MX2007010279A - Glicosaminoglicanasas solubles y metodos de preparar y usar glicosaminoglicanasas solubles. - Google Patents

Glicosaminoglicanasas solubles y metodos de preparar y usar glicosaminoglicanasas solubles.

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MX
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kda
hyaluronidase
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MX2007010279A
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Louis H Bookbinder
Gregory I Frost
Tyler M Dylan
Anirban Kundu
Michael F Haller
Gilbert A Keller
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Halozyme Therapeutics Inc
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Abstract

La invención se refiere al descubrimiento de glicoproteínas hialuronidasa activas, neutras, solubles (Shasgp's), novedosas, métodos de elaboración, y su uso para facilitar la administración de otras moléculas o para aliviar patologías asociadas con glicosaminoglicano. Se describen dominios de polipéptido mínimamente activos de los dominios de sHASEGP activos, neutros, solubles, que incluyen fracciones azúcar enlazadas a asparagina requeridas para un dominio hialuronidasa activo, neutro, funcional. Se incluyen péptidos líderes amino-terminales, modificados, que acrecientan la secreción de sHASEGP. La invención comprende además formas sialadas y PEGiladas de sHASEGP recombinante para acrecentar la estabilizada y la fármaco-cinética en suero sobre enzimas de matadero que ocurren de manera natural. Se describen además formulaciones adecuadas de glicopro-teína sHASEGP recombinante , sustancialmente purificada derivada de una célula eucariótica que genera la glicosilación requerida para su óptima actividad.

Description

GLICOSAMINOGLICANASAS SOLUBLES Y MÉTODOS DE PREPARAR Y USAR GLICOSAMINOGLICANASAS SOLUBLES Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La presente invención está relacionada generalmente con enzimas glicosaminoglicanasas , que incluyen glicoproteínas hialuronidasas (sHASEGPs) solubles, neutras-activas , y porciones de ellas, particularmente dominios hialuronidasa . De manera mas específica, la invención está relacionada con modificaciones químicas, composiciones farmacéuticas, plásmidos de expresión, métodos para elaborar y métodos terapéuticas que usan las glicosaminoglicanasas (y sus dominios y las moléculas de ácido nucleico que codifican) para la modificación terapéutica de glicosaminoglicanos en el tratamiento de enfermedades y para uso para incrementar la difusión de otras moléculas, tales como moléculas inyectadas, en un animal. Información Antecedente Los glicosaminoglicanos (GAGs) son polisacáridos lineales complejos de la matriz extra-celular (ECM) , los glicosaminoglicanos se caracterizan por estructuras de disacáridos de repetición de una hexosamina N-sustituida y un ácido urónico, (en el caso de hialuronano (HA) , sulfato de condroitina (CS) , condroitina (C) , sulfato de dermatano (DS) , sulfato de heparano (HS) , heparina (H) ) , o una galactosa (en el caso de sulfato de queratano (KS) ) . Con la excepción del hialuronano, todas existen covalentemente enlazadas a las proteínas de núcleo. Los glicosaminoglicanos con sus proteínas de núcleo son referidos estructuralmente como proteoglicanos (PGs) . El hialuronano (HA) se encuentra en mamíferos, predominantemente en los tejidos conectivos, en la piel, en el cartílago, y en el fluido sinovial . El hialuronano también es el constituyente principal del humor vitreo del ojo. En el tejido conectivo, el agua de la hidratación asociada con el hialuronano crea matrices hidratadas entre los te idos. El hialuronano tiene un papel clave en los fenómenos biológicos asociados con la movilidad celular, incluyendo rápido desarrollo, regeneración, reparación, embriogénesis , desarrollo embriológico, sanado de heridas, angiogénesis , y tumorigénesis (Toóle 1991 Cell Biol . Extracell. Matriz, Hay (editor), Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand y colaboradores, 1992 Int. J. Cáncer 52:1-6; Knudson y colaboradores, 1993 FASEB J. 7:1233-1241) . Además, los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad del tumor (Ozello y colaboradores, 1960 Cáncer Res. 20:600-604; Takeuchi y colaboradores, 1976, Cáncer Res . 36:2133-2139; Kimata y colaboradores 1983 Cáncer Res. 43:1347-1354). El hialuronano se encuentra en la matriz extra-celular de muchas células, en especial en los tejidos conectivos blandos. Al hialuronano se le han asignado varias funciones fisiológicas, tales como en homeostasis de proteína en agua y plasma (Laurent TC y colaboradores (1992) FASEB J. 6:2397-2404) . La producción de hialuronano aumenta en las células proliferantes, y puede tener un papel en la mitosis. También se ha implicado en la locomoción y en la migración celular. El hialuronano parece tener papeles importantes en la regulación, desarrollo, y diferenciación celular (Laurent y colaboradores, supra) . El hialuronano se ha utilizado en medicina clínica. Sus propiedades protectoras y reologicas del tejido han probado ser útiles en cirugía oftálmica para proteger el endotelio córneo durante la cirugía de cataratas. El hialuronano en suero es un diagnóstico de enfermedad hepática y diferentes condiciones inflamatorias, tales como artritis reumatoide . El edema intersticial causado por la acumulación de hialuronano puede causar disfunción de diferentes órganos (Laurent y colaboradores, supra) . Las interacciones de proteína-hialuronano también están involucradas en la estructura de la matriz extra-celular o "sustancia molida" . Las hialuronidasas son un grupo de enzimas activas en neutro y en ácido que se encuentran a través de todo el reino animal . La hialuronidasas varían con respecto a la especificidad del sustrato y el mecanismo de 'acción. Existen tres clases generales de hialuronidasas : 1. Hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35), las cuales son endo-beta-N-acetil -hexosaminidasas con tetrasacáridos y hexasacáridos como los productos finales principales. Tienen actividades tanto hidrolíticas como de transglicosidasa, y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroitina (CS) , específicamente C4-S y C6-S. 2. Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1) degradan el hialuronano, y hasta cierto grado, el sulfato de condroitina y el sulfato de dermatano . También son endo-beta-N-acetil -hexosaminidasas que operan mediante una reacción de eliminación beta que produce primordialmente productos finales de disacáridos . 3. Las hialuronidasas (EC 3.2.1.36) de sanguijuelas, otros parásitos, y crustáceos, son endo-beta-glucoronidasas que generan productos finales de tetrasacáridos y hexasacáridos a través de la hidrólisis del enlace beta 1-3. Las hialuronidasas de mamífero se pueden dividir además en dos grupos: enzimas activas en neutro y activas en ácido. Hay seis genes tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYALl, HYAL2 , HYAL3, HYAL4, HYALP1, y PH20/PAMl . HYALP1 es un pseudo-gen, y HYAL3 no ha mostrado poseer la actividad enzimática hacia cualquier sustrato conocido. HYAL4 es una condroitinasa , y carece de actividad hacia el hialuronano. HYALl es la enzima activa en ácido prototípica, y PH20 es la enzima activa en neutro prototí-pica. Las hialuronidasas activas en ácido, tales como HYALl y HYAL2 carecen de actividad catalítica en un pH neutro (es decir, pH 7) . Por ejemplo, HYAL1 no tiene actividad catalítica in vitro sobre pH 4.5 (Frost y colaboradores, Anal. Biochemistry, 1997) . HYAL2 es una enzima activa en ácido con una actividad específica muy baja in vitro. Las enzimas tipo hialuronidasa también se pueden caracterizar por aquéllas que se aseguran a la membrana de plasma mediante un ancla de glicosil-fosfatidil-inositol , tal como la HYAL2 humana y la PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 15 de abril de 2003; 100(8) :4580-5, Phelps y colaboradores, Science 1988), y aquéllas que son solubles, tales como la HYAL1 humana (Frost y colaboradores, Biochem. Biophys . Res. Commun. 9 de julio de 1997; 236(1) :10-5) . Sin embargo, existen variaciones de especie a especie: en bovinos, PH20, por e emplo, está muy flojamente unida a la membrana de plasma y no se ancla por medio de un ancla sensible a la fosfolipasa (Lalancette y colaboradores, Biol . Reprod. Agosto de 2001; 65(2) :628-36) . Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como un extracto para uso clínico (Wydase, Hyalase) . Otras especies de PH20 son enzimas ancladas a lípidos que no son insolubles sin el uso de detergentes o lipasas. Por ejemplo, la PH20 humana se ancla a la membrana de plasma por medio de un ancla de GPI . Los intentos por hacer construcciones de ADN de PH20 humana que no introduzcan un ancla de lípido en el polipéptido, dieron como resultado una enzima catalíticamente inactiva, o bien una enzima insoluble (Arming y colaboradores, Eur. J. Bioche . 1 de agosto de 1997; 247(3) :810-4) . La hialuronidasa de esperma de macaco que se presenta naturalmente, se encuentra tanto en forma soluble como enlazada a membrana. Aunque la forma enlazada a membrana de 64 kDa posee actividad enzimática a pH 7.0, la forma de 54 kDa solamente es activa a pH 4.0 (Cherr y colaboradores, Dev. Biol . 10 de abril de 1996; 175 (1) : 142-53) . Por consiguiente, las formas solubles de PH20 con frecuencia carecen de actividad enzimática bajo condiciones neutras. Las condroitinasas son enzimas que se encuentran a través de todo el reino animal . Estas enzimas degradan los glicosaminoglicanos a través de una reacción de endoglicosidasa.
Ejemplos específicos de las condroitinasas conocidas incluyen: i condroitinasa ABC (derivada a partir de Proteus vulgaris; solicitud de patente JP abierta No. 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, y S. Suzuki, J". Biol. Chem. , 243, 1523 (1968), S. Suzuki, J. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai , y T. Furuhashi, J". Biol. Chem., 243, 1543 (1968)), la condroitinasa AC (derivada a partir de Flavobacteriurn heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Hahuchi, y S. Suzuki, J. Biol. Chem. 243, 1523 (1968) ) , la condroitinasa AC II (derivada a partir de Arthrobac-ter aurescens; K. Hiyama, y S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K. Hiyama y S. Okada, J. Biochem. (Tokio), 80, 1201 (1976)) , la hialuronidasa ACHI (derivada a partir de Flavobacte- rium sp. Hpl02; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, y Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)), la condroitinasa B (derivada a partir de Flavobacterium heparinum; Y. M. Michelacci y C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun. 56, 973 (1974), Y. M. Michelacci y C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), Kenichi Maeyama, Akira Tawada, Akiko Ueno, y Keiichi Yoshida, Seikagaku, 57, 1189 (1985) ) , la condroitinasa C (derivada a partir de Flavobacterium sp. Hpl02, Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida Morikawa, y Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)), y similares . Las glicoproteínas se componen de una cadena de polipéptido covalentemente enlazada a una o más fracciones de carbohidrato. Existen dos amplias categorías de glicoproteínas que poseen carbohidratos acoplados ya sea a través de enlaces N-glicosídicos o bien O-glicosídicos con su proteína constituyente. Los glicanos N- y O-enlazados se unen a los polipéptidos a través de enlaces de asparagina N-acetil -D-glucosamina y serina (treonina) -N-acetil -D-galactosamina , respectivamente. Oligosacá-ridos N-enlazados complejos no contienen residuos de mañosa terminales. Contienen solamente N-acetil -glucosamina terminal, galactosa, y/o residuos de ácido siálico. Los oligosacáridos híbridos contienen residuos de mañosa terminales, así como N-acetil -glucosamina terminal, galactosa, y/o residuos de ácido Con las glicoproteínas N-enlazadas, se une un precursor de oligosacárido al grupo amino de la asparagina durante la síntesis del péptido en el retículo endoplásmico . Luego la fracción de oligosacárido se procesa en secuencia mediante una serie de enzimas específicas que suprimen y agregan fracciones de azúcar. El procesamiento se presenta en el retículo endoplásmico, y continúa con el paso a través del aparato de cis-, medial-, y trans-Golgi . Compendio de la Invención Provistas en la presente están enzimas de glicosamino-glicanasa solubles, particularmente miembros de la familia de Glicoproteínas Hialuronidasas activas neutras solubles (también referidas en la presente como sHASEGPs) , miembros preferidos siendo Glicoproteínas Hialuronidasas PH-20 (también referidas en la presente como rHuPH20s) . Las Hialuronidasas activas neutras solubles provistas en la presente son cada una un miembro de la familia de sHASEGP, designadas en la presente como una sHASEGP . El dominio de Hialuronidasa soluble, y usos del mismo también se proporcionan. Aunque un número de usos y aplicaciones de glicosaminoglicanasas solubles (en ocasiones referidas en la presente como enzimas GAG) se ilustran en la presente usando rHuPH20 como una glicosaminoglicanasa ejemplar (v.gr., en promover la entrega de farmacológicos y otros agentes dentro de tejidos del cuerpo mamífero) , se apreciará por los técnicos en la materia que otras glicosaminoglicanasas tales como aquellas descritas en la presente u otras conocidas en la materia pueden aplicarse a un número de tales aplicaciones. Glicosaminoglicana-sas solubles actualmente preferidas, tales como sHASEGPs, exhiben alguna actividad de hialuronidasa y pueden exhibir otras actividades de glicosaminoglicanasa también. Glicosaminoglicana-sas solubles humanas son actualmente preferidas para aplicaciones en las cuales la enzima se va a emplear dentro del cuerpo humano, incluyendo muchas aplicaciones médicas como se describe e ilustra en la presente. Un aspecto de la invención se basa en el descubrimiento de que una actividad de hialuronidasa activa neutra, soluble, se puede producir con alto rendimiento en un sistema de expresión de mamíferos mediante introducir ácidos nucleicos que carecen una región estrecha codificando aminoácidos en las terminales carboxi del cADN de PH20 humana. Modificaciones adicionales de la sHASEGP para acrecentar la secreción mediante el uso de péptidos líderes no nativos también se proporciona. Adicionalmente provistos son métodos para modificar la sHASEGP para prolongar su media vida mediante enmascarar la proteína con polietileno glicol (PEG) y/o modificaciones post-traducción a glicosilación nativa. Intentos previos para generar glicoproteínas hialuronidasas humanas activas neutras solubles fueron insatisfactorios . Se concluyó que los truncados del polipéptido de hialuronidasa humana resultó en tanto una pérdida de actividad enzimática neutra, y una incapacidad de células para secretar la proteína recombinante en sistemas de expresión de mamíferos (Arming, y colaboradores Eur. J. Biochem. 1 de agosto de 1997; 247 (3 ) : 810 -4 ) . Es crítico generar sHASEGP secretada de acción neutra para producción comercial y utilidad terapéutica como una hialuronidasa . La invención, divulgada en la presente, supera estos y otros retos. La invención además comprende una glicoproteína sHASEGP humana catalíticamente activa donde la sHASEGP posee por lo menos una fracción de azúcar N-enlazada. Los estudios mostrados en la presente demuestran que la PH20 humana requiere glicanos N-enlazados para actividad catalítica, mientras que hialuronidasas bovinas y de veneno de abejas permanecen activas sin tales glicanos N-enlazados. Un dominio de hialuronidasa PH20 humana desprovisto de fracciones N-enlazadas es catalíticamente inactivo. Así, tecnología de ADN recombinante clásica no permite la producción de una sHASEGP humana catalíticamente activa, a diferencia de hialuronidasa de veneno de abeja, la cual se puede producir en E. coli. La invención incluye métodos y células para generación de un polipéptido de glicoproteína sHASEGP N-enlazada, mediante uso de una célula capaz de introducir dichas fracciones de azúcar N-enlazadas o mediante introducción de dichas fracciones N-enlazadas en un polipéptido de sHASEGP. Métodos para identificar sHASEGP glicosilados apropiadamente se divulgan además. Glicoproteínas sHASEGP PEGiladas y/o super- sialadas catalíticamente activas también se proporcionan. sHASEGPs PEGiladas y/o super-sialadas poseen mayores medias vidas en suero comparadas con sHASEGPs de testículos bovinos y ovinos no sialadas que ocurren naturalmente, y son así preferibles para tanto estabilidad de enzimas y uso como fármacos o adyuvantes en circunstancias en las cuales medias vidas prolongadas son deseables (tal como es comúnmente el caso con entrega intravenosa) . La invención proporciona métodos para la preparación de sHASEGPs PEGiladas y/o super-sialadas, composiciones y usos de los mismos. Sin restringirse a una aplicación particular o mecanismo de acción, generalmente se considera que la unión de fracciones de PEG a sííASEGPs y otras glicosaminoglicanasas pueden usarse para efectivamente blindar las moléculas, disminuyendo su sensibilidad relativa a proteasas y potencialmente también disminuyendo el grado y tasa de su limpieza y eliminación del cuerpo. Aplicando estos principios y técnicas a otras glicosaminoglicanasas, PEGiladas, super-sialadas y/o de otra manera modificadas versiones de tales otras glicosaminoglicanasas pueden de manera similar generarse y usarse en el contexto de métodos y técnicas según se describe e ilustra en la presente (v.gr., técnicas para promover la dispersión de farmacológicos y otros agentes dentro de tejidos del cuerpo) . Proteínas codificadas por variantes de empalme de sHASEGP naturalmente deficientes de ancla de GPI también se proporcionan . Adicionalmente provistas son composiciones de la sHASEGP comprendiendo, una glicoproteína sHASEGP soluble con un ion de metal, donde el ion de metal es calcio, magnesio o sodio. sHASEGPs son generalmente óptimamente activos en presencia de tales metales. Formulaciones consistiendo de sHASEGP en presencia de dichos iones de metal también se proporcionan. Modificaciones de sHASEGPs y otras glicosaminoglicana-sas para prolongar adicionalmente su media vida se proporcionan. Modificaciones químicas de sHASEGPs y otras glicosaminoglicanasas con polímeros tales como polietileno glicol y dextrano se proporcionan. Tales modificaciones blindan sHASEGPs y otras glicosaminoglicanasas de remoción de los sistemas circulatorio e inmune así como receptores de glicosilación para mañosa y asialoglicoproteína . Además proporcionados son métodos para enlazar a grupos funcionales específicos tales como sitios de glicosilación, aminoácidos cargados positivamente y cisteínas. Ensayos para identificar efectores, tales como compuestos, incluyendo moléculas pequeñas, y condiciones, tales como pH, temperatura y fuerza iónica, que modulan la activación, expresión o actividad de sHASEGPs, también se proporcionan en la presente. En ensayos ejemplares, los efectos de compuestos de prueba en la habilidad de un dominio de Hialuronidasa de sHASEGPs para separar un sustrato conocido, típicamente un glicosaminogli-cano o proteoglicano, se evalúan. Agentes, generalmente compuestos, particularmente moléculas pequeñas, que modulan la actividad del dominio de Hialuronidasa son compuestos candidatos para modular la actividad de sHASEGP . Los dominios de Hialuronidasa también se pueden usar para producir anticuerpos específicos de Hialuronidasa con actividad perturbadora de función. Los dominios de Hialuronidasa provistos en la presente incluyen, pero no se limitan a, el dominio de glicosil -hidrolasa N-termina con porciones C-terminadas truncadas del mismo que exhiben actividad catalítica in vitro. Moléculas de ácido nucleico codificando a las proteínas y dominios de Hialuronidasa también se proporcionan. Moléculas de ácido nucleico que codifican un dominio de Hialuronidasa soluble o porciones catalíticamente activas del mismo y también aquellas que codifican al sHASEGP de longitud completa se proporcionan. Ácido nucleico codificando un dominio de Hialuronidasa ejemplar y ácido nucleico corriente abajo se expresan en la SEQ ID NO: 6; y el dominio de Hialuronidasa de sHASEGP ejemplar se expresa en la SEQ ID NO : 1 (aminoácidos 35-464) . La secuencia de proteína y secuencia de ácido nucleico que codifica de una sHASEGP de longitud completa ejemplar se expresan en las SEQ ID Nos : 1 y 6. También provistas son moléculas de ácido nucleico que hibridizan a tales ácidos nucleicos que codifican junto con su longitud completa o a lo largo de alrededor de 70%, 80% o 90% de la longitud completa y codifican al dominio de Hialuronidasa o porción del mismo se proporcionan. La hibridización generalmente se efectúa bajo condiciones de exactitud por lo menos baja, generalmente por lo menos moderada, y frecuentemente alta.
El fragmento de ácido nucleico aislado es ADN, incluyendo genómico o cADN, o es ARN, o puede incluir otros componentes, tales como ácido nucleico de proteína u otros análogos de nucleótidos. El ácido nucleico aislado puede incluir componentes adicionales, tales como promotores heterólogos o nativos, mej oradores y otras secuencias regulatorias de transcripción y traducción, estos genes pueden enlazarse a otros genes, tales como genes reporteros u otros genes indicadores o genes que codifican a indicadores. También provista es una molécula de ácido nucleico aislada que incluye la secuencia de moléculas que es complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica sHASEGP o la porción de la misma. También provistos son fragmentos de la misma u oligonucleótidos que se pueden usar como sondas o cartuchos y que contienen por lo menos alrededor de 10 a 16 nucleótidos, típicamente por lo menos alrededor de 20 nucleótidos, y generalmente menos de 1,000, típicamente menos de alrededor de 100 nucleótidos, expresados en la SEQ ID NO : 6 (o el complemento de la misma) ; o contienen por lo menos alrededor de 30 nucleótidos (o el complemento de los mismos) o contienen oligonucleótidos que hibridizan junto con su longitud entera (o por lo menos alrededor de 70, 80 o 90% de la misma) a cualquiera de tales fragmentos u oligonucleótidos. La longitud de los fragmentos es una función del propósito para el cual se usan y/o la complejidad del genoma de interés. Sondas y cartuchos generalmente contienen menos de alrededor de 50, 150 o 500 nucleótidos. También provistos son plásmidos conteniendo cualquiera de las moléculas de ácido nucleico provistas en la presente. Células conteniendo los plásmidos también se proporcionan. Tales células incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, células de levadura, células de hongos, células de plantas, células de insectos y células animales. También provistos son sistemas de expresión de mamíferos mejorados usando líderes de señal capaces de secrección eficiente de sHASEGPs . Un ejemplo de tales secuencia de aminoácidos y proteína de fusión de péptido líder secretorio eficiente con una sHASEGP se encuentra en las SEQ ID NOs:43 y 46. También provisto es un método para producir sHASEGPs mediante hacer crecer las células anteriormente descritas bajo condiciones donde la sHASEGP es expresada por las células, y recuperar el polipéptido o glicoproteína de sHASEGP. Métodos para aislar ácido nucleico que codifica a otras sHASEGPs también se proporcionan . También provistas son células, generalmente células eucarióticas , tales como células de mamíferos y células de levaduras, en las cuales un polipéptido de sHASEGP se expresa en la superficie de las células. Tales células se pueden usar en ensayos de selección de fármacos para identificar compuestos que modulan la actividad del polipéptido de sHASEGP. Estos ensayos, incluyendo ensayos de ligadura in vitro, y ensayos a base de transcripción en los cuales transducción de señal mediada directamente o indirectamente, tal como mediante activación de factores pro-crecimiento, por la sHASEGP se evalúa. También provistos son péptidos codificados por tales moléculas de ácido nucleico. Incluidos entre esos polipéptidos son el dominio de Hialuronidasa de sHASEGP o un polipéptido con cambios de aminoácidos tal que la especificidad y/o actividad de Hialuronidasa permanezca sustancialmente sin cambio. En particular, una glicoproteína de sHASEGP de mamífero sustancialmente purificada se proporciona que comprende una enzima activa neutra secretada . La invención también incluye un dominio catalítico de hialuronidasa y puede adicionalmente incluir otros dominios. La sHASEGP puede formar homodímeros y también puede formar heterodí-meros con alguna otra proteína, tal como una proteína ligada a membrana. También provista es una glicoproteína sustancialmente purificada incluyendo una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad a una sHASEGP ejemplar donde el porcentaje de identidad se determina usando algoritmos estándar y castigos de espacio que maximizan el porcentaje de identidad. Variantes de empalme de sHASEGPs, particularmente aquellas con dominios de Hialuronidasa catalíticamente activos, se contemplan en la presente. En otras formas de realización, polipéptidos sustan-cialmente purificados que incluyen un dominio de Hialuronidasa de un polipéptido sHASEGP o una porción catalíticamente activa del mismo, pero que no incluyen la secuencia de aminoácidos entera expresada en la SEQ ID NO : 1 se proporcionan. Entre estos son polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia de las SEQ ID NOs : 1 O 3. En una forma de realización específica, un ácido nucleico que codifica a una glicoproteína de Hialuronidasa eucariótica, designada una sHASEGP eucariótica, se proporciona. En particular, el ácido nucleico incluye la secuencia de nucleotidos expresada en la SEQ ID NO : 6 , particularmente expresada como nucleotidos 106-1446 de SEQ ID NO : 6 , o una porción de los mismos que codifica a un polipéptido catalíticamente activo . También provistas son moléculas de ácido nucleico que hibridizan bajo condiciones de exactitud por lo menos baja, generalmente exactitud moderada, mas típicamente exactitud alta a la SEQ ID NO : 6 o degenerados de la misma. En una forma de realización, el fragmento de ácido nucleico aislado hibridiza a una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleotidos expresada en la SEQ ID NO : 6 (o degenerados de la misma) bajo condiciones de alta exactitud.
Una sHASEGP de longitud completa se expresa en la SEQ ID NO : 1 y se codifica por la SEQ ID NO : 6 o degenerados de la misma. También provistas son muteínas del dominio de Hialuro-nidasa de sHASEGPs, particularmente muteínas en las cuales uno o mas residuos Cys en el dominio de Hialuronidasa que están libres (es decir, no forman enlaces de disulfuro con cualquier otro residuo Cys en el dominio de Hialuronidasa) se sustituyen con otro aminoácido, típicamente, aunque no necesariamente, con una sustitución de aminoácido conservadora o una sustitución que no elimina la actividad, y muteínas en las cuales un sitio (o sitios) de glicosilación específico se elimina. Polipéptidos de sHASEGP, incluyendo, pero no limitado a variantes de empalme de los mismos, y ácidos nucleicos que codifican a sHASEGPs, y dominios, derivados y análogos de los mismos se proporcionan en la presente. Glicoproteínas de Hialuronidasa secretadas de una sola cadena que tienen una funcionalidad de N-terminales equivalente a aquella generada por activación de una peptidasa de señal para formar sHASEGP también se proporcionan. Hay siete sitios de glicosilación N-enlazados potenciales en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de la sHASEGP de PH20 humana ejemplificada en la SEQ ID NO : 1. Enlaces de disulfuro se forman entre los residuos Cys C60-C351 y los residuos Cys C224 a C238 para formar el dominio de Hialuronidasa núcleo. Sin embargo, cisteínas adicionales se requieren en las terminales carboxi para actividad catalítica de enzima neutra tal que el dominio de sHASEGP a partir de los aminoácidos 36 a Cys 464 en la SEQ ID NO : 1 comprendan al dominio de hilauronidasa sHASEGP de PH20 humana mínimamente activa. Así, el sitio de glicosilación N-enlazado N-490 no se requiere para actividad de sHASEGP apropiada. Como se apreciará por los técnicos en la materia, cambios menores pueden hacerse a tales composiciones como se describe e ilustra en la presente sin sustancialmente eliminar o en algunos casos sin sustancialmente reducir (o potencialmente aun mejorar) su actividad útil, y así puede ser similarmente empleado en varias aplicaciones como se describe en la presente. Glicosilación N-enlazada de algunas sHASEGPs (tal como la sHASEGP comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1) puede ser muy importante para su actividad y estabilidad catalítica. Aunque alterar el tipo de glicano que modifica una glicoproteína puede tener efectos dramáticos en la antigenicidad, doblez estructural, solubilidad, y estabilidad, de la proteína, se piensa que la mayoría de las enzimas no requieren glicosilación para actividad de enzima óptima. Tales sHASEGPs son así únicas en este respecto, en que la remoción de la glicosilación N-enlazada puede resultar en desactivación casi completa de la actividad de Hialuronidasa . Para tales sHASEGPs, la presencia de glicanos N-enlazados es crítica para generar una enzima activa. Sistemas de expresión de proteínas adecuados para la introducción de residuos de glicosilación N-enlazados críticos en sHASEGPs se incluyen. Adicionalmente , la introducción de polipéptido sHASEGP desglicosilado en presencia de extractos capaces de introducir glicanos N-enlazados se incluyen. En un aspecto de la invención, glicosilación compleja coronada con sialación se describe mientras que otras coronadas con residuos de mañosa libres se contemplan también. De preferencia, los residuos de ácido siálico se encuentran en los residuos terminales de glicosilación N-enlazada en sHASEGPs . Oligosacáridos N-enlazados caen dentro de varios tipos mayores (oligomanosa, complejo, híbrido, sulfatado), todos de los cuales tienen núcleos (Man) 3 -GlcNAc-GlcNAc unidos mediante un nitrógeno de amida de residuos de Asn que caen dentro de secuencias de -Asn-Xaa-Thr/Ser- (donde Xaa no es Pro) . Glicosilación de un sitio de -Asn-Xaa-Cys- ha sido reportada para proteína C de coagulación. Sitios N-enlazados son frecuentemente asignados indirectamente por la aparición de un ciclo "en blanco" durante el secuenciado. Identificación positiva puede hacerse después de liberación del oligosacárido por PNGasa F, la cual convierte Asn glicosilado a Asp . Después de liberación de PNGasa F, oligosacáridos N-enlazados pueden purificarse, por ejemplo mediante usar cromatografía de Bio-Gel P-6, con el conjunto de oligosacáridos sujeto a cromatografía de intercambio de aniones preparativa a alto pH (HPAEC) (Townsend y colaboradores (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Ciertos isómeros de oligosacárido pueden resolverse usando HPAEC. Residuos de fucosa cambiarán posiciones de extracción mas temprano en el cromatograma de HPAEC, mientras que residuos de ácido siálico adicionales incrementarán el tiempo de retención. Tratamiento concurrente de glicoproteínas cuyas estructuras de oligosacáridos son conocidas (v.gr. , fetuína bovina, glicoproteína de ácido a-1, ovalbúmina, ARNasa B, transferrina) pueden facilitar la asignación de los picos de oligosacáridos. Los oligosacáridos recolectados se pueden caracterizar por una combinación de análisis de composición y de enlace de metilación (Waeghe y colaboradores (1983) Carbohydr. Res. 123, 281-304), con configuraciones anoméricas asignadas por espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) en Methods . Enzymol . 230) . En el caso de algunas sHASEGPs, ejemplificadas por la sHASEGP humana rHuPH20 descrita en la presente, la sHASEGP puede comprender enlaces tanto N-glicosídicos y O-glicosídicos . Por ejemplo, rHuPH20 (según se produce en la línea 3D3 de DG44 CHO, como se describe en los ejemplos siguientes) ha sido descubierta por tener oligosacáridos O-enlazados así como oligosacáridos N-enlazados. Modificaciones glicosídicas de tales sHASEGPs (por ejemplo, modificaciones comprendiendo una o mas adiciones, remociones o alteraciones de tales oligosacáridos N-enlazados y/u O-enlazados pueden usarse para generar sHASEGPs variantes glicosídicos exhibiendo perfiles farmacocinéticos y/o farmacodi-námicos alterados que los hacen deseables para aplicaciones particulares. A manera de ilustración, pero sin restringirse a un mecanismo de acción particular, remoción o alteración de (tal como mediante coronado o de otra manera desexponer) uno o mas oligosacáridos N-enlazados y/u O-enlazados que se involucran en ligadura a receptores celulares u otros pueden usarse para alterar le grado y/o tasa a la cual una sHASEGP se liga a o se toma por un tejido particular, el cual a su vez puede usarse para alterar, por ejemplo, su perfil farmacocinético (v.gr., mediante incrementar su vida media en suero o de otra manera alterar su bio-absorción) . Formulaciones de sHASEGPs también se proporcionan. sHASEGPs pueden formularse en formas liofilizadas y soluciones estabilizadas por ejemplo. Formulaciones conteniendo iones de metal específicos, tales como calcio, magnesio, o sodio, son útiles para actividad óptima a pH neutro. Además de formulaciones en solución estabilizadas, formulaciones de liberación lenta se contemplan en la presente para remoción extendida de glicosamino-glicanos o promoción extendida de esparcimiento o difusión de agentes tales como farmacológicos. También provistos en la presente son kits proporcionando para jeringas pre-empacadas de sHASEGPs para la administración de volúmenes pequeños de sHASEGP para procedimientos quirúrgicos intra-oculares y otros procedimientos de volúmenes pequeños. Formulaciones de sal balanceadas para uso ex vivo en procedimientos de tecnología reproductiva adicional también se proporcionan. Métodos para el uso de glicosaminoglicanasas incluyendo sHASEGPs en la remoción de glicosaminoglicanos también se proporcionan. Glicosaminoglicanasas incluyendo canales abiertos de sHASEGPs en el espacio intersticial a través de degradación de glicosaminoglicanos que generalmente permiten la difusión de moléculas de moléculas menores que alrededor de 500 nm en tamaño. Estos canales pueden permanecer relativamente abiertos por un periodo de 24-48 horas dependiendo en la dosis y formulación. Tales canales pueden usarse para facilitar la difusión de moléculas añadidas de manera exógena tales como fluidos, moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos y vectores de terapia de genes y otras moléculas menores que alrededor de 500 nm en tamaño. Además, sin restringirse a una teoría o mecanismo de acción particular, se cree que la formación de tales canales puede facilitar el flujo de fluidos en volumen dentro de un espacio intersticial, lo cual a su vez puede promover la dispersión o movimiento de un soluto (tal como una molécula detectable u otro agente de diagnóstico, un anestésico u otro agente modificador de tejido, un agente efectivo farmacológicamente o farmacéuticamente, o un cosmético u otro agente estético) que es efectivamente llevado por el fluido en un proceso en ocasiones referido en la presente como "transporte convectivo" o simplemente convección. Tal transporte convectivo puede sustan-cialmente exceder la tasa y efectos acumulados de difusión molecular y así puede ocasionar que la molécula terapéutica u otra administrada se difunda mas rápidamente y efectivamente en un tejido. Mas aun, cuando una molécula tal como un agente terapéutico u otro (tal como un fármaco de molécula pequeña o una molécula mas grande o complejo) se co-formula o co-administra con una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) y ambos se inyectan dentro de un sitio local relativamente confinado, tal como un sitio de administración parenteral no intravenoso (v.gr. , intradérmico , sub-cutáneo, intramuscular, o dentro o alrededor de otros tejidos internos, órganos u otros espacios relativamente confinados dentro del cuerpo) , entonces el fluido asociado con la dosis administrada puede tanto proporcionar una fuerza de impulso local (es decir, presión hidrostática) así como reducir la impedancia a flujo (mediante abrir canales dentro de la matriz intersticial) - ambos de los cuales tenderían a incrementar el flujo de fluidos, y con el transporte convectivo del agente terapéutico u otra molécula contenida dentro del fluido. Como se discute e ilustra en mayor detalle en la presente, y como se apreciará por los técnicos en la materia, estos aspectos del uso de sHASEGPs y otras glicosaminoglicanasas pueden tener utilidad sustancial para mejorar la bio-disponibilidad así como manipular otras características farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de agentes co-formulados o co-administrados . sHASEGPs y otras glicosaminoglicanasas pueden también usarse para remover glicosaminoglicanos en exceso tales como aquellos que ocurren siguiendo reperfusión de isquemia, inflamación, arteriosclerosis , edema, cáncer, lesión de médula espinal y otras formas de cicatrizado. En algunas instancias, sHASEGPs y otras glicosaminoglicanasas pueden entregarse sistemicamente por infusión intravenosa. Esto puede ser útil cuando acceso local no es fácilmente disponible tal como en el corazón o cerebro o en el caso de neoplasma diseminado donde la enfermedad es a través del cuerpo. Para tales aplicaciones intravenosas u otras intravascu-lares, sHASEGPs Super-Sialadas son frecuentemente preferibles para incrementar la media vida en suero y distribución sobre enzimas de hialuronidasa nativas que carecen de ácidos siálicos terminales . En algunas circunstancias, tales como lesión de médula espinal y otros desórdenes del sistema nervioso, glaucoma y ciertos otros desórdenes del ojo, así como varias condiciones auto- inmunes , inflamatorias, cánceres y otras enfermedades y condiciones crónicamente progresivas, y tratamientos cosméticos, entrega sostenida se prefiere. Como será apreciado por los técnicos en la materia, un número de diferentes composiciones y técnicas han sido desarrolladas para proporcionar formulaciones o depósitos de liberación lenta o liberación sostenida de moléculas de interés. En otras indicaciones, una sola dosis de acción corta es preferible. Remoción temporal de glicosaminoglicanos pueden usarse para mejorar la entrega de soluciones y fármacos dentro y/o a través de espacios intersticiales. Esto puede ser útil para la difusión de anestesia y para la administración de fluidos, moléculas y proteínas terapéuticos. Administración sub-cutáneas , intradérmicas e intramusculares de moléculas en la presencia de sHASEGPs (y/u otras glicosaminoglicanasas) también facilitan su distribución sistémica más rápidamente. Tales métodos son muy útiles cuando acceso intravenosa no está disponible o donde entrega de moléculas sistémica mas rápida es necesaria. A manera de ilustración, entrega de otras moléculas grandes tales como Factor VIII, que están pobremente bio-disponibles ante administración sub-cutánea, pueden injerirse con sHASEGPs para incrementar su disponibilidad. Usos de sHASEGPs para remoción enzimática de la matriz de cúmulo rodeando oocitos también se proporcionan. La remoción de la matriz de cúmulo usando un sHASEGP purificado sin los contaminantes tóxicos de hialuronidasa derivada de extracto permite recuperación mas gentil del oocito con mayores viabilidades. Mas aun, sHASEGPs pueden fabricarse sin el uso de extractos de ganado vacuno u otros organismos que llevan viruses y otros patógenos tales como encefalopatías espongiformes transmisibles. Inyecciones de volúmenes pequeños de sHASEGP para uso intraocular también se pueden usar para espacios pequeños. Por ejemplo, sHASEGPs y/u otras glicosaminoglicanasas pueden inyectarse dentro de la cámara anterior del ojo para remover sustratos viscoelásticos de exceso que se administran durante cirugía. Inyección intraocular de sHASEGPs puede también usarse para reducir presión intraocular en glaucoma, para disolver agregados vitreos, o "flotadores", para limpiar hemorragia vitrea, para el tratamiento de degeneración macular, para promover separación vítreo-retinal en retinopatía diabética y para mezclarse con otras enzimas para promover re-configuración de la córnea junto con lentes correctivos. Como se describe en la presente, sHASEGPs y/u otras glicosaminoglicanasas también se pueden inyectar dentro del ojo o dentro de espacios periorbitales que le rodean como una forma de "agente de esparcimiento" , es decir, para promover la entrega de agentes de diagnóstico, anestésicos o farmacológicos a sitios dentro y/o alrededor del tejido objetivo. Por ejemplo, inyección de una sHASEGP concomitante con o en proximidad temporal con inyección de agentes de diagnóstico, anestésicos o farmacológicos dentro del espacio de sub-Tenón o episcleral puede usarse para promover entrega transcleral del farmacológico a porciones interiores del ojo (tales como el coroideo, retina y cuerpo vitreo) . El espacio episcleral es un espacio conteniendo linfa entre los Bulbos de Facía (cápsula de Tenón) y la esclera la cual es un tejido protector relativamente duro que rodea el coroideo y la retina y el interior del ojo. El espacio de sub-Tenón o episcleral, el cual en ocasiones es referido como el espacio de linfa periscle-ral , es generalmente también continuo con las cavidades sub-dural y sub-aracnoide y se atraviesa por bandas de tejido conector extendiéndose desde la facia a la esclera. Como se apreciará por los técnicos en la materia, la habilidad para promover la entrega de composiciones a través de la capa escleral protectora cubriendo al ojo permite para una gran variedad de agentes farmacológicos y otros a ser entregados convenientemente y eficientemente a tejidos subyacentes dentro del ojo, tales como el coroideo, retina o humor vitreo. Mediante aplicar composiciones de la presente invención a tales rutas de entrega in vivo de tejidos aun relativamente difíciles de alcanzar, tales como aquellos en la parte trasera del ojo, estos se pueden tratar por medios mínimamente invasores . Se reconoce que en algunas instancias, el uso de sHASEGP de mayor duración tal como la sHASEGP PEGilada será deseable. Es importante notar que aunque hialuronidasas derivadas de animales pueden y han sido aplicadas para tratar ciertas condiciones del ojo, y como un factor de esparcimiento para promover la entrega de anestésicos y otros agentes terapéuticos o farmacológicos, varias consideraciones importantes aplican al uso de enzimas derivadas de animales y potencialmente ya sea limitan su uso o introducen preocupaciones de seguridad o riesgos adicionales cuando se usan para tratar humanos. Entre estas consideraciones está la preocupación de que proteínas y otras impurezas presentes en las formulaciones pueden llevar a problemas inmunogénicos y/u otros cuando se aplican a tejidos humanos in vivo. Además, al grado en que enzimas animales no humanas se emplean, aun enzimas purificadas pueden por si mismas contribuir a inmunogenicidad dado que son de origen no animal .
Además en ese respecto, el potencial para enzimas degradativas tales como hialuronidasas de efectivamente promover su propia dispersión (como se describe en la presente) , podría incrementar la probabilidad de que versiones o formulaciones inmunogénicas de tales productos derivados de animales se pongan en contacto por el sistema inmune. Preocupaciones con factores derivados de animales y/o impuros son también de significación incrementada en un número de situaciones; por ejemplo, situaciones en las cuales el tejido objetivo ya ha sido sujeto a procedimientos quirúrgicos u otros, situaciones en las cuales el agente está siendo introducido dentro de un espacio privilegiado relativamente inmune (tal como porciones del ojo, el corazón, el sistema nervioso y muchos otros tejidos y órganos que no están típicamente expuestos al ambiente externo) , y/o situaciones en las cuales el paciente está inmuno-comprometido o de otra manera en riesgo elevado asociado con infección. El uso de tales formulaciones derivadas de animales puede así evitarse en un número de aplicaciones en las cuales el riesgo de infección u otras complicaciones trompica su utilidad potencial. En esas situaciones y en otras, el uso de sHASEGPs preparados de manera recombinante de la presente invención puede proporcionar aplicaciones que son tanto altamente efectivas y tienen perfiles de seguridad favorables, y así mejoran y expanden las condiciones y situaciones en las cuales estas enzimas son usadas de manera benéfica.
En el contexto de inyecciones parenterales no intravenosas (tales como en inyecciones intradérmicas , sub-cutáneas , intramusculares y otras dentro de espacios diferentes a la vasculatura) , una sHASEGP (y/u otra glicosaminoglicanasa) y otro agente (v.gr., una co- formulación o una mezcla conteniendo una sHASEGP y otro agente tal como un agente de diagnóstico, un agente anestésico, un agente farmacológico, un agente estético, o combinaciones de los mismos) en un volumen de líquido (v.gr., un excipiente farmacéutico u otra solución) puede introducirse dentro de un sitio o sitios dentro del cuerpo por inyección o infusión. Sin desear limitarse por teoría, se cree que varias fuerzas pueden llevarse hacia movimiento para mejorar la entrega del agente farmacológico u otro (el grado del cual depende en parte de la composición particular, volumen y sitio de administración, por ejemplo) . Estas fuerzas de impulso pueden incluir un incremento en la presión hidrostática conforme un volumen del fluido es forzado efectivamente dentro de un espacio contenido (tal como en el espacio sub-Tenón referido anteriormente, o un sitio intradérmico , sub-cutáneo, intramuscular u otro de inyección parenteral no IV) , un incremento subsecuente en el transporte convectivo de solutos (o convección) conforme flujo de fluidos se incrementa hacia abajo de su gradiente de presión (y moléculas o complejos macromoleculares disueltos se llevan a cabo con el mismo) , así como un incremento en difusión y/o permeación mediada por degradación de glicosaminoglicanos y formación de canal concomitante dentro de la matriz intra-celular o espacio intersticial corriente abajo. En el caso de sHASEGPs siendo inyectadas dentro de la cámara anterior del ojo para remover sustratos viscoelásticos en exceso tales como formulaciones conteniendo glicosaminoglicanos (las cuales son comúnmente usadas como coadyuvantes oftalmoqui-rúrgicos en una variedad de procedimientos de segmento anteriores) , se apreciará por los técnicos en la materia, en vista de las enseñanzas de la presente solicitud, que sHASEGP puede usarse para suplementar o para obviar la necesidad por procedimientos post -quirúrgicos tales como irrigación y aspiración, los cuales son comúnmente usados para reducir la cantidad de viscoelástico aplicado restante en el ojo después de cirugía se completa. Viscoelásticos son comúnmente usados durante cirugías de segmento anterior para mantener una cámara anterior profunda permitiendo para manipulaciones mas eficientes y potencialmente protegiendo el endotelio córneo y otros tejidos durante cirugía. Una variedad de viscoelásticos conteniendo hialuronato y/o sulfato de condroitina se usan en cirugías tales como procedimientos de segmento anterior del ojo (ver, v.gr. , Provisc, Viscoat y Duovisc (disponibles de Alcon Laboratories, Inc., www.alconlabs.com); Healon, Healon 5 y Healon GV (disponibles de Advanced Medical Optics, www.healon.com); Amvisc y Amvisc Plus (disponibles de Bausch & Lomb, www.bausch.com); I-Visc, I-Visc Plus, I-Visc 18, e I-Visc Phaco (disponibles de I-MED Pharma, www.imedpharma.com) ; LA LON (disponible de General Innovations, www . generaltrade . -net) ) . Sin embargo, como se conoce en la materia, viscoelástico retenido en la cámara anterior después de procedimientos quirúrgicos tales como cirugía de cataratas puede llevar a flujo hacia afuera comprometido de la cámara anterior (potencialmente mediante reducir flujo hacia afuera a través de la malla trabecular) que puede ocasionar elevaciones en la presión infraocular (picos IOP) que pueden llevar a glaucoma. Así sHASEGPs de la presente invención se pueden introducir, por ejemplo, mediante inyección dentro de la cámara anterior del ojo como un "antídoto viscoelástico" para formulaciones viscoelásticas previamente aplicadas conteniendo glicosa-minoglicanos tales como hialuronano. Para uso como tal un antídoto viscoelástico, la sHASEGP generalmente será introducida por inyección post -quirúrgica dentro de la cámara anterior (con o sin irrigación o aspiración previa para remover alguna porción del viscoelástico previamente aplicado) siguiendo procedimientos del segmento anterior tales como cirugía de cataratas e implante de lente infraocular (v.gr. , por facoemulsificación o cirugía extracapsular) , cirugía de filtración de glaucoma (trabeculecto-mia) , cirugía de trasplante de córneas (v.gr., ceratoplastia de penetración), cirugía del ojo post-traumática, y similares. Como se apreciará por los técnicos en la materia, la cantidad de una sHASEGP aplicada en tal un contexto dependerá, ínter alia, en su actividad específica así como la cantidad de viscoelástico usado y si o no algo del viscoelástico es primero removido físicamente (v.gr. , por irrigación y aspiración). Cada aplicación así será generalmente optimizada para las circunstancias particulares, como será apreciado por los técnicos en la materia en vista de las descripciones e ilustraciones provistas en la presente. Algunos viscoelásticos , tales como Viscoat y Duovisc (disponibles de Alcon Labs) comprenden tanto hialuronato y sulfato de condroitina. Ventajosamente, muchas sHASEGPs de la presente invención son enzimáticamente activas tanto como hialuronidasas y como condroitinasas , haciéndolas particularmente adecuadas para tales viscoelásticos de formulación dual. Hialuronidasas incluyendo sHASEGPs pueden también combinarse con una o mas glicosaminoglicanasas adicionales (tales como condroitinasas) para aplicaciones tales como las anteriores o para adicionalmente abrir canales dentro de espacios intersticiales para otras aplicaciones tales como aquellas descritas e ilustradas en la presente. Al grado en que viscoelásticos sean también usados en otros procedimientos, sHASEGPs de la presente invención pueden de manera similar usarse en conjunto con o como reemplazo de técnicas para reducir o eliminar cantidades de viscoelástico aplicado, es decir, como un antídoto de viscoelástico. En aplicaciones de sHASEGPs como agentes de esparcimiento en tejidos tales como aquellos del ojo, una formulación comprendiendo una o mas sHASEGPs como se describe en la presente es típicamente aplicada a un tejido objetivo previo a o concomitante con aplicación de un agente anestésico, de diagnóstico, farmacológico u otro que se desea ser entregado dentro o en la vecindad del tejido objetivo. En algunos contextos, sHASEGPs pueden usarse para promover la entrega de un agente farmacológico u otro a través de un primer tejido para apuntar a uno o mas tejidos distantes del primero. A manera de ilustración, introducción de sHASEGPs dentro del espacio episcleral rodeando al ojo previo a o de manera concomitante con la introducción de un farmacológico u otro agente dentro del espacio episcleral puede usarse para promover la entrega del agente a través del tejido escleral protector y dentro del coroideo, la retina y el cuerpo vitreo. En esta manera, un número de agentes farmacológicos y/u otros los cuales son útiles para tratar condiciones del coroideo, retina y/o vitreo pueden entregarse relativamente localmente a los tejidos objetivo pero al mismo tiempo usando un enfoque relativamente tal como una inyección sub-Tenón. Situaciones análogas existen en otras situaciones en las cuales sHASEGPs pueden aplicarse a un tejido o ubicación en el cuerpo para facilitar la entrega de un agente farmacológico u otro dentro de ese tejido o ubicación y/o a sitios distantes, como se describe e ilustra en la presente. Aunque el grado y tasa de dispersión de un agente co-formulado o co-disperso depende en parte del tejido y del agente involucrados, tal dispersión puede generalmente ser incrementados mediante, ínter alia, incrementar la cantidad de sHASEGP aplicada, emplear una sHASEGP teniendo actividad específica mas alta, emplear una sHASEGP que es mas resistente a degradación u otra desactivación (tal como una sHASEGP PEGilada, super- sialada u otra tal modificada) , proporcionando una formulación de liberación sostenida o depósito de la sHASEGP, y otros tales enfoques para incrementar la actividad efectiva y/o duración de la sHASEGP aplicada. Además, donde se desea que la sHASEGP facilite la dispersión de un agente dentro de un tejido o ubicación distante a, v.gr., un sitio de inyección, entonces proporcionar la sHASEGP y/o agente en un volumen significativo de líquido (tal como sería parcialmente llenar o aun ligeramente distender el sitio de inyección) , puede usarse para promover adicionalmente la dispersión a través de un proceso de un transporte convectivo, como se describe e ilustra en la presente. Como se apreciará por los técnicos en la materia, sHASEGPs pueden así usarse para promover de manera efectiva entrega de un número de anestésicos, diagnóstico, farmacológicos y/u otros agentes a los segmentos posteriores del ojo para tratar condiciones tales como separaciones retínales, oclusiones de venas retínales, retinopatías proliferativas , retinopatías diabéticas, condiciones inflamatorias (tales como uveitis, coroiditis, retinitis y similares) , así como enfermedades degenerativas, enfermedades vasculares y varios tumores. De nuevo como será apreciado por los técnicos en la materia, una variedad de agentes farmacológicos o farmacéuticamente efectivos puede aplicarse útilmente para tratar tales condiciones y enfermedades de segmento posterior, incluyendo, a manera de ilustración, agentes anestésicos y farmacológicos tales como aquellos descritos e ilustrados mas adelante. Co- formulaciones y co-administraciones de sHASEGPs con otras sustancias pueden también visualizarse para plumas inyectables para administración sub-cutánea de volumen pequeño o rápida. Ejemplos tales como Epipen, insulina, y otros fluidos se pueden formular. Los métodos de la invención incluyen administración del polipéptido de sHASEGP o composiciones farmacéuticas conteniendo sHASEGP previo a, simultáneamente con o siguiendo administración de otras moléculas terapéuticas. La sHASEGP puede administrarse en un sitio diferente del sitio de administración de la molécula terapéutica o la'sHASEGP puede administrarse en un sitio el mismo como el sitio de administración de la molécula terapéutica . Sin desear limitarse por la teoría, se cree que la habilidad de sHASEGPs y otras glicosaminoglicanasas para ocasionar la degradación de una porción de los glicosaminoglica-nos en los espacios intersticiales entre células resultan en una abertura temporal de canales dentro del intersticio, lo cual a su vez tiende a incrementar el flujo de fluido instersticial y para concomitantemente facilitar la difusión y/o transporte de soluto convectivo (convección) de componentes disueltos dentro del fluido intersticial (tales como anestésicos, fármacos y otros agentes farmacológicos, etiquetas y agentes de diagnóstico, y similares) . Como será apreciado por los técnicos en la materia, sHASEGPs de la presente invención se pueden aplicar para mejorar la bio-disponibilidad (y potencialmente mejorar otras propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas ) de un número de farmacológicos u otros agentes que son útiles para tratar o diagnosticar varias condiciones de enfermedad o de otra manera modificar uno o mas tejidos in vivo. Categorías ilustrativas de tales agentes incluyen: agentes anti-cáncer, anti - infectivos , anestésicos, anti - inflamatorios , citocinas, anticuerpos y otras proteínas, ácidos nucleicos, complejos macromoleculares , y numerosas otras moléculas y agentes farmacológicos que modifican las actividades celulares u otras fisiológicas, incluyendo varias categorías de agentes (y miembros ejemplares de los mismos) descritos en la presente y en la materia. Aunque la difusión y el transporte convectivo de aun moléculas pequeñas puede mejorarse mediante abrir canales intersticiales e incrementar el flujo de fluido, en el caso de agentes farmacológicos mayores u otros, tales como muchos bio-terapéuticos (incluyendo anticuerpos y otras proteínas, ácidos nucleicos grandes, complejos macromoleculares (tales como liposomas y otros vehículos macromoleculares) , así como vectores de terapia de genes y similares) , el tamaño de las moléculas y la presencia de componentes intersticiales tales como glicosamino- glicanos sustancialmente perjudica la difusión y/o convección de los agentes. Varias consecuencias potencialmente limitantes de la utilidad del agente pueden resultar. Por ejemplo, los farmacoci-néticos del agente pueden efectivamente perjudicarse por una reducción de absorción y así distribución del agente. Además, atrapar una porción del agente en o cerca del sitio de administración tanto limita su bio-disponibilidad y puede también ocasionar toxicidad como resultado de una dosis local potencial -mente sostenida y alta. En este último respecto, toxicidad local que puede asociarse con efectos secundarios dolorosos y otros es un problema con muchas bio-moléculas grandes que se administran por inyección no intravenosa, tal como por inyección sub-cutánea, intradérmica o intramuscular. Como resultado, un número de agentes farmacológicos tienen perfiles farmacocinéticos (PK) y/o farmacodinámicas (PD) que pueden mejorarse mediante co- formular al agente con una sHASEGP (u otra glucosaminoglicanasa) y/o coadministrar al agente con una sHASEGP (u otra glicosaminoglicana-sa) , la cual puede proporcionarse antes, coincidente con o después del agente, y administrarse en el mismo o un diferente sitio, los cuales parámetros serían el sujeto de optimización en modelos estándar (tal como modelos animales típicamente usados para evaluar la farmacocinética y farmacodinámica del agente) . Cualquier variedad de terapéuticos y farmacológicos así como otros agentes (tales como formulaciones cosméticas o estéticas) que son típicamente administradas por administración parenteral pueden así mejorarse usando sHASEGPs . Aunque administración intravascular , particularmente por inyección intravenosa (IV) , puede generalmente proporcionar para bio-disponibilidad rápida, inyecciones IV son frecuentemente inconvenientes, asociadas con riesgos o inaplicables (y aun donde son practicables se pueden asociar con perfiles PK/PD globales menores que óptimos) . Dado que sHASEGPs pueden aplicarse para mejorar la bio-disponibilidad de agentes administrados por rutas parenterales no IV (tales como rutas sub-cutáneas , intradérmicas , intramusculares y otras entregando agentes dentro del intersticio) , agentes que han sido entregados por inyección IV pueden re-formularse para entrega por rutas parenterales no IV. Tales reformulaciones pueden proporcionar beneficios sustanciales tales como permitir el uso de agentes en los cuales administración IV es inconveniente, inaplicable, insegura, demasiado costosa o de otra manera limitada. La reformulación de agentes IV como parenterales no IV puede también permitir que pacientes se auto-administren los agentes, y puede permitir que la dosificación sea optimizada (v.gr. , mejor diseñada a los parámetros PK/PD del agente) mediante evitar la necesidad por administración mediante inyección intravenosa. Como se apreciará por los técnicos en la materia, parámetros PK/PD que se pueden mejorar mediante usar sHASEGPs (y/u otras glicosaminoglicanasas) incluyen tales medidas como Cmax (la concentración máxima del agente lograda después de absorción en, v.gr., el torrente sanguíneo), Tmax (el tiempo requerido para lograr la concentración máxima) , T½ (el tiempo requerido para que la concentración caiga por la mitad) , Cmin (la concentración mínima de agente después de metabolismo y excreción) , AUC (el área bajo la curva de concentración contra tiempo, una medida de la cantidad global de bio-disponibilidad) , concentraciones en varios tejidos de interés (incluyendo, v.gr., la velocidad de lograr concentraciones deseadas, los niveles globales, y la duración de mantener los niveles deseados) , y Emax (el efecto máximo logrado) . A manera de ilustración, reformular un fármaco u otro agente farmacológico con una sHASEGP o coadministrando al agente con una sHASEGP (que se puede introducir localmente o sistémicamente , y antes, junto con o después del agente) puede usarse por ejemplo para incrementar la Cmax del agente, disminuir su Tmax, disminuir su T¾, incrementar su AUC y/o incrementar su Emax. Como será apreciado, la habilidad para fácilmente y proporcionalmente manipular tales parámetros PK y PD claves (v.gr., mediante aplicar mas o menos unidades de sHASEGP y alterar el tiempo y/o ubicación de administración) permite la mejora de un número de un farmacológico y otros agentes. Evaluar los niveles de estos parámetros puede llevarse a cabo en modelos tales como modelos animales usados para mediciones PK/PD del agente, y co- formulaciones y/o co-administración que mejoran la eficacia relativa a perfil de seguridad así seleccionado para una aplicación particular.
Entre parenterales no IV, sHASEGPs (y/u otras glicosa-minoglicanasas) pueden también usarse para permitir que los agentes se administren por rutas mas convenientes, y/o con mayor eficiencia. A manera de ilustración (y sin limitación), mediante reformular y/o co-administrar agentes con sHASEGP (ya sea locales o sistémicos y ya sea antes, coincidentes con o después de administración del agente) agentes que son típicamente administrados mediante inyección sub-cutánea pueden en su lugar administrarse por inyección intradérmica , y agentes que son típicamente administrados por inyección intramuscular pueden en su lugar administrarse por inyección sub-cutánea o intradérmica. Alternativamente, agentes pueden administrarse por la misma ruta, pero con farmacocinéticos y/o farmacodinámicos mejorados usando sHASEGPs . El uso de sHASEGPs (y/u otras glicosaminoglicanasas) para reformular fármacos IV y otros agentes como parenterales no IV también permite entrega de los agentes usando cualquiera de una variedad de nuevos dispositivos de inyección diseñados para facilidad y/o velocidad de entrega, y para facilitar autoadministración. Tales dispositivos incluyen, por ejemplo, dispositivos ultra-agudos y de micro-agujas (tales como aquellos siendo desarrollados por Becton-Dickinson y otros) así como dispositivos de inyección libres de agujas (tales como Biojector y otros dispositivos disponibles de Bioject; IntraJect y otros dispositivos disponibles de Aradigm; dispositivos Medijector y similares) . Un número de dispositivos (tales como el Biojector) son particularmente útiles para facilitar inyecciones intradérmi-cas las cuales tienden a requerir mas experiencia cuando se usan agujas estándar (debido al potencial para penetrar la dermis durante la colocación de la aguja, y entregar el agente a un sitio de tejido subyacente tal como la capa sub-cutánea) . Para algunos agentes farmacológicos, tales como vacunas por ejemplo (v.gr., una vacuna a base de ADN u otra), puede ser particularmente ventajoso entregar el agente dentro de la dermis a diferencia de capas sub-dérmicas dado que tiende a haber una concentración relativamente alta de células presentando antígeno (APCs) localizadas dentro de la dermis. En el contexto de esos agentes que típicamente se entregan por inyección intradérmica (ya sea por agujas estándar o dispositivos mas nuevos) , o aquellos muchos otros agentes que no son actualmente pero que podrían entregarse por inyección intradérmica, la co- introducción local de una sHASEGP (y/u otra glicosaminoglicanasa) puede usarse para mejorar la entrega del farmacológico u otro agente entregado y para promover su dispersión o esparcimiento dentro de la dermis. En el caso de una vacuna, donde la dermis puede ser el tejido objetivo primario, dada la abundancia local de APCs, la sHASEGP (y/u otra glicosaminoglicanasa) puede así facilitar la dispersión de la vacuna dentro del tejido objetivo, con ello incrementando la probabilidad y grado de interacciones entre una vacuna y APCs (lo cual puede significativamente potenciar la generación de una respuesta inmuno-moduladora) . En el caso de otros agentes, la dermis puede no ser el tejido objetivo primerio puede en su lugar es un tejido dentro del cual una dosis del agente se introduce a partir de la cual se desea que el agente se absorba dentro de otro tejido, típicamente el torrente sanguíneo. En el último caso, el torrente sanguíneo puede por si mismo ser un tejido de interés objetivo (v.gr., para factores moduladores de sangre como se describe en la presente y en la materia) , o el torrente sanguíneo puede por si mismo ser un tejido de entrega por el cual el agente se transporta a un tejido objetivo distante (v.gr., un tejido en el cuerpo suministrado por el torrente sanguíneo) . En cualquiera de estos últimos casos (en los cuales la entrega es intradérmica pero se desea que el agente se entregue al torrente sanguíneo) , la sHASEGP (y potencialmente un volumen de líquido en el cual se inyecta) puede facilitar dispersión del agente primero dentro de la dermis y por ende dentro de la vasculatura drenando a la dermis y eventualmente dentro del suministro de sangre mayor, como se describe e ilustra en la presente. El uso de sHASEGP para mejorar la farmacocinética y/o farmacodinámica de otros agentes terapéuticos o farmacológicos puede también aplicarse a agentes entregados por rutas diferentes a administración parenteral no IV. Por ejemplo, sin desear limitarse por teoría, se cree que la presencia de sHASEGPs en espacios intersticiales dentro del cuerpo (lo cual se puede lograr por administración local y/o sistémica de sHASEGPs) tiende a promover canales intersticiales y un incremento en el flujo de fluido dentro del espacio intersticial que a su vez facilita tanto la difusión y transporte convectivo de agentes disueltos dentro del fluido intersticial (tal como agentes farmacológicos y otros) . A manera de ilustración, agentes que se administran directamente dentro del torrente sanguíneo (v.gr., por inyección intravenosa) , u oralmente (y así ingresan al torrente sanguíneo después de captación a partir del tracto gastrointestinal por ejemplo), pueden aun ser sujeto de restricciones en fase postabsorción, es decir, de distribución, de sus farmacocinética . Sin desear limitarse por teoría, se cree que sHASEGPs pueden mejorar la entrega de células objetivo mediante incrementar la permeabilidad intersticial y flujo de fluidos y con ello incrementar la difusión y/o convección de agentes dentro del espacio intersticial (lo cual efectivamente forma el intermedio entre casi todas las rutas de entrega farmacológicas y las células objetivo) . Además, se cree que cambios en la presión oncótica llevados por la administración de sHASEGPs puede contribuir a mejorar la entrega de agentes farmacológicos. De nuevo, sin desear limitarse por la teoría, la presencia de sHASEGP y degradación concomitante a lo largo del lado intersticial de un tejido vascularizado, tendería a disminuir la presión oncótica dentro del espacio intersticial que a su vez mejoraría la filtración de fluidos a partir de la vasculatura dentro del espacio intersticial. El potencial para disminuir la presión intersticial se considera que es particularmente importante en el contexto de muchos cánceres en los cuales la presión intersticial dentro del tumor (presión intersticial de tumor de TIF) es elevada. TIF alta puede resultar en impedancia relativa al flujo de fluidos a partir de la vasculatura hacia el centro de un tumor, con ello limitando la cantidad de un agente anti-cáncer que efectivamente alcanza un tumor, particularmente sitios que son mas profundos dentro de una masa de tumor. La introducción de sHASEGPs a intersticios de tumor así tendería a acrecentar la entrega de agentes anti-cáncer localmente entregados así como sistémicamente disponibles que pueden mas fácilmente penetrar al tumor cuando la presión oncótica intersticial se reduce y difusión y/o transporte convectivo se incrementa. Mediciones de TIF y conductividad hidráulica (K) dentro de tumores (v.gr., usando moléculas marcadas tales como albúmina marcada con colorante Azul de Evan) pueden usarse para evaluar cuantitativamente el efecto de varias concentraciones de sHASEGPs en la dinámica de fluidos de tumores in vivo, como se ilustra en la presente y/o en la materia. Exacerbando adicionalmente la dinámica de fluidos reducida dentro de muchos tumores, y resaltando un beneficio potencial adicional de aplicar sHASEGPs a tumores, es el hecho de que muchos tumores exhiben acumulación de glicosaminoglicanos , particularmente hialuronano (lo cual puede ser debido al hecho de que linfáticos, que son la ruta predominante para catabolismo de hialuronano, están perjudicados o carentes en muchos tumores) . Tal hialuronano de exceso puede contribuir a impedir conductividad hidráulica. La introducción de sHASEGPs puede así usarse para contrarrestar la acumulación de glicosaminoglicanos en muchos tumores, mejorando la conductividad hidráulica dentro del tumor y efectivamente haciéndolos mas susceptibles a agentes antitumores (entregados ya sea localmente o sistémicamente) . Como se apreciará por los técnicos en la materia, los principios descritos en la presente pueden también aplicarse a numerosos otros farmacológicos y otros agentes que se desea que sean entregados a sitios dentro del cuerpo, tal como para la prevención, diagnosis y/o tratamiento de enfermedad o para de otra manera modular funciones fisiológicas. Clases ilustrativas de tales agentes (y miembros ejemplares de los mismos) se proporcionan en la presente, y muchos mas se conocen en la materia o están bajo desarrollo. Además de su uso en mejoras potenciales y/o reformulaciones de una variedad de farmacológicos y/o agentes administrados parenteralmente , sHASEGPs pueden también ser empleadas útilmente en conexión con agentes no parenterales (tal como agentes formulados en pildoras, líquidos u otras formas para ingestión y absorción típica a través del tracto gastrointestinal) . Por ejemplo, dado que la mayoría de los fármacos no parenterales debe finalmente alcanzar células dentro del intersticio para ejercer sus efectos deseados, el uso de sHASEGPs para mejorar difusión y/o transporte convectivo dentro del intersticio (ya sea sistémicamente o localmente (v.gr., por administración local o apuntada de sHASEGP) ) puede aplicarse para mejorar el grado y/o tasa a la cual no parenterales (así como parenterales) alcanzan las células objetivo deseadas. Además, un número de agentes que típicamente se administran de manera no parenteral (v.gr., oralmente) pueden reformularse , o sus ingredientes activos reformularse , para uso en administraciones parenterales que se hacen mas efectivas y/o seguras en combinación con sHASEGPs. Para ilustrar este enfoque ampliamente aplicable, la habilidad de sHASEGPs para facilitar entrega apuntada a tejidos particulares (tal como la habilidad de sHASEGPs para proporcionar para entrega transcleral a tejidos dentro del posterior del ojo) puede usarse para entregar cualquiera de una variedad de agentes (incluyendo agentes previamente administrados sistémicamente) directamente y preferencialmente a un sitio de interés localizado dentro del cuerpo. Esto puede no solamente proporcionar para concentraciones mas deseables y/o mas rápidamente logradas en el sitio de interés, sino que puede sustancialmente reducir problemas potenciales y limitaciones asociadas con administración sistémica en la cual concentraciones en sitios no deseados puede equivaler o aun exceder concentraciones en el sitio objetivo deseado (potencialmente disparando efectos secundarios no deseados así como desperdiciando agente) . En algunos casos, agentes que no son ampliamente usados o no son usados para ciertas indicaciones o en ciertos pacientes, por ejemplo, pueden aplicarse de manera efectiva para beneficiar a pacientes adicionales mediante ser co-formulados o co-administrados con sHASEGPs como se describe e ilustra en la presente. Como se apreciará por los técnicos en la materia, la habilidad para emplear sHASEGPs para acrecentar, acelerar y/o apuntar bio-distribución de agentes co- formulados y/o coadministrados, y para manipular otros aspectos de su farmacociné-tica o farmacodinámica (v.gr., de manera que mejore su perfil de riesgo : beneficio o facilite su uso por pacientes, familia o profesionales de cuidado de la salud) , proporciona una oportunidad mayor para mejorar fármacos y otros agentes que son usados para tratar, diagnosticar o prevenir enfermedades. Sin desear limitarse a un conjunto de aplicaciones particular, glicosaminoglicanasas , incluyendo sHASEGPs como se describe en la presente (así como otras hialuronidasas y otras glicosaminoglicanasas) pueden usarse para efectivamente lograr entrega de bolo o símil de bolo de cualquier número de agentes farmacológicos y otros por rutas parenterales no intravenosas, así como por otras rutas de administración (v.gr., mediante acrecentar la entrega de agentes dentro y/o a través de un tejido objetivo después de que dejan el torrente sanguíneo (ya sea que se introduzcan dentro del torrente sanguíneo directamente (tal como por administración IV) o indirectamente (tal como por administración parenteral oral o no IV) ) . Sin estar restringidos a un mecanismo de acción específico o aspecto del mismo, se cree que la habilidad de estas enzimas para degradar temporalmente componentes de la matriz intersticial entre células (lo cual cuenta por una porción sustancial del espacio de fluidos en el cuerpo y un espacio correspondientemente grande debe ser atravesado para que los farmacológicos y otros agentes alcancen la mayoría de las células objetivo) puede significativamente promover la entrega de agentes a células objetivo por uno o mas de varios medios potencialmente sinérgicos. Primero, aunque el grueso del fluido intersticial exhibe algún grado de flujo, ese flujo es frecuentemente restringido o impedido por glicosaminoglicanos tales como hialuronano y otros componentes intersticiales. La habilidad de glicosaminoglicanasas incluyendo sHASEGPs (así como otras hialuronidasas y otras glicosaminoglicanasas) para abrir canales dentro de tales espacios intersticiales, como se describe e ilustra en la presente, puede usarse para disminuir la impedancia e incrementar el grado y la tasa de flujo "corriente abajo" resultando de cualquier presión "corriente arriba" dada. Segundo, en el caso de inyecciones parenterales no IV de sHASEGPs (u otra glicosaminoglicanasa) y otro farmacológico u otro agente, el volumen de la inyección parenteral no IV puede usarse para incrementar la presión o cabezal de presión de impulso corriente arriba (v.gr., mediante incrementar la presión hidrostática dentro de un espacio confinado) , lo cual puede adicionalmente promover flujo. Tercero, dado que el volumen del fluido comprendiendo a la sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) introducida y otro agente es efectivamente impulsado por el gradiente de presión incrementado (es decir, el gradiente incrementado creado mediante elevar la presión hidrostática asociada dentro del "bolo" inyectado y simultáneamente disminuyendo la presión intersticial dentro del tejido circundante), solutos dentro del bolo pueden ser efectivamente llevados (v.gr., por transporte convectivo) hacia el te ido adyacente. Este fluido o bolo inyectado puede así ser eficientemente y relativamente rápidamente movido hacia el tejido adyacente y entregar cualquier farmacológico u otro agente que se introdujo en o cerca del mismo sitio de introducción (v.gr., mediante co-formular o co-adminis-trar al agente en combinación con la sHASEGP u otra glicosaminoglicanasa) . A manera de ilustración, usando glicosaminoglicanasas tales como sHASEGPs para abrir canales dentro de espacios intersticiales, como se describe e ilustra en la presente, puede usarse para incrementar el flujo intersticial dentro y a través de tejidos tales como tumores y otros en los cuales el flujo es típicamente impedido y presiones intersticiales elevadas. Ejemplos ilustrativos de estos principios como se describen en la presente incluyen el uso de sHASEGPs para reducir la presión intersticial dentro de un tumor in vivo. Flujo incrementado puede de manera similar aplicarse a tejido normal para, v.gr., permitir que un agente anestésico, de diagnóstico, cosmético u otro estético, o uno farmacológico u otro sea entregado dentro de un tejido (v.gr., para modificar al tejido o introducir una formulación de depósito dentro de un tejido) . Flujo incrementado puede de manera similar aplicarse a un tejido primero o próximo para promover entrega de un agente a través de un tejido de introducción a un tejido distante, el cual tejido distante puede por si mismo ser el tejido objetivo deseado o una ruta al tejido objetivo deseado. Ejemplos ilustrativos de estos principios como se describen en la presente incluyen, por ejemplo: (i) el uso de sHASEGPs introducidas dentro del espacio episcleral rodeando al ojo para promover la entrega de agentes a través de la esclera para apuntar a tejidos objetivo distantes dentro del interior del ojo tal como en la retina y coroideo; y (ii) el uso de sHASEGPs introducidas intradérmicamente para promover la entrega de agentes a través de las capas sub-dérmicas y dentro del torrente sanguíneo, el cual puede por si mismo ser el tejido objetivo (v.gr., para agentes modificadores de sangre) o una ruta por la cual el agente (s) se puede entregar a otros tejidos objetivo dentro del cuerpo. A manera de ilustración adicional de estas técnicas y composiciones para promover la entrega de farmacológicos y otros agentes a tejidos deseados dentro del cuerpo, los siguientes ejemplos adicionales se proporcionan. Por medios tales como los descritos e ilustrados en la presente, los perfiles farmacociné-ticos y/o farmacodinámicos de agentes farmacológicos, y los perfiles de absorción, distribución y/o efectividad de otros agentes, pueden mejorarse o de otra manera modificarse. Además, los agentes que fueron esencialmente o prácticamente limitados a entrega por una ruta (tal como por inyección IV) pueden entregarse por otras rutas mas seguras, menos intrusivas, menos costosas, y/o mas convenientes. A manera de ilustración adicional y sin estar limitado a un tipo particular de aplicación, un volumen (V) de un líquido (L) comprendiendo una sHASEGP u otra glicosaminoglicanasa (Enzima GAG) puede introducirse dentro de un sitio de tejido en el cuerpo (un Tejido de Dosificación) . Por medios como se describen e ilustran en la presente, la Enzima GAG puede entregarse dentro y en algún grado a través del Tejido de Dosificación. Sin restringirse a un mecanismo de acción particular, la Enzima GAG puede efectivamente llevarse en el Tejido de Dosificación por transporte convectivo por el volumen de líquido (L) . El transporte convectivo puede a su vez promoverse en parte por la presión hidrostática asociada con L (la cual puede proporcionar una presión de impulso) y en parte por la habilidad de la Enzima GAG para abrir canales dentro de los espacios intersticiales del Tejido de Dosificación (lo cual puede reducir la impedancia corriente abajo a flujo y con ello reducir la presión de resistencia) . Un diferencial de presión de fluido de impulso puede así crearse y al grado deseado se puede incrementar, por ejemplo, por uno o ambos de los siguientes: (i) introducir y si se desea incrementar una presión hidrostática de impulso (v.gr., mediante introducir L en un espacio confinado y si se desea incrementar V); y (ii) reducir la impedancia corriente abajo a flujo (v.gr., mediante introducir la Enzima GAG, y si se desea incrementar su efectividad mediante por ejemplo incrementar su concentración, incrementar su resistencia a degradación (v.gr., por PEGilación, super- sialación u otra modificación) , y/o incrementar su entrega por transporte convectivo (v.gr., mediante incrementar V) ) . En ciertas formas de realización (v.gr., en las cuales el grado o tasa incrementados de entrega se desean) , V es un volumen suficiente para temporalmente distender el sitio dentro del Tejido de Dosificación en el cual la Enzima GAG se introduce. Como se apreciará por los técnicos en la materia, el volumen (V) puede así acomodarse y el grado resultante de distensión (D) depende en el tejido particular. Para propósitos de ilustración y no de limitación, el grado al cual la distensión ocurre varía, por ejemplo, a partir de situaciones en las cuales (i) el Tejido de Dosificación es un espacio llenado por fluido relativamente grande y/o moviéndose rápidamente (tal como el torrente sanguíneo en conexión con entrega intravenosa o intra-arterial ) , en cuyo caso L puede ser grande (v.gr., muchos mi si se desea) pero D tiende a ser relativamente mínima; (ii) el Tejido de Dosificación es un espacio llenado con fluido relativamente pequeño y/o moviéndose menos rápidamente (tal como fluido cerebro-espinal en conexión con entrega intratecal) , en cuyo caso L puede aun ser relativamente grande pero D puede ser mas que mínima dependiendo en el sitio preciso y volumen de inyección) ; (iii) el Te ido de Dosificación es un espacio relativamente pequeño pero un tanto distensible (tal como el espacio episcleral rodeando al ojo para propósitos de ilustración); o (iv) el Tejido de Dosificación es un espacio relativamente mas denso y/o mas confinado con mayor presión de resistencia (tal como la dermis en conexión con entrega intradérmica para propósitos de ilustración) . Como se apreciará por los técnicos en la materia, V puede variar de volúmenes de menos que 0.1 mi a volúmenes de mas de 100 mi, para muchas aplicaciones estando en el rango de alrededor de 0.5 a 20 mi, y para muchos en el rango de 1 a 10 mi, frecuentemente de 2 a 5 mi; pero puede variarse para situaciones particulares como se ilustra en la presente. V puede también optimizarse específicamente dentro de tales rangos para una aplicación según se desee; v.gr. , mediante comparar perfiles farmacocinéticos y/o farmacodinámicos estándar sobre un rango de volúmenes de prueba. Como será apreciado por los técnicos en la materia en vista de estas enseñanzas, mediante combinar la actividad de acción rápida y de reinicio de abertura de canal de la Enzima GAG (la cual tanto promueve y es promovida por su propia entrega) , junto con un sistema de entrega que tanto promueve y es promovido por la actividad catalítica, un sistema de entrega de fármacos múltiplemente sinérgico puede así generarse; como se describe e ilustra adicionalmente en la presente. En un primer aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP u otra glicosaminoglicanasa (Enzima GAG) y uno o mas agentes farmacológicos u otros (Agente (s) tal como moléculas detectables u otros agentes de diagnóstico, anestésicos u otros agentes modificadores de tejidos, farmacológicos o agentes farmacéuticamente efectivos, cosméticos u otros agentes estéticos, y otros agentes que se desea que sean introducidos dentro de uno o mas tejidos dentro del cuerpo) se introducen dentro de un primer sitio de tejido en el cuerpo (un Tejido de Dosificación) el cual es por si mismo un tejido objetivo deseado (un Tejido Objetivo) para el agente. Por medios como se describen e ilustran en la presente, el Agente (s) se entrega dentro y a través del Tejido Objetivo en un mayor grado y/o tasa que lo que ocurriría en ausencia de la Enzima GAG. Como se apreciará por los técnicos en la materia en conexión con este y otros aspectos ilustrativos en la presente, el Tejido de Dosificación puede ser cualquiera de una variedad de tejidos que pueden fácilmente alcanzarse desde el exterior del cuerpo (v.gr., usando varias rutas de administración como se describe e ilustra en la presente y/o como se conoce en la materia) o desde el interior del cuerpo (v.gr. , en conexión con cirugía o usando cualquiera de una variedad de enfoques y dispositivos no quirúrgicos o mínimamente invasores para alcanzar tejidos dentro del cuerpo). Tales Tejidos de Dosificación incluyen aquellos descritos e ilustrados en la presente así como otros conocidos en la materia. Como de la misma manera será apreciado por los técnicos en la materia en conexión con este y otros aspectos ilustrativos en la presente, el Tejido Objetivo puede ser cualquiera de una variedad de tejidos a los cuales se desea que una Enzima GAG y potencialmente otros Agentes se entreguen (v.gr., (i) tejidos que son el sujeto de esfuerzos para diagnosticar, prevenir o tratar una condición de enfermedad (ya sea intrínsecamente ocasionada tal como una condición de enfermedad heredada o desarrollada o extrínsecamente ocasionada tal como una infección); (ii) tejidos que se desean ser anestesiados o de otra forma modulados (v.gr., en el contexto de cirugía y/u otros procedimientos) ; (iii) tejidos en los cuales se desea disparar una respuesta inmune (tal como asociados con vacunación) ; (iv) tejidos los cuales son para servir como un sitio de depósito para agentes de liberación a otros tejidos; (v) tejidos a ser modificados para propósitos estéticos o cosméticos; y (vi) tejido o sitios en el cuerpo a ser modificados para otros propósitos) . Tales Tejidos Objetivo incluyen aquellos descritos e ilustrados en la presente así como otros conocidos en la materia.
