫生對可能出現的症狀或疾病進行診斷，更有效地給患者提供治療方案。
具體示例：以下實施例中所使用的人類臨床樣本是在病理檢查中被診斷為Ki67高表現（20-70%）的女性乳腺組織。換句話說，所述人類臨床樣本是Ki67陽性對照樣本。
實施例1為使用本揭露的澄清液對所述臨床組織進行染色，並藉由顯微鏡檢測其形態。
為了評價本揭露的效果，我們使用本揭露的澄清液對所述臨床組織（即病理檢查診斷為Ki67高表現（20-70%）的女性乳腺組織）進行染色，並藉由顯微鏡進一步檢驗其染色效率。下述表3-1和表3-2揭示了本實驗中所使用的澄清液的詳細成分。
表3-1：澄清液的詳細組成
| 編號 | 項目 | 成分 | 品牌 (Cat.) | 最終濃度 |
| 1 | 折射率吻合材料 | Sucrose | Amresco (0335) | 58 %w/v |
| 2 | 滲透劑 | Triton X-100 | J. T. Baker (JT-X198-07) | 0.5 %v/v |
| 3 | 第一染色物質 | SYTO 16 | ThermoFisher (S7578) | 5 µM |
| 4 | 第二染色物質 | DiD | ThermoFisher (D307) | 20 µg/ml |
| 5 | 第三染色物質 | Anti-Ki67 conjugated with AlexaFluor 555 | abcam (ab215226) | 0.5 %v/v |
| 6 | 溶劑 | PBS | Protech (BF-203) | N/A |
表3-2
| 編號 | 項目 | 成分 | 品牌 (Cat.) | 最終濃度 |
| 1 | 折射率吻合材料 | Sucrose | Amresco (0335) | 58 %w/v |
| 2 | 滲透劑 | Triton X-100 | J. T. Baker (JT-X198-07) | 0.5 %v/v |
| 3 | 第一染色物質 | SYTO 16 | ThermoFisher (S7578) | 5 µM |
| 4 | 第二染色物質 | Anti-CD8 conjugated with AlexaFluor 647 | abcam (ab204015) | 0.5 %v/v |
| 6 | 溶劑 | PBS | Protech (BF-203) | N/A |
本揭露還公開了一種使用本澄清液的高通量染色方法。所述染色方法的基本步驟為：（1）固定標本、（2）包埋樣本、（3）將標本浸泡在澄清液中、以及（4）對處理後的樣本進行成像。
其中，步驟一為從有乳腺癌症狀的女性患者身上採集新鮮的乳腺組織樣本。將組織樣本用PBS沖洗10分鐘，然後用紙吸乾水分。進一步，將組織樣本置於4%甲醛中進行固定以備日後使用。步驟二，將固定後的組織樣本嵌入3%瓊脂糖凝膠溶液(w/v)中，並置於室溫下10分鐘後再置於4℃下10分鐘。將固定的組織樣本切成厚度約為100～150μm的切片。步驟三，將組織樣本切片浸置於澄清液中使其滲透而使其透明，所述組織樣本將進一步用於對其細胞核和膜進行染色。 進一步地，此步驟是於在25℃下反應12小時。澄清液的詳細成分列於表3-1和表3-2中。其中，SYTO 16被用於對細胞核進行標記，而DiD被用於對細胞膜進行標記。步驟四，對具有約150微米厚度的組織樣本（已透明化且染色標記），從頂面到底面用LSCM系統（LSM780；蔡司）進行成像，以擷取約一百個連續的2D樣本影像，然後再利用所述影像生成樣本的3D立體影像。所述影像是藉由偵測SYTO 16（激發波長480 nm和散射波長525 nm）和DiD（激發波長638 nm和散射波長700 nm）而獲得。橫向解析度（沿x和y方向）小於1微米，軸向解析度（沿z方向）小於2微米。
