CN104614846B - 反射式分光瞳差动共焦‑光声显微成像装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种反射式分光瞳差动共焦‑光声显微成像装置与方法，属于共焦显微成像技术和光声显微成像技术领域。本发明将分光瞳差动共焦显微成像系统与光声成像系统的结构与功能有机融合，利用分光瞳差动共焦显微成像系统探测生物样品的空间结构信息，利用光声显微成像系统探测生物样品的功能信息，继而实现生物样品空间结构信息和功能信息的同时探测，以期对生物活体进行原位、无创的实时成像。分光瞳差动共焦成像技术的采用使分光瞳差动共焦光声显微成像装置的轴向分辨力和工作距得以有效兼顾，可抑制焦面杂散光对成像质量的干扰，系统信噪比高，便于分光瞳差动共焦‑光声显微成像装置的集成化和手持式设计。

Description

反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置与方法

技术领域

本发明涉及一种反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置与方法，属于共焦显微成像技术和光声显微成像技术领域。

技术背景

共焦显微成像技术由于具有光学领域独特的层析成像能力和高空间分辨能力，而被作为重要的技术手段在生物医学研究、物理化学研究、材料测试、微纳测试等领域得到广泛的应用。但是，现有共焦显微成像技术主要采用物体的散射光或荧光来进行成像，它获得的仅是被观察物体的结构图像，无法获得细胞或生物大分子的功能图像，同时共焦显微成像的层析深度仅达亚毫米量级。

光声成像是基于光声信号以被测对象的光学吸收特性为对比机制来进行成像，由于光声信号与生物组织的光学、热学和声学特性有关，因而光声信号所携带的信息量远多于共焦显微成像中散射光和荧光所携带的信息量，因此，光声成像可实现生物功能的成像，即可获得生物组织的化学组分及生物学行为(如生长、凋亡、代谢、病变、突变等)特征信息，同时光声成像的层析深度可达厘米量级。但是，光声成像的分辨力仅达10微米，它无法实现细胞水平的结构图像。

若将上述两种成像技术结合在一起，便能利用共焦显微成像和光声成像各自的技术优点对生物组织进行光声和共焦互补成像，可获取组织或细胞的更多的信息，同时可通过共焦聚焦提高横向分辨力，通过超声时间探测进一步拓展层析成像深度。

基于上述情况，本发明提出一种同时利用后向散射光子来实现共焦显微成像与光声成像的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置与方法，以期对生物活体进行原位、无创的实时成像。

本发明将反射式分光瞳差动共焦显微成像系统与光声成像系统的结构与功能有机融合，利用共焦显微成像系统探测被测对象的成分空间信息，利用光声显微成像系统探测被测对象的成分功能信息，继而实现被测对象成分空间信息和功能信息的同时探测。

反射式分光瞳差动共焦显微成像系统的采用使共焦-光声显微成像装置的轴向分辨力和工作距得以有效兼顾，抑制高散射被测对象焦面杂散光对共焦显微成像质量的干扰，便于共焦-光声显微成像装置的集成化和手持式设计。

发明内容

本发明的目的是设计一种反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置及方法，以期同时获得被测对象成分空间信息和功能信息。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

本发明的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，包括点光源系统，还包括依次放置在脉冲光束行进方向的准直透镜、反射聚光镜、三维光束扫描器和被测对象，依次放置在被测对象背向散射方向来探测光声信号的声学透镜和超声换能器，以及用于探测被测对象背向散射光或荧光信号的反射式分光瞳差动共焦探测系统；其中，反射式分光瞳差动共焦探测系统包括：沿被测对象背向散射光行进方向依次放置的三维光束扫描器、反射聚光镜、集光镜、用于放大集光镜焦斑的中继放大透镜、位于中继放大透镜焦面并使两针孔关于光轴左右对称放置的双孔针孔，以及放在双孔针孔后的第一光强探测器和第二光强探测器。

本发明的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，反射聚光镜与声学透镜背向贴近放置，且经反射聚光镜和三维光束扫描器聚焦的光学焦点与声学透镜的焦点共焦点。

本发明的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，反射式分光瞳差动共焦探测系统可以包括：沿被测对象背向散射光行进方向依次放置的三维光束扫描器、反射聚光镜、集光镜、中继放大透镜和位于中继放大透镜焦面上的CCD探测器。