Como de la misma manera será apreciado por los técnicos en la materia en conexión con el anterior y con otros aspectos ilustrativos en la presente, el Agente (s) puede ser de cualquier variedad de moléculas, macromoléculas y complejos macromolecula-res, que son o pueden usarse para alterar o modular condiciones dentro del cuerpo (v.gr., (i) para propósitos de diagnóstico, prevención o tratamiento de una condición de enfermedad (ya sea intrínsecamente ocasionada tal como una condición de enfermedad heredada o desarrollada o extrínsecamente ocasionada tal como una infección) afectando al Tejido Objetivo y/o tejidos adyacentes; (ii) para propósitos de anestesiar o de otra manera modular la fisiología del Tejido Objetivo; (iii) para propósitos de disparar una respuesta inmune según se asocia con vacunación; (iv) para propósitos de usar el Tejido Objetivo como un sitio de depósito para liberar agente (s) a otros tejidos; (v) para propósitos estéticos o cosméticos; y/o (vi) para otros propósitos servidos mediante entregar una Enzima GAG y potencialmente otro Agente (s) a un tejido u otro sitio en el cuerpo) . Tales Agentes incluyen las varias clases de agentes y miembros de las mismas descritos e ilustrados en la presente, así como otros miembros de tales clases de agentes, y otras clases de agentes (y miembros de los mismos) conocidos en la materia. En un segundo aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP u otra glicosaminoglicanasa (Enzima GAG) y uno o mas agentes farmacológicos u otros (Agen- te(s)) se introduce dentro de un sitio de tejido en el cuerpo (Tejido de Dosificación) el cual está adyacente o próximo a un tejido (Tejido B) el cual es por si mismo un tejido objetivo deseado. Por medios como se describen e ilustran en la presente, el Agente (s) se entrega a partir del Tejido A al Tejido B objetivo en un mayor grado y/o tasa que lo que ocurriría en ausencia de la Enzima GAG. En un tercer aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) (Enzima GAG) y uno o mas agentes farmacológicos u otros (Agentéis)) se introducen dentro de un sitio de tejido en el cuerpo (Tejido de Dosificación) el cual está próximo a uno o mas tejidos (Tejidos de Intervención) localizados entre los Tejidos A y otro tejido o tejidos (Tejidos Distantes) los cuales son por si mismos tejidos objetivo deseados o incluyen un tejido objetivo deseado (Tejidos Objetivo) . Por medios como se describen e ilustran en la presente, el Agente (s) se entrega del Tejido A y a través de uno o mas Tejidos de Intervención para alcanzar uno o mas Tejidos Objetivo en un mayor grado y/o velocidad que lo que ocurriría en ausencia de la Enzima (s) GAG. En un cuarto aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) (Enzima GAG) y uno o mas agentes farmacológicos u otros (Agentéis)) se introducen dentro de un sitio de tejido en el cuerpo (Tejido de Dosificación) el cual está próximo a uno o mas tejidos de entrega, tales como el torrente sanguíneo, linfa o fluido cerebro-espinal (Tejidos de Entrega), los cuales son tejidos objetivo deseados o incluyen un tejido objetivo deseado. Por medios como se describen e ilustran en la presente, el Agente (s) se entrega del Tejido A a uno o mas Tejidos de Entrega en un mayor grado y/o tasa que lo que ocurriría en ausencia de la Enzima (s) GAG. En un quinto aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) (Enzima GAG) y uno o mas agentes farmacológicos u otros (Agentéis)) se introducen dentro de un sitio de tejido en el cuerpo (Tejido de Dosificación) el cual está próximo a uno o mas tejidos de entrega, tales como el torrente sanguíneo, linfa o fluido cerebro-espinal (Tejidos de Entrega), los cuales entregan fluido a uno o mas tejidos objetivo deseados (Tejidos Objetivo) dentro del cuerpo. Por medios como se describen e ilustran en la presente, el Agente (s) se entrega del Tejido A a uno o mas Tejidos de Entrega y de ahí a uno o mas Tejidos Objetivo corriente abajo en un mayor grado y/o tasa de lo que ocurriría en ausencia de la Enzim (s) GAG. En un sexto aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) (Enzima GAG) y uno o mas agentes farmacológicos u otros (Agentéis)) se introduce dentro uno o mas tejidos de entrega, tales como el torrente sanguíneo, linfa o fluido cerebro-espinal (Tejidos de Entrega) los cuales suministran fluido a uno o mas Tejidos Objetivos deseados (v.gr., mediante el torrente sanguíneo suministrando un Tejido Objetivo) . Por medios como se describen e ilustran en la presente, el Agente (s) permea al Tejido Objetivo en un mayor grado y/o tasa de lo que ocurriría en ausencia de la Enzima (s) GAG. En un séptimo aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicana-sa) (Enzima GAG) se introduce dentro de un sitio de tejido en el cuerpo (Tejido A) el cual es un tejido objetivo deseado o está cerca de un tejido objetivo deseado (Tejido Objetivo), y uno o mas agentes farmacológicos u otros (Agente (s) ) se introducen dentro del cuerpo por otra ruta de administración (tal como por entrega oral o inyección intravenosa) lo cual permite que el Agente (s) alcance el Tejido Objetivo (v.gr., mediante el torrente sanguíneo suministrando al Tejido Objetivo, siguiendo absorción o inyección dentro de la sangre) . Por medios como se describen e ilustran en la presente, el Agente (s) permea al Tejido Objetivo en un mayor grado y/o tasa que lo que ocurriría en ausencia de la Enzima (s) GAG. En un octavo aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) (Enzima GAG) se introduce dentro de un sitio o sitios de tejido dentro del cuerpo (Sitio (s) de Tejido) el cual tiene una presión intersticial elevada. Por medios como describen e ilustran en la presente, la presión intersticial dentro del Sitio (s) de Tejido se reduce por la actividad degradativa de la Enzima (s) GAG. En un noveno aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) (Enzima GAG) se introduce dentro de un sitio o sitios de tejido dentro del cuerpo (Sitio (s) de Tejido) el cual tiene un exceso de hialuronano u otro glicosaminoglicano . Por medios como se describen e ilustran en la presente, el exceso de hialuronano u otro glicosaminoglicano dentro del Sitio (s) de Tejido se reduce por la actividad degradativa de la Enzima (s) GAG. En un décimo aspecto ilustrativo, un volumen de líquido (V) comprendiendo una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) (Enzima GAG) se introduce dentro de un sitio o sitios de tejido dentro del cuerpo (Sitio (s) de Tejido) el cual está en o cerca de un punto de acceso deseado para hipodermoclisis (un Sitio de Clisis) . Por medios como se describen e ilustran en la presente, fluidos pueden entonces ser entregados dentro y a través del Sitio (s) de Clisis en un mayor grado y/o tasa que lo que ocurriría en ausencia de la Enzima (s) GAG. Como será apreciado por los técnicos en la materia en vista de las descripciones detalladas y formas de realización ilustrativas provistas en la presente, cualquiera de una gran variedad de agentes pueden co- introducirse (v.gr., por co-formulación o co-administración con la Enzima GAG) y cualquiera de una variedad de Enzimas GAG pueden emplearse en concentracio- nes en rangos tales como aquellos provistos en la presente pero típicamente optimizados para el tejido u objetivo particulares involucrados. El volumen de líquido (V) aplicado en los aspectos ilustrativos anteriores generalmente dependerá de la naturaleza del sitio de introducción y de manera similar será típicamente optimizado para el tejido y objetivo particular involucrados. Como se describe e ilustra en la presente, en el caso de administraciones parenterales no IV, V puede incrementarse (dentro de las restricciones particulares del sitio de tejido) para proporcionar una presión de impulso hidrostática mejorada la cual, acoplada con impedancia disminuida asociada con degradación de hialuronano u otro glicosaminoglicano, puede ocasionar efectivamente que el volumen de líquido funcione como un bolo -llevando cualquier soluto que contenga dentro del espacio intersticial corriente abajo y potencialmente mas allá. Por ende, provistas en la presente son una variedad de técnicas empleando hialuronidasas (y/u otras glicosaminoglicana-sas) para promover la entrega de agentes farmacológicos y otros a sitios dentro del cuerpo, así como una familia de glicoproteí-nas de hialuronidasa activas neutras secretadas eucarióticas designadas sHASEGPs, y dominios funcionales de las mismas, especialmente dominios de Hialuronidasa (o catalíticos) de las mismas, muteínas y otros derivados y análogos de las mismas. También provistos en la presente son ácidos nucleicos codificando las sHASEGPs. Adicionalmente provistas son formulaciones, co- formulaciones y usos terapéuticos de dichas sHASEGPs (incluyendo por co-administración con otros agentes) para tratar, prevenir o diagnosticar enfermedad, y para uso como enzimas modificadoras de tej ido . Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es un mapa del Vector HZ24 de sHASEGP . Descripción Detallada de la Invención A. DEFINICIONES A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un técnico en la materia a la que pertenece la invención. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias Genbank, sitios web, y otros materiales publicados referidos a través de toda la divulgación de la presente, a menos que se observe de otra manera, se incorporan por referencia en su totalidad. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos de la presente, prevalecen aquellos en esta sección. Cuando se hace referencia a URL u otro identificador o dirección, se entiende que estos identificadores pueden cambiar, y la información particular en la Internet puede ir y venir, pero se puede encontrar información equivalente buscando en la Internet. La referencia a las mismas da evidencia de la disponibilidad y diseminación pública de esta información.
Como se utilizan en la presente, las abreviaturas para cualesquiera grupos protectores, aminoácidos, y otros compuestos, a menos que se indique de otra manera, están de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión sobre Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB (ver (1972) Biochem. 11:942-944) . Como se utiliza en la presente, la hialuronidasa eucariótica se refiere a una diversa familia de endoglucosamini -dasas de glicosaminoglicano, en donde un residuo de glutamato en la hialuronidasa hidroliza los enlaces beta-1,4 de hialuronano y sulfatos de condroitina a través de un mecanismo catalítico ácido-base . Son de un interés particular las hialuronidasas activas neutras solubles o sHASEGPs de mamífero, incluyendo de origen humano. Los técnicos en la materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en las regiones no esenciales de polipéptido no alteran de una manera sustancial la actividad biológica (ver, por ejemplo, Watson y colaboradores, (1987) Molecular Biology of the Gene, cuarta edición, The Benj amin/Cummings Pub . Co . , página 224) . Como se utiliza en la presente, sHASEGP anclada a membrana se refiere a una familia de hialuronidasas ancladas a membrana que comparten características estructurales comunes, como se describen en la presente. Como se describe e ilustra en la presente, hialuronidasas (es decir, glicosaminoglicanasa capaces de descomponer hialuronano, de preferencia aquellas exhibiendo por lo menos alguna actividad en los rangos de pH neutro) que son normalmente ancladas a membrana pueden convertirse a HASEGPs o sHASEGPs mediante remover o de otra manera modificar una o mas de las regiones que se asocian con anclado de hialuronidasa en la membrana. Como se utiliza en la presente, hialuronidasa soluble se refiere a un polipéptido caracterizado por su solubilidad bajo condiciones fisiológicas. La HASEGP soluble se puede distinguir, por ejemplo, por su división en la fase acuosa de una solución de Tritón X-114 calentada a 37°C (Bordier y colaboradores, J. Bíol . Chem. , 25 de febrero de 1981; 256 (4 ) : 1604 - 7 ) . Por otra parte, HASEGP anclada a lípido se dividirá en la fase rica en detergente, pero se dividirá en la fase pobre en detergente o acuosa en seguida de su tratamiento con fosfolipasa C. Por consiguiente, la referencia, por ejemplo, a "sHASEGP" , abarca a todas las glicoproteínas codificadas por la familia de genes sHASEGP, incluyendo, pero no limitándose a: sHASEGP humana, sHASEGP de ratón, o una molécula equivalente obtenida a partir de cualquier otra fuente, o que se haya preparado sintéticamente, o que exhiba la misma actividad. Las secuencias de moléculas de ácidos nucleicos codificantes, y las secuencias de aminoácidos codificadas de las sHASEGPs de ejemplo, y/o los dominios de las mismas, se estipulan, por ejemplo, en la SEQ ID N0:4. El término también abarca la sHASEGP con sustitucio- nes de aminoácidos que no alteren sustancialmente la actividad de cada miembro, y también abarca las variantes de empalme de las mismas. Las sustituciones adecuadas, incluyendo, aunque no necesariamente, sustituciones conservadoras de aminoácidos, son conocidas por los técnicos en la materia, y se pueden hacer sin eliminar la actividad biológica, tal como la actividad catalítica, de la molécula resultante. Como se utiliza en la presente, una sHASEGP, siempre que se haga referencia a la misma en la presente, incluye cuando menos uno o todos, o cualquier combinación de: un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos estipulada en la SEQ ID NO : 6 , o por una secuencia de nucleótidos que incluya a los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1-509 de la SEQ ID NO : 1 ; un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibride bajo condiciones de exactitud baja, moderada, o alta, a la secuencia de nucleótidos estipulada en la SEQ ID NO : 6 ; un polipéptido que incluya a la secuencia de aminoácidos estipulada como los aminoácidos 1-509 de la SEQ ID NO : 1 ; un polipéptido que incluya una secuencia de aminoácidos que tengan una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, con la secuencia de aminoácidos estipulada en la SEQ ID NO : 1 , o como los aminoácidos 1-448 de la SEQ ID NO : 4. En particular, se proporciona el polipéptido de sHASEGP, con los dominios de hialuronidasa como se indican en la SEQ ID N0:4. El polipéptido es un polipéptido de una sola o dos cadenas. También se proporcionan porciones más pequeñas del mismo que retengan actividad de hialuronidasa. Los dominios de hialuronidasa a partir de sHASEGP varían en tamaño y constitución, incluyendo inserciones y supresiones en los ciclos superficiales. Por consiguiente, para los propósitos de la presente, el dominio catalítico es una porción de una sHASEGP, como se define en la presente, y es homólogo a un dominio de otras secuencias tipo hialuronidasa, tales como HYAL1, HYAL2 , HYAL3 , las cuales se han identificado anteriormente; sin embargo, no se reconoció que una forma de una sola cadena aislada del dominio de hialuronidasa humana podría funcionar en ensayos in vitro. Los residuos de aspartato y glutamato necesarios para la actividad, están presentes en los motivos conservados. Como se utiliza en la presente, un "dominio de hialuronidasa neutro de una sHASEGP soluble" se refiere a un dominio de beta-1, 4-endoglucosaminidasa de una sHASEGP que exhibe actividad de hialuronidasa a un pH neutro, es soluble bajo las condiciones descritas, y comparte homología y características estructurales con los dominios de la familia de glicosil-hidrolasa de la hialuronidasa, pero contiene secuencias adicionales en la terminal carboxilo que se requieren para la actividad neutra. Por consiguiente, es cuando menos la porción mínima del dominio la que exhibe actividad de hialuronidasa, como se evalúa mediante ensayos convencionales in vitro, y permanece soluble. En la presente se contemplan estos dominios de hialuronidasa y las porciones catalíticamente activas de los mismos. También se proporcionan formas truncadas del dominio de hialuronidasa que incluyen el fragmento más pequeño del mismo que actúa catalíticamente como una forma de una sola cadena. Como se usa en la presente y en la materia, neutro o activo neutro se refiere a una proteína exhibiendo actividad a pH neutro (v.gr., exhibiendo actividad a alrededor de pH 7) y que por lo tanto es activa a un rango de pH característico de muchos tejidos fisiológicos. Como también será apreciado por los técnicos en la materia, una proteína generalmente exhibe un rango de actividad alrededor de su pH óptimo. El pH óptimo de una proteína neutra activa típicamente estará dentro de una a varias unidades de pH por encima o debajo de pH 7, pero su rango de actividad puede extenderse sobre muchas unidades de pH . Un dominio de hialuronidasa de una sHASEGP, siempre que se haga referencia al mismo en la presente, incluye cuando menos uno o todos, o cualquier combinación de una porción catalíticamente activa de: un polipéptido de glicoproteína N-enlazado que incluye la secuencia de aminoácidos estipulada en la SEQ ID NO : 1 ; un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones de exactitud baja, moderada, o alta, a la secuencia de nucleótidos estipulada en la SEQ ID NO : 6 ; un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos estipulada en la SEQ ID NO : 1 ; un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, con la secuencia de aminoácidos estipulada en la SEQ ID NO : 1 ; y/o un dominio de hialuronidasa de un polipéptido codificado por una variante de empalme de la sHASEGP . Por consiguiente, para los propósitos de la presente, el dominio de hialuronidasa es una porción de sHASEGP, como se define en la presente, y es homólogo a un dominio de otras sHASEGPs . Como con la clase más grande de enzimas de la familia de hialuronidasa, los dominios catalíticos de sHASEGP comparten un alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos. Los residuos Asp y Glu necesarios para la actividad están presentes en los motivos conservados. La forma activa significa una forma activa in vivo y/o in vi tro. Como se describe en la presente, el dominio de hialuronidasa también puede existir como una glicoproteína secretada soluble. Se demuestra en la presente que, cuando menos in vi tro, las formas de una sola cadena de las sHASEGPs y los dominios catalíticos o las porciones enzimáticamente activas de los mismos (típicamente los truncamientos C- terminales) exhiben actividad de hialuronidasa. Por consiguiente, en la presente se proporcionan formas aisladas de los dominios de hialuronidasa de sHASEGPs, y su uso en ensayos de rastreo de fármacos in vi tro, para la identificación de agentes que modulen su actividad. Como se utiliza en la presente, el dominio catalíticamente activo de una sHASEGP se refiere al dominio de endoglucosa-minidasa activa en neutro, como se define la actividad in vi tro hacia un sustrato de glicosaminoglicano . Las sHASEGPs de interés incluyen aquéllas que son activas contra los sulfatos de condroitina y los proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs) in vivo e in vitro; y aquellas que son activas contra el hialuronano. Como se utiliza en la presente, una sHASEGP humana es una codificada por ácido nucleico, tal como ADN, presente en el genoma de un ser humano, incluyendo todas las variantes alélicas y variaciones conservadoras, siempre que no sean variantes encontradas en otros mamíferos . Como se utiliza en la presente, el ácido nucleico que codifica "un dominio de hialuronidasa o una porción catalíticamente activa de una sHASEGP" , se debe interpretar para referirse a un ácido nucleico que codifica solamente el dominio de hialuronidasa de una sola cadena mencionado, o una porción activa del mismo, y no las otras porciones contiguas de la sHASEGP como una secuencia continua. Como se utiliza en la presente, "enfermedad" o "desorden" se refiere a una condición patológica en un organismo resultante de, v.gr., infección o defecto genético, y se caracteriza por síntomas identificables .
Como se utiliza en la presente, una variante de empalme se refiere a una variante producida mediante el procesamiento diferencial de una transcripción primaria de ácido nucleico genómico, tal como ADN, que da como resultado más de un tipo de ARNm. En la presente se proporcionan variantes de empalme de las sHASEGPs . Como se utiliza en la presente, el dominio de hialuro-nidasa de una proteína de sHASEGP se refiere al dominio de hialuronidasa de una sHASEGP que exhibe actividad de endoglucosa-minidasa en neutro. Por consiguiente, es cuando menos la porción mínima de la proteína la que exhibe actividad de endoglucosamini -dasa, como sea evaluada mediante ensayos convencionales in vi tro. Los dominios de hialuronidasa humana de ejemplo incluyen cuando menos una porción suficiente de secuencias de aminoácidos estipuladas en la SEQ ID NO : 4 , que exhiban actividad de endoglu-cosaminidasa . También se contemplan moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene actividad de endoglucosamini -dasa en un ensayo de hialuronidasa in vitro, y que tienen una identidad de secuencia de cuando menos el 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, con la longitud completa de un dominio de hialuronidasa de un polipéptido sHASEGP, o que se híbrida a lo largo de su longitud completa, o a lo largo de cuando menos aproximadamente el 70%, el 80%, o el 90% de la longitud completa a un ácido nucleico que codifica un dominio de hialuronidasa, en particular bajo condiciones de exactitud moderada, en general alta . Para los dominios de hialuronidasa de PH20, por ejemplo, los residuos en la región N-terminal pueden ser críticos aunque no sean suficientes para la actividad. Por aplicación de técnicas como se muestra en la presente, se pueden generar dominios de hialuronidasa de la sHASEGP son catalíticamente activos. A manera de ilustración, aunque el dominio de hialuronidasa de PH20 generalmente requiere de sus aminoácidos N-termina-les para la actividad; la porción de la terminal C se puede truncar hasta el último residuo de cisteína, y no obstante requiere de aminoácidos adicionales para ser óptimamente activa. La cantidad que se puede remover se puede determinar de una manera empírica probando el polipéptido para determinar su actividad de hialuronidasa en un ensayo in vitro que evalúe la separación catalítica. Por consiguiente, se contemplan porciones más pequeñas de los dominios de hialuronidasa, en particular los dominios de una sola cadena de los mismos que retengan actividad de hialuronidasa. Tales versiones más pequeñas son en general versiones truncadas C-terminales de los dominios de hialuronidasa. Los dominios de hialuronidasa varían en su tamaño y constitución, incluyendo inserciones y supresiones en los ciclos superficiales. Tales dominios exhiben una estructura conservada, incluyendo cuando menos una característica estructural, tal como el donador de protones, y/u otras características de los dominios de hialuronidasa de las endoglucosaminidasas . Por consiguiente, para los propósitos de la presente, el dominio de hialuronidasa es una porción de una sola cadena de una sHASEGP, como se define en la presente, pero es homólogo en sus características estructurales y en la retención de similitud u homología de secuencia del dominio de hialuronidasa con otras secuencias tipo hialuronidasa. La glicoproteína exhibe actividad de hialuronidasa como una sola cadena . Como se utiliza en la presente, homologa significa una identidad de secuencia de ácido nucleico aproximadamente mayor al 25%, tal como 25%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95%. Si es necesario, se especificará el porcentaje de homología. Los términos "homología" e "identidad" se utilizan con frecuencia de una manera intercambiable. En general, las secuencias se alinean de tal manera que se obtenga la concordancia de orden más alto (ver, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., editor, Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., editor, Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part/, Griffin, A. M . , y Griffin, H. G., editores, Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., editores, M. Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo y colaboradores (1988), Slam J. Applied Math 48 : 1073) . Por identidad de secuencia, los números de aminoácidos conservados son determinados por programas de algoritmos de alineación convencionales, y se utilizan con las multas de huecos predeterminadas establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácidos nucleicos sustancialmente homologas se hibridarían típicamente a una exactitud moderada o a una exactitud alta todo a lo largo de la longitud del ácido nucleico, o a lo largo de cuando menos aproximadamente 70%, 80%, 90% de la longitud completa de la molécula de ácido nucleico de interés. También se contemplan moléculas de ácidos nucleicos que contengan codones degenerados en lugar de los codones de la molécula de ácido nucleico de hibridación. El que cualesquiera dos moléculas de ácidos nucleicos tengan secuencias de nucleótidos que sean cuando menos, por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% "idénticas", se puede determinar utilizando algoritmos de computación conocidos, tales como el programa "FASTA", utilizando, por ejemplo, los parámetros predeterminados, como en Pearson y colaboradores (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85]; 2444 (otros programas incluyen el paquete del programa GCG (Vedereux, J., y colaboradores, Nucleic Acids Research 12 : 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., y colaboradores J. MOLEC. BIOL . 215]:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, y [CARILLO y colaboradores] (1988) SLAM J. Applied Math 48:1073) . Por ejemplo, se puede utilizar la función BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information para determinar la identidad. Otros programas comercialmente o públicamente disponibles incluyen DNASTAR "MEGALIGN" PROGRAM (Madison, WI) , y el programa "Gap" de University of Wisconsin Genetics Computer (UWG) (Madison, Wisconsin, Estados Unidos)). El porcentaje de homología o identidad de las proteínas y/o moléculas de ácidos nucleicos se puede determinar, por ejemplo, mediante una comparación de la información de la secuencia, utilizando un programa de computadora GAP, por ejemplo Needleman y colaboradores (1970) , J. Mol. Biol . 48:443, revisado por Smith y aterman, Adv. Appl . Math (1981) 2:482. Dicho de una manera breve, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que sean similares, dividido entre el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros predeterminados para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades, y de 0 para las no identidades) , y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y colaboradores (1986) Nucí. Acids Res. 14:6745, como es descrita por Schwartz y Dayhoff, editores, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358 (1979); (2) una multa de 3.0 por cada hueco, y una multa adicional de 0.10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna multa por los huecos de extremo. Por consiguiente, como se utiliza en la presente, el término "identidad" representa una comparación entre un polipéptido o polipéptido de prueba y uno de referencia. Como se utiliza en la presente, el término "cuando menos 90% idéntico a" se refiere al porcentaje de identidad de 90 a 99.99 en relación con los polipéptidos de referencia. La identidad en un nivel del 90% o más indica el hecho de que, para propósitos de ej emplificación, se asume que se comparan una longitud del polinucleotido de prueba y de referencia de 100 aminoácidos. No más del 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba difiere de aquél de los polipéptidos de referencia. Se pueden hacer comparaciones similares entre polinucleotidos de prueba y de referencia. Tales diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales aleatoriamente distribuidas sobre toda la longitud de una secuencia de aminoácidos, o se pueden agrupar en una o más localizaciones de longitud variable hasta el máximo permisible, por ejemplo una diferencia de 10/100 aminoácidos (una identidad de aproximadamente 90%) . Las diferencias se definen como sustituciones o supresiones de ácidos nucleicos o de aminoácidos. Al nivel de las homologías o identidades anteriores, de aproximadamente 85-90%, el resultado debería ser independiente del programa y se establecerían los parámetros de los huecos; estos altos niveles de identidad se pueden evaluar fácilmente, con frecuencia sin apoyarse en un software. Como se utiliza en la presente, cebador se refiere a un ol igonucleótido que contiene dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos , típicamente más de tres, a partir de los cuales se puede iniciar la síntesis de un producto de extensión de cebador. Las condiciones experimentales que conducen a la síntesis incluyen la presencia de trifosfatos de nucleosidos y un agente para la polimerización y extensión, tal como polimerasa de ADN, y un regulador, temperatura, y pH adecuados. Como se utilizan en la presente, los animales incluyen cualquier animal, tal como, pero no limitándose a, cabras, vacas, venados, ovejas, roedores, cerdos, y seres humanos. Los animales no humanos excluyen a los seres humanos como el animal contemplado. Las sHASEGPs proporcionadas en la presente son a partir de cualquier fuente, animal, planta, procariótica , y de hongos. La mayoría de las sHASEGPs son de origen animal, incluyendo de origen de mamífero, y mas preferentemente son de origen humano en el caso de su uso en humanos . Como se utiliza en la presente, la terapia génica involucra la transferencia de ácido nucleico heterologo, tal como ADN, a ciertas células, células objetivo, de un mamífero, en particular un ser humano, con un desorden o condiciones para las cuales se busque la terapia. El ácido nucleico, tal como el ADN, se introduce en las células objetivas seleccionadas de una manera tal que se expresa el ácido nucleico heterologo, tal como ADN, y se produce de esta manera un producto terapéutico codificado por el mismo. De una manera alternativa, el ácido nucleico heterólo-go, tal como ADN, puede mediar de alguna manera la expresión del ADN que codifique el producto terapéutico, o puede codificar un producto, tal como un péptido o un ARN que medie de alguna manera, directa o indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. La terapia génica también se puede utilizar para suministrar ácido nucleico que codifique un producto genético que reemplace un gen defectuoso, o que complemente a un producto genético producido por el mamífero o la célula en la cual se introduce. El ácido nucleico introducido puede codificar un compuesto terapéutico, tal como un inhibidor de factor de crecimiento del mismo, o un factor de necrosis tumoral o inhibidor del mismo, tal como un receptor para el mismo, que normalmente no sea producido en el huésped mamífero, o que no sea producido en las cantidades terapéuticamente efectivas, o en un tiempo terapéuticamente útil. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, que codifique el producto terapéutico, se puede modificar antes de introducirse en las células del huésped afligido con el objeto de mejorar o alterar de otra manera el producto o su expresión. La terapia génica también puede involucrar el suministro de un inhibidor o represor u otro modulador de la expresión genética. Como se utiliza en la presente, el ácido nucleico heterólogo es ácido nucleico que codifica proteínas (o, si ADN, codifica ARN que codifica proteínas) que normalmente no son producidas in vivo por la célula en la que se exprese, o que medie o codifique mediadores que alteren la expresión del ácido nucleico endógeno, tal como ADN, al afectar la transcripción, traducción, u otros procesos bioquímicos regulables. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, también puede ser referido como ácido nucleico extraño, tal como ADN. Cualquier ácido nucleico, tal como ADN, que un técnico en la materia reconozca o considere como heterólogo o extraño para la célula en la que se exprese, es abarcado en la presente como ácido nucleico heterólogo; el ácido nucleico heterólogo incluye ácido nucleico exógena-mente agregado que también se exprese de una manera endógena. Los ejemplos del ácido nucleico heterólogo incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico que codifique proteínas marcadoras rastreables, tales como una proteína que confiera resistencia a fármacos, ácido nucleico que codifique sustancias terapéuticamente efectivas, tales como agentes, enzimas y hormonas contra el cáncer, y ácidos nucleicos (tales como ADN y ARN) , que codifiquen otros tipos de proteínas, tales como anticuerpos. Los anticuerpos que sean codificados por el ácido nucleico heterólogo pueden ser secretados o expresados sobre la superficie de la célula en la que se haya introducido el ácido nucleico heterólogo. El ácido nucleico heterólogo generalmente no es endógeno para la célula en la que se introduce, pero se ha obtenido a partir de otra célula o se ha preparado sintéticamente . En general, aunque no necesariamente, este ácido nucleico codifica ARN y/o proteínas que normalmente no son producidas por la célula en la que se expresa. Como se utiliza en la presente, un producto terapéuticamente efectivo es un producto que es codificado por ácido nucleico heterólogo, típicamente ADN, que, al introducir el ácido nucleico en un huésped, se expresa un producto que aminora o elimina los síntomas, manifestaciones de una enfermedad heredada o adquirida, o que cura la enfermedad. Como se utiliza en la presente, la mención de que una glicoproteína consiste esencialmente en el dominio de hialuroni-dasa, significa que la única porción de sHASEGP del polipéptido es un dominio de hialuronidasa , o una porción catalíticamente activa del mismo. El polipéptido, opcionalmente , y en general, incluirá secuencias de aminoácidos no derivadas de sHASEGP adicionales . Como se utiliza en la presente, el dominio se refiere a una porción de una molécula, por ejemplo glicoproteínas o los ácidos nucleicos codificantes, que sean estructuralmente y/o funcionalmente distintos de otras porciones de la molécula. Como se utiliza en la presente, hialuronidasa se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de glicosamino-glicanos incluyendo hialuronanos .
Para mayor claridad, la referencia a hialuronidasa se refiere a todas las formas, y en particular las formas serán específicamente designadas. Para los propósitos de la presente, el dominio de hialuronidasa incluye la proteína enlazada con membrana y las formas solubles de una proteína sHASEGP . Como se utilizan en la presente, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN, y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos de proteína (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser de una sola o de doble cadena. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, opcionalmente marcados, con una marca detectable, tal como una marca fluorescente o una radiomarca, generalmente se contemplan las moléculas de una sola cadena. Estas moléculas normalmente son de una longitud tal que su objetivo es estadísticamente único o de bajo número de copias (típicamente menor de 5, en general menor de 3) para sondear o cebar una biblioteca. En general, una sonda o un cebador contiene cuando menos 14, 16, 20 o 30 residuos de secuencia contigua o casi contigua complementaria a, o idéntica a, un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100, o más ácidos nucleicos de largo. Como se utiliza en la presente, ácido nucleico que codifica un fragmento o una porción de una sHASEGP se refiere a un ácido nucleico que codifica solamente el fragmento o la porción recitados de sHASEGP, y no a las otras porciones contiguas de la sHASEGP.
Como se utiliza en la presente, enlace operativo de ácido nucleico heterologo a secuencias reguladoras y efectoras de nucleotidos, tales como promotores, potenciadores , sitios de paro de transcripción y traducción, y otras secuencias de señal, se refiere a la relación entre ese ácido nucleico, tal como ADN, y tales secuencias de nucleotidos. Por ejemplo, enlace operativo de ADN heterologo a un promotor, se refiere a la relación funcional (y típicamente física) entre el ADN y el promotor, de tal manera que la transcripción de tal ADN se inicia a partir del promotor mediante una polimerasa de ARN que reconoce específicamente, se enlaza a, y transcribe el ADN en el marco de lectura. Por consiguiente, operativamente enlazado u operativamente asociado se refiere a la relación funcional del ácido nucleico, tal como ADN, con secuencias reguladoras y efectoras de nucleotidos, tales como promotores, potenciadores, sitios de paro de transcripción y traducción, y otras secuencias de señal. Con el objeto de optimizar la expresión y/o la transcripción in vi tro, puede ser necesario remover, agregar, o alterar porciones no traducidas 5' de los clones, para eliminar el inicio de traducción alternativo inapropiado potencial extra, es decir, codones de inicio u otras secuencias que puedan interferir con, o reducir, la expresión, ya sea al nivel de la transcripción o de la traducción. De una manera alternativa, se pueden insertar sitios de enlace de ribosoma en consenso (ver, por ejemplo, Kozak J. Biol . Chem. 266: 19867-19870 (1991)) inmediatamente a 5' del codón de inicio, y se puede mejorar la expresión. El deseo (o necesidad) de esta modificación se puede determinar de una manera empírica. Como se utiliza en la presente, una secuencia complementaria para cuando menos una porción de un ARN, con referencia a los oligonucleótidos anti-sentido, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poderse hibridar con el ARN, en general bajo condiciones de exactitud moderada o alta, formando un dúplex estable; en el caso de los ácidos nucleicos anti-sentido de sHASEGP de doble cadena, se puede probar de esta manera una sola cadena del ADN dúplex (o ARNds) , o se puede ensayar la formación triplex. La capacidad para hibridarse depende del grado de complementariedad y de la longitud del ácido nucleico anti-sentido. En términos generales, mientras más largo sea el ácido nucleico que se hibride, más malas concordancias de bases con una sHASEGP que codifique ARN podrá contener, y todavía formar un dúplex estable (o triplex, según pueda ser el caso) . Un técnico en este campo puede aseverar un grado tolerable de mala concordancia mediante el empleo de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. Para los propósitos de la presente, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos en cualquiera de las sHASEGPs y los dominios de hialuronidasa de las mismas, en el entendido de que la proteína resultante exhiba actividad de hialuronidasa. Las sustituciones de aminoácidos contempladas incluyen sustituciones conservadoras, tales como las estipuladas en la Tabla 1, y otras modificaciones que no eliminen la actividad proteolítica . Como se describe en la presente, las sustituciones que alteren las propiedades de las proteínas, tales como la remoción de los sitios de disociación y otros sitios, también son contempladas; estas sustituciones en general no son conservadoras, pero pueden ser fácilmente efectuadas por los técnicos en la materia. Las sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos son conocidas para los técnicos en esta materia, y se pueden hacer en general sin eliminar (y de preferencia sin sustancial-mente alterar) la actividad biológica, por ejemplo la actividad enzimática, de la molécula resultante. Los técnicos en este campo reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en las regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (ver, v.gr., atson y colaboradores, Molecular Biology of the Gene, 4a edición, 1987, The Ben amin/Cummings Pub. Co . , página 224) . Dentro de la definición también se incluye el fragmento catalíticamente activo de una sHASEGP, en particular una porción de hialuronidasa de una sola cadena. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen, por ejemplo, de acuerdo con las estipuladas en la Tabla 1, como sigue: TABLA 1. Sustitución conservadora de residuos originales Ala (A) Gly; Ser, Abu Arg (R) Lys, Orn Asn (N) Gln; His Cys (C) Ser Gin (Q) Asn Glu (E) Asp Gly (G) Ala; Pro His (H) Asn; Gln lie (I) Leu; Val; Met; Nle; Nva Leu (L) ; Val; Met; Nle; Nv Lys (K) Arg; Gln; Glu Met (M) Leu; Tyr; lie; Nle Val Orn Lys ; Arg Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) lie; Leu; Met ; Nle; Nva . También son permisibles otras sustituciones, y se pueden determinar de una manera empírica o de acuerdo con las sustituciones conservadoras conocidas . Como se utiliza en la presente, Abu es ácido 2-aminobutírico ; Nle es norleucina; Nva es norvalina; Orn es ornitina. Como se utiliza en la presente, los aminoácidos que se presentan en las diferentes secuencias de aminoácidos que aparecen en la presente, se identifican de acuerdo con sus abreviaturas bien conocidas de tres letras o de una letra. Los nucleotidos que se presentan en los diferentes fragmentos de ADN, se designan con las designaciones estándares de una sola letra utilizadas rutinariamente en este campo. Como se utiliza en la presente, una sonda o cebador basado en una secuencia de nucleotidos dada a conocer en la presente, incluye cuando menos 10, 14, típicamente cuando menos 16 contiguos de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO : 6 , y las sondas de cuando menos 20, 30, 50, o 100 contiguos de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO : 6. La longitud de la sonda o del cebador para hibridación única es una función de la complejidad del genoma de interés. Como se utiliza en la presente, disminución de los síntomas de un desorden particular mediante la administración de una composición farmacéutica particular, se refiere a cualquier disminución, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria, que pueda ser atribuida a, o asociada con, la administración de la composición. Como se utiliza en la presente, los polinucleótidos anti-sentido se refieren a las secuencias sintéticas de bases de nucleotidos complementarias para el ARNm o la cadena de sentido de ADN de doble cadena. La mezcla de polinucleótidos de sentido y anti-sentido bajo condiciones apropiadas conduce al enlace de las dos moléculas, o a la hibridación. Cuando estos polinucleótidos se enlazan (se hibridan con) al ARNm, se presenta la inhibición de la síntesis de proteína (traducción) . Cuando estos polinucleótidos se enlazan al ADN de doble cadena, se presenta la inhibición de la síntesis del ARN (transcripción) . La inhibición resultante de la traducción y/o transcripción conduce a una inhibición de la síntesis de la proteína codificada por la cadena de sentido. La molécula de ácido nucleico anti-sentido típicamente contiene un número suficiente de nucleotidos para enlazarse específicamente con un ácido nucleico objetivo, en general de cuando menos cinco nucleotidos contiguos, con frecuencia de cuando menos 14 o 16 o 30 nucleotidos contiguos o nucleotidos modificados complementarios para la porción codificante de una molécula de ácido nucleico que codifique un gen de interés, por ejemplo un ácido nucleico que codifique un dominio de hialuronidasa de una sola cadena de una sHASEGP. Como se utiliza en la presente, un arreglo se refiere a una colección de elementos, tales como anticuerpos, que contiene tres o más miembros. Un arreglo dirigible es uno en donde los miembros del arreglo son identificables , típicamente por su posición sobre un soporte en fase sólida. Por consiguiente, en general, los miembros del arreglo se inmovilizan sobre lugares identificables separados sobre la superficie de una fase sólida . Como se utiliza en la presente, anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina , ya sea natural o parcialmente o totalmente producida sintéticamente, incluyendo cualquier derivado de la misma que retenga la capacidad de enlace específico del anticuerpo. Por consiguiente, el anticuerpo incluye cualquier proteína que tenga un dominio de enlace que sea homólogo, o sustancialmen-te homólogo, a un dominio de enlace de inmunoglobulina. Los anticuerpos incluyen miembros de cualquier inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE . Como se utiliza en la presente, fragmento de anticuerpo se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que sea menor que la longitud completa, que retenga cuando menos una porción de la capacidad de enlace específico del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab ' , F(ab)2, Fvs de una sola cadena (scFV) , FV, diacuerpo dsFV, y fragmentos Fd. El fragmento puede incluir múltiples cadenas enlazadas entre sí, tal como mediante puentes de disulfuro. Un fragmento de anticuerpo generalmente contiene cuando menos aproximadamente 50 aminoácidos, y típicamente cuando menos 200 aminoácidos. Como se utiliza en la presente, un fragmento de anticuerpo Fv se compone de un dominio pesado variable (VH) y un dominio ligero variable enlazado por interacciones no covalentes. Como se utiliza en la presente, un dsFV se refiere a un Fv con un enlace de disulfuro intermolecular diseñado. Como se utiliza en la presente, un fragmento F(ab)2 es un fragmento de anticuerpo que resulta de la digestión de una inmunoglobulina con pepsina a un pH de 4.0 a 4.5; se puede expresar de una manera recombinante para producir el fragmento equivalente . Como se utiliza en la presente, los fragmentos Fab son fragmentos de anticuerpos que resultan de la digestión de una inmunoglobulina con papaína; se pueden expresar de una manera recombinante para producir el fragmento equivalente. Como se utiliza en la presente, scFVs se refiere a fragmentos de anticuerpos que contienen una cadena ligera variable V, y una cadena pesada variable (VH) covalentemente conectadas mediante un enlazador de polipéptido en cualquier orden. El enlazador es de una longitud tal que los dos dominios variables se puentean sin una interferencia sustancial . Los enlazadores incluidos son residuos (Gly-Ser)n con algunos residuos Glu o Lys dispersados para aumentar la solubilidad. Como se utiliza en la presente, anticuerpos humanizados se refiere a los anticuerpos que se modifican para incluir secuencias humanas de aminoácidos, de tal manera que su administración a un ser humano no provoque una respuesta inmune. Los métodos para la preparación de estos anticuerpos son conocidos. Por ejemplo, para producir estos anticuerpos, el hibridoma u otra célula procariótica o eucariótica, tal como una célula de E. coli o de CHO, que exprese el anticuerpo monoclonal, se altera mediante técnicas de ADN recombinante , para expresar un anticuerpo en donde la composición de aminoácidos de la región no variable se base en los anticuerpos humanos. Se han diseñado programas de computadora para identificar estas regiones. Como se utiliza en la presente, los diacuerpos son scFV diméricos. Los diacuerpos típicamente tienen enlazadores de péptido más cortos que los scFVs, y en general se dimerizan. Como se utiliza en la presente, la producción por medios recombinantes mediante la utilización de métodos de ADN recombinante, significa el uso de métodos bien conocidos de biología molecular para expresar las proteínas codificadas por el ADN clonado. Como se utiliza en la presente, el término evaluar pretende incluir la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una sHASEGP, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también para obtener un índice, proporción, porcentaje, indicación visual, u otro indicador de valor del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta, y la especie química realmente detectada, por supuesto, no necesita ser el producto de proteólisis mismo, sino que, por ejemplo, puede ser un derivado del mismo o alguna otra sustancia. Como se utiliza en la presente, la actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un compuesto, a las respuestas fisiológicas que resultan después de la administración in vivo de un compuesto, composición, u otra mezcla. Por consiguiente, la actividad biológica abarca los efectos terapéuticos y la actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones, y mezclas. Las actividades biológicas se pueden observar en sistemas in vi tro diseñados para probar o usar estas actividades. Por consiguiente, para los propósitos de la presente, la actividad biológica de una luciferasa es su actividad de oxigenasa, mediante la cual, después de la oxidación de un sustrato, se produce luz. Como se utiliza en la presente, la actividad funcional se refiere a un polipéptido o porción del mismo que exhibe una o más actividades asociadas con una proteína de longitud completa. Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimáti-ca, antigenicidad (capacidad para enlazarse a, o competir con, un polipéptido por el enlace con un anticuerpo anti -polipéptido) , inmunogenicidad, capacidad para formar multímeros, la capacidad para enlazarse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido . Como se utiliza en la presente, un conjugado se refiere a los compuestos proporcionados en la presente que incluyen una o más sHASEGP, incluyendo una sHASEGP, en particular los dominios de hialuronidasa de una sola cadena de la misma, y uno o más agentes de dirección. Estos conjugados incluyen los productos por medios recombinantes como proteínas de fusión, los producidos por medios químicos, tales como acoplamiento químico a través de, por ejemplo, acoplamiento con grupos sulfhidrilo, y los producidos mediante cualquier otro método mediante el cual se enlace cuando menos una sHASEGP, o un dominio de la misma, directa o indirectamente mediante enlazadores, a un agente de dirección. Como se utiliza en la presente, un agente de dirección es cualquier fracción, tal como una proteína o una porción efectiva de la misma, que proporcione el enlace específico del conjugado con un receptor de superficie celular, el cual pueda internalizar el conjugado o la porción de la sHASEGP del mismo. Un agente de dirección también puede ser uno que promueva o facilite, por ejemplo, el aislamiento por afinidad o la purificación del conjugado; la unión del conjugado a una superficie; o la detección' del conjugado o complejos que contengan al conjugado. Como se en la presente, un conjugado de anticuerpo se refiere a un conjugado en donde el agente de dirección es un anticuerpo . Como se utiliza en la presente, el derivado o análogo de una molécula se refiere a una porción derivada a partir de una versión modificada de la molécula. Como se utiliza en la presente, una cantidad efectiva de un compuesto para el tratamiento de una enfermedad particular, es una cantidad que es suficiente para disminuir, o reducir de alguna manera los síntomas asociados con la enfermedad. Esta cantidad se puede administrar como una sola dosificación, o se puede administrar de acuerdo con un régimen, mediante el cual sea efectiva. La cantidad puede curar la enfermedad, pero típicamente se administra con el objeto de disminuir los síntomas de la enfermedad. Se puede requerir una administración repetida para alcanzar la disminución deseada de los síntomas. Como se utiliza en la presente, equivalente, al referirse a dos secuencias de ácidos nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestión codifican la misma secuencia de aminoácidos o proteínas equivalentes. Cuando se utiliza equivalente para referirse a dos proteínas o péptidos, significa que las dos proteínas o péptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos con solamente sustituciones de aminoácidos (tales como, pero no limitándose a, cambios conservadores tales como los estipulados en la Tabla 1 anterior) que no alteran sustancialmente la actividad o función de la proteína o del péptido. Cuando equivalente se refiere a una propiedad, la propiedad no necesita estar presente hasta el mismo grado (v.gr., dos péptidos pueden exhibir diferentes tasas del mismo tipo de actividad enzimática) , pero las actividades normalmente son sustancialmente iguales. Complementaria, cuando se refiere a dos secuencias de nucleótidos, significa que las dos secuencias de nucleótidos son capaces de hibridarse, típicamente con malas concordancias menores a 25%, 15%, 5%, o 0% entre nucleótidos opuestos. Si es necesario, se especificará el porcentaje de complementariedad . Normalmente las dos moléculas se seleccionan de tal manera que se hibriden bajo condiciones de alta exactitud. Como se utiliza en la presente, un agente que modula la actividad de una proteína o la expresión de un gen o ácido nucleico, reduce o aumenta o altera de otra manera la actividad de la proteína, o de alguna manera regula hacia arriba o abajo o altera de otra forma la expresión del ácido nucleico en una célula . Como se utiliza en la presente, inhibidor de la actividad de una sHASEGP abarca a cualquier sustancia que prohiba o reduzca la producción, las modificaciones post-traducción, la maduración, o la localización en membrana de la sHASEGP o cualquier sustancia que interfiera con, o reduzca, la eficacia proteolítica de la misma, en particular de una forma de una sola cadena en un ensayo de rastreo in vi tro. Como se utiliza en la presente, un método para tratar o prevenir una enfermedad neoplástica significa que se reducen, disminuyen, previenen, ponen en un estado de remisión, o se mantienen en un estado de remisión cualesquiera de los síntomas, tales como el tumor, las metástasis del mismo, la vascularización de los tumores, u otros parámetros mediante por los cuales se caracterice la enfermedad. También significa que se pueden eliminar, reducir, o prevenir las distinciones de la enfermedad neoplástica y metástasis mediante el tratamiento. Ejemplos no limitantes de las distinciones incluyen la degradación descontrolada de la membrana de basamento y la matriz extra-celular próxima, migración, división, y organización de las células endoteliales en nuevos capilares en funcionamiento, y la persistencia de estos capilares en funcionamiento. Como se utilizan en la presente, sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, u otros derivados de los conjugados, incluyen cualesquiera sales, ésteres, o derivados que puedan ser fácilmente preparados por los técnicos en la materia utilizando los métodos conocidos para esta derivación, y que produzcan compuestos que se puedan administrar a animales o a seres humanos sin efectos tóxicos sustanciales, y que sean farmacéuticamente activos o que sean pro- fármacos . Como se utiliza en la presente, un pro-fármaco es un compuesto que, después de su administración in vivo, se metaboli-za o se convierte de otra manera a la forma biológicamente, farmacéuticamente, o terapéuticamente activa del compuesto. Con el fin de producir un pro- fármaco, el compuesto farmacéuticamente activo se modifica de tal manera que se regenera el compuesto activo mediante procesos metabólicos. El pro- fármaco se puede diseñar para alterar la estabilidad metabólica o las características de transporte de un fármaco, para enmascarar los efectos secundarios o la toxicidad, para mejorar el sabor de un fármaco, o para alterar otras características o propiedades de un fármaco. En virtud del conocimiento de los procesos farmacodinámicos y del metabolismo del fármaco in vivo, los técnicos en este campo, una vez que conozcan el compuesto farmacéuticamente activo, pueden diseñar pro- fármacos del compuesto (ver, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nueva York, páginas 388-392) . Como se utiliza en la presente, un fármaco identificado mediante los métodos de rastreo proporcionados en la presente, se refiere a cualquier compuesto que sea un candidato para utilizarse como un producto terapéutico, o como un compuesto guía para el diseño de un producto terapéutico. Estos compuestos pueden ser moléculas pequeñas, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, miméticos de péptidos, moléculas anti-sentido o ARNds, tales como ARNi , anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos recombinantes , y otros compuestos que puedan servir como fármacos candidatos o como compuestos guías . Como se utiliza en la presente, un peptidomimético es un compuesto que imita la conformación y ciertas características estereoquímicas de la forma biológicamente activa de un péptido particular. En general, los peptidomiméticos se diseñan para imitar ciertas propiedades deseables de un compuesto, pero no las propiedades indeseables, tales como flexibilidad, que conducen a una pérdida de una conformación biológicamente activa, y al rompimiento del enlace. Los peptidomiméticos se pueden preparar a partir de compuestos biológicamente activos mediante el reemplazo de ciertos grupos o enlaces que contribuyan a las propiedades indeseables con bioisoésteres . Los bioisoésteres son conocidos por los técnicos en la materia. Por ejemplo, se ha utilizado el bioisoéster de metileno CH2S como un reemplazo de amida en los análogos de encefalina (ver, por ejemplo, Spatola (1983) páginas 267-357 en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weistein, Ed. Volumen 7, Marcel Dekker, Nueva York) . La morfina, la cual se puede administrar oralmente, es un compuesto que es un peptidomimético del péptido de endorfina. Para los propósitos de la presente, se incluyen péptidos cíclicos entre los peptidomiméticos. Como se utiliza en la presente, una región promotora o un elemento promotor se refiere a un segmento de ADN o ARN que controla la transcripción del ADN o del ARN con el que está operativamente enlazado. La región promotora incluye secuencias específicas que son suficientes para el reconocimiento, enlace, e inicio de transcripción de la polimerasa de ARN. Esta porción de la región promotora es referida como el promotor. Además, la región promotora incluye secuencias que modulan esta actividad de reconocimiento, enlace, e inicio de transcripción de la polimerasa de ARN. Estas secuencias pueden ser de acción cis, o pueden responder a factores de acción trans . Los promotores, dependiendo de la naturaleza de la regulación, pueden ser constitutivos o regulados. Los promotores de ejemplo contemplados para utilizarse en procariontes incluyen los promotores de bacteriófago T7 y T3. Como se utiliza en la presente, un receptor se refiere a una molécula que tiene afinidad para un ligando dado. Los receptores pueden ser moléculas que se presenten naturalmente, o sintéticas. Los receptores también pueden ser referidos en la técnica como anti-ligandos . Como se utiliza en la presente, el receptor y el anti -ligando son intercambiables. Los receptores se pueden utilizar en su estado no alterado, o como agregados con otras especies. Los receptores se pueden unir, de una manera covalente o no covalente, o pueden estar en contacto físico con, un miembro de enlace, ya sea directa o indirectamente por medio de una sustancia de enlace específico o de un enlazador. Los ejemplos de los receptores incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos, receptores de membrana celular, receptores de superficie, y receptores de internalización, anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos, tales como virus, células, u otros materiales, fármacos, polinucleótidos , ácidos nucleicos, péptidos, factores, lecitinas, azúcares, polisacáridos , células, membranas celulares , y organelos . Ejemplos de los receptores y de las aplicaciones utilizando estos receptores incluyen, pero no se restringen a: a) enzimas: proteínas de transporte específico o enzimas esenciales para la sobrevivencia de los microorganismos, que podrían servir como objetivos para la selección de antibióticos [ligandos] ; b) anticuerpos: se puede investigar la identificación de un sitio de enlace de ligando sobre la molécula de anticuerpo que se combina con el epítope de un antígeno de interés; la determinación de una secuencia que imite a un epítope antigénico puede conducir al desarrollo de vacunas, en las cuales el inmunógeno se basa en una o más de estas secuencias, o conduce al desarrollo de agentes de diagnóstico relacionados o compuestos útiles en tratamientos terapéuticos, tales como para enfermedades auto- inmunes ; c) ácidos nucleicos: identificación de ligando, tal como proteína o ARN, sitios de enlace; d) polipéptidos catalíticos: polímeros, incluyendo polipéptidos, que son capaces de promover una reacción química que involucre la conversión de uno o más reactivos hasta uno o más productos; tales polipéptidos incluyen en general un sitio de enlace específico para cuando menos un reactivo o intermediario de reacción, y una funcionalidad activa próxima al sitio de enlace, en donde la funcionalidad es capaz de modificar químicamente el reactivo enlazado (ver, por ejemplo la patente US 5,215,899); e) receptores de hormonas: la determinación de los ligandos que se enlazan con alta afinidad a un receptor es útil en el desarrollo de terapias de reemplazo de hormonas; por ejemplo, la identificación de los ligandos que se enlazan a estos receptores puede conducir al desarrollo de fármacos para controlar la presión sanguínea; y f) receptores de opiatos: la determinación de ligandos que se enlacen a los receptores opiatos en el cerebro es útil en el desarrollo de reemplazos menos adictivos para la morfina y fármacos relacionados. Como se utiliza en la presente, una muestra se refiere a cualquier cosa que pueda contener un analito para el cual se desee un ensayo de analito. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como fluido biológico o tejido biológico. Los ejemplos de los fluidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, fluido espinal cerebral, lágrimas, moco, esperma, fluido amniótico, o similares. Los tejidos biológicos son acumulaciones de células, usualmente de una clase particular, junto con su sustancia intercelular, que forman uno de los materiales estructurales de una estructura humana, animal, de planta, bacteriana, de hongos, o viral, incluyendo los tejidos conectivo, epitelial, muscular, y nervioso. Los ejemplos de los tejidos biológicos también incluyen órganos, tumores, nodos linfáticos, arterias, y células individuales . Como se utiliza en la presente: la exactitud de hibridación en la determinación del porcentaje de mala concordancia es como sigue: 1) exactitud alta: SSPE 0.1 x, SDS al 01 por ciento, 65°C; 2) exactitud media: SSPE 0.2 x, SDS al 0.1 por ciento, 50°C; 3) exactitud baja: SSPE 1.0 x, SDS al 0.1 por ciento, 50°C. Los técnicos en la materia saben que el paso de lavado selecciona los híbridos estables, y también conocen los ingredientes de SspE (ver, por ejemplo, Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Volumen 3, página B 13, ver también numerosos catálogos que describen las soluciones de laboratorio comúnmente utilizadas) . SspE es NaCl 0.18 N regulado con fosfato pH 7.4. Además, los técnicos en este campo reconocen que la estabilidad de los híbridos es determinada por la TmT que es una función de la concentración del ion de sodio y la temperatura (Tm=81.5°C-16.6+0.41 (% G+C) -600/L) ) , de tal manera que los únicos parámetros en las condiciones de lavado críticos para la estabilidad del híbrido son la concentración del ion de sodio en SspE (o SSC) , y la temperatura. Se entiende que se pueden lograr exactitudes equivalentes utilizando reguladores, sales, y temperaturas alternativas. A manera de ejemplo, y no de limitación, los procedimientos empleando condiciones de baja exactitud son como sigue (ver también Shilo y Weinberg, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 78:6789-6792 (1981)) : los filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 40°C en una solución que contiene formamida al 35%, SSC 5X, Tris-HCl 50 mM (pH de 7.5), EDTA 5 mM, PVP al 0.1%, Ficoll al 0.1%, BSA al 1%, y 500 ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (10X), SSC es cloruro de sodio 1.5 M, y citrato de sodio 0.15 M, ajustado a un pH de 7. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con las siguientes modificaciones: PVP al 0.02%, Ficoll al 0.02%, BSA al 0.2%, ADN de esperma 100VG/M, sulfato de dextrano al 10% (peso/volumen) , y se utiliza una sonda marcada con 32P de 5-20X 106 cpm. Los filtros se incuban en una mezcla de hibridación durante 18 a 20 horas a 40°C, y luego se lavan durante 1.5 horas a 55°C, en una solución que contiene SSC 2X, Tris-HCl 25 m (pH de 7.4), EDTA 5 mM, y SDS al 0.1%. La solución de lavado es reemplazada con solución fresca, y se incuba durante 1.5 horas adicionales a 60°C. Los filtros se secan y se exponen para la auto-radiografía. Si es necesario, los filtros se lavan por tercera vez a 65-68°C, y se vuelven a exponer a la película. Otras condiciones de baja exactitud que se pueden emplear son bien conocidas en la materia, por ejemplo, como se emplean para las hibridaciones de especies cruzadas. A manera de ejemplo, y no a manera de limitación, los procedimientos empleando condiciones de exactitud moderada incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, los procedimientos empleando condiciones de exactitud moderada como siguen: los filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 55°C en una solución que contiene SSC 6X, solución de Denhardt 5X, SDS al 0.5%, y 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución, y se utiliza la sonda marcada con 32P 5-20X 106. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55 °C, y luego se lavan dos veces durante 30 minutos a 60 °C en una solución que contiene SSC IX y SDS al 0.1%. Los filtros se secan y se exponen para auto-radiografía. Otras condiciones de exactitud moderada que se pueden emplear son bien conocidas en la materia. El lavado de los filtros se hace a 37°C durante 1 hora en una solución que contiene SSC 2X, SDS al 0.1%. A manera de ejemplo, y no a manera de limitación, los procedimientos empleando condiciones de alta exactitud son como sigue: se lleva a cabo la prehibridación de los filtros que contienen ADN durante 8 hasta durante la noche a 65 °C, en un regulador compuesto de SSC 6X, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), EDTA 1 m , PVP al 0.02%, Ficoll al 0.02%, BSA al 0.02%, y 500 ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65°C en la mezcla de prehibridación que contiene 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y la sonda marcada con 32P 5-20X 106 cpm. El lavado de los filtros se hace a 37°C durante 1 hora en una solución que contiene SSC 2X, PVP al 0.01%, Ficoll al 0.01%, y BSA al 0.01%. Esto es seguido por un lavado en SSC 0. IX a 50°C durante 45 minutos antes de la auto-radiografía. Otras condiciones de alta exactitud que se pueden emplear son bien conocidas en este campo. El término "sustancialmente idéntica" o "sustancialmen-te homologa", o similar, varía con el contexto, como es entendido por los técnicos en la materia pertinente, y significa en general una identidad de cuando menos el 60% o 70%, de preferencia significa cuando menos 80%, 85%, o más preferiblemente de cuando menos 90%, y de la manera mas preferible de cuando menos 95%. Como se utiliza en la presente, "sustancialmente idéntico" a un producto, significa que es suficientemente similar para que la propiedad de interés quede suficientemente sin cambios, de tal modo que se pueda utilizar el producto sustancialmente idéntico en lugar del producto. Como se utiliza en la presente, "sustancialmente puro" significa que es suficientemente homogéneo para aparecer libre de impurezas fácilmente detectables, como sea determinado por métodos convencionales de análisis, tales como cromatografía de capa delgada (TLC), electroforesis en gel, y cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) , utilizados por los técnicos en la materia para evaluar dicha pureza, o suficientemente puro para que la purificación adicional no altere de una forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como las actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los métodos para la purificación de los compuestos con el fin de producir compuestos sustancialmente puros químicamente, son conocidos por los técnicos en la materia. Un compuesto sustancialmente puro químicamente, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros o de isómeros. En esos casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
Como se utiliza en la presente, una célula objetiva se refiere a una célula que expresa una sHASEGP (en el contexto de producción de sHASEGP como se describe en la presente) , o a una célula que se apunta por una sHASEGP o un agente co- formulado o co-administrado in vivo (en el contexto de usar sHASEGPs para promover la entrega de farmacológicos y otros agentes para apuntar a células como se describe en la presente) . Como se utiliza en la presente, sustancia de prueba (o un compuesto de prueba) se refiere a un compuesto químicamente definido (por ejemplo, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas/inorgánicas , proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos , lípidos, polisacáridos , sacáridos, o híbridos entre estas moléculas, tales como glicoproteínas , etc.), o mezclas de compuestos (v.gr., una biblioteca de compuestos de prueba, extractos naturales, o sobrenadantes de cultivo, etc.) cuyo efecto sobre una sHASEGP, en particular una forma de una sola cadena que incluya al dominio de hialuronidasa, o una porción suficiente del mismo, para la actividad, como sea determinado por un método in vitro, tal como los ensayos proporcionados en la presente. Como se utilizan en la presente, los términos "un agente terapéutico", "régimen terapéutico", "radioprotector" , o "quimioterapéutico" , significan los fármacos y terapias con fármacos convencionales, incluyendo vacunas, que son conocidos por los técnicos en este campo. Los agentes radioterapéuticos son bien conocidos en la materia. Como se utiliza en la presente, el tratamiento significa cualquier manera en la cual se disminuyan o se alteren de otra forma benéficamente los síntomas de una condición, trastorno o enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de las composiciones de la presente. Como se utiliza en la presente, vector (o plásmido) se refiere a elementos separados que se utilizan para introducir ácido nucleico heterólogo en las células, ya sea para su expresión o para su réplica. Los vectores normalmente siguen siendo episomales, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen o una porción del mismo en un cromosoma del genoma . También se contemplan los vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y uso de estos vehículos es bien conocida por los técnicos en la materia. Un vector de expresión incluye los vectores que son capaces de expresar ADN que se enlace operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que sean capaces de efectuar la expresión de estos fragmentos de ADN. Por consiguiente, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante , tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante , u otro vector que, después de su introducción en una célula huésped apropiada, dé como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los técnicos en este campo, e incluyen aquéllos que se pueden replicar en células eucarióticas y/o en células procarióticas , y aquéllos que sigan siendo episomales, o aquéllos que se integren en el genoma de la célula huésped. Como se utiliza en la presente, una secuencia de enlace de proteína se refiere a una secuencia de proteína o péptido que es capaz de enlazarse de una manera específica a otras secuencias de proteínas o de péptidos en general, a un conjunto de secuencias de proteínas o péptidos, o a una secuencia de proteína o péptido particular. Como se utiliza en la presente, una marca de epítope se refiere a un estiramiento corto de residuos de aminoácidos correspondientes aun epítope, para facilitar el análisis bioquímico e inmunológico subsecuente de la proteína o del péptido marcado con el epítope. La marca con epítopes se logra incluyendo la secuencia de la marca del epítope en la secuencia que codifica la proteína en un vector de expresión apropiado. Las proteínas marcadas con epítope se pueden purificar por afinidad utilizando anticuerpos altamente específicos reproducidos contra las marcas. Como se utiliza en la presente, la secuencia de enlace de metal se refiere a una secuencia de proteína o péptido que es capaz de enlazarse específicamente a iones de metales en general, a un conjunto de iones de metales, o a un ion de metal particu- lar. Como se utiliza en la presente, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más artículos. Como se utiliza en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, una pasta, acuosa, no acuosa, o cualquier combinación de los mismos. Como se utiliza en la presente, un fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Por lo tanto, los fluidos abarcan las composiciones que están en la forma de semi -sólidos , pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas, y otras de estas composiciones. Como se utiliza en la presente, un extracto celular se refiere a una preparación o fracción que se hace a partir de una célula lisada o alterada. Como se utiliza en la presente, se dice que un agente se selecciona de una manera aleatoria, cuando el agente se escoge aleatoriamente sin considerar las secuencias específicas involucradas en la asociación de una proteína sola o con sus sustratos asociados, componentes de enlace, etc. Un ejemplo de agentes aleatoriamente seleccionados es el uso de una biblioteca química o de una biblioteca de combinación de péptidos, o un caldo de cultivo de un organismo o medio acondicionado. Como se utiliza en la presente, se dice que un agente se selecciona o se diseña racionalmente, cuando el agente se escoge sobre una base no aleatoria que toma en cuenta la secuencia del sitio objetivo y/o su conformación en relación con la acción del agente. Como se describe en los ejemplos, existen sitios de enlace propuestos para la hialuronidasa , y sitios (catalíticos) en la glicoproteína que tienen la SEQ ID NO : 1 o la SEQ ID NO : 4. Los agentes se pueden seleccionar racionalmente o se pueden diseñar racionalmente mediante la utilización de las secuencias de péptidos que formen estos sitios. Por ejemplo, un agente peptídico racionalmente seleccionado puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica a los sitios o dominios de enlace de ATP o de calmodulina. Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, ya sea que el sacárido en el extremo reductor sea o no de hecho un azúcar reductor. De conformidad con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se ilustran en la presente con el extremo no reductor sobre la izquierda, y el extremo reductor sobre la derecha. Todos los oligosacáridos descritos en la presente se describen con el nombre o la abreviatura para el sacárido no reductor (por ejemplo, Gal) , seguido por la configuración del enlace glicosídi-co (alfa o beta) , el enlace de anillo, la posición en el anillo del sacárido reductor involucrado en el enlace, y luego el nombre o la abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, GlnNAc) . El enlace entre dos azúcares se puede expresar, por ejemplo, como 2,3, 2. fw darw.3, o (2,3) . Cada sacárido es una piranosa.
