TW201634901A - 高速三維成像之光學系統 - Google Patents

Abstract

本發明揭露一種可在三維空間高速成像的光學系統，以及利用該系統來快速截取三維腦神經結構之光學影像，此高速三維成像的光學系統包含：一光源、一分光鏡、一光束整型器、至少一透鏡與影像偵測模組，其中光束整型器將光源於透鏡後的焦點沿光路方向拉近或延伸，如此一來即可將光源所輻射之光於透鏡後聚焦在樣品內的不同深度。其中光源、樣品分別置於透鏡兩側；影像偵測模組，配置於光路徑上，俾使樣品處被激發出的光訊號透過至少一透鏡被該影像偵測模組接收，以利擷取該樣品之不同深度平面影像。

Description

高速三維成像之光學系統

本發明係關於一種光學系統，具體而言，本發明係指一種可用於快速偵測樣品三維結構之光學系統。

雷射掃瞄共軛焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscopy，又可簡稱為LSCM)係為用於觀察生物醫學影像之重要裝置，且其基本功能乃為了提升傳統顯微鏡影像之品質。雷射掃瞄共軛焦顯微鏡的成像原理為利用雷射光取代傳統非同調性光源，基於雷射光源較容易將能量有效聚焦於焦點並且在空間中達到繞射極限的大小。透過橫向上移動聚焦點可形成聚焦面，而在聚焦面之外的區域則稱為非焦面。利用一針孔作為空間濾波器取得由樣品聚焦面的結構資訊，進一步利用電腦演算法重組形成聚焦面的影像，則可被稱為共軛焦點影像(confocal image)。

進一步而言，雷射光源將在樣品上的螢光物質(例如，生物探針)進行激發產生螢光，激發光的焦點經由雷射掃瞄器的導引，經過逐點掃描依序構成聚焦面，而軸向上移動樣品載物台或是物鏡可以改變聚焦面在樣品中不同深度位置，如此一來即可擷取樣品在不同深度的影像進一步提供結構資訊。在雷射掃描共軛焦顯微鏡之系統中亦包含感測器，感測器的功能為接收從掃描器而來的螢光訊息，螢光訊息在進入感測器之前會再通過針孔(pinhole)以阻擋其他非焦距面之雜訊，以解決傳統螢光顯微鏡在使用時常受到其他非焦距面之雜訊的干擾，除可提昇影像之品質，亦能得到清晰的共軛焦影像。

經過雷射掃瞄共軛焦顯微鏡產生的共軛焦影像會再透過電腦進行影像處理，從而得到清楚的細胞或組織內部結構的螢光影像，透過螢光影像之觀察，可以瞭解在細胞或組織中的生理信號及細胞型態的變化(如鈣離子濃度、酸鹼值、細胞膜電位之變化等等)。

雷射掃瞄共軛焦顯微鏡相較於普通的光學顯微鏡或螢光顯微鏡 之優點在於具有較高的分辨率、靈敏度、減少螢光檢測的雜訊干擾，能適用於長時間的影像擷取。另外，雷射掃瞄共軛焦顯微鏡亦可應用於活體細胞或組織之檢測，並且提供較好的空間與時間解析。當對於細胞或組織進行分層掃描後，即可進行三維立體影像重建且對於各種信號做強度測量分析，因此可對細胞或組織內部的動態變化進行觀察。有些光學系統為了減低光束對於活體細胞的傷害，則以可見光雷射或雙光子技術取代紫外光進行取像分析。利用雙光子技術時可以不需要針孔的設計，由於雙光子技術是利用空間及時間上的脈衝壓縮使得雷射光只有在焦點的位置才能夠激發出有效的螢光訊號，因此其本身就具有光學切片能力剔除非焦面的訊號，相對可見光及紫外光雷射等單光子技術，雙光子技術擁有較大的穿透深度以及較低的樣品光破壞。

