CN114096826A - 用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物、套组及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物、套组及方法。澄清组成物包含：折射率吻合材料、包含表面活性剂的渗透剂、至少两种染色物质和溶剂。染色方法包括以下步骤：(a)将样本于固定液中固定；(b)将样本包埋于包埋材料中；(c)将被包埋的样本浸置于上述澄清组成物而使得澄清组成物可以渗透被包埋的样本；以及(d)使用封片胶对被包埋的样本进行密封。
Description
技术领域
本发明主张在公元2019年8月7日所申请的美国临时申请案US62/883,656号作为优先权，并且援引美国临时申请案所有内容。
本发明涉及一种用于生物组织分析领域的组成物和方法，更具体地说，涉及一种用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物、套组及方法。
背景技术
在撷取和分析生物组织影像的领域中，共轭焦显微镜比常规广域光学显微镜具有较多优势。例如包含控制景深的能力，消除或减少远离焦距平面的背景信息的能力，以及从厚样本中收集连续光学切片的能力。共轭焦显微镜的基础重点是空间滤波，它可以消除厚度超过焦点所在平面的标本中的离焦光线或眩光。通过共轭焦显微镜，可以获得更佳的次微米荧光生物学影像。
在正常情况下，组织的厚度限制了光的穿透程度，因为组织的本质在未处理时是不透明的。而克服上述问题的一种方法是将大/厚组织切成较薄的样本，使其适合使用显微镜观察。另一种方法是将组织变透明化，使光可以穿透其本身。在某些情况下，为了通过光学显微镜或共轭焦显微镜观察非透明组织内的目标，需要将其进行预处理。一个典型的预处理被称为澄清化处理(clearing treatment)。基本上，为使用澄清剂使组织本身变得透明。
美国专利申请：US 2014/0087419 A1(下称「419专利申请」)(Atsushi Miyawaki等人，2012)发明了一种使生物材料变透明的方法。419专利申请中提到，在现有技术中，使用有机溶剂作为活性成分或类似物是进行澄清化处理的必要条件。然而，对应的澄清化方法主要仅适用于已固定的样本，但绝大不适用于活体组织。这类方法还具有会造成生物材料萎缩的风险。为了解决上述问题，419专利申请教示了使用尿素来使生物材料变透明。由于尿素具有高生物亲和性(bio-affinity)之特点，因此使用尿素或尿素衍生物作为活性成分进行透明化处理，可解决上述之问题。
419专利申请中所公开的方法涉及分别用两种渗透溶液浸渍组织样本。此外，第一渗透溶液含有至少一种尿素或尿素衍生物的化合物，第二渗透溶液含有至少一种尿素或尿素衍生物的化合物，并且其浓度高于第一溶液中含有的化合物的浓度。
WO 2011/111876A1专利申请(下称「876专利申请」)(Atsushi Miyawaki等人，2010)公开了一种用于使生物材料透明的试剂。更具体而言，该试剂含有活性成分和至少一种尿素或尿素衍生物的化合物。依876专利申请，在现有技术中，使用一种称作FocusClear的溶液可使组织样本变透明。然而，由于FocusClear溶液含有二甲基亚砜(DMSO)或类似物(例如，活性成分)，因此其不适用于活体组织。因此，FocusClear溶液主要为用于已固定的样本。此外，FocusClear溶液的成分复杂，故导致制备过程复杂且成本高。FocusClear为强碱性溶液，容易破坏生物标记物。在其他现有技术中，澄清剂的组成必须包含大量的有机溶剂，因此其几乎破坏了所有的荧光蛋白。其产生结果是很难通过荧光蛋白进行组织观察。
为了解决上述问题，876专利申请公开了一种使生物材料透明化的澄清剂，该澄清剂包含具有较高生物亲和力的活性成分。简而言之，876专利申请中的澄清剂包含具有至少一种尿素化合物或尿素衍生物的活性组分。然而，876专利申请所公开的方法仍然需较长的处理时间和较高成本的等一些缺陷。
发明内容
本发明公开了一种用于使生物材料呈现透明的澄清组成物。该澄清组成物可以随套组(kit)一起提供。澄清组成物包含折射率(Refractive Index；RI)吻合材料、包含表面活性剂的渗透剂、第一染色物质、第二染色物质和溶剂。
在某些实施例中，其中组成物的pH值为6.5至8.4。
在某些实施例中，折射率吻合材料包含：放射性对比剂、单醣、寡醣或上述任意的组合。
在某些实施例中，折射率吻合材料包含：碘克沙醇(iodixanol)、果糖(fructose)、蔗糖(sucrose)或上述任意的组合。
在某些实施例中，渗透剂包含：清洁剂(detergent)。
在某些实施例中，表面活性剂不包含任何离子物质。
