CN102621115B - 一种共焦的光声荧光同时成像方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明属于无损测试测量技术，公开一种共焦的光声荧光同时成像方法与装置。该方法包括光声荧光激发光源发出的激光经过显微镜物镜聚焦后照射在样品上，激发出光声信号和荧光信号，分别被碗状中空聚焦超声探测器和光电倍增管接收，样品由电动平台带动扫描后，通过最大值投影算法重建出光声图像和荧光图像。该装置包括光声荧光激发光源发生器、碗状中空聚焦超声探测器、光电倍增管、反射镜、分光镜、显微镜物镜、超声耦合杯、样品台、二维电动平台、避光筒、滤光片、双通道并行采集卡和带有采集控制软件和电机控制软件的计算机。本发明的光声荧光同时成像装置能够实现高对比度以及高分辨率的光声及荧光成像，分辨率可以达到0.3～2微米。
Description
技术领域
本发明属于无损测试测量技术领域，特别涉及一种共焦的光声荧光同时成像方法与装置。
背景技术
光声成像技术利用短脉冲激光激发产生光声信号，可重建出组织的光吸收分布图像，它结合了纯光学成像的高对比度和纯声学成像的高分辨率特性。光声成像技术不仅能够有效的刻画生物组织结构，还能够精确实现无损功能成像，为研究生物组织的形态结构，生理、病理特征，代谢功能等提供了全新手段。
而荧光共焦显微镜由于其高分辨率，高灵敏度以及独特的轴向层析成像能力几乎适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等所有涉及细胞研究的医学和研究领域。它不仅可以通过对获得或固定的细胞以及组合i帧进行无损伤的“光学切片”获取精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像，并同时进行单标记或双标记细胞以及组织标本的荧光稳定性定量分析，还可以用于活细胞的生理信号诸如电位等。
将以上两种成像技术结合在一起，同时对组织进行成像，实现组织的光声和荧光互补成像，可以获取组织或细胞的更多的信息。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种共焦的光声荧光同时成像方法。
本发明的另一目的在于提供采用上述方法进行成像的装置。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种共焦的光声荧光同时成像方法，包括以下操作步骤：
(1)光声荧光激发光源发出的脉冲激光经过显微镜物镜聚焦后的点光斑落在样品上，同时激发产生光声信号和荧光信号；
(2)光声信号穿过超声耦合液后被碗状中空聚焦超声探测器接收，荧光信号经过分光镜和滤光片滤光后被光电倍增管接收，两路信号被双通道并行采集卡同时采集，再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像重建软件的计算机中；
(3)样品与盛放超声耦合液的超声耦合杯一起放置于二维电动平台上，由装有电机控制软件的计算机控制其移动，每采集完一次光声信号和荧光信号，电动平台移动一步，以对样品进行逐点扫描，用于重建二维图像；
(4)采集完全部的信号后，通过最大值投影的算法重建出样品的光声和荧光图像。
所述步骤(1)中的光声荧光激发光源为短脉冲激光器，输出激发波长可为400～2500nm，脉宽范围为5ns～50ns，重复频率为20～200kHz。
所述步骤(2)中的超声耦合液为水。
所述步骤(2)中的碗状中空聚焦超声探测器的主频为1～100MHz。
所述步骤(3)中的光声荧光激发光源发生器输出的脉冲激光经显微镜物镜聚焦后形成的点光斑直径范围为0.3～2微米，该光斑由于衍射的限制，一般最小达到0.2μm。所述碗状中空聚焦超声探测器的声焦点与脉冲激光经显微聚焦后的点光斑重合，即碗状中空聚焦超声探测器与显微镜物镜共焦点。