Como se utiliza en la presente, una fracción de azúcar N-enlazada se refiere a un oligosacárido unido a una sHASEGP por medio del nitrógeno de amida de los residuos de Asn. Los oligosacáridos N-enlazados caen en varios tipos principales (oligomanosa, complejo, híbrido, sulfatado) , todos los cuales tienen núcleos de (Man) 3 -GlcNAc-GlcNAc- unidos por medio del nitrógeno de amida de los residuos de Asn que caen dentro de las secuencias-Asn-Xaa-Thr/Ser- (en donde Xaa no es Pro) . Los sitios N-enlazados con frecuencia se asignan indirectamente por la aparición de un ciclo "en blanco" durante la secuenciación . Se puede hacer una identificación positiva después de la liberación del oligosacárido por la PNGasa F, que convierte el Asn glicosi-lado a Asp . Después de la liberación de PNGasa F, los oligosacáridos N-enlazados se pueden purificar utilizando cromatografía de bio-gel P-6, sometiéndose a la reserva de oligosacárido a cromatografía de intercambio de aniones de alto pH de preparación (HPAEC) (Townsend y colaboradores, (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8) . Ciertos isómeros de oligosacáridos se pueden resolver utilizando la HPAEC. Los residuos de fucosa cambiarán las posiciones de elución más pronto en el cromatograma de HPAEC, mientras que los residuos de ácido siálico adicionales aumentarán el tiempo de retención. El tratamiento concurrente de las glicoproteínas cuyas estructuras de oligosacáridos sean conocidas (por ejemplo, fetuína bovina, glicoproteína de ácido a-1, ovalbúmina, ARNsa B, transferrina) , pueden facilitar la asigna- - HO-ción de los picos de los oligosacáridos . Los oligosacáridos recolectados se pueden caracterizar por una combinación de análisis de composición y de enlace de metilación (Waegheet y colaboradores, (1983) Carbohydr. Res. 123, 281-304), con las configuraciones anoméricas asignadas mediante espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) en Methods Enzymol 230) . De una manera alternativa, los oligosacáridos se pueden identificar mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluorescencia (FACE) , Callewaert y colaboradores (2001) Glycobio-logy 11, 275-281. Como se utiliza en la presente, el término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de 9 átomos de carbono. El miembro más común de la familia de ácido siálico es el ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2 -ceto- 5 -acetamido- 3 , 5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-l-ónico (con frecuencia abreviado como Neu5Ac, NeuAc, o NANA) . Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil -neuramínico (Neu5Gc o NeuGc) , en donde el grupo N-acetilo de NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia de ácido siálico es el ácido 2 -ceto- 3 -desoxi -nonulosónico (KDN) (Nadano y colaboradores (1986) J. Bíol . Chem. 261:11550-11557; Kanamori y colaboradores (1990) J. Bíol. Chem. 265:21811-21819). También se incluyen los ácidos siálicos 9 - sustituidos , tales como 9-O-C . sub .1-C-sub .6 acil-Neu5Ac tipo 9-0-lactil-Neu5Ac o 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi- Neu5Ac . Para una revisión de la familia de ácido siálico, ver, por ejemplo, Varki (1992) Glycobiology 2:25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, N.Y. (1992)) . La síntesis y el uso de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialación se dan a conocer en la Solicitud Internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992. Como se utiliza en la presente, PNGasa se refiere a una N-glicosidasa F específica del péptido de asparagina, tal como la N-glicosidasa F del péptido de Flavobacterium maningoseptum. Las enzimas de PNGasa se caracterizan por su especificidad hacia los oligosacáridos N-enlazados en lugar de los O-enlazados. La caracterización de la eficacia de la PNGasa se puede definir tanto mediante electroforesis de SDS-PAGE, como mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluorescencia. Como se utiliza en la presente, la sialación sustan-cialmente terminada se refiere a los oligosacáridos N-enlazados que terminan con un residuo de ácido siálico como un azúcar terminal. Los ácidos siálicos terminales se pueden identificar mediante análisis FACE de los carbohidratos liberados en seguida del tratamiento con neuraminidasa . El tiempo de vida en la circulación de las glicoproteí-nas en la sangre depende mucho de la composición y estructura de sus grupos carbohidrato N-enlazados. Este hecho es de una relevancia directa para las glicoproteínas terapéuticas que se pretenden para administrarse parenteralmente . En general, la vida media circulatoria máxima de una glicoproteína requiere que sus grupos carbohidrato N-enlazados terminen en la secuencia NeuAc-Gal-GlcNAc. Sin el ácido siálico terminal (NeuAc) , la glicoproteína se libera rápidamente de la sangre mediante un mecanismo que involucra el reconocimiento de la N-acetil -galactosamina (GalNAc) subyacente, o de los residuos de galactosa (Gal) (Goochee y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1347-1355) . Por esta razón, el asegurar la presencia del ácido siálico terminal sobre los grupos carbohidrato N-enlazados de las glicoproteínas terapéuticas, es una consideración importante para su desarrollo comercial . Las glicoproteínas circulantes se exponen a las sialidasas (o neuraminidasas) que pueden remover los residuos de ácido siálico. Típicamente, la remoción del ácido siálico expone a los residuos de galactosa, y estos residuos son reconocidos y enlazados por los receptores específicos de galactosa de los hepatocitos (revisado en Ashwell y Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:531) . El hígado también contiene otros receptores específicos de azúcar que median la remoción de las glicoproteínas de la circulación. Las especificidades de estos receptores también incluyen N-acetil -glucosamina , mañosa, fucosa, y fosfomanosa. Las glicoproteínas liberadas por los receptores de galactosa de los hepatocitos sufren una degradación sustancial, y luego entran en la bilis; las glicoproteínas liberadas por el receptor de mañosa de las células de Kupffer entran al sistema reticuloendotelial (revisado en Ashwell y Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:53) . Como se utiliza en la presente, activa en neutro se refiere a una glicoproteína de sHASEGP con actividad catalítica hacia un sustrato de glicosaminoglicano in vitro, a un pH entre 5 y 8, bajo condiciones de sal menores a 150 mM, y una concentración reguladora menor a 50 mM. Como se utiliza en la presente, una solución estabilizada se refiere a una sHASEGP que retiene más del 60% de su actividad inicial después de almacenarse a temperatura ambiente durante 30 días. Como se utiliza en la presente, a menos que se especifique de otra manera, una unidad se expresa en unidades reductoras de turbidez (TRU) . Una TRU se define como la cantidad de actividad de hialuronidasa requerida para reducir la turbidez de una solución acidificada de ácido hialuronico y su equivalente a las unidades U . S . P . /Formulario Nacional (NF XIII) (NFU) . El ensayo enzimático tipo ELISA descrito en la presente se puede relacionar con las TRU, las NFU, y la unidad U.S.P. a través de una curva estándar de una muestra de hialuronidasa (v.gr. , estándar USP o WHO) estandarizada a través de U.S.P. Por consiguiente, las actividades enzimáticas determinadas mediante el ensayo enzimático tipo ELISA son realmente TRU relativas, debido a que la actividad enzimática no es realmente medida - inutilizando el ensayo turbidométrico (Dorfman y colaboradores, 1948, J. Biol. Chem. 172:367). Como se utiliza en la presente, la potencia se define por la cantidad de proteína sHASEGP requerida para degradar el sustrato in vi tro, basándose en una Unidad Reductora de Turbidez o Unidad Reductora de Turbidez Relativa. Como se utiliza en la presente, la actividad específica se refiere a unidades de actividad por mg de proteína. La cantidad de proteína sHASEGP se define por la absorción de una solución de sHASEGP a 280 nm, asumiendo un coeficiente de extinción molar de aproximadamente 1.7, en unidades de M"1 cm"1. El polietileno glicol (PEG) se ha utilizado ampliamente en biomateriales , biotecnología, y medicina, primordialmente debido a que el polietileno glicol es un polímero biocompatible, no tóxico, no inmunogénico , y soluble en agua (Zhao y Harris, ACS Symposium Series 680:458-72, 1997). En el área del entrega de fármacos, los derivados de polietileno glicol se han utilizado ampliamente en la unión covalente (es decir, "PEGilación" ) a proteínas, para reducir la inmunogenicidad, la proteólisis, y la liberación por el riñon, y para mejorar la solubilidad (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995) . De una manera similar, el polietileno glicol se ha unido a fármacos relativamente hidrofó-bicos de bajo peso molecular para mejorar la solubilidad, reducir la toxicidad, y alterar la bio-distribución . Típicamente, los fármacos PEGilados se inyectan como soluciones.
Una aplicación estrechamente relacionada es la síntesis de redes de polietileno glicol degradables reticuladas, o formulaciones para utilizarse en el suministro de fármacos, debido a que mucha de la misma química utilizada en el diseño de vehículos de fármacos solubles degradables, también se puede utilizar en el diseño de geles degradables (Sawhney y colaboradores, Macromolecules 26:581-87, 1993). También se sabe que se pueden formar complejos intermacromoleculares mezclando soluciones de dos polímeros complementarios. Estos complejos se estabilizan en general mediante interacciones electrostáticas (polianión-policatión) y/o enlaces de hidrógeno (poliácido-polibase) entre los polímeros involucrados, y/o mediante interacciones hidrofóbicas entre los polímeros en un medio circundante acuoso (Krupers y colaboradores, Eur. Polym. J. 32:785-790, 1996) . Por ejemplo, la mezcla de solución de poli-ácido acrílico (PAAc) y poli-óxido de etileno (PEO) bajo las condiciones apropiadas, da como resultado la formación de complejos basados en su mayor parte en el enlace de hidrógeno. La disociación de estos complejos en condiciones fisiológicas se ha utilizado para suministrar fármacos libres (es decir, no PEGilados) . Además, se han formado complejos de polímeros complementarios, tanto a partir de homopolímeros como de copolímeros . En un aspecto, el polietileno glicol tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 3 kD a aproximada- - llámente 50 kD, y de preferencia de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 30 kD . La unión covalente del PEG al fármaco (conocida como "PEGilacion") se puede llevar a cabo mediante técnicas de síntesis química conocidas. Por ejemplo, en un aspecto de la presente invención, la PEGilacion de la proteína se puede llevar a cabo mediante la reacción del polietileno glicol activado por NHS con la proteína bajo condiciones de reacción adecuadas. Aunque se han descrito numerosas reacciones para la PEGilacion, las que son más generalmente aplicables confieren direccionalidad, utilizan condiciones de reacción suaves, y no necesitan de un extenso procesamiento corriente abajo para remover los catalizadores o subproductos tóxicos. Por ejemplo, el monometoxi PEG (mPEG) tiene solamente un hidroxilo terminal reactivo, y por consiguiente, su uso limita algo de la heterogeneidad de la mezcla del producto de polietileno glicol -proteína resultante. La activación del grupo hidroxilo en el extremo del polímero opuesto al grupo metoxilo terminal generalmente es necesaria para llevar a cabo una PEGilacion de proteína eficiente, con el objetivo de hacer que el PEG derivado sea más susceptible al ataque nucleófilo. El nucleófilo atacante normalmente es el grupo épsilon-amino de un residuo de lisilo, pero también pueden reaccionar otras aminas (v.gr., la alfa-amina N-terminal, o las aminas de anillo de la histidina) si son favorables las condiciones locales. Es posible una unión más dirigida en las proteínas que contienen una sola lisina o cisteína. Este último residuo se puede dirigir mediante PEG-maleimida para la modificación específica del tiol. De una manera alternativa, la hidrazida del PEG se puede hacer reaccionar con la sHASEGP oxidada con peryodato, y se puede reducir en la presencia de NaCNBH3. De una manera más específica, los azúcares de CMP PEGilados se pueden hacer reaccionar con sHASEGP en la presencia de glicosil -transferasas apropiadas. Una técnica es la técnica de "PEGilación" , en donde un número de moléculas poliméricas se acoplan al polipéptido en cuestión. Cuando se utiliza esta técnica, el sistema inmune tiene dificultades para reconocer los epítopes sobre la superficie del polipéptido responsable de la formación de anticuerpos, reduciendo de esta manera la respuesta inmune. Para los polipéptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del cuerpo humano para dar un efecto fisiológico particular (es decir, productos farmacéuticos) , la respuesta inmune potencial típica es una respuesta de IgG/IgM, mientras que los polipéptidos que se inhalan a través del sistema respiratorio (es decir, polipéptido industrial) , pueden causar potencialmente una respuesta de IgE (es decir, una respuesta alérgica) . Una de las teorías que explican la respuesta inmune reducida, es que los epítopes protectores de moléculas poliméricas sobre la superficie del polipéptido responsables de la respuesta inmune, conducen a la formación del anticuerpo. Otra teoría, o cuando menos un factor parcial, es que mientras más pesado sea el conjugado, más se obtiene una respuesta inmune más reducida. En el caso de sHASEGPs humanas siendo usadas en el cuerpo humano, una combinación preferida como se describe en la presente, la tendencia para la sHASEGP para extraer una respuesta inmune puede significativamente reducirse según se compara con, por ejemplo, enzimas derivadas de animales no humanas tales como hialuronidasas bovinas u ovinas (es decir, aun si estas enzimas derivadas de animales pudieras estar completamente purificadas fuera de otras proteínas derivadas de animales, lo cual es difícil a imposible de lograr en la práctica) . Aunque sHASEGPs humanas por consecuencia representan una mejora sustancial y muy importante sobre productos derivados de animales, puede para muchos usos ser mejoradas aun adicionalmente por modificaciones post-traducción (PTMs) tales como PEGilación para mejorar su resistencia a degradación o eliminación y/o para mejorar otras propiedades haciéndolas aun mas benéficas para aplicaciones particulares . Por ejemplo, aunque composiciones preferidas para humanos (tales como las sHASEGPs humanas) exhiben imnunogenicidad reducida comparadas con hialuronidasas derivadas de animales o sHASEGPs no humanas, PEGilación de tales sHASEGPs humanas puede usarse, por ejemplo, para extender su vida media en el torrente sanguíneo y/o en otros tejidos dentro del cuerpo. Sin restringirse a un mecanismo de acción particular, se considera generalmente que la unión de las fracciones PEG a sHASEGPs puede usarse para blindar efectivamente la molécula, disminuyendo su sensibilidad relativa a proteasas y potencialmente también disminuyendo el grado y la tasa de su limpieza y eliminación del cuerpo. Las moléculas poliméricas acopladas al polipéptido pueden ser cualquier molécula polimérica adecuada con un peso molecular como se define de acuerdo con la invención, incluyendo homopolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir, poli-OH) , poliaminas (es decir, poli-NH2) , y poli-ácidos carboxílicos (es decir, poli-COOH) , y además heteropolímeros , es decir, polímeros que comprenden uno o más grupos de acoplamiento diferentes, por ejemplo un grupo hidroxilo y grupos amina. Ejemplos de las moléculas poliméricas adecuadas incluyen las moléculas poliméricas seleccionadas a partir del grupo que comprende poli -óxidos de alquileno (PAO) , tales como polialquileno glicoles (PAG) , incluyendo polipropileno glicoles (PEG) , metoxipolietileno glicoles (mPEG) , y polipropileno glicoles, PEG-glicidil éteres (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazo-la (CDI-PEG), polietileno glicoles ramificados (PEGs) , poli-alcohol vinílico (PVA) , policarboxilatos , polivinil-pirrolidona, poli-D, L-aminoácidos, polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido málico, dextranos, incluyendo carboxi -metil -dextranos , heparina, albúmina homologa, celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa , etilcelulosa , hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa , e hidroxipropilcelulo-sa; hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietil- almidones, e hidroxipropil -almidones , glicógenos, agarosas y sus derivados, goma guar, pululano, inulina, goma de xantano, carragenina, pectina, hidrolizados de ácido algínico, y biopolí-meros . Las moléculas poliméricas preferidas son las moléculas poliméricas no tóxicas, tales como (m) polietileno glicol (mPEG) , que además requiere de una química relativamente simple para su acoplamiento covalente con los grupos de unión sobre la superficie de la enzima. Los poli-óxidos de alquileno (PAO) que se ven en general, tales como los poli-óxidos de etileno, tales como PEG y en especial mPEG, son las moléculas poliméricas preferidas, debido a que estas moléculas poliméricas, en comparación con los polisacáridos tales como dextrano, pululano, y similares, tienen pocos grupos reactivos capaces de reticularse, lo cual es indeseable . Mejoras en PEGilación y otros tipos de modificaciones post-traducción (PTMs) han sido extensas y ahora hay un gran número de técnicas de PTM y reactivos conocidos en la materia, y nuevas son regularmente desarrolladas. Técnicas y reactivos para PEGilación incluyen, por ejemplo: (i) enlazadores especializados y químicas de acoplamiento (ver, v.gr. , los reactivos y tecnologías revisados por Harris, J. M., Adv. Drug. Deliv. Rev. 54:459-476 (2002) y las referencias primarias revisadas en la misma); (ii) PEGs ramificados los cuales permiten efectivamente que grupos PEG adicionales se unan en un solo sitio de conjugación (ver, v.gr., Veronese, F. M., y colaboradores, Bíoorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180 (2002)); (iii) PEGilación específica de sitio, incluyendo monoPEGilación específica de sitio (ver, v.gr., Chapman, A. P., y colaboradores, Nature Bíotech. 17:780-783 (1999)); y (iv) PEGilación enzimática dirigida en sitio (v.gr., usando una reacción de transglutaminasa como se describe por Sato, H., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:487-504 (2002)). Hay también tecnologías adicionales y reactivos disponibles a partir de un número en incremento de proveedores comerciales (ver, v.gr., Nektar/Shearwater (www.nektar.com), Sunbio (www.sunbio.com y www.sunbio.com/peg-shop), Celares GmbH (www.celares.com), y otros) . B. PERFILES DE EXPRESIÓN EN EL TEJIDO DE sHASEGP Aunque previamente se pensaba que era específica de los testículos, la sHASEGP humana se expresa en múltiples tejidos en seres humanos cuando se utilizan técnicas más sensibles, tales como reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) . La transcripción de sHASEGP se encuentra en la médula (cerebro) , en el endotelio microvascular, en la próstata, mama, retina, melanocitos humanos reservados, corazón fetal, y útero preñado. La sHASEGP también se expresa en los tumores de células germinales. Generalmente se requiere la detección basada en RT-PCR de las transcripciones de sHASEGP para detectar los niveles en tejidos diferentes de los testículos.
C. ENSAYOS PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE sHASEGP ENSAYO DE MICROTITULACIÓN TURBIDOMÉTRICO PARA ACTIVIDAD DE HIALURONIDASA La actividad de hialuronidasa se puede detectar por medio de un ensayo turbidométrico modificado en una solución de suero acidificada. Los reactivos requeridos son como sigue: Se preparan los siguientes reactivos: Solución Reguladora de Acetato - 14.0 g de acetato de potasio y 25.0 mL de ácido acético glacial en agua, para hacer 1,000 mL . Solución Reguladora de Fosfato - 2.5 g de fosfato de sodio monobásico, 1.0 g de fosfato de sodio anhidro dibásico, y 8.2 g de cloruro de sodio en agua, para hacer 1,000 mL . Solución de Suministro de Diluyente de Enzimas - 500 mL de Solución Reguladora de Fosfato con 500 mL de agua. Solución de Procesamiento de Diluyente de Enzimas - 33 mg de gelatina hidrolizada en 50 mL de Solución de Suministro de Diluyente de Enzimas - preparada dentro de 2 horas de su uso. Solución Reguladora de Estabilización de Muestras ("SSB" Soln.) - 125 microlitros (yL) de una Solución de Albúmina de Suero Humana al 20%, y 50 yL de una Solución de Cloruro de Calcio 1M en 50 mL de Solución de Procesamiento de Diluyente de Enzimas, y se mezclan completamente. Solución de Suministro de Suero - Diluir 1 volumen de suero de caballo con 9 volúmenes de Solución Reguladora de Acetato. Se ajusta con ácido clorhídrico 4N hasta un pH 3.1, y se permite a la solución reposar a temperatura ambiente durante 18 a 24 horas. Se almacena la solución a 4°C, y se utiliza dentro de 30 días. Solución de Procesamiento de Suero - 10 mL de Solución de Suministro de Suero en 30 mL de Solución Reguladora de Acetato, ajustada a la temperatura ambiente. Solución de Suministro de Ácido Hialurónico - Ácido Hialurónico Sódico hasta una concentración de 5.0 mg/mL en agua. Solución de Procesamiento de Ácido Hialurónico - 0.75 mL de la solución de suministro de ácido hialurónico en 4.25 mL de solución reguladora de fosfato. Solución de Suministro Estándar -Un recipiente de hialuronidasa estándar de referencia USP hasta una concentración de 1,000 Unidades/mL en agua, se saca en alícuotas en porciones de 50 yL, y se almacenan a -20°C. Solución de Procesamiento Estándar - 40 yL de solución de suministro estándar en 960 de Solución de Procesamiento de Diluyente de Enzimas Fría, para obtener una solución que tiene una concentración conocida de 40 Unidades/mL, preparada inmediatamente antes de usarse en el ensayo. Todas las muestras de enzimas se diluyen en una placa de 96 pozos de "bajo enlace de proteína" de acuerdo con los siguientes lineamientos : a) El intervalo de la máxima sensibilidad de este ensayo es de entre 10-30 Unidades/mL. Para minimizar el número de veces que se deba repetir el ensayo con el objeto de obtener resultados que estén dentro del intervalo, primero determine el número aproximado de unidades totales/mL para la muestra, y luego elija una dilución (número entero) tal que la concentración final sea de aproximadamente 20 Unidades/mL. b) Los volúmenes de muestra mínimos necesarios para llevar a cabo el ensayo son como sigue: fracciones de FPLC = 50 µL, sobrenadantes de cultivo de tejido = 1 mL, Material Purifica-do/Concentrado/del Paso Final = 10 \ih. c) Para las muestras con diluciones en serie, se hacen diluciones de 1:10 en la placa de 96 pozos de "bajo enlace de proteína" por triplicado, pasando por pipeta 360 yL de la solución "SSB" y 40 pL de muestra hacia cada pozo.
Para la preparación del estándar USP, prepare la curva estándar USP en la placa de 96 pozos de "bajo enlace de proteína" como sigue: Pozos: Estándar: Solución de Curva Estándar USP diluyente de enzimas (en Solución de Conc . Final (en V11^ : procesamiento Unidades/mL) : estándar (en µ??) : A1-A3 StOl 0 100 40 B1-B3 St02 20 80 32 C1-C3 St03 40 60 24 D1-D3 St04 60 40 16 E1-E3 St05 80 20 8 F1-F3 St06 90 10 4 G1-G3 St07 100 0 0 Para la preparación del control de ácido hialuronico en las columnas 1-3, preparar el control de H.A. en la placa de 96 pozos de "Fondo Plano", como sigue: Pozos Control: Controles de H.A. Solución de procesamiento Solución de procesamiento d yente de enzimas CoOl 0 60 La Placa de Reacción: Se pasan por pipeta 30 yL por pozo de solución de procesamiento de ácido hialuronico utilizando una pipeta de transferencia de 8 canales, de 50 µ?,, hacia una placa de microtitulación de 96 pozos de "Fondo Plano", dejando vacíos los pozos H1-H3. Se pasan por pipeta 60 pL/pozo de la solución de procesamiento de diluyente de enzimas hacia los pozos H1-H3 de la placa de muestra como el control de HA. Solución de Procesamiento de Suero: Se dosifican 40 mL de Solución de Procesamiento de Suero en un recipiente de transferencia, y en seguida hacia el bloque de calor. Etapa previa al calentamiento: Una vez que se han preparado ambas placas, la placa de 96 pozos de bajo enlace de proteína que contiene las muestras diluidas, los estándares, los controles, y la placa de 96 pozos de fondo plano que contiene la Solución de Procesamiento de Ácido Hialurónico, se colocan sobre el bloque de calor, y se les permite calentarse durante 5 minutos a 37°C. La reacción se inicia mediante la adición de la Enzima al Sustrato: se pasan 30 L desde la placa de enzima hacia todos los pozos de la columna #1 de la placa de fondo plano de 96 pozos (que contiene al sustrato) utilizando una pipeta de 8 canales, de 5-50 µ??. La Mezcla de Reacción de Enzima/Sustrato se aspira 5 veces (dirigiendo la solución hacia arriba y hacia abajo con la transferencia durante los primeros 15 segundos para asegurar una mezcla completa de la muestra) . Después de mezclar la enzima y el sustrato, se expulsan las puntas, y se carga un nuevo juego de puntas sobre la pipeta de transferencia para la siguiente columna. Se reinicia un cronómetro, y en el tiempo (t)=0:30, se repite este proceso para la columna 2. En el siguiente intervalo de 30 segundos (t)=l:00, se repite este proceso para la columna 3. Este proceso se repite moviéndose de izquierda a derecha a través de la placa, cada 30 segundos, hasta que todos los pozos contengan tanto enzima como sustrato. Terminación de la reacción: Cuando el cronómetro llega a 6 minutos (t)=6:00, se pasan por pipeta 240 ?^ de la solución de procesamiento de suero hacia cada pozo, utilizando una pipeta de transferencia de 8 canales, de 50 a 300 µ???, hacia la columna 1 de la placa de fondo plano de 96 pozos, desde el depósito de reactivo de 50 mL adyacente. La mezcla se aspira 3 veces (dirigiendo la solución hacia arriba y hacia abajo con la pipeta de transferencia) durante los primeros 10 segundos, para asegurar una mezcla completa. El proceso se repite cada 30 segundos, procediendo desde la columna 1 hasta la 12. Al terminar en la última columna (columna 12) , se remueve la placa de reacción del bloque de calor y se coloca la placa sobre la charola de lectura del lector de placas a 640 nM. Se genera un ajuste de curva lineal a partir de la curva estándar, que permite hacer la extrapolación de las muestras de prueba. ENSAYOS ALTERNATIVOS PARA HIALURONIDASA ENSAYO DE MICROTITULACIÓN DE HIALURONANO BIOTINILADO Los grupos carboxilo libres sobre los residuos de ácido glucurónico del hialuronano, se biotinilan en una reacción de un paso, utilizando biotina-hidrazida (Pierce) , sulfo NHS (Pierce) , y 1-etil dimetilaminopropil-carbodiimida (Sigma) . Este sustrato de HA biotinilado se acopla de una manera covalente a la placa de microtitulación de 96 pozos en una segunda reacción. Al terminar la reacción enzimática, se detecta el sustrato residual con una reacción de avidina-peroxidasa que se puede leer en un lector de placas ELISA estándar. Debido a que el sustrato se enlaza de una manera covalente a la placa de microtitulación, no se presentan artificios, tales como el desplazamiento dependiente del pH del sustrato biotinilado. La sensibilidad permite hacer una rápida medición de la actividad de la hialuronidasa a partir de las células cultivadas y de las muestras biológicas con una variación inter-ensayo de menos del 10%. La actividad específica de la hialuronidasa se expresa en unidades reductoras de turbidez (TRU) . Una unidad reductora de turbidez se define como la cantidad de actividad de hialuronidasa requerida para reducir la turbidez de una solución acidificada de ácido hialurónico, y es equivalente a las unidades de USP/Formulario Nacional (NF XIII) (NFU) . El ensayo enzimático tipo ELISA utilizado para la purificación está relacionado con las unidades TRU, NFU, y U.S.P. a través de una curva estándar de una muestra de hialuronidasa (por ejemplo, USP) estandarizada a través de USP. Por consiguiente, las actividades enzimáticas determinadas mediante el ensayo enzimático tipo ELISA son realmente en relación con TRU, debido a que la actividad enzimática no es realmente medida utilizando el ensayo turbidomé-trico (Dorfman y colaboradores, 1948, J". Biol . Chem. 172:367).
Muchos ensayos de hialuronidasa se han basado en la medición de la generación de nuevos grupos N-acetilamino reductores (Bonner y Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966), o en la pérdida de viscosidad (De Salegui y colaboradores, Arc . Biochem. Biophys . 121:548-554, 1967), o en la turbidez (Dorfman y Ott, J. Biol . Chem. 172:367, 1948) . Con los sustratos purificados, todos estos métodos son suficientes para la determinación de la presencia o de la ausencia de la actividad endoglucosamídica . También se pueden utilizar sustratos de glicosaminogli-cano sustancialmente purificados para el ensayo de cambio de gel . Los glicosaminoglicanos se mezclan con la sHASEGP recombinante , para probar la actividad de endoglucosidasa que dé como resultado un cambio en la movilidad del sustrato adentro del gel. El sulfato de condroitina-4 y -6, el sulfato de dermatano, y el sulfato de heparano se pueden obtener en Sigma Chemical. El hialuronano de cordón umbilical humano se puede obtener en ICN. Cada sustrato de prueba se diluye hasta 0.1 mg/ml en un intervalo del regulador a un pH 3.5-7.5. Se mezclan 10 ul de muestras de sHASEGP purificada o del medio acondicionado a partir de células que expresan sHASEGP con 90 ul de sustrato de prueba en el regulador deseado, y se incuban durante 3 horas a 37°C. En seguida de la incubación, las muestras se neutralizan con el regulador de muestras (Tris EDTA, pH 8.0, azul de bromofenol , y glicerol) , seguido por electroforesis . Los glicosaminoglicanos se detectan tiñendo los geles en azul Alciano al 0.5% en ácido acético glacial al 3% durante la noche, seguido por el desteñido en ácido acético glacial al 7%. La degradación se determina mediante una comparación de la movilidad del sustrato en la presencia o en ausencia de la enzima. También se puede detectar la actividad de la hialuroni-dasa mediante zimografía en gel del sustrato (Guentenhoner y colaboradores, 1992, atrix 388-396). En este ensayo, se aplica una muestra a un gel de SDS-PAGE que contiene ácido hialuronico, y se separan las proteínas de la muestra mediante electroforesis . Luego se incuba el gel en un regulador de ensayo enzimático, y subsecuentemente se tiñe para detectar el ácido hialuronico en el gel. La actividad de hialuronidasa se visualiza como una zona aclarada en el gel del sustrato. D. IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE LOS GENES DEL POLIPÉPTIDO DE sHASEGP El gel del polipéptido de sHASEGP y/o sus dominios, se pueden obtener mediante métodos bien conocidos en la materia para aislamiento del ADN. Se puede "emplear cualquier método conocido por los técnicos en la materia para la identificación de ácidos nucleicos que codifiquen los genes deseados. Se puede emplear cualquier método disponible en este campo para obtener un ADNc de longitud completa (es decir, que abarque toda la región codificante) , o un clon de ADN genómico que codifique un polipéptido de sHASEGP. Por ejemplo, se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el fin de amplificar una secuencia que se exprese en tejidos normales, por ejemplo ácidos nucleicos que codifiquen un polipéptido de sHASEGP (SEQ ID NOs : 1 y 2), en una biblioteca genómica o de ADNc. Se pueden utilizar cebadores de oligonucleótidos que se hibriden a las secuencias en las terminales 3' y 5' de las secuencias identificadas, para amplificar mediante las secuencias de reacción en cadena de la polimerasa a partir de una muestra de ácido nucleico (ARN o ADN, en general una biblioteca de ADNc, a partir de una fuente apropiada (por ejemplo, testículos, próstata, mama)) . La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la utilización de un ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus y con polimerasa Taq (Gene Amp) . El ADN que se esté amplificando puede incluir ARNm o ADNc, o ADN genómico a partir de cualquier especie eucariótica. Se puede elegir sintetizar varios cebadores degenerados diferentes para utilizarse en las reacciones PCR. También es posible variar la exactitud de las condiciones de hibridación empleadas en el cebado, de las reacciones PCR, para amplificar homólogos de ácidos nucleicos (v.gr. , para obtener secuencias de polipéptidos de sHASEGP de especies diferentes de seres humanos, o para obtener secuencias humanas con homología al polipéptido de sHASEGP) , permitiendo mayores o menores grados de similitudes de secuencias de nucleótidos entre la secuencia de nucleótidos conocida y el homólogo de ácido nucleico que se esté aislando. Para la hibridación de especies cruzadas, se utilizan condiciones de baja exactitud a exactitud moderada. Para la hibridación de la misma especie, se utilizan condiciones moderadamente restringentes a altamente restringen-tes. Las condiciones se pueden determinar de una manera empírica. Después de la amplificación con éxito del ácido nucleico que contenga toda o una porción de la secuencia de polipéptido de sHASEGP identificada, o de un ácido nucleico que codifique todo o una porción de un homólogo de polipéptido de sHASEGP, ese segmento se puede clonar y secuenciar molecularmen-te, y se puede utilizar como una sonda para aislar un ADNc completo o un clon genómico. A su vez, esto permite la determinación de la secuencia de nucleótidos completa del gen, el análisis de su expresión, y la producción de su producto de proteína para el análisis funcional. Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos, se puede determinar un marco de lectura abierta que codifique al producto de proteína del gen del polipéptido de sHASEGP mediante cualquier método bien conocido en la materia para la determinación de marcos de lectura abierta, por ejemplo, utilizando programas de computadora públicamente disponibles para el análisis de secuencias de nucleótidos. Una vez que se define un marco de lectura abierta, es rutinario determinar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el marco de lectura abierta. De esta manera, se pueden identificar las secuencias de nucleótidos de los genes del polipéptido de sHASEGP entero, así como las secuencias de aminoácidos de las proteínas y análogos del polipéptido de sHASEGP. Cualquier célula eucariotica puede servir potencialmen-te como la fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen del polipéptido de sHASEGP. Los ácidos nucleicos se pueden aislar a partir de fuentes de vertebrados, mamíferos, seres humanos, porcinas, bovinas, felinas, de aves, de equinos, caninos, así como fuentes de primates adicionales, insectos, plantas, y otros organismos. El ADN se puede obtener mediante procedimientos convencionales conocidos en la materia a partir del ADN clonado (por ejemplo, una "biblioteca" de ADN) , mediante síntesis química, mediante clonación de ADNc, o mediante la clonación del ADN genómico, o fragmentos del mismo, purificado a partir de la célula deseada (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual , 2da. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D. . , editor, 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Volumen 1, 11). Los clones derivados a partir del ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras y de intrones además de las regiones codificantes; los clones derivados a partir del ADNc contendrán solamente secuencias de exones . Para cualquier fuente, el gen se clona en un vector adecuado para su propagación. En la clonación molecular del gen a partir de ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen deseado.
El ADN se puede disociar en sitios específicos utilizando diferentes enzimas de restricción. De una manera alternativa, se puede utilizar ADNsa en la presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN se puede someter a esfuerzo cortante físicamente, por ejemplo, mediante tratamiento sónico. Luego se pueden separar los fragmentos del ADN lineal de acuerdo con los tamaños mediante técnicas convencionales, incluyendo, pero no limitándose a, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida , y cromatografía en columna. Una vez que se generan los fragmentos de ADN, se puede llevar a cabo la identificación del fragmento de ADN específico que contenga al gen deseado, en un número de maneras. Por ejemplo, una porción del gen del polipéptido de sHASEGP (de cualquier especie) (v.gr., un producto de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa obtenido como se describe en lo anterior, o un oligonucleótido que tenga una secuencia de una porción de la secuencia de nucleótidos conocida) o su ARN específico, o un fragmento del mismo, se puede purificar y marcar, y se pueden rastrear los fragmentos de ADN generados mediante hibridación del ácido nucleico a la sonda marcada (Benton y Davis, Science 196:180 (1977); Grunstein y Hogness, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 72:3961 (1975)). Se hibridarán los fragmentos de ADN con una homología sustancial con la sonda. También es posible identificar el fragmento apropiado mediante digestión con enzima de restricción, y mediante la comparación de los tamaños de los fragmentos con los esperados de acuerdo con el mapa de restricción conocido, si está disponible, o mediante análisis de secuencia de ADN y comparación con la secuencia de nucleótidos conocida del polipéptido de sHASEGP. Se puede llevar a cabo una selección adicional con base en las propiedades del gen. De una manera alternativa, se puede detectar la presencia del gen mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas, o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, se pueden seleccionar clones de ADNc, o clones de ADN que se hibriden-seleccionen al ARNm apropiado, que produzcan una proteína, v.gr., que tenga una migración electroforática , comportamiento de enfoque isoeléctrico, mapas de digestión proteolítica, propiedades antigénicas , actividad de hialuronidasa similares o idénticos. Si está disponible un anticuerpo anti-polipéptido de sHASEGP, la proteína se puede identificar mediante el enlace del anticuerpo marcado con los clones de síntesis del polipéptido de sHASEGP supuestos, en un procedimiento tipo ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado con enzima) . Las alternativas al aislamiento del ADN genómico del polipéptido de sHASEGP incluyen, pero no se limitan a, la síntesis química de la secuencia genética a partir de una secuencia conocida, o convertir el ADNc al ARNm que codifique el polipéptido de sHASEGP . Por ejemplo, para la clonación del ADNc del polipéptido de sHASEGP, se puede aislar el gen a partir de células que expresen la proteína. Luego se pueden insertar los ácidos nucleicos identificados y aislados en un vector de clonación apropiado. Se pueden utilizar un gran número de sistemas de vector-huésped conocidos en este campo. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector debe ser compatible con la célula huésped utilizada. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como pBR322 o derivados del plásmido pUC, o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . Por ejemplo, la inserción en un vector de clonación se puede llevar a cabo ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tenga terminales cohesivas complementarias . Si no están presentes los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN en el vector de clonación, se pueden modificar enzimáticamente los extremos de las moléculas de ADN. De una manera alternativa, se puede producir cualquier sitio deseado ligando las secuencias de nucleótidos (enlazadores) sobre los términos del ADN; estos enlazadores ligados pueden incluir oligonucleotidos químicamente sintetizados específicos que codifiquen las secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector disociado y el gen del polipéptido de sHASEGP se pueden modificar mediante formación de cola homopoli- mérica . Se pueden introducir moléculas recombinantes en células hospederas mediante transformación, transfección, infección, electroporación, precipitación de calcio, y otros métodos, siempre que se generen muchas copias de la secuencia genética. En las formas de realización específicas, la transformación de las células hospederas con moléculas de ADN recombinan-te que incorporen al gen del polipéptido de SHASEGP aislado, al ADNc , o a la secuencia de ADN sintetizada, hace posible la generación de múltiples copias del gen. Por consiguiente, el gen se puede obtener en grandes cantidades cultivando los transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes, y cuando sea necesario, recuperando el gen insertado a partir del ADN recombinante aislado. E. VECTORES, PLÁSMIDOS, Y CÉLULAS QUE CONTIENEN ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UN POLIPÉPTIDO SHASEGP O EL DOMINIO DE HIALURONIDA-SA DEL MISMO, Y EXPRESIÓN DE VECTORES Y CÉLULAS DE LOS POLIPÉPTI-DOS DE SHASEGP Para la expresión recombinante de uno o más de los polipéptidos de sHASEGP, se puede insertar el ácido nucleico que contenga toda o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifique al polipéptido de sHASEGP en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación de la proteína insertada. Las señales de transcripción y traducción necesarias también pueden ser suministradas por el promotor nativo para los genes de sHASEGP, y/o sus regiones de flanqueo . También se proporcionan vectores que contienen ácido nucleico que codifica las sHASEGPs, que se pueden introducir en un sistema de expresión capaz de producir una sHASEGP activa neutra soluble. También se proporcionan células que contienen a los vectores. Las células incluyen células eucarióticas y procarióti-cas, y los vectores adecuados para utilizarse en las mismas. Se proporcionan células eucarióticas, incluyendo las células de ovario de hámster chino deficientes en dihidrofolato reductasa (DG44), que contienen a los vectores. Las células adecuadas incluyen células de levadura, células fúngicas, células de plantas, células de insectos, y células de animales. Las células se utilizan para producir un polipéptido de sHASEGP o el dominio de hialuronidasa del mismo, mediante: (a) hacer crecer las células anteriormente descritas bajo condiciones mediante las cuales el polipéptido de sHASEGP codificado o el dominio de hialuronidasa del polipéptido de sHASEGP sea expresado por la célula, y luego (b) recuperar la proteína del dominio de hialuronidasa expresado. En las formas de realización ejemplificadas, el dominio de hialuronidasa se secreta hacia el medio. En una forma de realización, los vectores incluyen una secuencia de nucleotidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de hialuronidasa, y contiene todo o una porción de solamente el dominio de hialuronidasa, o se proporcionan múltiples copias del mismo, de una proteína sHASEGP. También se proporcionan vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica el dominio de hialuronidasa, y porciones adicionales de una proteína sHASEGP hasta e incluyendo una proteína sHASEGP de longitud completa, así como también se proporcionan múltiples copias del mismo. Los vectores se pueden seleccionar para la expresión de la proteína sHASEGP o el dominio de hialuronidasa de la misma en la célula, o de tal manera que se exprese la proteína sHASEGP como una proteína secretada. De una manera alternativa, los vectores pueden incluir las señales necesarias para la secreción de las proteínas codificadas. Cuando se expresa el dominio de hialuronidasa, el ácido nucleico se enlaza el ácido nucleico que codifica una señal de secreción, tal como una secuencia de señal del factor de acoplamiento de Saccharomyces cerevisiae, o una porción de la misma, o la secuencia de señal nativa . Con el objeto de generar una sHASEGP activa neutra soluble, se requieren células capaces de introducir la glicosila-ción N-enlazada. En la forma de realización preferida, las células de ovario de hámster chino de mamífero deficientes en dihidrofolato reductasa, tales como DG44, se electroporan con un plásmido que codifique un promotor de mamífero fuerte, tal como CMV, ácido nucleico que codifique una sHASEGP seguida por un sitio de entrada ribosomal interno, el gen de dihidrofolato reductasa de ratón, y la secuencia de poliadenilación SV40, como se muestra en la SEQ ID NO: 51. Luego se cultivan estas células en un medio químicamente definido en ausencia de hipoxantina y timidina, seguido por una amplificación genética adicional con concentraciones crecientes de metotrexato. Se pueden utilizar una variedad de sistemas de huésped-vector, para expresar la secuencia de codificación de la proteína. Éstos incluyen, pero no se limitan a, sistemas celulares de mamífero infectados con virus (v.gr . , virus de vacuna, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insectos infectados con virus (v.gr., baculovirus) ; microorganismos, tales como vectores de levadura que contienen levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN de plásmido, o ADN de cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus concentraciones y especificidades. Dependiendo del sistema de huésped-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados. Observe que la expresión bacteriana del ADN de sHASEGP no dará como resultado una sHASEGP catalíticamente activa por sí mismo, sino que, cuando se combina con la maquinaria de glicosilación apropiada, se puede glicosilar artificialmente como tal. Se pueden emplear cualesquiera métodos conocidos por los técnicos en la materia para la inserción de fragmentos de ácido nucleico en un vector, con el fin de construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que contenga señales de control de transcripción/traducción apropiadas, y secuencias de codificación de proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante y técnicas in vitro, y recombinantes in vivo (recombinación genética) . La expresión de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de sHASEGP, o los dominios, derivados, fragmentos, u homólogos del mismo, se pueden regular mediante una segunda secuencia de ácido nucleico, de tal manera que se expresen los genes o los fragmentos de los mismos en un huésped transformado con las moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas se puede controlar mediante cualquier promotor/potenciador conocido en la materia. En una forma de realización específica, el promotor no es nativo para los genes para el polipéptido de sHASEGP. Los promotores que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981)) , el promotor contenido en la repetición terminal larga 3 ' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y colaboradores, Cell 22: 787-797 (1980)) , el promotor de quinasa de timidina de herpes (Wagner y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 78 : 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster y colaboradores, Nature 296:39-42 (1982)); los vectores de expresión procariótica , tales como el promotor de ß-lactamasa (Villa-Kamaroff y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 (1987)); o el promotor TAC (Deboer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 80:21-25 (1983)); ver también "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" : en Scientific American 242:79-94 (1980); los vectores de expresión en plantas que contienen al promotor de sintetasa de opalina (Herrar-Estrella y colaboradores, Nature 303:209-213 (1984)); o el promotor de ARN 35S de virus de mosaico de coliflor (Garder y colaboradores, Nucleic Acids RES. 9:2871 (1981) ) , y el promotor de bisfosfato de ribulosa carboxilasa de la enzima fotosintética (Herrera-Estrella y colaboradores, Nature 310:115-120 (1984)); los elementos promotores de levadura y otros hongos, tales como el promotor Gal4 , el promotor de deshidrogenasa de alcohol, el promotor de quinasa de fosfoglicerol , el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control de transcripción de animales que exhiben especificidad del tejido, y que se han utilizado en animales transgénicos : la región de control del gen de elastasa I que es activa en las células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz y colaboradores, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 50:399-409 (1986); Macdonald, Hepatology 7:425-515 (1987)) ; la región de control del gen de insulina que es activa en las células beta pancreáticas (Hanahan y colaboradores, Nature 315:115-122 (1985)), la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl y colaboradores, Cell 38:647-658 (1984); Adams y colaboradores, Nature 318:533-538 (1985); Alexander y colaboradores, Mol. Cell Biol . 7:1436-1444 (1987)), la región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares , de mama, linfoides, y células mástil (Leder y colaboradores, Cell 45:485-495 (1986)), la región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (PINCKERT y colaboradores, Genes and Devel . 1:268-276 (1987)), la región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer y colaboradores, Science 235:53-58, 1987)), la región de control del gen de antitripsina alfa-1 que es activa en el hígado (Kelsey y colaboradores, Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), la región de control del gen de beta-globina que es activa en las células mieloides (Mogram y colaboradores, Nature 315:338-340 (1985) ; Kollias y colaboradores, Cell 46:89-94 (1986)), la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en las células de oligodendrocitos del cerebro (Readhead y colaboradores, Cell 48:703-712 (1987), la región de control del gen de cadena ligera de miosina-2 que es activa en el músculo esquelético (Sani, Nature 314:283-286 (1985)), y la región de control del gen de hormona liberadora gonadotrófica que es activa en los gonadótrofos del hipotálamo (Masón y colaboradores, 234:1372-1378 (1986) ) . En una forma de realización específica, se utiliza un vector que contiene un promotor operativamente enlazado a los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de sHASEGP, o un dominio, fragmento, derivado, u homólogo del mismo, uno o más orígenes de réplica, y opcionalmente uno o más marcadores selecciónateles (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) . También se pueden requerir señales de inicio específicas para la traducción eficiente de una secuencia de sHASEGP . Estas señales incluyen el codón de inicio de ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en donde se inserta la sHASEGP, su codón de inicio, y las secuencias corriente arriba en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en donde solamente se inserta la codificación, o una porción de la misma, se deben proporcionar señales de control de transcripción exógenas, incluyendo el codón de inicio de ATG. Además, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la transcripción de todo el inserto. Los elementos de transcripción exógenos y los codones de inicio pueden ser de diverso origen, tanto natural como sintético. La eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular que se esté utilizando (Scharf D y colaboradores (1994) Resulte Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner y colaboradores (1987) Methods in Enzymol 153:516-544). Además, se puede seleccionar una cepa de células huéspedes por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas, o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento posttraducción que disocia una forma "prepro" de la proteína, también puede ser importante para una inserción, pliegue, y/o función correctas. Diferentes células hospederas, tales como CHO (DG44, DXB11 CH0-K1) , HeLa, MDCK, 293, WI38, etc., tienen la máquina celular específica y mecanismos característicos para estas actividades post -traducción, y se pueden seleccionar para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteína extraña introducida. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de las proteínas recombinantes , se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresen establemente la sHASEGP se pueden transformar utilizando vectores de expresión que contengan orígenes de réplica virales o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. En seguida de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia' a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresen con éxito las secuencias introducidas. Los grupos resistentes de células establemente transformadas se pueden proliferar empleando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula. Se puede utilizar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no se limitan a, los genes de timidina quinasa de virus de herpes símplex (Wigler M. y colaboradores (1977) Cell 11:223-32), y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy I. y colaboradores (1980) Cell 22:817-23), que se pueden emplear en células TK o APRT, respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia a antimetabolitos , antibióticos, o herbicidas como la base para la selección; por ejemplo, la DHFR que confiere resistencia al metotrexato (Wigler M. y colaboradores (1980) Proc. Nati. Acad. Sci . 77:3567-70); npt , que confiere resistencia a los aminoglicósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin F. y colaboradores (1981) J. Mol. Biol . 150:1-14), y ais o pat, que confieren resistencia al clorosulfurón y a la fosfinotricina acetiltransferasa , respectivamente (Murry, supra) . Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman S.C. y R.C. Mulligan (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:8047-51) . Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas , beta-glucuronidasa y su sustrato, GUS, y luciferasa y su sustrato, luciferrina, utilizándose ampliamente no sólo para identificar los transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribui-ble a un sistema de vector específico (Rhodes C.A. y colaboradores (1995) Methods Mol. Biol . 55:121-131) . IDENTIFICACIÓN DE TRANSFORMANTES QUE CONTIENEN LA SECUENCIA DE POLINUCLEÓTIDOS Aunque la presencia/ausencia de expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés también está presente, se debe confirmar la presencia y expresión de una sHASEGP activa. Por ejemplo, si se inserta la sHASEGP dentro de una secuencia del gen marcador, se pueden identificar las células recombinantes que contengan sHASEGP por la ausencia de la función del gen marcador. De una manera alternativa, se puede colocar un gen marcador en tándem con una secuencia de sHASEGP bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección, usualmente indica la expresión de la sHASEGP en tándem también. La detección de sHASEGP activa en neutro apropiadamente glicosilada se puede determinar por medio de la prueba del medio acondicionado para la actividad enzimática de sHASEGP bajo condiciones apropiadas. PURIFICACIÓN DE LA sHASEGP Las células hospederas transformadas con una secuencia de nucleótidos de sHASEGP se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante de preferencia se secreta, pero puede estar contenida intracelularmente , dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Como será entendido por los técnicos en este campo, se pueden diseñar vectores de expresión que contengan sHASEGP con secuencias de señal que faciliten la secreción directa de sHASEGP a través de una membrana celular procariotica o eucariótica. Se pueden unir otras construcciones recombinantes de sHASEGP a la secuencia de nucleotidos que codifique un dominio de polipéptido, lo cual facilitará la purificación de las proteínas solubles (Kroll D. J. y colaboradores (1993) DNA Cell Biol . 12:441-53 ; ver la discusión de los vectores más adelante que contienen las proteínas de fusión) . La sHASEGP también se puede expresar como una proteína recombinante con uno o más dominios de polipéptido adicionales agregados para facilitar la purificación de la proteína. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales, tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de extensión FLAGS/purificación por afinidad (Immunex Corp. Seattle ash.) . La inclusión de secuencias enlazadoras disociables, tales como el Factor XA o la enteroqui-nasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y la sHASEGP, es útil para facilitar la purificación. Uno de tales vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que compromete una sHASEGP, y contiene ácido nucleico que codifica seis residuos de histidina, seguidos por tiorredoxina y un sitio de disociación de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación sobre IMIAC (cromatografía por afinidad de ion de metal inmovilizado, como se describe en Porath y colaboradores (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281), mientras que el sitio de disociación de enteroquinasa proporciona un medio para purificar la quimiocina a partir de la proteína de fusión. En adición a la producción recombinante , se pueden producir fragmentos de sHASEGP mediante síntesis directa de péptidos, empleando técnicas en fase sólida (ver Stewart y colaboradores (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco; Merrifield J. (1963) J". Am. Chem. Soc . 85:2149-2154) . Se puede llevar a cabo la síntesis de proteína in vitro utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City Calif.), de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Diferentes fragmentos de sHASEGP se pueden sintetizar químicamente por separado, y se pueden combinar empleando los métodos químicos para producir la molécula de longitud completa. La expresión de los vectores que contienen las secuencias de codificación, o porciones de las mismas, de un polipéptido de sHASEGP, se hace, por ejemplo, mediante la sub-clonación de las porciones codificantes en el sitio de restricción EcoRI de cada uno de los tres vectores PGEX (vectores de expresión de glutationa S-transferasa (Smith y Johnson, Gene 7:31-40 (1988)) . Esto permite la expresión de los productos en el marco de lectura correcto. Los vectores y sistemas de ejemplo para la expresión de los dominios de hialuronidasa de los polipéptidos de sHASEGP incluyen los vectores de Pichia bien conocidos (disponibles, por ejemplo, en Invitrogen, San Diego, CA) , en particular los diseñados para la secreción de las proteínas codificadas. La proteína también se puede expresar citoplásmicamente , tal como en los cuerpos de inclusión. En los ejemplos se describe un vector de ejemplo. Los plásmidos para la transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (ver la patente US 4,952,496; disponible en Novagen, Madison, isconsin, Estados Unidos; ver también la literatura publicada por Novagen que describe el sistema) . Tales plásmidos incluyen pET lia, que contiene al promotor T71ac, al terminador T7 , al operador lac de E. coli inducible, y al gen represor de lac; pET 12A-C, que contiene al promotor T7 , al terminador T7 , y a la señal de secreción OMPT de E. coli; y pET 15B y pET19B (Novagen, Madison, WI) , que contienen una secuencia líder His-Tag para utilizarse en la purificación con una columna His y un sitio de disociación de trombina que permite la disociación en seguida de la purificación sobre la columna; la región promotor T7-lac, y el terminador T7. Los vectores se introducen en las células hospederas, tales como células de Pichia y células bacterianas, tales como E. coli, y las proteínas expresadas en las mismas. Las cepas de Pichia de ejemplo incluyen, por ejemplo, GS115. Los hospederos bacterianos de ejemplo contienen copias cromosomicas de ADN que codifica la polimerasa de ARN T7 operativamente enlazada con un promotor inducible, tal como el promotor LACUV (ver, la patente US 4,952,496) . Estos hospederos incluyen, pero no se limitan a, la cepa BL21 de E. coli lisogénica (DE3) . Los dominios de sHASEGP, derivados y análogos, se pueden producir mediante diferentes métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, una vez que se identifica una célula recombinante que expresa un polipéptido de sHASEGP, o un dominio, fragmento, o derivado del mismo, se puede aislar y analizar el producto genético individual . Esto se logra mediante ensayos basados en las propiedades físicas y/o funcionales de la proteína, incluyendo, pero no limitándose a, marcado radioactivo del producto, seguido por análisis mediante electroforesis en gel, inmunoensayo , reticulación con el producto marcado con el marcador, y ensayos de actividad proteolítica . Los polipéptidos de sHASEGP se pueden aislar y purificar mediante métodos convencionales conocidos en este campo (ya sea a partir de fuentes naturales, o bien a partir de células hospederas recombinantes que expresen los complejos o las proteínas) , incluyendo, pero no restringiéndose a, cromatografía en columna (v.gr. , intercambio de iones, afinidad, exclusión de gel, de alta presión en fase inversa, y de líquidos con proteína rápida), centrifugación diferencial, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional utilizada para la purificación de proteínas. En una forma de realización, la sHASEGP se puede purificar hasta la homogeneidad a partir del medio acondicionado químicamente definido de células DG44 transfectadas y amplificadas con metotrexato mediante: 1) diafiltración de flujo tangencial, 2) enlace y elución a partir de cromatografía de intercambio de aniones, 3) flujo a través de cromatografía en fenil-sefarosa, 4) enlace y elución a partir de cromatografía en boronato de fenilo, y 5) enlace y elución con cromatografía en hidroxiapatita . Las propiedades funcionales se pueden evaluar utilizando cualquier ensayo adecuado conocido en la materia. De una manera alternativa, una vez que se identifica un polipéptido de sHASEGP o su dominio o su derivado, se puede deducir la secuencia de aminoácidos de la proteína a partir de la secuencia de nucleótidos del gen que la codifica. Como resultado, la proteína o su dominio o su derivado se puede sintetizar mediante métodos químicos convencionales conocidos en este campo (v.gr., ver Hunkapiller y colaboradores, Nature 310:105-111 (1984)), seguidos por glicosilación in vitro. Se pueden hacer manipulaciones de las secuencias de polipéptidos de sHASEGP al nivel de la proteína. En la presente también se contemplan proteínas de polipéptidos de sHASEGP, dominios de las mismas, derivados o análogos o fragmentos de las mismas, que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, v.gr. , mediante glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, pegilación, derivación mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, disociación proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo, u otro ligando celular. Se pueden llevar a cabo cualesquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitándose a, disociación química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina , papaína, V8 , NABH4 , acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en la presencia de tunicamicina y otros de estos agentes . Además, se pueden sintetizar químicamente dominios, análogos, y derivados de un polipéptido de sHASEGP. Por ejemplo, se puede sintetizar un péptido correspondiente a una porción de un polipéptido de sHASEGP, que incluya el dominio deseado, o que medie la actividad deseada in vitro, mediante la utilización de un sintetizador de péptidos. Mas aun, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una sustitu- ción o adición en la secuencia del polipéptido de sHASEGP. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros-D de los aminoácidos comunes, ácido a-aminoisobutírico , ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2 -aminobutírico , E-ABU, e-Ahx, ácido 6-amino-hexanoico, Aib, ácido 2 -amino- isobutírico , ácido 3-amino-propiónico , ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiproli-na, sarcosina, citrulina, ácido cistéico, terbutilglicina, terbutilalanina, fenilglicina , ciclohexilalanina , ß-alanina, fluoro-aminoácidos , aminoácidos diseñadores tales como ß-metil aminoácidos, ca-metil aminoácidos, na-metil aminoácidos, y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser d (dextrogiratorio) o 1 (levogiratorio) . En los casos en donde se sospeche que los productos naturales son mutantes o están aislados a partir de especies nuevas, se puede determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido de sHASEGP aislado a partir de la fuente natural, así como las expresadas in vitro, o a partir de vectores de expresión sintetizados in vivo o in vitro, con un análisis de la secuencia de ADN, o de una manera alternativa, mediante la secuenciación directa de la proteína aislada. Tal análisis se puede llevar a cabo mediante secuenciación manual o a través del uso de un secuenciador de aminoácidos automatizado. Modificaciones. En la presente se contemplan una variedad de modificaciones de los polipéptidos y dominios de sHASEGP. Una molécula de ácido nucleico que codifique sHASEGP se puede modificar mediante cualquiera de numerosas estrategias conocidas en este campo (Sambrook y colaboradores (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) . Las secuencias se pueden disociar en los sitios apropiados con endonuclea-sas de restricción, seguido por modificación enzimática adicional, si se desea, se pueden aislar, y ligar in vi tro. En la producción del gen que codifica un dominio, derivado, o análogo de sHASEGP, se debe tener cuidado de asegurarse de que el gen modificado retenga el marco de lectura de traducción original, que no esté interrumpido por señales de paro de traducción, en la región genética en donde se codifique la actividad deseada. Adicionalmente , las moléculas de ácidos nucleicos que codifican sHASEGP se pueden mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir las secuencias de traducción, inicio, y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones codificantes, y/o para formar nuevos sitios de endonucleasa de restricción, o para destruir los previamente existentes, con el fin de facilitar además la modificación in vitro. También, como se describe en la presente, se contemplan las muteínas con alteraciones de la secuencia primaria, tales como reemplazados de residuos Cys , y la eliminación o adición de sitios de glicosilación; la sHASEGP de la SEQ ID NO : 1 tiene siete sitios de glicosilación potenciales. Tales mutaciones se pueden efectuar mediante cualquier técnica para mutagénesis conocida en este campo, incluyendo, pero no limitándose a, mutagénesis química y mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson y colaboradores, J. Biol . Chem. 253:6551-6558 (1978)), el uso de enlazadores TABE (Pharmacia) . En una forma de realización, por ejemplo, se modifica un polipéptido de sHASEGP o un dominio del mismo, para incluir una marca fluorescente. En otras formas de realización específicas, el polipéptido de sHASEGP se modifica para tener un reactivo heterobifuncional , y estos reactivos heterobifuncionales se pueden utilizar para reticular a los miembros del complejo. Además, se pueden sintetizar químicamente dominios, análogos, y derivados de una sHASEGP. Por ejemplo, se puede sintetizar un péptido correspondiente a una porción de una sHASEGP, que incluya al dominio deseado, o que medie la actividad deseada in vitro, mediante la utilización de un sintetizador de péptidos. Adicionalmente , si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en la secuencia de sHASEGP. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros-D de los aminoácidos comunes, ácido a-amino-isobutírico, ácido 4 -amino-butírico , Abu, ácido 2-amino-butírico, S-ABU, e-Ahx, ácido 6 -amino-hexanoico , Aib, ácido 2-amino-isobutírico, ácido 3 -amino-propiónico , ornitina, norleucina, norvalina, hidroxi-prolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteíco, terbutil-glicina, terbutil -alanina , fenilglicina, ciclohexilalanina , ß-alanina, fluoro-aminoácidos , aminoácidos diseñadores tales como ti-metil aminoácidos, ca-metil aminoácidos, na-metil aminoácidos, y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser d (dextrógiratorio) o 1 (levógiratorio) . F. GENERACIÓN DE UNA sHASEGP GLICOSILADA FUNCIONALMENTE ACTIVA CON FRACCIONES DE AZÚCAR N-ENLAZADAS La sHASEGP humana apropiadamente N-glicosilada se requiere para generar una proteína catalíticamente estable. La glicosilación N-enlazada de la sHASEGP se puede lograr a través de diferentes técnicas. La glicosilación de sHASEGP se puede lograr mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifiquen sHASEGP en las células de origen eucariótico capaces de tener una glicosilación N-enlazada apropiada, o de una manera alternativa, mediante el contacto del polipéptido de sHASEGP con extractos celulares libres o" enzimas purificadas capaces de introducir las fracciones de azúcar N-enlazadas deseadas. SELECCIÓN DE UN SISTEMA DE EXPRESIÓN Los sistemas de expresión celular eucarióticos varían en la extensión y el tipo de glicosilación que introducen en un polipéptido ectópicamente expresado. Por ejemplo, las células CHO son altamente eficientes para la introducción de la glicosilación N-enlazada en un polipéptido de sHASEGP activo. Los sistemas de expresión eucariótica adicionales que introducen glicosilación N-enlazada para generar un producto de sHASEGP funcional, se pueden probar mediante la introducción de un plásmido de expresión de sHASEGP humana en estas células, y probando la actividad en neutro. La glicosilación N-enlazada apropiada se puede determinar por medio de análisis FACE de los oligosacáridos liberados por PNGasa. Los perfiles de glicosilación de las sHASEGPs catalíticamente activas se proporcionan adicionalmente en la presente. También se puede hacer la verificación de la glicosilación mediante el tratamiento de la sHASEGP a partir de estas células con PNGasa-F, o cultivando estas células en tunicamicina en seguida de la introducción de los ácidos nucleicos que codifiquen sHASEGP . N-glicosilación del polipéptido de sHASEGP in vitro. El polipéptido de sHASEGP se puede N-glicosilar mediante el contacto del polipéptido de sHASEGP con extractos exentos de células que contengan actividad capaz de transferir azúcar N-enlazados al polipéptido de sHASEGP, tales como membranas microsomales caninas, o a través de transcripción acoplada y traducción como está comercialmente disponible (Promega, Madison, Wisconsin, Estados Unidos) . Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, ya sea que el sacárido en el extremo reductor sea o no de hecho un azúcar reductor. De conformidad con la nomenclatura aceptada, en la presente se ilustran oligosacáridos con el extremo no reductor sobre la izquierda, y el extremo reductor sobre la derecha. Todos los oligosacáridos descritos en la presente se describen con el nombre o la abreviatura para el sacárido no reductor (v.gr., Gal) , seguido por la configuración del enlace glicosídico (alfa o beta) , el enlace de anillo, la posición en el anillo del sacárido reductor involucrado en el enlace, y luego el nombre o la abreviatura del sacárido reductor (v.gr., GlcNAc) . El enlace entre dos azúcares se puede expresar, por ejemplo, como 2, 3, 2. fw darw.3, o (2,3). Cada sacárido es una piranosa. Como se utiliza en la presente, una fracción de azúcar N-enlazado se refiere a un oligosacárido unido a una sHASEGP por medio del nitrógeno de amida de los residuos de Asn. Los oligosacáridos N-enlazados caen en varios tipos principales (oligomanosa, complejo, híbrido, sulfatado), todos los cuales tienen núcleos de (Man) 3 -GlcNAc-GlcNAc- unidos por medio del nitrógeno de amida de los residuos de Asn que caen dentro de las secuencias-Asn-Xaa-Thr/Ser- (en donde Xaa no es Pro) . Los sitios N-enlazados con frecuencia se asignan indirectamente por la aparición de un ciclo "en blanco" durante la secuenciación . Se puede hacer una identificación positiva después de la liberación del oligosacárido por la PNGasa F, que convierte el Asn glicosi-lado hasta Asp . Después de la liberación de PNGasa F, los oligosacáridos N-enlazados se pueden purificar utilizando cromatografía Bio-Gel P-6, sometiéndose a la reserva de oligosacáridos a cromatografía de intercambio de aniones de alto pH de preparación (HPAEC) (Townsend y colaboradores, (1989) Anal. Bioche . 182, 1-8) . Ciertos isómeros de oligosacáridos se pueden resolver utilizando la HPAEC. Los residuos de fucosa cambiarán las posiciones de elución más temprano en el cromatograma de HPAEC, mientras que los residuos de ácido siálico adicionales aumentarán el tiempo de retención. El tratamiento concurrente de las glicoproteínas cuyas estructuras de oligosacáridos sean conocidas (por ejemplo, fetuína bovina, glicoproteína de ácido a-1, ovalbúmina, ARNsa B, transferrina) , pueden facilitar la asignación de los picos de los oligosacáridos. Los oligosacáridos recolectados se pueden caracterizar por una combinación de análisis de composición y de enlace de metilación (Waegheet y colaboradores, (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304), con las configuraciones anoméricas asignadas mediante espectroscopia de RMN (Van Halbeek (1993) en Methods Enzymol 230) . De una manera alternativa, los oligosacáridos se pueden identificar mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluorescencia (FACE) , Callewaert y colaboradores (2001) Glycobio-logy 11, 275-281. G. DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS FRACCIONES DE AZÚCAR N-ENLAZADAS SOBRE LA sHASEGP La determinación de si una proteína de hecho está glicosilada, es el paso inicial en el análisis del glicano de la glicoproteína. La electroforesis en gel de poliacrilamida en la presencia de dodecil - sulfato de sodio (SDS-PAGE) ha llegado a ser el método de elección como el paso final antes de la secuencia-ción de la proteína. Las proteínas glicosiladas con frecuencia migran como bandas difusas mediante SDS-PAGE. Una disminución notoria en la amplitud de banda y un cambio en la posición de migración después del tratamiento con el péptido N - (N-acetil -D-glucosaminil ) asparagina amidasa (PNGasa F) se considera como un diagnóstico de la glicosilacion N-enlazada. Si son predominantes los otros tipos de glicosilacion, se deben emplear otros planteamientos. Los métodos de mancha de lectina proporcionan un planteamiento que es independiente de la clase de glicosilacion (N contra 0) . Las lecitinas, las proteínas de enlace de carbohidratos a partir de diferentes tejidos de plantas, tienen tanto una alta afinidad como una estrecha especificidad para un amplio intervalo de epítopes de azúcar definidos que se encuentran sobre los glicanos de la glicoproteína (Cummings, R. D. (1994) Methods in Enzymol . 230, 66-86) . Cuando se conjugan con biotina o digoxigenina, se pueden identificar fácilmente sobre manchas de membrana a través de una reacción colorimétrica utilizando anticuerpos de avidina o anti -digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (Haselbeck y colaboradores (1993) Methods in Mol. Biol . 14, 161-173), de una manera análoga a las reacciones de anticuerpo secundario- fosfatasa alcalina empleadas en la Western blot. El rastreo con un panel de lecitinas con una especificidad bien definida puede proporcionar información considerable acerca del complemento de carbohidrato de una glicoproteína. Es importante que la amplificación de desarrollo de color sea suficientemente alta para que se puedan ver fácilmente de 10 a 50 nng de una glicoproteína sobre una mancha de membrana de un SDS-PAGE. Aunque las lecitinas exhiben muy alta afinidad para sus ligandos cognados, algunas revelan una avidez significativa para los epítopes estructuralmente relacionados. Por consiguiente, es importante observar cuidadosamente la posibilidad de la reactividad cruzada cuando se elija un panel de lecitinas, y aplicarlas con la más alta probabilidad de complejo individualmente distintivo, híbrido, y glicanos N-enlazados altos en mañosa a partir de las estructuras O-enlazadas. También se puede utilizar el análisis de monosacáridos para determinar si la sHASEGP está glicosilada, y como en el caso del análisis de lectina, proporciona información adicional sobre las características estructurales. El análisis de composición de monosacáridos cuantitativo: i) identifica las proteínas glicosi-ladas, ii) da la proporción molar de los azúcares individuales a la proteína, iii) sugiere, en algunos casos, la presencia de clases de oligosacáridos , iv) es el primer paso en el diseño de una estrategia de elucidación estructural, y v) proporciona una medida de consistencia de producción para la terapia con glicoproteína recombinante . En los años recientes, se ha utilizado extensamente la cromatografía de intercambio de aniones a un alto pH con detección amperométrica (HPAEC-PAD) , con el fin de determinar la composición de los monosacáridos (Townsend y colaboradores (1995) , en Carbohydrate Analysis High-performance liquid enromatography and capillary electrophoresis (Z. El Rassi ed.) páginas 181-209) . Más recientemente, se han introducido métodos de marcado basados en fluoróforo, y muchos están disponibles en forma de estuche. Una ventaja distintiva de los métodos fluorescentes, es un aumento en la sensibilidad (50 veces) . Una desventaja potencial es que diferentes monosacáridos pueden demostrar diferente selectividad para el fluoróforo durante la reacción de acoplamiento, ya sea en el hidrolizado o en la mezcla estándar externa. Sin embargo, el aumento en la sensibilidad y la capacidad para identificar cuáles monosacáridos están presentes a partir de una pequeña porción de la cantidad total de glicoproteína disponible, así como el potencial para una mayor selectividad utilizando la fluorescencia inducida por láser, hace atractivo este planteamiento. El análisis de composición de monosacáridos de pequeñas cantidades de sHASEGP se lleva a cabo mejor sobre membranas de PVDF (PSQ) , después del electromanchado (Weitzhandleret y colaboradores, (1993) J". Biol . Chem. 268, 5121-5130), o si se van a analizar alícuotas más pequeñas, en manchas de puntos. PVDF es una matriz ideal para el análisis de carbohidratos, debido a que los mono- u oligo-sacáridos se enlazan a la membrana, una vez liberada ya sea por la hidrólisis ácida o enzimática. El análisis FACE es un medio eficiente para detectar los perfiles de glicosilación de las sHASEGPs . La Perfilación de Oligosacáridos N-enlazados FACE (Prozyme) con geles de oligosacá-ridos al 30%, es uno de estos mecanismos. Se pueden utilizar oligosacáridos disociados a partir de 100 yg de glicoproteínas mediante digestión enzimática con N-glicanasa (también conocida como PNGasa) , marcada utilizando el fluoróforo A TS , y separados mediante electroforesis , para la detección de los perfiles de glicosilación de sHASEGP . Las posiciones relativas de las bandas de oligosacárido se determinan ejecutando la muestra y las diluciones de la muestra a lo largo de una escala estándar de oligosacárido que designa la distancia de migración en unidades de Grado de Polimerización (DP) . H. MÉTODOS DE RASTREO PARA IDENTIFICAR LOS COMPUESTOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE sHASEGP En la presente se ejemplifican y se describen varios tipos de ensayos. Se entiende que los dominios de hialuronidasa se pueden utilizar en otros ensayos. Sin embargo, en la presente se muestra que los dominios de hialuronidasa exhiben actividad catalítica . Como tales, son iguales para los ensayos de rastreo in vi tro . También se pueden utilizar en ensayos de enlace. Los zimógenos de longitud completa de SHASEGP, las enzimas activadas, y los dominios de hialuronidasa, se contemplan para utilizarse en cualquier ensayo de rastreo conocido por los técnicos en la materia, incluyendo los proporcionados en la presente. Por consiguiente, la siguiente descripción se refiere a ensayos de hialuronidasa pretendidos para aplicarse al uso del dominio de hialuronidasa de una sola cadena, o una porción catalíticamente activa del mismo de cualquier hialuronidasa, incluyendo una sHASEGP. En la presente se proporcionan otros ensayos, tales como ensayos de enlace, en particular para utilizarse con una sHASEGP, incluyendo cualesquiera variantes, tales como variantes de empalme de la misma. 1. Ensayos catalíticos para la identificación de agentes que modulan la actividad de hialuronidasa de una proteína sHASEGP. En la presente se proporcionan métodos para identificar un modulador de la actividad catalítica de una sHASEGP, en particular un dominio de hialuronidasa de una sola cadena, o una porción catalíticamente activa del mismo. Los métodos se pueden practicar mediante: poner en contacto la sHASEGP, un zimógeno de longitud completa o una forma activada, y en particular un dominio de una sola cadena de la misma, con un sustrato de la sHASEGP en la presencia de una sustancia de prueba, y detectar la proteólisis del sustrato, mediante lo cual se evalúa la actividad de la sHASEGP, y comparar la actividad con un control. Por ejemplo, un control puede ser la actividad de la sHASEGP evaluada poniendo en contacto una sHASEGP, incluyendo un zimógeno de longitud completa o una forma activada, y en particular un dominio de una sola cadena de la misma, con un sustrato de la sHASEGP, y detectando la proteólisis del sustrato, mediante lo cual se evalúa la actividad de la sHASEGP. Se comparan los resultados en la presencia y en ausencia de los compuestos de prueba. Una diferencia en la actividad indica que la sustancia de prueba modula la actividad de la sHASEGP . También se contemplan activadores de la disociación de activación de sHASEGP; tales ensayos se describen más adelante. En una forma de realización, se rastrea simultáneamente una pluralidad de sustancias de prueba en el método de rastreo anterior. En otra forma de realización, la sHASEGP se aisla a partir de una célula objetiva como un medio para identificar luego los agentes que sean potencialmente específicos para la célula objetiva. En otra forma de realización, una sustancia de prueba es un compuesto terapéutico, y en donde la diferencia de la actividad de sHASEGP medida en la presencia y en ausencia de la sustancia de prueba, indica que la célula objetiva responde al compuesto terapéutico. Un método incluye los pasos de: (a) poner en contacto el polipéptido de sHASEGP o el dominio de hialuronidasa del mismo, con uno o una pluralidad de compuestos de prueba bajo condiciones que conduzcan a la interacción entre el ligando y los compuestos; y (b) identificar uno o más compuestos en la pluralidad que se enlace específicamente al ligando. Otro método proporcionado en la presente incluye los pasos de: a) poner en contacto un polipéptido de sHASEGP o un dominio de hialuronidasa del mismo, con un sustrato del polipéptido de sHASEGP, y detectar la degradación del sustrato, mediante lo cual se evalúa la actividad del polipéptido de sHASEGP; b) poner en contacto el polipéptido de sHASEGP con un sustrato de sHASEGP en la presencia de una sustancia de prueba, y detectar la degradación del sustrato, mediante lo cual se evalúa la actividad del polipéptido de sHASEGP; y c) comparar la actividad del polipéptido de sHASEGP evaluada en los pasos a) y b) , mediante lo cual la actividad medida en el paso a) difiere de la actividad medida en el paso b) , e indica que la sustancia de prueba modula la actividad del polipéptido de sHASEGP. En otra forma de realización, se rastrean de una manera simultánea una pluralidad de sustancias de prueba. En la comparación de la actividad de polipéptido de sHASEGP en la presencia y en ausencia de una sustancia de prueba para evaluar si la sustancia de prueba es moduladora del polipéptido de sHASEGP, no es necesario ensayar la actividad en paralelo, aunque esta medición en paralelo es típica. Es posible medir la actividad del polipéptido de sHASEGP en un punto del tiempo, y comparar la actividad medida con un valor histórico de la actividad del polipéptido de sHASEGP. Por ejemplo, se puede medir la actividad del polipéptido de sHASEGP en la presencia de una sustancia de prueba, y comparar con el valor histórico de la actividad del polipéptido de sHASEGP medida previamente en ausencia de la sustancia de prueba, y viceversa. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, proporcionando la actividad del polipéptido de sHASEGP en un inserto o panfleto proporcionado con un estuche para conducir el ensayo . Los métodos para seleccionar sustratos para una sHASEGP particular se describen en los ejemplos, y se ejemplifican los ensayos particulares de hialuronidasa . Se proporcionan combinaciones y kits que contienen las combinaciones, incluyendo de manera opcional instrucciones para llevar a cabo los ensayos. Las combinaciones incluyen un polipéptido de sHASEGP y un sustrato del polipéptido de sHASEGP que se va a ensayar; y opcionalmente reactivos para detectar la proteólisis del sustrato. Los sustratos, los cuales pueden ser moléculas cromogénicas o fluorogénicas , incluyendo glicosamino-glicanos, sujetos a proteólisis por un polipéptido de sHASEGP particular, se pueden identificar de una manera empírica mediante la prueba de la capacidad del polipéptido de sHASEGP para disociar el sustrato de prueba. Se identifican los sustratos que se disocien de una manera más efectiva, es decir, en las concentraciones más bajas y/o a la velocidad más rápida, o bajo condiciones deseables. Adicionalmente se proporciona en la presente un kit que contiene la combinación anteriormente descrita. El kit incluye opcionalmente instrucciones para identificar un modulador de la actividad de un polipéptido de sHASEGP. Se contempla cualquier polipéptido de sHASEGP como el objetivo para identificar moduladores de la actividad del mismo. 2. Ensayos de enlace. En la presente también se proporcionan métodos para la identificación y el aislamiento de agentes, en particular compuestos que se enlazan con las sHASEGPs . Los ensayos se diseñan para identificar los agentes que se enlacen al dominio de hialuronidasa aislado (o una proteína diferente de un polipéptido de sHASEGP, que contenga al dominio de hialuronidasa de un polipéptido de sHASEGP) , y a la forma activada, incluyendo la forma activada derivada a partir del zimógeno de longitud completa, o a partir de un dominio de hialuronidasa extendido. Los compuestos identificados son candidatos o guías para la identificación de compuestos para tratamientos o trastornos y enfermedades que involucren una actividad aberrante de hialuronidasa. Los polipéptidos de sHASEGP utilizados en los métodos incluyen cualquier polipéptido de sHASEGP como se define en la presente, incluyendo el dominio de hialuronidasa de una sola cadena de sHASEGP, o su porción proteolíticamente activa. En la presente se proporcionan una variedad de métodos. Estos métodos se pueden llevar a cabo en reacciones en solución o en fase sólida en donde los polipéptidos de sHASEGP o los dominios de hialuronidasa de los mismos se enlacen, ya sea directa o indirectamente mediante un enlazador, a un soporte sólido. Los ensayos de rastreo se describen en los ejemplos, y estos ensayos se han utilizado para identificar los compuestos candidatos . Para los propósitos de la presente, todos los ensayos de enlace descritos anteriormente se proporcionan para la sHASEGP. En la presente se proporcionan métodos para identificar un agente, tal como un compuesto, que se enlace específicamente a un dominio de hialuronidasa de una sola cadena de sHASEGP, una sHASEGP activada de longitud completa, o un dominio de hialuronidasa de doble cadena de la misma. El método se puede practicar mediante: (a) poner en contacto la sHASEGP con uno o una pluralidad de los agentes de prueba bajo condiciones que conduzcan al enlace entre la sHASEGP y un agente; y (b) identificar uno o más agentes dentro de la pluralidad que se enlacen específicamente a la sHASEGP. Por ejemplo, en la práctica de estos métodos, el polipéptido de sHASEGP se mezcla con un socio de enlace potencial o un extracto o fracción de una célula, bajo condiciones que permitan la asociación de los componentes de enlace potenciales con el polipéptido. Después de mezclar, los péptidos, polipépti-dos, proteínas, u otras moléculas que se hayan llegado a asociar con una sHASEGP, se separan de la mezcla. Luego se puede remover y analizar adicionalmente el socio de enlace que se haya enlazado a la sHASEGP. Con el fin de identificar y aislar un socio de enlace, se puede utilizar la proteína entera, por ejemplo la proteína dada a conocer con la SEQ ID NO:l entera. De una manera alternativa, se puede utilizar un fragmento de la proteína. Se pueden utilizar una variedad de métodos para obtener extractos celulares o fluidos corporales, tales como sangre, suero, orina, sudor, fluido sinovial, CSF, y otros fluidos. Por ejemplo, las células se pueden alterar utilizando métodos de alteración física o química. Los ejemplos de los métodos de alteración física incluyen, pero no se limitan a, tratamiento sónico y esfuerzo de corte mecánico. Ejemplos de los métodos de lisis química incluyen, pero no se limitan a, lisis con detergente y lisis enzimática. Un técnico puede adaptar fácilmente los métodos para preparar extractos celulares con el objeto de obtener extractos para utilizarse en los presentes métodos . Una vez que se prepara un extracto de una célula, el extracto se mezcla con la sHASEGP bajo condiciones en las que se pueda presentar la asociación de la proteína con el socio de enlace. Se pueden utilizar una variedad de condiciones, incluyendo condiciones que se parezcan a las condiciones que se encuentran en el citoplasma de una célula humana o en un fluido corporal, tal como sangre. Las características, tales como la osmolaridad, el pH, la temperatura, y la concentración de extracto celular utilizada, se pueden variar para optimizar la asociación de la proteína con el socio de enlace. De una manera similar, se conocen los métodos para el aislamiento de las moléculas de interés a partir de los fluidos corporales. Después de mezclar bajo condiciones apropiadas, el complejo enlazado se separa de la mezcla. Se pueden emplear una variedad de técnicas para separar la mezcla. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos específicos para una sHASEGP, con el fin de inmunoprecipitar el complejo del componente de enlace. De una manera alternativa, se pueden emplear técnicas de separación química convencionales, tales como cromatografía y centrifugación por densidad/sedimento. Después de remover los constituyentes celulares no asociados del extracto, se puede disociar el componente de enlace del complejo utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, la disociación se puede llevar a cabo mediante la alteración de la concentración de sal o del pH de la mezcla. Con el fin de ayudar en la separación de los pares de componentes de enlace asociados del extracto mixto, la sHASEGP se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Por ejemplo, la proteína se puede unir a una matriz de nitrocelulosa o a perlas de acrílico. La unión de la proteína o un fragmento de la misma a un soporte sólido ayuda a separar los pares de péptido/componente de enlace de otros constituyentes encontrados en el extracto. Los componentes de enlace identificados pueden ser una sola proteína o un complejo formado de dos o más proteínas . De una manera alternativa, se pueden utilizar moléculas de ácidos nucleicos que codifiquen las hialuronidasas de una sola cadena en un sistema de dos híbridos de levadura. El sistema de dos híbridos de levadura se ha utilizado para identificar otros pares de socios de proteina, y se puede adaptar fácilmente para emplear las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente. Otro ensayo de enlace in vitro, particularmente para una sHASEGP, utiliza una mezcla de un polipéptido que contiene cuando menos el dominio catalítico de una de estas proteínas, y uno o más objetivos de enlace o sustratos candidatos. Después de incubar la mezcla bajo condiciones apropiadas, se evalúa la capacidad de la sHASEGP o de un polipéptido o fragmento de la misma que contenga el dominio catalítico, para enlazarse a, o interactuar con, el sustrato candidato. Para los ensayos de enlace sin células, uno de los componentes incluye o se acopla a una marca detectable. La marca puede proporcionar la detección directa, tal como radioactividad, luminiscencia, densidad óptica o de electrones, etc., o la detección indirecta, tal como marca de epítope, una enzima, etc. Se pueden emplear una variedad de métodos para detectar la marca, dependiendo de la naturaleza de la marca y de otros componentes del ensayo. Por e emplo, la marca se puede detectar enlazada al sustrato sólido, o una porción del complejo enlazado que contenga la marca se puede separar del sustrato sólido, y después se detecta la marca. 3. La detección de la sHASEGP de transducción de señal, que es una proteína anclada a membrana, puede estar involucrada directa o indirectamente en la transducción de señal directamente como un receptor de superficie celular, o indirectamente mediante proteínas activadoras, tales como factores pro-crecimiento que puedan iniciar la transduccion de señal . Además, la sHASEGP secretada, tal como el dominio soluble de la sHASEGP, como se describe en la SEQ ID NO : 4 , puede estar involucrada en la transduccion de señal, ya sea directamente mediante su enlace a, o interactuando con, un receptor de superficie celular, o indirectamente mediante proteínas activado-ras, tales como factores pro- crecimiento que puedan iniciar la transduccion de señal . Los ensayos para evaluar la transduccion de señal son bien conocidos por los técnicos en la materia, y se pueden adaptar para utilizarse con el polipéptido de sHASEGP. Se proporcionan ensayos para identificar agentes que afecten o alteren la transduccion de señal directa o indirectamente mediada, tal como mediante la activación de un factor procrecimiento, mediante una sHASEGP, en particular la longitud completa o una porción suficiente para anclar el dominio extra-celular o una porción funcional del mismo de una sHASEGP sobre la superficie de una célula. Estos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos basados en la transcripción, en donde se evalúa la modulación de una señal transducida, mediante la detección de un efecto sobre la expresión a partir de un gen reportero (ver, v.gr., la patente US 5,436,128). 4. Métodos para identificar agentes que modulen la expresión de un ácido nucleico que codifique una sHASEGP. Otra forma de realización proporciona métodos para identificar agentes que modulen la expresión de un ácido nucleico que codifique una sHASEGP . Estos ensayos utilizan cualquier medio disponible para monitorear los cambios en el nivel de expresión de los ácidos nucleicos que codifiquen una sHASEGP . Se pueden utilizar formatos de ensayo para monitorear la capacidad del agente para modular la expresión de un ácido nucleico que codifique una sHASEGP. Por ejemplo, se puede monitorear la expresión del ARNm directamente mediante hibridación a los ácidos nucleicos. También se pueden utilizar ensayos enzimáticos como se describen, para detectar agentes que modulen la expresión de la sHASEGP. Las líneas celulares se exponen al agente que se vaya a probar bajo condiciones y en el tiempo apropiado, y se aisla el ARN total o el ARNm mediante procedimientos convencionales (ver, v.gr., Sambrook y colaboradores (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Se pueden preparar sondas para detectar las diferencias en los niveles de expresión de ARN entre las células expuestas al agente y las células de control, a partir de los ácidos nucleicos. Es típico, pero no necesario, diseñar sondas que se hibriden solamente con los ácidos nucleicos objetivos bajo condiciones de alta exactitud. Solamente se forman híbridos de ácidos nucleicos altamente complementarios bajo las condiciones de alta exactitud. De conformidad con lo anterior, la exactitud de la condiciones de ensayo determina la cantidad de complementariedad que existiría entre dos cadenas de ácidos nucleicos, con el objeto de formar un híbrido. La exactitud se debe seleccionar para maximizar la diferencia en la estabilidad entre la sonda: el híbrido objetivo y la sonda potencial: los híbridos no objetivos. Por ejemplo, los fragmentos N- y C-terminales de la sHASEGP se pueden expresar en bacterias, y se pueden utilizar para buscar proteínas que se enlacen a estos fragmentos. Las proteínas de fusión, tales como His-tag o la fusión GST con las regiones N- o C-terminales de la sHASEGP se pueden preparar para utilizarse como un sustrato. Estas proteínas de fusión se pueden acoplar, por ejemplo, a perlas de glutationa- sefarosa , y luego se pueden sondear con lisados celulares o fluidos corporales. Antes de la lisis, las células o los fluidos corporales se pueden tratar con un agente candidato que pueda modular una sHASEGP o las proteínas que interactúen con los dominios sobre la misma. Las proteínas del lisado que se enlacen a las proteínas de fusión se pueden resolver mediante SDS-PAGE, se pueden aislar e identificar mediante secuenciacion de proteínas o espectroscopia de masas, como se conoce en la materia. Se preparan sondas de anticuerpo mediante la inmunización de hospederos mamíferos adecuados en protocolos de inmunización apropiados utilizando los péptidos, polipéptidos , o proteínas, si son de suficiente longitud (por ejemplo, de , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más aminoácidos consecutivos del polipéptido de sHASEGP) , o si se requieren para mejorar la inmunogenicidad, conjugados con vehículos adecuados. Los métodos para preparar conjugados inmunogénicos con vehículos, tales como albúmina de suero bovino (BSA) , hemocianina de limpete de orificio (KLH) , u otras proteínas portadoras son bien conocidas en la materia. En algunas circunstancias, puede ser efectiva la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida ; en otros casos, pueden ser deseables los reactivos de enlace, tales como los suministrados por Pierce Chemical Co . , Rockford, Illinois, Estados Unidos, para proporcionar accesabilidad al hapteno. Los péptidos de hapteno se pueden extender ya sea en el término amino 0 carboxilo con un residuo Cys, o se pueden intercalar con residuos de cisteína, por ejemplo, para facilitar el enlace a un vehículo . La administración de los inmunógenos se conduce en general mediante inyección durante un período de tiempo adecuado, y con el uso de adyuvantes adecuados, como es entendido en general en la materia. Durante el programa de inmunización, se toman titulaciones de los anticuerpos para determinar si es adecuada la formación del anticuerpo. Se pueden generar anticuerpos anti -péptidos utilizando péptidos sintéticos correspondientes, por ejemplo, a los aminoácidos carboxi -terminales de la sHASEGP. Los péptidos sintéticos pueden ser tan pequeños como de 1 a 3 aminoácidos de longitud, en general de cuando menos cuando 4 o más residuos de aminoácidos de largo. Los péptidos se pueden acoplar a la KLH empleando métodos convencionales, y se pueden inmunizar en animales, tales como conejos o ungulados. Luego se pueden purificar los anticuerpos policlonales , por ejemplo, utilizando perlas Actigel que contengan al péptido covalentemente enlazado . Aunque los antisueros policlonales producidos de esta manera pueden ser satisfactorios para algunas aplicaciones, para las composiciones farmacéuticas, en general se utilizan preparaciones monoclonales. Se pueden preparar líneas celulares inmortalizadas que secreten los anticuerpos monoclonales deseados empleando el método convencional de Kohler y colaboradores (Nature 256:495-7 (1975)), o modificaciones que efectúen la inmortalización de los linfocitos o de las células de bazo, como se conoce en general. Las líneas celulares inmortalizadas que secreten los anticuerpos deseados se rastrean mediante inmunoen-sayos, en donde el antígeno es el hapteno del péptido, el polipéptido, o la proteína. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado que secrete el anticuerpo deseado, las células se pueden cultivar ya sea in vitro, o bien mediante la producción in vivo por medio de fluido de ascitas. Son de un interés particular los anticuerpos monoclonales que reconocen el dominio catalítico o el sitio de disociación de activación (región) de una sHASEGP. También se pueden producir los anticuerpos o fragmentos. Se pueden producir regiones que se enlacen específicamente a las regiones deseadas del receptor en el contexto de quimeras con origen de múltiples especies. Los agentes que se ensayen en el método anterior se pueden seleccionar de una manera alteatoria, o se pueden seleccionar o diseñar racionalmente. Los agentes pueden ser, como ejemplos, péptidos, moléculas pequeñas, y carbohidratos. Un técnico en la materia puede reconocer fácilmente que no hay límite para la naturaleza estructural de los agentes. Los agentes de péptido se pueden preparar utilizando métodos de síntesis de péptidos en fase sólida convencionales (o en fase de solución) , como se conoce en este campo. Además, el ADN que codifique estos péptidos se puede sintetizar empleando instrumentación de síntesis de oligonucleótidos comercialmente disponible, y se pueden producir de una manera recombinante utilizando los sistemas de producción recombinante convencionales. Se necesita la producción utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida si se van a incluir aminoácidos no codificados por el gen. I. MÉTODOS DE TRATAMIENTO Las sHASEGPs identificadas mediante los métodos de la presente, se utilizan para el tratamiento o la prevención de acumulaciones anormales de sustratos de sHASEGP en un animal, en particular en un mamífero, incluyendo un ser humano. En una forma de realización, el método incluye administrar a un mamífero una cantidad efectiva de una glicoproteína de sHASEGP, mediante lo cual se trata o se previene la enfermedad o el trastorno. En otra forma de realización, se puede utilizar un inhibidor de sHASEGP en el tratamiento de una cantidad excesiva de actividad de hialuronidasa en neutro. El mamífero tratado puede ser un ser humano. Los inhibidores proporcionados en la presente son aquéllos identificados mediante los ensayos de rastreo. Además, se contemplan anticuerpos y ácidos nucleicos anti-sentido, o ARN de doble cadena (ARNds) , tal como AR i . 1. Tratamiento anti-sentido: En una forma de realización específica, como se describe anteriormente en la presente, se reduce o se inhibe la función del polipéptido de sHASEGP mediante ácidos nucleicos anti-sentido del polipéptido de sHASEGP, para tratar o prevenir una actividad excesiva de condroitinasa . Se proporciona el uso terapéutico o profiláctico de ácidos nucleicos de cuando menos seis nucleótidos, en general de hasta aproximadamente 150 nucleótidos, que son anti-sentido para un gen o ADNc que codifique el polipéptido de sHASEGP o una porción del mismo. Un ácido nucleico "anti-sentido" del polipéptido de sHASEGP, como se utiliza en la presente, se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridarse a una porción de un ARN del polipéptido de sHASEGP (en general ARNm) en virtud de alguna complementariedad de secuencias, y en general bajo condiciones de alta exactitud. El ácido nucleico anti-sentido puede ser complementario para una región codificante y/o no codificante de un ARNm del polipéptido de sHASEGP. Estos ácidos nucleicos antisentido tienen utilidad como terapéuticos que reducen o inhiben la función del polipéptido de sHASEGP, y se pueden utilizar en el tratamiento o en la prevención de trastornos como se describen anteriormente . Los ácidos nucleicos anti-sentido del polipéptido de sHASEGP son de cuando menos seis nucleótidos, y son en general oligonucleótidos (en el intervalo de 6 a aproximadamente 150 nucleótidos, incluyendo de 6 a 50 nucleótidos) . La molécula anti-sentido puede ser complementaria para todo o una porción del dominio de hialuronidasa . Por ejemplo, el oligonucleótido es de cuando menos 10 nucleótidos, de cuando menos 15 nucleótidos, de preferencia cuando menos 20, 40, 80 o cuando menos 100 nucleótidos, o de cuando menos 125 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser ADN, o ARN, o mezclas quiméricas, o derivados o versiones modificadas de los mismos, de una sola cadena o de doble cadena. El oligonucleótido se puede modificar en la fracción base, en la fracción de azúcar, o en la estructura base de fosfato. El oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos, o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6553-6556 (1989); Lemaitre y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:648-652 (1987); publicación PCT WO 88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) , o de la barrera de sangre-cerebro (ver, por ejemplo, publicación PCT WO 89/10134, publicada el 25 de abril de 1988) , agentes de disociación desencadenada por la hibridación (ver, por ejemplo, Krol y colaboradores, BioTechni-ques 6:958-976 (1988)), o agentes intercaladores (ver, por ejemplo, Zon. Pharm. Res. 5:539-549 (1988)). El ácido nucleico anti-sentido del polipéptido de sHASEGP es en general un oligonucleótido, típicamente ADN o ARN de una sola cadena, o un análogo de los mismos o mezclas de los mismos. Por ejemplo, el oligonucleótido incluye una secuencia anti-sentido para una porción de un ácido nucleico que codifique un polipéptido de sHASEGP humano. El oligonucleó ido se puede modificar en cualquier posición sobre su estructura con sustitu-yentes generalmente conocidos en este campo. El oligonucleótido anti-sentido del polipéptido de sHASEGP puede incluir cuando menos una fracción base modificada que se selecciona a partir del grupo que incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracilo, 5 -bromouracilo , 5 -clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4 -acetilcitosina , 5-(carboxi-hidroximetil ) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil uracilo, dihidrouracilo , beta-D-galacto-silqueosina, inosina, N6 - isopenteniladenina , 1 -metilguanina , 1-metilinosina, 2 , 2 -dimetilguanina , 2 -metiladenina , 2 -metilguanina, 3 -metilcitosina, 5 -metilcitosina , N6-adenina, 7 -metilguanina , 5-metilaminometil uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina , 5-apos-metoxicarboximetil uracilo, 5-metoxi uracilo, 2-tiometil-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wybutoxosina , pseudo-uracilo , queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2 -1iouracilo , 4 -tiouracilo, 5-metil uracilo, metiléster del ácido uracil - 5 -oxiacético , ácido uracil - 5 -oxiacético (v) , 5 -metil -2 -tiouracilo, 3 - (3 -amino-3 -n-2 -carboxipropil ) uracilo, (ACP3)w, y 2 , 6 -diamino-purina . En otra forma de realización, el oligonucleótido incluye cuando menos una fracción de azúcar modificada seleccionada a partir del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluoro-arabinosa, xilulosa, y hexosa. El oligonucleótido puede incluir cuando menos una estructura base de fosfato modificada seleccionada a partir de un fosforotioato , un fosforoditioato , un fosforoamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato , un metilfosfonato, un alquil fosfotriéster, y un formacetal o análogo del mismo. El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido a-anomérico. Un oligonucleótido a-anomérico forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario, en donde las cadenas corren paralelas unas a otras (Gautier y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15:6625-6641 (1987)). El oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, tal como, pero no limitándose a, un péptido; un agente de reticulación desencadenada por la hibridación, un agente de transporte, o un agente de disociación desencadenada por la hibridación. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar mediante métodos convencionales conocidos en este campo, por ejemplo mediante la utilización de un sintetizador de ADN automatizado (tal como están comercialmente disponibles en Biosearch, Applied Biosystems, etc.) . Como ejemplos, los oligonucleótidos de fosforotioato se pueden sintetizar mediante el método de Stein y colaboradores, Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); los oligonucleótidos de metilfosfonato se pueden preparar mediante la utilización de soportes poliméricos de vidrio poroso controlados (Sarin y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sel. USA 85 : 7448-7451 (1988)), etc. En una forma de realización específica, el oligonucleótido anti-sentido del polipéptido de sHASEGP incluye ARN catalítico o una ribozima (ver, por ejemplo, la publicación internacional PCT WO 90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver y colaboradores, Science 247:1222-1225 (1990)). En otra forma de realización, el oligonucleótido es un 2 ' -O-metil -ribonucleótido (Inoue y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15:6131-6148 (1987)), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores, FEBS Lett. 215:327-330 (1987)). De una manera alternativa, el oligonucleótido puede ser ARN de doble cadena (ARNds) , tal como ARNi . En una forma de realización alternativa, el ácido nucleico anti-sentido del polipéptido de sHASEGP se produce intracelularmente mediante transcripción a partir de una secuencia exógena . Por ejemplo, se puede introducir un vector in vivo, de tal manera que sea recuperado por una célula, dentro de cuya célula, se transcriba el vector o una porción del mismo, produciendo un ácido nucleico anti-sentido (ARN) . Este vector contendría una secuencia que codifique el ácido nucleico anti-sentido del polipéptido de sHASEGP . Este vector puede seguir siendo episomal o puede llegar a integrarse cromosómicamente , siempre que se pueda transcribir para producir el ARN anti-sentido deseado. Estos vectores se pueden construir mediante métodos de tecnología de ADN recombinante convencionales en la materia. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, u otros conocidos en la materia, utilizados para la réplica y expresión en células de mamífero. La expresión de la secuencia que codifique el ARN anti-sentido del polipéptido de sHASEGP puede ser mediante cualquier promotor conocido en este campo por actuar en células de mamífero, incluyendo de un ser humano. Estos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Estos promotores incluyen, pero no se limitan a: la región del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981)) , el promotor contenido en la repetición terminal larga 31 del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y colaboradores, Cell 22:787- 797 (1980)) , el promotor de quinasa de timidina de herpes (Wagner y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 78 : 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster y colaboradores, Nature 296:39-42 (1982)), etc. Los ácidos nucleicos anti-sentido incluyen una secuencia complementaria para cuando menos una porción de una transcripción de ARN de un gen del polipéptido de sHASEGP, incluyendo un gen del polipéptido de sHASEGP humano. No se requiere una complementariedad absoluta. La cantidad de ácido nucleico anti-sentido del polipéptido de sHASEGP que sea efectiva en el tratamiento o en la prevención de una enfermedad neoplástica depende de la naturaleza de la enfermedad, y se puede determinar empíricamente mediante técnicas clínicas convencionales . Cuando sea posible, es deseable determinar la citotoxi-cidad anti-sentido en las células in vitro, y luego en sistemas de modelos animales útiles antes de probarse y usarse en seres humanos . 2. Interferencia de ARN. Se puede emplear la interferencia de ARN (ARNi) - (ver, v.gr. , Chuang y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985), con el fin de inhibir la expresión de un gen que codifique una sHASEGP. Se pueden utilizar fragmentos de ARN de interferencia (ARNi) , en particular ARNi de doble cadena (DS) , para generar la función de pérdida de sHASEGP. Los métodos en relación con el uso de ARNi para silenciar genes en organismos, incluyendo mamíferos, C. elegans, Drosophila, y plantas, y en seres humanos, son conocidos (ver, v.gr., Fire y colaboradores (1998) Nature 391:806-811; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-363; Sharp (2001) Genes Dev. 15:485-490; Hammond y colaboradores, (2001) Nature Rev, Genet. 2:110-119; Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2:239-245; Hamilton y colaboradores (1999) Science 286:950-952; Hammond y colaboradores (2000) Nature 404:293-296; Zamore y colaboradores (2000) Cell 101:25-33; Bernstein y colaboradores (2001) Nature 409 : 363 -366 ; Elbashir y colaboradores (2001) Genes Dev. 15:188-200; Elbashir y colaboradores (2001) Nature 411:494-498; solicitud internacional PCT O 01/29058; solicitud internacional PCT WO 99/32619) . Se introducen construcciones que expresen ARN de doble cadena (ARNds) en un huésped, tal como un animal o una planta, utilizando un vector replicable que siga siendo episomal, o que se integre en el genoma . Mediante la selección de las secuencias apropiadas, la expresión del ARNds puede interferir con la acumulación del ARNm endógeno que codifique una sHASEGP . También se puede utilizar el ARNi para inhibir la expresión in vitro. Se utilizan regiones que incluyan cuando menos aproximadamente 21 (o 21) nucleótidos que sean selectivos (es decir, únicos) para la sHASEGP, con el fin de preparar el ARNi. Los fragmentos más pequeños de aproximadamente 21 nucleótidos se pueden transformar directamente (es decir, in vitro o in vivo) en las células; las moléculas de ARNds de ARNi más grandes se introducen en general utilizando vectores que las codifiquen. Las moléculas de ARNds son de cuando menos aproximadamente 21 pares de bases de largo, o más largas, tal como de 50, 100, 150, 200, y más largas. Los métodos, reactivos, y protocolos para introducir moléculas de ácidos nucleicos en las células in vitro e in vivo son conocidos por los técnicos en la materia. 3. Terapia génica en una forma de realización de ejemplo, se administran ácidos nucleicos que incluyan una secuencia de nucleótidos que codifiquen un polipéptido de sHASEGP, o los dominios funcionales o derivados del mismo, para promover la función del polipéptido de sHASEGP, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia que se lleva a cabo mediante la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En esta forma de realización, el ácido nucleico produce su proteína codificada que media un efecto terapéutico mediante la promoción de la función del polipéptido de sHASEGP. Se puede emplear cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la materia (ver, Goldspiel y colaboradores, Clinícal Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy 3 : 87 - 95 (1991); Tolstos-hev, An. Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, An. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIBTECH 11 5:155-215 (1993)). Por ejemplo, una composición terapéutica para terapia génica incluye un ácido nucleico que codifique el polipéptido de sHASEGP, que es parte de un vector de expresión que expresa un polipéptido de sHASEGP, o un dominio, fragmento, o proteína quimérica del mismo, en un huésped adecuado. En particular, este ácido nucleico tiene un promotor operativamente enlazado a la región codificante del polipéptido de sHASEGP, siendo este promotor inducible o constitutivo, y opcionalmente , específico del tejido. En otra forma de realización particular, se utiliza una molécula de ácido nucleico en donde las secuencias de codificación del polipeptido de sHASEGP y cualesquiera otras secuencias deseadas estén flanqueadas por regiones que promuevan la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, proporcionando de esta manera la expresión intracromosomica del ácido nucleico de la proteína sHASEGP (Koller y Smithies, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra y colaboradores, Nature 342:435-438 (1989) ) . El suministro del ácido nucleico a un paciente puede ser directo, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o al vector que lleve el ácido nucleico, o indirecto, en cuyo caso primero se transforman las células con el ácido nucleico in vi tro, y luego se trasplantan al paciente. Estos dos planteamientos se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo. En una forma de realización específica, el ácido nucleico se administra directamente in vivo, en donde se expresa para producir el producto codificado. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos en este campo, v.gr., mediante su construcción como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado, y su administración de tal manera que llegue a ser intracelular, v.gr., mediante infección utilizando un vector retroviral u otro vector viral defectuoso o atenuado (ver la patente US 4,980,286), o mediante inyección directa del ADN desnudo, o mediante la utilización de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una bomba de genes; Biolistic, Dupont) , o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes transfectantes , encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas , o mediante su administración enlazado a un péptido que se sepa que entra al núcleo, mediante su administración enlazado a un ligando sujeto a endocitosis mediada por el receptor (ver, v.gr., Wu y Wu, J". Biol . Che . 262:4429-4432 (1987)) (el cual se puede utilizar para dirigir tipos de células que expresen específicamente los receptores) , etc. En otra forma de realización, se puede formar un complejo de ácido nucleico- ligando , en donde el ligando sea un péptido viral fusogénico para alterar endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En todavía otra forma de realización, el ácido nucleico se puede dirigir in vivo para la recuperación y expresión específica de la célula, mediante la dirección de un receptor específico (ver, por ejemplo, las publicaciones internacionales PCT WO 92/06180 fechada el 16 de abril de 1992 (Wu y colaboradores) ; WO 92/22635 fechada el 23 de diciembre de 1992 (Wilson y colaboradores) ; WO 92/20316 fechada el 26 de noviembre de 1992 (Findeis y colaboradores) ; WO 93/14188 fechada el 22 de julio de 1993 (Clarke y colaboradores) ; WO 93/20221 fechada el 14 de octubre de 1993 (Young) ) . De una manera alternativa, el ácido nucleico se puede introducir intracelular-mente, y se puede incorporar en el ADN de la célula huésped para su expresión, mediante recombinación homologa (Koller y Smithies, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86:8932-8935 (1989), Zijistra y colaboradores, Nature 342:435-438 (1989)). En una forma de realización específica, se utiliza un vector viral que contenga al ácido nucleico del polipéptido de sHASEGP . Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (ver Miller y colaboradores, Meth. Enzymol . 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales se han modificado para suprimir las secuencias retrovirales que no sean necesarias para empacar el genoma viral e integrarse en el ADN de la célula huésped. El ácido nucleico del polipéptido de sHASEGP que se va a utilizar en la terapia génica se clona en el vector, lo cual facilita el suministro del gen a un paciente. Se puede encontrar mayor detalle acerca de los vectores retrovirales en Boesen y colaboradores, Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdrl a células madre hematopoiéticas , con el objeto de hacer que las células madre es sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes y colaboradores, J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem y colaboradores, Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Teraphy 4:129-141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden utilizar en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan naturalmente el epitelio respiratorio, en donde provocan una enfermedad leve. Otros objetivos para los sistemas de suministro basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endote-liales, y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar a las células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Current Opinión in Genetics and Developwent 3:499-503 (1993) presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout y colaboradores, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) , demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de macacos Rhesus . Otros casos del uso de adenovirus en la terapia génica se pueden encontrar en Rosenfeld y colaboradores, Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld y colaboradores, Cell 68:143-155 (1992); y Mastrangeli y colaboradores, J". Clin. Invest. 91:225-234 (1993). También se ha propuesto el virus adeno-asociado (AAV) para utilizarse en la terapia génica (Walsh y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . Exp. Biol . Med. 204:289-300 (1993)). Otro planteamiento para la terapia génica involucra transferir un gen a las células en un cultivo de tejido, mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, o infección viral. Usualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Luego se ponen las células bajo selección para aislar las células que hayan recuperado y estén expresando el gen transferido. Entonces se suministran estas células a un paciente. En esta forma de realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Esta introducción se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en este campo, incluyendo, pero no limitándose a, transíección, electroporación, microinyección, infección con un vector de bacteriófago o viral que contenga las secuencias de ácidos nucleicos, fusión celular, transferencia genética mediada por el cromosoma, transferencia genética mediada por microcélulas , fusión de esferoplastos , etc. Se conocen numerosas técnicas en la materia para la introducción de genes extraños en células (ver, por ejemplo, Loeffler y Behr, Meth. Enzymol . 217:599-618 (1993); Cohén y colaboradores, Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac . Ther. 29:69-92 (1985)), y se pueden utilizar, en el entendido de que no se alteren las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras. La técnica proporcionaría la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de tal manera que el ácido nucleico pueda ser expresado por la célula y sea en general heredable y expresable por su progenie celular. Las células recombinantes resultantes se pueden suministrar a un paciente mediante diferentes métodos conocidos en la materia. En una forma de realización, se inyectan células epiteliales, v.gr., subcutáneamente. En otra forma de realización, se pueden aplicar células de piel recombinantes como un injerto de piel al paciente. Se pueden administrar células sanguíneos recombinantes (v.gr., células madre hematopoiéticas o progenitoras) intravenosamente. La cantidad de células previstas para utilizarse depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc., y puede ser determinada por un técnico en la materia . Las células en las que se puede introducir un ácido nucleico para los propósitos de la terapia génica abarcan cualquier tipo de célula disponible deseado, e incluyen, pero no se limitan a, células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos , fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos , granulocitos ; diferentes células madre o progenitoras, en particular células madre hematopoiéticas o progenitoras, v.gr., tales como células madre obtenidas de médula ósea, de sangre de cordón umbilical, de sangre periférica, de hígado fetal, y de otras f entes. Por ejemplo, una célula utilizada para la terapia génica es autóloga para el paciente. En una forma de realización en donde se utilizan células recombinantes en la terapia génica, se introduce un ácido nucleico del polipéptido de sHASEGP en las células, de tal manera que pueda ser expresado por las células o su progenie, y luego se administran las células recombinantes in vivo para el efecto terapéutico. En una forma de realización especifica, se utilizan células madre o progenitoras. De conformidad con esta forma de realización, se pueden utilizar potencialmente cualesquiera células madre y/o progenitoras que se puedan aislar y mantener in vitro. Estas células madre incluyen, pero no se limitan a, células madre hematopoiéticas (HSC) , células madre de tejidos epiteliales, tales como piel y el revestimiento del intestino, células musculares de corazón embriónico, células madre de hígado (publicación internacional PCT WO 94/08598, fechada el 28 de abril de 1994), y células madre neurales (Stemple y Anderson, Cell 71 : 973-985 (1992) ) . Las células madre epiteliales (ESC) o los queratinoci-tos, se pueden obtener a partir de tejidos tales como la piel y el revestimiento del intestino mediante procedimientos conocidos (Rheinwald, Meth. Cell Bio . 21A:229 (1980)). En el tejido epitelial estratificado, tal como la piel, se presenta la renovación mediante mitosis de las células madre dentro de la capa germinal, la capa más cercana a la lámina basal . Las células madre dentro del revestimiento del intestino proporcionan una rápida velocidad de renovación de este tejido. Las células madre epiteliales o los queratinocitos obtenidos de la piel o del revestimiento del intestino de un paciente o donador, se pueden cultivar en un cultivo de te ido (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); Pittelkow y Scott, Cano. Clinic Proc . 61:771 (1986) ) . Si las células madre epiteliales son proporcionadas por un donador, también se puede emplear un método para suprimir la reactividad del injerto contra el huésped (por ejemplo, irradiación, administración de fármaco o anticuerpo para promover una inmunosupresión moderada) . Con respecto a las células madre hematopoiéticas (HSC) , se puede emplear cualquier técnica que proporcione el aislamiento, la propagación, y el mantenimiento in vítro de las células madre hematopoiéticas en esta forma de realización. Las técnicas mediante las cuales se puede llevar a cabo esto incluyen: (a) el aislamiento y establecimiento de cultivos de células madre hematopoiéticas a partir de células de médula ósea aisladas del huésped futuro, o de un donador, o (b) el uso de cultivos de células madre hematopoiéticas a largo plazo previamente establecidos, los cuales pueden ser alergénicos o xenogénicos. Las HSC no autólogas se utilizan con un método para suprimir las reacciones inmunes al trasplante del huésped futuro/paciente. En una forma de realización particular, las células de médula ósea humanas se pueden obtener a partir de la cresta ilíaca posterior mediante aspiración aguja (ver, v.gr., Kodo y colaboradores, J. Clin. Invest. 73:1377-1384 (1984)). Por ejemplo, las HSC se pueden hacer altamente enriquecidas, o en una forma sustancialmente pura. Este enriquecimiento se puede llevar a cabo antes, durante, o después del cultivo de largo plazo, y se puede hacer mediante cualesquiera técnicas conocidas en este campo. Se pueden establecer cultivos de largo plazo de células de médula ósea, y se pueden mantener utilizando, por ejemplo, técnicas de cultivo celular de Dexter modificadas (Dexter y colaboradores, J. Cell Physiol . 91:335 (1977)), o las técnicas de cultivo de Witlock-Witte (Witlock y Witte, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 79:3608-3612 (1982)). En una forma de realización específica, el ácido nucleico que se vaya a introducir para los propósitos de la terapia génica incluye un promotor inducible operativamente enlazado a la región codificante, de tal manera que se pueda controlar la expresión del ácido nucleico mediante el control de la presencia o ausencia del inductor apropiado de la transcripción . 3. Profármacos. Se proporciona un método para el tratamiento de tumores. El método se practica mediante la administración de un profármaco que se disocia en un sitio específico mediante una sHASEGP para liberar un fármaco activo o precursor que pueda ser convertido en el fármaco activo in vivo. Después del contacto con una célula que exprese la actividad de sHASEGP, el profármaco se convierte en un fármaco activo. El profármaco puede ser un conjugado que contenga al agente activo, tal como un fármaco antitumoral, tal como un agente citotóxico, u otro agente terapéutico (TA) , enlazado a un sustrato para la sHASEGP objetiva, de tal manera que el fármaco o el agente sea inactivo o incapaz de entrar a una célula, en el conjugado, pero que se active después de la disociación. El profármaco, por ejemplo, puede contener una molécula de sulfato de condroitina, típicamente una relativamente corta, de menos de aproximadamente 20 Unidades de disacárido, que se disocie catalíticamente mediante la sHASEGP objetiva. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, agentes antiprolifera-tivos, y agentes de enlace de tubulina. Otros incluyen fármacos vinca, mitomicina, bleomicinas, y taxanos . J. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MODOS DE ADMINISTRACIÓN 1. Componentes de las composiciones En la presente se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen una sHASEGP activa. También se proporcionan combinaciones de compuestos que modulan la actividad de un polipéptido de sHASEGP y otro tratamiento o compuesto para el tratamiento de un trastorno de hialuronidasa , tal como un compuesto de anticuerpo. El polipéptido de sHASEGP y un segundo agente, se pueden empacar como composiciones separadas para administrarse juntas o en secuencia o de una manera intermitente. De una forma alternativa, se pueden proporcionar como una sola composición para la administración, o como dos composiciones para administrarse como una sola composición. Las combinaciones se pueden empacar como kits terapéuticos. 2. Formulaciones y vía de administración Los polipéptidos de sHASEGP y el dominio de hialuroni-dasa humano soluble de los mismos, proporcionados en la presente, se pueden formular como composiciones farmacéuticas, normalmente para administrarse en una sola dosificación. Las concentraciones de los polipéptidos en las formulaciones son efectivas para el suministro de una cantidad, después de la administración, que sea efectiva para el tratamiento pretendido. Normalmente, las composiciones se formulan para una administración de una sola dosificación. Con el fin de formular una composición, la fracción en peso de un polipéptido de sHASEGP, dominios de hialuronidasa humanos solubles del mismo, o mezcla del mismo, se disuelve, se suspende, se dispersa, o se mezcla de otra manera en un vehículo seleccionado, en una concentración efectiva, de tal manera que se alivie o se reduzca la condición tratada. Los portadores o vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de la sHASEGP o de los dominios de hialuronidasa humanos solubles de la misma, proporcionados en la presente, incluyen cualesquiera vehículos conocidos por los técnicos en la materia como adecuados para el modo de administración particular. Además, los polipéptidos se pueden formular como el único ingrediente farmacéuticamente activo en la composición, o se pueden combinar con otros ingredientes activos. Las suspensiones liposomales, incluyendo los liposomas dirigidos al tejido, también pueden ser adecuadas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstas se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por los técnicos en este campo. Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar como se describe en la patente US 4,522,811. La sHASEGP activa o el dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, se incluye en el vehículo farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. La concentración terapéuticamente efectiva se puede determinar de una manera empírica probando los polipéptidos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, tal como mediante la utilización de los ensayos proporcionados en la presente, o ver, por ejemplo, Taliani y colaboradores (1996) Anal. Biochem. 240:60-67, Filocamo y colaboradores (1997) J". Virology 71 : 1417 - 1427 , Sudo y colaboradores (1996) Antiviral Res. 32:9-18, Buffard y colaboradores (1995) Virology 209 : 52-59, Bianchi y colaboradores (1996) Anal. Biochem. 237:239-244, Hamatake y colaboradores (1996) Intervirology 39:249-258, Steinkühler y colaboradores (1998) Biochem. 37:8899-8905, D'Souza y colaboradores (1995) J. Gen. Virol. 76:1729-1736, Takeshita y colaboradores (1997) Anal. Biochem. 247:242-246; ver también, por ejemplo, Shimizu y colaboradores (1994) J". Virol. 68:8406-8408; Mizutani y colaboradores (1996) J. Virol. 70:7219-7223, Mizutani y colaboradores (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:822-826, Lu y colaboradores (1996) Proc . Nati. Acad.
Sci . (USA) 93:1412-1417, Hahm y colaboradores (1996) Virology 226:318-326, Ito y colaboradores (1996) J. Gen. Virol . 77:1043-1054, Mizutani y colaboradores (1995) Biochem. Biophys . Res. Commun. 212:906-911, Cho y colaboradores (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207, y luego se extrapola a partir de los mismos para las dosificaciones para seres humanos. Típicamente se contempla una dosificación terapéuticamente efectiva. Las cantidades administradas pueden ser del orden de 0.001 a 1 mg/ml, incluyendo de aproximadamente 0.005-0.05 mg/ml , y aproximadamente 0.01 mg/ml del volumen de sangre. Las formas unitarias de dosificación farmacéutica se preparan para proporcionar de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1,000 mg, incluyendo de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 mg, e incluyendo de aproximadamente 25-75 mg del ingrediente activo esencial, o una combinación de ingredientes esenciales, por forma unitaria de dosificación. La dosificación precisa se puede determinar de una manera empírica. En algunos casos, es preferible una dosis unitaria alta de la sHASEGP humana. Por ejemplo, con la administración intravenosa de sHASEGP, son preferibles las concentraciones de sHASEGP de 500-100,000 Unidades por mi. Las formulaciones liofilizadas de sHASEGP también son ideales para el almacenamiento de dosis unitarias grandes de sHASEGP. Se contemplan frascos liofilizados de 200,000 Unidades de sHASEGP para el suministro intravenoso .
También se contemplan dosis de alta concentración para el suministro de volúmenes pequeños de sHASEGP . Se contempla la administración de 10-100 ul de 5,000 Unidades/ml de sHASEGP para inyección en la cámara anterior, para disolver las sustancias viscoelásticas previamente administradas durante las cirugías de cataratas y de implantación de lentes intraoculares fácicos. También se contemplan las inyecciones de volumen pequeño de dosis de 50-200 U/ml para los procedimientos intravítreos , tales como el tratamiento de hemorragia vitrea o separación vitro-retinal en la retinopatía diabética. Inyecciones de volumen un tanto mayor (v.gr. , entre alrededor de uno a varios mi, o mas) se contemplan para espacios un tanto mas grandes y/o mas fácilmente drenados dentro del cuerpo. Por ejemplo, como se ilustra en la presente, inyecciones periorbitales de uno a varios mi o mas se pueden hacer dentro de uno o mas espacios rodeando al ojo, v.gr., por inyección dentro del espacio del sub-tenón o episcleral, de manera que se promueva el suministro transcleral de agentes farmacológicos a tejidos en la parte trasera del ojo tal como el plexus coroideal y/o retina. Como se apreciará por los técnicos en la materia, algunos espacios dentro del cuerpo pueden fácilmente acomodar volúmenes mas grandes. A manera de ilustración, el espacio episcleral o de sub-tenón alrededor del ojo puede fácilmente acomodar uno a varios mi o volúmenes aun mas grandes (v.gr. , hasta o mayores que 5 a 10 mi, dependiendo, por ejemplo, en las características del te ido particular y la tasa a la cual se entrega el volumen) . Además, como se describe e ilustra en la presente, parece que la introducción de una sHASEGP (potencialmente en combinación con uno o mas agentes farmacológicos u otros adicionales) en un volumen mas grande puede usarse para adicio-nalmente impulsar el suministro de agentes a sitios objetivo deseados dentro del cuerpo. Sin restringirse a un mecanismo de acción particular, se cree que tales inyecciones de volumen mas grande pueden adicionalmente impulsar la permeación o esparcimiento de tanto sHASEGP así como otros agentes presentes en el tejido tratado por un proceso de transporte convectivo que se promueve por un diferencial de presión incrementado. De nuevo, sin desear restringirse por un mecanismo de acción particular, se cree que tal un diferencial de presión incrementado puede llevarse a punto en el contexto de la presente invención mediante, ínter alia, uno o ambos de los siguientes: (i) una presión de impulso elevada o "cabezal de presión" elevado (v.gr., ocasionado por presión hidrostática incrementada asociada con una inyección que mayormente llena o un tanto sobre-llena o distiende un espacio o sitio de inyección) ; y (ii) una presión corriente abajo reducida o "impedancia" reducida (v.gr., ocasionada por la abertura de canales en la matriz intersticial asociada con actividad de hialuronidasa localizada y degradación consecuente de hialuronano relativamente hidratado) . Hialuronidasas preferidas para uso en esta y otras aplicaciones de la presente invención (tal como facilitar el suministro de agentes farmacológicos y otros) son sHASEGPs, particularmente sHASEGPs humanas en el contexto de suministro de agentes a uno o mas tejidos en el cuerpo humano. Sin embargo, este y otros enfoques al uso y aplicación de hialuronidasas también se pueden aplicar usando sHASEGPs no humanas, tales como sHASEGPs de mamíferos, así como otras hialuronidasas humanas y de mamíferos, de preferencia formas solubles de tales hialuronidasas. El ingrediente activo se puede administrar todo a la vez, o se puede dividir en un número de dosis más pequeñas para administrarse a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento es una función de la enfermedad que se esté tratando, y se puede determinar empíricamente empleando protocolos de prueba conocidos, o mediante extrapolación a partir de los datos de prueba in vivo o in vi tro. Se debe observar que las concentraciones y los valores de dosificación también se pueden variar con la exactitud de la condición que se vaya a aliviar. Se debe entender además que, para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajusfar a través del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administre o que supervise la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración estipulados en la presente son solamente un ejemplo, y no pretenden limitarse el alcance o uso de las composiciones reivindicadas y las combina- ciones que las contienen. Los derivados farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos, sales, esteres, hidratos, solvatos, y formas de profármaco. El derivado normalmente se selecciona de tal manera que sus propiedades farmacocinéticas sean superiores a la sHASEGP neutra correspondiente o su dominio de hialuronidasa humano soluble. Por consiguiente, se mezclan concentraciones o cantidades efectivas de uno o más de los polipéptidos de la presente, o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, con un portador o vehículo farmacéutico adecuado para administración sistémica, tópica, o local, para formar las composiciones farmacéuticas. Los polipéptidos de sHASEGP o los dominios de hialuronidasa humanos solubles de los mismos se incluyen en una cantidad efectiva para disminuir o tratar el trastorno para el cual se contempla el tratamiento. La concentración del polipépti-do activo en la composición depende de las velocidades de absorción, inactivación, excreción del polipéptido activo, del programa de dosificación, de la cantidad administrada, de la formulación particular, así como de otros factores conocidos por los técnicos en este campo. Los agentes terapéuticos para utilizarse en los métodos se pueden administrar mediante cualquier vía conocida por los técnicos en la materia, tal como, pero no limitándose a, tópicamente, intra-articularmente , intracisternamente , intraocu-larmente, intraventricularmente , intratecalmente , intravenosamen- te, intramuscularmente , intraperitonealmente , intradérmicamente , subcutáneamente, intratraquealmente , así como mediante cualquier combinación de cualesquiera dos o más de las mismas. También se prevén formulaciones pulmonares en polvo seco. La vía de administración más adecuada variará dependiendo del uso propuesto, tal como, por ejemplo, el uso como un agente de suministro para facilitar el suministro subcutáneo de fluidos, el uso para reducir la presión intraocular en los ojos de los pacientes de glaucoma que reciban viscoelásticos , o el uso como un "agente de extensión" para mejorar la actividad de los productos quimioterapéuticos , y la localización de interés, tal como un órgano interno particular, un crecimiento tumoral , una cavidad intraocular, y la epidermis. Los modos de administración incluyen, pero no se limitan a, tópicamente, localmente, intra-articularmente , intracisternamente , intraocularmente , intraven-tricularmente , intratecalmente , intravenosamente, intramuscularmente, intratraquealmente, intraperitonealmente, intradérmicamente, subcutáneamente y mediante una combinación de cualesquiera dos o más de las mismas. Por ejemplo, para el tratamiento de diferentes cánceres, tales como el carcinoma de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de vejiga urinaria, y cáncer gastrointestinal, la administración local, incluyendo la administración al sitio del crecimiento tumoral (v.gr., intratecalmente, intraventricularmente , o intracisternamente) proporciona la ventaja de que el agente terapéutico se puede administrar en una alta concentración sin el riesgo de las complicaciones que pueden acompañar a la administración sistémica de un agente terapéutico . Como una clase ejemplar de agentes farmacológicos que se pueden combinar con sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) (v.gr., combinarse por co- formulación con una o mas sHASEGPs o por co-administración con una o mas sHASEGPs (las cuales se pueden administrar previo a, coincidentemente con o siguiendo a la administración del agente) ) , un número de agentes teniendo efectividad o efectividad potencial en el tratamiento de varios cánceres han sido descritas en la materia, y agentes anti-cáncer novedosos son regularmente siendo desarrollados los cuales de manera similar pueden combinarse con una o mas sHASEGPs (v.gr., proporcionarse por co- formulación o por co-administración antes, coincidentemente con y/o siguiendo la administración del agente) para mejorar la farmacocinética , farmacodinámica u otras propiedades útiles del agente. A manera de ilustración (y sin limitación) un número de agentes anti-cáncer o quimioterapéuticos han sido ahora aprobados para el tratamiento de varios cánceres los cuales se pueden combinar con sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) mediante co- formulación o co-administración (antes de, coincidentes con o después de administración del agente anti-cáncer) . Tales agentes incluyen, por ejemplo, Aldesleucinas (v.gr., PROLEUKIN) ; Alemtuzumabs (v.gr., CAMPATH) ; Alitretinoínas (v.gr., PANRETIN) ; Alopurinoles (v.gr., ZYLOPRIM) ; Altretaminas (v.gr., HEXALEN) ; Amifostinas (v.gr., ETHYOL) ; Anastrozolas (v.gr., ARIMIDEX) ; Trióxidos de Arsénico (v.gr., TRISENOX) ; Asparaginasas (v.gr., ELSPAR) ; BCG Live (v.gr., TICE BCG) ; Bexarotenos (v.gr., TARGRETIN) ; Bleomicinas (v.gr. , BLENOXANE) ; Busulfano intravenoso (v.gr., BUSULFEX) ; Busulfanos orales (v.gr., YLERA ) ; Calustero-nas (v.gr., METHOSARB) ; Capecitabinas (v.gr., XELODA) ; Carbopla-tinas (v.gr., PARAPLATIN) ; Carmustinas (v.gr., BCNU, BiCNU) ; Carmustinas con Polifeprosanos (v.gr. , GLIADEL Wafer) ; Celecoxibs (v.gr., CELEBREX) ; Clorambucilos (v.gr., LEUKERAN) ; Cisplatinas (v.gr., PLATINOL) ; Cladribinas (v.gr., LEUSTATIN, 2-CdA); Ciclofosfamidas (v.gr., CYTOXAN, NEOSAR) ; Citarabinas (v.gr., CYTOSAR-U) ; liposomales de Citarabina (v.gr., DepoCyt) ; Dacarba-zinas (v.gr., DTIC-Dome) ; Dactinomicinas (v.gr., COSMEGEN) ; Darbepoetinas Alfas (v.gr., ARANESP) ; liposomales de Daunorubici-na (v.gr., DANUOXOME) ; Daunorubicinas/Daunomicinas (v.gr., CERUBIDINE) ; Denileucina Diftitoxas (v.gr., ONTAK) ; Dexrazoxanos (v.gr., ZINECARD) ; Docetaxeles (v.gr., TAXOTERE) ; Doxorubicinas (v.gr., ADRLA YCIN, RUBEX) ; liposomales de Doxorubicina (v.gr., DOXIL) ; propionatos de Dromostanolona (v.gr., DROMOSTA OLONE e Ineycción de MASTERONE) ; Soluciones de Elliott B(v.gr., Elliot 's B Solution) ; Epirubicinas (v.gr., ELLENCE) ; Epoetinas alfas (v.gr., EPOGEN) ; Estramustinas (v.gr., EMCYT) ; fosfatos de Etopósido (v.gr., ETOPOPHOS) ; Etopósido VP-16s (v.gr., VEPESID) ; Exemestanos (v.gr., AROMASIN) ; Filgrastimas (v.gr., NEUPOGEN) ; Floxuridinas (v.gr., FUDR) ; Fludarabinas (v.gr., FLUDARA) ; Fluorouracilos incluyendo 5-FUs (v.gr., ADRUCIL) ; Fulvestrantos (v.gr., FASLODEX) ; Gemcitabinas (v.gr., GEMZAR) ; Gemtuzu-mabs/Ozogamicinas (v.gr., MYLOTARG) ; acetatos de Goserelina (v.gr., ZOLADEX) ; Hidroxiureas (v.gr., HYDREA) ; Ibritumo-mabs/Tiuxetanos (v.gr., ZEVALIN) ; Idarubicinas (v.gr., IDAMYCIN) ; Ifosfamides (v.gr., IFEX) ; mesilatos de Imatinib (v.gr., GLEEVEC) ; Interferon alfa-2as (v.gr., ROFERON-A) ; Interferon alfa-2bs (v.gr., INTRON A) ; Irinotecanos (v.gr., CAMPTOSAR) ; Letrozolas (v.gr., FEMARA); Leucovorinas (v.gr., WELLCOVORIN, LEUCOVORIN) ; Levamisolas (v.gr., ERGAMISOLTM) ; Lomustinas/CCNUs (v.gr., CeeBU) ; Mecloretaminas/mostazas de Nitrógeno (v.gr., MUSTARGEN) ; acetatos de Megestrol (v.gr., MEGACE) ; Melfalanos/L-PAMs (v.gr., ALKERAN) ; Mercaptopurina incluyendo 6-MPs (v.gr., PURINETHOL) ; Mesnas (v.gr., MESNEX) ; Metotrexatos ; Metoxsalenos (v.gr., UVADEX) ; Mitomicina Cs (v.gr., MUTAMYCIN, MITOZYTREX) ; Mitotanos (v.gr., LYSODREN) ; Mitoxantronas (v.gr., NOVANTRONE) ; Fenpropionatos de Nandrolona (v.gr., DURABOLIN- 50 ) ; Nofetumomabs (v.gr., VERLUMA) ; Oprelvecinas (v.gr., NEUMEGA) ; Oxaliplatinas (v.gr., ELOXATIN) ; Paclitaxeles (v.gr., PAXENE, TAXOL) ; Pamidro-natos (v.gr., AREDIA) ; Pegademasas (v.gr., ADAGEN); Pegaspargasas (v.gr., ONCASPAR) ; Pegfilgrastimas (v.gr., NEULASTA) ; Pentostati-nas (v.gr., NIPENT) ; Pipobromanos (v.gr., VERCYTE) ; Plicamici-na/Mitramicinas (v.gr., MITHRACIN) ; sodios de Porfímero (v.gr., PHOTOFRIN) ; Procarbazinas (v.gr., MATULANE) ; Quinacrinas (v.gr., ATABRINE) ; Rasburicasas (v.gr., ELITEK) ; Rituximabs (v.gr. , RITUXAN) ; Sargramos imas (v.gr., PROKINE) ; Estreptozocinas (v.gr., ZA OSAR) ; Talcos (v.gr., SCLEROSOL) ; Tamoxifenos (v.gr., NOLVADEX) ; Temozolomidas (v.gr., TEMODAR) ; Tenipósidos/VM-26s (v.gr., VUMON) ; Testolactonas (v.gr., TESLAC) ; Tioguaninas incluyendo 6-TG; Tiotepas (v.gr., THIOPLEX) ; Topotecanos (v.gr., HYCAMTIN) ; Toremifenos (v.gr., FARESTON) ; Tositumomabs (v.gr., BEXXAR) ; Trastuzumabs (v.gr., HERCEPTIN) ; Tretinoinas/ATRA (v.gr., VESANOID) ; Mostazas de Uracilo; Valrubicinas (v.gr., VALSTAR) ; Vinblastinas (v.gr., VELBAN) ; Vincristinas (v.gr., ONCOVIN) ; Vinorelbinas (v.gr., NAVELBINA) ; Zoledronatos (v.gr., ZOMETA) ; así como otros agentes descritos en la presente y en la materia . Como con otras clases de agentes farmacológicos descritos en la presente, una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) puede usarse en conjunto con la administración de (o co-formularse con) un agente farmacológico individual (tal como un anti -neoplástico para propósitos de ilustración, o con un miembro de otra clase de agentes como se describe en la presente y/o se conoce en la materia) . Alternativamente, una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) puede usarse en conjunto con la administración de (o co- formularse con) mas de un agente farmacológico o una clase dada (tal como múltiples agentes anti -neoplásticos para propósitos de ilustración, o múltiples miembros de otras clases de agentes como se describe en la presente y/o se conoce en la materia) . En el caso de combinaciones con dos o mas agentes de una clase dada, frecuentemente se prefiere que los dos o mas agentes actúen por dos o mas diferentes mecanismos de acción. Una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) puede también usarse en conjunto con la administración de (o co- formularse con) un agente farmacológico de una primera clase dada (tal como un antineoplástico para propósitos de ilustración, o un miembro de una o mas de las otras clases de agentes como se describen en la presente y/o se conocen en la materia) , y uno o mas agentes farmacológicos adicionales de una o mas diferentes clases que son útiles para tratar cualquiera de una variedad de condiciones. Aunque ciertos principios son por consiguiente referidos en la presente en el caso de agentes anti-cáncer para propósitos de ilustración, estos principios también son aplicables a, por ejemplo, anti - infectivos y los miembros numerosos de otras clases de agentes que se describen e ilustran en la presente, así como agentes adicionales que ya se conocen en la materia o que son recientemente desarrollados. En el caso de cualquiera de las combinaciones y/o co-formulaciones descritas en la presente (comprendiendo por lo menos una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) y por lo menos un otro agente (tal como un agente farmacológico, v.gr. , un miembro de una de las clases de agentes ilustradas en la presente) ) , se contempla que tal combinación y/o co- formulación pueda además comprender uno o mas agentes (tal como varios estabilizantes, excipientes y similares ) que no ejercen por si mismos efectos farmacodinámicos sustanciales pero que promueven la utilidad de la combinación y/o co- formulación (v.gr., mediante estabilizar uno o mas de los componentes o una formulación entera, mediante ayudar a promover o apuntar a la actividad de uno o mas de los agentes o de la sHASEGP, y/o mediante reducir la toxicidad o de otra manera mejorar el perfil de seguridad de la combinación o co- formulación . Como se apreciará por los técnicos en la materia, nuevas versiones y formulaciones de estos y otros agentes anti-cáncer (así como miembros de otras clases de agentes como se describe en la presente) están siendo regularmente desarrollados los cuales pueden de manera similar combinarse con sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) . Mas aun, dado que tales enzimas se pueden usar para mejorar los perfiles farmacocinéticos y/o farmacodinámicos de una gran variedad de agentes, y permiten que agentes se suministren por diferentes (y potencialmente mas dirigidas) rutas, por ejemplo, sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) pueden usarse para mejorar los perfiles PK y/o PD de un número de agentes previamente considerados por tener perfiles sub-óptimos. La prueba de agentes en modelos animales apropiados con y sin sHASEGP concomitante puede usarse para evaluar la efectividad relativa y toxicidad de agentes particulares. Como se ilustra y ejemplifica en la presente, un número de agentes de moléculas grandes (tales como anticuerpos y otras proteínas, particularmente aquellos administrados por inyección parenteral no IV) , exhiben perfiles farmacocinéticos relativamente pobres y pueden ser particularmente mejorados por co- formulación o co-administración con sHASEGPs (u otras glicosaminoglica-nasas) . Sin restringirse a un mecanismo de acción particular, generalmente se considera que agentes de moléculas pequeñas exhibiendo hidrofobia relativamente baja son dispersables de manera mas efectiva mediante, v.gr., transporte convectivo dentro de fluidos intersticiales como se puede promover por sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) . Un método comúnmente usado para predecir tales atributos es evaluar los coeficientes de partición octanol: agua calculados y/o estimados (Kow) los cuales han sido reportados para un número de compuestos. En ese respecto, agentes exhibiendo log Kow de <3, mas preferentemente <2 o <1, mas preferentemente <0, aun mas preferentemente <(-l) . Como se apreciará por los técnicos en la materia, muchos agentes puede también modificarse de manera covalente y/o no covalente para incrementar su hidrofobia, y/o para abarcar tales agentes dentro de vesículas o complejos macromoleculares para facilitar su permeación y/o suministro. Para propósitos de ilustración adicional (y sin limitación) , agentes farmacológicos anti-cáncer o quimioterapéu-ticos ejemplares que se pueden combinar con sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) se incluyen en la siguiente lista (y otros son conocidos en la materia) : Acivicinas; Aclarubicinas ; Acodazolas; Acronines; Adozelesinas ; Aldesleucinas ; Alitreninoi-nas (Ácidos 9-Cis-Retinoicos) ; Altretaminas ; Alvocidibs; Ambazonas; Ambomicinas; Ametantrones ; Aminoglutetimidas ; Amsacrinas ; Anastrozolas ; Anaxironas; Ancitabinas ; Antramicinas ; Apaziquones ; Argimesinas; Asparaginasas ; Asperlinas; Atrimusti-nas; Azacitidinas ; Azetepas; Azotomicinas ; Banoxantronas ; Batabulinas ; Batimastatos ; Benaxibinas ; Bendamustinas ; Benzode-pas; Bexarotenos; Bicalutamidas ; Bietaserpinas ; Biricodaros ; Bisantrenos ; Bisantrenas ; Dimesilatos de Bisnafida; Bizelesinas; Bleomicinas; Bortezomibs; Brequinaros; Bropiriminas ; Budotitanos; Busulfanos; Cactinomicinas ; Calusteronas ; Canertinibs; Capecita-binas; Caracemidas; Carbetímeros ; Carboplatinas ; Carboquonas; Carmofuros; Carmustinas; Carubicinas; Carzelesinas ; Cedefingoles ; Cemadotinas; Clorambucilos ; Cioteronelos ; Cirolemicinas ; Cisplatinas; Cladribinas; Clanfénuros; Clofarabinas ; Crisnatolas; Ciclofosfamidas ; Citarabinas; Dacarbazinas ; Dactinomicinas ; Daunorubicinas ; Decitabinas; Dexniguldipinas ; Dexormaplatinas ; Dezaguaninas ; Diaziquonas ; Dibrospidiums; Dienogestos; Dinalinas; Disermolidas ; Docetaxeles; Dofequidaros ; Doxifluridinas ; Doxorubicinas ; Droloxifenos ; Propionatos de Dromostanolona ; Duazomicinas ; Ecomustinas; Edatrexatos; Edotecarinas ; Eflorniti-nas; Elacrídaros; Elinafidas; Elsamitrucinas ; Emitéfuros; Enloplatinas ; Enpromatos; Enzastaurinas ; Epipropidinas ; Epirubi-cinas; Eptaloprostos ; Erbulozolas; Esorubicinas ; Estramustinas ; Etanidazolas ; Etoglúcidos; Etopósidos; Etoprinas; Exisulindos; Fadrozolas; Fazarabinas ; Fenretinidas ; Floxuridinas ; Fludarabi-nas; Fluorouracilos ; Fluoximesteronas ; Flurocitabinas ; Fosquido-nas; Fostriecinas ; Fostriecinas ; Fotretamines ; Galarubicinas ; Galocitabinas Gemcitabinas ; Geroquinoles ; Gimatecanos ; Gimeraci-los; Gloxazonas; Glufosfamidas ; Hidroxiureas ; Idarubicinas ; Ifosfamidas; Ilmofosinas; Ilomastatos ; Imexonas; Improsulfanos ; Indisulamos; Inproquonas; Interferones; Interferones Alfas; Interferones Betas; Interferones Gammas; Interleucina-2s y otras Interleucinas (incluyendo Interleucinas recombinantes) ; Intopli-cinas; Iobenguanos [131-1]; Iproplatinas ; Irinotecanos ; Irsogla-dinas; Ixabepilonas ; Cetotrexatos; L-Alanosinas ; Lanreotidos; Lapatinibos; Ledoxantroñas ; Letrozolas; Leuprolidas; Leuproreli-nas (Leuprorelidas) ; Lexacalcitoles ; Liarozolas; Lobaplatinas ; Lometrexolas ; Lomustinas; Lonafamibos ; Losoxantronas ; Lurtoteca-nos; afosfamidas ; Manosulfanos ; Marimastatos ; Masoprocoles ; Maitansinas; Mecloretaminas ; Megestroles ; Melengestroles ; Melfalanos; Menogarilos; Mepitiostanos ; Mercaptopurinas ; Metesindos; Metotrexatos ; Metomidatos; Metoprinas; Meturedepas ; iboplatinas ; Miproxifenos ; Misonidazolas ; Mitindomidas ; Mitocarcinas ; Mitocrominas ; Mitoflaxonas ; Mitogilinas; Mitoguazo-nas; Mitomalcinas ; Mitomicinas; Mitonafidas; Mitoquidonas ; Mitósperos; Mitotanos; Mitoxantronas ; Mitozolomidas ; Mivobulinas; Mizoribinas; Mofarotenos; Mopidamoles; Mubritinibos ; Ácidos Micofenólicos ; Nedaplatinas ; Nel zarabinas ; Nemorubicinas ; Nitracrinas; Nocodazolas; Nogalamicinas ; Nolatrexedos ; Nortopi- xantronas; Octreotidas ; Ormaplatinas ; Ortataxeles; Oteracilos; Oxisuranos; Oxofenarsinas ; Paclitaxeles ; Pamidronatos ; Patubilo-nas; Pegaspargasas ; Peldesinas; Peliomcinas ; Pelitrexoles ; Pemetrexedos ; Pentamustinas ; Peplomicinas ; Perfosfamidas ; Perifosinas; Picoplatinas ; Pinafidas; Pipobromanos ; Piposulfanos ; Pirfenidonas ; Piroxantronas ; Pixantronas ; Plevitrexedos ; Plicamicinas ; Plomestanos ; Plomestanos ; Porfimeros ; Porfiromici -nas; Prednimustinas ; Procarbazinas ; Propamidinas ; Prospidios; Pumitepas; Puromicinas ; Pirazofurinas ; Ranimustinas ; Riboprinas; Ritrosulfanos ; Rogletimidas ; Roquinimexos ; Rufocromomicinas ; Sabarubicinas ; Safingoles; Satraplatinas ; Sebriplatinas ; Semustinas; Simtrazenos ; Sizofiranos; Sobuzoxanas; Sorafenibos; Esparfosatos ; Ácidos Esparfósicos; Esparsomicinas ; Espirogerma-nios; Espiromustinas ; Espiroplatinas ; Espiroplatinas ; Esqualami-nas; Estreptonigrinas ; Estreptovaricinas ; Estreptozocinas ; Sufosfamidas ; Sulofenuros ; Tacedinalinas ; Talisomicinas ; Talimustinas ; Tariquidaros ; Tauromustinas ; Tecogalanos ; Tegafu-ros; Teloxantronas ; Temoporfinas ; Tenipósidos ; Teroxironas; Testolactonas; Tiamiprinas ; Tioguaninas ; Tiotepas; Tiamiprinas ; Tiazofurinas ; Tilomisolas ; Tiloronas; Timcodaros; Timonacicos; Tirapazaminas ; Topixantronas ; Toremifenos ; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); Trastuzumabos ; Trestolonas ; Triciribinas ; Triciribinas ; Trilostanos ; Trimetrexatos ; Tetranitratos de Triplatina; Triptorelinas ; Trofosfamidas ; Tubulozolas; Ubenime-xos ; Mostazas de Uracilo; Uredepas; Valspodaros; Vapreotidos; Verteporfinas ; Vinblastinas ; Vincristinas ; Vindesinas; Vinepidi-nas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos ; Vinleucinoles ; Vinleurosinas ; Vinorelbinas ; Vinrosidinas ; Vintriptoles ; Vinzolidinas ; Vorozolas; Xantomicina A's (Guameciclinas) ; Zeniplatinas ; Zilascorbos [2-H]; Zinostatinas ; Zorubicinas; Zosuquidaros ; y similares. Los portadores o vehículos farmacéuticos y cosméticos adecuados para la administración de los polipéptidos de sHASEGP o del dominio de hialuronidasa humano soluble de los mismos proporcionados en la presente incluyen cualquiera de esos vehículos conocidos por los técnicos en la materia como adecuados para el modo de administración particular. Además, los polipéptidos se pueden formular como el único ingrediente farmacéuticamente activo en la composición, o se pueden combinar con otros ingredientes activos que no perjudiquen la acción deseada, o con materiales que complementen la acción deseada, conocidos por los técnicos en este campo. Por ejemplo, los polipéptidos de sHASEGP proporcionados en la presente se pueden utilizar como un agente de suministro o de "extensión" en combinación con un segundo compuesto activo, tal como un agente terapéuticamente efectivo, incluyendo, pero no limitándose a, un fármaco o un profármaco, para facilitar el suministro de, o para mejorar la actividad del segundo ingrediente activo. En una forma de realización particular, se puede co-formular o co-administrar un polipéptido de sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble del mismo con un agente anestésico, tal como lignocaína, bupivacaína, o una mezcla de las dos, y opcionalmente un agente hormonal, tal como epinefrina, para reducir o detener la recuperación sanguínea durante la cirugía oftálmica. En otra forma de realización particular, un polipéptido de sHASEGP o un dominio de hiluronida-sa humano soluble del mismo se pueden co- formular o co-adminis-trar con un agente farmacológico tal como un agente anti-inflamatorio para mejorar el suministro del farmacológico a tejidos de mamíferos in vivo (v.gr., a porciones del ojo) donde tal agente se desea para tratar una condición particular. Por coadministración se tiene la intención de la administración de la sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) junto con o en proximidad temporal cercana a la administración de un agente farmacológico. Típicamente se prefiere que la sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) pueda administrarse poco antes (v.gr., 5 a 60 minutos antes) o, para conveniencia máxima, junto con el agente farmacológico. Como será apreciado por los técnicos en la materia, la proximidad deseada de co-administración depende en parte significativa en las vidas medias efectivas de los agentes en la configuración de tejido particular, y la enfermedad particular siendo tratada, y pueden fácilmente optimizarse mediante probar los efectos de administrar los agentes en tiempos variados en modelos adecuados, tal como en modelos animales adecuados. En algunas situaciones, el tiempo de administración óptimo de la sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) excederá de 60 minutos. A manera de ilustración y sin desear limitarse por teoría, en algunas situaciones de tumores por ejemplo la entrada máxima de agente quimioterapéutico hacia el tumor puede ocurrir después de que la degradación de hialuronano en el tumor está sustancialmen-te completa tal que reduzca el volumen intersticial del tumor, lo cual se sigue por una fase regenerativa de hialuronano durante la cual fluido se regresa hacia el tumor resultando en adsorción incrementada de un agente quimioterapéutico a partir del plasma. En el último caso, administración óptima de sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) puede obtenerse entre alrededor de una a veinticuatro horas previo a administración del agente farmacológico. Para optimizar el tiempo de pre-administración relativo al agente farmacológico para una combinación particular de condición de enfermedad y agente farmacológico, un técnico en la materia puede conducir un curso de tiempo rutinario de pre-administración, típicamente comparando uno o varios puntos del tiempo de una hora o menos con uno o varios puntos del tiempo de mas de una hora (pero típicamente no excediendo un día) para optimizar el tiempo de administración. Un polipéptido de sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble del mismo también se pueden co-formular o co-administrar con varios quimioterapéuticos , tales como una toxina y un factor de necrosis tumoral, para mejorar la actividad del producto quimioterapéutico y/o la accesabilidad de los tumores objetivos para el producto quimioterapéutico. El compuesto activo se incluye en el vehículo en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos tóxicos serios en el individuo tratado. La concentración efectiva se puede determinar empíricamente mediante la prueba de los compuestos utilizando sistemas in vitro e in vivo, incluyendo los modelos animales descritos en la presente. En el caso de agentes farmacológicos que se entregan por administración parenteral (es decir, por rutas diferentes que a través del tracto digestivo, tal como por rutas sub-cutáneas , intradérmicas , intramusculares o intravenosas, por ejemplo) sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) pueden fácilmente co-formularse con o co-administrarse con cualquiera de una variedad de tales agentes farmacológicos para mejorar su suministro a sitios deseados dentro del cuerpo. Por ejemplo, dependiendo de la combinación particular de agente farmacológico y ruta de administración, el suministro se puede mejorar mediante incrementar el grado (y/o la tasa) al cual el agente se difunde a través de un tejido o cerca del sitio de suministro (v.gr. , siguiendo su inyección) y/o el grado (y/o la tasa) al cual el agente se difunde y/o es portado por transporte convectivo a través de un tejido objetivo (v.gr., siguiendo su liberación del torrente sanguíneo, linfa, fluido cerebroespinal u otro sistema de fluidos) . El grado por el cual el suministro se mejora puede fácilmente evaluarse, por ejemplo, en sistemas de modelo animales en los cuales la adición de una sHASEGP resulta en un incremento mesurable en la bio-disponibilidad del agente en tejidos de interés dentro del cuerpo. Sin desear limitarse por teoría, se cree que en el caso de parenterales no intravenosos (tales como inyectables subcutáneos, intradérmicos e intramusculares), la presencia de sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) en la vecindad de un sitio de inyección y en sitios "corriente abajo) tales como aquellos entre un sitio de inyección y un lecho vascular distante, puede mejorar la difusión y/o transporte convectivo del agente dentro de un sistema de suministro tal como la vasculatura. Suministro mejorado en tal una situación puede ser asociada con un incremento en la cantidad del agente que efectivamente pasa a través y hacia afuera del sitio de suministro inicial (potencialmente mediante tanto incrementar el volumen y la tasa de flujo de fluido en bruto) . En el caso de muchos agentes farmacológicos, los cuales se sujetan a degradación, remoción u otras formas de desactivación en tejidos, incrementar la tasa de su paso a través de un tejido puede a su vez sustancialmente incrementar la cantidad de agente efectivo que transita a través del tejido, incrementando adicionalmente su bio-disponibilidad . Para parenterales administrados no intravenosamente que subsecuentemente ingresan al torrente sanguíneo u otro conducto, así como agentes entregados directamente hacia los vasos de conducto (tal como por administración intravenosa, IV) , la habilidad del agente para difundirse a través de un tejido suministrado por el conducto también puede mej orarse por la presencia de sHASEGP en el tejido. Ya sea que sHASEGP esté presente en un "tejido de suministro" tal como en el primer caso, y/o en el "tejido objetivo" como en el último caso, la presencia de sHASEGP puede así acrecentar el grado y/o tasa efectivos de suministro del farmacológico a tejidos objetivo dentro del cuerpo. En cualquier caso, la sHASEGP puede usarse para incrementar la bio-disponibilidad efectiva de un agente farmacológico con el cual se ha co-formulado o co-administrado . Como resultado, la sHASEGP puede usarse para lograr concentraciones elevadas y/o mas rápidamente logradas del agente para proporcionar, por ejemplo, una respuesta mas potente y/o mas rápida para una dosis dada. Alternativamente, la sHASEGP puede usarse para permitir que una respuesta dada sea lograda con una dosis mas baja del agente administrado, por ejemplo. La habilidad de una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) para mejorar el flujo de fluidos en bruto en y cerca de un sitio de inyección puede también mejorar otros aspectos del suministro del farmacológico asociado. Por ejemplo, el incremento en el flujo de fluidos en bruto puede ayudar a permitir que el volumen de fluido inyectado sea mas fácilmente dispersado a partir del sitio de inyección (reduciendo consecuencias potencialmente dolorosas u otras adversas de inyección) . De hecho, ha sido reconocido por mucho tiempo que tales sensaciones adversas asociadas con inyecciones parenterales no IV son una razón clave por la que pacientes pueden resistir o evitar administración parenteral no IV (lo cual puede efectivamente requerir que un producto sea administrado intravenosamente cuando puede de otra manera ser dado de manera mas conveniente y/o mas segura a través de una ruta no IV) . Al usar una sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) de la presente invención para mejorar la entrega de uno o mas agentes farmacológicos u otros en el cuerpo (un uso que en ocasiones es referido como "extensión) , la sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) por si misma puede administrarse por la misma ruta como es el agente farmacológico (en cuyo caso puede ser co- formulado o de otra manera co-administrado junto con el agente farmacológico o puede ser administrado por separado) , de preferencia antes del agente farmacológico como se