在某些实施例中，表面活性剂包含：聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、吐温-20(Tween-20)、吐温-80(Tween-80)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、尿素(Urea)、CHAPS、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)或上述任意的组合。
在某些实施例中，表面活性剂选自由Triton X-100和Tween-20所组成的群组。
在某些实施例中，表面活性剂的临界微胞浓度(CMC)为0.01至0.025。
在某些实施例中，溶剂包含：磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、双蒸水(ddH2O)或上述的组合。
在某些实施例中，第一染色物质和第二是选自由促进剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、抗体(antibody)、蛋白质卵白素(avidin)、右旋糖酐(dextran)、脂质核苷酸(lipidnucleotide)或蕈类毒素(phallotoxin)所组成的群组。
在某些实施例中，第一染色物质包含：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶(Propidium Iodide)、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。
在某些实施例中，第二染色物质包含：亲脂性示踪剂荧光染料(lipophilictracers fluorescence dye)。
在某些实施例中，澄清组成物或套组还包含抗冻剂、保湿剂或上述任意的组合。
在某些实施例中，折射率吻合材料相对于组成物的重量/体积百分比浓度为30～80％(w/v)。
在某些实施例中，渗透剂相对于组成物之体积/体积百分比浓度为0.1～2％(v/v)。
在某些实施例中，第一染色物质相对于组成物的浓度为100ng/ml～1mg/ml。
在某些实施例中，第二染色物质相对于组成物的浓度为1μg/ml～1mg/ml。
在某些实施例中，澄清组成物或套组还包含第三染色物质。
本发明还公开了一种用于使生物材料透明化并进一步染色的方法。该方法包含以下步骤：(a)将样本于固定液中固定；(b)将样本包埋于包埋材料中；(c)将被包埋的样本浸置于上述澄清组成物而使得澄清组成物可以渗透被包埋的样本；以及(d)使用封片胶(mounting solution)对被包埋的样本进行密封。
在某些实施例中，固定液包含：甲醛(formaldehyde)、磷酸盐缓冲福尔马林(phosphate buffered formalin)、formal calcium、甲醛生理盐水(formal saline)、锌福尔马林(zinc formalin)、Zenker’s fixative、Helly’s fixative、B-5fixative、Bouin’ssolution、Hollande’s、Gendre’s solution、Clarke’s solution、Carnoy’s solution、Methacarn、Alcoholic formalin、Formol acetic alcohol或上述任意的组合。
在某些实施例中，包埋材料包含：明胶(gelatin)、丙烯酰胺(acrylamide)或琼脂胶(agarose gel)。
在某些实施例中，包埋材料为琼脂胶溶液(agarose gel solution)
在某些实施例中，方法还包含在步骤(c)之前将样本切成切片的步骤。
在某些实施例中，切片的厚度为约100微米-1000微米。
在某些实施例中，方法还包含在步骤(c)前将生物材料进行抗原回复(antigenretrieval)。
在某些实施例中，其中生物材料被浸泡于上述澄清组成物中8小时～15小时。
在某些实施例中，其中生物材料被浸泡于澄清组成物中并进行离心1小时～8小时。
在某些实施例中，其中生物材料被浸泡于澄清组成物中并置于电场中1小时～8小时。
在某些实施例中，其中封片胶包上述澄清组成物。
在某些实施例中，方法还包含在步骤(d)之后进一步辨识样本上的第一染色物质或第二染色物质的表现量的步骤。
附图说明
附图图片中通过示例而非局限性方法展示出了一个或多个实施例，其中具有相同参考数字标识的组件始终表示类似组件。附图并非等比例图，除非另有披露。
图1A和1B是流程示意图，其说明了本发明与现有染色技术之间的差异。利用现有技术的染色流程(图1A)来制备具有至少两个标记目标的透明生物样本，其方法至少包含六个必要步骤。然而，利用本发明(图1B)以制备具有至少两个标记目标的透明生物样本，其方法仅需包括至少三个必要步骤。
图2是示意性的柱状图，其用以说明了本发明的苏木精-伊红染色(H&E染色)、标准澄清化荧光染色和本发明澄清成分染色之间所需的时间差异。