本发明的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，反射式分光瞳差动共焦探测系统还可以包括：沿被测对象背向散射光行进方向依次放置的三维光束扫描器、反射聚光镜、集光镜、中继放大透镜、位于中继放大透镜焦面并使两针孔关于光轴左右对称放置的双孔针孔以及放在双孔针孔后的二象限光电探测器。

本发明的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，点光源系统可以是光纤出射点光源系统。

本发明的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，点光源系统还可以由激光器、放置在激光出射方向的聚焦镜和放置在聚焦镜焦点位置的针孔构成，其中激光器可采用脉冲激光或周期性强度调制激光，其波长、脉宽和重复频率可根据需要选择。

本发明的一种反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像方法，包括以下步骤：

步骤一、打开点光源系统，使点光源系统出射的光束经准直透镜、反射聚光镜、三维光束扫描器后聚焦到被测对象上激发出光声信号、散射光或荧光信号；

步骤二、利用声学透镜和超声换能器来收集和探测光声信号，用于表征被测对象的生物功能信息；

步骤三、利用反射聚光镜、三维光束扫描器、集光镜、中继放大透镜将探测的被测对象的散射光或荧光聚焦在位于中继放大透镜焦面出的双孔针孔上，位于双孔针孔后的第一光强探测器和第二光强探测器各自探测对应针孔出射的强度信号并进行差动相减，即可探测被测对象的结构图像信息；

步骤四、计算机通过三维光束扫描器来控制聚焦光束对被测对象进行三维扫描，来对被测对象激发出的光声信号、散射光或荧光信号进行实时层析成像；

步骤五、计算机将探测的被测对象的光声信号、散射光或荧光信号进行数据融合处理，即可实现被测对象成份空间信息和功能信息的原位、无创成像。

本发明反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像方法中，步骤三还可以为：利用反射聚光镜、三维光束扫描器、集光镜、中继放大透镜将探测的被测对象的散射光或荧光聚焦在位于中继放大透镜焦面处的CCD探测器上，计算机将焦面上的放大焦斑分割为第一虚拟针孔和第二虚拟针孔进行强度探测，将第一虚拟针孔探测的第一离轴共焦信号和第二虚拟针孔探测的第二离轴共焦信号差动相减得到分光瞳差动共焦信号，利用该分光瞳差动共焦信号即可探测被测对象的结构图像信息；

本发明反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像方法中，步骤三还可以为：利用反射聚光镜、三维光束扫描器、集光镜、中继放大透镜将探测的被测对象的散射光或荧光聚焦在位于中继放大透镜焦面上的双孔针孔，位于双孔针孔后的二象限光电探测器的两个象限光强探测区域各自探测对应针孔出射的强度信号并进行差动相减，即可探测被测对象的结构图像信息。

有益效果

本发明对比已有技术，具有以下优点：

1)本发明基于斜入射的激光分光瞳差动共焦显微成像系统，使激发光照射区域与超声探头检测区域相重合，用同一激发光源通过斜入射照射方式同时激发出光声和荧光信号，以期实现光声和荧光的同时双成像，可获得单模式方式难以获得的信息；

2)斜入射的激光分光瞳差动共焦成像技术，在不降低轴向分辨力的前提下，大幅增加了成像系统的工作距，使光声成像系统和三维光束扫描器便于集成到反射式共焦-光声显微成像装置，便于生物活体成份结构信息和功能信息的原位、无创、实时成像；

3)在不引入高数值孔径的物镜的条件下，利用低数值孔径的物镜即可提高共焦系统的轴向分辨力，扩展了共焦显微系统的工作距离，更易于测量装置实现小型化和手持式；

4)分光瞳差动共焦探测方法的采用使测量系统具有绝对零点和双极性跟踪特性，线性量程范围宽，提高了层析精度的同时还可实现绝对测量；同时提高了系统的信噪比，可有效地抑制环境状态的差异、光源光强的波动、探测器电气漂移等引起的共模噪声；