目前不論是雷射掃瞄共軛焦顯微鏡或是雙光子掃描顯微鏡，其取像方式主要是以樣品的X-Y座標進行掃描再沿Z-軸進行多層掃描取像，以取得不同Z軸的X-Y座標平面影像，再經由電腦進行影像處理，除可觀察與紀錄樣品的空間結構隨時間的變化情形，也可將多個平面影像疊合得到高空間解析的立體影像。然而其技術侷限沿Z軸的掃描時間需耗時約數秒至數分鐘，故難以用現有雷射掃描顯微技術在短時間內觀察以螢光標定之生物樣品中的某些三維的生化反應(例如，鈣離子濃度、酸鹼值、細胞膜電位之變化等等)或者樣品內的動態變化。因此現有的掃瞄技術雖能取得高空間解析之影像，但卻尚未能有效解決無法取得高時間解析影像之問題。

本發明之目的在於提供一種可用於快速偵測樣品三維結構之光學掃瞄系統，其特點在於光源與透鏡之間設置一個光束整型器，而光束整型器具有可調變之聚焦能力，使透鏡後的焦點能夠在軸向上移動，進一步在樣品內不同深度位置激發出光訊號。此一光束整型器可產生數十萬赫以上之調制，使得焦點得以相同頻率在軸向上快速移動百微米的範圍，進一步快速取得不同深度的光訊號。橫向上，雷射掃描器在影像中一個畫素的積分時間至少要能夠讓焦點在軸向上完成一次移動，如此才能夠形成一張軸向上涵蓋百微米深度的動態光學訊號記錄或立體影像。在一實施例中，本發明之光學系統可以極短之時間取得高空間與高時間解析之影像(例如，平面影像或立體影像)。

於本發明的第一觀點中，本發明之用於快速偵測樣品三維結構之 光學系統包含：一光源、一光束整型器、至少一透鏡與一影像偵測模組，其中上述的光源、光束整型器及至少一透鏡依序沿一光路徑配置，其中一光束整型器將光源經至少一透鏡所聚焦於樣品之光束焦點沿該光光路徑拉近或延伸，以利於將光源所輻射之光經透鏡聚焦於樣品中不同深度的位置進行掃描，其中上述光源、樣品分別置於至少一透鏡兩側；影像偵測模組，配置於光路徑上，俾使樣品置於該至少一透鏡與該影像偵測模組間，以利影像偵測模組擷取該樣品中不同深度之焦平面上所被激發出的光訊號並將多個光訊號組成多個平面影像。在一實施例中，本發明之光學系統又可為共軛焦光學顯微系統或是雙光子顯微系統。於另一實施例中，上述之系統進一步具有一分光鏡，上述分光鏡位於上述光之光路徑上且可用於反射上述樣品之不同深度平面影像至影像偵測模組中。在某些實施例中，上述樣品所被激發之光訊號可為螢光訊號。

在一實施例中，影像偵測模組擷取聚焦點在樣品中的不同深度位置之多個光訊號，且能夠依照多個光訊號擷取的時間先後順序將上述多個光訊號組合成多個平面影像排列在不同深度的二維平面上。

在本發明的第二觀點中，本發明之系統又進一步包含一影像處理模組，其可與上述的影像偵測模組相耦合，且得以將該多個平面影像重組成一立體影像。在一實施例中，當本系統對樣品進行連續性掃描時，上述影像處理模組可將多個平面影像重組成多個立體影像。在一實施例中，使用者可經由上述多個立體影像觀察樣品內的三維空間中的動態變化(例如，活體細胞內的分子活動、神經電位的變化、血液的流動等等)。

在本發明的第三觀點中，本發明之系統又包含一資料庫，其係可與影像處理模組連結以用於儲存上述所獲得之立體影像或多個平面影像；在一實施例中，上述所獲得之立體影像或多個平面影像亦可利用以與資料庫內現有的標準資料進行比對並產生比對結果；經由上述之比對結果可以得知立體影像或多個平面影像相對於標準資料的實際位置。