图3A至3C公开了一个人类乳腺组织样本，样本是从女性乳腺癌患者中所采集的，并在病理检查中被诊断为Ki67高表现(20-70％)的患者，而进一步使用本发明的澄清组成物处理使其透明，最后利用显微镜撷取其图示。更特别的是，图3A中的图像是于50微米的深度下所拍摄的；图3B中的图像是于100微米的深度下所拍摄的；图3C中的图像是于150微米的深度下所拍摄的。
图4A和4B是比较由本发明的方法和现有技术所制备的人类乳腺组织样本的染色切片图。图4C和4D分别是图4A和4B中白色方框的放大图。
图5A是比较由具有不同折射率吻合材料的澄清剂所制备的组织样本的染色图。图5B和5C为将病理诊断为Ki67高表现(20-70％)的乳腺癌组织样本使用具有不同表面活性剂和染色物质的澄清组成物处理后的染色图，并且利用显微镜撷取的图像。更特别的是，用于处理图5B中的组织样本的澄清组成物中的折射率吻合材料是FocusClear溶液，用于处理图5C中的组织样本的澄清组成物中的折射率吻合材料是meglumine diatrizoate。
图6A和6B是比较利用具有不同CMC值的渗透剂的澄清组成物所制备的组织样本并利用显微镜撷取的染色图像。
图7A和7B是比较利用具有不同溶剂的澄清组成物所制备的组织样本并利用显微镜撷取的染色图像。
本附图仅为示意图，且并不进一步限制其他可能的变化。在附图中，为达到说明目的，一些组件的尺寸可能过大，且未按比例绘制。该尺寸和相对尺寸不一定对应于本发明的实际实施方式。本专利申请中的所有参考标记不得解释为对本专利申请中权利要求范围的限制。在各个附图中，类似的参考符号表示类似组件。
具体实施方式
以下内容详细讨论了本专利申请说明中实施例的相关制造和使用。然而，应当理解以下实施例提供了许多可实施的发明概念，此类概念可能体现在各类具体情况中。以下所讨论的具体实施例仅说明了制造和使用实施例的具体方式，且未进一步限制本专利申请说明的范围。
在各类视图和说明性实施例中，类似的参考数字用于表示类似组件。接下来我们将详细参考附图中所示的典型实施例。附图和描述中尽可能使用相同的参考数字来表示相同或相似部件。在附图中，出于清晰和方便目的，形状和厚度可能会放大。根据本专利申请说明，本专利申请说明的描述将特别针对构成装置的一部分、或直接与装置一同工作的组件。应当理解，对于未具体表示或描述的组件，其形式可能多种多样。本专利申请说明中，「一项实施例」或「某一实施例」的引用是指关于该实施例所描述的某一特定特征、结构、或特性包含于至少一项实施例中。因此，本专利申请说明中不同位置出现的短语「在一项实施例中」或「在某一实施例中」不一定均指同一实施例。此外，上述特定特征、结构或特性可通过任何适宜方式在一项或多项实施例中进行组合。应当理解，以下附图未按比例绘制；更准确地说，此类附图仅可用于说明。
在附图的各类视图中，类似参考编号用于标示相同或相似的组件，同时表示和描述了本专利申请说明的说明性实施例。附图不一定按比例绘制，且在某些情况下，为达到说明目的，附图已放大和/或简化。本领域中的普通技术人员须根据本专利申请说明的以下说明性实施例来理解本专利申请说明的多种可能的应用和变体。
【定义】
应当理解，除非上下文另有明确指示，否则单数形式「一」、「某」、「该」、「」也包含复数形式。
本文中所使用的「大约」和「约」为当涉及例如：数量、持续时间等可测之值时，其意味着涵盖范围为指定值之±10％，且更佳地为指定值之±5％的范围，因为这样的范围内适于达成所公开的方法。
如本文所使用的「标记材料」、「染料」、「染色材料」或「探针」可互换使用，并指能够在生物样本上标记特定分子的任何材料，其它包含化学成分物质或生物成分物质。
本文所用的「深度」，当指的是可测量的值，如焦距与样品基线之间的距离。
本文所使用的「样本」、「临床样本」、「标本」或「生物样本」可相互替换使用，并其可来自人类或人以外的任何生物样本。它可以来自任何生物体或身体或组织的任何部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括科技术语)的意义与本专利申请说明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。应当进一步理解，常用词典中定义的术语的含义应当与相关领域和本专利申请说明的上下文中的含义一致，且不会解释地过于理想化或过于正式，除非本文中明确定义。
本发明公开了一种用于使生物材料透明化的澄清组成物。澄清组成物也可被称为「澄清液」、「澄清溶液」或「澄清组合物」。
表一：澄清组成物之成分