5)斜入射的激光分光瞳差动共焦成像技术可抑制焦面上生物被测对象杂散光对共焦显微成像质量的干扰等。

附图说明

图1.反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置；

图2.反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置；

图3.反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置；

图4.反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置实施例；

图5.反射式分光瞳差动共焦显微成像示意图；

图6.分光瞳差动共焦显微结构示意图；

图7.反射式分光瞳差动共焦显微与共焦显微成像轴向分辨力比较。

其中：1-点光源系统、2-脉冲光束、3-准直透镜、4-反射聚光镜、5-超声换能器，6-声学透镜、7-被测对象、8-三维光束扫描器、9-集光镜、10-中继放大透镜、11-双孔针孔、12-第一光强探测器、13-第二光强探测器、14-激光器、15-聚焦镜、16-针孔、17-CCD探测器、18-光纤出射点光源、19-二象限光电探测器、20-像差补偿半球镜、21-超声探测电路系统、22-光强信号采集系统、23-计算机、24-放大焦斑、25-第一虚拟针孔、26-第二虚拟针孔、27-第一离轴共焦信号、28-第二离轴共焦信号、29-分光瞳差动共焦信号、30-斜入射激发光束、31-斜出射被测对象散射光、32-照明光学系统的点扩散函数(PSF)、33-收集光学系统的PSF、34-合成的系统PSF、35-反射式分光瞳差动共焦仿真轴向响应曲线、36-普通共焦显微系统的仿真轴向响应曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明实施例基于图4所示的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，包括激光器14、放置在激光出射方向的聚焦镜15和放置在聚焦镜15焦点处的针孔16构成的点光源系统1，依次放置在脉冲光束2行进方向的准直透镜3、反射聚光镜4、三维光束扫描器8、像差补偿半球镜20和被测对象7，依次放置在被测对象7背向散射方向来探测光声信号的声学透镜6和超声换能器5，以及用于探测被测对象7背向散射光或荧光信号的反射式分光瞳差动共焦探测系统；其中反射式分光瞳差动共焦探测系统包括：沿被测对象7背向散射方向依次放置的像差补偿半球镜20、三维光束扫描器8、反射聚光镜4、集光镜9、中继放大透镜10和位于中继放大透镜10焦面上的CCD探测器17。

激光器14采用脉冲激光器或周期性的强度调制光，其波长、脉宽和重复频率可根据需要选择。

中继放大透镜10用于放大集光镜9的聚焦焦斑以便CCD探测器17进行分割焦斑差动探测。

三维光束扫描器8用于聚焦光束的三维层析扫描，采用MEMS器件，便于系统的集成化。

像差补偿半球镜20用于补偿系统像差和匹配被测对象折射率。

对被测对象进行原位、无创成像的过程如下：

激光器14发出的激光光束经聚焦镜15聚焦到针孔16形成点光源，针孔16出射的脉冲光束2经准直透镜3、反射聚光镜4、三维光束扫描器8、像差补偿半球镜20后聚焦到被测对象7上激发出光声信号、散射光或荧光信号。

光声信号由声学透镜6收集后被超声换能器5探测，再经超声探测电路系统21处理后传送给计算机23。

如图4-5所示，聚焦光束激发的被测对象散射光或荧光信号经像差补偿半球镜20、三维光束扫描器8、反射聚光镜4、集光镜9、中继放大透镜10聚焦到位于中继放大透镜10焦面上的CCD探测器17上，光强信号采集系统22和计算机23将焦面放大焦斑24分割为第一虚拟针孔25和第二虚拟针孔26进行强度探测，将第一虚拟针孔25探测的第一离轴共焦信号27和第二虚拟针孔26探测的第二离轴共焦信号28差动相减得到分光瞳差动共焦信号29，利用该分光瞳差动共焦信号29即可探测被测对象7的结构图像信息。

计算机23通过三维光束扫描器8来控制聚焦光束对被测对象7进行三维扫描，来对被测对象7激发出的光声信号、散射光或荧光信号进行实时层析成像。

计算机23依据发给三维光束扫描器8的三维位置信号、光强信号采集系统22采集的分光瞳差动共焦信号和超声探测电路系统21采集的光声信号进行数据融合处理，即可同时得到生物组织的成份空间信息和功能信息。

如图6所示，反射式分光瞳差动共焦显微成像技术利用光轴之间存在一定夹角θ的照明光学系统与收集光学系统的PSF相互制约，减小系统PSF的主瓣宽度，从而达到提高轴向分辨力和工作距离的目的。