discute anteriormente. Alternativamente, o además, la sHASEGP (u otra glicosaminoglicanasa) puede administrarse por una ruta de administración diferente. Por ejemplo, el agente farmacológico se puede introducir localmente mediante inyección parenteral no IV y la sHASEGP puede introducirse intravenosamente. Como otro ejemplo ilustrativo y no limitativo, la sHASEGP puede introducirse localmente por inyección parenteral no IV (en un tejido que se desea que sea apuntado por el agente farmacológico) y el propio agente farmacológico puede introducirse por otra ruta, tal como ruta intravenosa, no parenteral (v.gr. , oral) u otra. Como será apreciado por los técnicos en la materia, sHASEGPs de la presente invención pueden usarse para acrecentar la entrega y bio- disponibilidad de una variedad de agentes farmacológicos y otros incluyendo agentes que pueden entregarse típicamente por rutas parenterales así como no parenterales . Por ejemplo, sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas ) pueden co- formularse o co-administrarse con una variedad de agentes farmacológicos que son típicamente administrados por suministro parenteral, v.gr., para acrecentar su efectividad y/o para mejorar su perfil de riesgo/beneficio en tratar la enfermedad. A manera de ilustración de la variedad de agentes farmacológicos que pueden administrarse parenteralmente y su entrega y/o bio-disponibilidad mejorada a través de co-formula-ción y/o co-administración con sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) de la presente invención, la siguiente lista no es exhaustiva (y así no se pretende que sea limitativa) sino simplemente para proporcionar agentes ejemplares: Adalimumabs (v.gr., HUMIRA) , Agalsidasas Betas (v.gr., FABRAZYME) , Aldesleu-cinas (PROLEUKIN IL-2) , Alefaceptos (v.gr., AMEVIVE) , Ampicilinas (v.gr., Inyección de U ASYN) , Anaquinras (v.gr., KINERET) , Vacunas Antipoliomielíticas (v.gr., PEDIARIX) , Anti -Timocitos (v.gr., THYMOGLOBULIN) , Azitromicinas (v.gr., ZITHROMAX IV), Becaplerminas (v.gr., REGRA EX) , Caspofunginas (v.gr., CA CIDAS) , Cefazolinas (v.gr., A CEF y CEFAZOLIN) , Cefepimas (v.gr., MAXIPIME) , Cefotetanos (v.gr., CEFOTAN) , Ceftazidimas (v.gr., FORTAZ) , Ceftriaxonas (v.gr., ROCEFIN) , Cetuximabs (v.gr., ERBITUX) , Cilastatinas (v.gr., PRIMAXIN IV), Ácidos Clavulánicos (v.gr. , en conjunto con Amoxicilinas tales como en AUGMENTIN) , Clindamicinas (v.gr., CLEOCIN) , Darbepoetinas Alfas (v.gr., ARANESP) , Deaclizumabs (v.gr., ZENAPAX) , Toxoides de Difteria (típicamente en combinaciones v.gr., DAPTACEL, INFANRIX y PEDIARIXTM) , Efalizumabs (v.gr., RAPTIVA) , Epinefrinas (v.gr., EPIPEN) , Eritropoietinas Alfas (v.gr., EPOGEN y PROCRIT) , Etanerceptos (v.gr., ENBREL) , Filgrastimas (v.gr., NEUPOGEN) , Fluconazolas (v.gr., Inyección de DIFLUCAN), Hormonas Estimulantes de Folículos tales como Folitropinas Alfas (v.gr., GONAL-F) y Folitropinas Betas (v.gr., FOLLISTIM) , Fosfenitoínas (v.gr., CEREBYX) , Fluconazolas (v.gr., DIFLUCAN), Gadodiamidas (v.gr., OMNISCAN) , Gadopentetatos (v.gr., MAGNEVIST) , Gatifloxacinas (v.gr., TEQUIN) , Glatirámeros (v.gr., COPAXONE) , GM-CSF's (v.gr., LEUKINE) , Gosereiinas (v.gr., ZOLADEX) , Granisetrones (v.gr., KYTRIL) , Hemofilus Influenza B's (v.gr., COMVAX y HibTITER) , Haloperidoles (v.gr., HALDOL) , Vacunas de Hepatitis A (v.gr., HAVRIX, TWINRIX y VAQTA) , Vacunas de Hepatitis B (v.gr., recombinantes COMVAX, ENGERIX-B, RECOMBIVAX-HB , TWINRIX, y no recombinantes BAYHEP-B y NABFM-HB) , Ibritumomab Tiuxetanos (v.gr., ZEVALIN) , Inmunoglobulinas (incluyendo mezclas de inmunoglobulinas tales como GAMMAGARD y similares, así como cualquiera de una variedad de inmunoglobulinas purificadas) , Vacunas del Virus de Influenza (v.gr., FLUMIST) , Infliximabs (v.gr., REMICADE) , Insulinas (v.gr., HUMALOG, HUMALOG MIX 75/25 , productos HUMULIN (incluyendo 50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra y Ultralente) , y NOVOLIN) , Insulinas Glargines (v.gr., LANTUS) , Interferones Alfa-2a's (ROFERAN-A) , Interferones Alfa-2b's (v.gr., INTRON-A) , Interferones Alfacon-l's (v.gr., INFERGEN) , Interferones Alfa-n3s (v.gr., ALFERON N) , Interferones Betas (v.gr., BETASERON y BETAFERON) , Interferones Beta-la's (v.gr., AVONEX y REBIF) , Interferones Gammas (v.gr., ACTIMMUNE) , Iodixanoles (v.gr., VISIPAQUE) , Iohexoles (OMNIPAQUE) , Iopamido-les, Ioversoles (v.gr., OPTIRAY) , Cetorolacos (v.gr., TORADOL) , Laronidasas (v.gr., ALDURAZYME) , Levofloxacinas (v.gr., LEVA-QUIN) , Lidocaínas, Linezolidas (v.gr., ZYVOX) , Lorazepamos (v.gr., ATIVAN) , Vacunas de Sarampión (v.gr., ATTENUVAX) , Vacunas de Virus de Sarampión-Paperas-Rubeola (v.gr., M-M-R II), Medroxiprogesteronas (v.gr., DEPO-PRO VERA) , Meropenemos (v.gr., MERREM IV) , Metilprednisolonas (v.gr., SOLU-MEDROL) , Midazolamos (v.gr., VERSED) , Morfinas (v.gr., ASTRAMORPH/PF) , Octreotidas (v.gr., SANDOSTATIN) , Omalizumabs (v.gr., XOLAIR) , Ondansetronas (v.gr., ZOFRAN) , Palivizumabs (v.gr., SYNAGIS) , Pantoprazolas (v.gr., PROTONIX) , Pegaspargasas (v.gr., ONCASPAR) , Pegfilgrasti -mas (v.gr., NEULASTA) , Peg- Interferones Alfa-2a's (v.gr., PEGASYS) , Peg- Interferones Alfa-2b's (v.gr., PEG-INTRON) , Pegvisomantos (v.gr., SOMAVERT) , vacunas de Pertussis, Piperaci-linas (v.gr., ZOSYN) , Vacunas de Neumococos (v.gr., PNEUMO V AX 23) y Vacunas de Conjugado de Neumococos (v.gr., PREVNAR) , Prometazinas (v.gr., PHENERGAN) , Reteplasas (v.gr., RETAVASE) , Somatro inas (v.gr., GENOTROPIN, HUMATROPE , NORDITROPIN, NUTROPIN, SAIZEN, SEROSTIM, ZORBTIVE) , Sulbactamas, Sumatriptanos (v.gr., IMITREX) , Tazobactamas , Tenecteplasas (v.gr., TNKASE) , Toxoides Purificados de Tétano, Ticarcilinas (v.gr., TIMENTIN) , Tositumomabs (v.gr., BEXXAR) , Triamcinolona Acetonidas , Vancomi-cinas (v.gr., VANCOCIN) , Vacunas de Varicela (v.gr., VARIVAX) así como otras vacunas; y similares. Como se describe e ilustra en la presente, agentes farmacológicos de un número de diferentes clases y rutas de administración se pueden beneficiar por co-administración y/o co-formulación con sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) para mejorar uno o mas de sus aspectos de uso. Tales mejoras pueden comprender, por ejemplo, una o cualquier combinación de las siguientes: (i) mejorar el grado y/o la tasa de absorción y así bio-disponibilidad de un agente (por ejemplo mediante ocasionar que mas del mismo alcance el torrente sanguíneo después de administración parenteral no IV, y/o menos del mismo sea degradado después de tal administración local por permeación mas rápida), el cual puede ser llevado, por ejemplo, mediante acelerar el flujo intersticial y potencialmente transporte convectivo siguiendo administración parenteral no IV (v.gr., mediante aplicar presión hidrostática asociada con el volumen de inyección combinado con una reducción en impedancia a flujo asociada con la degradación de hialuronano) ; (ii) proporcionar para una ruta de administración mas segura o mas conveniente (por ejemplo, permitir para administración parenteral no IV en lugar de IV, o para administraciones parenterales no IV mejoradas o mas convenientes tales como intradérmicas o sub-cutáneas en lugar de intramusculares) ; (iii) regímenes de dosificación mas favorables (por ejemplo, dosificación menos frecuente, o una ruta no IV de dosis mas frecuente pero inferior a diferencia de una dosis IV menos frecuente pero mayor) ; (iv) reducir un efecto secundario o de otra manera disminuir la toxicidad (por ejemplo, un efecto asociado con la concentración inicialmente alta (Cmax alta) generada por dosificación IV, o a partir de una dosis local alta generada por absorción lenta y/o incompleta siguiendo administración parenteral no IV) ; (v) de otra manera mejorar la farmacoci-nética y/o farmacodinámica (por ejemplo, mediante permitir que mas de un agente alcance un sitio objetivo (v.gr., mediante flujo de fluido intersticial y transporte convectivo incrementados debido a la presencia de sHASEGP en o cerca de un sitio de entrega tal como un sitio de inyección) y/o mediante acrecentar la permeación dentro de un sitio objetivo (v.gr., mediante flujo de fluido intersticial y transporte convectivo incrementados debido a la presencia de sHASEGP dentro del sitio objetivo), o mediante suministrar un agente preferencialmente a un sitio objetivo (v.gr., mediante administración local a un sitio objetivo en conexión con administración local o sistémica de una sHASEGP para promover permeación del objetivo, o mediante usar vehículos o complejos macromoleculares para preferencialmente apuntar a un agente a un sitio particular combinado con administración local o sistémica de sHASEGP para promover permeacion del sitio objetivo)); agentes que han sido suministrados oralmente también pueden beneficiarse por reformulaciones para suministro parenteral para, v.gr., evitar pérdida del agente al tracto gastrointestinal o degradación subsecuente o toxicidad, permitir para direccionamiento mas efectivo a un sitio de acción deseado y por lo tanto potencialmente mayor efectividad y/o menos toxicidad, o de otra manera proporcionar para perfiles farmacoci-nético y/o farmacodinámico mas favorables. Además, sHASEGPs pueden usarse para mejorar la farmacodinámica de agentes que se administran oralmente (por ejemplo, mediante mejorar la permeacion de un agente administrado oralmente dentro de su sitio objetivo (v.gr., mediante flujo de fluido intersticial y transporte convectivo incrementados debidos a la presencia de sHASEGP dentro del sitio objetivo siguiendo administración sistémica de sHASEGP y/o siguiendo administración local de sHASEGP al sitio objetivo)). Aun en situaciones en las cuales el sitio objetivo deseado para un agente tal como uno farmacológico es el propio torrente sanguíneo, tales agentes se pueden mejorar por coadministración y/o co- formulación con sHASEGPs (u otras glicosa-minoglicanasas) . Por ejemplo, hay un número de agentes que actúan como modificadores de sangre, los cuales se pueden administrar por una de varias rutas incluyendo dosificación oral así como administración parenteral (tal como inyección IV) . Un número de agentes que son o podrían administrarse oralmente sin embargo exhiben captación relativamente limitada o lenta y/o se sujetan a degradación no deseable (y no hay otros agentes que sean generalmente seguros y efectivos una vez introducidos dentro del torrente sanguíneo pero no se administran oralmente por esa razón) . Administración parenteral de tales agentes (v.gr., mediante rutas intramusculares, sub-cutáneas , intradérmicas o transdérmicas en combinación con administración de sHASEGP, de preferencia en o cerca del sitio de administración parenteral) puede así emplearse para proporcionar para introducción dentro del torrente sanguíneo. Además, hay un número de situaciones médicas urgentes en las cuales entregar rápida de un agente al torrente sanguíneo es esencial pero dosificación oral es demasiado lenta y dosificación intravenosa es ya sea inconveniente, no segura o no disponible. Estas situaciones urgentes incluyen aquellas en las cuales la sangre es el objetivo así como aquellas en las cuales el torrente sanguíneo es simplemente la ruta de suministro a otro tejido objetivo. En tales situaciones, la habilidad para combinar administración con sHASEGP (o aplicar una co- formulación preparada lista con una sHASEGP) puede permitir para entrega rápida del agente mediante administración parenteral no IV. Como será apreciado por los técnicos en la materia, hay un número de formulaciones y dispositivos diseñados para administraciones parenterales no IV que pueden proporcionar para, v.gr., liberación de agentes temporizada o de otra manera disparada, así como dosificación variablemente controlada y similares. Un gran número de tales agentes farmacológicos (que se pueden co- formular con o usarse en combinación con una sHASEGP) se aplican regularmente en la práctica médica y aspectos de su uso son bien descritos (ver, v.gr., Physicians' Desk Reference, Thomson 2003, 2004, 2005), y muchos otros tales agentes se conocen en la materia. En este último respecto, como será apreciado por los técnicos en la materia, sHASEGPs pueden emplearse en combinación con agentes actualmente usados (para, v.gr., mejorar su capacidad de aplicación como se describe en la presente) , con agentes que no están actualmente usados (para, v.gr., mejorar su farmacocinética y/o farmacodinámica y así hacerlos útiles), o con agentes que están recién desarrollados. Así, para agentes farmacológicos (tales como agentes anti -cáncer, modificadores sanguíneos o miembros de otras clases de agentes como se describe en la presente) que típicamente se introducen parenteralmente (v.gr., mediante inyección IV), sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) pueden usarse por ejemplo para permitir que tales agentes se administren por otras rutas potencialmente mas convenientes y/o seguras tales como por administración parenteral no IV (v.gr., por rutas intramuscular, sub-cutánea, intradérmica o transdérmica) . Para agentes que están ya disponibles por una ruta parenteral no IV, sHASEGPs pueden usarse para mejorar su grado y/o tasa de captación y entrega (v.gr., mediante promover su dispersión y entrada subsecuente dentro del torrente sanguíneo, lo cual puede probablemente ayudarse por transporte convectivo como se describe en la presente) . Ventajas de tales efectos incluyen tener a una porción mayor del agente alcanzando el torrente sanguíneo, teniendo exposición local reducida a agente (en términos de concentración y/o tiempo) (v.gr., en o cerca del sitio de inyección, lo cual frecuentemente limita la dosificación o resulta en problemas de toxicidad locales) , incrementando la velocidad a la cual un agente se puede suministrar dentro del torrente sanguíneo, otras propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas mejoradas, y conveniencia de administración. En este último respecto, administraciones parenterales no IV pueden permitir que muchos agentes sean administrados fuera del hospital que de otra manera requerirían hospitalización u otra atención médica típicamente requerida para administraciones intravenosas. Ejemplos ilustrativos de modificadores sanguíneos incluyen agentes tales como agentes anti-hemolíticos y agentes de deficiencia de factor sanguíneo (incluyendo, por ejemplo, factores anti -hemófilos (v.gr., ADVATE, HEMOFIL, KOATE-DVI, KOGENATE-FS , RECOMBINATE y REFACTO) , complejos coagulantes antiinhibidores (v.gr., FEIBA VH) , antitrombina IIIs (v.gr., THROMBATE III), Facotres VII de coagulación (v.gr., NOVOSEVEN) , Factores VIII de coagulación (v.gr., ADVATE, KOGENATE-FS y RECOMBINATE), factores IX de coagulación (v.gr., BEBULIN, BENEFIX y PROPLEX T) , fraccciones de proteína de plasma (v.gr. , PLASMANA-TE) , factores de von Willebrand) ) ; agentes anti -plaquetas (incluyendo, por ejemplo, abciximabs (v.gr., REOPRO) , anagrélidos (v.gr., AGRYLIN) , cilostazoles (v.gr., PLETAL) , bisulfatos de clopidogrel (v.gr., PLAVIX) , dipiridamolas (v.gr., AGGRENOX y PRESANTINE) , epoprostenoles (v.gr., FLOLAN) , eptifaibatidas (v.gr., INTEGRILIN) , tirofibanos (v.gr., AGGRASTAT) ) ; factores estimulantes de colonias (CSFs) (incluyendo, por ejemplo, CSFs de Granulocitos (v.gr., NEULASTA y NEUPOGEN) y CSFs de Macrófagos de Granulocitos (v.gr., LEUKINE) ) ; estimulantes de eritropoiesis (incluyendo, por ejemplo, eritropoietinas tales como darbepoeti-nas alfas (v.gr., ARANESP) y epoetinas alfas (v.gr., EPOGEN y PROCRIT) ; hemostáticos y albúminas (incluyendo, por ejemplo, aprotininas (v.gr., TRASYLOL) , combinaciones de factores antihemófilos y plasma (v.gr., ADVATE) , Acetatos de Desmopresina (v.gr., DDAVP) , y albúminas (v.gr., BU INATE y PLASBUMIN) ) ; globulinas inmunes (v.gr., BAYGAM, CARIMU E NF IV, FLEBOGAMMA, GAMIMUNE, GAMMAGARD S/D, GAMUNEX, IVEEGAM, IVEEGAM EN IGIV, MICRHOGAM, RHOGAM, PANGLOBULIN y THYMOGLOBULIN, así como globulinas inmunes de hepatitis B (v.gr., BAYHEP B, NABI-HB, y NOVAPLUS NABI-HB)); inhibidores de trombina (incluyendo, por ejemplo, inhibidores de trombina directos (v.gr., ARGATROBAN) y lepirudina (v.gr., REFLUDAN) , y drotecoginas alfas (v.gr., XIGRIS) ; anticoagulantes (incluyendo, por ejemplo, dalteparinas , enoxaperinas y otras heparinas (v.gr., FRAGMIN y LOVENOX) , warfarinas (v.gr., COUMADIN y JANTOVEN) ) ; y similares. A manera de ilustración adicional, ejemplos de varios tipos de agentes que han sido administrados parenteralmente y que pueden co-administrarse y/o co- formularse con sHASEGPs (u otras glicosaminoglicanasas) se incluyen en la lista siguiente: Acetazolamidas ; Acicloviras ; Adipiodonas ; Alatrofioxacinas ; Aldesleucinas ; Alemtuzumabs ; Alfentanilos ; Extractos alergénicos; Allopurinolas ; Inhibidores de Alfa 1 -proteinasa ; Alprostadilos ; Amifostinas ; Amicacinas; Aminoácidos; Ácidos aminocaproicos ; Aminofilinas ; Amitriptilinas ; Amobarbitales ; Amrinonas; Anaquin-ras; Analgésicos; Vacunas anti-poliomielíticas ; Sueros antirábicos; Inmunoglobulinas anti-tétanos; Antitrombinas III; Sueros anti -veneno; Argatrobanos ; Argininas; Arsénicos; Ácidos ascórbi-cos; Asparaginasas ; Atenololas; Atracurios; Atropinas; Aurotio-glucosas; Azatioprinas ; Azitromicinas ; Aztreonamos; Vacunas de bacilo Calmette-Guerin (BCG) ; Bacitracinas ; Baclofenos; Basilixi-mabs; Ácidos benzoicos; Benztropinas ; Betametasonas ; Biotinas; Bivalirudinas ; Bleomicinas; Anti-toxinas de botulismo; Bretilios; Bumetanidas; Bupivacaínas ; Buprenorfinas ; Busulfanos; Butorfano-las; Calcitoninas ; Calcitrioles ; Calcios; Capreomicinas ; Carboprostas ; Carmustinas; Carnitinas; Caspofunginas ; Cefamando-las; Cefazolinas; Cefoperazonas ; Cefotaximas; Cefotetanos; Cefoxitinas; Ceftazidimas ; Ceftizoximas ; Cefuroximas; Cloramfenícolas; Cloroprocaínas ; Cloroquinas; Clorotiazidas ; Clorpromazi-nas; Ácidos Condroitinsulfúricos ; Coriogonadotropinas alfa; Cromos; Cidofoviros; Cimetidinas ; Ciprofloxacinas ; Cisatracurios Cisplatinas ; Cladribinas; Ácicos clavulánicos ; Clindamicinas Clonidinas; Codeinas; Colquicinas; Colistinas; Colágenos Trifutatos de corticorelina ovina; Corticotrofinas ; Cosintropi ñas; Cianocobalaminas ; Ciclofosfamidas ; Ciclosporinas ; Cisteínas Citarabinas; Dacarbazinas ; Dacliximabs; Dactinomicinas ; Dalfo prístinas; Dalteparinas ; Danaparoides ; Dantrolenos; Daunorubici ñas; Deferoxaminas ; Denileucina diftitoxos; Desmopresinas Dexametasonas ; Dexmedetomidinas ; Dexpantenoles ; Dexrazoxanos Dextranos; Ácidos diatrizoicos; Diazepamos ; Diazóxidos; Diciclo minas; Digibindos; Digoxinas; Dihidroergotaminas ; Diltiazems Difenhidraminas ; Vacunas de difteria, tétanos and pertussis Antitoxinas de difteria; Dipiridamoles ; Dobutaminas; Dopaminas Doxacurios; Doxapramos; Doxercalciferóles ; Doxiciclinas Droperidoles ; Drotrecoginas alfa; Difilinas; Ácidos edéticos Edrofonios; Enalaprilatos ; Efedrinas; Epoprostenolas ; Ergocalci feróles; Ergonovinas; Ertapenemos ; Eritromicinas ; Esmololes Estradioles; Estrógenos; Ácidos etacrínicos; Etanolaminas Etanoles; Aceites etiodizados; Ácidos etidrónicos; Etomidatos Etopósidos; Factores VIII; Famotidinas; Fenoldopamos ; Fentanilos Floxuridinas ; Fludarabinas ; Flumazenilos ; Fluoresceínas Fluorouracilos ; Flufenazinas ; Ácidos folíeos ; Hormonas estimulan tes de folículos; Fomepizolas; Fomivirsenos ; Fondaparinuxos Foscarnetos; Fosfenitoínas ; Fulvestrantos ; Furosemidas; Gadoteri doles; Gadoversetamidas ; Gancicloviros ,- Gatifloxacinas ; Gemtuzu mab ozogamicinas ; Gentamicinas ; Glucagones; Glucosas; Glicinas; Glicopirrolatos ; Gonadorelinas ; Coriónicos de gonadotropina ; Polisacáridos de hemófilo B; Haloperidoles ; Heminas; Vacunas de influenza hemófila; Vacunas de Hepatitis; Herbales; Histaminas; Hidralazinas ; Hidrocortisonas ; Hidromorfonas ; Hidroxocobalaminas ; Hidroxizinas ; Hiosciaminas ; Ibutílidos; Idarubicinas ; Ifosfami-das; Imiglucerasas ; Inmunoglobulinas ; Carminas índigo; Indometa-cinas; Interferones alfa-conls ; Interferones alfa-2As ; Interfero-nes alfa-N3s; Interferones beta-lAs; Ioduros; Iopromidos; Ácidos iotalámicos; Ácidos ioxáglicos; Ioxilanos; Inyecciones de hierro dextrano; Isoniazidas; Isoproterenoles ; Vacunas de encefalitis japonesa; Kanamicinas; Cetaminas; Cetorolacos; Labetaloles; Lepirudinas; Leucovorinas ; Leuprolidos; Levobupivacaínas ; Levotiroxinas ; Lidocaínas; Lincomicinas ; Linezolidas; Liotironi-nas; Lorazepamos ; Hormonas luteinizantes ; Vacunas de enfermedad de Lyme; Mangafodípiros ; Manitoles; Vacunas de sarampión; ecloretaminas ; Melfalanos; Vacunas de polisacárido meningococal; Meperidinas; Mepivacaínas ; Meropenemos; Mesnas; Mesoridazinas ; etaraminoles ; Metadonas ; Metocarbamoles ; Metohexitalos ; Metotrexatos ; Metildopatos ; Metilergonovinas ; Metoclopramidos ; Metoprololes ; Metronidazolas ; Midazolamos; Minociclinas ; Mitramicinas ; Mitomicinas; Mitoxantronas ; Mivacurios; Ácidos morruicos; Moxifloxacinas ; Viruses de paperas; Muromonab-CD3s ; Micofenolato mofetilos; Nafcilinas; Nalbufinas; Nalmefenos; Naloxonas; Nandrolonas; Neostigminas ; Niacinamidos ; Nicardipinas ; Nitroglicerinas ; Nitroprusidos ; Norepinefriñas ; Oprelvecinas ; Orfenadrinas ; Oxacilinas; Oxaliplatinas ; Oxiniorfonas ; Oxitetra-ciclinas; Oxitocinas; Pancuronios; Pantenoles; Ácidos pantoténi-cos; Papaverinas; Pegaspargasas ; Peg- interferones alfa 2A; Penicilinas G; Pentamidinas ; Pentazocinas ; Pentobarbitales ; Pentostatinas ; Perflutrenos ; Perfenazinas ; Vacunas de Pertussis; Fenobarbitales ; Fentolaminas ; Fenilefrinas ; Fenitoinas; Fisostig-minas; Fitonadionas ; Vacunas de neumococos; Polimixinas b; Porfímeros; Pralidoximas ; Prilocaínas; Procainamidas ; Procaínas; Proclorperazinas ; Progesteronas ; Prometazinas ; Propranololes ; Hidróxidos de piridostigmina; Piridoxinas; Quinidinas; Quinupris-tinas; Inmunoglobulinas de rabia; Vacunas para rabia; Ranitidi-nas; Rasburicasos ; Remifentanilos ; Riboflavinas; Rifampinas; Ropivacaínas ; Vacunas de Rubéola; Samarios; Escopolaminas ; Selenios; Sermorelinas ; Sincalidas; Somatremos; Espectinomicinas ; Estreptoquinasas ; Estreptomicinas; Estreptozocinas ; Succinilcoli-nas; Sufentanilos ; Sulbactamas; Sulfametoxazolas ; Sumatriptanos ; Tacrolimus; Tenipósidos; Terbutalinas ; Teriparatidas ; Testostero-nas; Anti-toxinas de tétanos; Tetracaínas; Sulfatos de tetradeci-lo; Teofilinas; Tiaminas; Tietilperazinas ; Tiopentales; Hormonas estimulantes de tiroides; Ticarcilinas ; Tinzaparinas ; Tirofiba-nos; Tobramycins; Tolazolines; Tolbutamides ; Topotecans; Torsemidas; Ácidos tranexámicos ; Treprostinilos ; Triamcinolona acetonidas; Triamcinolona hexacetonidas ; Triamcinolonas ; Trietilenotiofosforamidas (Tiotepa) ; Trifluoperazines ; Trimeto- benzamidas; Trimethoprimos ; Trimetrexatos ; Triptorelinas ; Trometaminas ; Tuberculinas ; Vacunas de tifoidea; Urofolitropinas ; Uroquinasas; Ácidos valproicos ; Valrubicinas ; Inmunoglobulinas de Varicela Zóster; Vasopresinas ; Vecuronios; Verapamilos ; Vinblas-tinas; Vincristinas ; Voriconazolas ; Warfarinas; Vacunas de fiebre amarilla; Zidovudinas; Zincs; Hidrocloruros de ziprasidone; y agentes relacionados a los anteriores o en la misma o similares clases como los anteriores. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral (incluyendo por rutas de aplicación intramuscular, intradérmica , subcutánea, o tópica y otra no oral) pueden incluir cualquiera de los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyecciones, solución salina, aceite fijo, polietileno glicol, glicerina, propileno glicol, u otro solvente sintético; agentes antimicrobianos, tales como alcohol bencílico y metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico y bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetra-acético (EDTA) ; reguladores, tales como acetatos, citratos, y fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, incluyendo, pero no limitándose a, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, dextrosa, glicerol, o ácido bórico. Preparaciones parenterales pueden comprenderse en ámpulas, jeringas desechables o frascos de una sola o múltiples dosis hechos de vidrio, plástico u otro material adecuado. Los polipéptidos de sHASEGP o los dominios de hialuro- nidasa humanos solubles de los mismos, se pueden suspender en una forma micronizada o en otra forma adecuada, o se pueden derivar para producir un producto activo más soluble, o para producir un profármaco. La forma de la mezcla resultante depende de un número de factores, incluyendo el modo de administración pretendido y la solubilidad del polipéptido en el portador o vehículo seleccionado. La concentración efectiva es suficiente para disminuir la condición objetivo, y se puede determinar de una manera empírica empleando los métodos conocidos por los técnicos en la materia. Con el fin de formular una composición, la fracción en peso del polipéptido se disuelve, suspende, dispersa, o se mezcla de otra manera en un vehículo seleccionado, en una concentración efectiva, de tal manera que se alivie o se disminuya la condición obj etivo . En los casos en los cuales los polipéptidos de sHASEGP o el dominio de hialuronidasa humano soluble de los mismos exhiban una solubilidad insuficiente, se pueden emplear los métodos para solubilizar polipéptidos. Tales métodos son conocidos por los técnicos en la materia, e incluyen, pero no se limitan a, utilizar cosolventes, tales como sulfóxido de dimetilo (DMSO) , utilizar tensoactivos , tales como T EEN y Pluronic F68; o la disolución en bicarbonato de sodio acuoso. También se pueden utilizar derivados de los polipéptidos, tales como profármacos de los polipéptidos, en la formulación de composiciones farmacéuticas efectivas. Para las indicaciones oftálmicas, las composicio- nes se formulan en un vehículo oftálmicamente aceptable. Para los usos oftálmicos en la presente, se contempla la administración local, ya sea mediante administración tópica o mediante inyección. También son deseables las formulaciones de liberación en tiempo. Típicamente, las composiciones se formulan para la administración de una sola dosificación, de tal manera que una sola dosis administre una cantidad efectiva. Ante mezclado o adición del polipéptido con el vehículo, la mezcla resultante puede ser una solución, suspensión, emulsión, u otra composición, y se puede formular como mezclas acuosas, cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elíxires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, rocíos, supositorios, parches, o cualquier otra formulación adecuada para su administración sistémica, tópica, o local. La forma de la mezcla resultante depende de un número de factores, incluyendo el modo de administración pretendido y la solubilidad del compuesto en el portador o vehículo seleccionado. Si es necesario, se preparan sales farmacéuticamente aceptables u otros derivados de los compuestos. Para la administración local interna, tal como la administración intramuscular, parenteral, o intra-articular, los compuestos se formulan de preferencia como una suspensión en solución en un medio basado en agua, tal como solución salina isotónicamente regulada, o se combinan con un soporte biocompatible o un bioadhesivo pretendido para adminis- tración interna. El polipéptido de sHASEGP o el dominio de hialuronidasa humano soluble del mismo, se incluye en el vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. Se entiende que el número y grado de efectos secundarios depende de la condición para la cual se administren los compuestos. Por ejemplo, se toleran ciertos efectos secundarios tóxicos e indeseables, cuando se tratan enfermedades amenazantes de la vida, que no se tolerarían cuando se trataran trastornos de una consecuencia menor. Las cantidades efectivas para uso terapéutico, por supuesto, dependerán de la exactitud de la enfermedad y del peso y estado general del sujeto, así como de la vía de administración. La administración local del agente terapéutico normalmente requerirá de una dosificación más pequeña que cualquier modo de administración sistémica, aunque en algunos casos, la concentración local del agente terapéutico puede ser más alta en seguida de la administración local de lo que se puede alcanzar con seguridad con la administración sistémica. Debido a que los sujetos individuales pueden presentar una amplia variación en la exactitud de los síntomas, y a que cada agente terapéutico tiene sus características terapéuticas únicas, corresponde al practicante determinar la respuesta de un sujeto al tratamiento y variar las dosificaciones de conformidad con lo mismo. Las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para la administración in si tu de la composición farmacéutica, y en algunos casos, se pueden utilizar modelos animales para determinar las dosificaciones efectivas para el tratamiento de trastornos particulares. Sin embargo, en general, para la administración local, se contempla que una cantidad efectiva del agente terapéutico será una cantidad dentro del intervalo de aproximadamente 0.1 picogramos (pg) hasta aproximadamente 1 nanogramo por kg de peso corporal. Los técnicos en la materia conocen diferentes consideraciones para llegar a una cantidad efectiva, y ya se han descrito (ver, por ejemplo, Goodman y Gilman: The Pharmacolo-gical Bases of Therapeutics , 8a edición, Pergamon Press, 1990; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Mantyh y colaboradores (Science 278 : 275-79, 1997), que involucra la inyección intratecal de un ligando-toxina específico neuronal , cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad) . Las formulaciones de los polipéptidos de sHASEGP o de los dominios de hialuronidasa humanos solubles de los mismos para utilizarse en la presente, incluyen aquéllas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, por inhalación, bucal, sublingual, otra parenteral (v.gr., subcutánea, intramuscular, intradérmica , transdérmica , o intravenosa) , o por cualquier vía. La vía más adecuada en cualquier caso depende de la naturaleza y exactitud de la condición que se esté tratando, y de la naturaleza del compuesto activo particular que se esté utilizando. Las formulaciones se proporcionan para administrarse a seres humanos y animales en formas de dosificación unitaria, tales como tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, y soluciones o suspensiones orales, y emulsiones de aceite-agua que contengan cantidades adecuadas de los polipéptidos y/u otros agentes o derivados farmacéuticamente activos de los mismos. Los polipéptidos farmacéuticos terapéuticamente activos y/u otros agentes y derivados de los mismos, se formulan típicamente y se administran en formas de dosificación unitaria o en formas de múltiples dosificaciones. Una forma de dosis unitaria, como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas para sujetos humanos y animales, y se empacan individualmente como se conoce en la materia. Las composiciones farmacéuticas se proporcionan para administrarse a seres humanos y animales en formas de dosificación unitaria, tales como tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, y soluciones o suspensiones orales, y emulsiones de aceite-agua que contengan cantidades adecuadas del polipéptido de sHASEGP o del dominio de hialuronidasa humano soluble del mismo, y opcionalmen-te otro agente, o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los compuestos farmacéuticos terapéuticamente activos y sus derivados normalmente se formulan y se administran en formas de dosificación unitaria o en formas de múltiples dosificaciones. Una forma de dosis unitaria, como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas para sujetos humanos y animales, y empacadas individualmente como se conoce en este campo. Cada dosis unitaria contiene una cantidad previamente determinada del compuesto terapéuticamente activo, suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo, o diluyente farmacéutico requerido. Ejemplos de las formas de dosis unitaria incluyen, pero no se limitan a, ampolletas, jeringas, y tabletas o cápsulas individualmente empacadas. Por ejemplo, una formulación de volumen pequeño que contenga una solución estabilizada con 1 a 5,000 Unidades de sHASEGP en un volumen pequeño, tal como de 5 a 50 µ?, se puede empacar previamente en una jeringa para utilizarse, tal como después de la inyección viscoelástica . Las formas de dosis unitaria se pueden administrar en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de múltiples dosis es una pluralidad de formas de dosificación unitaria idénticas empacadas en un solo recipiente para administrarse en una forma de dosis unitaria segregada. Los ejemplos de las formas de múltiples dosis incluyen frascos, botellas de tabletas o cápsulas, o botellas de pintas o galones. Por consiguiente, la forma de múltiples dosis es un múltiplo de dosis unitarias que no se segregan en el empaque. La composición puede contener, junto con el ingrediente activo, tal como un polipéptido de sHASEGP : un diluyente, tal como lactosa, sacarosa, difosfato de calcio, o carboxi -metil -celulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio, y talco; y un aglutinante, tal como almidón, gomas naturales, tales como goma de acacia, gelatina, glucosa, melaza, polivinil-pirrolidina, celulosas y sus derivados, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes conocidos por los técnicos en la materia. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables , por ejemplo, se pueden preparar mediante la disolución, dispersión, o mezcla de otra manera de un compuesto activo como se define anteriormente, y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol, y similares, para formar de esta manera una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que se vaya a administrar, también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, o agentes solubilizantes , agentes reguladores del pH, y similares, por ejemplo acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina , monolaurato de sorbitán, trietanolamina , acetato de sodio, oleato de trietanolamina, y otros agentes. Los métodos para la preparación de estas formas de dosificación son conocidos, o serán aparentes para los técnicos en este campo (ver, v.gr., Remington's Pharmaceutical Sciences, ack Publishing Company, Easton, PA, 15a edición, 1975) . La composición o formulación que se vaya a administrar contiene una cantidad del compuesto activo en una cantidad suficiente para aliviar los síntomas del sujeto tratado. Por ejemplo, una formulación estabilizada estándar de sHASEGP, o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, como se dispone en la presente, incluye 150 Unidades/ml de la glicoproteína soluble formulada en EDTA, NaCl, y CaCl2. Adicionalmente , puede estar presente en la formulación un agente antibacteriano o antihongos, incluyendo, pero no limitándose a, tiomersal. Otra formulación proporcionada en la presente es una solución estabilizada o una forma liofili-zada de sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma en EDTA, NaCl, y CaCl2, conteniendo una cantidad activa efectiva de la glicoproteína soluble, tal como 150 Unidades/ml, con la adición de lactosa, tal como 13 mg/ml. También en la presente se proporciona una formulación que contiene una solución estabilizada o una forma liofilizada de sHASEGP, o de un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma en EDTA, NaCl, y CaCl2, que contiene una cantidad activa efectiva de la glicoproteína soluble, tal como 150 Unidades/ml, con la adición de lactosa, tal como 13 mg/ml, y albúmina, Pluronic F68, TWEEN y/u otro detergente. Otra formulación proporcionada en la presente, ya sea liofilizada o bien como una solución estabilizada, contiene una cantidad efectiva de sHASEGP o de un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, tal como de 1 a 300 Unidades/ml, en EDTA, NaCl, y CaCl2.
Se pueden preparar formas de dosificación o composiciones que contengan al ingrediente activo en el intervalo del 0.005% al 100%, formándose el resto del vehículo no tóxico. Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma, por ejemplo, de tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (v.gr. , almidón de maíz previamente gelatinizado , polivinil-pirrolidona, o hidroxi-propil-metil-celulosa) ; rellenos (v.gr., lactosa, celulosa microcristalina, o fosfato ácido de calcio; lubricantes (v.gr., estearato de magnesio, talco, o sílice); desintegrantes (v.gr., almidón de papa o glicolato de almidón de sodio) ; o agentes humectantes (v.gr., lauril -sulfato de sodio) . Las tabletas se pueden recubrir mediante métodos bien conocidos en este campo. Las sHASEGPs o un dominio de hialuronidasa humano soluble de las mismas, o los derivados farmacéuticamente aceptables, se pueden preparar con vehículos que protejan a la glicoproteína soluble con la eliminación rápida del cuerpo, tales como formulaciones o recubrimientos de liberación en tiempo. Las composiciones pueden incluir otros agentes farmacéuticamente efectivos conocidos en la materia general como valiosos en el tratamiento de una o más de las enfermedades o condiciones médicas, incluyendo, pero no limitándose a, un agente quimiotera-péutico, un agente analgésico, un agente anti - inflamatorio , un agente antimicrobiano, un agente amibicida, un agente tricomono- cida, un agente anti-Parkinson, un agente contra la malaria, un agente anticonvulsionante, un agente anti -depresivo , un agente antiartrítico, un agente antihongos, un agente anti-hipertensivo, un agente antipirético, un agente anti -parasitario , un agente antihistamínico, un agente agonista alfa-adrenérgico , un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador de bronquios, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático , un agente bloqueador beta-adrenérgico, un agente bloqueador de canal de calcio, un agente de fármaco cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestionarite , un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolito, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente contractor muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético , un agente energizador psíquico, un agente sedante, un agente simpatomimético , un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente anti - inflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina , un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, un profármaco, una molécula orgánica, y un inductor de sueño, para obtener las combinaciones de propiedades deseadas. Se debe entender que esta terapia de combinación constituye un aspecto adicional de las composiciones y métodos de tratamiento proporcionados en la presente. 1. Composiciones para Administración Oral Las formas de dosificación farmacéutica oral son sólidas, gel, o líquidas. Las formas de dosificación sólidas son tabletas, cápsulas, gránulos, y polvos a granel. Los tipos de tabletas orales incluyen tabletas comprimidas, grageas y tabletas masticables, las cuales pueden tener recubrimiento entérico, recubrimiento de azúcar, o recubrimiento de película. Las cápsulas pueden ser cápsulas de gelatina dura o blanda, mientras que los gránulos y polvos se pueden proporcionar en una forma no efervescente o efervescente con la combinación de otros ingredientes conocidos por los técnicos en la materia. Las composiciones farmacéuticas que contienen una sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, pueden estar en forma líquida, por ejemplo soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto de fármaco para reconstituirse con agua u otro vehículo antes de usarse. Estas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (v.gr. , jarabe de sorbitol, derivados de celulosa, o grasas comestibles hidrogenadas) ; agentes emulsionantes (v.gr., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (v.gr., aceite de almendra, ésteres oleosos, o aceites vegetales fraccionados) ; y conservadores (v.gr. , metil- o propil -p-hidroxi -benzoatos o ácido sórbico) . En ciertas formas de realización, las formulaciones son formas de dosificación sólidas, de preferencia cápsulas o tabletas. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos, y similares, pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante; un diluyente; un agente desintegrante; un lubricante; un derrapante; un agente edulcorante; y un agente saborizante. Los ejemplos de los aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma de tragacanto, solución de glucosa, acacia, mucílago, solución de gelatina, sacarosa, y pasta de almidón. Los lubricantes incluyen talco, almidón, estearato de magnesio o de calcio, licopodio, y ácido estéarico. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, sacarosa, almidón, caolín, sal, manitol, y difosfato de calcio. Los derrapantes incluyen, pero no se limitan a, dióxido de silicio coloidal. Los agentes desintegrantes incluyen croscarmelosa de sodio, glicolato de almidón de sodio, ácido algínico, almidón de maíz, almidón de papa, bentonita, metilcelulosa , agar, y carboximetilcelulosa . Los agentes colorantes incluyen, por ejemplo, cualquiera de los tintes FD y C solubles en agua certificados y aprobados, y mezclas de los mismos; y los tintes FD y C insolubles en agua suspendidos en hidrato de alúmina. Los agentes edulcorantes incluyen sacarosa, lactosa, manitol, y agentes edulcorantes artificiales tales como sacarina, y cualquier número de sabores secados por pulverización. Los agentes saborizantes incluyen saborizantes naturales extraídos de plantas, tales como frutas, y mezclas sintéticas de compuestos que produzcan una sensación agradable, tales como, pero no limitándose a, menta y salicilato de metilo. Los agentes humectantes incluyen monoestearato de propilenglicol , mono-oleato de sorbitán, monolaurato de dietilenglicol , y lauril éter de polioxietileno . Los recubrimientos heméticos incluyen ácidos grasos, grasas, ceras, shellac, shellac amoniatado, y ftalatos de acetato de celulosa. Los recubrimientos de película incluyen hidroxietilcelulosa , carboximetilcelulosa de sodio, polietileno glicol 4000, y ftalato de acetato de celulosa. Si se desea la administración oral, la sHASEGP o el dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, se podría proporcionar en una composición que la proteja del medio ambiente ácido del estómago. Por ejemplo, la composición se puede formular en un recubrimiento entérico que mantenga su integridad en el estómago y libere el compuesto activo en el intestino. La composición también se puede formular en combinación con un antiácido u otro ingrediente. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, en adición al material del tipo anterior, un vehículo líquido tal como aceite graso. En adición, las formas de dosificación unitaria pueden contener otros diferentes materiales que modifiquen la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo recubrimientos de azúcar y otros agentes entéricos. Los compuestos también se pueden administrar como un componente de un elíxir, suspensión, jarabe, oblea, salpicadura, goma de mascar, o similar. Un jarabe puede contener, en adición a los compuestos activos, sacarosa como un agente edulcorante, y ciertos conservadores, tintes, colorantes, y saborizantes . La sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, también se puede mezclar con otros materiales activos que no perjudiquen la acción deseada, o con materiales que complementen la acción deseada, tales como antiácidos, bloqueadores de H2 , y diuréticos. El ingrediente activo es un compuesto o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe en la presente. Se pueden incluir concentraciones más altas, de hasta aproximadamente el 98% en peso del ingrediente activo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluidos en las tabletas son aglutinantes, lubricantes, diluyentes, agentes desintegrantes, agentes colorantes, agentes saborizantes, y agentes humectantes. Las tabletas con recubrimiento entérico, debido al recubrimiento entérico, resisten a la acción del ácido del estómago, y se disuelven o se desintegran en los intestinos neutros o alcalinos. Las tabletas recubiertas con azúcar son tabletas comprimidas a las cuales se les aplican diferentes capas de sustancias farmacéuticamente aceptables. Las tabletas recubiertas con película son tabletas comprimidas que se han recubierto con un polímero u otro recubrimiento adecuado. Las tabletas múltiplemente comprimidas son tabletas comprimidas hechas mediante más de un ciclo de compresión utilizando las sustancias farmacéuticamente aceptables previamente mencionadas. También se pueden utilizar agentes colorantes en las formas de dosificación anteriores. Los agentes saborizantes y edulcorantes se utilizan en tabletas comprimidas, tabletas recubiertas con azúcar, tabletas múltiplemente comprimidas, y tabletas mastica-bles. Los agentes saborizantes y edulcorantes son en especial útiles en la formación de tabletas masticables y grageas. Las formas de dosificación oral líquidas incluyen soluciones acuosas, emulsiones, suspensiones, soluciones y/o suspensiones reconstituidas a partir de gránulos no efervescentes, y preparaciones efervescentes reconstituidas a partir de gránulos efervescentes. Las soluciones acuosas incluyen, por ejemplo, elíxires y jarabes. Las emulsiones son de aceite en agua o de agua en aceite. Los elíxires son preparaciones hidroalcohólicas edulcoradas transparentes. Los vehículos farmacéuticamente aceptables utilizados en los elíxires incluyen solventes. Los jarabes son soluciones acuosas concentradas de un azúcar, por ejemplo sacarosa, y pueden contener un conservador. Una emulsión es un sistema de dos fases, en donde se dispersa un líquido en la forma de pequeños glóbulos a través de otro líquido. Los vehículos farmacéuticamente aceptables utilizados en las emulsiones son líquidos no acuosos, agentes emulsionantes, y conservadores. Las suspensiones utilizan agentes de suspensión y conservadores farmacéuticamente aceptables. Las sustancias farmacéuticamente aceptables utilizadas en los gránulos no efervescentes, para reconstituirse en una forma de dosificación oral líquida, incluyen diluyentes, edulcorantes, y agentes humectantes. Las sustancias farmacéuticamente aceptables utilizadas en los gránulos efervescentes, para reconstituirse en una forma de dosificación oral líquida, incluyen ácidos orgánicos y una fuente de dióxido de carbono. En todas las formas de dosificación anteriores se utilizan agentes colorantes y saborizantes . Los solventes incluyen glicerina, sorbitol, alcohol etílico, y jarabe. Ejemplos de los conservadores incluyen glicerina, metil- y propil -parabeno , ácido benzoico, benzoato de sodio, y alcohol. Ejemplos de los líquidos no acuosos utilizados en las emulsiones incluyen aceite mineral y aceite de semilla de algodón. Ejemplos de los agentes emulsionantes incluyen gelatina, acacia, tragacanto, bentonita, y tensoactivos tales como mono-oleato de polioxietileno sorbitán. Los agentes de suspensión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, pectina, tragacanto, Veegum, y acacia. Los diluyentes incluyen lactosa y sacarosa. Los agentes edulcorantes incluyen sacarosa, jarabes, glicerina, y agentes edulcorantes artificiales tales como sacarina. Los agentes humectantes incluyen monoestearato de propilenglicol , mono-oleato de sorbitán, monolaurato de dietilenglicol , y lauril-éter de polioxietileno. Los aditivos orgánicos incluyen ácido cítrico y tartárico. Las fuentes de dióxido de carbono incluyen bicarbonato de sodio y carbonato de sodio. Los agentes colorantes incluyen cualquiera de los tintes FD y C solubles en agua certificados aprobados, y mezclas de los mismos. Los agentes saborizantes incluyen saborizantes naturales extraídos de plantas, tales como frutas, y mezclas sintéticas de compuestos que produzcan una sensación de sabor agradable. Para una forma de dosificación sólida, la solución o suspensión, por ejemplo en carbonato de propileno, aceites vegetales, o triglicéridos , se encapsula en una cápsula de gelatina. Estas soluciones, y su preparación y encapsulacion, se dan a conocer en las patentes US 4,328,245; 4,409,239; y 4,410,545. Para una forma de dosificación líquida, la solución, v.gr., en polietileno glicol, se puede diluir con una cantidad suficiente de un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, v.gr. , agua, para medirse fácilmente para su administración. De una manera alternativa, se pueden preparar formulaciones orales líquidas o semi-sólidas mediante la disolución o dispersión de la sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma en aceites vegetales, glicoles, triglicéridos, propileno glicol -ésteres (v.gr., carbonato de propileno), y otros vehículos, y mediante la encapsulacion de estas soluciones o suspensiones en cubiertas de cápsulas de gelatina dura o blanda. Otras formulaciones útiles incluyen las estipuladas en las patentes US Re 28,819 y 4,358,603.
Las formulaciones adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen, por ejemplo, grageas que contengan a la sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; y pastillas que contengan al compuesto en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia. En todas las formas de realización, las formulaciones de tabletas y cápsulas se pueden recubrir como es conocido por los técnicos en este campo, con el objeto de modificar o sostener la disolución del ingrediente activo. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden recubrir con un recubrimiento convencional entéricamente digerible, tal como salicilato de fenilo, ceras, y ftalato de acetato de celulosa. 2. Inyectables, Soluciones y Emulsiones En la presente también se contempla la administración parenteral de la sHASEGP o de un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, caracterizada en general por inyección, ya sea subcutáneamente, intramuscularmente , o intravenosamente. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de su inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, suero, dextrosa, glicerol, o etanol . Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se vayan a administrar, también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH, estabilizantes, mej oradores de solubilidad, y otros agentes, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina , y ciclodextrinas . En la presente también se contempla la implantación de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida, de tal manera que se mantenga un nivel constante de dosificación (ver, v.gr. , la patente US 3,710,795). El porcentaje de la sHASEGP o de un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, contenido en estas composiciones parenterales , depende de su naturaleza específica, así como de la actividad del compuesto y de las necesidades del sujeto. La administración parenteral de las composiciones incluye la administración intravenosa, subcutánea, e intramuscular. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles en seco estériles, tales como polvos liofilizados , listos para combinarse con un solvente o solución estéril justo antes de usarse, incluyendo tabletas hipodérmicas , suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para combinarse con un vehículo justo antes de usarse, y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas . Si se administran intravenosamente, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológico o solución salina regulada con fosfato (PBS) , y las soluciones contienen agentes espesantes y solubilizantes , tales como glucosa, polietileno glicol, y polipropileno glicol, y mezclas de los mismos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables utilizados en las preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotonicos, reguladores del pH, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y de dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes, y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de los vehículos acuosos incluyen Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringers, Inyección de Dextrosa Isotónica, Inyección de Agua Estéril, Dextrosa, e Inyección de Ringers Lactada. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de ajonjolí, y aceite de cacahuate. Se deben agregar agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a las preparaciones parenterales empacadas en recipientes de múltiples dosis, los cuales incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol , ésteres de ácido metil- y propil -p-hidroxibenzoico, tiomersal, cloruro de benzalconio, y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los reguladores del pH incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa , y polivinilpirrolidona . Los agentes emulsionantes incluyen Polysorbate 80 (TWEEN 80) . Un agente secuestrante o quelante e iones de metales incluye EDTA. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietileno glicol, y propileno glicol, para vehículos miscibles en agua, e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico, o ácido láctico para el ajuste del pH. La concentración del compuesto farmacéuticamente activo se ajusta de tal manera que una inyección proporciona una cantidad efectiva para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso, y la condición del paciente o animal, como se conoce en la materia. Las preparaciones parenterales en dosis unitarias se empacan en una ampolleta, un frasco, o una jeringa con una aguja. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles, como es conocido y practicado en este campo. De una manera ilustrativa, la infusión intravenosa o intra-arterial de una solución acuosa estéril que contenga un compuesto activo, es un modo de administración efectivo. Otra forma de realización es una solución o suspensión acuosa u oleosa estéril que contenga un material activo inyectado como sea necesario para producir el efecto farmacológico deseado. Los inyectables se diseñan para administración local y sistémica. Típicamente, una dosificación terapéuticamente efectiva se formula para contener una concentración de cuando menos aproximadamente el 0.1% en peso/peso hasta aproximadamente el 90% en peso/peso o más, de preferencia más del 1% en peso/peso del compuesto activo a los tejidos tratados. El ingrediente activo, tal como una sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, se puede administrar todo a la vez, o se puede dividir en un número de dosis más pequeñas para administrarse a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento son una función del tejido que se esté tratando, y se pueden determinar empíricamente empleando los protocolos de prueba conocidos, o mediante extrapolación a partir de los datos de prueba in vivo o in vitro. Se debe observar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la edad del individuo tratado. Se debe entender además que, para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar sobre el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las formulaciones, y que los intervalos de concentración estipulados en la presente son solamente de ejemplo, y no pretenden limitar el alcance o la práctica de las formulaciones reivindicadas. Los compuestos proporcionados en la presente se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, v.gr., mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, v.gr., en ampolletas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes, y/o de dispersión. De una manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituirse con un vehículo adecuado, v.gr., agua estéril exenta de pirógeno u otros solventes, antes de usarse. Por ejemplo, en la presente se proporcionan formulaciones parenterales que contienen una cantidad efectiva de sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, tal como de 500 a 500,000 Unidades, en una solución estabilizada o en una forma liofilizada. El compuesto se puede suspender en una forma microniza-da o en otra forma adecuada, o se puede derivar para producir un producto activo más soluble, o para producir un profármaco. La forma de la mezcla resultante depende de un número de factores, incluyendo el modo de administración pretendido y la solubilidad del compuesto en el portador o vehículo seleccionado. La concentración efectiva es suficiente para disminuir los síntomas de la condición, y se puede determinar de una manera empírica. 3. Polvos Liofilizados En la presente también se proporcionan polvos liofili- zados que contienen sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, que se pueden reconstituir para administrarse como soluciones, emulsiones, y otras mezclas. Estas formulaciones también se pueden reconstituir y formular como sólidos o geles . El polvo liofilizado estéril se prepara disolviendo una porción sólida de, o mezclando una alícuota de, una solución que contenga una sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, en un solvente adecuado. El solvente puede contener un excipiente que mejore la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o de la solución reconstituida, preparada a partir del polvo. Los excipientes que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa, lactosa, u otro agente adecuado. El solvente también puede contener un regulador del pH, tal como citrato, fosfato de sodio o de potasio, u otro regulador conocido por los técnicos en la materia, típicamente a un pH aproximadamente neutro. La filtración estéril subsecuente de la solución, seguida por liofiliza-ción bajo condiciones convencionales conocidas para los técnicos en la materia, proporciona la formulación liofilizada. En general, la solución resultante de la filtración estéril se distribuye en frascos para liofilización . Cada frasco puede contener una sola dosificación, tal como de 10-1,000 mg, o de 100-500 mg, o múltiples dosificaciones del compuesto.
Dicho de una manera breve, el polvo liofilizado se prepara mediante la disolución de dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa, lactosa u otro agente adecuado, en de aproximadamente el 1 al 20%, en un regulador adecuado, tal como citrato, fosfato de sodio de potasio, u otro regulador conocido por los técnicos en la materia, a un pH aproximadamente neutro. Luego se agrega a la mezcla resultante una sal seleccionada, tal como, por ejemplo, la sal sódica de la sHASEGP (aproximadamente 1 g de la sal por 10-100 g de la solución reguladora, típicamente aproximadamente 1 g/30 g) , arriba de la temperatura ambiente, tal como de aproximadamente 30-35°C, y se agita hasta que se disuelva. La mezcla resultante se diluye mediante la adición de más regulador, para reducir la concentración resultante de la sal por de aproximadamente el 10-50%, típicamente de aproximadamente el 15-25%. La mezcla resultante se filtra estéril, o se trata para remover las partículas y para asegurar la esterilidad, y se distribuye en frascos para la liofilización . El polvo liofilizado se puede almacenar bajo condiciones apropiadas, tales como de aproximadamente 4°C hasta la temperatura ambiente. La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para inyección proporciona una formulación para utilizarse en la administración parenteral . Para su reconstitución, se agrega una cantidad terapéuticamente efectiva del polvo liofilizado conteniendo una sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma por mi de agua estéril u otro vehículo adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado y se puede determinar empíricamente mediante métodos conocidos por los técnicos en este campo. 4. Administración Tópica Las mezclas tópicas se preparan como se describe para la administración local y sistémica. Administración tópica, la cual en ocasiones es referida en la materia como administración percutánea, típicamente involucra aplicaciones diseñadas para absorción a través de la piel, membranas mucosas u otras superficies del cuerpo (v.gr. , aplicaciones aplicadas directamente sobre la piel, bajo la lengua (sublinguales), contra la mejilla (bucal) , a los ojos, nariz u orejas, o a los pulmones (inhalación) ) . La mezcla resultante puede ser una solución, suspensión, emulsión, o similar, y se formula como cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elíxires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, rocíos, supositorios, parches, parches dérmicos, o cualesquiera otras formulaciones adecuadas para administración tópica. Las composiciones de sHASEGP o un dominio de hialuroni-dasa humano soluble de la misma, o de los derivados farmacéuticamente aceptables de la misma, se pueden formular como aerosoles para aplicación tópica, tal como mediante inhalación (ver, por ejemplo, las patentes US 4,044,126, 4,414,209, y 4,364,923, las cuales describen aerosoles para el suministro de un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en particular asma) . Estas formulaciones para administración al tracto respiratorio pueden estar en la forma de un aerosol o de una solución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solo o en combinación con un vehículo inerte, tal como lactosa. En ese caso, las partículas de la formulación normalmente tendrán diámetros menores a 50 mieras, tales como menores a 10 mieras. Para la administración mediante inhalación, las composiciones para utilizarse en la presente se pueden suministrar en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de paquetes presurizados o de un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, incluyendo, pero no limitándose a, dicloro-difluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, y otros gases adecuados. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos, v.gr. , de gelatina, para utilizarse en un inhalador o insuflador, conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón. Las composiciones se pueden formular para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica a la piel y a las membranas mucosas, tales como en el ojo, en la forma de geles, cremas, y lociones, y para aplicarse al ojo, o para aplicación intracisternal o intraespinal . La administración tópica se contempla para el suministro transdérmico , y también para administrarse a los ojos o a la mucosa, o para las terapias de inhalación. También se pueden administrar soluciones nasales del compuesto activo solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas para aplicación tópica a la piel o al ojo en general se formulan como un ungüento, crema, loción, pasta, gel, rocío, aerosol, y aceite. Los vehículos que se pueden utilizar incluyen vaselina, lanolina, polietileno glicoles, alcoholes, y combinaciones de dos o más de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden contener además convenientemente del 0.05 al 15% en peso de espesantes, incluyendo, pero no limitándose a, hidroxipropilmetilcelulosa , metilcelu-losa, polivinilpirrolidona, poli-alcohol vinílico, poli- (alqui-lenglicoles) , poli/hidroxi-alquilo, (met ) acrilatos , o poli- (met) -acrilamidas. Una formulación tópica se aplica con frecuencia mediante instilación o como un ungüento en el saco conjuntivo. También se puede utilizar para irrigación o lubricación del ojo, de los senos faciales, y del meato auditivo externo. Las formulaciones tópicas en el estado líquido también pueden estar presentes en una matriz polimérica tridimensional hidrófila en la forma de una tira, lentes de contacto, y similares, desde donde se liberan los componentes activos. También se puede inyectar en la cámara anterior del ojo y en otros lugares. Por ejemplo, en la presente se proporciona una formulación para uso intraocular después de la inyección viscoelástica conteniendo una solución estabilizada de una cantidad efectiva de una sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, tal como de 1 a 5,000 Unidades de la glicoproteína soluble, con de 30 a 150,000 Unidades/mg de actividad específica, en un volumen pequeño, tal como de 5 a 50 µ? . Como otro ejemplo, se provee en la presente una formulación para uso intraocular para mejorar la entrega de uno o mas agentes farmacológicos a tejidos dentro del ojo siguiendo a inyección por vías de administración tales como una inyección sub-Tenón dentro del espacio episcleral rodeando la esclera, comprendiendo una solución estabilizada de una cantidad efectiva de una sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, tal como 50 a 5,000 Unidades de glicoproteína soluble con 30 a 150,000 Unidades/mg de actividad específica, en un volumen tal como 0.05 a 10 mi. Estas soluciones, en particular las pretendidas para uso oftálmico, se pueden formular como soluciones isotónicas del 0.01%-10%, a un pH de aproximadamente 5-7, con las sales apropiadas . Co-Aplicaciones Con Iontoforesis En el caso de administraciones tópicas y otras aplicaciones a tejidos que son susceptibles a iontoforesis, el uso de una o mas sHASEGPs (potencialmente co- formuladas o coadministradas con otro farmacológico u otro agente) pueden combinarse con técnicas iontoforéticas de manera que impulse adicionalmente la permeación de un tejido. En este respecto, iontoforesis y sHASEGPs pueden funcionar cooperativamente en que la iontoforesis puede promover el suministro de sHASEGPs dentro de un tejido u otra ubicación dentro del cuerpo, y la sHASEGP así suministrada puede adicionalmente impulsar la permeación de la enzima, así como moléculas co- formuladas o co-administradas u otras presentes en el tejido, es decir, mediante abrir enzimáti-camente canales que facilitan difusión así como promover flujo de fluidos en volumen y así transporte convectivo de solutos tales como farmacológicos. 5. Composiciones para Otras Vías de Administración En la presente también se contemplan otras vías de administración, tales como aplicación tópica, parches transdérmi-cos , y administración rectal. Por ejemplo, las formas de dosificación farmacéuticas para administración rectal son supositorios, cápsulas, y tabletas rectales para efecto sistémico. Como se utilizan en la presente, los supositorios rectales significan cuerpos sólidos para insertarse en el recto, que se funden o se reblandecen a la temperatura del cuerpo, liberando uno o más ingredientes farmacológicamente o terapéuticamente activos. Las sustancias farmacéuticamente aceptables en los supositorios rectales son bases o vehículos y agentes para elevar el punto de fusión. Ejemplos de las bases incluyen manteca de cacao (aceite de teobroma) , glicerina-gelatina, carbocera (polioxietileno glicol ) , y mezclas apropiadas de mono-, di-, y tri -glicéridos de ácidos grasos. Se pueden utilizar combinaciones de diferentes bases. Los agentes para elevar el punto de fusión de los supositorios incluyen espermacetos y cera. Los supositorios rectales se pueden preparar ya sea mediante el método comprimido, o bien mediante moldeo. El peso típico de un supositorio rectal es de aproximadamente 2 a 3 g. Las tabletas y cápsulas para administración rectal se fabrican utilizando la misma sustancial farmacéuticamente aceptable y mediante los mismos métodos que para las formulaciones para administración oral. Las formulaciones adecuadas para administración transdérmica se pueden presentar como parches separados adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período de tiempo prolongado. Tales parches adecuadamente contienen al compuesto activo como una solución acuosa opcionalmente regulada, de una concentración, por ejemplo, de 0.1 a 0.2 M con respecto al compuesto activo. Las formulaciones adecuadas para administración transdérmica también se pueden suministrar mediante iontoforesis (ver, v.gr., Pharmaceutical Research 3(6) :318 (1986)), y típicamente toman la forma de una solución acuosa opcionalmente regulada del compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por medios y/o dispositivos de suministro de liberación controlada (ver, v.gr., patentes US 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533; y 5,733,566). Los compuestos activos o los derivados farmacéuticamente aceptables se pueden preparar con vehículos que protejan al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como formulaciones o recubrimientos de liberación en tiempo. En una forma de realización de las composiciones y métodos proporcionados en la presente, el agente terapéutico se administra localmente en un vehículo de suministro de liberación lenta, por ejemplo, encapsulado en un sistema de dispersión coloidal o en cristales estabilizados con polímero. Los sistemas de dispersión coloidal útiles incluyen nanocápsulas , microesfe-ras, perlas, y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelios, micelios mixtos, y liposomas. Por ejemplo, el sistema de dispersión coloidal puede ser un liposoma o una microesfera. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de suministro de liberación lenta cuando se inyectan o se implantan. Algunos ejemplos de conjugados de lípido-polímero y liposomas se dan a conocer en la patente US 5,631,018, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Otros ejemplos de vehículos de suministro de liberación lenta son las matrices de hidrogel biodegradables (patente US 5,041,292) , los conjugados de polímeros dendríticos (patente US 5,714,166), y los liposomas multivesiculares (Depofoam, Depotech, San Diego, California, Estados Unidos) (patentes US 5,723,147 y 5,766,627). Un tipo de microesferas adecuadas para encapsular agentes terapéuticos para inyección local (por ejemplo, en el tejido subdérmico) es el de las microesferas de poli- (D, L) -láctido, como se describen en D. Fletcher, Anesth. Analg. 84:90-94 (1997). Por ejemplo, se puede emplear una formulación de liberación lenta que contenga una cantidad efectiva de sHASEGP o de un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, tal como de 1 a 5,000 Unidades/ml, para diferentes usos o para tratar diferentes condiciones, incluyendo, pero no limitándose a, formulaciones cosméticas, tratamiento de lesiones de la médula espinal y otros desordenes del sistema nervioso, ciertos desordenes oftálmicos, condiciones inflamatorias o auto- inmunes , cánceres, y otras condiciones de enfermedad crónica, en las cuales suministro prolongado de la sHASEGP es benéfico. Se pueden mantener niveles en sangre deseables mediante una infusión continua del agente activo como se asevera, mediante los niveles en plasma. Se debe observar que el médico que atienda sabría cómo y cuándo terminar, interrumpir, o ajustar la terapia a una dosificación más baja debido a la toxicidad, o a disfunciones de la médula ósea, del hígado, o del riñon. Inversamente, el médico que atienda sabría cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica no es adecuada (precluyendo los efectos secundarios tóxicos) . La eficacia y/o toxicidad del polipéptido de sHASEGP y/o de sus inhibidores, solos o en combinación con otros agentes, tales como agentes terapéuticamente efectivos, también se puede evaluar mediante métodos conocidos en la materia (ver, por ejemplo, 0 & Apos; Reilly, Investigational New Drugs 15:5-13 (1997) ) . 6. Artículos de Manufactura Los polipéptidos de sHASEGP o los dominios de hialuro-nidasa humanos solubles de los mismos, o las composiciones que contienen a cualquiera de los agentes anteriores, se pueden empacar como artículos de manufactura conteniendo el material de empaque, un compuesto o derivado adecuado del mismo proporcionado en la presente, que sea efectivo para el tratamiento de enfermedades o trastornos contemplados en la presente, adentro del material de empaque, y una etiqueta que indique que el compuesto o un derivado adecuado del mismo es para el tratamiento de las enfermedades o trastornos contemplados en la presente. La etiqueta también puede incluir opcionalmente los trastornos para los cuales se garantiza la terapia. Los artículos de manufactura proporcionados en la presente contienen materiales de empaque. Los materiales de empaque para utilizarse en el empaque de productos farmacéuticos son bien conocidos por los técnicos en este campo (ver, v.gr., patentes US 5,323,907; 5,052,558; y 5,033,352). Los ejemplos de los materiales de empaque farmacéuticos incluyen, pero no se limitan a, paquetes de ampolla, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, frascos, envases, jeringas, y cualquier material de empaque adecuado para una formulación seleccionada y un modo pretendido de administración y tratamiento. En la presente se contempla un amplio conjunto de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionados en la presente, así como una variedad de tratamientos para cualquier trastorno en donde esté implicada la infección por HCV, como un mediador o contribuyente para los síntomas o la causa. En la presente también se proporcionan kits terapéuticos que contienen a las composiciones y/o las combinaciones con instrucciones para su administración. El kit terapéutico puede incluir además una aguja o jeringa, típicamente empacada en una forma estéril, para inyectar el complejo, y/o un co ín de alcohol empacado. Opcionalmente se incluyen instrucciones para la administración del agente activo por parte de un clínico o por el paciente. Por ejemplo, en la presente se proporciona un kit terapéutico que contiene una jeringa de pequeño volumen con una cantidad efectiva de sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, tal como de 1 a 5,000 Unidades de la glicoproteína soluble, en un volumen de 5 a 50 µ?, conteniendo opcionalmente una segunda jeringa que contenga un viscoelástico . En la presente también se proporciona un kit terapéutico que contiene una jeringa de volumen pequeño que contiene una cantidad efectiva de sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma, tal como de 1 a 500 Unidades de la glicoproteína soluble, y una cantidad terapéutica de un segundo ingrediente activo, tal como un fármaco, una molécula pequeña, una proteína, o un ácido nucleico. K. MODELOS ANIMALES En la presente se proporcionan modelos animales transgénicos , y animales, tales como roedores, incluyendo ratones y ratas, reses, pollos, cerdos, cabras, ovejas, monos, incluyendo gorilas, y otros primates. En particular, se proporcionan animales transgénicos no humanos que contienen ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de sHASEGP, o un animal transgénico en el que se ha alterado la expresión del polipéptido, tal como mediante el reemplazo o la modificación de la región promotora u otra región reguladora del gen endógeno. Tal un animal se puede producir promoviendo la recombinación entre el ácido nucleico endógeno y un gen de sHASEGP exógeno que se podría sobre-expresar o expresar mal, tal como mediante la expresión bajo un promotor fuerte, mediante un evento homólogo u otro evento de recombinación. Los animales transgénicos se pueden producir mediante la introducción del ácido nucleico empleando cualquier método conocido de suministro, incluyendo, pero no limitándose a, microinyección, lipofección, y otros modos de suministro de genes en una célula de la línea germinal o en las células somáticas, tales como una célula madre embrionaria. Típicamente, el ácido nucleico se introduce en una célula, tal como una célula madre embrionaria (ES) , seguido por la inyección de las células madres embrionarias en un blastocito, y la implantación del blastocito en la madre adoptiva, lo cual es seguido por el nacimiento de un animal transgénico. En general, la introducción de una molécula de ácido nucleico heteróloga en un cromosoma del animal se presenta mediante una recombinación entre el ácido nucleico que codifica la por sHASEGP heterologo y el ácido nucleico endógeno. El ácido nucleico heterologo se puede dirigir hacia un cromosoma específico. En algunos casos, se pueden producir animales con eliminación genética. Tal un animal se puede producir inicialmen-te promoviendo la recombinación homologa entre un gen del polipéptido de sHASEGP en su cromosoma, y un gen del polipéptido de sHASEGP exógeno que se haya hecho biológicamente inactivo (típicamente mediante la inserción de una secuencia heteróloga, v.gr., un gen de resistencia a antibióticos) . En una forma de realización, esta recombinación homologa se lleva a cabo mediante la transformación de células madres derivadas de embrión (ES) con un vector que contenga el gen del polipéptido de sHASEGP insercionalmente inactivado, de tal manera que se presente la recombinación homologa, seguida por la inyección de las células madres embrionarias en un blastocito, y la implantación del blastocito en una madre adoptiva, seguida por el nacimiento del animal quimérico ("animal con eliminación genética"), en el cual se haya inactivado un gen del polipéptido de sHASEGP (ver Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)). El animal quimérico se puede reproducir para producir animales con eliminación genética homocigóticos , los cuales luego se pueden utilizar para producir animales con eliminación genética adicionales. Los animales con eliminación genética incluyen, pero no se limitan a, ratones, hámsteres, ovejas, cerdos, reses, y otros mamíferos no humanos. Por ejemplo, se produce un ratón con eliminación genética. Los animales resultantes pueden servir como modelos de enfermedades específicas, tales como cánceres, que exhiban una sub-expresión de un polipéptido de sHASEGP . Estos animales con eliminación genética se pueden utilizar como modelos animales de estas enfermedades, por ejemplo, para rastrear o probar moléculas para determinar su capacidad para tratar o prevenir tales enfermedades o trastornos. También se pueden producir otros tipos de animales transgénicos , incluyendo aquéllos que sobre-expresen el polipéptido de sHASEGP. Estos animales incluyen los animales con "adición genética" , que son animales en los que el gen normal es reemplazado por una variante, tal como mutante, una forma sobre-expresada, u otra forma. Por ejemplo, el gen de una especie, tal como un gen endógeno de roedor, puede ser reemplazado por el gen de otra especie, tal como de un ser humano. También se pueden producir animales mediante recombinación no homologa en otros sitios de un cromosoma; incluyendo animales que tengan una pluralidad de eventos de integración. Después de la producción del animal transgénico de la primera generación, se puede reproducir un animal quimérico para producir animales adicionales con los polipéptidos de sHASEGP sobre-expresados o mal expresados. Estos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, hámsteres, ovejas, cerdos, reses, y otros mamíferos no humanos. Los animales resultantes pueden servir como modelos de enfermedades específicas, tales como cánceres, que exhiban una sobre-expresión o una mala expresión de un polipéptido de sHASEGP . Tales animales se pueden utilizar como modelos animales de tales enfermedades, por ejemplo para rastrear o probar moléculas para determinar su capacidad para tratar o prevenir estas enfermedades o trastornos. En una forma de realización específica, se produce un ratón con el polipéptido de sHASEGP sobre-expresado o mal expresado. Los siguientes ejemplos se incluyen para propósitos ilustrativos solamente, y no pretenden limitar el alcance de la invención . L. USOS TERAPÉUTICOS DE LA sHASEGP Las enzimas de hialuronidasa que se presentan naturalmente de los rastros han sido la fuente principal de las preparaciones enzimáticas clínicas durante más de 40 años. Los testículos bovinos y ovinos son la principal fuente de este material. Sin embargo, estas preparaciones enzimáticas clínicas son muy crudas, y se venden en preparaciones con una pureza en el intervalo del 0.5-5%, basándose en las actividades específicas conocidas de entre 30-100,000 Unidades/mg. Por consiguiente, su carencia de pureza combinada con su origen en el rastro, las deja tanto como inmunogénicas para los seres humanos, y como una fuente potencial de la enfermedad de Jacob Creutzfeld y otros patógenos bovinos y ovinos. Se sabe que se presentan reacciones anafilácticas a las preparaciones de hialuronidasa bovinas y ovinas . La hialuronidasa de res o bacterianamente derivada se ha utilizado en el tratamiento de enfermedades asociadas con un exceso de ácido hialurónico, y para mejorar la circulación de los fluidos fisiológicos y/o de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, la hialuronidasa bovina se puede co- inyectar con anestesia en los procedimientos quirúrgicos teribulbares , retrobulbares , y en los bloques de sub-tenón para procedimientos quirúrgicos oftálmicos. Más aún, se presentan mayores complicaciones quirúrgicas en su ausencia (Brown SM y colaboradores, J". Cataract. Refract. Surg . septiembre de 1999; 25 (9) : 1245-9) . La hialuronidasa bovina también se utiliza como un antídoto para la necrosis local por la inyección paravenosa de sustancias necróticas tales como los alcaloides vinca (Few, B.J. (1987) A er. J. Matern. Child Nurs . 12, 23-26) . La hialuronidasa de testículos bovinos también es útil para el tratamiento de los quistes de los ganglios (Paul y colaboradores, J. Hang Surg, abril de 1997; 22(2) :219-21) . La hialuronidasa también se puede utilizar para facilitar el suministro subcutáneo de fluidos en la hipodermoclisis (Berger EY, Am Geriatr. Soc . , marzo 1984; 32(3)-199-203) . La hialuronidasa también se ha utilizado para reducir la presión intraocular en los ojos de los pacientes de glaucoma y de los pacientes de cataratas que reciben viscoelásticos (patente US 4,820,516 expedida el 11 de abril de 1989). Las hialuronidasas de res o bacterianamente derivadas también se han utilizado como un "agente de extensión" para mejorar la actividad de los productos quimioterapéuticos , y/o la accesibilidad de los tumores a los productos quimioterapéuticos (Schuller y colaboradores, 1991, Proc . Amer. Assoc. Cáncer Res. 32 : 173 , extracto número 1034; Czejka y colaboradores, 1990, Pharmazie 45:H.9) . La quimioterapia de combinación con hialuronidasa es efectiva en el tratamiento de una variedad de cánceres, incluyendo cáncer de vejiga urinaria (Horn y colaboradores, 1985, J. Surg. Oncol . 28:304-307), carcinoma de células escamosas (Kohno y colaboradores, 94, J". Cáncer Res. Oncol. 120:293-297), cáncer de mama (Beckenlehner y colaboradores, 1992, J. Cáncer Res. Oncol. 118:591-596), y cáncer gastrointestinal (Scheithauer y colaboradores, 1988, Anticancer Res. 8:391-396) . La hialuronidasa es efectiva como el único agente terapéutico en el tratamiento de cáncer de mama (gliomas) (solicitud internacional WO 88/02261, publicada el 7 de abril de 1988) . La administración de hialuronidasa también induce la respuesta de los tumores previamente resistentes a la quimioterapia del páncreas, estómago, colon, ovarios, y mama (Baumgartner y colaboradores, 1988, Reg. Cáncer Treat. 1:55-58; Zanker y colaboradores, 1986, Proc . Amer. Assoc. C ncer Res. 27:390) . Desafortunadamente, los contaminantes y la naturaleza no humana de estas hialuronidasas , dan como resultado reacciones anafilácticas . Además de sus efectos indirectos contra el cáncer, la hialuronidasa derivada de res tiene efectos anti -carcinógenos directos. La hialuronidasa previene el crecimiento de tumores trasplantados en ratones (De Maeyer y colaboradores, 1992, Int. J. Cáncer 51:657-660) , e inhibe la formación de tumor después de su exposición a carcinógenos (Pawlowski y colaboradores, 1979, Int. J. Cáncer 23:105-109; Haberman y colaboradores, 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 22:105, extracto número 415) . Dado el valor de las hialuronidasas derivadas de res como un producto terapéutico, en particular en la quimioterapia en conjunto con productos quimioterapéuticos convencionales, o como un producto quimioterapéutico en y por sí mismas, existe una necesidad en el campo de preparaciones sustancialmente puras de hialuronidasa de origen humano. También existe una necesidad de métodos eficientes y efectivos por el costo para fabricar la hialuronidasa con el fin de proporcionar cantidades comercialmen-te significativas de la enzima. La presente invención resuelve estos problemas .