如上表所示，本发明的澄清组成物包含四大成分，即折射率吻合材料、渗透剂、染色物质和溶剂。澄清组成物的最终pH值需在6.5～8.4范围内，以避免强烈抑制抗体－抗原反应。由于市售的折射率吻合材料的产品(例如FocusClear和RapiClear)的pH值超出了上述范围，因此能与抗体搭配使用的市售折射率吻合材料十分有限。折射率吻合材料包含：放射性对比剂、单醣、寡醣或其任意组合。放射性对比剂必须是非离子性的，以防止钠离子和氯离子对抗体－抗原反应产生影响。放射性对比剂、单糖和寡醣的可能示例分别是碘克沙醇(iodixanol)、果糖和蔗糖。折射率吻合材料对染色的影响将在下面的实施例3中做进一步说明。渗透剂的主要成分是表面活性剂。通常用于厚组织的标准免疫荧光染色的渗透材料的临界微胞浓度(critical micelle concentration；CMC)在0.04～0.08范围内。与标准厚组织染色相比，本澄清组成物中渗透材料的临界微胞浓度应在0.005～0.025的范围内，较佳为0.01～0.015以使样本具有渗透性，但同时保持样本的表面脂质以进行膜染色。下面实施例4将进一步说明不同的临界微胞浓度对膜染色的影响。在稳定的核染色下，以高临界微胞浓度进行膜染色时则会造成信号明显下降。另一方面，表面活性剂的示例包含：TritonX-100、Tween-20、十二烷基硫酸钠(SDS)、n-Dodecyl-β-D-maltoside(DDM)、Tween-80、尿素、3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS)、脱氧胆酸钠、或上述任意之组合。在本发明中，较佳的表面活性剂是Triton X-100、Tween-20或上述任意的组合。溶剂可包含：磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、双蒸水(ddH2O)或上述任意的组合。
关于染色材料，本发明的澄清液包含至少两种染色材料，其用于在检测生物样本上标记至少两种分子。染色材料可以选自促进剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、抗体(antibody)、蛋白质卵白素(avidin)、右旋糖酐(dextran)、脂质核苷酸(lipidnucleotide)或蕈类毒素(phallotoxin)。使用者可以依据不同试验需求而选择不同种类的染色材料来针对不同的分子，例如对于标记细胞核，其较佳的染色材料是DAPI、碘化丙啶(Propidium Iodide)、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。在另一个例子中，用于观察细胞形态则染色材料可以是亲脂性荧光染料。值得注意的是，不同的染色材料需要不同的作用浓度以达到足够的标记效果。在本发明中，染色材料的最终作用浓度为约100ng/ml至1mg/ml。更具体而言，当使来标记细胞核则染色材料的作用浓度较佳为约100ng/ml至1mg/ml。当使用于标记细胞核以外的分子时，染色材料的较佳作用浓度为约11μg/ml至10mg/ml。
澄清液的折射率吻合材料和渗透剂的浓度或比例对最终染色图像的质量至关重要。折射率吻合材料会影响样本的透明程度，渗透剂会影响染色材料的标记效率。此外，当渗透剂过量时，会损坏待检测生物样本或染色材料。另一方面，当渗透剂不足时，渗透剂会降低染色材料标记至生物样本上分子的效率。在本发明中，折射率吻合材料与澄清液的较佳重量/体积百分比浓度为约30～80％(w/v)，渗透剂与清液的较佳体积/体积百分比浓度为约0.1～2％(v/v)。
本发明还公开了一种用于使生物材料透明的套组。套组的主要成分是澄清组成物。套组还可包含：抗冻剂、保湿剂或上述两者。图1a和图1b公开的是示意性的流程图。图1A和1B发明了一个流程示意图，其比较了本发明与现有技术样本澄清和染色方法的不同。具体而言，图1A是利用本领域中现有技术常规澄清溶液进行染色，而图1B则是利用本发明的澄清溶液进行染色。如图1A中所公开，当我们想要制备一个透明的生物样本，并进一步使用不同的染剂标记至少两个不同的目标时，则其方法至少需要六个步骤。具体来说，五个必要步骤包括：固定、包埋、渗透、第一次染色、第二次染色和进行澄清。其中，渗透、第一次染色、第二次染色和进行澄清这几个步骤是用来使样本透明化，并将样本上的目标用通过不同的染色物质进行标记。值得一提的是，当通过现有技术的方法并搭配不同的染色物质标记多个分子/目标时则需要延长整体方法时间，而所延长时间取决于要标记的目标有多少个。如图1A中所公开，在每个染色反应中，只有一种单一染色材料与样本一起进行反应。因此，如果要在样本上标记多个分子/目标(例如两种不同的蛋白质)，那么染色过程所需的时间消耗就变成了两倍。上述情况还进一步导致后续的澄清流程需要额外的作用时间。此外，每一轮染色程序的总时间还受到过程中所使用的染色材料的影响。一些染色材料(例如化学合成染色物质或荧光共轭探针)能够直接与目标分子结合，因此相较于与使用抗体的进行染色程序其所消耗的时间较少。化学合成染料或荧光共轭探针可以包含：促进剂、拮抗剂、抗体、蛋白质卵白素、右旋糖酐、脂质核苷酸或蕈类毒素。对于习知技艺者而言，其可理解使用抗体进行标记比使用化学合成染料或荧光共轭探针需要更多的时间。其主要原因为，抗体染色方法是一种利用三明治夹心法进行标记之方法。在第一轮反应中使用一抗进行标记目标/分子，然后使用与荧光材料共轭的二抗与一抗进行连接，使其在显微镜下变得可被侦测。简单总结一下，传统的标记多个目标并使样本透明化的程序是相当耗时的，而且对于医院等医疗机构来说是不理想的。本发明公开了一种澄清组成物和其使用方法，因此，医疗机构可以在较短时间内制备出具有标记目标的透明样本。因此，医生更能够辨别目标的医疗状况，且更及时地为患者提供建议和治疗。