100‧‧‧光學系統

102‧‧‧光源

104‧‧‧光束整型器

106‧‧‧透鏡

108‧‧‧樣品

110‧‧‧分光鏡

112‧‧‧影像偵測模組

114‧‧‧針孔

302‧‧‧影像處理模組

402‧‧‧資料庫

本發明之實施例係藉由後附圖式中之實例加以說明，而非用以限制本發明。後附圖式中相似之元件符號係指類似之元件。

第一圖係根據一實施例顯示本發明之高速三維成像之光學系統。

第二圖係用以說明不同時間點取到的訊號可對應於不同焦平面的影像。

第三圖係顯示具有影像處理模組之光學系統。

第四圖係根據一實施例顯示多個平面影像組合成一立體影像。

第五圖係根據一實施例顯示具有一資料庫之光學系統。

以下藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟悉此技術之人士可藉由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之功效性與其優點。且本發明亦可藉由其他具體實施例加以運用及實施，本說明書所闡述之各項細節亦可基於不同需求而應用，且在不悖離本發明之精神下進行各種不同的修飾或變更。

本發明將以較佳實施例及觀點加以描述，此類敘述係解釋本發明之系統與方法，僅用以說明而非用以限制本發明之申請專利範圍。因此，除說明書中之較佳實施例以外，本發明亦可廣泛實行於其他實施例中。

如第一圖所示，本發明之高速三維成像之光學系統100包含：一光源102、一光束整型器104、至少一透鏡106與一影像偵測模組112。其中上述的光源102、光束整型器104及至少一透鏡106依序沿一光路徑配置，其中光束整型器104將該光源102經該至少一透鏡106所聚焦於一樣品108之焦點沿該光光路徑拉近或延伸，以利於將該光源所輻射之光聚焦於樣品內不同深度的位置，其中該光源102、該樣品108分別置於該至少一透鏡兩側；一影像偵測模組112，配置於該光光路徑上，俾使樣品置於該至少一透鏡與該影像偵測模組間，以利該影像偵測模組擷取該樣品中不同深度之焦平面上所被激發出的光訊號(例如，螢光訊號)。在一實施例中，本發明之光學系統又可為共軛焦光學顯微系統或是雙光子顯微系統。

於另一實施例中，上述之系統進一步具有一分光鏡110，上述分光鏡位於上述光之光路徑上且可用於反射上述樣品之不同深度平面影像至影像偵測模組中。於另一實施例中，上述所用之光源進一步可為可見光或紫外光(UV)。

於本發明之光學系統中，在影像偵測模組與樣品之間可進一步放置針孔(Pinhole)114以過濾非焦面的訊號，只擷取聚焦面之訊號進一步提供了光學切片的能力而將影像的對比提升。在一實施例中，當針孔越小，則影像的訊雜比越高。

在一實施例中，由於光源透過光束整型器的作用，使得光源所輻射之光能夠聚焦在樣品內的不同深度，因此影像偵測模組可於短時間內擷取來自不同樣品深度的光訊號；在某些實施例中，經由對於樣品連續性地掃描，則可觀察樣品內部的三維結構於不同時間點的變化。在一實施例中，本系統可偵測的樣品深度範圍為傳統無光束整型器之100倍以上。依據本發明之操作方式，本發明之系統毋須移動樣品且可掃描、擷取樣品的不同深度影像資訊。

於一實施例中，光束整型器造成光束聚焦點位置會沿其光路徑產生拉近或延伸，而光束聚焦點位置之拉近或延伸的長度則可對應到不同時間點並產生多個光訊號。在一實施例中，若採集上述某一時間點的光訊號，便可得到在透鏡後光束聚焦的焦點位置，同時決定對應相對的樣品深度。

在一實施例中，本系統之影像處理模組又可依下列計算式對於上述光束焦點沿該光光路徑拉近或延伸之長度與其相對樣品深度進行換算， 其中z₁為在時間t₁所取出之體素深度。為相位常數，t₁及t₂ 為相對於光束週期(T)的時間，並t₂-t₁小於光束擴張週期的一半、t₁及t₂時間取得的兩張具有最高的相關度影像(當關聯性越高，表示兩個平面影像的近似度越高)。