El ácido hialurónico es un componente esencial de la matriz extra-celular. El ácido hialurónico se encuentra en el tejido conectivo de los mamíferos, y es el constituyente principal del vitreo del ojo. En el tejido conectivo, el agua de la hidratación asociada con el ácido hialurónico crea espacios entre los tejidos, creando de esta manera un medio ambiente que conduce al movimiento y la proliferación celular. El ácido hialurónico tiene un papel clave en los fenómenos biológicos asociados con la movilidad celular, incluyendo un rápido desarrollo, regeneración, reparación, embriogénesis , desarrollo embriológico, sanado de heridas, angiogénesis , y tumorigénesis (Toóle, 1991, Cell Biol . Extracell . Matriz, Hay (ed) , Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand y colaboradores, 1992, Int. J. Cáncer 52:1-6; Knudson y colaboradores, 1993, FASEB J. 7:1233-1241) . Además, los niveles de ácido hialurónico se correlacionan con la agresividad del tumor (Ozello y colaboradores, 1960, Cáncer Res. 20:600-604, Takeuchi y colaboradores, 1976, Cáncer Res. 36:2133-2139; Kimata y colaboradores, 1983, Cáncer Res. 43:1347-1354). Siguiendo a lesión de médula espinal, se producen cicatrices gliales mediante los astrocitos, y contienen proteo-glicanos de sulfato de condroitina (CSPGs) . Los CSPGs tienen un papel crucial en la inhibición del crecimiento de los axones (Levine, 1994; Powell y colaboradores, 1997). Por ejemplo, durante el desarrollo fetal, los CSPGs repelen a los axones e inhiben la adhesión celular neural . Los CSPGs también tienen un papel importante en la formación de límites (Snow y colaboradores, 1990, 1992; Powell y Geller, 1999). En adición, aumenta la expresión de los CSPGs en seguida de lesión del sistema nervioso central (Mckeon y colaboradores, 1991; Davies y colaboradores, 1997) . Los estudios indican que los efectos inhibidores de los CSPGs se deben principalmente a la cadena de azúcar del glicosa-minoglicano (GAG) del sulfato de condroitina (CS) (Snow y colaboradores, 1990; Colé y McCable, 1991; Geisert y Bidanset, 1993) . Esto es apoyado por el descubrimiento de que la administración de condroitinasa bacteriana de hecho promueve la regeneración de axones cuando se administra intratecalmente . Más aún, los experimentos electrofisiológicos determinaron que los axones CST regenerados establecían conexiones funciones (Bradbury y colaboradores, 2002) . En adición a sus efectos inhibidores directos, los CSPGs también podrían interactuar con las moléculas de adhesión celular o con los factores neurotróficos para tener influencia sobre el crecimiento excesivo de las neuritas (Roberts y colaboradores, 1988; Ruoslahti y Yamaguchi, 1991; Milev y colaboradores, 1994) . Por consiguiente, las hialuronidasas de mamífero recombinantes son útiles para revertir la inhibición de los CSPGs en la cicatrización glial, y para promover la regeneración de axones en seguida de la lesión. La cantidad de sHASEGP requerida para degradar suficientemente los CSPGs en la cicatrización glial variará. En algunos casos, se requerirá una administración repetida de 10 a 5,000 Unidades de sHASEGP mediante suministro intratecal, para remover los CSPGs en la cicatriz. En otros casos, se puede preferir la liberación sostenida de sHASEGP a través del uso de una formulación de liberación lenta. De una manera alternativa, la administración de vectores de terapia génica que codifiquen sHASEGP puede ser efectiva para mejorar la liberación de los CSPGs . Las sHASEGPs también se pueden utilizar para el tratamiento de discos herniados en un proceso conocido como quimionucleólisis . La condroitinasa ABC, y los sustratos similares de disociación enzimática como sHASEGP, pueden inducir la reducción de la presión intradiscal en la espina lumbar.
(Sasaki y colaboradores, 2001; Ishikawa y colaboradores, 1999) . Existen tres tipos de lesiones de discos. Un disco sobresaliente es uno que está intacto pero abultado. En un disco extruido, la envoltura fibrosa se ha desgarrado, y se ha salido la NP, pero todavía está conectada al disco. En un disco secuestrado, se ha roto y aflojado un fragmento de la NP del disco, y está libre en el canal espinal . La quimionucleólisis es efectiva sobre los discos abultados y extrudidos, pero no sobre las lesiones de discos secuestrados. En los Estados Unidos, la quimionucleólisis está aprobada solamente para utilizarse en la espina lumbar (inferior) . En otros países, también se ha utilizado con éxito para tratar hernias cervicales (espina superior) . Por consiguiente, la quimionucleólisis es una alternativa conservadora a la cirugía de discos, cuando es preferible reducir la presión del disco . La composición precisa y la estructura de las cadenas de carbohidratos sobre una glicoproteína , puede tener una influencia directa sobre su tiempo de vida en suero, debido a que las células del hígado y del sistema retículo-endotelial pueden enlazar en internalizar las glicoproteínas circulantes con carbohidratos específicos. Los hepatocitos tienen receptores sobre sus superficies que reconocen las cadenas de oligosacáridos con residuos Gal terminales (es decir, en los extremos más externos de los glicanos en relación con el polipéptido) , los macrófagos contienen receptores para los residuos Man o GlcNAc terminales, y los hepatocitos y linfocitos tienen receptores para los residuos de fucosa expuestos. Sin embargo, no se han encontrado receptores específicos de ácido siálico. Aunque depende un poco de la configuración espacial de los oligosacáridos, como regla general, mientras mayor sea el número de residuos de azúcar expuestos reconocidos por los receptores de superficie celular en el hígado y en el sistema retículo-endotelial, más rápidamente se liberará una glicoproteína del suero. Sin embargo, debido a la ausencia de receptores específicos de ácido siálico, los oligosacáridos con todas las ramificaciones terminadas, o "tapadas", con ácido siálico, no promoverán la liberación de la proteína con la que se unen. La presencia y naturaleza de las cadenas de oligosacá-ridos sobre una glicoproteína también pueden afectar a propiedades bioquímicas importantes en adición a su reconocimiento por los receptores específicos de azúcar en el hígado y en las células retículo-endoteliales . La remoción del carbohidrato de una glicoproteína usualmente reducirá su solubilidad, y también puede aumentar su susceptibilidad a la degradación proteolítica mediante la desestabilización del patrón de pliegue de polipépti-do correcto, y/o mediante el desenmascaramiento de los sitios sensibles a la proteasa. Por razones similares, el estado de glicosilación de una proteína puede afectar a su reconocimiento por parte del sistema inmune. Las sHASEGPs se pueden utilizar para remover las células de cúmulo que rodean a un huevo antes de la criopreserva-ción y otras técnicas de fertilización in vitro, tales como una inyección de esperma intracitoplásmica (ICSI) . Se puede agregar hialuronidasa a los oocitos cosechados en entre 10 y 200 Unidades/ml en soluciones de sal reguladas. Los oocitos se separan de las células de cúmulo liberadas mediante aspiración, y se lavan a través de varios lavados con un medio que carezca de hialuronidasa. Luego se pueden procesar los huevos para la criopreservación o las técnicas de IVF. Las sHASEGPs también son útiles para la penetración más efectiva de los agentes quimioterapéuticos en los tumores sólidos. Las sHASEGPs se pueden inyectar intratumoralmente con agentes contra el cáncer, o intravenosamente para los cánceres diseminados o los tumores difíciles de alcanzar. El agente contra el cáncer puede ser un producto quimioterapéutico , un anticuerpo, un péptido, o un vector de terapia génica, virus, o ADN. Adicionalmente , las sHASEGPs se pueden utilizar para reclutar células tumorales en la reserva de ciclo para la sensibilización en tumores previamente quimio-refractarios que hayan adquirido resistencia a múltiples fármacos en cultivo (St. Croix y colaboradores, Cáncer Lett., 11 de septiembre de 1998; 131(1) :35-44) . Las sHASEGPs también son útiles para mejorar el suministro de productos biológicos, tales como anti-cuerpos monoclonales , citoquinas y otros fármacos a los tumores que acumulen glicosami-noglicanos. Muchos tumores suprimen los genes involucrados en el catabolismo de los glicosaminoglicanos , de tal manera que la acumulación localizada puede impedir que los agentes antineoplásticos y el sistema inmune alcancen la masa tumoral . La sHASEGP también se puede utilizar para aumentar la sensibilidad de los tumores que sean resistentes a la quimioterapia convencional. En una forma de realización, la sHASEGP se administra a un paciente que tenga un tumor asociado con un defecto en LuCa-1 en una cantidad efectiva para aumentar la difusión alrededor del sitio del tumor (v.gr., para aumentar la circulación de los factores quimioterapéuticos , v.gr., para facilitar la circulación y/o las concentraciones de agentes quimioterapéuticos en y alrededor del sitio del tumor) , para inhibir la movilidad de las células tumorales (v.gr., mediante degradación del hialuronano) , y/o para reducir el umbral de apóptosis de las células tumorales (v.gr., para llevar a las células tumorales hasta un estado de anoiquis) , un estado que hace que las células tumorales sean más susceptibles a la acción de los agentes quimioterapéuticos y otros agentes que puedan facilitar la muerte celular, de preferencia para facilitar la muerte celular programada de las células en anoiquis. Los agentes quimioterapéuticos, como se utilizan en la presente, abarcan todas las moléculas, sintéticas (v.gr., cisplatina) así como las que se presentan naturalmente (v.gr., factor de necrosis tumoral IF) , que facilitan la inhibición del crecimiento de células tumorales, y de preferencia facilitan, y más preferiblemente facilitan de preferencia la muerte de las células tumorales. Es de un interés particular el uso de sHASEGP para el tratamiento de cánceres metastásicos y no metastásicos , en particular de cánceres metastásicos, que tengan una actividad de hialuronidasa reducida hasta indetectable en relación con las células no cancerosas (normales) . La sHASEGP se puede utilizar como un agente quimioterapéutico (sola o en combinación con otros productos quimioterapéuticos) en el tratamiento de cualquiera de una variedad de cánceres, en particular tumores invasivos. Por ejemplo, la sHASEGP se puede utilizar en el tratamiento de carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma pulmonar de células escamosas, así como cánceres de mama, ovarios, cabeza y cuello, o cualquier otro cáncer asociado con niveles deprimidos de hialuronidasa , o con un gen LuCa-1 defectuoso (hpHAsa) (v.gr., un gen LuCa-1 que no proporciona la expresión de niveles adecuados de hpHAsa, o que codifique una hpHAsa defectuosa que no proporcione un nivel adecuado de actividad de hialuronidasa) , u otro defecto asociado con el catabolismo reducido del hialurona-no. La sHASEGP es preferible para el tratamiento de malignidades asociadas con un catabolismo de hialuronano deficiente, debido a que no requiere de la participación celular para que ocurra la degradación . La dosificación específica apropiada para administración puede ser fácilmente determinada por un técnico ordinario en la materia, de acuerdo con los factores descritos anteriormente (ver, por ejemplo, Harrison's Principies of Internal Medicine, llth Ed., 1987) . Además, se pueden extrapolar las estimaciones para las dosificaciones apropiadas en seres humanos, a partir de las determinaciones del nivel de actividad enzimática de la sHASEGP in vitro, y/o las dosificaciones efectivas en estudios con animales. Por ejemplo, de 70-300 TRU de hialuronidasa son efectivas para reducir la carga tumoral en un ratón Scid. Dada esta información, las dosificaciones correspondientes en el ser humano promedio de 70 kg, estarían en el intervalo de aproximadamente 250,000-1,200,000 TRU de hialuronidasa. La cantidad de sHASEGP administrada a un paciente humano está en general en el intervalo de 1 TRU a 5,000,000 TRU de actividad enzimática, de preferencia entre aproximadamente 1,000 TRU y 2,500,000 TRU, más preferiblemente entre aproximadamente 100,000 TRU y 1,500,000 TRU, normalmente entre aproximadamente 250,000 TRU y 1,200,000 TRU, representando aproximadamente 725,000 TRU las dosis prescritas promedio. En una forma de realización, se formula una sHASEGP en una solución salina 0.15 M conteniendo sHASEGP en una concentración de aproximadamente 150,000 TRU/centímetro cúbico. Luego la formulación se inyecta intravenosamente a 15,000 TRU/kg de peso corporal del paciente. De una manera alternativa, la formulación enzimática también se puede inyectar subcutáneamente para permitir que la hialuronidasa se perfunda alrededor del sitio del tumor. En una forma de realización preferida, la sHASEGP se inyecta peritumoralmente o dentro de la masa tumoral . En otra forma de realización preferida, la sHASEGP se formula como un liposoma, y se suministra mediante inyección, ya sea intravenosamente, o bien en o cerca del sitio de las células cancerosas asociadas con un defecto en el gen LuCa-1 (hpHAsa) . La inyección de sHASEGP intravenosamente da como resultado que haya sHASEGP en el sitio del tumor. Más aún, la sHASEGP super- sialada es preferible para la administración parenteral, porque los ácidos siálicos terminales sobre la sHASEGP previenen la liberación de la enzima de la circulación por parte del sistema retículo-endotelial. Las comparaciones de la sHASEGP super-sialada con las hialuronidasas bovina y ovina no sialadas, revelan que se logra una farmacocinética sustancialmente más favorable. FACILITACIÓN DE TERAPIA GÉNICA La eficacia de la mayoría de los vehículos de suministro de genes in vivo no corresponde con la eficacia que se encuentra in vi tro. Los glicosaminoglicanos pueden impedir la transferencia y difusión del ADN y de los vectores virales hacia muchos tipos de células. Los niveles que puede impedir este material de matriz extra-celular obstaculizan el proceso de una manera considerable. Dubensky y colaboradores {Proc. Nati. Acad. Sci., diciembre de 1984; 81 (23) : 7529-33 ) demostraron que la hialuronidasa, al combinarse con colagenasa, podría facilitar la transducción del ADN in vivo. Se ha demostrado que los virus adeno-asociados también son susceptibles a la terapia génica mediada por hialuronidasa (Favre y colaboradores, Gene Ther. , agosto de 2000; 7 (16) : 1417-20) . Se ha determinado en la presente que se abren canales de un tamaño definido en la matriz extra-celular con la sHASEGP. Estos poros no mejoran la difusión de sustancias mayores de sHASEGP 200 a 500 nm de diámetro. Sin embargo, las moléculas más pequeñas, tales como los retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, y complejos de ADN, son susceptibles a la difusión mediada por sHASEGP. El hecho de que sHASEGPs generalmente actúan para abrir canales que son sustancialmente mas grandes para permitir el movimiento de la mayoría de los agentes terapéuticos u otros farmacológicos de interés (incluyendo macromoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos así como complejos macromoleculares tales como vectores de terapia génica) y que aun son generalmente no demasiado grandes tal que promuevan la dislocación y movimiento de células, proporciona aplicaciones particularmente ventajosas en tratar, prevenir y/o diagnosticar una variedad de enfermedades, por ejemplo. De una manera alternativa, los virus se pueden armar con el gen de sHASEGP para facilitar su réplica y extensión dentro de un tejido objetivo, por ejemplo. El tejido objetivo puede ser un tejido canceroso, en donde el virus sea capaz de replicarse de una manera selectiva adentro del tumor. El virus también puede ser un virus no lítico, en donde el virus se replica de una manera selectiva bajo un promotor específico del tejido. A medida que se replican los virus, la co-expresión de sHASEGP con los genes virales facilitará la extensión del virus in vivo. De una manera alternativa, se pueden utilizar el ácido nucleico de interés y una sHASEGP de una forma simultánea o consecutiva, o para quedar escalonada a través del tiempo. De una forma simultánea se refiere a la co-administración . En este caso, estos dos componentes esenciales se pueden mezclar para formar una composición antes de administrarse, o se pueden administrar al mismo tiempo a la célula o al organismo huésped. También es posible administrarlos de una forma consecutiva, es decir, uno después del otro, sin importar cuál componente del producto de combinación de acuerdo con la invención se administre primero. Finalmente, es posible utilizar un modo de administración que esté escalonado a través del tiempo, o que sea intermitente y se detenga y se reinicie a intervalos que pueden o no ser regulares. Se señala que las vías y los sitios de administración de los dos componentes pueden ser diferentes. De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, la sHASEGP se administra antes del ácido nucleico, siendo de preferencia la vía de administración de los dos componentes similar. El intervalo de tiempo entre las inyecciones no es crítico, y puede ser definido por la persona experta. Es posible recomendar un intervalo desde 10 minutos hasta 72 horas, convenientemente desde 30 minutos hasta 48 horas, de preferencia desde 1 hasta 24 horas, y de una forma muy preferible desde 1 hasta 6 horas. Además, el producto de combinación de conformidad con la invención también se puede combinar con una o más moléculas que se pretendan para mejorar la administración del ácido nucleico. Las moléculas pueden ser moléculas que tengan un efecto protector sobre el ácido nucleico (protección con respecto a la degradación en la célula) , que mejoren su penetración o su expresión en la célula huésped (péptido fusogénico, señal de localización nuclear, etc.), que hagan posible que se dirijan a un tipo de célula particular (ligando o anticuerpo que reconozca una proteína de superficie celular, etc.), o que prolonguen el efecto terapéutico (agente inmunosupresor , etc.) . El producto de combinación también se puede combinar con agentes que faciliten la transfección (proteínas, etc.) . El producto de combinación de acuerdo con la invención se puede preparar con vistas a la administración local o parenteral, o a la administración por la vía digestiva. Las vías que se pueden mencionar en particular son la vía intragástrica , subcutánea, intracardíaca , intravenosa, intraperitoneal , intrasinovial , intratumoral , intrapulmonar, intranasal , e intratraqueal , y muy particularmente, la vía intramuscular. La administración se puede efectuar por medio de cualquier técnica del ámbito (inyección, vía oral, aerosol, instilación, etc.), como una sola dosis, o como una dosis que se repita una o varias veces después de un intervalo de tiempo particular. La vía de administración se puede ajustar para adaptarse al gen de interés que se vaya a transferir y a la enfermedad que se vaya a tratar. La formulación puede incluir vehículos farmacéuticamente aceptables (excipientes, adyuvantes, etc.). La sustancia que conduzca a la desorganización de la matriz extra-celular y del ácido nucleico de interés, de preferencia se disuelve en un regulador que sea adecuado para uso farmacéutico, y el cual puede ser hipertónico, hipotónico, o isotónico. Se pueden prever diferentes reguladores. Los que se pueden mencionar a manera de ilustración son una solución de suero fisiológico (NaCl al 0.9%) , una solución de suero no fisiológico (NaCl al 1.8%) , una solución de Hepes-Ringer , una solución de lactato-Ringer , un regulador que se base en Tris-HCl (Tris-HCl 10 ttiM, pH 7.5 a 8, EDTA 1 mM; Tris HC1 10 mM, pH 7.5 a 8, MgCl2 1 mM) , un regulador de fosfato (regulador de Krebs fosfato H20) , una solución de azúcar (glucosa, sacarosa, trehalosa, etc.), o simplemente agua. HIPODERMOCLISIS La hipodermoclisis , la infusión subcutánea de fluidos, es una técnica de hidratación útil y fácil adecuada para pacientes adultos levemente a moderadamente deshidratados, en especial para los ancianos. El método se considera seguro, y no presenta complicaciones serias. El efecto adverso más frecuente es el edema subcutáneo leve que puede ser tratado mediante masaje local o con diuréticos sistémicos. Se pueden dar aproximadamente 3 L en un período de 24 horas en dos sitios separados. Los sitios de infusión comunes son el pecho, el abdomen, los muslos, y los antebrazos. La solución preferida es solución salina normal, pero también se pueden utilizar otras soluciones, tales como solución salina medio-normal, glucosa con solución salina o glucosa al 5%. Se puede agregar cloruro de potasio a la bolsa de la solución si es necesario. Adicionalmente , se pueden suministrar otros fármacos a través de vías similares. La sHASEGP humana se puede agregar para mejorar la absorción del fluido y para aumentar la velocidad de administración global. La sHASEGP humana es preferible para la hipodermoclisis repetida sobre las enzimas derivadas de rastros, debido a que no tiene probabilidades de ser inmunogénica como se sabe que es la enzima bovina. Puede ser administrada en el hogar por miembros de la familia o por una enfermedad; la técnica debe ser familiar para todo médico familiar . En los pacientes ambulatorios, los sitios de hipodermo-clisis incluyen el abdomen, la parte superior del pecho, encima del pecho, sobre un espacio intercostal, y el área escapular. En los pacientes confinados en cama, los sitios preferidos son los muslos, el abdomen, y el aspecto externo del antebrazo. Después de 1 a 4 días, se debe cambiar la aguja y la tubería, aunque se han dejado los juegos de infusión en su lugar durante períodos mucho más largos sin complicaciones. También se puede dar una administración de 500 mL de bolos durante 1 o 2 horas tres veces al día, dándose 150 Unidades de sHASEGP en el sitio subcutáneo antes de la primera infusión de la mañana. FACILITACIÓN DE INYECCIONES TERAPEUTICAS Muchas moléculas inyectadas percutáneamente (v.gr., mediante usar una aguja u otro dispositivo que penetra la piel y se usa para depositar las moléculas dentro de una capa sub-dérmica) llegan a la circulación lentamente o con muy baja eficiencia. Varios factores regulan la farmacocinética y farmacodinámica de las moléculas inyectadas subcutáneamente (SC) o intramuscularmente (IM) . En general, las moléculas más grandes llegan a la circulación más lentamente y con menos eficiencia sin el transporte activo hacia la circulación. La bio-disponibilidad subcutánea se determina calculando la proporción del área debajo de las curvas de la administración subcutánea contra intravenosa (AUCsc/AUCintravenosa) . Un segundo factor es la carga y afinidad para las moléculas de matriz que pueden tener un papel en el secuestro de las moléculas subcutáneamente. Si se degradan estos materiales localmente, pueden nunca llegar a sus objetivos deseados, y por lo tanto, demuestran una bio-disponibilidad sistémica global reducida en los órganos objetivos. Las proteínas grandes normalmente se dan intravenosamente, de tal manera que el medicamento esté directamente disponible en el torrente sanguíneo. Sin embargo sería conveniente que un medicamento se pueda dar subcutáneamente, intramuscu-larmente, o intradérmicamente (ID), debido a que estas formas de administración son mucho más fáciles de administrar para el paciente. En especial, si el medicamento se debe tomar regularmente durante toda la vida y el tratamiento va a empezar pronto, cuando el paciente es niño. Sin embargo, un medicamento con una molécula muy grande y lábil, tal como el factor de coagulación VIII de 170 a 300 kDa, tiene normalmente una bio-disponibilidad muy baja si se da subcutáneamente, intramuscularmente , o intradérmicamente, debido a que la recuperación no es suficiente y la degradación es severa. Además a la necesidad de aumentar la bio-disponibilidad de muchos productos biológicos subcutáneamente administrados, también es críticamente importante una farmacocinética más rápida en los casos de la medicina de emergencia. El tiempo requerido para alcanzar un acceso intravenoso en muchos pacientes puede impedir que se utilice un fármaco de otra manera rápida, cuando se administre sistémicamente . En algunos casos, el fracaso para alcanzar el acceso intravenoso es seguido luego por la inyección subcutánea, la cual conduce a una demora adicional para alcanzar los órganos objetivos. Por consiguiente, la disponibilidad más rápida de los fármacos subcutáneos sería benéfica como la primera línea de tratamiento, en lugar de arriesgarse al tiempo requerido para alcanzar el acceso intravenoso. Ejemplos de las moléculas que se pueden suministrar subcutáneamente, así como intravenosamente, incluyen epinefrina, atropina, narcano, lignocaína, y dextrosa . Un beneficio adicional de la invención está en la capacidad para suministrar volúmenes equivalentes o más grandes de soluciones subcutáneas o intramusculares sin el dolor y patología asociada con la presión y el volumen de la solución en el sitio de inyección. A manera de ilustración (y sin limitación) , hay un número de biológicos que se pueden mejorar por combinación con una o mas sHASEGPs (v.gr. , por co- formulación o co-administración de sHASEGP antes, coincidente con o después de administración del biológico), incluyendo por ejemplo: Abciximabs (v.gr., REOPRO) , Adalimumabs (v.gr., HUMIRA) , Agalsidasas betas (v.gr., FABRAZY-ME) , Aldesleucinas (v.gr., PROLEUKIN) , Alefaceptos (v.gr., AMEVIVE) , Alemtuzumabs (v.gr., CAMPATH) , Alteplasas (v.gr., ACTIVASE), Alteplasas (v.gr., CATHFLO ACTIVASE), Anakinras (v.gr., KINERET) , Arcitumomabs (v.gr., CEA-Scan) , Asparaginasas (v.gr., ELSPAR) , Basiliximabs (v.gr., SIMULECT) , Becaplerminas (v.gr., REGRANEX) , bevacizumabs (v.gr., AVASTIN) , Toxinas de Botulinio Tipo A (v.gr., BOTOX) , Toxinas de Botulinio Tipo B (v.gr., MYOBLOC) , Capromab Pendetidos (v.gr., PROSTASCINT) , Cetuximabs (v.gr., ERBITUX) , Daclizumabs (v.gr., ZENAPAX) , Darbepoetinas alfa (v.gr., ARA ESP) , Denileucinas diftitox (v.gr., ONTAK) , Dornasas alfa (v.gr., PULMOZYME) , Drotrecoginas alfa (v.gr., XIGRIS) , Efalizumabs (v.gr., RAPTIVA) , Epoetinas alfa (v.gr., EPOGEN) , Etanerceptos (v.gr., ENBREL) , Filgrastimas (v.gr., NEUPOGEN) , Ibritumomabs/Tiuxetans (v.gr., ZEVALIN) , Pentetatos de Imciromab (v.gr., MYOSCINT) , Infliximabs (v.gr., REMICADE) , Interferones alfa-2a (v.gr., ROFERON-A) , Interferones alfacon-1 (v.gr., INFERGEN) , Interferones alfa-n3 (v.gr., ALFERON N) , Interferones beta-la (v.gr., AVONEX, BETASERON) , Interferones beta-la (v.gr., REBIF) , Interferones gamma- Ib (v.gr., ACTIMMU E) , Laronidasas (v.gr., ALDURAZYME) , Nofetumomabs (v.gr., VERLUMA) , Omalizumabs (v.gr., XOLAIR) , Oprelvecinas (v.gr., NEUMEGA) , Palivizumabs (v.gr., SYNAGIS) , Pegfilgrastimas (v.gr., NEULASTA) , Peg- interferones alfa-2a (v.gr., PEGASYS) , Peg- interferones alfa-2b (v.gr., PEG- INTRON) , Rasburicasas (v.gr., ELITEK) , Reteplasas (v.gr., RETAVASE) , Rituximabs (v.gr., RITUXAN) , Tenecteplasas (v.gr., TNKase) , Tositumomab y Iodo 1-13 I (v.gr., BEXXAR) , Trastuzumabs (v.gr., HERCEPTIN) , Urokinasas (v.gr., ABBOKINASE) . HEMORRAGIA DEL VITREO En un esfuerzo por minimizar el potencial de causar una separación o desgarre adicional de la retina durante la realización de la vitrectomía, anteriormente se ha propuesto, en la patente US 5,292,509 (Hageman) , inyectar ciertas enzimas de glicosaminoglicanasa libre de proteasa en el cuerpo vitreo, para hacer que el cuerpo vitreo llegue a desacoplarse o "desinsertarse" de la retina, antes de remover el cuerpo vitreo. Tal desinserción o desacoplamiento del cuerpo vitreo se pretende para minimizar la posibilidad de que ocurra un desgarre o separación adicional de la retina cuando se remueva el cuerpo vitreo. Ejemplos de las enzimas de glicosaminoglicanasa libre de proteasa específicas que se pueden utilizar para provocar esta desinserción vitrea a propósito incluyen: condroitinasa ABC, condroitina-sa AC, condroitinasa B, condroitina 4-sulfatasa, condroitina 6-sulfatasa, hialuronidasa, y beta-glucuronidasa . Aunque se ha sabido que la enzima de hialuronidasa es útil para diferentes aplicaciones oftálmicas, incluyendo la aplicación adjunta en vitrectomía descrita en la patente US 5,292,509 (Hageman), los estudios publicados han indicado que la enzima hialuronidasa puede por sí misma ser tóxica para la retina y/u otras estructuras anatómicas del ojo. Ver, The Safety of Intravitreal Hyaluronidase ; Gottleib, J. L . ; Antoszyk, A. . , Hatchell, D. L. y Soloupis, P., Invest Ophtalmol Vis Sci 31:11, 2345-52 (1990) . Más aún, el uso de preparaciones impuras del rastro de la hialuronidasa puede causar uveítis o inflamación del ojo. El uso de sHASEGP humana, por lo tanto, es preferible por su mayor potencia, pureza, y carencia de origen animal que puede dar lugar a las reacciones inmunogénicas y a la neutralización mediada por anticuerpo en seguida de su administración repetida. En otra forma de realización, se puede inyectar una forma pegilada de una sHASEGP en el ojo. Tal sHASEGP pegilada no se libera del vitreo en esta forma tan rápida, y mantiene su actividad en el vitreo durante un período de tiempo más largo. La toxicidad oftálmica de algunas preparaciones de hialuronidasa ha sido confirmada por otros investigadores, quienes han propuesto que estas preparaciones de hialuronidasa se utilicen como un irritante tóxico para causar una neovasculari za-ción experimentalmente inducida del ojo, en modelos de toxicidad animales (ver An Experimental Model of Preretinal Neovasculariza-tion in the Rabbit; Antoszyk, A. N. Gottleib, J. L. Casey, R. C., Hatchell, D. L. y Machemer, R., Invest Ophtalmol Vis Sci 32:1, 46-51 (1991) . El uso de la sHASEGP altamente purificada carente de contaminantes basados en mercurio o derivados de reses o bacterias, es preferible para los procedimientos intraoculares . Más aún, una sHASEGP humana recombinante es preferible sobre las preparaciones derivadas del rastro, tanto por la falta de pureza de los patógenos bovinos como por el riesgo reducido de inmunoge-nicidad. De una manera más preferible, se prevé una sHASEGP pegilada . Por consiguiente, se proporciona un método enzimático que utiliza una sHASEGP humana para el tratamiento de desórdenes oftálmicos del ojo del mamífero. En una forma de realización de la invención, dicha sHASEGP está pegilada para prolongar su residencia dentro del vitreo y prevenir la captación localizada. La prevención de la neovascularización, y la mayor velocidad de liberación del vitreo de los materiales tóxicos para la retina, se llevan a cabo mediante la administración de una cantidad de hialuronidasa efectiva para licuar el humor vitreo del ojo tratado sin causar un daño tóxico al ojo. La licuefacción del humor vitreo aumenta la velocidad de intercambio de líquidos desde la cámara vitrea. Este aumento en el intercambio remueve los materiales y las condiciones cuya presencia provoca daño oftalmológico y retinal. USOS COSMÉTICOS DE sHASEGP Se sabe que la hialuronidasa tiene el efecto de despolimerizar las cadenas de mucopolisacárido largas de la sustancia fundamental, responsable de la retención del agua enlazada y de hacer más lenta la compresión capilar, de la difusión de los líquidos orgánicos, que eliminan los desechos metabólicos. Tal retención de agua y desechos asociada con la sobrecarga de grasa de los lipocitos, constituye el clásico edema de "piel de cerdo" o edema de "piel de naranja". Esta despolimerización, por consiguiente, corta las cadenas largas de los mucopolisacáridos en cadenas más cortas, con la eliminación del agua enlazada, de los desechos, la restauración de la circulación venosa y linfática, y la desaparición del edema local. El uso de sHASEGP por medio de administración subcutánea, por lo tanto, es preferido para remover los glicosaminogli -canos involucrados en la acumulación de la denominada celulitis, y para promover el flujo linfático. Se prefiere la sHASEGP humana para el tratamiento de celulitis, porque es capaz de remover estos glicosaminoglicanos sin los componentes inflamatorios de las proteínas derivadas del rastro, y es de una alta pureza y no tiene probabilidades de ser inmunogénica . La sHASEGP se puede administrar a través e inyecciones subcutáneas repetidas, a través de suministro transdérmico en la forma de ungüentos o cremas, o a través del uso de formulaciones inyectables de liberación lenta para promover la degradación continua de los glicosaminoglicanos y prevenir su retorno. TRASPLANTE DE ÓRGANOS El hialuronano tiene varios efectos biológicos, que en parte están relacionados con su tamaño molecular (West, D.C., Kumar, S. Exp . Cell Res. 183, 179-196, 1989) . El contenido de hialuronano en un órgano aumenta en diferentes condiciones de inflamación de ese órgano. Por consiguiente, se ha demostrado que una mayor concentración de hialuronano en el tejido de diferentes órganos se caracteriza por lesión inflamatoria- inmunológica , tal como alveolitis (Nettelbladt O. y colaboradores, Am. Rev. Resp.
Dis. 1989; 139:759-762), e infarto de miocardio (Waldenstrom y colaboradores, J". Clin. Invest. 1991; 88 (5) : 1622-1628) . Otros ejemplos son rechazo de aloinjerto después de un trasplante renal (H llgren y colaboradores, J. Exp. Med. 1990a; 171:2063-2076; Wells y colaboradores, Transplantation 1990; 50:240-243), del intestino delgado (Wallander y colaboradores, Transplant Int. 1993; 6:133-137), o cardíaco (Hállgren y colaboradores, J. Clin. Invest. 1990b; 85:668-673); o una inflamación del miocardio de origen viral (Waldenstrom y colaboradores, Eur. J. Clin. Invest. 1993 ; 23 :277-282) . La presentación de edemas intersticiales en relación con el injerto de un órgano constituye un severo problema en el campo de la cirugía de trasplantes. Tanto como el 25% de los injertos se hincharán hasta un grado tal que se perderá temporalmente la función. Más aún, en el 2-3% de los casos, el hincha-miento provoca alteración del riñon, dando como resultado una hemorragia masiva. La sHASEGP se puede utilizar para degradar los glicosaminoglicanos acumulados en un trasplante de órgano. La remoción de estos glicosaminoglicanos promueve la remoción de agua desde el injerto, y por lo tanto, la función del órgano. Se puede administrar una dosis en el intervalo de 500-10,000 Unidades/kg para reducir la presión intersticial como tal . ACUMULACIONES PATOLÓGICAS DE GLICOSAMINOGLICANOS EN EL CEREBRO Los niveles de hialuronano se elevan en un número de condiciones patológicas cerebroespinales. Los niveles de hialuronano cerebroespinal normalmente son menores a 200 ug/L en adultos (Laurent y colaboradores, Acta Neurol . Scand. septiembre de 1996; 94(3) : 194-206) . Estos niveles pueden elevarse hasta más de 8,000 ug/L en enfermedades tales como meningitis, estenosis espinal, lesión de la cabeza, e infarto cerebral. Por consiguiente, la administración de sHASEGP (por ejemplo, mediante suministro intratecal o mediante inyección sistémica de una sHASEGP, sHASEGP PEGilada, o sHASEGP super-sialada, se puede utilizar para degradar los niveles críticamente elevados del sustrato. La falta de linfáticos efectivos en el cerebro también puede conducir a un edema amenazante de la vida en seguida de trauma de la cabeza. La acumulación de hialuronano es un resultado del incremento en la síntesis por las sintasas de hialuronano, y de una degradación reducida. La acumulación de hialuronano sirve para el propósito de aumentar el contenido de agua en el tejido dañado, con el fin de facilitar la extravasación de leucocitos, pero puede ser letal. La administración de sHASEGP humana a un paciente que sufra de trauma de la cabeza, por consiguiente, puede remover la acumulación de hialuronano en el tejido, y el agua asociada con él. La sHASEGP humana se puede administrar intratecalmente a través de un derivador, o de una manera alternativa, se puede administrar una sHASEGP, sHASEGP PEGilada, o sHASEGP super-sialada (de preferencia versiones humanas de las mismas) intravenosamente para que llegue al tejido del cerebro. Enseguida de una isquemia del cerebro, como ocurre en la embolia, aumenta el contenido de hialuronano dramáticamente debido a un incremento en la expresión de las sintasas de hialuronano y a un catabolismo reducido. La falla de las bombas de iones y la fuga de plasma hacia el intersticio da como resultado retención de fluido que no será apropiadamente liberado por los linfáticos, y da como resultado necrosis del tejido. Algunos grupos han tratado de prevenir la acumulación del fluido intersticial en seguida de reperfusión por isquemia mediante el bloqueo de la permeabilidad vascular. Sin embargo, una vez que se ha extravasado el fluido, impidiendo la permeabilidad vascular, se puede impedir la resolución del edema y se exacerban las condiciones. Como se menciona anteriormente, sHASEGP humana puede administrarse intratecalmente (v.gr., a través de un derivador) , o sHASEGP, sHASEGP PEGilada o sHASEGP super-sialada (de preferencia versiones humanas de las mismas) se pueden administrar intravenosamente para alcanzar el tejido cerebral. La sHASEGP humana también se puede utilizar en el tratamiento de edema asociado con tumores cerebrales, en particular el asociado con glioblastoma multiforme. El edema asociado con tumores cerebrales resulta de la acumulación de hialuronano en las porciones no cancerosas del cerebro adyacentes al tumor. La administración de hialuronidasa a los sitios de acumulación de hialuronano (por ejemplo, mediante inyección intravenosa o por medio de un derivador) , puede aliviar el edema asociado con estas malignidades, mediante la degradación del exceso de hialuronano en estos sitios. Por consiguiente, la hialuronidasa tiene éxito en el tratamiento de tumores cerebrales, no solamente en la reducción de la masa tumoral e inhibición del crecimiento y/o metástasis tumoral, sino que también es útil para aliviar el edema asociado con la malignidad. La sHASEGP humana se puede administrar para el tratamiento de edema de una manera similar a aquélla para la administración de hialuronidasa testicular bovina para tratar edema (ver, por ejemplo, Sa Earp Arg. Braz. Med. 44:217-20) . Sin desear ligarse a una aplicación particular o mecanismo de acción, sHASEGPs pueden potencialmente mejorar isquemia o embolia hemorrágica y/u otras condiciones dañinas del SNC mediante uno o mas de los siguientes: (i) incrementar la oxigenación del tejido dañado mediante reducir la presión intracraniana ; (ii) facilitar la disolución de coágulos y resorción de metabolitos tóxicos; (iii) suprimir la extravasación de leucocitos hacia regiones infartadas o expuestas a hemorragias (v.gr., mediante la remoción de hialuronano el cual es un receptor para CD44) ; (iv) promoción de regeneración neural del tejido dañado; o (v) incrementar la vasculogénesis cerebral. TRATAMIENTO DE LA ACUMULACIÓN DE GLICOSAMINOGLICANO EN CARDIOVAS-CULOPATÍA Se ha demostrado que la administración de hialuronidasa en modelos animales en seguida de infarto de miocardio experimental, puede reducir el tamaño del infarto (Maclean y colaboradores, Science, 8 de octubre de 1976; 194 (4261) : 199-200) . El mecanismo propuesto mediante el cual la hialuronidasa bovina reduce el tamaño del infarto en animales, es mediante la reducción de la acumulación de hialuronano que se presenta en seguida de reperfusión por isquemia. Se cree que la reducción del tamaño del infarto ocurre por un mayor drenaje de linfa y una mayor oxigenación del tejido y reducción del contenido de agua del miocardio. Aunque se podría obtener un tamaño de infarto reducido en modelos animales, no se llevaron a cabo los beneficios en los estudios clínicos mayores en seres humanos. La hialuronidasa de los testículos bovinos posee una vida media en suero notoriamente corta de aproximadamente 3 minutos en animales y en el hombre. Wolf y colaboradores, J. Pharmacol . Exp. Ther. , agosto de 1982; 222(2) : 331-7. Esta corta vida media se debe a los residuos de mañosa terminales que son fácilmente reconocidos por los receptores de eliminadores del sistema reticuloendotelial . Aunque los animales pequeños pueden beneficiarse de la hialuronidasa debido a un lecho vascular más pequeño, se necesita una enzima con una vida media incrementada. La sHASEGP super-sialada posee una farmacocinética más favorable debido a la sialación para la cual no hay ningún receptor de eliminadores. La sHASEGP super-sialada en dosis variando de 100-200,000 Unidades/kg , se puede utilizar para facilitar la resolución de un exceso de hialuronano en seguida de reperfusión por isquemia, y para reducir el tamaño del infarto. La sHASEGP super-sialada también se puede utilizar para limitar las placas coronarias de la arterioesclerosis . Estas placas acumulan glicosaminoglicanos y median la adhesión de macrófagos y células de espuma. Kolodgie y colaboradores, Arterioscler. Thromb. Vasc . Biol . 1 de octubre de 2002; 22 (10) : 1642-8. Se puede utilizar la administración de sHASEGP super-sialada para reducir la formación de placa. Debido a que se contempla una administración repetida de hialuronidasa en dosis de 100-100,000 Unidades/kg , la necesidad de utilizar una proteína recombinante humana con un bajo riesgo de inmunogenicidad y una mayor vida media, dará como resultado una reducción superior de las placas. TRATAMIENTO DE NECROSIS DE TEJIDOS PERIFÉRICOS La necrosis del tejido se presenta en muchas enfermedades debido a la insuficiencia venosa. La falta de oxigenación suficiente es uno de los obstáculos principales para el recrecimiento del tejido. Se ha demostrado que el tratamiento con hialuronidasa intra-arterial mejora de una manera significativa el cuadro clínico en los pacientes con enfermedad oclusiva arterial periférica (Eider y colaboradores, Lancer (1980) 648-649). La sHASEGP se puede inyectar intra-arterialmente de 3-5 veces a la semana, en dosis de 10-200,000 Unidades. SUMINISTRO MEJORADO DE ANESTESIA Y OTROS AGENTES FARMACOLÓGICOS A TEJIDOS DE MAMÍFEROS La hialuronidasa derivada del rastro se utiliza comúnmente para el bloqueo peribulbar en la anestesia local antes de la cirugía oftálmica. La presencia de la enzima previene la necesidad de bloques adicionales, y hace más rápido el tiempo hasta el establecimiento de aquinesia (pérdida de movimiento del ojo) . El bloqueo peribulbar y de sub-Tenón son las aplicaciones más comunes de la hialuronidasa para los procedimientos oftálmicos. Debido a la discontinuación de la ydase, se han presentado reportes de un incremento de diplopia y ptosis con el bloqueo peribulbar (Brown y colaboradores, J. Cataract. Refract. Surg. 1999; 25 : 1245-9) . Al descontinuarse Wydase de Wyeth, ahora el material de hialuronidasa derivada de testículos bovinos es suministrado por las farmacias que hacen mezclas. Sin embargo, existen varias preocupaciones con la utilización de un producto estéril mezclado de una forma extemporánea. http : / /www . ash . org/shortage/ hvaluronidase . cfm?cfid?11944667&CFToken=9426953 - ref#ref . Las preparaciones compuestas no son productos aprobados por la FDA. Como tal, la FDA no tiene control alguno sobre la calidad o consistencia del proceso de fabricación. La sHASEGP de 10-500 Unidades se puede mezclar directamente con 5 mi de lidocaína al 2% (xilocaína) , 5 mi de bupivacaína al 0.5% (marcaína) , y opcionalmente con epinefrina en 1:200,000. La sHASEGP se puede utilizar para aumentar el establecimiento de aquinesia, y para remover la necesidad de bloques adicionales. La sHASEGP también es ideal para la aquinesia, para cirugía cosmética en blefaroplastias y levantamientos de la cara. La sHASEGP también se puede utilizar en seguida de estos procedimientos quirúrgicos para difundir los anti - inflamatorios , y con el fin de reducir el hinchamiento del tej ido . La sHASEGP también se puede mezclar con una solución reguladora, tal como bicarbonato, para prevenir el malestar durante el procedimiento de inyección. La sHASEGP también se puede mezclar con anestesia para laceraciones, tanto para reducir el volumen total del material requerido para inyección, como para reducir el dolor por el hinchamiento del tejido. USO DE sHASEGPs PARA PROMOVER DISPERSIÓN DE AGENTES FARMACOLÓGICOS Y OTROS Como se describe en la presente, las composiciones y métodos de la presente invención que se pueden usar para promover o mejorar el suministro de anestésicos y otros agentes farmacológicos (tales como miembros de las varias clases de agentes farmacéuticamente efectivos a los que se hace referencia en la presente) a cualquiera de una variedad de tejidos de mamífero in vivo. En ese respecto, la sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma puede usarse para facilitar la difusión y por lo tanto promover el suministro de agentes farmacológicos de moléculas pequeñas, tales como anestésicos, anti-infectivos y anti - inflamatorios , por ejemplo, así como agentes farmacológicos de moléculas mas grandes, tales como proteínas (incluyendo, v.gr., enzimas, anticuerpos monoclonales , y similares) , ácidos nucleicos (incluyendo ácidos desoxirribonu-cleicos (v.gr., genes y moléculas anti - sentido) y ácidos ribonucleicos (incluyendo moléculas para interferencia de ARN (ARNi) y similares), y composiciones macromoleculares las cuales pueden comprender una combinación de tales componentes (incluyendo combinaciones de ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, lípidos y moléculas a base de lípidos, y similares) . A manera de ilustración y sin limitación, moléculas y complejos macromoleculares variando de menos de alrededor de 10 nm a alrededor de 500 nm de diámetro, particularmente de alrededor de 20 a 200 nm, es probable que exhiban mejoras dramáticas en suministro a través de espacios intersticiales cuando el espacio intersticial ha sido previamente, o es coincidentemente , expuesto a una sHASEGP como se describe e ilustra en la presente. Sin restringirse a una teoría particular de mecanismo de acción, se cree que la sHASEGP de la presente invención funciona principalmente mediante hidrolizar glicosaminoglicanos dentro de la matriz extra-celular que rodea a las células de mamíferos para crear pasajes o canales similares a poros que facilitan la difusión u otro movimiento de moléculas dentro de la matriz extra-celular expuesta; y, mas aun, que permeabilizar tales porciones de la matriz extra-celular tiene el mayor efecto en la difusión o "extensión" de las moléculas que no son tan grandes tal que también sean obstruidas por otros componentes macromoleculares de la matriz extra-celular, tal como una red sobre-arqueada de colágeno. El grado del efecto de extensión que se puede obtener con una sHASEGP dada o un dominio de hialuroni-dasa humano soluble de la misma en un ambiente de tejido particular puede fácilmente apreciarse como se ilustra en la presente mediante evaluar el efecto de la sHASEGP o dominio de la misma en la difusión de moléculas de prueba detectables de varios tamaños (tales como perlas fluoresceinadas o de otra manera marcadas) dentro del tejido de prueba, ya sea con o sin pre-tratamiento o tratamiento concomitante con sHASEGP o dominio de la misma en un rango de tiempos y concentraciones. A manera de ilustración, en el caso de rHuPH20 recombinante inyectada subcutáneamente dentro de la piel lateral de ratones, pruebas de difusión de perlas fluoresceinadas (como se ejemplifica en la presente) indicaron que los efectos en la difusión fueron mayores con partículas de menos de alrededor de 500 nm de diámetro. Se cree además que macromoléculas mas grandes (ejemplificadas por perlas de 500 nm o mayores) pueden obstruirse en difusión no solamente por su tamaño mayor sino también por su interacción potencial con otras redes relativamente mas abiertas dentro de la matriz extra-celular, tal como una red formada de hebras de colágeno intersticial. Además, y a diferencia de las hialuronidasas derivadas de animales descritas, sHASEGPs actualmente preferidas de la presente invención no contienen agentes que promueven la extravasación o agentes contaminantes tales como colagenasas (que pueden abrir canales grandes) u otros contaminantes que pueden provocar reacciones inmunes. En aplicaciones particulares en las cuales poros o canales mas grandes se desean, la sHASEGP o un dominio de hialuronidasa humano soluble de la misma puede combinarse de preferencia con formas relativamente puras de otras enzimas degradantes de matriz tales como colagenasas para facilitar expansión adicional de los complejos macromoleculares o células de mayor tamaño. Para la mayoría de las aplicaciones, el uso de un agente que promueve la permeabilidad de macromoléculas teniendo un tamaño de menos de alrededor de 500 nm, y mas preferentemente de menos de alrededor de 200 nm, es muy ventajoso en que el agente sustancialmente no promueve el movimiento de células dentro de un tejido tratado sino que promueve el paso de complejos y agentes mas pequeños. Como se describe e ilustra en la presente, las sHASEGPs pueden usarse para mejorar el suministro de una variedad de otros agentes farmacológicos y/u otros a tejidos dentro del cuerpo humano (incluyendo tejidos tales como aquellos en la parte posterior del ojo que típicamente son relativamente difíciles de alcanzar) . Sin desear limitarse por teoría, se cree que las sHASEGPs pueden mejorar los perfiles farmacocinéticos y/o farmacodinámicos de un número de tales agentes mediante poten-cialmente mejorar su difusión o permeación dentro de un tejido, y/o mediante mejorar su transporte convectivo mediante incrementar el flujo de fluidos en volumen dentro del espacio intersticial de un tejido. Para propósitos de ilustración (y sin limitación) , ejemplos de agentes farmacológicos que se pueden combinar con sHASEGPs de la presente invención (v.gr., combinarse por co- formulación con una o mas sHASEGPs o mediante co-adminis-tración con una o mas sHASEGPs (los cuales se pueden administrar previo a, coincidentes con o siguiendo administración del agente) ) para tratamiento de varias condiciones que afectan al ojo incluyen, por ejemplo, inhibidores de angiogénesis (tales como angiostatinas , acetatos de anecortavo (v.gr., RETAANE) , endostatinas , trombospondinas (v.gr., trombospondina- 1 y trombospondina-2 ) , anticuerpos anti -angiogénicos y otros agentes anti -angiogénicos o agentes de objetivo vascular (VTAs) (v.gr., anticuerpos anti-VEGF tales como bevacizumabs (v.gr., AVASTIN) , carboxiamido triazola (CAI) , Interleucina- 12 (IL-12) , OLTIPRAZ (5- [2-pirazinil] -4-metil-l , 2 , 3-tiona) , SU-5416, TNP-470, talidomida) , y similares); sustancias anti -cataratas y anti-retinopatía diabética (tales como inhibidores de aldosa reductasa (ARIs) , por ejemplo, tolrestatos (v.gr., ALREDASE) y zopolresta-tos (v.gr., ALOND) , lisinoprilos , enalaprilos, estatilos, y sustancias reticulantes de tioles y similares) ; agentes antiinflamatorios (incluyendo agentes anti - inflamatorios esteroidales y no esteroidales como se describe en la presente y en la materia) ; anti - infectivos (incluyendo compuestos como se describe mas adelante, así como un número de preparaciones oftálmicas de las mismas tales como BLEPHAMIDE , CILOXAN, POLYTRIM, QUIXIN, TOBRADEX, VIGA OX, ZYMAR) ; agentes de bloqueo beta-adrenérgicos (tales como betaxololes (v.gr., BETOPTIC S) , timololes (v.gr. , BETIMOL y TIMOPTIC) y combinaciones de los mismos (v.gr., timololes y un inhibidor de anhidrasa carbónica tal como una dorzolamida (v.gr., COSOPT); inhibidores de anhidrasa carbónica (tales como acetazolamidas , brinzolamidas (v.gr., AZOPT) , diclorofenamidas , dorzolamidas (v.gr., TRUSOPT, y en combinaciones con otros agentes como en, v.gr., COSOPT), metazolamidas y similares) ; midriáticos (tales como sulfatos de atropina, ciclopentolatos , homatropinas , escopolaminas , tropicamidas , eucatropinas , e hidroxianfetaminas y similares); agentes de terapia fotodinámica (tal como verteporfina (v.gr, . VISUDYNE) ; análogos de prostaglandina (tales como bimatoprostos (v.gr., LUMIGAN) , latanoprostos (v.gr., XALATAN) , y travoprostos (v.gr., TRAVATA ) ; simpatomiméticos (tales como brimonidinas (v.gr., ALPHAGAN P) ; así como combinaciones de los mismos (tales como combinaciones de un agente de bloqueo beta-adrenérgico y un inhibidor de anhidrasa carbónica tal como en COSOPT) ; y numerosas otras clases de agentes tales como anti - infectivos y varios otros moduladores fisiológicos como se describe mas adelante o en otros puntos en la presente, y/o como se conoce en la materia o recién se desarrolla. Un número de otros agentes farmacológicos que se pueden combinar con sHASEGPs de la presente invención (v.gr., combinarse por co-formulación con una o mas sHASEGPs o por co-administración con una o mas sHASEGPs (los cuales pueden administrarse previo a, coincidentes con o siguiendo administración del agente) ) pueden usarse para tratamiento de varias condiciones afectando al ojo o afectando varios otros tejidos del cuerpo. Para propósitos de ilustración (y sin limitación) , tales agentes incluyen, por ejemplo: anestésicos, anti -metabolitos , anti -neoplásticos y otros agentes anti -cáncer; anti -virales ; anti-infectivos, incluyendo anti -bacterianos y otros antibióticos, anti-hongos y otros antiinfectivos; agentes inmunomoduladores ; anti-inflamatorios esteroidales y no esteroidales ; bloqueadores beta; simpatomiméti -eos; ducosanoides , prostaglandinas y análogos de prostaglandina ; mióticos, colinérgicos y anti-colinesterasas ; anti -alergénicos y decongestivos ; agentes hormonales; factores de crecimiento; otros agentes sintéticos y derivados biológicamente; y combinaciones de los mismos. Algunos ejemplos ilustrativos de agentes teniendo tales propiedades que se pueden combinar con sHASEGPs en la formulación de farmacológicos novedosos y/o reformulaciones de farmacológicos existentes incluyen las varias categorías de agentes descritos anteriormente y mas adelante (asi como otros agentes conocidos y novedosos que están regularmente siendo identificados para diagnóstico, prevención o tratamiento de varias enfermedades) : Anestésicos, particularmente anestésicos locales no de inhalación (tales como ambucaínas; amoxecaínas; amilocaínas; aptocaínas; articaínas; benoxinatos ; alcoholes bencílicos; benzocaínas ; betoxicaínas ; bifenaminas ; bucricaínas ; bumecaínas; bupivacaínas ; butacaínas; butambenos; butanilicaínas ; carbizocaí-nas; cloroprocaína ; clibucainas; clodacaínas; cocaínas; dexiva-caínas; diamocaínas; dibucaínas; diclonines; elucaínas; etidocaí-nas; euprocinas; fexicaínas; fomocaínas; heptacaínas; hexilcaí-nas; hidroxiprocaínas ; hidroxitetracaínas ; isobutambenos ; cetocaínas; leucinocaínas ; lidocaínas; mepivacaínas ; meprilcaí-nas; octocaínas; ortocaínas; oxetacaínas; oxibuprocaínas ; fenacaínas; pinolcaínas; piperocaínas ; piridocaínas ; polidocano-les; pramocaínas; prilocaínas; procaínas; propanocaínas ; propipocaínas ; propoxicaínas ; proximetacaínas ; pirrocaínas; quatacaínas; quinisocaínas ; risocaínas; rodocaínas; ropivacaínas ; alcoholes salicílicoss ; suicaínas; tetracaínas; trapencaínas ; trimecaínas) y similares; así como varios otros anestésicos no de inhalación (tales como alfaxalonas; amolanonas; etoxadroles ; fentanilos; cetaminas; levoxadroles ; metiturales; metohexitales ; midazolamos; minaxolonas; propanididos ; propoxatos; pramoxinas; propofoles; remifentanilos ; sufentanilos ; tiletaminas; zolamina y similares) ; Anti-metabolitos (tales como análogos de ácido fólico (v.gr., denopterinas , edatrexatos, metotrexatos , piritreximas , pteropterinas , tomudex, trimetrexatos) , análogos de purina (v.gr., cladribinas, fludarabinas , 6 -mercaptopurinas , tiamipri- ñas, tiaguaninas) , y análogos de pirimidina (v.gr. , ancitabinas, azacitidinas , 6 -azauridinas , carmofuros, citarabinas, doxifluri-dinas, emitefuros, enocitabinas , floxuridinas , fluorouracilos , gemcitabinas , tegafuros) y similares; Anti -neoplásticos (tales como aclacinomicinas , actinomicinas , adriamicinas , ancitabinas, antramicinas , azacitidinas, azaserinas, 6 -azauridinas , bisantrenos, bleomicinas, cactinomicinas , carmofuros, carmustinas, carubicinas, carzinofi-linas, cromomicinas , cisplatinas, cladribinas, citarabinas, dactinomicinas , daunorabicinas , denopterinas , 6 -diazo- 5 -oxo-L-norleucinas, doxifluridinas , doxorubicinas , edatrexatos, emitefuros, enocitabinas, fepirubicinas , fludarabinas , fluorouracilos, gemcitabinas, idarubicinas , loxuridinas, menogarilos, 6-mercaptopurinas , metotrexatos , mitramicinas , mitomicinas, ácidos micofenólicos , nogalamicinas , olivomicinas , peplomicina, pirarubicinas , piritreximos , plicamicinas , porfiromicinas , pteropterinas , puromicinas, ácidos retinoicos, estreptonigrinas , estreptozocinas , tagafuros, tamoxifenos, tiamiprinas, tioguani-nas, triamcinolonas , trimetrexatos , tubercidinas , vinblastinas , vincristinas , zinostatinas , zorubicinas y similares) (ver también los agentes anti-cáncer ilustrativos descritos en la presente) ; Anti-virales (tales como abacaviros (v.gr., ZIAGEN) , acicloviros (v.gr., ZOVIRAX) , amantadinas y rimantadinas (v.gr., SYMMETREL) , amprenaviros (v.gr., AGENERASE) , cidofoviros (v.gr., VISTIDE) , delavirdinas (v.gr., RESCRIPTOR) , didanosinas (v.gr., VIDEX) , efavirenz (v.gr., SUSTIV A), famcicloviros (v.gr. , FAMVIR) , fomivirsenos (v.gr., VITRAVENE) , foscarnetos (v.gr., FOSCAVIR) , gancicloviros (v.gr., CYTOVENE) y valgancicloviros (v.gr., VALCYTE) , idoxuridinas (v.gr., HERPLEX) , indinaviros (v.gr., CRIXIVA ) , interferones (v.gr., ALFERON N, INTRON A, PEGASYS, PEG-INTRON, ROFERON-A, y combinaciones de interferones y otros anti -virales tales como ROBETRON y PEGASYS/COPEGUS) , lamivudinas (v.gr., 3TC y EPIVIR) y combinaciones de lamivudinas y zidovudinas (v.gr., COMBIVIR) , anticuerpos monoclonales tales como palivizumabs (v.gr., SYNAGIS) , nelfmaviros (v.gr., VIRA-CEPT) , nevirapinas (v.gr., VIRAMU E) , oseltamiviros (TAMIFLU) , pencicloviros (v.gr., DENAVIR) , pleconarilos , ribavirinas (v.gr., COPEGUS y REBETOL) , rimantadinas (v.gr., FLUMADINE) , ritonaviros (NORVIR) , saquinaviros (v.gr., INVERASE) , estavudines (d4T, v.gr., ZERIT) , valacicloviros (v.gr., VALTREX) , vidarabinas (v.gr., VIRA-A), zalcitabinas (v.gr., HWID) , zanamiviros (RELENZA) , zidovudinas (v.gr., AZT, RETROVIR) , y similares); Anti -bacterianos y otros antibióticos, incluyendo, por ejemplo, Aminoglicósidos ; Amfenicoles; ansamicinas ; Carbacefemos ; Carbapenemos ; Cefalosporinas o Cefemos; Cefamicinas ; Clavamos; Lipopéptidos cíclicos; Diaminopirimidinas ; Cetolidas; Lincosami-das; Macrólidos; Monobactartias ; Nitrofuranos ; Oxacefemos; Oxazolidinonas ; Penemos; tienamicinas y beta- lactamas misceláneas; Penicilinas; Antibióticos polipéptidos ; Quinolonas; Sulfonamidas ; Sulfonas; Tetraciclinas y otros antibióticos, miembros ilustrativos de los cuales se proporcionan a continuación (y otros conocidos en la materia o recién desarrollados) : Aminoglicósidos (v.gr., amicacinas, apramicinas, arbecacinas, bambermicinas , butirosinas, dibecacinas, dihidros-treptomicinas , fortimicinas , gentamicinas , isepamicinas , kanamicinas, micronomicinas , neomicinas, undecilenatos de neomicina, netilmicinas , paromomicinas , ribostamicinas , sisomici-nas, espectinomicinas , estreptomicinas, tobramicinas , trospecto-micinas y similares) ; Amfenicoles (v.gr., azidamfenicoles , cloramfenicoles , florfenicoles , tiamfenicoles y similares); Ansamicinas (v.gr., rifamidas, rifampinas o rifampici-nas (v.gr. RIFADIN, RIFADIN IV, así como combinaciones comprendiendo rifampinas tales como rifampina/isoniazida (v.gr., RIFAMATE) y rifampina/isoniazida/pirazinamida (v.gr., RIFATER) , rifamicinas, rifapentinas , rifaximinas (v.gr., XIFAXAM) , y similares) ; Carbacefemos (v.gr., loracarbefos , 3 -cloro- 1 -carbacefe-mos , carbacefemos 3-tio sustituidos, carbacefemos descritos en la solicitud de patente publicada US 20050004095, y similares); Carbapenemos (v.gr., biapenemos, imipenemos, meropene-mos, panipenemos y similares); Cefalosporinas o cefemos (v.gr., cefacloros (v.gr., CECLOR) , cefadroxilos , cefamándolas , cefatrizinas , cefazedonas, cefazolinas (v.gr., A CEF) , cefeapeno pivoxilos, cefelidinas, cefdiniros, cefditorenos , cefepimas (v.gr., MAXIPIME) , cefetame-tos, cefiximas, cefmenoximas , cefmetazolas , cefodizimas , cefonicidas, cefoperazonas , ceforanidas, cefotaximas, cefotiamos, cefotetanos, cefoxitinas, cefozopranos , cefpimi zolas , cefpirami-das, cefpiromas, cefpodoxima proxetilos, cefprozilos, cefroxadi-nas, cefsulodinos , ceftazidimas (v.gr., FORTAZ) , cefteramos, ceftezolas, ceftibutenos , ceftizoximas , ceftriaxonas (v.gr., ROCEPHIN) , cefuroximas (v.gr., ZINACEF) , cefuzonamos, cefacetri-los, cefalexinas, cefaloglicinas , cefaloridinas , cefalosporinas , cefalotinas , cefapirinas, cefradinas, pivcefalexinas y similares) ; Cefamicinas (v.gr., cefbuperazonas , cefinetazolas , cefininoxas, cefotetanos, cefoxitinas (v.gr., MEFOXIN) , y similares) ; Clavamos (v.gr., ácido clavulínico o clavulanatos , 2-y 3-fenil clavamos, y combinaciones comprendiendo agentes tales ocmo amoxicilina/clavulanatos (v.gr., AUGMENTIN) y ticarcili-na/clavulanatos (v.gr., TIMENTIN) , y similares); Lipopéptidos cíclicos (v.gr., daptomicinas (v.gr., CUBICIN) ; Diaminopirimidinas tales como 2 , -diaminopirimidinas (v.gr., brodimoprimos , tetroxoprimos , timetoprimos y similares); Cetólidos (v.gr., telitromicinas (v.gr., KETEK) , y cetólidos bicíclicos puenteados (v.gr., Enanta EP-013420 y cetólidos 6-11 bicíclicos según se describe en la solicitud de patente publicada US 20040157787) , y similares) ; Lincosamidas (v.gr., clindamicinas , lincomicinas y similares) ; Macrólidos (v.gr., azitromicinas (v.gr., ZITHROMAX) , carbomicinas , claritoromicinas , diritromicinas , eritromicinas , acistratos de eritromicina , estolatos de eritromicina , glucofena-tos de eritromicina, lactobionatos eritromicina, propionatos de eritromicina, estearatos de eritromicina, josamicinas, leucomici-nas, midecamicinas , miocamicinas , oleandomicinas , primicinas, roquitamicinas , rosaramicinas , roxitromicinas , espiramicinas , troleandomicinas y similares) ; Monobactamas (v.gr., aztreonamos (v.gr., AZACTA ) , carumonamos, tigemonamos y similares); Nitrofuranos (v.gr., furaltadonas , cloruros de furazolinio, nifuradenos, nifuratelos, nifurfolinas , nifurpirino-les, nifurprazinas , nifurtoinoles , nitrofuirantoínas y similares) ; Oxacefemos (v.gr., flomoxefos, latamoxefos o moxalacta-mas (v.gr. , MOXAM) , y similares) ; Oxazolidinonas (v.gr., linezolidas (v.gr., ZYVOX) , eperezolidas , y similares); Penemos, tienamicinas y beta- lactamas misceláneas (v.gr, ertapenemos (v.gr., INVANZ) , imipenemos (v.gr., con Cilastatina como en PRIMAXIN) , meropenemos (v.gr., MERREM) , y similares) ; Penicilinas (v.gr., amdinocilinas , amdinocilina pivoxilos, amoxicilinas , ampicilinas ( incluyendo combinaciones de las mismas (v.gr. , con sublactamas como en UNASYN) ) , apalcilinas, aspoxicilinas , azidocilinas , azlocilinas, bacampicilinas , ácidos bencilpenicilínicos , bencilpenicilinas sódicas, carbenicilinas , carindacilinas , clometocilinas , cloxacilinas , coamoxiclavs , ciclacilinas , dicloxacilinas , epicilinas, fenbenicilinas , floxacilinas , hetacilinas, lenampicilinas , metampicilinas , meticilinas sódicas, mezlocilinas , nafcilinas, oxacilinas, penamecilinas , hidroyoduros de penetamato, penicilina G benetami-nas, penicilina G benzatinas (v.gr., BICILLIN L-A) , penicilina G benzhidrilaminas , penicilinas G de calcio, penicilina G hidraba-minas, penicilinas G de potasio, penicilina G procaínas, penicilina N, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatinas, penicilina V hidrabaminas , penimepiciclinas , feneticilinas de potasio, piperacilinas (incluyendo combinaciones de las mismas (v.gr., con inhibidores de beta-lactamasa tales como tazobactama, como en ZOSYN) ) , pivampicilinas , propicilinas , quinacilinas , sulbenicilinas , sultamicilinas , talampicilinas , tazocilinas, temocilinas, ticarcilinas (v.gr., con clavulanatos como en TIMENTIN) , y similares) ; Antibióticos polipéptidos (v.gr., amfomicinas, bacitracinas , capreomicinas , colistimetatos (v.gr., COLI-MYCIN M) , colistinas, enduracidinas , enviomicinas , fusagunginas , gamicidinas, micamicianas , polimixinas, pristinamicinas (y derivados de pristinamicina tales como quinupristinas y dalfo-pristinas (v.gr., SYNERCID) ) , ristocetinas , teicoplaninas , tiostreptonas , tuberactinomicinas , tirocidinas, tirotricinas , vancomicinas , viomicinas , virginiamicinas , bacitracinas de zinc y similares) ; Quinolonas (incluyendo fluoroquinolonas y análogos) (v.gr., mesilatos de alatrofloxacina , cinoxacinas, ciprofloxaci -ñas (v.gr., CIPRO) , clinafloxacinas , difloxacinas , enoxacinas, fleroxacinas , flumequinas, gatifloxacinas (v.gr., TEQUIN) , grepafloxacinas , levofloxacinas (v.gr., LEVAQUIN) , lomefloxaci-nas, miloxacinas, moxifloxacinas (v.gr., AVELOX) , nadifloxacinas , ácidos nalidíxicos, norfloxacinas , ofloxacinas, ácidos oxolíni-cos, pazufloxacinas , perfloxacinas , ácidos pipemídicos, ácidos piromídicos, rosoxacinas, rufloxacinas , esparfloxacinas , temafloxacinas , tosufloxacinas , mesilatos de trovafloxacina y similares) ; Sulfonamidas (v.gr., acetil sulfametoxipirazinas , bencilsulfamidas , cloramina-B, cloramina-T, dicloramina T, formilsulfisomidinas , beta-glucosilsulfanilamidas , mafenidas, 4'- (metilsulfamoil ) sulfanilanilidas , noprilsulfamidas , ftalilsulfa-cetamidas, ftalilsulfatiazoles , salazosulfadimidinas , succinil-sulfatiazoles , sulfabenzamidas , sulfacetamidas , sulfaclorpirida-zinas, sulfacrisoidinas , sulfacitinas , sulfadiazinas , sulfadicra-midas, sulfadimetoxinas , sulfadoxinas , sulfaetidoles , sulfaguani-dinas, sulfaguanoles , sulfalenos, ácidos sulfalóxicos , sulfamera- zinas, sulfameteros , sulfametazinas , sulfametizóles , sulfametomi dinas, sulfametoxazoles , sulfametoxipiridazinas , sulfametroles sulfamidoclirisoidinas , sulfamoxoles , sulfanilamidas , ácidos 4 sulfanilamidosalicílieos , sulfanililsulfanilamidas , sulfanililu reas, n-sulfanilil -3 , 4 -xilamidas , sulfanitranos , sulfaperinas sulfafenazoles , sulfaproxilinas , sulfapirazinas , sulfapiridinas sulfasomizoles , sulfasimazinas , sulfatiazoles , sulfatioureas sulfatolamidas , sulfisomidinas , sulfisoxazoles y similares); Sulfonas (v.gr., acedaponas, acediasulfonas , acetosul fonas sódicas, dapsonas, diatimosulfonas , glucosulfonas sódicas solasulfonas , sublactamas, succisulfonas , ácidos sulfanílieos , p sulfanilbencilaminas , sulfoxonas sódicas, tiazolsulfonas similares) ; Tetraciclinas (v.gr., apiciclinas, clortetraciclinas clomociclinas , demeclociclinas , doxiciclinas , guameciclinas limeciclinas , meclociclinas , metaciclinas , minociclinas oxitetraciclinas , penmepiciclinas , pipaciclinas , rolitetracieli ñas, sanciclinas, tetraciclina) , y otras (v.gr, cicloserinas mupirocinas, tuberinas y similares); y otros antibióticos (tales como clofoctoles, ácido; fusídicos, hexedinas, metenaminas (incluyendo v.gr., metenamina anhidrometileno-citratos de metenamina, hipuratos de metenamina mandelatos de metenamina, sulfosalicilatos de metenamina) nitrofurantoínas (v.gr., FURADANTIN) , nitroxolinas , ritipenemos taurolidinas , xibomoles y similares); Anti-hongos, incluyendo polienos tales como anfoterici-nas B (v.gr. , ABELCETE y AMBISOME) , candicidinas , dermostatinas , filipinas, fungicrominas , hachimicinas , hamicinas, lucensomici-nas, mepartricinas , natamicinas (v.gr., Natacina) , nistatinas, pecilocinas, perimicinas, y otros (v.gr., azaserinas, griseoful-vinas, oligomicinas , undecilenatos de neomicina, pirrolnitrinas , sicaninas, tubercidinas , viridinas) ; así como anti-hongos sintéticos tales como alilaminas (v.gr., butenafinas, naftifinas, terbinafinas) ; imidazolas (v.gr., bifonazolas, butoconazolas , clordantoínas , clormidazolas , cloconazolas , clotrimazolas , econazolas, enilconazolas , fenticonazolas , flutrimazolas , isoconazolas , itraconazola , cetoconazolas , lanoconazolas , miconazolas, omoconazolas , nitratos de oxiconazola, sertaconazo-las, sulconazolas , tioconazolas , voriconazoles (e.g. VFEND) ) ; tiocarbamatos (v.gr., tolciclatos, tolindatos, tolnaftatos) ; triazolas (v.gr., fluconazolas (e.g. DIFLUCAN) , itraconazolas (v.gr., SPORANOX) , saperconazolas , terconazolas) ; y otros sintéticos (v.gr., acrisorcinas , amorolfinas, bifenaminas, bromosalicilcloranilidas , buclosamidas , propionatos de calcio, clorofenesinas , ciclopiroxas , cloxiquinas, coparafinatos , dihidrocloruros de diametazola, exalamidas, flucitosinas , haletazolas, hexetidinas, lipopéptidos tales como equinocandina (como en caspofungina CANCIDAS) , loflucarbanos , nifuratelos, yoduros de potasio, ácidos propiónicos, piritionas, salicilanili -das, propionatos de sodio, sulbentinas, tenonitrozolas , triaceti- nas, ujotionas, ácidos undecilénicos , propionato de zinc) y similares ; Amebicidas y anti -protozoarios (incluyendo, v.gr., atovaquona, hidrocloruro de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazola , hidrocloruro de metronidazola , isetionato de pentamidina y similares); Anti -helménticos y anti -parásitos (incluyendo, v.gr., mebendazola, pamoato de pirantelo, tiabenda-zola y similares); Anti-malaria (incluyendo, v.gr., hidrocloruro de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquina , hidrocloruro de mefloquina, fosfato de primaquina, primetamina, pirimetamina con sulfadoxina) ,· Anti-tuberculósicos y anti - leprósicos (incluyendo, v.gr., clofazimina, cicloserina, dapsona, hidrocloruro de etambutol, isoniazida, pirazinamida , rifabutina, rifampina, rifapentina, sulfato de estreptomicina y similares, así como combinaciones de las mismas tales como rifampina/isoniazida (v.gr., RIFAMATE) y rifampi-na/isoniazida/priazinamida (v.gr., RIFATER) . Para propósitos de ilustración adicional (y sin limitación), ejemplos de agentes inmunomoduladores que se pueden combinar con sHASEGPs de la presente invención (v.gr., combinarse por co- formulación con una o mas sHASEGPs o por co-administración con una o mas sHASEGPs (los cuales se pueden administrar previo a, coincidentes con o siguiendo administración del agente) ) , incluyen, por ejemplo, miembros de las siguientes clases de agentes : Inmunosupresores (incluyendo, v.gr., azatioprina, biasiliximab, ciclosporina , daclizumab, inmunoglobulina de linfocitos, muromomab-CD3 , micofenolato mofetil , hidrocloruro de micofenolato mofetil, sirolimus, tacrolimus