图1B为本发明的高通量染色程序/方法。在本染色方法中，渗透、染色和澄清化的三个步骤合并为一个步骤。换句话说，在我们的方法中，渗透、染色和澄清化是在一个步骤中同时进行的。因此，比较图1A和1B中的方法过程，本发明用于在生物样本上对目标进行染色并使其透明的澄清组成物和方法比习知方法更有效率。此外，本发明之方法仍然可以获得期望的结果(即较佳影像的质量和最终的诊断评价)。
表二：不同染色程序所需消耗的时间
图2是示意性的柱状图，其用以说明H&E染色、标准澄清化荧光染色和本发明方法的耗时差异。表2为图2的统计结果。图2和表2还公开了三种染色方法中不同程序(即固定、制备和成像)之所需时间。值得注意的，表二中本发明的整个染色过程之时间比H&E染色或标准荧光染色的时间还要来的少。更明确地，本方法所需时间少于标准澄清化荧光染色所需总时间的百分之五十。更具体地说，三种染色程序中固定所需的时间是非常相似的。即使本发明中的成像步骤似乎比H&E染色中的成像步骤需要更多的时间，但它被制备时间相抵消。总之，本发明的染色所需的总时间减少。此外，最终的显微镜分析结果也是较佳的，因为由于制备时间的缩短，而使得组织得到了更好的保存。
综上，利用本公开的内容，医院的病理科可以更有效地将多个目标呈现在临床样本上，并使其透明化，以便进一步进行显微镜分析。因此，医生可以在更短的时间内，更清晰地识别出临床样本(如患者样本)上特定分子的表达谱，而且单一步骤的制备过程也降低了人工操作成本。同时也方便医生对可能出现的症状或疾病进行诊断，更有效地给患者提供治疗方案。
【具体示例】
以下实施例中所使用的人类临床样本是在病理检查中被诊断为Ki67高表现(20-70％)的女性乳腺组织。换句话说，人类临床样本是Ki67阳性对照样本。
实施例1为使用本发明的澄清组成物(澄清液)对临床组织进行染色，并通过显微镜检测其形态。
为了评价本发明的效果，我们使用本发明的澄清液对临床组织(即病理检查诊断为Ki67高表现(20-70％)的女性乳腺组织)进行染色，并通过显微镜进一步检验其染色效率。下述表3-1和表3-2公开了本实验中所使用的澄清液的详细成分。
表3-1：澄清液的详细组成
表3-2
本发明还公开了一种使用本澄清液的高通量染色方法。染色方法的基本步骤为：(1)固定标本、(2)包埋样本、(3)将标本浸泡在澄清液中、以及(4)对处理后的样本进行成像。
其中，步骤(1)为从有乳腺癌症状的女性患者身上采集新鲜的乳腺组织样本。将组织样本用PBS冲洗10分钟，然后用纸吸干水分。进一步，将组织样本置于4％甲醛中进行固定以备日后使用。步骤(2)，将固定后的组织样本嵌入3％琼脂糖凝胶溶液(w/v)中，并置于室温下10分钟后再置于4℃下10分钟。将固定的组织样本切成厚度约为100～150μm的切片。步骤(3)，将组织样本切片浸置于澄清液中使其渗透而使其透明，组织样本将进一步用于对其细胞核和膜进行染色。进一步地，此步骤是于在25℃下反应12小时。澄清液的详细成分列于表3-1和表3-2中。其中，SYTO 16被用于对细胞核进行标记，而DiD被用于对细胞膜进行标记。步骤(4)，对具有约150微米厚度的组织样本(已透明化且染色标记)，从顶面到底面用LSCM系统(LSM780；蔡司)进行成像，以撷取约一百个连续的2D样本影像，然后再利用影像生成样本的3D立体影像。影像是通过侦测SYTO 16(激发波长480nm和散射波长525nm)和DiD(激发波长638nm和散射波长700nm)而获得。横向分辨率(沿x和y方向)小于1微米，轴向分辨率(沿z方向)小于2微米。
图3A和3B是通过本发明的高通量染色方法所制备的透明和染色的组织样本且进一步撷取的影像。图3A中的刻度条单位代表100微米。此外，图3A中的图像是分别于20微米、60微米和100微米的深度下所拍摄的。从影像中可清楚看出，于三个不同的影像层中各组织形态都非常清晰，且SYTO 16和DiD的染色模式也非常均匀。换句话说，本澄清液及其利用方法能够更有效地对生物样本进行标记和透明化，以便进一步对其进行图像分析。此外，图3B中的影像为分别于20微米、70微米和120微米的深度下进行拍摄。图3B中的刻度条单位代表200微米。值得注意的是，图3B中所使用的染色材料是CD8抗体。而且，图3B中的抗体染色结果也显示与图3A相似的结果。
实施例2：比较本公开与标准荧光染色的效率和标记效果。
为了进一步说明本发明相对于标准荧光染色的优势，我们采用与实施例1相同的临床样本，且使用两种不同的染色。通过显微镜分析，以进一步评估和辨别各自的染色效率和效果。
图4A和4C是取自通过实施例1中的处理方法的临床样本的影像，而图4B和4D是使用标准荧光染色处理的影像。图4A至4D中的图像是在100微米深度下所撷取的。此外，图4C和4D分别是图4A和4C中白色方框标记处的放大图。