一种光声荧光同时成像的装置，是根据上述成像方法进行成像的，该装置包括光声荧光激发光源发生器、碗状中空聚焦超声探测器、光电倍增管、反射镜，分光镜，显微镜物镜、超声耦合杯、样品台、二维电动平台、避光筒、滤光片、双通道并行采集卡和带有采集控制软件、图像重建软件和电机控制软件的计算机；
所述显微镜物镜固定于碗状中空聚焦超声探测器内部，并保证显微镜物镜与碗状中空聚焦超声探测器共焦点；所述盛放超声耦合液的超声耦合杯位于样品正上方，碗状中空聚焦超声探测器和光电倍增管置于超声耦合杯的正上方，其中光电倍增管在碗状中空聚焦超声探测器的上方；
所述光声荧光激发光源发生器、碗状中空聚焦超声探测器、光电倍增管、二维电动平台、双通道并行采集卡与带有采集控制软件、图像重建软件和电机控制软件的计算机依次电气相连。
所述显微镜物镜的放大倍数为1倍，2倍，4倍，10倍以及20倍，成像质量只与放大倍数有关，倍数越高则质量越好。
所述双通道并行采集卡的型号可以为PCI2400(NI公司生产)，但其他型号的也可用；所述采集控制软件和图像重建软件均为Labview软件。
所述二维电动平台由转动电机和移动平台构成，通过电机旋转带动移动平台前后移动，二维电动平台由两个这种电动平台组成，可以实现前后左右四个方向移动；所述电机控制软件为Labview软件。
所述最大值投影的算法是通过Matlab软件自行编写的。
所述光声荧光同时成像装置的光声和荧光成像分辨率可以达到0.3～2微米。所述分辨率由显微镜物镜的点光斑的直径决定，计算公式为0.51λ/NA，其中λ为脉冲激光的波长，NA为显微镜物镜的数值孔径。
该装置操作简单，检测精度高，能够同时实现光声荧光双成像。
本发明的作用原理是：光声激发光源产生脉冲激光(波长、脉宽和重复频率可根据需要选择)，经过显微镜物镜聚焦之后照射样品，样品所产生的光声信号和荧光信号被碗状中空聚焦超声探测器和光电倍增管接收；二者接收的信号被双通道信号采集卡同时采集，传输到带有采集控制软件和计算软件的计算机做后处理；本发明采用信号激发源与信号接收器共焦点，并且光声信号和荧光信号同时采集，适用于待测样品的光声荧光同时双成像。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明在同一激发光源作用下同时激发出光声和荧光信号，二者被碗状中空聚焦超声探测器和光电倍增管同时接收，通过双通道并行采集系统同时采集，实现了光声和荧光的同时双成像。比起单一的模式，该装置能够同时重建光声图像和荧光图像，实现双成像，给出待测样品的双参数。
(2)本发明的碗状中空聚焦探测器、光电倍增管与脉冲激光通过显微镜物镜聚焦后所形成的点光斑共焦点，能够实现光声荧光的共焦成像，其分辨率比旋转扫描的光声成像方式分辨率高，旋转扫描的分辨率约为100微米。
附图说明
图1为实施例1的光声荧光同时成像装置的结构示意图，其中1为带有采集和控制软件的计算机，2为二维电动平台，3为光声荧光激发光源发生器，4为反射镜，5为放置样品的样品台，6为超声耦合杯，7为碗状中空聚焦超声探测器，8为显微镜物镜，9为避光筒，10为分光镜，11为滤光片，12为光电倍增管。
图2为实施例2得到的光声图像和荧光图像，其中，(a)为头发丝的光声图像；(b)为罗丹明的荧光图像。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：光声荧光同时成像装置的结构示意图如图1所示；
该装置包括带有采集和控制软件的计算机1，二维电动平台2，光声荧光激发光源发生器3，反射镜4，放置样品的样品台5，超声耦合杯6，碗状中空聚焦超声探测器7，显微镜物镜8，避光筒9，分光镜10，滤光片11，光电倍增管12；其中，光声荧光激发光源发生器3、碗状中空聚焦超声探测器7、光电倍增管12、带有采集组件和控制软件的计算机1依次电气相连；碗状中空聚焦超声探测器7和显微镜物镜8共焦点。