y similares); Vacunas y toxoides (incluyendo, v.gr., vacuna BCG, vacuna del cólera, toxoides de difteria y tétanos (adsorbidos) , toxoides de difteria y tétanos y vacuna de Pertussis acelular adsorbidas, toxoides de difteria y tétanos y vacuna de Pertussis de células enteras, vacunas de conjugado de Hemofilio b, vacuna de hepatitis A (desactivada) , vacuna de hepatitis B (recombinan-te) , vacunas del virus de la influenza (con base en antígenos superficiales purificados) , vacunas del virus de la influenza (con base en sub-viriones o sub-viriones purificados) , vacunas del virus de la influenza (con base en viriones completos) , vacuna del virus de encefalitis japonesa (desactivada) , vacuna de enfermedad de Lyme (OspA recombinante) , vacuna de los virus de sarampión y paperas y rubéola (viva) , vacuna de los virus de sarampión y paperas y rubéola (viva atenuada) , vacuna de polisacárido meningococal , vacuna del virus de paperas (viva), vacuna de plaga, vacuna de neumococos (polivalente) , vacuna de poliovirus (desactivada), vacuna de poliovirus (viva, oral, trivalente) , vacuna de la rabia (adsorbida) , vacuna de la rabia (célula diploide humana) , vacuna de los virus de rubéola y paperas (viva) , vacuna del virus de rubéola (viva, atenuada) , toxoide de tétanos (adsorbido) , toxoide de tétanos (fluido) , vacuna de tifoidea (oral) , vacuna de tifoidea (parenteral) , vacuna de polisacárido de tifoide VI, vacuna del virus de varicela, vacuna de fiebre amarilla y similares) ; Antitoxinas y antiveninas (incluyendo, v.gr. , antiveninas de viuda negra y otras arañas, antiveneno de Crotalidae (polivalente) , antitoxina de difteria (equina) , antivenina de Micrurus fulvius y similares) ; Sueros inmunes (incluyendo, v.gr., inmunoglobulina de citomegalovirus (intravenosa) , inmunoglobulina de hepatitis B (humana) , inmunoglobulina intramuscular, inmunoglobulina intravenosa, inmunoglobulina de la rabia (humana) , inmunoglobulina intravenosa del virus sincitial respiratorio (humana) , inmunoglobulinas (humanas) inmunoglobulina del tétanos (humana) , inmunoglobulina de varicela- zoster y similares); Otros inmunomoduladores (incluyendo, v.gr., aldesleuci-na, epoetina alfa, filgrastima, acetato de glatirámero para inyección, interferón alfacón-1, interferón alfa-2a (recombinan-te) , interferón alfa-2b (recombinante) , interferón alfa-n3, interferón beta- la , interferón beta- Ib (recombinante), interferón gamma-lb, hidrocloruro de levamisola, oprelvecina, sargramostim y similares) . Otros agentes que se pueden combinar con sHASEGPs de la presente invención (v.gr., combinados por co- formulación con una o mas sHASEGPs o por co-administración con una o mas sHASEGPs (que se pueden administrar previo a, coincidentes con o siguiendo administración del agente)) incluyen, v.gr. , los siguientes: Anti - inflamatorios esteroidales (tales como aclometaso-nas, algestonas, beclometasonas , betametasonas , budesonidas, clobetasoles , clobetasonas , clocortolonas , cloprednoles , corticoesteronas , cortisonas e hidrocortisonas (v.gr., acetato de hidrocortisona) , cortivazoles , defazacortos , desonidas, desoxime-tasonas, dexametasonas (v.gr, 21-fosfato de dexametasona) , difluorosonas , diflucortolonas , difluprednatos , enoxolonas, fluazacortos , flucloronidas , flumetasonas , flunisolidas , fluocinolonas , fluocinonidas , fluocortinas , fluocortolonas , fluorometolonas , fluperolonas , fluprednidenos , fluprednisolonas , flurandrenolidas , fluticasonas , formocortalos , halcinonidas , halobetasoles , halometasonas , halopredonas , hidrocortamatos , hidrocortisonas , etabonato de loteprednol, mazipredonas , medrisonas, meprednisonas , metilprednisolonas , furoato de mometasona, parametasonas , prednicarbatos , prednisolonas (v.gr., 25-dietilamino-acetato de prednisolona , fosfato sódico de prednisolona) , prednisonas, prednivalos, prednilidenos , rimexolo-nas, tixocortoles , triamcinolonas (v.gr., triamcinolona acetoni-da, triamcinolona benetonida, y triamcinolona hexacetonida) y similares) ; Anti - inflamatorios no esteroidales (tales como cromoglicatos , diclofenacos , flurbiprofenos , indometacinas , ibuprofenos, cetorolacos (v.gr., cetorolac trometamina) , lodoxamidas, nedocromilos , piroxicamos, salicilatos, y simila- res) ; Bloqueadores beta (tales como betaxololes (v.gr. , hidrocloruro de betaxolol), carteololes, esmololes, levobunolo-les, metipranololes , timololes (v.gr., timolol hemihidratado y varias formas de maleato de timolol) y similares) ; Simpatomiméticos (tales como adrenalina, bimonidinas, dipivefriñas , epinefrinas y similares); Ducosanoides , prostaglandinas y análogos de prostaglan-dina (tales como bimatoprostos , latanoprostos , travoprostos , unoprostonas , y similares) así como anti -prostaglandinas y precursores de prostaglandinas; Mióticos, colinérgicos y anti -colinesterasas (tales como cloruros de acetilcolina, carbacoles, bromuros de demecario, fluorofosfatos de diisopropilo , eserinas, fisostigminas , pilocarpinas , yoduros de fosfolina, salicilatos, y similares); Anti -alenérgicos (tales como antazolinas de sodio, cetirizinas, clorfeniraminas , cromoglicatos , cromolino sódico (Crolom) , difumarato de emedastina, cetotifinas (v.gr., fumarato de cetotifeno) , levocabastinas , metapirilinas , nedocromilo sódico, olopatadinas , pirilaminas, profenpiridaminas , y similares) ; Descongestivos (tales como fenilefriñas , nafazolinas, tetrahidrozolinas y similares) ; Agentes hormonales (tales como estrógenos , estradioles, progestacionales , progesteronas , insulinas, calcitoninas , hormona paratiroide y factor de liberación de péptido y vasopresina del hipotálamo y similares) ; Factores de crecimiento (tales como factor de crecimiento de epidermis, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante beta, somatotropina y fibronectina y similares) ; Analgésicos (tales como acetaminofeno ; alfentanilo; aminobenzoato ; aminobenzoato ; anidoxima; anileridina ; anileridi-na; anilopam; anirolac; antipirina; aspirina; benoxaprofeno ; bencidamina ; hidrocloruro de bicifadina; brifentanil ; bromadoli-na; bromofenaco ; buprenorfina ; butacetina; butixirato; butorfa-nol ; butorfanol ; carbamazepina ; carbaspirina de calcio; carbife-no; carfentanilo ; succinato de ciprefadol; ciramadol; ciramadol; clonixerilo; clonixina; codeína; fosfato de codeína; sulfato de codeína; conorfona ; ciclazocina; doxoxadrol ; dexpemedolac ; dezocina; diflunisal; dihidrocodeina ; dimefadano; dipirona; doxipicomina; drinideno, enadolina; epirizola; tartrato de ergotamina; etoxazeno; etofenamato ; eugenol; fenoprofeno; fenoprofeno de calcio; citrato de fentanilo; floctafenina ; flufenisal; flunixina; flunixina meglumina; flupirtina; flupro-quazona; fluradolina; flurbiprofeno ; hidromorfona ; ibufenaco; indoprofeno; cetazocina; cetorfanol; cetorolac; letimida; acetato de levometadilo ; acetato hidrocloruro de levometadilo ; levonan-tradol; levorfanol; lofemizola; oxalato de lofentanilo; lorcina-dol; lomoxicarno; salicilato de magnesio; ácido mefenámico; menabitano; meperidina; meptazinol; metadona; acetato de metadilo; metofolina; metotrimeprazina ; acetato de metcefamida ; mimbano; mirfntanilo ; molinazona; sulfato de morfina ; moxazocina; nabitano; nalbufina; nalmexona; namoxirato; nantradol; naproxeno; naproxeno; naproxol ; nefopam; nexeridina; noracimetadol ; ocfentanilo ; octazamida; olvanilo; oxetorona; oxicodona; oxicodona; terftalato de oxicodona; oximorfona; pemedolaco; pentamorfona ; pentazocina; pentazocina ; fenaxzopiridina ; feniramidol ; picenadol ; pinadolina; pirfenidona ; piroxicam olamina; pravadolina ; prodilidina ; profadol ; propiram; propoxife-no; napsilato de propoxifeno; proxazola; proxorfano; pirrolifeno; remifentanilo ; salcolex; maleato de saletamida; salicilamida; salicilato meglumina; salsalato; salicilato; espiradolina ; sufentanilo; sufentanilo ; sucapsaicina ; talmetacina; talnifluma-to; talosalato; tazadoleno; tebufelona; tetridamina ; tifuraco; tilidina; tiopinaco; tonazocina; tramadol; trefentanilo ; trolamina; veradolina; verilopam; volazocina; xorfanol ; xilazina; mesilato de zenazocina; zomepiraco; y similares); Otros agentes farmacológicos macromoleculares tales como otras proteínas, ácidos nucleicos, y similares; así como complejos de macromoléculas tales como varios vehículos de suministro de fármacos, suministro de proteínas y/o suministro de genes (incluyendo vehículos preparados de manera sintética tales como liposomas y similares, así como vehículos generados biológicamente tales como vectores virales y similares) ; y Otros agentes usados para una variedad de condiciones (e información adicional con respecto a uso, dosis, contraindicaciones, etc., de varios agentes incluyendo aquellos identificados en la presente), como se conoce en la materia, incluyendo, por ejemplo aquellos agentes adicionales identificados en referencias tales como Physicians' Desk Reference (PDR) (Thomson 2003, 2004, 2005) ; the American College of Physicians Complete Home Medical Guide (DK Publishing 2003) ; y agentes adicionales identificados en referencias de patentes incluyendo, por ejemplo, las solicitudes de patente publicadas US 20040224023, 20040224012 y 2005000286 (las cuales listas de agentes por ende se incorporan en la presente por referencia) . Combinaciones de agentes (v.gr. , dos o mas agentes seleccionados a partir de uno o mas de los grupos de agentes precedentes y/o de otros grupos o clases de agentes farmacológicos y otros especificados en la presente o conocidos en la materia) . USO DE sHASEGPs PARA REDUCCIÓN DE LA PRESIÓN INTRAOCULAR Y OTRAS INDICACIONES OFTÁLMICAS Un efecto secundario común que se presenta en los pacientes de cataratas posterior a la operación es una elevación temprana significativa, y ocasionalmente prolongada, en la presión intraocular. Tal condición algunas veces es seria, en especial en los pacientes con cambios del disco óptico glaucoma-tosos . Aunque el aumento de presión tiende a ser más severo cuando se inyectan agentes viscoelásticos , tales como ácido hialurónico, en el ojo, durante la cirugía, la presión intraocu-lar puede llegar a elevarse post -operativamente , inclusive cuando no se utilicen tales agentes. Mas aun, tal un aumento de presión puede presentarse, inclusive cuando no se utilicen medicamentos adicionales durante el procedimiento quirúrgico. En algunos casos, es conveniente dejar un agente viscoelástico en el ojo, lo cual con frecuencia necesita de dar a los pacientes grandes dosis de inhibidores de anhidrasa carbónica. Estos inhibidores reducen la presión intraocular mediante la disminución de la formación de humor acuoso, un fluido que es normalmente secretado en el ojo, por el cuerpo ciliar. Los métodos actuales para aliviar los incrementos de presión post -operativos en el ojo incluyen diferentes tipos de gotas para los ojos, tales como agentes bloqueadores beta-adrenérgicos , agentes simpatomiméticos , mióticos, agentes selectivos alfa II, inhibidores de anhidrasa carbónica, y agentes de prostaglandina . Un método preferido para remover el viscoelástico, tal como el ácido hialurónico, es mediante la inyección de sHASEGP durante o inmediatamente en seguida de los procedimientos quirúrgicos del segmento anterior o del segmento posterior, aunque también son posibles otros métodos de administración conocidos en este campo. Se prefiere que el ácido hialurónico y la sHASEGP se administren mediante inyección en la cámara anterior durante los procedimientos quirúrgicos oculares del segmento anterior, para permitir que el ácido hialurónico actúe como un separador durante el inicio del procedimiento quirúrgico. En algunos casos de trasplante de córnea, la combinación de ácido hialurónico y sHASEGP se puede colocar sobre la superficie de las estructuras intraoculares antes de suturar el trasplante de córnea en su lugar. Esta combinación también se puede utilizar en la cirugía del segmento posterior, tal como cirugía de retina o del vitreo. En algunos casos, puede ser recomendable dejar un agente viscoelástico , tal como Healon, Viscoat u otras sustancias que ocupan espacio en la cámara anterior del ojo a la conclusión de la cirugía. Esto es especialmente cierto en la elevación de presión positiva cuando el contenido intraocular tiende a ir hacia adelante y oprimir contra la superficie posterior de la córnea. Si ocurre esto en un ojo con un lente intraocular sintético en su lugar, la presión sobre el endotelio córneo puede causar un daño significativo a las células, y se puede presentar el subsecuentemente hinchamiento de la córnea y opacificación, que están asociados con una visión disminuida. Típicamente, si la presión intraocular de un paciente se eleva de una forma significativa a la conclusión del procedimiento operativo, es necesario dar a este paciente grandes dosis de inhibidores de anhidrasa carbónica, así como gotas tópicas para los ojos, tales como bloqueadores beta y agonistas alfa II, con el objeto de reducir la formación acuosa y/o de aumentar el flujo acuoso hacia afuera. Estos agentes tienen todos efectos secundarios significativos, y en algunos casos, están contraindicados en los pacientes con diferentes tipos de condiciones médicas, tales como problemas de respiración, cardiopatías , o alta presión sanguínea. Sin embargo, el uso de sHASEGP en estas situaciones eliminará la necesidad de dar a estos pacientes grandes dosis de tales fármacos . Adicionalmente , hay una cantidad significativa de ácido hialurónico en la malla trabecular. La sHASEGP la descompondrá, y por consiguiente, mejorará el flujo hacia afuera del fluido acuoso a través de la malla trabecular. Por consiguiente, se reducirá la presión intraocular del paciente. La combinación de sHASEGP con otros agentes de la cámara anterior, tales como una metilcelulosa (Ocucoat, por ejemplo comercialmente disponible en Storz Instrument Co . ) , utilizados como separadores y/o agentes protectores en la cirugía de cataratas, también será eficaz para prevenir las elevaciones significativas en la presión, debido a que en efecto abrirá la malla trabecular y permitirá un mayor drenaje del humor acuoso mediante el rompimiento de una cantidad significativa del ácido hialurónico presente en la malla trabecular . La remoción de los glicosaminoglicanos de la malla trabecular también es útil para la reducción de la presión intraocular en los individuos que sufran de un glaucoma de ángulo abierto. La sHASEGP humana se puede administrar mediante inyección subconj unti al , o inyección directamente en la cámara anterior. Dado que la sHASEGP actúa enzimáticamente , cantidades aun relativamente limitadas de sHASEGP pueden funcionar efectivamente como un antídoto viscoelástico o para otras situaciones que se ayudan o mejoran por aplicación de una glicosaminoglicanasa . Como con otros usos, las unidades de actividad de hialuronidasa provistas por la sHASEGP para aplicación óptima dependerán en parte en la situación particular siendo tratada - especialmente la cantidad de degradación de glicosaminoglicano que se desea -pero puede fácilmente evaluarse usando modelos apropiados y luego optimizarse como sea apropiado para usos particulares. A manera de ilustración, las unidades de sHASEGP a ser aplicadas como un antídoto serán influenciadas, inter alia, por el procedimiento particular empleado y la cantidad de viscoelástico aplicado, y también en si cualquiera del viscoelástico aplicado se va a remover usando otros procedimientos tales como irrigación y aspiración. Donde sHASEGP se usa siguiendo irrigación y aspiración, generalmente cantidades proporcionando en el rango de 10 a 12,000 unidades, típicamente 100 a 5,000 Unidades, mas típicamente 500 a 2,000 unidades pueden aplicarse, aunque esto de nuevo dependerá de la aplicación particular. Donde sHASEGP se usa para obviar la necesidad por irrigación y aspiración, cantidades mas grandes serán aplicadas para efectivamente digerir un volumen mayor de viscoelástico aplicado, con cantidades generalmente proporcionando en el rango de 50 a 20,000 unidades, típicamente 400 a 10,000, mas típicamente 1,500 a 5,000 unidades se pueden aplicar, aunque esto de nuevo dependerá de la aplicación particular . En el caso de sHASEGPs siendo usadas para reducir la presión intraocular asociada con glaucoma, aplicación de sHASEGPs puede también usarse como un tratamiento primario para reducir IOP asociada con glaucoma y por ende potencialmente evitar la necesidad por procedimientos quirúrgicos tales como filtración de glaucoma, implantes de drenado de glaucoma (derivaciones de tubo) , trabeculoplastia láser, ciclofotocoagulación o iridotomía. Así, sHASEGPs de la presente invención pueden introducirse, por ejemplo, por inyección dentro de la cámara anterior del ojo para proporcionar medios mínimamente invasivos para reducir la presión intraocular asociada con glaucoma. Sin desear limitarse por teoría, se cree que la administración de sHASEGPs en tales configuraciones puede mejorar el flujo hacia afuera de fluidos mediante la malla trabecular y así reducir IOP mediante reducir presiones hidrostática y/u oncótica dentro de la cámara anterior. En el caso de sHASEGPs siendo usadas para disolver agregados o "flotadores" del vitreo, los cuales son generalmente agregados opacos macroscópicos de fibras vitreas, la administración de sHASEGP al cuerpo vitreo puede usarse para promover desagregación . De manera similar, sHASEGPs como se describen en la presente pueden aplicarse al vitreo para promover la resolución de hemorragias del vitreo (es decir, extravasación de sangre dentro del vitreo) lo cual puede ocurrir en conexión con condiciones tales como retinopatía diabética, neovascularización retinal, oclusión de venas retínales, separación del vitreo posterior, lágrimas retínales, traumas oculares y similares. La presencia de hemorragias del vitreo, las cuales son típicamente lentas en resolver, puede retrasar, complicar o impedir procedimientos que requieren que la retina sea visualizada a través del vitreo para diagnóstico y/o para procedimientos de tratamiento tales como fotocoagulación láser y similares las cuales son frecuentemente técnicas de tratamiento para condiciones tales como retinopatía diabética proliferativa . El uso de sHASEGPs para promover resolución de tales hemorragias del vitreo puede así usarse para facilitar diagnóstico de condiciones retínales y/o para evitar la necesidad por procedimientos mas radicales tales como vitrectomía. En el caso de sHASEGPs siendo usadas para promover separación vítreo-retinal al tratar condiciones tales como retinopatía diabética, la administración de sHASEGP dentro del vitreo puede usarse para promover separación o desacoplamiento del cuerpo vitreo de la retina. En este contexto, la sHASEGP puede no solamente promover la separación sino ayudar a que ocurra de una manera que reduce el potencial para distorsión o desgarre retinal. Las sHASEGPs de la presente invención también se pueden usar para tratar opacidades de córnea. En ese respecto, una variedad de distorsiones o deformidades pueden afectar la estructura normalmente organizada de la córnea y llevar a perturbaciones en el paso de luz a través de la córnea y deterioros concomitantes en la visión. De esta manera, un número de condiciones y causas llevan a distorsiones de córnea que pueden aparecer como cicatrices, nebulosidad u opacificación . Al aplicar sHASEGPs a la mejora o tratamiento de tales condiciones de córnea, la sHASEGP (en una solución farmacéuticamente aceptable la cual puede comprender uno o mas agentes farmacológicos adicionales) puede introducirse a la córnea por cualquiera de varias rutas de administración, dependiendo en parte del grado y ubicación de la lesión de córnea. A manera de ilustración, sHASEGPs pueden introducirse sobre la superficie exterior del ojo (usando gotas u otra aplicación tópica, por ejemplo) , potencial-mente encapsuladas dentro de vehículos tales como liposomas y similares que se pueden usar para facilitar transferencia a través del epitelio de córnea, por inyección o microinyección sobre o dentro de la propia córnea, o por otros enfoques al tejido de córnea. Además de adyuvantes bioquímicos o mecánicos para promover suministro, otros medios para promover permeación tales como iontoforesis pueden de manera similar aplicarse. Las sHASEGPs de la presente invención también se pueden usar, por ejemplo, para mejorar la permeabilidad de agentes empleados en terapia fotodinámica (PDT) . PDT es un tratamiento para membranas neovasculares coroidales (CNVM) , las cuales son generalmente estructuras vasculares con fugas bajo la retina en la forma "húmeda" de degeneración macular relacionada con la edad (AMD) . En PDT, un colorante fotosensible tal como VISUDYNE (verteporfina) típicamente se administra de manera intravenosa (IV) y se le permite difundir la CNVM, así como el resto del cuerpo. Un oftalmólogo entonces generalmente trata la CNVM con un láser rojo de una longitud de onda específica (v.gr., 689 nm) por alrededor de 90 segundos. La luz de láser no térmica activa al colorante (tal como VISUDYNE) produciendo una forma activa de oxígeno que tanto coagula y reduce el crecimiento de vasos de sangre anormales, lo cual a su vez inhibe la fuga de fluido de la CNVM. Las sHASEGPs de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, para promover administración mas localizada de un colorante (tal como VISUDYNE) directamente al ojo; y/o para facilitar la entrega de otros agentes que son administrados de manera útil al ojo en conexión con procedimientos tales como PDT. QUISTES DE GANGLIOS El quiste de ganglios (también conocido como quiste de muñeca, quiste de biblia, o quiste de tendón dorsal) es la masa de tejido blanco más común de la mano. Es un saco relleno de fluido que se puede sentir debajo de la piel. Normalmente está unido a una vaina de tendón (revestimiento que lubrica el tendón) en la mano o en la muñeca, o está conectado con una articulación subyacente; sin embargo, algunos no tienen una conexión obvia a estructura alguna. Éstos se pueden presentar también en los pies. Con frecuencia se presenta cuando hay un desgarre en los ligamentos que se sobreponen al revestimiento de los tendones o articulaciones, y el revestimiento se hernia hacia afuera del defecto ligamentoso, causando un abultamiento debajo de la piel. Debido a que con frecuencia hay inflamación asociada, el tejido inflamado produce un fluido tipo jalea que rellena el saco sobresaliente. Pueden ser duros como roca debido a una alta presión del fluido tipo mucoso contenido adentro del quiste, y con frecuencia son pasados por alto por una prominencia ósea. La sHASEGP se puede utilizar para aminorar los quistes de ganglios. La inyección intra-lesional de la sHASEGP, de 5-1,000 Unidades, seguida por aspiración con aguja fina, removerá el quiste sin la necesidad de cirugía. Opcionalmente se pueden inyectar corticosteroides , así como la sHASEGP. Se puede requerir una inyección adicional para algunos pacientes. MIXEDEMA La infiltración de glicosaminoglicano (GAG) de la piel es una característica del hipertiroidismo , hipotiroidismo, mixedema pretibial, escleromixedema , y escleredema. El ácido hialurónico es el glicosaminoglicano principal en todas las condiciones y en la piel normal. Existe una variabilidad histológica mínima de distribución dérmica de glicosaminoglicano. Las mucinosas cutáneas adquiridas exhiben una distribución y composición bioquímica similar de glicosaminoglicano en la piel.
Las diferencias morfológicas en la actividad fibroblástica sugieren que las mucinosas del escleredema y el escleromixedema representan un proceso local, mientras que la infiltración de glicosaminoglicano de las enfermedades de tiroides puede tener un origen sistémico. Estos trastornos se pueden aminorar con una sHASEGP, tanto con la vía de administración local como sistémica. Para la terapia crónica, se puede prever la sHASEGP pegilada. USOS PULMONARES DE sHASEGP Los niveles de hialuronano en los lavados bronquioal-veolares (BAL) de individuos normales, generalmente están debajo de 15 ng/ml. Sin embargo, los niveles BAL se elevan dramáticamente en condiciones de tensión respiratoria (Bjermer Br. Med. J. (Clin Res. Ed.) 3 de octubre de 1987; 295 ( 6602 ) : 803 - 6 ) . Por ejemplo, en el ARDS, los niveles de hialuronano pueden aumentar hasta 500 ng/ml, mientras que en el pulmón de los granjeros, los niveles BAL pueden sobrepasar los 1,000 ng/ml (Hallgren y colaboradores, Am. Rev. Respir. Dis. marzo de 1989; 139(3) :682-7), (Larrson y colaboradores, Chest., enero de 1992; 101(1) :109-14) . El incremento de hialuronano en el pulmón puede prevenir la difusión de oxígeno y el intercambio de gases, así como activar las respuestas de neutrófilos y macrófagos . Las preparaciones de bovino de hialuronidasa no son preferibles para el tratamiento de estas condiciones por un número de razones. Primero, se sabe que las preparaciones de hialuronidasa derivadas de testículos del rastro están contamina- das con proteasas de serina, tales como acrosina. En segundo lugar, la naturaleza extraña de las enzimas bovinas aumenta la probabilidad de una reacción anafiláctica , la cual podría dar como resultado la muerte del paciente. Por consiguiente, se puede suministrar una preparación altamente purificada de sHASEGP humana recombinante ya sea mediante suministro pulmonar o intravenoso. La sHASEGP humana también se puede administrar a los pacientes que sufran de otras complicaciones pulmonares que estén asociadas con glicosaminoglicanos elevados, o para mejorar el suministro de otras moléculas co-suministradas al pulmón. Ahora se describirá la invención con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLO 1 ENSAYOS DE HIALURONIDASA BASADOS EN MICROTITULACIÓN El siguiente ejemplo proporciona un ensayo rápido para medir la actividad de hialuronidasa de la sHASEGP. Este ensayo se puede relacionar con TRU, IU, o NFU, a través del uso de una preparación estándar W.H.O de hialuronidasa. ENSAYO DE MICROTITULACIÓN DE HIALURONANO BIOTINILADO Los grupos carboxilo libres sobre los residuos de ácido glucurónico del hialuronano se biotinilan en una reacción de un paso utilizando biotina-hidrazida (Pierce) , sulfo-NHS (Pierce) , y 1-etil dimetilaminopropil-carbodiimida (Sigma) . Este sustrato de hialuronano biotinilado se acopla de una manera covalente a una placa de microtitulación de 96 pozos en una segunda reacción.
Al terminar la reacción enzimática, se detecta el sustrato residual con una reacción de avidina-peroxidasa que se puede leer en un lector de placas ELISA estándar. Debido a que el sustrato se enlaza covalentemente a la placa de microtitulación, no se presentan artificios, tales como un desplazamiento dependiente del pH del sustrato biotinilado. La sensibilidad permite medir rápidamente la actividad de hialuronidasa a partir de las células cultivadas y de las muestras biológicas con una variación inter-ensayo menor al 10 por ciento, a. Protocolo PREPARACIÓN DEL SUSTRATO DE HIALURONANO BIOTINILADO Se disolvieron 100 mg de hialuronano (Sigma Chemicals) en MES 0.1 M, pH de 5.0, hasta una concentración final de 1 mg/ml, y se les permitió disolverse durante cuando menos 24 horas a 4°C antes del acoplamiento de la biotina. Se agregó sulfo-NHS (Pierce; Rockford, Illinois, Estados Unidos) a la solución de CS04 MES, hasta una concentración final de 0.184 mg/ml. Se disolvió hidrazida de biotina (Pierce) en sulfóxido de dimetilo como una solución de suministro de 100 mM, y se agregó a la solución CS04 hasta una concentración final de 1 mM. Se preparó una solución de suministro de 1 -etil -3 - ( 3 -dimetilaminopropil ) carbodiimida (EDAC) como una solución de suministro 100 mM en agua destilada, y se agregó a la solución de hialuronano-biotina en una concentración final de 30 mM. Esta solución se dejó agitándose durante la noche a 4°C. Se removieron la biotina y la EDAC no enlazadas mediante diálisis contra agua con tres cambios de un volumen ?,???? de agua. El hialuronano biotinilado (bHA) dializado se puso en alícuotas, y se almacenó a -20°C durante hasta varios meses . El sulfo-NHS se diluyó hasta 0.184 mg/ml en agua con el bHA en una concentración de 0.2 mg/ml, y se pasó por pipeta a placas COVALINK-NH de 96 pozos (NU C; Placerville NJ) a 50 µ? por pozo. La EDAC se diluyó hasta 0.123 mg/ml en agua, y se pasó por pipeta a las placas COVALINK-NH con la solución de bHA, dando como resultado una concentración final de 10 g/pozo de bHA y 6.15 g/pozo de EDAC. Las placas se incubaron durante la noche a 4°C, o durante 2 horas a 23°C, lo cual dio resultados comparables. Después de la inmovilización covalente del bCS04 sobre las placas de microtitulación, se removió la solución de acoplamiento mediante agitación, y las placas se lavaron tres veces en suero regulado con fosfato conteniendo NaCl 2M y MgS04 50 mM (Regulador A) . Las placas se pudieron almacenar a 4°C durante hasta una semana . Las placas COVALINK-NH con el bHA inmovilizado, se equilibraron con 100 µ?/???? de regulador de ensayo - ya sea formato 0.1 M, pH 3.7, NaCl 0.1 M, detergente Tritón X-100 al 1%, sacarolactona 5 mM para la hialuronidasa lisosomal; o bien, Hepes 10 mM, pH 7.4 con CaCl2 1 mM, y 1 mg/ml de albúmina de suero humana (ICN) para las enzimas activas en neutro. Se generó un conjunto de estándares para la calibración de la actividad enzimática contra las "Unidades Reductoras de Turbidez Relativa" (rTRUs) diluyendo la hialuronidasa testicular bovina (Sigma, Tipo VI-S) en el regulador de enzima neutro a partir de 1.0 a lxlO"6 rTRU/pozo, y ensayando 100 µ?/???? por triplicado. Las muestras de hialuronidasa activa en ácido se diluyeron en el regulador de ensayo lisosomal a partir de 1:10 hasta 1:130,000, y se pasaron por pipeta por triplicado a 100 µ?/????. Para la mayoría de los ensayos de extractos de tejido y plasma humano, fue suficiente una incubación de 30 minutos a 37°C. Se incluyeron los pozos de control positivo y negativo (sin enzima o sin ABC (ver más adelante), respectivamente) por triplicado. La reacción se terminó mediante la adición de 200 µ?/???? de guanidina-HCl 6 M, seguida por tres lavados de 300 µ?/???? con suero regulado con fosfato, NaCl 2 mM, MgS04 50 mM, detergente Tween 20 al 0.05% (Regulador B) . Se preparó un kit (Vector Labs ; Burlingame, California, Estados Unidos) de complejo de avidina-biotina (ABC) en 10 mi de suero regulado con fosfato conteniendo detergente Tween 20 al 0.1%, el cual se incubó previamente durante 30 minutos a temperatura ambiente durante la incubación. Se agregó la solución ABC (100 µ?/????) , y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó cinco veces con el Regulador B, luego se agregó un sustrato de O-fenilendiamina (OPD) a 100 µ?/???? disolviendo una tableta de 100 mg de OPD en 10 mi de regulador de citrato-P04 0.1 M, pH 5.3, y agregando 7.5 µ? de H202 al 30%. La placa se incubó en la oscuridad durante 10-15 minutos, y luego se leyó utilizando un filtro de 492 nm en un lector de placas ELISA (Titertek Multiskan PLUS; ICN) monitoreada mediante computadora, utilizando el software lector de placas Delta Soft II de Biometalics (Prince-ton, Nueva Jersey, Estados Unidos) . Se generó una curva estándar utilizando hialuronidasa testicular bovina, mediante un ajuste de curva de cuatro parámetros de la preparación de hialuronidasa comercial, y se interpolaron muestras desconocidas a través de su absorbencia a 492 nm. Con el fin de analizar la dependencia en el pH de las hialuronidasas , se utilizan sHASEGP recombinante purificada y hialuronidasa testicular bovina. La dependencia en el pH de la actividad enzimática se mide diluyendo la sHASEGP purificada o la hialuronidasa testicular bovina parcialmente purificada hasta 0.1 rTRU en los siguientes reguladores: formato 50 mM, pH 3-4.5; acetato 50 mM, pH 5-6; MES 50 mM; pH 6-7; o HEPES 50 nM, pH 7-8. Las muestras se ensayaron durante 30 minutos a 37°C, y la actividad se expresó como un porcentaje de la actividad má ima. No se utilizó NaCl en los reguladores, debido a que puede alterar el pH óptimo de las preparaciones de hialuronidasa testicular (Gold, Biochem. J. 205:69-74, 1982; Gacesa y colaboradores, Biochem. Soc . Trans . 7:1287-1289, 1979); las concentraciones de sal fisiológica (0.15 M) redujeron el pH óptimo aparente, un efecto que fue más pronunciado en las preparaciones purificadas de la enzima testicular que en la muestra cruda original . b. Resultados El hialuronano se biotiniló en una reacción de un paso utilizando hidrazida de biotina y EDAC. Mediante la limitación de la EDAC, que acopla con los grupos carboxilo libres del HA con la hidrazida de biotina, solamente se marcó una pequeña fracción de los residuos de ácido glucurónico totales del HA. Esta cantidad de EDAC (3xl0~5 M) agregada al HA (2.8xl0~3 M) da como resultado un máximo de una molécula de hidrazida de biotina acoplada por 93 Unidades de disacárido de HA. Se preparó un ajuste de curva de cuatro parámetros de reacciones estándares de hialuronidasa testicular bovina medidas a un pH de 3.7, y se diluyeron de 1.0 a 1 x 10"6 TRU/pozo. Se establecieron ajustes de curva de cuatro parámetros a partir de la ecuación y= ( (A-D) / ( 1+ (conc/C) AB) ) +D) , en donde logit y= ln (y'/l-y'), y ' = (y-D) / (A-D) , B=-b/ln 10 y C=EXP (a/B) . Los cuatro parámetros (A,B,C,D) se calcularon con un programa de software que utilizó el algoritmo 2+2 con regresión lineal (Rodbard y colaboradores, Clin. Chem. 22:350, 1976) . Este ajuste de la curva incorpora los aspectos sigmoidales de la curva estándar. Se presenta una exactitud óptima para la medición de una muestra típicamente de 0.001 a 0.01 TRU/pozo para una incubación de 30 minutos. Durante la incubación de 60 minutos, es detectable hasta 1/1,000 de una TRU. También se puede utilizar una curva logarítmica estándar sobre un intervalo más corto de valores para establecer un ajuste de curva estándar. Aunque la invención se ha descrito en relación con las modalidades preferidas específicas, se debe entender que la invención como se reivindica no debe limitarse indebidamente a estas modalidades específicas. EJEMPLO 2 CLONACIÓN DEL ADNc de sHASEGP Un técnico en la materia puede obtener el ácido nucleico que codifica la sHASEGP humana a través de un número de procedimientos, incluyendo, pero no limitándose a, síntesis de genes artificiales, RT-PCR, e hibridación de biblioteca de ADNc (por ejemplo, ver Gmachl y colaboradores, FEBS 336(3) 1993, Kimmel y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 90, 1993, 10071-10075) . De una manera alternativa, se pueden obtener clones que codifiquen la sHASEGP humana a partir de IMAGE, u otros proveedores de secuencias genéticas humanas (Invitrogen, Clon ID IOH10647) . Se calculó la longitud completa del ADN de PH20 humano en 2009 nucleótidos de longitud, y contenía un marco de lectura abierta de 1,530 nucleótidos. La UTR 5' es inusualmente grande, lo cual puede indicar un intrón retenido, y puede inhibir la traducción previniendo el enlace del ribosoma al codón de metionina de inicio de correcto debido a los nueve codones de inicio no codificantes de la UTR 5' . Se predice que la proteína (Genbank, Número de Acceso NP_003108) comprende 509 aminoácidos, SEQ ID NO:l, con una masa molecular calculada de 58 kDa . Para la secuenciación de los clones, las bandas amplificadas con reacción en cadena de la polimerasa se cortaron, y se extrajeron con el Gel Extraction Kit (Qiagen) , y se clonaron en los vectores apropiados con los extremos compatibles después de la digestión de restricción. Todas las reacciones de secuen-ciación se llevaron a cabo sobre ADN de doble cadena con el estuche de secuenciación de ciclo con terminador de desoxi de tinte Taq (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se ejecutaron en un secuenciador automatizado ABI Prism (Applied Biosystems) . El marco de lectura abierta de PH20 humano se obtuvo amplificando una biblioteca de ADNc de testículos humanos (Clontech, Palo Alto, California, Estados Unidos) mediante reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los cebadores de las SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 47. Los productos PCR se digirieron con Nhel y BamHI, y se clonaron en los sitios Nhel y BamHI del vector IRESpuro2 (Clontech) . EJEMPLO 4 AISLAMIENTO DE LA sHASEGP A PARTIR DEL ADNc DE PH20 HUMANO Se generó un vector de expresión de sHASEGP humana recombinante secretada catalíticamente activo capaz de tener una glicosilación efectiva en células de mamífero, como se describe en seguida. Se contemplan otras construcciones de expresión con promotores y genes de selección para diferentes especies, tales como células de levadura y de insecto, que también son capaces de generar la sHASEGP. También se pueden utilizar genes de selección positiva tales como sintasa de glutamina o reductasa de dihidro-folato (DHFR) . Los ejemplos que se dan más adelante no pretenden restringir la invención, sino que más bien se proporcionan como un ejemplo de diferentes sistemas de expresión de plásmidos que se pueden utilizar. Con el objeto de construir las formas secretadas de sHASEGP, se construyeron mutantes de truncamiento que carecen del extremo C-terminal hidrofóbico. Utilizando un programa de predicción de disociación de GPI, se localizó el sitio de disociación de ancla de GPI alrededor de la posición del aminoácido N 483 en la proteína anclada a GPI de longitud completa. Se utilizó un conjunto de siete cebadores 3' anidados para construir un conjunto de siete mutantes de supresión truncados que carecían del ancla de GPI predicha empezando en la posición Y 482, y se suprimió progresivamente por un aminoácido. Estos cebadores se diseñaron para tener sitios Nhel (5') y BamHI (31) compatibles para clonar los mutantes de truncamiento en el vector Irespuro2, ya sea no marcados con un codón de paro en el cebador 3 ' , o como una proteína marcada con His C-terminal para una facilidad de purificación y de detección. Por ejemplo, se utilizaron los cebadores en reversa de las SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, para generar mutantes de supresión finalizando en la posición Y 482, F 481, e I 480 sin una marca 6 His. Se generaron otros cebadores de mutantes con el mismo diseño básico, con las modificaciones apropiadas, para incluir y excluir los aminoácidos particulares. Para generar las variantes marcadas con His, se utilizó el mismo conjunto de cebadores que para las variantes no marcadas, con la excepción de que los cebadores carecen del codón de paro en los cebadores en reversa respectivos, quedando el cebador hacia adelante igual (para esta construcción marcada con His, haga referencia a los cebadores con las SEQ ID N0s:19, 20, 21, 22, 23, 24, y 25, que son los cebadores en reversa sin codón de paro correspondientes a los cebadores en reversa no marcados, para ver sus construcciones respectivas) . Se utilizaron cebadores traslapados para construir un separador de 6 aminoácidos, seguidos por hexahistidina dentro de los sitios BamHI y Notl en el vector Irespuro2, de tal manera que se generaron los mutantes marcados con His mediante ligamento de los productos amplificados con PCR y digeridos por restricción dentro de los sitios Nhel y BamHI en esta marca His que contiene el vector Irespuro2. Con el fin de identificar si se podía modificar la sHASEGP en su término carboxilo para generar una enzima secretada y activa en neutro, se hicieron una serie de truncamientos a partir del sitio de unión de ancla de GPI al "dominio catalítico" predicho, basándose en la homología con la enzima de veneno de abej a . Se utilizó el ADN que codificaba el clon anclado de GPI de longitud completa de la sHASEGP humana en el IRESPuro2 como una plantilla, para generar los diferentes mutantes de supresión truncados. Los programas de modelación de software dieron varios sitios de disociación predichos para el polipéptido de longitud completa. Uno de estos sitios predichos estuvo en la posición del aminoácido N483 (SEQ ID N0:1) . Se diseñaron cebadores de reacción en cadena de la polimerasa para truncar sucesivamente la proteína a partir de N483, con el fin de generar 6 mutantes de supresión empezando en Y482 (que carece de N) y finalizando en E 477 (que carece de P) . a. Protocolo Generación de mutante con truncamiento que carece de N483: El clon de sHASEGP anclado a GPI de longitud completa entre el sitio Nhel y BamHI en el pIRESPuro2 se utilizó como una plantilla. Esta plantilla se amplificó con el cebador 5' que contiene el sitio Nhel que empieza en la metionina de inicio del péptido de señal nativo en MI (SEQ ID N0:14) , y un cebador 3' que contiene el sitio BamHI que termina en Y 482 (SEQ ID N0:8) . El producto de la reacción en cadena de la polimerasa se ejecutó sobre un gel de agarosa al 1% para resolver y confirmar la banda amplificada en el tamaño correcto, se purificó en gel, se digirió por restricción con Nhel y BamHI, y se clonó en el vector pIRESPuro2 (Clontech) entre los sitios Nhel y BamHI, generando un vector de expresión para expresar este mutante con truncamiento de sHASEGP que termina en la posición del aminoácido N482, y que carece del ancla de GPI con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO : 5 para la secuencia del polipéptido resultante de sHASEGP hasta Y 482), y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:48 - que codifica los nucleótidos para el polipéptido de la SEQ ID N0:5), como se indica. Generación de otros mutantes con truncamiento que carecen de Y 482, F 481, I 480, Q 479, y P 478, respectivamente. Se empleó la misma estrategia, siendo la única diferencia la utilización del cebador 3 ' apropiado para cada mutante. Los cebadores 3' respectivos son como sigue: El cebador 3 ' para el mutante de sHASEGP que carece de Y 482 - SEQ ID NO : 9. El cebador 3' para el mutante que carece de F 481 - SEQ ID NO: 10. El cebador 3' para el mutante que carece de I 480 - SEQ ID NO: 11. El cebador 3' para el mutante que carece de Q 479 - SEQ ID NO: 12. El cebador 3 ' para el mutante que carece de P 478 - SEQ ID NO: 13. Generación de mutantes con supresión adicionales para determinar el dominio mínimamente activo de sHASEGP: Se hicieron supresiones adicionales, en bloques de 10 a 20 aminoácidos, desde el extremo 3' del mutante con truncamiento activo a un pH neutro más interno de sHASEGP, que es la sHASEGP hasta E 477. Se utilizó el cebador hacia adelante de Nhel de la SEQ ID NO: 14, con un cebador 3' apropiadamente colocado para amplificar con reacción en cadena de la polimerasa un mutante con supresión de sHASEGP de la longitud deseada, desde el extremo carboxi -terminal . Por ejemplo, se utilizó reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores descritos en la SEQ ID NO: 14 y en la SEQ ID NO: 26 como los cebadores 51 y 3', respectivamente, con el fin de generar el polipéptido en la SEQ ID NO: 49, cuando se expresa a partir de una construcción de expresión en el vector IresPuro2. De una manera similar, se utilizó reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores en reversa 3 ' descritos en las SEQ ID NO:27, 28, 29, 30, 31, y 32, para generar los mutantes de supresión que terminan en las posiciones de aminoácidos A 477, S 430, G 413, S 394, A 372, y S 347, respectivamente, de la sHASEGP madura. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa en cada caso se digirieron con las enzimas Nhel y BamHI , y el producto digerido se clonó en el vector pIresPuro2 entre los sitios Nhel y BamHI . Unos cuantos clones independientes en la construcción de expresión final de cada grupo se probaron para determinar su actividad de sHASEGP activa en neutro secretada, mediante transfeccion transitoria en células de ovario de hámster chino en un medio exento de suero de CD-CHO (Invitro-gen, California, Estados Unidos) , y las muestras se extrajeron en los puntos del tiempo indicados para el ensayo. El ADN de Miniprep preparado a partir de cultivos nocturnos, se transfectó con el reactivo de transfeccion Genejuice (Novagen, California, Estados Unidos) , siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. La actividad de hialuronidasa se midió mediante ensayo de microtitulación como se describe en lo anterior, b. Resultados La actividad de hialuronidasa se midió en los mutantes con truncamiento de sHASEGP para identificar el dominio mínimamente activo para la actividad de hialuronidasa activa en neutro secretada .
Los resultados mostraron que los seis mutantes de supresión de un aminoácido que terminaban en los aminoácidos indicados desde Y 482 hasta E 477, dieron una actividad secretada más alta que la sHASEGP anclada a GPI . Los resultados también mostraron que la supresión es más allá de A 467 eliminaban cualquier actividad secretada. La actividad en neutro secretada desde los clones A 467 se redujo hasta aproximadamente el 10% de la encontrada en los clones P 478 o N 483. Por consiguiente, se concluyó que se requería más del dominio carboxi -terminal de la sHASEGP humana para crear el dominio de hialuronidasa activa en neutro de lo que previamente se asumía para la enzima de veneno de abeja. Las cisteínas en el dominio carboxi -terminal , por lo tanto, son necesarias para la actividad en neutro. De esta manera, un intervalo muy estrecho que se extiende por aproximadamente 10 aminoácidos antes del sitio de disociación de GPI en N 483 definió el dominio mínimamente activo. EJEMPLO 5 EFECTOS DE LA MODIFICACIÓN DEL PÉPTIDO DE SEÑAL SOBRE LA ACTIVIDAD SECRETORA DE sHASEGP La sHASEGP humana posee un péptido líder nativo predicho inusualmente largo. Adicionalmente , la existencia de dos residuos de cisteína adyacentes en el péptido líder puede conducir a la acumulación de multímeros de polipéptidos dentro del retículo endoplásmico durante la expresión de alto nivel, y por consiguiente, impide la expresión de alto nivel de una sHASEGP. Por consiguiente, probamos una serie de péptidos líderes secretores más eficientes para examinar su capacidad para mejorar la dirección de la sHASEGP para la secreción, a. Protocolo Se construyó el péptido líder Kappa mediante el traslape del templado del cebador y PCR de extensión con los cebadores correspondientes a las secuencias de las SEQ ID NO: 37, 38, 39, y 40. La secuencia Kappa amplificada con PCR resultante se amplificó con cebadores de flanqueo que contenían el sitio Nhel en el extremo 5' (como se describe en la SEQ ID NO:41) , y el sitio EcoRI en el extremo 31 (como se describe en la SEQ ID NO:42) . Esto permitió clonar el péptido líder Kappa (la secuencia de polipéptido es como se describe en la SEQ ID NO:43) en el vector Litmus 39 (NEB) entre los sitios Nhel y EcoRI . La sHASEGP tiene un sitio EcoRI interno; por consiguiente, esta construcción Kappa entre el sitio Nhel y el sitio EcoRI, se amplificó adicionalmente con un cebador Spel 5' (como se describe en la SEQ ID NO:44), y un cebador MluI 3' (como se describe en la SEQ ID NO-.45) . La sHASEGP sin el ancla de GPI que termina en P 478, se cortó del pIresPuro2 con Nhel y BamHI , y se clonó en un vector Litmus 39 (NEB) dentro de los sitios Nhel y BamHI del vector Litmus 39. Este vector Litmus que contiene sHASEGP resultante, se digirió con las enzimas de restricción Spel y MluI, y se clonó ahí la construcción líder Kappa amplificada con Spel y MluI. Se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio sobre este vector Litmus 39 que contenía tanto la secuencia Kappa como la de sHASEGP, para generar la fusión en el marco de la secuencia líder Kappa con el polipéptido maduro de sHASEGP . Se utilizaron pares de cebadores correspondientes a las SEQ ID NOs:34 y 35 para generar el líder Kappa con el Asp nativo como el aminoácido terminal fusionado al F 38 de sHASEGP (hasta P 478) (como se describe en la SEQ ID NO: 46 para la secuencia del polipéptido de la proteína de fusión) . Se utilizaron otras combinaciones de pares de cebadores, tales como se incorporan por la SEQ ID NO: 33 con la SEQ ID NO: 35, para generar el líder Kappa que termina en el Asp (D) terminal fusionado con L36 de sHASEGP; se utilizaron las SEQ ID NO: 33 con SEQ ID NO: 36 para generar el líder Kappa que termina en Gly (G) (antes del Asp (D) terminal) fusionado con L 36 de la sHASEGP; y se utilizaron las SEQ ID NO: 34 con SEQ ID NO: 36 para generar el Kappa que termina en Gly (G) (antes del Asp (D) terminal) fusionado con F 38 de la sHASEGP. Las fusiones de Kappa- sHASEGP obtenidas mediante mutagénesis dirigida al sitio, se purificaron en gel, se digirieron con la enzima Dpnl para digerir cualquier ADN progenitor llevado adelante, y luego se digirieron con Nhel y BamHI , y se clonaron en la estructura base de HisIresPuro2 digerido con Nhel/BamHI, que tiene la marca His (un separador de seis aminoácidos seguido por seis histidinas) clonada entre los sitios BamHI y Notl en el vector pIRESPuro2. Por consiguiente, después del ligamento, obtenemos una construcción que es Nhel -Kappa- sHASEGP-BamHI -His en el pIresPuro2. Se obtuvieron cuatro juegos de esta construcción que corresponderían a las combinaciones de G o D en el extremo del líder Kappa, y L 36 o F 38 al principio de la sHASEGP madura. Se transfectaron unos cuantos clones independientes de cada tipo de construcción en células CHO, en un medio de CD-CHO (Invitrogen, CA) , para probar si la presencia del líder de secreción Kappa promovería mayores niveles de proteína secretada, comparándose con el líder de secreción nativo. El ADN de Miniprep preparado a partir de cultivos nocturnos se transfectó con el reactivo de transfección Genejuice (Novagen, California, Estados Unidos) , siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante, y se extrajeron las muestras para la prueba mediante ensayo de microtitulacion en los puntos del tiempo indicados. La actividad de hialuronidasa se midió mediante el ensayo de microtitulacion, como se describe anteriormente . Se probaron las construcciones de fusión de sHASEGP con el péptido líder de cadena Kappa de IgG de ratón para probar niveles más altos de la actividad de sHASEGP activa en neutro secretada . b. Resultados Los resultados del ensayo enzimático indicaron que el líder Kappa de IgG era capaz de mejorar la secreción de sHASEGP de aproximadamente 7 a 8 veces más alta que el líder de secreción nativo, al compararse con los clones P478, Y 482, o N 483 que carecían de este líder. Otras construcciones de líder Kappa con variaciones del sitio de fusión del líder desde el Asp o el Gly del líder Kappa hasta L 36 o F 38 de sHASEGP, produjeron mayores niveles de actividad de hialuronidasa activa en neutro secretada también. Estos ejemplos pretenden extender, más bien que limitar, el alcance de la invención, debido a que se pueden utilizar otras secuencias líderes secretoras eficientes con la misma tecnología. EJEMPLO 6 GENERACIÓN DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN DE sHASEGP HUMANA Se generó una sHASEGP sin una marca de epítope, mediante la clonación en un cartucho de expresión bicistrónico, HZ24 (SEQ ID NO: 47) . El vector del plásmido HZ24 para la expresión de sHASEGP comprende una estructura base el vector pCI (Promega) , la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos 1-482 de la hialuronidasa PH20 humana, un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) a partir del virus ECMV (Clontech) , y el gen de reductasa de dihidrofolato de ratón (DHFR) . La estructura base del vector pCI también incluye ADN que codifica el gen de resistencia a beta-lactamasa (AmpR) , un origen de réplica fl, una región potenciadora/promotora inmediata- temprana de citomegalovi -rus (CMV) , un intrón quimérico, y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40) . El ADN que codificaba la construcción de sHASEGP contenía una secuencia en consenso Kozak en la metionina del líder de señal nativo, y un codón de paro en la tirosina 482.
La construcción resultante pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ-24) da como resultado una sola especie de ARNm impulsada por el promotor CMV que codifica los aminoácidos 1-482 de PH20, y los aminoácidos 1-187 de la reductasa de dihidrofolato separada por el sitio de entrada ribosomal interno. El marco de lectura abierta de PH20 humano se amplificó a partir de un clon de marco de lectura abierta de Invitrogen (IOH10647, Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) con un cebador 5' que introdujo un sitio Nhel y la secuencia en consenso Kozak antes de la metionina de PH20, y un cebador en reversa que introdujo un codón de paro en seguida de la tirosina 486, y que introdujo un sitio de restricción BamHI . El producto de reacción en cadena de la polimerasa resultante se ligó en el plásmido pIRESPuro2 (Clontech, Palo Alto, CA) en seguida de la digestión del fragmento de la reacción en cadena de la polimerasa de PH20 con Nhel y BamHI. EJEMPLO 7 GENERACIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR QUE EXPRESA sHASEGP Las células CHO DG44 no transíectadas , creciendo en un medio CD-CHO modificado GIBCO para células con DHFR ( - ) , complementado con glutamina 4 mM y 18 mi de Pluronic F68/L (Gibco) , se sembraron a 0.5 x 106 células/ml en un matraz de agitación en preparación para la transfección . Las células se cultivaron a 37°C en una incubadora humidificada con C02 al 5 por ciento, a 120 revoluciones por minuto para la agitación. Se probó la viabilidad de las células CHO DG44 no transfectadas que crecían exponencialmente , antes de la transfección . 60,000,000 células viables del cultivo celular CHO DG44 no transfectado , se granularon y se volvieron a suspender hasta una densidad de 20,000,000 células en 0.7 mi de regulador de transfección 2x (2X HeBS = Hepes 40 mM, pH 7.0, NaCl 274 mM, KCl 10 mM, Na2HP04 1.4 mM, dextrosa 12 mM) . A cada alícuota de células resuspendidas , se le agregaron 0.09 mL del plásmido HZ24 lineal (250 pg) , y las soluciones de células/ADN se transfirieron a cubetas de electroporacion BTX con un hueco de 0.4 cm (Gentro-nics) , a temperatura ambiente. Se llevó a cabo una electroporacion de control negativo sin ADN del plásmido mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmido se electroporaron con una descarga del capacitor de 330 V y 960 µ?, o a 350 V y 960 µ?. Las células se removieron de las cubetas después de la electroporacion, y se transfirieron a 5 mi del medio CD-CHO modificado para las células con DHFR ( - ) , complementado con glutamina 4 mM, y 18 mi de Pluronic F68/L (Gibco) , y se les permitió crecer en un pozo de una placa de cultivo de tejido de seis pozos sin selección durante dos días a 37°C, en una incubadora humidificada con C02 al 5%. Dos días después de la electroporacion, se removieron 0.5 mL de medio de cultivo de tejido de cada pozo, y se probaron para determinar la presencia de actividad de hialuronidasa .
Actividad de hialuronidasa inicial de células CHO DG44 transfectadas con HZ24 a las 40 horas después de la transfección.
Las células de la transfección 2 (350V) se recolectaron del pozo de cultivo de tejido, se contaron, y se diluyeron hasta 10,000 a 20,000 células viables por mi. Se transfirió una alícuota de 0.1 mL de la suspensión celular a cada pozo de cinco placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pozos. Se agregaron 0.1 mL del medio CD-CHO (GIBCO) conteniendo Glutamax-1 4 mM, y sin complementos de hipoxantina y timidina a los pozos que contenían las células (volumen final de 0.2 mL) . Se identificaron 10 clones a partir de las 5 placas cultivadas sin metotrexato.
Placa/Pozo ID Actividad de Hialuronidasa Relativa 1C3 261 2C2 261 3D3 261 3E5 243 3C6 174 2G8 103 1B9 304 2D9 273 4D10 302 1E11 242 Al(+) control 333 H12(-) control 0 Se expandieron seis clones HZ24 en el cultivo, y se transfirieron a matraces de agitación como suspensiones de células individuales. Los clones 3D3 , 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, y 4D10 se aplicaron a placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pozos utilizando una estrategia de dilución infinita bidimensio-nal . Los clones diluidos se cultivaron en un fondo de 500 células CHO DG44 no transíectadas por pozo, para proporcionar los factores de crecimiento necesarios para los días iniciales en cultivo. Se hicieron 10 placas por cada subclon. El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales. Se midió una actividad de hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (> 50 Unidades/mL) , y estos 8 subclones se expandieron en matraces de cultivo de tejido T-25 en la presencia de metotrexato 50 nM. El clon 3D3 50 nM se expandió adicionalmen-te en metotrexato 500 nM, dando lugar a los clones que se produjeron en exceso de 1,000 Unidades/ml en matraces de agitación (clon 3D3 5M) . EJEMPLO 8 PRODUCCIÓN DE sHASEGP Un frasco de 3D3 5M se descongeló y se expandió a partir de matraces T a través de matraces centrífugos de 1L en CHO CDM (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) complementado con metotrexato 100 nM y glutamax (Invitrogen) . Las células se transfirieron desde los matraces centrífugos hasta un bio-reactor de 5L (Braun) a una densidad de inoculación de 4.0 x 10E5 células viables por mi. Los parámetros fueron el punto establecido de temperatura, 37°C, pH 7.2 (punto establecido de partida) , con el punto establecido de oxígeno disuelto del 25% en una sobrecapa de aire de 0-100 cm cúbicos/minuto. A las 168 horas, se agregaron 250 mi del Medio de Alimento #1 (CD CHO + 50 g/L de glucosa) . A las 216 horas, se agregaron 250 mi de Medio de Alimento #2 (CD CHO + 50 g/L de glucosa + butirato de sodio 10 mM) , y a las 264 horas, se agregaron 250 mi del Medio de Alimento #2. Este proceso dio como resultado una productividad final de 1,600 Unidades por mi, con una densidad celular máxima de 6,000,000 de células/ml. Se encontró que la adición de butirato de sodio mejora dramáticamente la producción de sHASEGP en las etapas finales de producción.
Crecimiento de 3D3-5M y producción de sHASEGP, bio-reactor de 5L.
EJEMPLO 9 PURIFICACIÓN DE sHASEGP El medio acondicionado a partir del clon 3D3 se aclaró mediante filtración profunda y diafiltración de flujo tangencial en Hepes 10 mM, pH 7.0. Luego se purificó la sHASEGP soluble mediante cromatografía en secuencia sobre intercambio de iones Q Sepharose (Pharmacia) , cromatografía de interacción hidrofóbica con fenil -Sepharose (Pharmacia), cromatografía con boronato de fenilo (Prometics) , y cromatografía con hidroxiapatita (Biorad, Richmond, California, Estados Unidos) . La sHASEGP se enlazó con Q Sepharose, y se extrajo en NaCl 400 mM en el mismo regulador. El extracto se diluyó con sulfato de amonio 2M hasta una concentración final de 500 mM AS04 , y se pasó a través de una columna de fenil-Sepharose (sub-baja), seguido por enlace bajo las mismas condiciones a una resina de boronato de fenilo. La sHASEGP se extrajo a partir de la resina de fenil -Sepharose en Hepes, pH 6.9, después de lavar a un pH 9.0 en bicina 50 mM sin AS04. El extracto se cargó sobre una resina de hidroxiapatita de cerámica a un pH 6.9 en P04 5 mM, CaCl2 lmM, y se extrajo con P04 80 mM a un pH de 7.4 con CaCl2 0.1 mM . La sHASEGP purificada resultante tuvo una actividad específica mayor de 65,000 Unidades USP/mg de proteína, por medio del ensayo de microturbidez , utilizando el estándar de referencia USP. La sHASEGP purificada se extrajo como el único pico de 24 a 26 minutos a partir de una columna de estireno/divinilbenceno Pharmacia 5RPC con un gradiente entre TFA al 0.1%/H2O, y TFA al 0.1%/acetonitrilo al 90%/H2O al 10%, y se resolvió como una sola banda ancha de 61 kDa mediante electroforesis en SDS , que se redujo hasta una banda aguda de 51 kDa después del tratamiento con PNGasa-F. La secuenciación de aminoácidos N-terminales reveló que el péptido líder se había removido de una manera eficiente. sHASEGP purificada bioquímicamente con la secuencia de aminoácidos N-terminal.
EJEMPLO 10 ANÁLISIS DE LA GLICOSILACION DE sHASEGP DERIVADA DE CHO DG44 Existen datos en conflicto sobre si las sHASEGPs de diferentes especies requieren de glicosilación para su actividad catalítica. Por ejemplo, se reporta que la hialuronidasa de veneno de abeja enzimáticamente activa se puede sintetizar en células que carezcan de maquinaria de glicosilación, es decir, tales como E. coli . Más aún, el tratamiento de hialuronidasa de testículos bovinos purificada con PNGasa no inactivo la actividad enzimática (Yamagata y colaboradores, 1997) . Otros estudios reportan la pérdida de actividad en seguida de la desglicosila-ción, y que adicionalmente se requieren enlaces de disulfuro. Sin embargo, debido a que todas las pruebas anteriores se hicieron utilizando preparaciones ya sea crudas o bien parcialmente purificadas, no fue aparente si la pérdida de actividad era un resultado de la exposición de la enzima desglicosilada a las proteasas contaminantes en las preparaciones crudas, o una relación funcional directa entre la glicosilación y la actividad catalítica. a. Protocolo Con el fin de determinar si la glicosilación N-enlazada funcional podría introducirse en la sHASEGP humana utilizando un sistema de expresión basado en CHO bajo condiciones exentas de proteína, se expresó un ADNc que codifica la sHASEGP humana-HIS6 en células CHO, utilizando un cartucho bicistrónico IRESpuro en un medio químicamente definido. Las células se cultivaron durante 72 horas en CHO CDM ( Invitrogen/Gibco) , seguido por concentración y diafiltración de flujo tangencial sobre una unidad Pellicon TFF (Millipore) con membranas cortadas a 30 kDa . El concentrado se intercambió con Hepes 10 mM, pH 7.4, NaCl 50 m . Luego se cargó el diafiltrado sobre una resina de Sepharose en línea con DEAE, y se extrajo con un gradiente de NaCl desde NaCl 0-1M sobre una resina Pharmacia FPLC. La sHASEGP humana se extrajo en NaCl entre 10-30%. Los niveles de sHASEGP en las fracciones de la columna determinaron que la mayor parte de la enzima se recuperaba en el gradiente de NaCl de 10-30%. La enzima a partir del gradiente de NaCl del 10-30% se purificó entonces adicionalmente a través de cromatografía por afinidad sobre una resina IMAC cargada con Ni. La sHASEGP humana se eluyó a partir de la resina IMAC después de lavarse con imidazol 10 mM, con acetato 50 mM, pH 5.0. La proteína se concentró y se dializó contra Hepes 10 mM, pH 7.4. Se determinó que la enzima altamente purificada posee una actividad específica de 97,000 Unidades/mg de proteína en la presencia de calcio 1 mM, y de 1 mg/ml de HSA en el ensayo de microtitulación de sustrato biotinilado basado en ELISA. Con el fin de detectar los cambios en la masa molecular relativa de la proteína, la sHASEGP humana purificada se trató con PNGasa o neuraminidasa durante la noche, seguido por electroforesis en gel, electrotransferencia , y análisis Western blot, con un anti-cuerpo monoclonal HRP-enlazado anti-HIS6 (Qiagen) y detección con ECL. b. Resultados El análisis Western blot determinó que la sHASEGP humana producida en células CHO era sensible al tratamiento con PNGasa. La masa molécula relativa de la sHASEGP humana reveló que la proteína estaba altamente glicosilada. Después de una digestión nocturna completa con PNGasa, la sHASEGP humana se redujo hasta una sola especie, confirmando que la ligera heterogeneidad de la banda no digerida se podría atribuir a los residuos de azúcar N-enlazados. La digestión parcial con PNGasaF mostró una serie de intermediarios que cambiaban desde un cambio no tratado y progresivo con el tratamiento más largo. Aunque las bandas eran un poco difusas sobre un gel al 7%, se pudieron visualizar cuando menos seis isoformas intermedias diferentes. El tratamiento de la sHASEGP con neuraminidasa reveló que las células CHO de hecho eran capaces de sintetizar sHASEGP humana sialada. Después del tratamiento con neuraminidasa y análisis Western blot de la sHASEGP sobre geles al 7%, la sHASEGP recombinante humana derivada de CHO reveló un cambio de aproxima- damente 1-3 kDa en la movilidad, comparándose con la sHASEGP no tratada. Por lo tanto, éste es el primer reporte de la generación de una sHASEGP humana sustancialmente sialada. Esto es muy valioso tanto por la estabilidad como para mejorar la vida media en suero de una sHASEGP humana debido a que la sHASEGP de esperma nativa de muchas especies carece de sialación, y no reacciona con las lectinas específicas de ácido siálico. Análisis FACE de la sHASEGP El análisis de los oligosacáridos de sHASEGP activos mediante análisis FACE permite hacer una determinación rápida de los perfiles de las sHASEGPs catalíticamente activas. Protocolo La hialuronidasa purificada a partir del clon 3D3 5M se evaluó utilizando FACE N-Linked Oligosaccharide Profiling (Perfilación de Oligosacárido N-enlazado) (Prozyme) . Los oligosacáridos se disociaron a partir de 128.7 ig de glicoproteí-nas mediante digestión enzimática con N-glicanasa (conocida como PNGasa) , se marcaron utilizando el fluoróforo ANTS, y se separaron mediante electroforesis . Las posiciones relativas de las bandas de oligosacárido se determinaron ejecutando la muestra y haciendo diluciones de la muestra junto con una escala estándar de oligosacárido que designó la distancia de migración en unidades de Grados de Polimerización (DP) . Resultados El Perfil-N para la muestra de hialuronidasa consiste en 10 bandas, de las cuales seis (ejecutándose de una manera concomitante con las bandas estándares de oligosacárido G5-G12) tuvieron intensidades mayores al 9%. Además, la banda que corre a lo largo del estándar G9 fue la más intensa, con intensidades del 35-46%. Análisis de oligosacárido sHASEGP EJEMPLO 11 DEPENDENCIA DE LA GLICOSILACION N-ENLAZADA DE LA sHASEGP PARA LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA a. Protocolo Las muestras de sHASEGP HIS6 purificadas se mezclaron con el regulador que contenía neuraminidasa y PNGasa, con y sin octilglucósido 50 mM durante la noche a 37°C. Se verificó que los oligosacáridos se removieron mediante cambio de gel a partir de un análisis Western blot . b. Resultados EJEMPLO 12 ACTIVIDAD DE LA SHASEGP HACIA LOS GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS Y NO SULFATADOS En adición al ensayo basado en microtitulación utilizando hialuronano , se puede probar la especificidad del sustrato de la sHASEGP hacia otros glicosaminoglicanos o proteoglicanos , utilizando un ensayo de cambio de gel con sustratos purificados para determinar la actividad de la sHASEGP hacia otros glicosaminoglicanos. Muchos ensayos de hialuronidasa se han basado en la medición de la generación de nuevos grupos N-acetilamino reductores (Bonner.y Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966) , o en la pérdida de viscosidad (De Salegui y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys . 121:548-554, 1967) o turbidez (Dorfman y Ott, J. Biol . Chem. 172:367, 1948) . Con los sustratos purificados, todos estos métodos son suficientes para la determinación de la presencia o ausencia de la actividad endoglucosamídica . a. Protocolo ENSAYO DE CALCIO DE GEL - Los sustratos purificados se mezclan con la sHASEGP recombinante para probar la actividad de endoglucosidasa que da lugar a la mayor movilidad en el sustrato dentro del gel . El sulfato de condroitina A, Aggrecan, y D fueron de Calbiochem. El hialuronano, sulfato de condroitina C (cordón umbilical humano) , sulfato de dermatano, y sulfato de heparano, se obtuvieron en Calbiochem. El hialuronano de cordón umbilical humano se obtuvo en ICN. Cada sustrato de prueba se diluye a 0.1 mg/ml . Se mezclan 10 µ? de muestras de sHASEGP purificada o medio acondicionado a partir de células que expresan sHASEGP, con 90 microlitros del sustrato de prueba en el regulador deseado, y se incuban durante 3 horas a 37°C. En seguida de la incubación, las muestras se neutralizan con regulador de muestras (Tris-EDTA, pH 8.0, azul de bromofenol, y glicerol), seguido por electroforesis en geles de poliacrilamida al 15%. Los glicosaminoglicanos se detectan tiñendo los geles en azul Alciano al 0.5% en ácido acético glacial al 3% durante la noche, seguido por desteñido en ácido acético glacial al 7%. La degradación se determina mediante la comparación de la movilidad del sustrato en la presencia y en ausencia de la enzima, b. Resultados 100 Unidades de sHASEGPHIS6 en 10 ul se incubaron con 90 ul de regulador Hepes 10 mM con 50 ug/ml de albúmina de suero humana durante 2 horas a 37°C, conteniendo 10 ug de diferentes glicosaminoglicanos y proteoglicanos . El análisis electroforético seguido por teñido con azul Alciano, revelo mayores cambios de movilidad para una sola especie en sulfato de condroitina A, C, y D, Aggrecan, y hialuronano, pero no en sulfato de heparano ni en sulfato de condroitina B. Aunque los glicosaminoglicanos no digeridos se ejecutaron como una mancha a la mitad del gel, los productos digeridos mostraron la mayor parte de la mancha azul Alciano corriendo en el frente del tinte con una pequeña cantidad de material corriendo como una escala creciente. EJEMPLO 13 EFECTOS DE LOS IONES DE METALES SOBRE LA ACTIVACIÓN DE sHASEGP Además al requerimiento de glicosilación para una actividad enzimática óptima, se encontró que la sHASEGP humana se activa con cationes para una actividad enzimática óptima. En el proceso de purificación, se encontró que la sHASEGP tiene una actividad específica baja en seguida de pasos de cromatografía sucesivos. Se encontró que la sHASEGP marcada con HIS6 tiene una actividad específica baja cuando se purifica hasta la homogeneidad a partir de DEAE, seguido por purificaciones sucesivas con Ni-IMAC. Debido a que las resinas IMAC pueden quelar los iones de metales, se agregaron diferentes metales de regreso a la sHASEGP para determinar la actividad enzimática relativa, a. Protocolo Se probó la sHASEGP purificada en seguida de la incubación con níquel 0.1 m (Ni), cobalto (Co) , zinc (Zn) , calcio (Ca) , y magnesio (Mg) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por la determinación de la actividad de hialuronidasa en un ensayo basado en microtitulación . b. Resultados Se encontró un incremento significativo en la actividad de hialuronidasa en seguida de la incubación de sHASEGP con calcio 0.1 mM o magnesio 0.1 mM. No se encontró esta activación en seguida de la incubación con otros metales. La adición de calcio a la sHASEGP aumentó la actividad específica de la enzima hasta aproximadamente 97,000 Unidades por mg de proteína, basándose en la medición de A280. Luego se probó una curva de respuesta a la dosis de los metales de calcio y magnesio para determinar la concentración óptima de los iones de metales para la enzima.