圖3A和3B是藉由本揭露的高通量染色方法所製備的透明和染色的組織樣本且進一步擷取的影像。圖3A中的刻度條單位代表100微米。 此外，圖3A中的圖像是分別於20微米、60微米和100微米的深度下所拍攝的。從影像中可清楚看出，於三個不同的影像層中各組織形態都非常清晰，且SYTO 16和DiD的染色模式也非常均勻。換句話說，本澄清液及其利用方法能夠更有效地對生物樣本進行標記和透明化，以便進一步對其進行圖像分析。此外，圖3B中的影像為分別於20微米、70微米和120微米的深度下進行拍攝。圖3B中的刻度條單位代表200微米。值得注意的是，圖3B中所使用的染色材料是CD8抗體。而且，圖3B中的抗體染色結果也顯示與圖3A相似的結果。
實施例2：比較本公開與標準螢光染色的效率和標記效果。
為了進一步說明本揭露相對於標準螢光染色的優勢，我們採用與實施例1相同的臨床樣本，且使用兩種不同的染色。藉由顯微鏡分析，以進一步評估和辨別各自的染色效率和效果。
圖4A和4C是取自藉由實施例1中的處理方法的臨床樣本的影像，而圖4B和4D是使用標準螢光染色處理的影像。圖4A至4D中的圖像是在100微米深度下所擷取的。此外，圖4C和4D分別是圖4A和4C中白色方框標記處的放大圖。
請注意圖4A和4B，圖中的染色效果（例如，染色品質）可能看起來相似。然而，當進一步對圖4C和4D中的影像進行詳細比較時，圖4C的解析度和影像品質是遠高於圖4D。換句話說，本揭露之高通量染色法與澄清液能夠更有效地使標本透明化，因此可為醫生提供更好或更準確的分子表現圖譜，以達到特定的診斷目的。此外，本澄清液染色法的總反應時間約為23小時，其遠低於標準螢光染色法的總反應時間，標準螢光染色法的總反應時間通常為54小時左右。 綜上所述，本揭露與習知技術相比，本揭露的優點至少有以下幾點：（1）臨床樣本的分子表現圖譜更準確、（2）所需耗費時間更少、（3）由於程續簡化／步驟減少，因此成本更低。
實施例3：澄清成分的pH值和離子材料影響染色材料的標記能力。
圖5A揭示了病理檢查中被診斷為Ki67高表現（20-70%）的乳腺癌樣本上的ki67表現圖譜。具體地，將乳腺癌組織樣本使用與AlexaFluor 555共軛連結之抗ki67抗體（abcam，ab215226）和不同折射率吻合材料（如下表4所示）的澄清組成物進行處理。一般的染色程序則與前述之實施例相同。每個影像中的比例尺為約50微米。此外，第一行之對照組則按照標準的免疫螢光染色過程進行處理，並且使用FocusClear溶液進行澄清化。
結果如同圖中所揭示，澄清組成物中最終pH值和離子物質會顯著地影響染色的效果。具體而言，具有適當pH值且不含非離子物質的折射率吻合材料將有助於抗體（例如澄清組成物）維持結合親和力。其結果顯示，使用習知的折射率吻合材料（例如FocusClear溶液和RapiClear）的組別均顯示較差的染色效果。值得注意的是，FocusClear溶液和RapiClear溶液的pH值為約10～11。此外，使用不含離子成分（例如：果糖、蔗糖和碘克沙醇）的折射率吻合材料的組別也顯示出較好的染色特性。值得知道的是，即使Meglumine diatrizoate的pH值在6～8以內，其染色效果仍然極差。綜上所述，當使用所述澄清組成物與抗體對組織樣本進行染色時，其較佳的條件為：（1）pH值為約6.5～8.4，以及（2）澄清組成物中不含任何離子物質。
根據前述，極端的pH值條件將導致抗體產生結構變化，而破壞其與抗原間的互補性。為了進一步證明前述之的折射率吻合材料會因其pH值而降低抗體的染色效果，我們進行類似於圖5A的實驗。我們使用具有不同染色物質的FocusClear溶液處理乳腺癌組織樣本（例如：核酸SYTO 16（Thermo Fisher Scientific，S7578）或與AlexaFluor 555結合的抗ki67抗體（abcam，ab215226）。如圖5B中所揭示的，螢光染色物質SYTO 16的表現在不同的影像層（例如：20、60或100微米）中非常顯著。 然而，使用抗體（例如：抗ki67）的染色結果並不像預期的那樣。抗ki67抗體的螢光信號和染色專一性都會隨著樣本深度的增加而降低，而且不能發揮細胞核專一性染色的作用效果。 因此，依據上述之結果，FocusClear溶液只會破壞抗體等蛋白質類染色物質。