如图5所示，反射式分光瞳差动共焦显微成像装置利用低数值孔径的反射聚光镜4分别构成照明光学系统和收集光学系统，照明光学系统光轴(z_i轴)和收集光学系统光轴(z_c轴)成θ角放置，(x，y，z)为系统坐标系，(x_i，y_i，z_i)和(x_c，y_c，z_c)分别为斜入射激发光束30和斜出射被测对象散射光31在被测对象空间的坐标。

三个坐标系之间的变换关系为：

x_i＝x cosθ-z sinθ x_c＝x cosθ+z sinθ (1)

y_i＝y y_c＝y (2)

z_i＝x sinθ+z cosθ z_c＝-x sinθ+z cosθ (3)

反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置的理论模型可由基于旁轴近似的衍射理论进行推导。

准直透镜3、反射聚光镜4、三维光束扫描器8、像差补偿半球镜20构成照明光学系统，照明光学系统的PSF 32的表达式为：

$h_i(x_i,y_i,z_i)=\∫{\∫}_{-\∞}^{+\∞}{P}_i(x_{\mathrm{i\ρ}},y_{\mathrm{i\ρ}})\exp \left[\frac{i{u}_i}{2}(x_{\mathrm{i\ρ}}^2+y_{\mathrm{i\ρ}}^2)\right]\exp \left[i(v_{\mathrm{ix}}{x}_{\mathrm{i\ρ}}+v_{\mathrm{iy}}{y}_{\mathrm{i\ρ}})\right]d{x}_{\mathrm{i\ρ}}d{y}_{\mathrm{i\ρ}}---\left(4\right)$

像差补偿半球镜20、三维光束扫描器8、反射聚光镜4、集光镜9和中继放大透镜10构成了收集光学系统，收集光学系统的PSF 33的表达式为：

$h_c(x_c,y_c,z_c)=\∫{\∫}_{-\∞}^{+\∞}{P}_c(x_{\mathrm{c\ρ}},y_{\mathrm{c\ρ}})\exp \left[\frac{i{u}_c}{2}(x_{\mathrm{c\ρ}}^2+y_{\mathrm{c\ρ}}^2)\right]\exp \left[i(v_{\mathrm{cx}}{x}_{\mathrm{c\ρ}}+v_{\mathrm{cy}}{y}_{\mathrm{c\ρ}})\right]d{x}_{\mathrm{c\ρ}}d{y}_{\mathrm{c\ρ}}---\left(5\right)$

其中，P_i(x_iρ，y_iρ)和P_c(x_cρ，y_cρ)分别是用于照明的反射聚光镜4和用于收集光的反射聚光镜4的瞳函数，v_ix、v_iy和u_i是反射聚光镜4在被测对象空间的归一化光学坐标，v_cx、v_cy和u_c是反射聚光镜4在被测对象空间的归一化光学坐标。

因此，探测到的反射式分光瞳差动共焦成像系统的PSF 34的表达式为：

h_cs(x，y，z)＝h_i(x_i，y_i，z_i)×h_c(x_c，y_c，z_c) (6)

因此，探测到的反射式分光瞳差动共焦成像系统的强度响应表达式为：

I_cs(x，y，z)＝|h_i(x_i，y_i，z_i)×h_c(x_c，y_c，z_c)|² (7)

定义(x_d，y_d，z_d)为集光镜9在探测空间的坐标，当点探测器沿x_d轴方向存在横向偏移M时，收集光学系统的的点扩散函数PSF 33的表达式变为：

$\begin{array}{c}{h}_c(x_c,y_c,z_c,v_{\mathrm{xM}})=\∫\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}{P}_c(x_{\mathrm{c\ρ}},y_{\mathrm{c\ρ}})\exp \left[\frac{i{u}_c}{2}(x_{\mathrm{c\ρ}}^2+y_{\mathrm{c\ρ}}^2)\right]\\ \×\exp \left\{i\right[(v_{\mathrm{cx}}+v_{\mathrm{xM}})x_{\mathrm{c\ρ}}+v_{\mathrm{cy}}{y}_{\mathrm{c\ρ}}\left]\right\}d{x}_{\mathrm{c\ρ}}d{y}_{\mathrm{c\ρ}}\end{array}---\left(8\right)$