在一實施例中，如第二圖所示，影像偵測模組循序接收三維空間中的聚焦點所產生的多個光訊號，再將上述多個光訊號根據時間與二維空間橫向掃描的對應先組成以時間相位排列的多個平面影像。

如第三圖所示，上述之系統又進一步包含一影像處理模組，其與上述的影像偵測模組相耦合。當影像處理模組從影像偵測模組擷取多個平面影像後，影像處理模組可經由計算而將多個平面影像組合成一立體影像(參照第四圖)；在一實施例中，影像處理模組亦可用於儲存上述多個平面影像。

在一實施例中，如第五圖所示，本發明進一步包含一資料庫402，其係可與前述之影像處理模組連結以比對、分析動態影像；在一實施例中，上述已組合而成之立體影像或多個平面影像亦可利用以與資料庫內現有的標準資料(例如：果蠅腦部或其他種組織樣品)進行比對；經由比對結果可以得知立體影像或多個平面影像相對於標準資料的實際位置。在另一實施例中，資料庫又 進一步可與上述之影像偵測模組連結，而影像偵測模組可直接傳輸多個平面影像至資料庫中進行儲存。

在一實施例中，當無法對欲觀察的樣品位置進行取像，可調整至少一透鏡沿著Z軸方向之升降以針對樣品之不同深度進行聚焦取像。

本發明之方法中的若干者係以其最基礎的形式加以敘述，但在不脫離本發明之基礎範圍下仍可加入若干方法至其任一者或從其任一者刪除若干方法，且可增加若干資訊至此處所述訊息之任一者中或從其刪減若干資訊。此領域中具通常知識之技藝者將得以領會，可對本發明進一步做若干更動及改變。此處所提供之特定實施例並非用以限制本發明，而係用以說明本發明。

100‧‧‧光學系統

102‧‧‧光源

104‧‧‧光束整型器

106‧‧‧透鏡

108‧‧‧樣品

110‧‧‧分光鏡

112‧‧‧影像偵測模組

114‧‧‧針孔

Claims (11)

1. 一種高速三維成像之光學系統，其包含：一光源、一光束整型器及至少一透鏡依序沿一光路徑配置，其中該光束整型器將該光源經該至少一透鏡所聚焦於一樣品之光束焦點沿該光光路徑拉近或延伸，以利於將該光源所輻射之光聚焦於樣品中不同深度的位置，其中該光源、該樣品分別置於該至少一透鏡兩側；一影像偵測模組，配置於該光光路徑上，以利擷取該樣品之不同深度所被激發出的多個光訊號並將該多個光訊號組成多個平面影像。
2. 如請求項1所述之高速三維成像之光學系統，其中該系統可為共軛焦光學顯微系統或雙光子顯微系統。
3. 如請求項1或2所述之高速三維成像之光學系統，其中該系統又進一步包含一影像處理模組，其與該影像偵測模組相耦合，且將該多個平面影像組合成一立體影像。
4. 如請求項1所述之高速三維成像之光學系統，其中該系統進一步具有一分光鏡，其位於該光光路徑上且用於反射該樣品之不同深度平面影像。
5. 如請求項1所述之高速三維成像之光學系統，其中該系統又包含一針孔，其用以過濾非焦平面的訊號。
6. 如請求項3所述之高速三維成像之光學系統，其中該影像處理模組又可用於換算該光束焦點沿該光光路徑拉近或延伸之長度與其相對樣品深度。
7. 如請求項1或2所述之高速三維成像之光學系統，其中該系統又包含一資料庫，其係可與該影像偵測模組連結以用於儲存該多個平面影像。
8. 如請求項3所述之高速三維成像之光學系統，其中該系統又包含一資料庫，其係可與該影像處理模組連結以用於儲存該立體影像。
9. 如請求項1所述之高速三維成像之光學系統，其中可調整該至少一透鏡於Z 軸方向之升降以針對樣品之不同深度進行取像。
10. 如請求項1所述之高速三維成像之光學系統，其中該光源又為可見光或紫外光(UV)。
11. 如請求項1或8所述之高速三維成像之光學系統，其中該系統可偵測的樣品深度範圍為1~200μm。