為了證實前述，pH值條件和離子物質都會顯著影響抗體的染色能力。我們將同樣的乳腺癌組織樣本使用澄清液進行處理，其中折射率吻合材料為meglumine diatrizoate （60%w/v），染色材料為核酸SYTO 16（Thermo Fisher Scientific，S7578）和與AlexaFluor 555共軛結合的抗ki67抗體（abcam，ab215226）。如圖5C中所揭示的結果則與圖5B中結果相似，螢光染色物質SYTO 16的表現在不同的影像層（例如：20、60、100微米）都非常顯著，但使用抗體（例如抗ki67之抗體）的染色結果卻不盡如人意。
表四
| 果糖 | 蔗糖 | 碘克沙醇 | Meglumine diatrizoate | FocusClear | RapiClear | |
| 濃度 %(w/v) | 80% | 58% | 32% | 60% | 100% | 100% |
| pH | 6.57 | 7.03 | 7.4 | 7.29 | 10.9 | 9.94 |
| 離子物質 | 無 | 無 | 無 | 有 | 有 | 有 |
實施例4：不同臨界微胞濃度的滲透劑的膜染色效果分析。
如前所述，在穩定的核染色的情況下，臨界微胞濃度高時，膜上染色信號明顯下降。 另外，於本揭露中較佳的界面活性劑包含Triton X-100或Tween-20。
圖6A和6B進一步說明了本揭露中臨界微胞濃度對染色物質的效果至關重要。簡而言之，與先前實施例一樣，乳腺癌樣本使用本澄清組成物搭配本揭露之程序進行處理。然而，值得注意的是，在本澄清組成物中所使用的介面活性劑是Triton X-100（圖6A）或Tween-20（圖6B），而染色物質是SYTO 16（染細胞核）和DiD（染細胞膜）。 此外，為了進一步評估什麼是較佳的臨界微胞濃度，我們使用Triton X-100（圖6A）或Tween-20（圖6B）搭配的不同臨界微胞濃度進行染色，以辨識染色能力。
如圖6A和6B中的結果所揭示，臨界微胞濃度確實會影響染色物質結合至膜上的能力。更具體而言，當介面活性劑的臨界微胞濃度過高時（例如0.0428），介面活性劑會分解脂質並降低標記能力（第一行圖）。 相反地，當介面活性劑的臨界微胞濃度過低時（例如0.00535），介面活性劑無法有效地提供滲透，並導致標記能力變弱（第四行圖）。因此，只有在本澄清液中使用一定範圍臨界微胞濃度內的介面活性劑才能得到較好的、準確的染色結果。更具體而言，本澄清液中滲透劑的臨界微胞濃度為約0.005～0.025，較佳為約0.01～0.015，而得以使樣本具有滲透性，且維持樣本上脂質而可進行膜染色。
實施例5：有機溶劑和脫氧劑也會影響抗體的染色能力。
DMSO和甘油由於具有抗凍功能，是組織澄清組成物中常用的溶劑組合材料。但是，DMSO是一種有機溶劑，當其濃度高時會使蛋白質變性。另外，甘油是一種脫氧劑，也會影響抗體的結合反應。圖7A和7B的結果支持上述說明。圖7A是比較由澄清液所製備的組織樣本的染色圖，其中使用的溶劑是甘油。圖7A揭露了當使用高濃度的甘油作為溶劑時，無論在哪個深度的組織樣本層中，樣本上都沒有螢光信號。換句話說，高濃度（50%（w/v））的甘油抑制了抗Ki67抗體和抗原之間的結合。但是，當甘油的濃度在5～20%（w/v）左右時，抗Ki67抗體能與標本上的目標結合。
圖7B是比較由澄清液所製備的組織樣本的染色圖，其中使用的溶劑是DMSO。 由圖7B中的結果顯示，抗Ki67抗體的結合專一性隨著DMSO濃度的增加而降低。具體而言，當使用高濃度（50％(w/v））的DMSO作為本澄清液的溶劑時，抗Ki67抗體不再具有與細胞核專一性結合。然而，當DMSO的濃度在約5~20%（w/v）之間時，抗Ki67抗體結合至樣本上的目標。
因此，依據圖7A和7B的結果，當在本澄清組成物中使用這兩種物質作為溶劑時，DMSO和甘油的濃度都應小於20%（v/v）。
實施例6：使用本揭露的澄清液且搭配離心力對臨床組織進行染色，最後藉由顯微鏡檢測其型態。