其中，v_xM是对应于横向偏移M的归一化横向偏移量，可依据分辨力参数要求进行优化设计。

因此，第一虚拟针孔25和第二虚拟针孔26所探测到的强度响应I₁(x，y，z，-v_xM)和I₂(x，y，z，+v_xM)分别为：

I₁(x，y，z，-v_xM)＝|h_i(x_i，y_i，z_i)×h_c(x_c，y_c，z_c，-v_xM)|² (9)

I₂(x，y，z，+v_xM)＝|h_i(x_i，y_i，z_i)×h_c(x_c，y_c，z_c，+v_xM)|² (10)

则反射式分光瞳差动共焦显微系统强度响应为：

I(x，y，z，v_xM)＝I₁(x，y，z，-v_xM)-I₂(x，y，z，+v_xM) (11)

由公式(4)可求得照明光学系统的点扩散函数PSF如图6中的32所示，由公式(5)可求得收集光学系统的点扩散函数PSF如图6中的33所示，由公式(6)可求得反射式分光瞳差动共焦显微成像系统的合成PSF如图6中的34所示。

由于反射式分光瞳差动共焦显微成像系统的PSF是照明光学系统的PSF 32与收集光学系统的PSF 33的乘积，因此在反射式分光瞳差动共焦结构中可以得到一个轴向(z方向)宽度Δz和横向(x方向)宽度Δx相近的合成的系统PSF 34。

从图6中可以看出：合成的系统PSF 34的焦体越小，共焦显微系统就能观察被测对象的更精细结构的信息，从而达到了提高共焦系统轴向分辨力的目的。理论上当两个光轴正交时，系统的合成焦体体积最小，可形成一个近乎球形的焦体。

反射式分光瞳差动共焦显微成像系统则在反射式分光瞳共焦显微成像系统的基础上进一步提高了轴向分辨能力。

依据公式(11)本实施例的仿真轴向响应曲线35如图7所示，同等数值孔径NA.条件下普通共焦显微系统的仿真轴向响应曲线36如图7所示。

从仿真轴向响应曲线35和36可以看出，反射式分光瞳差动共焦显微成像系统大幅提高了共焦显微系统的轴向分辨力，换言之，在达到同等轴向分辨力的前提下，反射式分光瞳差动共焦显微成像系统的数值孔径NA.要比共焦显微系统的NA.小得多，即反射式分光瞳差动共焦显微成像系统的工作距大幅提高。

反射式分光瞳差动共焦显微成像系统的工作距大幅提高为三维光束扫描器8的安放以及光束的三维层析扫描成像提供了必要的前提。

实施例2

如图1所示，在实施例1的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，将CCD探测器17替换为位于中继透镜焦面上、双孔轴对称放置的双孔针孔11，以及位于双孔针孔11后的第一光强探测器12和第二光强探测器13，探测激发的被测对象7的散射光或荧光信号。

其余测量方法与实施例1相同。

实施例3

如图2所示，在实施例1的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，将点光源系统1替换为光纤出射点光源18。

其余测量方法与实施例1相同。

实施例4

如图3所示，在实施例1的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置中，将CCD探测器17替换为位于中继透镜焦面上、双孔轴对称放置的双孔针孔11，以及位于双孔针孔11后的二象限光电探测器19，探测激发的被测对象7的散射光或荧光信号。

其余测量方法与实施例1相同。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围。

本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，包括点光源系统(1)，其特征在于：还包括依次放置在脉冲光束(2)行进方向的准直透镜(3)、反射聚光镜(4)、三维光束扫描器(8)和被测对象(7)，依次放置在被测对象(7)背向散射方向来探测光声信号的声学透镜(6)和超声换能器(5)，以及用于探测被测对象(7)背向散射光或荧光信号的反射式分光瞳差动共焦探测系统；其中，反射式分光瞳差动共焦探测系统包括：沿被测对象(7)背向散射光行进方向依次放置的三维光束扫描器(8)、反射聚光镜(4)、集光镜(9)、用于放大集光镜(9)焦斑的中继放大透镜(10)、位于中继放大透镜(10)焦面并使两针孔关于光轴左右对称放置的双孔针孔(11)，以及放在双孔针孔(11)后的第一光强探测器(12)和第二光强探测器(13)；反射聚光镜(4)与声学透镜(6)背向贴近放置，且经反射聚光镜(4)和三维光束扫描器(8)聚焦的光学焦点与声学透镜(6)的焦点重合。