请注意图4A和4B，图中的染色效果(例如，染色质量)可能看起来相似。然而，当进一步对图4C和4D中的影像进行详细比较时，图4C的分辨率和影像质量是远高于图4D。换句话说，本发明之高通量染色法与澄清液能够更有效地使标本透明化，因此可为医生提供更好或更准确的分子表现图谱，以达到特定的诊断目的。此外，本澄清液染色法的总反应时间约为23小时，其远低于标准荧光染色法的总反应时间，标准荧光染色法的总反应时间通常为54小时左右。综上，本发明与习知技术相比，本发明的优点至少有以下几点：(1)临床样本的分子表现图谱更准确、(2)所需耗费时间更少、(3)由于程续简化/步骤减少，因此成本更低。
实施例3：澄清成分的pH值和离子材料影响染色材料的标记能力。
图5A公开了病理检查中被诊断为Ki67高表现(20-70％)的乳腺癌样本上的ki67表现图谱。具体地，将乳腺癌组织样本使用与AlexaFluor 555共轭连结的抗ki67抗体(abcam，ab215226)和不同折射率吻合材料(如下表4所示)的澄清组成物进行处理。一般的染色程序则与前述的实施例相同。每个影像中的比例尺为约50微米。此外，第一行的对照组则按照标准的免疫荧光染色过程进行处理，并且使用FocusClear溶液进行澄清化。
结果如同图中所公开，澄清组成物中最终pH值和离子物质会显著地影响染色的效果。具体而言，具有适当pH值且不含非离子物质的折射率吻合材料将有助于抗体(例如澄清组成物)维持结合亲和力。其结果显示，使用现有技术的折射率吻合材料(例如FocusClear溶液和RapiClear)的组别均显示较差的染色效果。值得注意的是，FocusClear溶液和RapiClear溶液的pH值为约10～11。此外，使用不含离子成分(例如：果糖、蔗糖和碘克沙醇)的折射率吻合材料的组别也显示出较好的染色特性。值得知道的是，即使Megluminediatrizoate的pH值在6～8以内，其染色效果仍然极差。综上，当使用澄清组成物与抗体对组织样本进行染色时，其较佳的条件为：(1)pH值为约6.5～8.4，以及(2)澄清组成物中不含任何离子物质。
根据前述，极端的pH值条件将导致抗体产生结构变化，而破坏其与抗原间的互补性。为了进一步证明前述的的折射率吻合材料会因其pH值而降低抗体的染色效果，我们进行类似于图5A的实验。我们使用具有不同染色物质的FocusClear溶液处理乳腺癌组织样本(例如：核酸SYTO 16(Thermo Fisher Scientific，S7578)或与AlexaFluor 555结合的抗ki67抗体(abcam，ab215226)。如图5B中所公开的，荧光染色物质SYTO 16的表现在不同的影像层(例如：20、60或100微米)中非常显著。然而，使用抗体(例如：抗ki67)的染色结果并不像预期的那样。抗ki67抗体的荧光信号和染色专一性都会随着样本深度的增加而降低，而且不能发挥细胞核专一性染色的作用效果。因此，依据上述的结果，FocusClear溶液只会破坏抗体等蛋白质类染色物质。
为了证实前述，pH值条件和离子物质都会显著影响抗体的染色能力。我们将同样的乳腺癌组织样本使用澄清液进行处理，其中折射率吻合材料为meglumine diatrizoate(60％w/v)，染色材料为核酸SYTO 16(Thermo Fisher Scientific，S7578)和与AlexaFluor555共轭结合的抗ki67抗体(abcam，ab215226)。如图5C中所公开的结果则与图5B中结果相似，荧光染色物质SYTO 16的表现在不同的影像层(例如：20、60、100微米)都非常显著，但使用抗体(例如抗ki67的抗体)的染色结果却不尽如人意。
表四
实施例4：不同临界微胞浓度的渗透剂的膜染色效果分析。
如前，在稳定的核染色的情况下，临界微胞浓度高时，膜上染色信号明显下降。另外，于本发明中较佳的界面活性剂包含Triton X-100或Tween-20。
图6A和6B进一步说明了本发明中临界微胞浓度对染色物质的效果至关重要。简而言之，与先前实施例一样，乳腺癌样本使用本澄清组成物搭配本发明的程序进行处理。然而，值得注意的是，在本澄清组成物中所使用的表面活性剂是Triton X-100(图6A)或Tween-20(图6B)，而染色物质是SYTO 16(染细胞核)和DiD(染细胞膜)。此外，为了进一步评估什么是较佳的临界微胞浓度，我们使用Triton X-100(图6A)或Tween-20(图6B)搭配的不同临界微胞浓度进行染色，以辨识染色能力。
如图6A和6B中的结果所公开，临界微胞浓度确实会影响染色物质结合至膜上的能力。更具体而言，当表面活性剂的临界微胞浓度过高时(例如0.0428)，表面活性剂会分解脂质并降低标记能力(第一行图)。相反地，当表面活性剂的临界微胞浓度过低时(例如0.00535)，表面活性剂无法有效地提供渗透，并导致标记能力变弱(第四行图)。因此，只有在本澄清液中使用一定范围临界微胞浓度内的表面活性剂才能得到较好的、准确的染色结果。更具体而言，本澄清液中渗透剂的临界微胞浓度为约0.005～0.025，较佳为约0.01～0.015，而得以使样本具有渗透性，且维持样本上脂质而可进行膜染色。