依據前述，使用本澄清液可以有效地減少分析的總時間。此外，一些研究指出，使用額外的應力也可提高染色效果並減少染色時間。（Lee, Eunsoo, and Woong Sun. 「ACT-PRESTO：對生物組織進行體積成像的澄清和免疫標記方法」。JoVE（Journal of Visualized Experiments）118（2016）：e54904）。值得注意的是，該文獻中所提到的技術也可以應用至本方法中，以進一步減少總分析時間。
無
附圖圖片中通過示例而非局限性方法展示出了一個或多個實施例，其中具有相同參考數位識別碼的元件始終表示類似元件。附圖並非等比例圖，除非另有披露。
圖1A和1B是流程示意圖，其說明了本揭露與現有染色技術之間的差異。 利用習知的染色流程（圖1A）來製備具有至少兩個標記目標的透明生物樣本，其方法至少包含六個必要步驟。然而，利用本揭露（圖1B）以製備具有至少兩個標記目標的透明生物樣本，其方法僅需包括至少三個必要步驟。
圖2是示意性的柱狀圖，其用以說明了本揭露的蘇木精-伊紅染色（H&E染色）、標準澄清化螢光染色和本發明澄清成分染色之間所需的時間差異。
圖3A至3B揭示了一個人類乳腺組織樣本，所述樣本是從女性乳腺癌患者中所採集的，並在病理檢查中被診斷為Ki67高表現（20-70%）的患者，而進一步使用本揭露的澄清組成物處理使其透明，最後利用顯微鏡擷取其圖示。
圖4A和4B是比較由本揭露之方法和習知技術所製備的人類乳腺組織樣本的染色切片圖。圖4C和4D分別是圖4A和4B中白色方框的放大圖。
圖5A是比較由具有不同折射率吻合材料的澄清劑所製備的組織樣本的染色圖。圖5B和5C為將病理診斷為Ki67高表現（20-70%）的乳腺癌組織樣本使用具有不同介面活性劑和染色物質的澄清組成物處理後的染色圖，並且利用顯微鏡擷取的圖像。更特別的是，用於處理圖5B中的組織樣本的澄清組成物中的折射率吻合材料是FocusClear溶液，用於處理圖5C中的組織樣本的澄清組成物中的折射率吻合材料是meglumine diatrizoate。
圖6A和6B是比較利用具有不同CMC值的滲透劑的澄清組成物所製備的組織樣本並利用顯微鏡擷取的染色圖像。
圖7A和7B是比較利用具有不同溶劑的澄清組成物所製備的組織樣本並利用顯微鏡擷取的染色圖像。
本附圖僅為示意圖，且並不進一步限制其他可能之變化。在附圖中，為達到說明目的，一些元件的尺寸可能過大，且未按比例繪製。該尺寸和相對尺寸不一定對應於本發明的實際實施方式。本專利申請中的所有參考標記不得解釋為對本專利申請中權利要求範圍的限制。在各個附圖中，類似的參考符號表示類似元件。
Claims (30)
- 一種用以使生物材料透明並進一步染色之澄清組成物，其包含：折射率吻合材料，其包含放射性對比劑、單醣、寡醣或上述任意之組合；滲透劑，其包含：介面活性劑；第一染色物質；第二染色物質；以及溶劑；其中，第一和第二染色物質是選自由促進劑、拮抗劑、抗體、蛋白質卵白素、右旋糖酐、脂質核苷酸或蕈類毒素所組成之群組，並且所述澄清組成物之pH值為6.5至8.4。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述折射率吻合材料包含：碘克沙醇、果糖、蔗糖或上述任意之組合。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述滲透劑包含：清潔劑。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述介面活性劑不包含任何離子物質。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述介面活性劑包含：Triton X-100、Tween-20、Tween-80、十二烷基硫酸鈉、DDM、尿素、CHAPS、脫氧膽酸鈉或上述任意之組合。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述介面活性劑選自由Triton X-100和Tween-20所組成之群組。