2.根据权利1所述的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，其特征在于：反射式分光瞳差动共焦探测系统包括：沿被测对象(7)背向散射光行进方向依次放置的三维光束扫描器(8)、反射聚光镜(4)、集光镜(9)、中继放大透镜(10)和位于中继放大透镜(10)焦面上的CCD探测器(17)。

3.根据权利1所述的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，其特征在于：反射式分光瞳差动共焦探测系统还可以包括：沿被测对象(7)背向散射光行进方向依次放置的三维光束扫描器(8)、反射聚光镜(4)、集光镜(9)、中继放大透镜(10)、位于中继放大透镜(10)焦面并使两针孔关于光轴左右对称放置的双孔针孔(11)以及放在双孔针孔(11)后的二象限光电探测器(19)。

4.根据权利1所述的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，其特征在于：点光源系统(1)可以是光纤出射点光源(18)。

5.根据权利1所述的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，其特征在于：点光源系统(1)还可以由激光器(14)、放置在激光出射方向的聚焦镜(15)和放置在聚焦镜(15)焦点位置的针孔(16)构成。

6.根据权利要求5所述的反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像装置，其特征在于：激光器(14)可采用脉冲激光或周期性强度调制激光，其波长、脉宽和重复频率可根据需要选择。

7.一种反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、打开点光源系统(1)，使点光源系统(1)出射的脉冲光束(2)经准直透镜(3)、反射聚光镜(4)、三维光束扫描器(8)后聚焦到被测对象(7)上激发出光声信号、散射光或荧光信号；

步骤二、利用声学透镜(6)和超声换能器(5)来收集和探测光声信号，用于表征被测对象(7)的生物功能信息；

步骤三、利用反射聚光镜(4)、三维光束扫描器(8)、集光镜(9)、中继放大透镜(10)将探测的被测对象(7)的散射光或荧光聚焦到位于中继放大透镜(10)焦面处的双孔针孔(11)上，位于双孔针孔(11)后的第一光强探测器(12)和第二光强探测器(13)各自探测对应针孔出射的强度信号并进行差动相减，即可探测被测对象(7)的结构图像信息；

步骤四、计算机(23)通过三维光束扫描器(8)控制聚焦光束对被测对象(7)进行三维扫描，来对被测对象(7)激发出的光声信号、散射光或荧光信号进行实时层析成像；

步骤五、计算机(23)将探测的被测对象(7)的光声信号、散射光或荧光信号进行数据融合处理，即可实现被测对象成分空间信息和功能信息的原位、无创成像。

8.根据权利要求7所述的一种反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像方法，其特征在于：所述步骤三可以为：利用反射聚光镜(4)、三维光束扫描器(8)、集光镜(9)、中继放大透镜(10)将探测的被测对象(7)的散射光或荧光聚焦在位于中继放大透镜(10)焦面处的CCD探测器(17)上，计算机(23)将焦面上的放大焦斑(24)分割为第一虚拟针孔(25)和第二虚拟针孔(26)进行强度探测，将第一虚拟针孔(25)探测的第一离轴共焦信号(27)和第二虚拟针孔(26)探测的第二离轴共焦信号(28)差动相减得到分光瞳差动共焦信号(29)，利用该分光瞳差动共焦信号即可探测被测对象(7)的结构图像信息。

9.根据权利7要求所述的一种反射式分光瞳差动共焦-光声显微成像方法，其特征在于：步骤三还可以为：利用反射聚光镜(4)、三维光束扫描器(8)、集光镜(9)、中继放大透镜(10)将探测的被测对象(7)的散射光或荧光聚焦在位于中继放大透镜(10)焦面处的双孔针孔(11)上，位于双孔针孔(11)后的二象限光电探测器(19)的两个象限光强探测区域各自探测对应针孔出射的强度信号并进行差动相减，即可探测被测对象(7)的结构图像信息。