实施例5：有机溶剂和脱氧剂也会影响抗体的染色能力。
DMSO和甘油由于具有抗冻功能，是组织澄清组成物中常用的溶剂组合材料。但是，DMSO是一种有机溶剂，当其浓度高时会使蛋白质变性。另外，甘油是一种脱氧剂，也会影响抗体的结合反应。图7A和7B的结果支持上述说明。图7A是比较由澄清液所制备的组织样本的染色图，其中使用的溶剂是甘油。图7A发明了当使用高浓度的甘油作为溶剂时，无论在哪个深度的组织样本层中，样本上都没有荧光信号。换句话说，高浓度(50％(w/v))的甘油抑制了抗Ki67抗体和抗原之间的结合。但是，当甘油的浓度在5～20％(w/v)左右时，抗Ki67抗体能与标本上的目标结合。
图7B是比较由澄清液所制备的组织样本的染色图，其中使用的溶剂是DMSO。由图7B中的结果显示，抗Ki67抗体的结合专一性随着DMSO浓度的增加而降低。具体而言，当使用高浓度(50％(w/v))的DMSO作为本澄清液的溶剂时，抗Ki67抗体不再具有与细胞核专一性结合。然而，当DMSO的浓度在约5～20％(w/v)之间时，抗Ki67抗体结合至样本上的目标。
因此，依据图7A和7B的结果，当在本澄清组成物中使用这两种物质作为溶剂时，DMSO和甘油的浓度都应小于20％(v/v)。
实施例6：使用本发明的澄清液且搭配离心力对临床组织进行染色，最后通过显微镜检测其型态。
依据前述，使用本澄清液可以有效地减少分析的总时间。此外，一些研究指出，使用额外的应力也可提高染色效果并减少染色时间。(Lee,Eunsoo,andWoong Sun.「ACT-PRESTO：对生物组织进行体积成像的澄清和免疫标记方法」。JoVE(Journal of VisualizedExperiments)118(2016)：e54904)。值得注意的是，该文献中所提到的技术也可以应用至本方法中，以进一步减少总分析时间。
Claims (34)
1.一种用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于包含：
折射率吻合材料；
渗透剂，其包含：表面活性剂；
第一染色物质；
第二染色物质；以及
溶剂。
2.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述组成物的pH值为6.5至8.4。
3.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述折射率吻合材料包含：放射性对比剂、单醣、寡醣或上述任意的组合。
4.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述折射率吻合材料包含：碘克沙醇、果糖、蔗糖或上述任意的组合。
5.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述渗透剂包含：清洁剂。
6.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述表面活性剂不包含任何离子物质。
7.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述接口活性剂包含：聚乙二醇辛基苯基醚、吐温-20、吐温-80、十二烷基硫酸钠、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、尿素、CHAPS、脱氧胆酸钠或上述任意的组合。
8.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述接口活性剂选自由聚乙二醇辛基苯基醚和吐温-20所组成的群组。
9.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述接口活性剂的临界微胞浓度为0.01至0.025。
10.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述溶剂包含：磷酸盐缓冲生理盐水、双蒸水或上述的组合。
11.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第一染色物质和所述第二染色物质是选自由促进剂、拮抗剂、抗体、蛋白质卵白素、右旋糖酐、脂质核苷酸或蕈类毒素所组成的群组。
12.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第一染色物质包含：4',6-二脒基-2-苯基吲哚、碘化丙啶、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。
13.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第二染色物质包含：亲脂性示踪剂荧光染料。