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述介面活性劑之臨界微胞濃度為0.01至0.025。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述溶劑包含：磷酸鹽緩衝生理鹽水、雙蒸水或上述之組合。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述第一染色物質包含：DAPI、Propidium Iodide、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述第二染色物質包含：lipophilic tracers fluorescence dye。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述折射率吻合材料相對於所述組成物之重量/體積百分比濃度為30~80%。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述滲透劑相對於所述組成物之體積/體積百分比濃度為0.1~2%。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述第一染色物質相對於所述組成物之濃度為100ng/ml~1mg/ml。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述第二染色物質相對於所述組成物之濃度為1μg/ml~1mg/ml。
- 如請求項1之澄清組成物，其中所述溶劑相對於所述澄清組成物的體積/體積百分比濃度為小於20%(v/v)。
- 如請求項1之澄清組成物，還包含第三染色物質。
- 一種使生物材料透明並進一步染色之套組，其包含如請求項1所述之澄清組成物。
- 如請求項17之套組，還包含：抗凍劑、保濕劑或上述之組合。
- 一種用以使生物材料透明並進一步染色之方法，其包含：(a)將樣本於固定液中固定；(b)將所述樣本包埋於包埋材料中；(c)將所述被包埋的樣本浸置於如請求項1中所述澄清組成物而使得所述組成物可以滲透所述被包埋的樣本；以及(d)使用封片膠對所述被包埋的樣本進行密封。
- 如請求項19之方法，其中所述固定液包含：甲醛(formaldehyde)、磷酸鹽緩衝福馬林(phosphate buffered formalin)、formal calcium、甲醛生理鹽水(formal saline)、鋅福馬林(zinc formalin)、Zenker’s fixative、Helly’s fixative、B-5 fixative、Bouin’s solution、Hollande’s、Gendre’s solution、Clarke’s solution、Carnoy’s solution、Methacarn、Alcoholic formalin、Formol acetic alcohol或上述任意之組合。
- 如請求項19之方法，其中所述包埋材料包含：明膠、丙烯醯胺或瓊脂膠。
- 如請求項19之方法，其中所述包埋材料為瓊脂膠溶液。
- 如請求項19之方法，還包含於所述步驟(c)前將樣本切成切片。
- 如請求項23之方法，其中所述切片的厚度為100-1000微米。
- 如請求項19之方法，還包含於所述步驟(c)前將所述生物材料進行抗原回復。
- 如請求項19之方法，其中所述生物材料被浸泡於請求項1之所述澄清組成物中8~15小時。
- 如請求項19之方法，其中所述生物材料被浸泡於所述澄清組成物中並進行離心1~8小時。
- 如請求項19之方法，其中所述生物材料被浸泡於所述澄清組成物中並置於電場中1~8小時。
- 如請求項19之方法，其中所述封片膠包含請求項1之所述澄清組成物。
- 如請求項19之方法，還包含在步驟(d)之後進一步辨識所述樣本上的第一或第二染色物質的表現量之步驟。
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