显微镜物镜8装在碗状中空聚焦超声探测器7内部；超声耦合杯6位于放置样品的样品台5上方，两者为一个整体，固定在二维电动平台2上，二维电动平台2带动放置样品的样品台和超声耦合杯一起移动并扫描；超声耦合杯6中装入超声耦合液水用于光声信号传播；所述光声荧光激发光源发生器3发出的脉冲激光由反射镜4和分光镜10反射，然后经过显微镜物镜8聚焦后照射在样品上，即脉冲激光经过聚焦后形成的点光斑落在样品上，产生的光声信号先经过超声耦合液以后被碗状中空聚焦超声探测器7和光电倍增管12接收，产生的荧光信号经过分光镜10和滤光片11后被光电倍增管12接收，接收的荧光信号和光声信号同时被带有采集控制软件和图像重建软件Labview的计算机1采集。
二维电动平台2由带有电机控制软件Labview的计算机控制移动，每采集完一次光声信号和荧光信号，电动平台移动一步，采集完全部的信号后，通过最大值投影的算法(为通过Matlab软件自行编写)重建出样品的光声图像和荧光图像。
实施例2：应用实施例1所述装置实现光声荧光同时成像的方法如下：
(1)将滴有罗丹明(该物质为荧光染料，用于荧光成像)，并且埋有头发丝的琼脂块放在样品台上；
(2)光声荧光激发光源发生器采用Nd:YAG泵浦的激光器，输出激光波长为532nm，脉宽为10ns，重复频率是20Hz；上述激光器产生的脉冲激光经聚焦物镜聚焦后的点光斑落在样品上，产生光声信号和荧光信号；
(3)头发丝被脉冲激光照射后产生光声信号，光声信号穿过超声耦合液水后被碗状中空聚焦超声探测器(主频为15MHz)接收；罗丹明被脉冲激光照射后产生荧光信号，荧光信号经过分光镜和滤光片滤光后被光电倍增管接收；两路信号被双通道并行采集卡同时采集，再将数据传输并储存到带有采集控制软件和图像重建软件的计算机中；
(5)对采集的数据进行处理，通过最大值投影的算法重建出样品的光声和荧光图像，得到如图2所示的图像，其中，(a)为头发丝的光声图像；(b)为罗丹明的荧光图像。
可见，通过本发明的装置可以同时获得样品的光声图像和荧光图像，即可以对有光学吸收但不发出荧光的物质进行光声成像，也可以对有光学吸收又会发出荧光的物质进行荧光成像，最终通过一次扫描对样品同时进行光声荧光双成像。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种共焦的光声荧光同时成像装置，其特征在于：该装置包括光声荧光激发光源发生器、碗状中空聚焦超声探测器、光电倍增管、反射镜、分光镜、显微镜物镜、超声耦合杯、样品台、二维电动平台、避光筒、滤光片、双通道并行采集卡和带有采集控制软件、图像重建软件和电机控制软件的计算机；所述显微镜物镜固定于碗状中空聚焦超声探测器内部，并使显微镜物镜与碗状中空聚焦超声探测器共焦点；
所述超声耦合杯位于样品正上方，碗状中空聚焦超声探测器和光电倍增管置于超声耦合杯的正上方，其中光电倍增管在碗状中空聚焦超声探测器的上方；
所述光声荧光激发光源发生器、碗状中空聚焦超声探测器、光电倍增管、二维电动平台、双通道并行采集卡与带有采集控制软件、图像重建软件和电机控制软件的计算机依次电气相连。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述二维电动平台由转动电机和移动平台构成，通过电机旋转带动移动平台前后移动，二维电动平台由两个这种电动平台组成，实现前后左右四个方向移动；所述电机控制软件为Labview软件。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：通过所述装置得到的光声图和荧光图像的分辨率达到0.3～2微米。
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