14.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述折射率吻合材料相对于所述组成物的重量/体积百分比浓度为30～80％(w/v)。
15.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述渗透剂相对于所述组成物的体积/体积百分比浓度为0.1～2％(v/v)。
16.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第一染色物质相对于所述组成物之浓度为100ng/ml～1mg/ml。
17.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第二染色物质相对于所述组成物的浓度为1μg/ml～1mg/ml。
18.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中多元醇、有机溶剂或上述任意组合相对于所述溶剂的体积/体积百分比浓度为小于20％(v/v)。
19.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：还包含第三染色物质。
20.一种用于使生物材料透明并进一步染色的套组，其特征在于，包含如权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物。
21.根据权利要求20所述的用于使生物材料透明并进一步染色的套组，其特征在于，还包含：抗冻剂、保湿剂或上述的组合。
22.一种用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于，其包含：
(a)将样本于固定液中固定；
(b)将所述样本包埋于包埋材料中；
(c)将所述被包埋的样本浸置于澄清组成物而使得所述澄清组成物可以渗透所述被包埋的样本；以及
(d)使用封片胶对所述被包埋的样本进行密封，
其中，所述澄清组成物为权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物。
23.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述固定液包含：甲醛、磷酸盐缓冲福尔马林、formal calcium、甲醛生理盐水、锌福尔马林、Zenker’s fixative、Helly’s fixative、B-5fixative、Bouin’s solution、Hollande’s、Gendre’ssolution、Clarke’s solution、Carnoy’s solution、Methacarn、Alcoholicformalin、Formol acetic alcohol或上述任意的组合。
24.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述包埋材料包含：明胶、丙烯酰胺或琼脂胶。
25.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述包埋材料为琼脂胶溶液。
26.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：还包含在所述步骤(c)前将样本切成切片。
27.根据权利要求26所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述切片的厚度为100微米-1000微米。
28.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：还包含在所述步骤(c)前将所述生物材料进行抗原回复。
29.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：还包含在所述步骤(c)前将所述生物材浸于阻隔剂(blockingbuffer)中。
30.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述生物材料被浸泡在所述澄清组成物中8小时～15小时。
31.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述生物材料被浸泡在所述澄清组成物中并进行离心1小时～8小时。
32.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述生物材料被浸泡在所述澄清组成物中并置于电场中1小时～8小时。
33.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：其中所述封片胶包含所述澄清组成物。
34.根据权利要求22所述的用于使生物材料透明并进一步染色的方法，其特征在于：还包含在步骤(d)之后进一步辨识所述样本上的第一染色物质或第二染色物质的表现量的步骤。
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