Metal divalente mM [Ca++] [Mg++] 100 1 1.3 10 108 104 1 169 164 0.1 123 78 0.01 59 18 0.001 47 13 0.0001 39 13 0.00001 55 15 Se encontró que se presenta la activación de sHASEGP en el intervalo micromolar . Las concentraciones mayores de 10 mM fueron inhibidoras tanto para el calcio como para el magnesio. Para descartar la activación no específica del sustrato en lugar de la enzima, se incubó cloruro de calcio en regulador Hepes 10 mM con el sustrato biotinilado inmovilizado sobre la placa de microtitulación, seguido por lavado. No se encontró activación cuando se agregó la enzima a la placa previamente incubada con calcio que había lavado. También se probó la activación sobre la sHASEGP nativa liberada con fosfolipasa C, que reveló una activación similar con calcio, descartando un artificio de la marca del epítope HIS6 en el término carboxilo. EJEMPLO 14 EFECTOS DE LA ALBÚMINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA sHASEGP Se encontró que la dilución de rHUPH20 recombinante y otras preparaciones de hialuronidasas derivadas de testículos de rastro, requerían de la albúmina en adición al calcio para una actividad óptima. a. Protocolo Se diluyó albúmina de suero humana (ICN) en regulador Hepes 10 mM con calcio, para determinar los efectos de la proteína albúmina sobre la actividad enzimática. Los ensayos enzimáticos con sHASEGP y las preparaciones comerciales se examinaron utilizando tanto CaCl2 1 mM como 1 mg/ml de albúmina de suero humana . b. Resultados Se encontró activación de la actividad de hialuronidasa en altas diluciones en la presencia de albúmina. No está claro si esta activación fue un resultado de impedir la desnaturalización, o si la albúmina afectó a la disponibilidad del sustrato. Por consiguiente, una formulación preferible de sHASEGP humana podría incluir albúmina y una sal de metal consistente ya sea en calcio o en magnesio. EJEMPLO 15 EXTENSIÓN DE ACTIVIDAD DE LA sHASEGP PURIFICADA JiV VIVO a. Protocolo La sHASEGP purificada en Hepes 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, Pluronic al 0.1%, se diluyó hasta 0.5 Unidades/ul en agua exenta de pirógeno con NaCl 0.15 M. Se hicieron una serie de diluciones en 20 ul finales de suero, para dar un total de 0.01, 0.05, 0.1 Unidades por inyección. Se agregaron 20 ul de solución de azul de tripano hasta un volumen final de 40 ul , y se inyectaron subcutáneamente en la piel lateral sobre cada lado de ratones Balb Nu/Nu que previamente se habían anestesiado intraperi tonealment e mediante administración de cetamina/xilazina . Las áreas de tinte se midieron en dos dimensiones con un microcalibre desde t=0 hasta t=45 minutos. El área se representó como mm cuadrados. Como un control, se incluyó HYAL1 humana recombinante que carece de actividad en neutro, pero que se secreta, b. Resultados EJEMPLO 16 CINÉTICA DE LA ACTIVIDAD DE DIFUSIÓN DE sHASEGP a. Protocolo La sHASEGPHIS6 purificada recombinante se separó en dos alícuotas. Una se calentó a 95°C durante 15 minutos en un termociclador con una tapa calentada. La otra permaneció a temperatura ambiente. La inactivación térmica de la actividad enzimática se verificó en el ensayo enzimático basado en microtitulación . Para el análisis cinético, se probó el material inactivado por calor contra el nativo. Se inyectaron subcutáneamente 4 Unidades de sHASEGP purificada o un material inactivado por calor equivalente, con tinte azul de tripano. Las áreas se probaron en diferentes puntos del tiempo hasta 15 minutos, b. Resultados EJEMPLO 17 RESTAURACIÓN DE LA BARRERA DÉRMICA ROTA POR LA sHASEGP a. Protocolo Con el fin de establecer el tiempo de regeneración de los poros abiertos con sHASEGP en seguida de la administración subcutánea, se inyectaron 2 Unidades de sHASEGP purificada o control de suero en dos sitios laterales opuestos subcutáneamente en animales en el t=0, seguido por inyección con azul de tripano en el mismo sitio a los 30 minutos, a los 60 minutos, y a las 24 horas. El área de difusión del tinte en el t=15 minutos después de la inyección, se registró para cada punto del tiempo, comparándose con el control . b. Resultados Los resultados demuestran que la barrera dérmica se reconstituye dentro de 24 horas de la administración de 2 Unidades de la enzima. EJEMPLO 18 DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE LOS CANALES ABIERTOS POR LA sHASEGP Se demostró que la sHASEGP humana abría canales en el espacio intersticial suficientes para permitir la difusión de una molécula pequeña, es decir, tinte azul de tripano. Sin embargo, se desconoce cuáles eran los límites superiores sobre el tamaño de las partículas que se podrían difundir en la presencia de sHASEGP. a. Protocolo Se utilizaron moléculas fluorescentes de diferentes tamaños para determinar el tamaño de los canales abiertos por la sHASEGP humana; se administraron dextranos fluoresceinados de un peso molecular promedio 4,400 y 2 millones de Da (Sigma) , así como perlas marcadas con fluoresceína de diámetros definidos de 20 nm a 500 nm (Molecular Probes) subcutáneamente, en un volumen de 40 ul , siguiendo la inyección de sHASEGP o de control de suero en los mismos sitios. El área del frente del tinte se midió entonces en dos dimensiones a los 15 minutos después de la inyección . b. Resultados Los resultados demostraron que las moléculas de aproximadamente 1 kDa (azul de tripano) a 50 nm de diámetro (perlas de látex) mostraron una mejor difusión en seguida de la administración de sHASEGP. Aunque la albúmina de suero bovino (66 kDa) mostró una cinética de difusión similar a la del azul de tripano, las perlas de látex de 50 nm requirieron de significativamente más tiempo para difundirse. Las perlas de 500 nm no mostraron difusión alguna hasta los 480 minutos.
EJEMPLO 19 PERFILES FARMACOCINETICOS EN SUERO DE LOS Anti-cuerpoS BIOTINILADOS EN SEGUIDA DE LA CO- INYECCIÓN SUBCUTÁNEA DE sHASEGP HUMANA a. Protocolo Se anestesiaron ratones Balb/C hembras con una mezcla de cetamina/xilazina . Luego los ratones se inyectaron subcutáneamente con 20 ul de una solución de 0.5 mg/ml de IgG de ratón biotinilada, con 20 ul ya sea de suero, o 20 ul de sHASEGP conteniendo 4 Unidades de actividad. b. Resultados Los resultados demuestran que la sHASEGP aumenta la cinética de la distribución en suero de las moléculas grandes en circulación. Cuando no se pudo detectar IgG biotinilada en el grupo de control a las 2 horas, eran aparentes 360 ng/ml a las 2 horas en el grupo de sHASEGP. EJEMPLO 20 EXTENSIÓN DE ACTIVIDAD DE MOLÉCULAS SUBCUTÁNEAMENTE INYECTADAS EN SEGUIDA DE INYECCIÓN INTRAVENOSA DE sHASEGP HUMANA a. Protocolo Se utilizaron cuatro sitios para la inyección de tinte por dosis de cada artículo de prueba y control de vehículo. La inyección de tinte fue 45 minutos después de la inyección intravenosa. Cada dosis del artículo de prueba o de control se inyectó intravenosamente en dos animales . La medición del área frontal de tinte después de 45 minutos de la administración de la enzima se calculó a los 2.5, 5, 10, y 15 minutos para cada dosis o control de vehículo, b. Resultados Los resultados demostraron que la sHASEGP altamente purificada estaba sistémicamente disponible para los tejidos distales después de su administración intravenosa. La extensión de actividad de la sHASEGP sistémicamente administrada era dependiente de la dosis, siendo una inyección de 10 Unidades indistinguible del control de vehículo.
Tipo Dosis IV Tiempo Área Promedio Desviación Minutos (mm2) Estándar PH20 1000 2.5 86.417 2.834193 PH20 1000 5 102.17 2.221146 PH20 1000 10 124.53 6.304944 PH20 1000 15 129.81 1.434319 PH20 300 2.5 59.137 7.218615 PH20 300 5 73.638 7.51197 PH20 300 10 87.092 8.686008 PH20 300 15 92.337 10.66466 PH20 100 2.5 56.308 7.741934 PH20 100 5 63.156 11.42052 PH20 100 10 76.519 16.18449 PH20 100 15 77.432 17.32264 PH20 30 2.5 50.534 10.64287 PH20 30 5 59.493 5.163971 PH20 30 10 68.102 11.00071 PH20 30 15 71.118 9.934212 PH20 10 2.5 36.4 3.807072 PH20 10 5 39.859 6.680932 PH20 10 10 45.649 4.44936 PH20 10 15 48.41 6.546835 Control 0 2.5 34.652 5.935037 Control 0 5 36.279 3.614544 Control 0 10 44.687 5.821216 Control 0 15 53.002 2.812439 EJEMPLO 21 USO ILUSTRATIVO DE PEGILACION PARA GENERAR sHASEGPs MODIFICADOS EXHIBIENDO FARMACOCINÉTICA MEJORADA Como un ejemplo ilustrativo del uso de PEGilacion para generar formas de sHASEGPs teniendo farmacocinética mejorada, tal como una vida media en suero incrementada, se unieron fracciones de polietileno glicol (PEG) lineales o ramificadas a una sHASEGP ejemplar, PH20 humana recombinante (rHuPH20) como se describe anteriormente .
Un número de diferentes grupos funcionalmente activados pueden usarse para unir fracciones de PEG a sHASEGPs tales como rHuPH20 (incluyendo, a manera de ilustración, aldehidos, succinimidas , maleimidas y otros) . Un número de diferentes reactivos de PEGilación que están comercialmente disponibles a partir de varias fuentes incluyendo Nektar Therapeutics (www.nek-tar.com) así como un número de otros proveedores (www . pharma . -dow.com, www.nof.co.jp, www.sunbio.com, www.celares.com). Para propósitos de ilustración, rHuPH20 ha sido efectivamente PEGilada como se describe en la presente usando un número de reactivos PEG ilustrativos para generar un número de diferentes enzimas rHuPH20 PEGiladas. Metodologías análogas también han sido aplicadas a otras enzimas de hialuronidasa , incluyendo una hialuronidasa derivada de animales ilustrativa (usando una preparación de hialuronidasa testicular ovina disponible como Vitrase de ISTA Pharmaceuticals) , una hialuronidasa derivada de bacterias ilustrativas (usando una preparación de hialuronidasa bacteriana disponible como Hyaluronate Lyase de Sigma) , y una condroitinasa derivada de bacterias teniendo actividad de hialuronidasa (usando una preparación de condroitinasa de bacterias ABC disponible como Chrondroitinase ABC de Associates of Cape Cod, Inc . /Seikagaku Corporation) . Además de variar el grupo funcional, PEGs de una variedad de diferentes longitudes y estructuras están disponibles los cuales se incorporan usando un grupo funcional particular.
Para propósitos de ilustración, longitudes de PEG variando de 5 a 60 kDa (v.gr., 5, 10, 20, 30, 40 y 60 kDa) han sido conjugados a rHuPH20. De nuevo una variedad de diferentes PEGs teniendo diferentes longitudes y estructuras están fácilmente disponibles a partir de fuentes incluyendo Nektar, The Dow Chemical Corporation (Dowpharma) , NOF Corporation, Sunbio, Celares y otros. Un gran número de referencias se conocen en la materia a reactivos PEG y métodos para PEGilar proteínas, incluyendo un número de revistas y artículos citados en la presente; ver, v.gr., Roberts, MJ y colaboradores, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris JM y Zalipsky, S. (editores) de "Poly (ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680 (1997); Mehvar, R., y colaboradores J. Pharm. Pharmaceut. Sci . , 3(1): 125-136 (2000); Harris, JM, Nature Reviews 2:215 y seq. (2003); Tsubery, H., J. Biol . Chem. 279 (37) : 38118-24 (2004) ; y se describen adicionalmente en un número de referencias describiendo PEGilación y varios reactivos y metodologías (ver, v.gr., Monfardini, C, y colaboradores, Bioconjugate Chem. 6:62-69 (1995); Veronese FM et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207 (1997); y una variedad de patentes US y otras publicadas y solicitudes incluyendo US 5,672,662; US 5,932,462; US 6,495,659; y US 6,737,505; así como las patentes US 4,002,531; 4,179,337; 5,122,614; 5,183,550; 5,324,844; 5,446,090; 5,612,460; 5,643,575; 5,766,581; 5,795,569; 5,808,096; 5,900,461; 5,919,455; 5,985,263; 5,990,237; 6,113,906; 6,214,966; 6,258,351; 6,340,742; 6,413,507; 6,420,339; 6,437,025; 6,448,369; 6,461,802; 6,828,401; 6,858,736; las solicitudes de patente US publicadas 20010021763; 20010044526; 20010046481; 20020052430; 20020072573; 20020156047; 20030114647; 20030143596; 20030158333; 20030220447; 20040013637; 2005000360; 20050114037; 20050171328 y 20050209416; y las publicaciones europeas EP 01064951; y EP0822199; y las publicaciones PCT WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; y WO 0187925 (cada una de las cuales publicaciones se incorpora en la presente por referencia) . EJEMPLO 21-A VERSIONES PEGILADAS ILUSTRATIVAS DE HIALURONIDASAS RECOMBINANTES HUMANAS Como una ilustración ejemplar de la PEGilación de una sHASEGP ilustrativa, PEG aldehidos, succinimidas y carbonatos han sido cada uno aplicados a fracciones de PEG conjugadas con rHuPH20. De estas tres químicas, succinimidil PEGs típicamente han sido los mas convenientes para usar en el caso de rHuPH20. Por ejemplo, rHuPH20 ha sido conjugada con reactivos de succinimidil monoPEG (mPEG) ejemplares incluyendo Succinimidil Propiona-tos de mPEG (mPEG-SPA) , Succinimidil Butanoatos de mPEG (mPEG-SBA) , y (para unir PEGs "ramificados") N-hidroxisuccinimida mPEG2. Estos succinimidil ésteres PEGilados contienen esqueletos de carbonos de diferentes longitudes entre el grupo PEG y el reticulador activado, y ya sea un grupo PEG sencillo o ramificado. Estas diferencias se pueden usar, por ejemplo, para propor- cionar diferentes cinéticas de reacción y para potencialmente restringir sitios disponibles para unión de PEG a rHuPH20 durante el proceso de conjugación. Succinimidil PEGs (como anteriormente) comprendiendo PEGs ya sea lineales o ramificados han sido conjugados a rHuPH20. Usando composiciones y técnicas como se describe en la materia, succinimidil PEGs han sido usados para generar rHuPH20s de manera reproducible comprendiendo una combinación de moléculas teniendo entre alrededor de tres a seis moléculas de PEG por sHASEGP. Tales composiciones de rHuPH20 PEGiladas fueron fácilmente purificadas para producir composiciones teniendo actividades específicas de aproximadamente 25,000 Unidades/mg de actividad de hialuronidasa de proteína, y estando sustancialmente libres de rHuPH20 no PEGilada (menos de 5% no PEGilada) . Como se conoce en la materia, y se describe por ejemplo en referencias de PEGila-ción incluyendo aquellas mencionadas anteriormente, una variedad de reactivos y técnicas también están disponibles para lograr productos de PEG mono-dispersos a diferencia de poli-dispersos (ver, v.gr., las revisiones y referencias citadas en la descripción detallada anteriormente ¦ relacionadas con monoPEGilación específica de sitio y PEGilación dirigida en sitio) . Mejoras en tanto farmacocinética y farmacodinámica han sido observadas en modelos animales siguiendo a la administración de una sHASEGP PEGilada según se compara con la versión no modificada de sHASEGP. Por ejemplo, siguiendo administración intravenosa a ratones de ya sea 1,000 Unidades de una rHuPH20 no modificada o 1,000 Unidades de rHuPH20 conjugada a PEGs teniendo un peso molecular de aproximadamente 40 kDa (rHuPH20-PEG40) , se observó que la vida media en suero de actividad de hialuronidasa activa neutra (PH20) en suero de ratones tratados con rHuPH20-PEG40 fue significativamente mas larga (16-20 veces) que aquella de ratones tratados con rHuPH20 no modificada. Además, la efectividad de rHuPH20-PEG40 se ha comparado con rHuPH20 no PEGilada en un modelo de apoplejía de rata. Resultados iniciales a partir de estos estudios demuestran mayor efectividad de rHuPH20-PEG40 (mayor que 75-85% de supervivencia, contra menos de 50% en controles) en supervivencia de ratas 7 días posteriores a la inducción del infarto. Usando varios reactivos de PEG como los disponibles de Nektar, se han preparado versiones ejemplares de hialuronidasas recombinantes humanas (enzimas particularmente preferidas con base en rHuPH20) usando mPEG-SBA (30 kD) , mPEG-SMB (30 kD) , y veriones ramificadas con base en mPEG 2-NHS (40 kD) , mPEG2 -NHS (60 kD) . Estos reactivos y numerosos otros están disponibles en varios pesos moleculares (ver, v.gr., el Catálogo de Productos Nektar 2005-06 el cual está disponible en línea en http://www.nektar.com o en http://www.nektar.com/pdf/nektar_ca-talog.pdf, referencias en las mismas, los cuales catálogo y referencias se incorporan en la presente por referencia) . Un número de otros reactivos de PEG y metodologías están disponibles a partir de otros proveedores y/o se describen en la materia. A manera de ilustración, versiones PEGiladas de rHuPH20 han sido generadas usando químicas de NHS, así como carbonatos, y aldehidos, usando cada uno de los siguientes reactivos disponibles de Nektar: mPEG2-NHS-40K ramificado (Nektar #2z3y0t01) ; mPEG-NHS-10K ramificado (Nektar #2 z3xOLol - 10 ) ; mPEG-NHS-20K ramificado (Nektar #2z3xOLol-20) ; mPEG-NHS-40K ramificado (Nektar #2z3xOLo 1-40) ; mPEG2 -NHS- 60K ramificado (Nektar #2z3y0v01) ; mPEG-SBA-5K (Nektar #2m450h01) ; mPEG-SBA-20K (Nektar #2M450p01) ; mPEG-SBA-30K (Nektar #2M450r01) ; mPEG-SMB-20K (Nektar #2m4k0p01) ; mPEG-SMB-30K (Nektar #2m4k0r01) ; mPEG-butiraldehído-30K (Nektar #072M0R01) ; mPEG-SPA-20K (Nektar #2m4m0p01) ; mPEG-SPA-30K (Nektar #2m4m0r01) ; y PEG-NHS-5K-biotina (Nektar #0H4M0H02) . También se han generado versiones PEGiladas de hialuronidasas (v.gr., rHuPH20) usando reactivos PEG disponibles de Dowpharma, una división de Dow Chemical Corporation; incluyendo hialuronidasas PEGiladas con p-nitrofenil -carbonato PEG (30 kDa) de Dowpharma y con propionaldehído PEG (30 kDa) . Los reactivos de Nektar y Dowpharma y sus productos resultantes se usaron y se probaron esencialmente como se describe mas adelante para generar una gran variedad de composiciones de hialuronidasa PEGiladas. Otros reactivos, y otras hialuronidasas, pueden hacerse reaccionar de manera similar usando técnicas análogas. Para generar versiones PEGiladas de rHuPH20, enzima purificada (a una concentración de entre alrededor de 1 a 14 mg/ml) se mezcló con un exceso molar de cada reactivo PEG (generalmente en alrededor de un exceso molar 10:1 de PEG ¡enzima) , a pH y otras condiciones como se recomienda para cada uno de los reactivos o químicas de PEG (generalmente reacciones de aldehido se llevaron a cabo a alrededor de pH 4.5, reacciones de NHS a pH neutro y reacciones de carbonato a alrededor de pH 9.5) . Los componentes de reacción se hicieron reaccionar con mezclado por aproximadamente 16 horas a 4°C. SDS-PAGE se usó para examinar inicialmente los productos de reacción. La rHuPH20 generalmente no modificada se observó migrando como una sola banda de aproximadamente 63 kDa de peso molecular. Las varias versiones PEGiladas de rHuPH20 generalmente comprendieron una banda en el rango de alrededor de 150-200 kDa (típicamente alrededor de 180 kDa) así como varias bandas de mas de 200 kDa. Luego se llevó a cabo filtración con gel de los productos de enzima modificada seguido por actividad de enzima de proteínas fraccionadas. Brevemente, siguiendo a técnicas como se conoce en la materia, separaciones de hialuronidasas modificadas con PEG a partir de sus formas no modificadas nativas respectivas, se llevaron a cabo por cromatografía de filtración de gel, usando una columna de Superóse 6 (GE/Pharmacia) . Solución salina regulada con fosfato se usó como la fase móvil para las separaciones, con una tasa de flujo de 0.2 mL/minuto. La columna se calibró usando Estándares de Calibración de Filtración de Gel de GE/Pharmacia . Fracciones conteniendo enzimas que degradan hialuronano separadas se evaluaron para actividad de hialuronidasa relativa por un ensayo de Turbidez USP modificado, llevado a cabo en un formato de microtitulación . El volumen de retención pico (tiempo) para actividad de enzima de hialuronidasa rHuPH20 fraccionando a través de una columna de filtración con gel Superóse 6, cambió de alrededor de 16 mL (aproximadamente 60 a 80 kD de peso molecular aparente) para la hialuronidasa no modificada, a alrededor de 10 mL (mas de 100,000 kD a aproximadamente 670,000 kD de peso molecular aparente) para la hialuronidasa modificada con PEG. La modificación con PEG puede, aparentemente, cambiar por completo toda la actividad de enzima mesurable a las formas modificadas de mayor peso molecular, cuando el PEG en exceso molar se hace reaccionar con la enzima. Se examinó la actividad enzimática de varias enzimas nativas y modificadas usando zimografía (análisis de actividad de degradación de glicosaminoglicano por electroforesis de gel de sustrato) . Brevemente, geles dé zimograma de SDS-PAGE conteniendo hialuronano se forjaron y análisis se llevaron a cabo esencialmente de acuerdo con el procedimiento previamente descrito por Miura, RO y colaboradores, Analysis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel electrophoresis (zymography) , Anal. Biochem. , 1 de marzo de 1995; 225 (2) : 333-40. Hialuronidasa rHuPH20 nativa demostró la actividad de degradación de hialuronano en geles de zimograma como una sola banda con un peso molecular aparente de aproximadamente 60 kDa . Modificaciones con PEG de hialuronidasa rHuPH20 resultaron en un cambio en la actividad de degradación de hialuronano en geles de zimograma con señales enzimáticamente activas en aproximadamente 180 kDa, y con por lo menos 2 bandas adicionales teniendo actividad de enzimas con masas moleculares mayores que 200 kDa. Estos resultados y otros descritos en la presente demuestran que las glicosaminoglicanasas pueden ser efectivamente modificadas por PEGilación (la cual se puede usar para alterar sus perfiles farmacocinéticos y/u otros usando cualquiera de una amplia variedad de reactivos de PEG, y que las enzimas resultantes pueden retener actividad enzimática sustancial haciéndolas útiles en cualquiera de una variedad de diferentes aplicaciones -particularmente aplicaciones in vivo u otras en las cuales modificar la enzima para extender su vida media puede ser útil. EJEMPLO 21-B VERSIONES PEGILADAS ILUSTRATIVAS DE HIALURONIDASAS NO HUMANAS Aunque las hilauronidasas recombinantes humanas son particularmente preferidas para aplicaciones en las cuales la enzima está siendo usada en asociación con células humanas, y aun mas particularmente cuando se está aplicando a o dentro del cuerpo humano, las técnicas ilustradas en la presente también se pueden emplear para generar versiones farmacocinéticamente mejoradas de otras enzimas de hialuronidasa que pueden tener aplicación adecuada en ciertos contextos o ambientes. Por consiguiente , mediante aplicar metodologías según se ilustra en la presente y se describe en la materia a otras enzimas de hialuronidasa , se ha generado un número de enzimas modificadas que son PEGiladas (las cuales se pueden usar para mejorar su farmacocinética como se ilustra anteriormente) y aun retengan actividad enzimática sustancial. Para propósitos de ilustración, metodologías como se describen e ilustran en la presente han sido aplicadas a una serie de diferentes enzimas de hialuronidasa "no humana" , incluyendo una hialuronidasa derivada de animales ilustrativa, una hialuronidasa derivada de bacterias ilustrativa, y una condrotitinasa derivada de bacterias ilustrativa teniendo actividad de hialuronidasa. Versiones PEGiladas de tales hialuronidasas no humanas, como se describe en la presente, pueden usarse para proporcionar de manera efectiva vidas medias extendidas (tal como siguiendo administración intravenosa u otra in vivo) . Como un ejemplo ilustrativo de una hialuronidasa derivada de animales no humana, se han generado versiones PEGiladas de hialuronidasa testicular ovina (disponible como Vitrase de ISTA Pharmaceuticals) . Vitrase (hialuronidasa por inyección, liofilizada, ovina NDC 67425-001-01, 6,200 Unidades USP/frasco) , adquirida de ISTA Pharmaceuticals, fue un obsequio de un oftalmólogo. Las soluciones de Vitrase se prepararon mediante reconstituir la Vitrase liofilizada con Inyección de Cloruro de Sodio al 0.9% USP (Baxter) .
Como un ejemplo ilustrativo de una hialuronidasa derivada de bacterias no humana, se han generado versiones PEGiladas de hialuronidasa de bacterias disponible como Hyaluro-nate Lyase de Sigma. Hyaluronate Lyase de Streptomyces hyaluroly-ticus u otras especies, número CAS 9001-54-1, número EC 4.2.2.1) (674 unidades/frasco) se adquirió de Sigma. Hyaluronate Lyase se reconstituyó con solución salina regulada con fosfato filtrada estéril. Ver, v.gr. , Ohya, T., y Kaneko, Y., Bíochem. Biophys . Acta 198, 607 (1970) . Como un ejemplo ilustrativo de una condroitinasa no humana teniendo actividad de hialuronidasa, se han generado versiones PEGiladas de controitinasa ABC de bacterias (disponible como Chondroitinase ABC de Associates of Cape Cod, Inc. Seikagaku Corporation) . Chondroitinase ABC de Proteus vulgaris (Chondoritin ABC lyase, Chondroitin ABC eliminase, Número EC : 4.2.2.4, número CAS: 9024-13-9, cat . # 100330 ó 10033) se adquirió de Associates of Cape Cod Inc. Soluciones de Chondroitinase ABC se prepararon en solución de BSA al 0.1%. Referencias incluyen: (1) Yamagata, T., y colaboradores, J". Biol . Chem. , 243, 1523 (1968); (2) Saito, H., y colaboradores, J. Biol. Chem., 243, 1536 (1968); (3) Suzuki, S., y colaboradores, J". Biol. Chem., 243, 1543 (1968); y (4) Oike, Y., y colaboradores, J". Biol. Chem., 257, 9751 (1982). Como un reactivo de PEG ilustrativo, se usó un Succinimidil Butanoato de mPEG (disponible como mPEG-SBA (30 kD) de Nektar) . Aunque mPEG-SBA-30K (N-hidroxisuccinimidil éster de metoxi poli (etileno glicol) -ácido butanoico, peso molecular promedio 30,000, Cat # 2M450R01) , se usó para este ejemplo, otro N-hidroxisuccinimidil éster de metoxi poli (etileno glicol) de cualquier peso molecular o N-hidroxisuccinimidil ésteres de poli (etileno glicol) de cualquier peso molecular, o PEG-aldehídos de cualquier tamaño, o PEG-carbonatos de cualquier tamaño, u otros reactivos de PEG de Nektar, u otros reactivos de PEGilación también se pueden usar. Ver, v.gr., Zalipsky, S. y C. Lee, "Poly (ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications", J. M. Harris, editor, Plenum, Nueva York, Estados Unidos, 1992, cf. capítulo 21. Para la generación de versiones PEGiladas ejemplares de hialuronidasas derivadas de animales, un frasco de hialuronidasa testicular ovina (Vitrase) se reconstituyó con 0.62 mL de solución salina al 0.9% (10 unidades/microlitro) , y 0.3 mL de la solución de enzima reconstituida se transfirió a un tubo estéril. El reactivo de PEG ejemplar, mPEG-SBA-30K (9.9 mg) se añadió al tubo conteniendo la solución de Vitrase, el tubo se mezcló hasta que todo el mPEG pareció entrar en solución, y luego la mezcla se hizo reaccionar por aproximadamente 16 horas a 4°C, con mezclado. Para la generación de versiones PEGiladas ejemplares de hialuronidasas derivadas de bacterias, una ámpula de Sigma Hyaluronate Lyase se reconstituyó con 0.7 mL de solución salina regulada con fosfato filtrada estéril (~1 unidad/microl itro) , y 0.3 mL de solución de enzima reconstituida se transfirió a un tubo estéril. El reactivo de PEG ejemplar, mPEG-SBA-30K (9.8 mg) , se añadió al tubo conteniendo la solución de Hyaluronate Lyase, el tubo se mezcló entonces hasta que todo el mPEG pareció estar en solución, y la mezcla se hizo reaccionar por aproximadamente 16 horas a 4°C, con mezclado. Para la generación de versiones PEGiladas ejemplares de condroitinasa derivada de bacterias teniendo actividad de hialuronidasa , un frasco de Chondroitinase ABC (10 Unidades) se reconstituyó con 0.2 mL de solución salina al 0.9%, y el reactivo de PEG ejemplar, mPEG-SBA-30K (12.4 mg) , se añadió al frasco conteniendo solución de Chondroitinase ABC, y se mezcló hasta que todo el mPEG pareció estar en solución, y la mezcla se hizo reaccionar por aproximadamente 11 horas a 4°C, con mezclado. Análisis iniciales incluyeron la aplicación de SDS-PAGE para examinar las enzimas modificadas comparadas con controles no modificados. Brevemente, la proteína total se visualizó con manchado con ya sea azul de Comassie o plata después de separación a través de geles NuPage Tris/Acetato a de 3 a 8% (Invitro-gen) . Pesos moleculares de bandas manchadas se determinaron por comparación con proteínas estándar de corrida de masa conocida en el mismo gel . Los resultados con Vitrase fueron como sigue: (A) Vitrase (sin modificar) , 5 bandas de aproximadamente los siguientes pesos moleculares (kDa) : 90, 80, 63, 50 y 40; (B) PEG-Vitrase, 7 bandas de aproximadamente los siguientes pesos moleculares (kDa) : 150, 180 y cinco bandas de mas de 200. Resultados con Chondroitinase ABC fueron como sigue: (A) Chondroitinase ABC (sin modificar) , 6 bandas de aproximadamente los siguientes pesos moleculares (kDa) : 100, 80, 50, 38, 33 y 30; (B) PEG-Chondroitinase ABC, 8 o mas bandas de aproximadamente los siguientes pesos moleculares (kDa) : una a dos bandas entre 150-200 y seis o mas bandas de mas de 200. Los resultados con Hyaluronate Lyase fueron como sigue: (A) Hyaluronate Lyase (sin modificar) , una banda de aproximadamente el siguiente peso molecular (kDa) : 35; (B) PEG-Hyaluronate Lyase, cuatro o mas bandas de aproximadamente los siguientes pesos moleculares (kDa) : mas de 200. Como se demuestra, polietileno glicol activado (v.gr.: mPEG-SBA-30K (N-hidroxisuccinimidil éster de metoxi poli (etileno glicol) ácido butanoico, peso molecular promedio 30,000), puede aplicarse a hialuronidasa ovina (v.gr., Vitrase) , Chondroitinase ABCs bacterianas (v.gr., de Proteus vulgaris) , o Hyaluronate Lyases bacterianas (v.gr., de Stre omyces hyalurolyticus) , para inducir cambios químicos en las preparaciones de enzima que producen nuevas moléculas de masa molecular promedio incrementada, como será asociado con la generación de versiones PEGiladas de estas enzimas. Caracterización adicional de estos productos proporcionó evidencia adicional de que las enzimas pueden no solamente ser efectivamente PEGiladas pero que los productos de enzima resultantes pueden exhibir actividad enzimática sustancial en la degradación de hialuronano - demostrando que PEGilación puede aplicarse a estos varios tipos de enzimas (las cuales se pueden usar para alterar sus perfiles farmacocinéticos mientras que al mismo tiempo retienen actividad enzimática sustancial) . Luego se llevó a cabo filtración con gel de los productos de enzima modificados seguido por actividad de enzima de proteínas fraccionadas. Brevemente, siguiendo técnicas conocidas en la materia, separaciones de hialuronidasas modifi-cads con PEG a partir de sus formas no modificadas nativas respectivas, se llevaron a cabo por cromatografía de filtración de gel, usando una columna de Superóse 6 (GE/Pharmacia) . Solución salina regulada con fosfato se usó como una fase móvil para las separaciones, con una tasa de flujo de 0.2 mL/minuto . La columna se calibró usando Estándares de Calibración de Filtración de Gel de GE/Pharmacia . Fracciones conteniendo enzimas que degradan hialuronano separadas se evaluaron para actividad de hialuronida-sa relativa por un ensayo de Turbidez USP modificado, llevado a cabo en un formato de micro-titulación . El pH y amortiguador usados para evaluar la actividad de cada una de las enzimas que degradan hialuronano probadas, fue según se describe en la literatura, para cada enzima específica. El volumen de retención pico (tiempo) para actividad de enzima hialuronidasa ovina (v.gr., Vitrase) fraccionando a través de una columna de filtración de gel de Superóse 6, cambió de 15.5 mL (aproximadamente 60 a 80 kD de peso molecular aparente) para la hialuronidasa ovina nativa, a 9.5 mL (mas de 100,000 kD a aproximadamente 670,000 kD de peso molecular aparente) para la hialuronidasa ovina modificada con PEG. La modificación con PEG puede, aparentemente, completamente cambiar toda la actividad de enzima mesurable a formas modificadas de mayor peso molecular, cuando PEG molar en exceso se hace reaccionar con la enzima ovina . El volumen de retención pico (tiempo) para actividad de enzima de Hyaluronate Lyase bacteriana nativa fue aproximadamente 16 mL (aproximadamente 50 a 70 kD de peso molecular aparente) después de la inyección. Hyaluronate Lyase PEG-modificada fraccionada por filtración con gel no demostró actividad de enzimas en cualquier fracción. La carencia de actividad de enzimas mesurable incluyó fracciones donde la actividad de Hyaluronate Lyase es normalmente mesurable, sugiriendo que la modificación con PEG afectó negativamente la función de enzimas. Chondroitinase ABC modificada con PEG demostró actividad de enzima pico a aproximadamente 11 y 13 mL después de inyección (aproximadamente entre 200 y 600 kD de peso molecular aparente) , y de nuevo en aproximadamente 16 mL después de inyección (aproximadamente 50 a 70 kD de peso molecular aparente) . Chondroitinase ABC nativa tiene actividad de enzimas en solamente aproximadamente 16 mL después de inyección. Estos datos sugieren que la Chondroitinase ABC fue modificada con PEG, con mantenimiento de la actividad enzimática tan alto como las moléculas de masa molecular nativas. La filtración de gel se puede usar para estimar el grado de modificación con PEG en enzimas que degradan hialuronano; y análisis de actividad enzimática de preparaciones fraccionadas se puede usar para evaluar el efecto que la modificación con PEG tiene en la actividad enzimática de las enzimas que degradan con hialuronano, con respecto a actividad total y la masa molecular de constituyentes demostrando actividad de enzima. Luego se examinó la actividad enzimática de varias enzimas nativas y modificadas usando zimografía (análisis de actividad de degradación de glicosaminoglicano por electroforesis de sustrato de gel) . Brevemente, geles de zimograma de SDS-PAGE conteniendo hialuronano se forjaron y análisis se llevaron a cabo esencialmente de acuerdo con los procedimientos previamente descritos por Miura, R.O., y colaboradores, Analysis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel elecrophore-sis (zymography) Anal. Biochem. 1 de marzo de 1995; 225(2) :333-40. Hialuronidasa de ovinos nativa demuestra actividad que degrada hialuronano en geles de zimograma identificando principalmente dos bandas de actividad en aproximadamente 60 kD y 90 kD con algún toque de actividad de enzima entre esos pesos moleculares. Ninguna actividad de enzimas se demuestra mayor que 100 kD. La modificación con PEG de hialuronidasa ovina demuestra un cambio en la actividad de degradación de hialuronano en geles de zimograma con señales enzimáticamente activas en aproximadamente 150 kD, y con por lo menos 2 bandas adicionales teniendo actividad de enzimas con masas moleculares mayores que 200 kD . Chondroitinase ABC nativa demostró una sola banda de actividad de degradación de hialuronano en geles de zimograma, demostrando una masa molecular de aproximadamente 80 a 90 kD . Modificación con PEG de Chondroitinase ABC demuestra un cambio en la actividad de degradación de hialuronano en geles de zimograma con señales enzimáticamente activas en aproximadamente 180 kD, y con por lo menos una banda de actividad adicional con una masa molecular mayor que 200 kD . El análisis de zimografía así confirmó que una hialuronidasa derivada de animales ejemplar (Vitrase) y una condroitinasa derivada de bacterias ejemplar teniendo actividad de hialuronidasa (Chondroitinase ABC) puede modificarse por PEGilación (la cual se puede usar para alterar su perfil farmacocinético como se ilustra anteriormente con respecto a hialuronidasa humana recombinante) y que las enzimas modificadas resultantes pueden aun exhibir actividad enzimática sustancial . Como se apreciará por los técnicos en la materia en vista de los ejemplos anteriores, otras hialuronidasas (tanto humanas y otras versiones recombinantes como se describen en la presente, así como otras hialuronidasas no humanas animales o bacterianas, procarióticas u otras, así como condroitinasas) pueden de la misma manera modificarse usando cualquiera de una variedad de reactivos PEG como se conoce en la materia o recién se descubre, para generar enzimas modificadas teniendo perfiles farmacocinéticos y/u otros alterados que los hacen mas útiles para aplicaciones particulares. EJEMPLO 22 USO ILUSTRATIVO DE UNA sHASEGP PARA PROMOVER EXTENSIÓN DE UN AGENTE FARMACOLÓGICO DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS IN VIVO Como un ejemplo ilustrativo del uso de composiciones de sHASEGP de la presente invención para promover extensión o difusión de agentes farmacológicos hacia y dentro de órganos y tejidos en un mamífero, se evaluó el uso de rHuPH20 para promover penetración de dexametasona ( "dex" , un agente anti - inflamatorio usado como un farmacológico de moléculas pequeñas ejemplar) hacia tejidos del ojo del mamífero in vivo. Para inyección de agentes tales como anestésicos al ojo del mamífero, rutas peri -orbitales comúnmente usadas para lograr bloques anestésicos incluyen inyecciones peri-bulbar, retro-bulbar y sub-Tenón. Para este ejemplo ilustrativo, se compararon las inyecciones sub-Tenón de dex, con o sin administración concomitante de sHASEGP, dentro del espacio episcleral, y luego se examinaron las concentraciones de dex dentro de tejidos del posterior del ojo, particularmente las capas de coroideo y retina, las cuales son objetivos de fármaco importantes pero son frecuentemente difíciles para eficientemente alcanzar con agentes farmacológicos .
Conejos machos rojos de Nueva Zelanda (aproximadamente 2.1 a 3.2 kg) se emplearon y se colocaron bajo anestesia general usando inyecciones intramusculares de hidrocloruro de cetamina (21 mg/kg) e hidrocloruro de xilazina (5.25 mg/kg) . Proparacaína tópica al 0.5% se usó para anestesiar la superficie ocular. Las pupilas se dilataron con tropicamida al 1% y fenilefrina al 2.5%. Después de abrir las conjuntivas del ojo derecho de cada conejo usando tijeras de Vannas, la punta de una cánula anestésica de tres puertos Medez (Eagle Laboratories, Rancho Cucamonga, California, Estados Unidos) se insertó dentro del espacio episcleral y 1.5 mi de ya sea dex sola (American Pharmaceutical Partners, n=18) o dex mas sHASEGP (3,000 unidades de rHuPH20, n=18) se inyectaron adyacentes al polo posterior del ojo. Un aplicador de punta de algodón se colocó en el sitio de entrada conjuntival para prevenir egreso del fluido. A l, 2, 3 o 6 horas después de la inyección, conejos se anestesiaron como se describe anteriormente y se sacrificaron por inyección intracardiaca de pentobarbital sódico (120 mg/kg) . Siguiendo la eutanasia, 1 mi de muestra de sangre se tomó y ambos ojos fueron enucleados de cada animal. Inmediatamente después de la enucleación, una muestra de 2 mi de humor acuoso se recolectó mediante la paracentesis de cámara anterior con jeringa de tuberculina de cada ojo. Después de la remoción del segmento anterior de los ojos enucleados, 1 mi de muestra vitrea se retiró y se colocó en tubos Eppendorf marcados. El resto del ojo se disectó y 6 mm de trefina (Fine Science Tools, Foster City, California, Estados Unidos) se usó para golpear la muestra de tejido inferior al nervio óptico donde fármaco se inyectó en el lado extra-escleral. A partir del tejido golpeado se raspó la retina con una hoja desafilada y se colocó dentro del tubo marcado así como el coroideo. Espectrometría de masas se usó para evaluar los niveles de dex en tejidos con los límites cuantificables mínimos estando en el orden de 5 ng/ml . Para las muestras de coroideo y de retina, un regulador conteniendo base de Tris 50 mM, MgCl2 1 mM, pH 9.0, se añadió al tejido tal que la concentración final fuera 20 mg/mL . El tejido se descontinuó usando un homogeneizador ultrasónico (BioLogics, Inc., modelo 150 V/T) por 5-15 segundos. Las muestras de tejido homogeñeizado, el fluido vitreo, fluido acuoso, y plasma todas se analizaron por el siguiente procedimiento. Muestras conteniendo dexametasona y prednisolona como el estándar interno (I.S.) se extrajeron con metil -t-butil éter por mezclado con vórtice por cinco minutos. Las capas orgánicas y acuosa se separaron por centrifugación a 1,300 g por cinco minutos, la capa acuosa se congeló a -70°C por quince minutos, y la capa orgánica se derramó hacia nuevos tubos y se evaporó bajo una corriente de nitrógeno a 40°C. El residuo se reconstituyó con agua : acetonitrilo (50:50 v/v) . Las muestras procesadas se analizaron por cromatografía líquida de alto desempeño usando una columna de Phenomenex Synery Polar RP mantenida a 45°C. La fase móvil se nebulizó usando nitrógeno calentado en una fuen-te/interfaz de rocío Z y los compuestos ionizados se detectaron usando un espectrómetro de masas de cuatro polos en tándem. Alturas de pico de dexametasona y prednisolona se adquirieron y se integraron usando software MassLynx, Micromass, Beverly, Massachusetts , Estados Unidos. Las curvas de calibración se obtuvieron mediante ajustar las relaciones de altura pico de los estándares al estándar interno a una ecuación de potencia en MassLynx. La ecuación de la curva de calibración se usó entonces para interpolar la concentración de dexametasona en las muestras usando sus relaciones de altura pico. Los resultados de espectrometría de masas revelaron que los niveles de dexametasona de coroideo, retina y vitreo en conejos tratados con dex sola alcanzaron concentraciones pico en el primer punto del tiempo (es decir, 1 hora después de inyección) mientras que las concentraciones de dex de coroideo y retina en conejos que recibieron sHASEGP concomitante fueron mas altas y continuaron incrementándose en el segundo punto del tiempo (es decir, 2 horas después de inyección) . Concentraciones de coroideo, retina y vitreo pico fueron aproximadamente 10 veces, 5 veces y 8 veces mas altas, respectivamente, en tejidos que han sido tratados con sHASEGP, y las áreas bajo la curva (AUC) fueron también por lo menos 50% mayores. Estos resultados indican que la administración de sHASEGP puede usarse para sustancialmente mejorar la entrega de agentes farmacológicos tales como dex, aun para dificultar relativamente el alcance a tejidos in vivo tales como segmentos en el posterior del ojo del mamífero. Mas aun, dado que la capa escleral relativamente gruesa forma una barrera de tejido entre el espacio de inyección sub-Tenón y las capas de coroideo y retina de objetivo, los niveles altos de agente farmacológico entregados a las últimas capas indican que sHASEGP pueden usarse para promover de manera efectiva la entrega de farmacológicos a capas de tejido dentro del cuerpo. En el caso de promover la entrega transcleral, sHASEGP puede así aplicarse en un procedimiento mínimamente invasor para promover la entrega de agentes usados para tratar condiciones que afectan la parte trasera del ojo los cuales son de interés particular en un número de situaciones de enfermedad ocular. Esto puede proporcionar, por ejemplo, una ruta de suministro menos invasiva para el tratamiento de neovascularización coroidal (v.gr., mediante administrar esteroides) , degeneración macular y otras enfermedades afectando estos tejidos las cuales se tratan típicamente mediante inyección intravitreal . Hay una amplia variedad de agentes actualmente usados para estas condiciones, tales como, pero no limitados a, dexametasona , triamcinolona , Macugen, y antagonistas de VEGF . Además de las actividades enzimáticas de sHASEGP que contribuyen a la extensión en el contexto de rutas de suministro tales como mediante inyección sub-Tenón, también se cree que la introducción de sHASEGP en un volumen de fluido que efectivamente llena o distiende el espacio de tejido dentro del cual se inyecta genera presiones hidrostát icas positivas que sirven para adicionalmente impulsar la entrega de fluidos, y los agentes comprendidos en los mismos, dentro de los tejidos que le rodean (v.gr., mediante promover transporte convectivo) . EJEMPLO 23 USO ILUSTRATIVO DE UNA sHASEGP PARA REDUCIR LA PRESIÓN DE FLUIDO INTERSTICIAL CON ELLO PROMOVIENDO LA SUSCEPTIBILIDAD DE UN TUMOR A AGENTES FARMACOLÓGICOS ANTI -TUMOR Como se describe e ilustra en la presente, sHASEGPs pueden usarse para generar canales intersticiales que pueden incrementar el flujo de fluidos y facilitar la entrega de los agentes f rmacológicos y otros a sitios de tejido deseados n vivo. Tumores presentan un asunto de objetivo particularmente importante para un número de agentes farmacológicos conocidos y desarrollados regularmente, especialmente ant i -neoplásticos , ant i -metabolitos , anti -angiogénicos y varios agentes citotóxicos y citostáticos . Los retos asociados con apuntar tales farmacoló-gicos a sitios de tumores in vivo son exacerbados por el hecho de que muchos tumores exhiben presiones intersticiales elevadas que tienden a impedir infusión de farmacológicos administrados, particularmente a sitios profundos dentro de una masa de tumor. Se cree que las sHASEGPs pueden reducir esta impedancia, y por ende facilitar el suministro de cualquiera de una variedad de agentes farmacológicos conocidos y recién desarrollados hacia tumores, con ello haciéndolos mas sensibles a y mas tratables por una dosis dada de un farmacológico. En este respecto, sHASEGPs de la presente invención han sido mostrados capaces de promover la formación de canales intersticiales y para mejorar la dispersión de marcadores de varios tamaños como se describe anteriormente. Además, se ha observado que sHASEGPs pueden usarse para incrementar la conductividad hidráulica de tejidos intersticiales mas de diez veces. Como confirmación de estos principios en el contexto de células de tumor, aplicación de una sHASEGP ejemplar (rHuPH20, 50 Unidades) a células de tumor in vi tro resultó en remoción sustancial de matrices pericelulares , las cuales se cree que son un contribuyente principal a la presión de fluidos intersticial elevada . Además, administración de rHuPH20 in vivo, en un modelo de tumor humano de xeno-injerto, resultó en una reducción significativa en la presión de fluido intersticial tumoral dentro de una hora de administración. Como se describe en la descripción detallada anterior de la invención, sHASEGPs de la presente invención se pueden aplicar en combinación con cualquiera de un número de agentes anti-tumores conocidos o recién desarrollados para uso en el tratamiento de varios cánceres. EJEMPLO 24 USO ILUSTRATIVO DE UNA sHASEGP PARA MEJORAR LA FARMACOCINETICA DE UNA MACROMOLÉCULA SUMINISTRADA POR INYECCIÓN PARENTERAL NO INTRAVENOSA Como se discute anteriormente, sHASEGPs pueden usarse para modular la farmacocinética de agentes farmacológicos y otros conocidos o recién desarrollados mediante, por ejemplo, facilitar su absorción y/o distribución dentro del cuerpo. Tales parámetros farmacocinéticos mejorados pueden a su vez usarse para mejorar la farmacodinámica de un agente particular (v.gr. , reduciendo la toxicidad local mediante reducir la cantidad de un agente dejado cerca de un sitio de inyección y/o elevando la efectividad mediante incrementar la cantidad de un agente entregado a (y/o a través) de un objetivo deseado) . Alternativamente, dado que sHASEPGs pueden usarse para impulsar de manera efectiva la dispersión de un agente farmacológico localmente administrado (v.gr., a través de un sitio de inyección y dentro del torrente sanguíneo) , es también posible usar el sHASEGP para esencialmente mejorar la farmacocinética de absorción y lograr farmacodinámica similar con una cantidad reducida de agente aplicado. Como un ejemplo ilustrativo del uso de sHASEGPs para mejorar la farmacocinética de un fármaco macromolecular que es normalmente administrado por inyección parenteral no intravenosa, se combinó con PH20 humana recombinante (rHuPH20) con una versión PEGilada de interferón alfa 2b (PEG-INTRON disponible de Schering-Plough) . PEG-INTRON es una macromolécula de aproximada- mente 31 kD que típicamente se administra por inyección subcutánea para el tratamiento del virus de la Hepatitis C (HCV) (generalmente en combinación con el fármaco de molécula pequeña ribavirina) . Como muchas macromoléculas administradas de manera sub-cutánea, PEG-INTRON es absorbida relativamente lentamente y una porción sustancial del agente nunca llega al torrente sanguíneo, con bio-disponibilidad en el orden de 50-60%. Además, una fracción sustancial de pacientes (típicamente mas de la mitad) desarrollan varias reacciones en el sitio de inyección, presumiblemente como resultado de o exacerbado por las concentraciones locales retenidas del farmacológico. Como se aprecia por los técnicos en la materia, las consecuencias de tales farmacoci-néticos son de varias veces; e incluyen no solamente el "desgaste" del agente atrapado cerca del sitio de inyección sino también reacciones al compuesto localmente metabolizado . Se administró PEG-INTROL marcado con Yodo- 125 por diferentes rutas de administración, con o sin administración concomitante de rHuPH20, para examinar los efectos de rHuPH20 sobre los parámetros farmacocinéticos de PEG-INTRON. Para determinar la biodisponibilidd absoluta de rHuPH20, también se midieron los parámetros farmacocinéticos de PEG-INTROL administrados por administración intravenosa. Brevemente, dieciocho ratas Sprague-Dawley (cada una pesando aproximadamente 225-250 gramos) se dividieron en tres grupos de seis animales cada uno. Un primer grupo se administró en el artículo de prueba (es decir, PEG-INTRON marcado con 1-125) por administración intravenosa (1.5 mg/kg en un volumen de 100 microlitros mediante inyección en la vena de cola) . Actividad específica del interferón marcado con 1-125 fue 55 uCi/microgramo . Muestras de sangre (100 microlitros) se recolectaron pre-dosis y a 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de dosificar y se procesaron para cuantificación de fármaco marcado por conteo gamma (expresado como Conteos Por Minuto (CPM) por gramo de plasma) . Un segundo grupo de seis animales se administró a una dosis y volumen equivalentes de artículo de prueba por inyección intradérmica dentro de un punto rasurado y preparado sobre la parte posterior del cuello, y muestras de sangre se procesaron como para el primer grupo. Un tercer grupo de seis animales se administraron con una dosis equivalente de artículo de prueba mezclado con rHuPH20 (100 U.I.) en un volumen combinado de 100 microlitros por inyección intradérmica como en el grupo precedente, y muestras de sangre fueron entonces procesadas como para los grupos uno y dos . Los resultados de este estudio se muestran mas adelante en la Tabla Tabla 24-1 Efectos de sHASEGP en el perfil farmacocinético de interferón Como se puede observar en la Tabla 24-1, la bio-disponibilidad del farmacológico ejemplar PEG-INTRON (según se evalúa por AUC) se mejoró dramáticamente cuando la dosificación intradérmica se combinó con una dosis de sHASEGP. De hecho, la bio-disponibilidad absoluta lograda con una dosificación intradérmica en combinación con sHASEGP fue estadísticamente indistinguible de la administración intravenosa directa, donde todo el material se entrega directamente hacia el torrente sanguíneo. Así, el uso de sHASEGP en combinación con un farmacológico que se introduce por administración parenteral no IV puede proporcionar niveles de suministro comparables con administración directamente hacia el torrente sanguíneo. Aunque el Tmax fue necesariamente mas largo siguiendo la administración ID (dado que alguna cantidad de tiempo es necesaria para que el agente alcance al torrente sanguíneo) , dentro de varias horas después de dosificación ID con sHASEGP, las concentraciones del agente en el torrente sanguíneo esencialmente alcanzaron aquellas logradas por dosificación IV, y posteriormente aparentemente las excedieron. EJEMPLO 25 USO ILUSTRATIVO DE UNA sHASEGP PARA FACILITAR EL SUMINISTRO INTRADÉRMICO DE UNA MACROMOLÉCULA NORMALMENTE SUMINISTRADA POR INYECCIÓN INTRAVENOSA Como se discute anteriormente, sHASEGPs pueden usarse para facilitar el suministro de agentes farmacológicos conocidos o recién desarrollados u otros mediante diferentes rutas de administración que pueden proporcionar para mayor conveniencia, seguridad, costos reducidos y/u otros beneficios. Como un ejemplo ilustrativo de tal una reformulación, se usó una sHASEGP para facilitar la entrega intradérmica de un fármaco macromolecular que normalmente se administra por inyección intravenosa. Para este ejemplo particular, se combinó PH20 humana recombinante (rHuPH20) con un anticuerpo monoclonal anti-TNFa humano-murino quimérico (Infliximab, disponible como REMICADE de Centocor) .
REMICADE es una macromolécula de aproximadamente 150 kD que es típicamente administrada por inyección intravenosa para el tratamiento de artritis o enfermedad de Crohn. La administración de REMICADE por ende generalmente requiere el involucramiento de acceso intravenoso y cuidado y riesgos profesionales concomitantes, y también requiere en el orden de dos horas para cada dosificación . REMICADE (20 mg/ml) se marcó con 125I a una actividad específica de 10 Ci/mg. Dieciocho ratas se dividieron en tres grupos de seis animales cada uno y se administraron con una mezcla de REMICADE radioactiva y fría (combinadas 10 mg/kg) en un volumen final de 100 µ? (i) por administración intravenosa, (ii) por administración intradérmica o (iii) por administración intradermica en combinación con 100 Unidades de sHASEGP (a partir de un material de 100,000 U/ml) ; y luego sangre y tejidos se procesaron por conteos gamma en varios puntos después de dosificar, esencialmente como se describe para el ejemplo precedente. Los resultados se resumen en la Tabla: Tabla 25-1 Efectos de sHASEGP en los parámetros farmacocinéticos de REMICADE Como se puede observar en la Tabla 25-1, la bio-disponibilidad del farmacológico ejemplar REMICADE (según se evalúa por AUC) se mejoró dramáticamente cuando la dosificación intradérmica se combinó con una dosis de sHASEGP. Como se observó con entrega mejorada de PEG-INTRON, los niveles globales de bio-disponibilidad de REMICADE logrados con una dosificación intradérmica en combinación con sHASEGP fueron estadísticamente similares a aquellos de la administración intravenosa cuando todo el material se entregó directamente hacia el torrente sanguíneo. Aunque la Tmax de REMICADE es necesariamente mas larga siguiendo administración ID contra IV, dentro de veinticuatro horas después de dosificación ID con sHASEGP, las concentraciones del agente en el torrente sanguíneo excedieron aquellas observadas con dosificación IV, y posteriormente alcanzaron o excedieron las concentraciones IV. Comparadas con dosificación ID sin sHASEGP, la Tmax observada se alcanzó alrededor de dos veces mas rápido con sHASEGP (24 horas contra 48 horas) ; y la Cmax y la bio-disponibi -lidad (AUC) ambas sustancialmente se incrementaron (por alrededor de 65% y 95%, respectivamente) . EJEMPLO 26 USO ILUSTRATIVO DE UNA sHASEGP PARA FACILITAR EL SUMINISTRO INTRADERMICO DE UN COMPLEJO MACROMOLECULAR MAS GRANDE NORMALMENTE ENTREGADO POR INYECCIÓN PARENTERAL NO IV Como otro ejemplo ilustrativo del uso de sHASEGPs para mejorar la farmacocinética de un fármaco macromolecular que normalmente se administra por inyección parenteral intravenosa, se combinó PH20 humana recombinante (rHuPH20) con Factor VIII humano recombinante (RECOMBINATE disponible de Baxter) . Factor VIII es un complejo de glicoproteína grande comprendiendo múltiples polipéptidos , y tiene un peso molecular combinado de aproximadamente 280 kD . Factor VIII es típicamente solamente administrado por inyección intravenosa para el tratamiento de hemofilia. Como muchas macromoléculas administradas sub-cutánea- mente, Factor VIII es absorbido relativamente lentamente y una porción sustancial del agente nunca llega al torrente sanguíneo, con bio-disponibilidad en el orden de 0.5-1%. Dieciocho ratas se dividieron en tres grupos de seis animales cada uno y se administraron con Factor VIII marcado con 125-1 (i) por administración intravenosa, (ii) por administración intradérmica o (iii) por administración intradérmica en combinación con sHASEGP; y luego sangre y tejidos procesados en varios puntos después de dosificar para medir conteos por minuto (CPM) por gramo de plasma, esencialmente como se describe para el ejemplo precedente.
Tabla 26-1 Efectos de sHASEGP en la farmacocinética de Factor VIII Como se muestra en la Tabla 26-1, co-administración del Factor VIII con rHuPH20 incrementó significativamente la bio-disponibilidad sistémica con relación al Factor VIII solo (P<0.01) . El uso de precipitación de TCA fue necesario para eliminar la contribución de proteína de Factor VIII marcada con 1-125 completamente degradada ingresando al torrente sanguíneo.
EJEMPLO 27 USO ILUSTRATIVO DE UNA sHASEGP PARA MEJORAR LA SUPERVIVENCIA Y/O RESULTADOS DE COMPORTAMIENTO SIGUIENDO APOPLEJÍA En un primer conjunto de estudios, sHASEGPs se evaluaron en un modelo de apoplejía de ratas. Brevemente, apoplejía se indujo quirúrgicamente en ratas Sprague-Dawley mediante oclusión de arteria cerebral media, seguida en varios momentos por administración intravenosa de ya sea una solución de control (solución salina) o una solución de prueba (solución salina comprendiendo sHASEGP) . Se le permitió recuperarse a los animales y se siguió por un periodo de tiempo para evaluar las tasas de supervivencia en grupos de control contra prueba. Además, los supervivientes se evaluaron sobre un rango de puntos del tiempo usando análisis múltiples de condiciones de comportamiento típicamente asociados con apoplejía. Solamente ratas que se desempeñaron normalmente en una prueba de flexión de extremidades frontales de calificación inicial se incluyeron en el estudio, y fueron asignadas aleatoriamente a un grupo de animales de control o de prueba. Procedimientos quirúrgicos asépticos se llevaron a cabo por Zivic Laboratories esencialmente como sigue. Ratas se anestesiaron en una cámara suministrada con 2.5% de halotano. Una incisión de línea media ventral se hizo y la musculatura se separó para exponer la arteria carótida externa derecha, la cual entonces se aisló y fue doblemente ligada. Una ligadura de poliamida 5/0 no atada pero construida se colocó entonces alrededor del muñón carótido externo. Un agujero pequeño se cortó dentro del lumen del muñón y un material de sutura de microfila-mente 4/0 de 18-20 mm de longitud se insertó dentro del lumen y se avanzó dentro de la arteria carótida interna. Cuando se avanzó por completo, la punta internalizada del monofilamento debe bloquear el flujo hacia la arteria cerebral media. La ligadura de poliamida de constricción entonces se ató para sujetar el monofilamento . La retracción se removió y la incisión de piel se cerró con un pasador de herida. Procedimientos de inyección intravenosa se llevaron a cabo esencialmente como sigue. Ratas se anestesiaron en una cámara suministrada con 2.5% de halotano. Una incisión de piel ventral se hizo para exponer la vena yugular. Una jeringa desechable estéril de 1 mi se ajustó con una aguja calibre 30 y se cargó con material de inyección. Usando la clavícula para soporte, la jeringa se insertó dentro de la vena yugular (usando ligera presión negativa en la jeringa para tomar flujo sanguíneo hacia la jeringa y por ende confirmar la colocación apropiada para inyección IV) y luego el material de inyección se inyectó lentamente dentro de la vena yugular. Después de inyección, la aguja se retiró lentamente (y cualquier sangrado controlado con un aplicador de algodón estéril) , y luego la incisión de piel se cerró con un pasador de herida . La supervivencia de animales en los varios grupos ( proximadamente 40 animales en cada grupo) se monitoreó siguiendo inducción de apoplejía, el número de supervivientes en cada día se trazó entonces contra días después de apoplejía para generar una curva de apoplejía Kaplan-Meier . Diferencias sustanciales entre los grupos fueron aparentes para el tercer día siguiendo a la apoplejía. Por una semana después de la inducción de la apoplejía, mas de la mitad de los animales de control habían muerto, mientras que casi tres cuartos de los animales tratados con sHASEGP habían sobrevivido, lo cual fue una diferencia estadísticamente significativa (p=0.03). Además de medir las tasas de supervivencia después de la apoplejía, los supervivientes también fueron probados (en 1, 2, 3 y 4 semanas después de apoplejía) usando otros análisis diseñados para evaluar la incidencia de ciertos problemas de comportamiento asociados con apoplejía. Condiciones de comportamiento evaluadas incluyeron la flexión de las extremidades delanteras, giros de torso, extremidades traseras, perturbaciones de marcha y caminado en pared, las cuales se usaron para generar una calificación de comportamiento PNEGS (mayores calificaciones reflejando un incremento en problemas de comportamiento asociados con apoplejía) . Para la segunda semana después de inducción de apoplejía, los animales tratados con sHASEGP exhibieron calificaciones de comportamiento significativamente mayores (p=0.02), y las diferencias relativas entre el grupo tratado y el control fueron aun mayores sobre las semanas subsecuentes (p=0.007 y p=0.003 para semanas tres y cuatro respectivamente) . Aunque la invención ha sido descrita con referencia a los ejemplos anteriores, se entenderá que modificaciones y variaciones se contemplan dentro del espíritu y alcance de la invención. De manera acorde, la invención se limita solamente por las reivindicaciones siguientes.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una glicoproteína sustancialmente purificada, que comprende un polipéptido de hialuronidasa soluble activo neutro y por lo menos una fracción de azúcar N-enlazada, donde la fracción de azúcar N-enlazada está unida de manera covalente a un residuo de asparagina del polipéptido. 2. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el polipéptido se selecciona a partir de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia que incluye por lo menos alrededor de 74% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO : 1 ; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos expresada en la SEQ ID NO : 6 ; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que hibridiza a lo largo de 85% de su longitud completa bajo condiciones de alta exactitud a la secuencia de nucleótidos expresada en la SEQ ID NO: 6; o (d) un polipéptido que se codifica por una secuencia de nucleótidos que es una variante de empalme de la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expresada en la SEQ ID NO : 50. 3. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicha fracción de azúcar se une de manera covalente a un residuo de asparagina seleccionado a partir de los aminoácidos 82, 166, 235, 254, 368, 393 o 490 según se expresan en la SEQ ID NO : 1. 4. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicha fracción de azúcar se enlaza de manera covalente a dicho polipéptido a través de un enlace sensible a PNGasa . 5. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicha fracción de azúcar es del tipo de alta mañosa. 6. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicha fracción de azúcar es del tipo complejo. 7. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicha fracción de azúcar es un tipo híbrido. 8. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicha fracción de azúcar además comprende por lo menos una terminada con ácido siálico. 9. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el polipéptido consiste esencialmente del dominio de hialuronidasa de glicoproteína de hialuronidasa humana (sHASEGP) o una porción catalíticamente activa del mismo. 10. El polipéptido de la reivindicación 1, donde la porción de hialuronidasa del polipéptido comprende del dominio de hialuronidasa de sHASEGP o una porción catalíticamente activa del mismo . 11. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el polipéptido se modifica con un polímero. 12. El polipéptido de la reivindicación 11, donde el polímero es PEG o dextrano. 13. Un polipéptido, consistiendo esencialmente de un dominio de hialuronidasa o una porción catalíticamente activa del mismo de una proteína de hialuronidasa humana. 14. El polipéptido de la reivindicación 13, donde la hialuronidasa es super-sialada . 15. El polipéptido de la reivindicación 13, donde el dominio de hialuronidasa comprende la secuencia de aminoácidos expresada como los aminoácidos 1-450 de la SEQ ID NO : 3. 16. El polipéptido de la reivindicación 13, donde el dominio de hialuronidasa comprende la secuencia de aminoácidos expresada como los aminoácidos 1-438 de la SEQ ID NO : 3. 17. El polipéptido de la reivindicación 13, donde el dominio de hialuronidasa comprende la secuencia de aminoácidos expresada como los aminoácidos de la SEQ ID NO : 3. 18. El polipéptido de la reivindicación 13, donde el polipéptido se modifica con un polímero. 19. El polipéptido de la reivindicación 18, donde el polímero es PEG o dextrano. 20. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el sHASEGP es un polipéptido humano. 21. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el polipéptido es un polipéptido soluble como se expresa en la SEQ ID NO : 4. 22. El polipéptido de la reivindicación 1, donde una secuencia de señal capaz de dirigir al polipéptido fuera de su célula se une operativamente al polipéptido sHASEGP . 23. Una glicoproteína de hialuronidasa humana soluble aislada (sHASEGP) donde la potencia de la sHASEGP es mayor que 40,000 Unidades USP/mg de proteína. 24. El polipéptido de la reivindicación 23, donde la hialuronidasa es sialada. 25. El polipéptido de la reivindicación 23, donde la proteína es modificada con un polímero. 26. El polipéptido de la reivindicación 25, donde el polímero es PEG o dextrano. 27. Una molécula de ácido nucleico, que codifica al polipéptido de la reivindicación 1. 28. Una molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia seleccionada a partir de: (a) una secuencia según se expresa en la SEQ ID NO : 6 ; (b) una secuencia que hibridiza bajo alta exactitud a por lo menos alrededor de 70% de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos expresada en la SEQ ID NO: 6; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido expresado en las SEQ ID NOs : 1 , 3, 4, 5 y 50; (d) una secuencia que es una variante de empalme de (a) , (b) o (c) ; (e) una secuencia que codifica al dominio de hialuroni- dasa o una porción catalíticamente activa del mismo que incluye una secuencia de nucleótidos teniendo por lo menos alrededor de 60% de identidad de secuencia con la secuencia expresada en la SEQ ID NO: 6 O 50; y (f) una secuencia comprendiendo codones degenerados de (a) , (b) , (c) , (d) o (e) . 29. Un vector teniendo una secuencia según se expresa en la SEQ ID NO: 51. 30. Un vector comprendiendo la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27. 31. Una célula aislada, comprendiendo al vector de la reivindicación 30. 32. La célula de la reivindicación 31, que es una célula de mamífero. 33. Un anticuerpo que se liga a la sHASEGP de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo está libre de reactividad a hialuronidasa bovina, ovina o bacteriana. 34. Un animal transgénico no humano, donde un gen endógeno que codifica a un polipéptido de la reivindicación 1 ha sido interrumpido por recombinación homologa o mutagénesis de inserción del animal o un ancestro del mismo. 35. Un método para producir un polipéptido soluble que contiene una sHASEGP, comprendiendo: introducir un ácido nucleico según se expresa en la SEQ ID NO: 6 enlazado operativamente a un promotor dentro de una célula que incorpora fracciones de azúcar N-enlazadas hacia SHASEGP; cultivar la célula bajo condiciones con las cuales el polipéptido codificado se expresa por la célula; y recuperar al polipéptido expresado. 36. Un método para producir un polipéptido soluble que contiene sHASEGP, comprendiendo: introducir un ácido nucleico que codifica al polipéptido de la reivindicación 1 enlazado operativamente a un promotor adecuado dentro de una célula capaz de incorporar fracciones de azúcar N-enlazadas hacia sHASEGP; cultivar la célula bajo condiciones con las cuales el polipéptido codificado se expresa por la célula; y recuperar al polipéptido expresado. 37. Un método para producir un polipéptido soluble que contiene sHASEGP, comprendiendo: cultivar la célula de la reivindicación 31 bajo condiciones con las cuales el polipéptido codificado se expresa por la célula; y recuperar al polipéptido expresado. 38. Un método de terapia génica ex vivo, que comprende: introducir, in vi tro, un ácido nucleico que codifica al polipéptido de la reivindicación 1 y se enlaza operativamente a un promotor adecuado dentro de una célula capaz de incorporar fracciones de azúcar N-enlazadas hacia sHASEGP; con lo cual se genera una célula genéticamente modificada que contiene al ácido nucleico; y administrar la célula comprendiendo al ácido nucleico al sujeto, con lo cual el ácido nucleico que codifica al sHASEGP se transfiere al sujeto. 39. Un método para preparar un oocito de mamífero para fertilización in vi tro, dicho método comprendiendo: poner en contacto un oocito con una sHASEGP de la reivindicación 1 en una cantidad efectiva para remover la matriz de cúmulo. 40. El método de la reivindicación 39, donde el cúmulo se remueve efectivamente sin manipulación del oocito con una pipeta de perforación estrecha. 41. Un método para generar un polipéptido sHASEGP que comprende : poner en contacto al polipéptido de la reivindicación 1 con enzimas de glicosiltransferasa capaces de introducir dichas fracciones de azúcar N-enlazadas hacia el polipéptido, con ello generando sHASEGP. 42. Una composición, comprendiendo un polipéptido de glicoproteína sHASEGP sustancialmente purificado y un portador farmacéutico adecuado. 43. Una composición, que comprende al polipéptido de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable. 44. Un método para tratar a un sujeto teniendo un exceso de sustrato sHASEGP, que comprende: administrar una cantidad de polipéptido sHASEGP de la reivindicación 1 suficiente para remover dicho sustrato de sHASEGP . 45. El método de la reivindicación 44, donde dicho sustrato de exceso se produce a partir de tejido de cicatriz. 46. El método de la reivindicación 45, donde dicho tejido de cicatriz es una cicatriz glial resultando de lesión del cordón espinal . 47. El método de la reivindicación 45, donde dicho tejido de cicatriz es una cicatriz celoide . 48. Un método para incrementar la difusión de una sustancia terapéutica u otra molécula o complejo macromolecular (cada uno un Agente) menor que alrededor de 0.5 mieras en diámetro en el sujeto, comprendiendo: administrar a un sujeto un polipéptido sHASEGP en una cantidad suficiente para abrir o para formar canales mas pequeños que alrededor de 0.5 mieras en diámetro y un Agente, con lo cual la difusión del Agente se incrementa. 49. El método de la reivindicación 48, donde dicho polipéptido sHASEGP se inyecta en una dosis entre 0.1 y 1,500 Unidades . 50. El método de la reivindicación 48, donde dicho polipéptido sHASEGP se mezcla con la sustancia terapéutica u otro Agente previo a inyección. 51. Un kit, comprendiendo: (a) un polipéptido sHASEGP en una dosis de entre 0.1 y 1,500 Unidades/ml en un portador aceptable; (b) por lo menos una sustancia terapéutica u otra molécula o complejo macromolecular (cada uno un Agente) en un portador aceptable; y (c) opcionalmente, instrucciones para entregar sustancias terapéuticas u otros Agentes. 52. El kit de la reivindicación 51, donde el polipéptido sHASEGP y la sustancia terapéutica u otro Agente se proporciona como una mezcla. 53. Un método para tratar un desorden cardiovascular, comprendiendo : administración de un polipéptido sHASEGP de la reivindicación 1 a un sujeto en una cantidad suficiente para remover glicosaminoglicanos en exceso. 54. El método de la reivindicación 53, donde dicho desorden cardiovascular se selecciona a partir de infarto de miocardio, falla congestiva del corazón o arterioesclerosis . 55. Un método para tratar un tumor que comprende: administración de un polipéptido sHASEGP de la reivindicación 1 a un sujeto en una cantidad suficiente para remover glicosaminoglicanos en exceso. 56. Un método para entregar una molécula a un tejido conteniendo cantidades en exceso de glicosaminoglicano, comprendiendo: administrar un polipéptido sHASEGP de la reivindicación 1 a un tejido en una cantidad suficiente para degradar glicosami-noglicanos lo suficiente para abrir canales menores que alrededor de 500 nm de diámetro; y administrar una molécula al tejido comprendiendo los glicosaminoglicanos degradados. 57. El método de la reivindicación 56, donde el polipéptido se modifica con un polímero. 58. El método de la reivindicación 57, donde el polímero es PEG o dextrano. 59. El método de la reivindicación 56, donde el polipéptido sHASEGP se administra previo a, o simultáneamente con o siguiendo la administración de la molécula. 60. Una composición farmacéutica, comprendiendo, polipéptido de glicoproteína de hialuronidasa soluble sustancial-mente purificada (sHASEGP) de la reivindicación 1 y un portador farmacéutico . 61. Una composición farmacéutica, comprendiendo al polipéptido sHASEGP sustancialmente purificado de la reivindicación 1. 62. La composición farmacéutica de la reivindicación 60, comprendiendo además un agente farmacéuticamente activo o farmacológico . 63. La composición farmacéutica de la reivindicación 62, donde el agente farmacéuticamente activo o farmacológico se selecciona a partir del grupo de agentes que consiste de un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente anti- inflamatorio, un agente anti-microbiano, un agente amebicida, un agente tricomonocida, un agente anti-Parkinson, un agente antimalaria, un agente anti-convulsivo, un agente anti-depresivo, un agente anti-artritis, un agente anti-hongos, un agente antihipertensión, un agente anti-pirético, un agente anti-parásitos , un agente anti-histamínico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador del canal de calcio, un agente de fármacos cardiovasculares, un agente contraceptivo, un agente descongestivo, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un inductor de sueño, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente antiinflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de enzima convertidora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, o una molécula orgánica. 64. Una combinación, comprendiendo, un frasco estéril y la composición farmacéutica de la reivindicación 60 donde la composición se contiene en el frasco. 65. Un kit comprendiendo la composición de la reivindicación 64 y por lo menos uno de: (a) un material de empaque; o (b) instrucciones para usar el kit para uso de la composición farmacéutica. 66. Una combinación comprendiendo: una jeringa estéril conteniendo la composición farmacéutica de la reivindicación 60. 67. Una combinación comprendiendo: una jeringa estéril conteniendo la composición farmacéutica de la reivindicación 62. 68. La combinación de la reivindicación 67, comprendiendo además una segunda jeringa conteniendo un agente farmacéuticamente efectiva. 69. La combinación de la reivindicación 67, donde el agente farmacéuticamente activo o farmacológico se selecciona a partir del grupo de agentes que consiste en un agente quimiotera-péutico, un agente analgésico, un agente anti-inflamatorio, un agente anti-microbiano, un agente amebicida, un agente tricomono-cida, un agente anti-Parkinson, un agente anti-malaria , un agente anti-convulsivo, un agente anti-depresivo, un agente antiartritis, un agente anti-hongos, un agente anti-hipertensión, un agente anti-pirético, un agente anti-parásitos , un agente anti-histaminico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador del canal de calcio, un agente de fármacos cardiovasculares, un agente contraceptivo, un agente descongestivo, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un inductor de sueño, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente anti-inflama-torio no esferoidal, un agente inhibidor de enzima convertidora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, o una molécula orgánica. 70. La combinación de la reivindicación 68, donde la segunda jeringa comprende un viscoelástico . 71. Un kit que comprende la combinación de la reivindicación 67 y uno o mas de los siguientes: (a) un material de empaque; y (b) instrucciones para usar el kit para el uso de la composición farmacéutica. 72. Un método para el tratamiento de una acumulación patológica de glicosaminoglicanos , comprendiendo: administración de una sHASEGP recombinante , donde dicha sHASEGP está libre de enzimas bovinas, ovinas o bacterianas, en una cantidad suficiente para mejorar o reducir el glicosaminogli-cano acumulado. 73. El método de la reivindicación 72, donde la acumulación se selecciona a partir de cardiovascular, cerebral, parafimosis, mixedema, escleromixedema y linfedema. 74. Un método para facilitar la revascularización de tejido necrótico, comprendiendo la administración de una sHASEGP recombinante en una cantidad suficiente para inducir el crecimiento de neovasculatura hacia dicho tejido necrótico. 75. Un método para remoción de glicosaminoglicanos a partir del humor vitreo, comprendiendo: administración de una sHASEGP. 76. Un proceso para producir un polipéptido de hialuronidasa soluble activo neutro sustancialmente purificado y por lo menos una fracción de azúcar N-enlazada, donde la fracción de azúcar N-enlazada se une de manera covalente a un residuo de asparagina del polipéptido, comprendiendo hacer crecer células de Ovario de Hámster Chino en un medio de crecimiento adecuado y en la presencia de Butirato de Sodio 0.1-1 mM bajo condiciones adecuadas para producción del polipéptido. 77. Un proceso para purificar una sHASEGP, dicho proceso comprendiendo: poner en contacto medio conteniendo sHASEGP bajo resistencia iónica baja con una resina de intercambio de aniones a pH neutro, y extraer dicha sHASEGP con alrededor de 400 mM de una sal; contacto de dicha sHASEGP con resina de cromatografía de interacción hidrófoba en presencia de sulfato de amonio alrededor de 0.5 M; contacto de dicha sHASEGP en sulfato de amonio con resina de boronato de fenilo; extraer dicha sHASEGP en sal baja a pH neutro; contacto de dicha sHASEGP con resina de Hidroxiapatita, y extracción de dicha sHASEGP con fosfato de Na alrededor de 100 mM, resultando en una sHASEGP donde dicha sHASEGP es sustancialmente purificada. 78. Un método para inducir licuefacción de humor vitreo para tratar un desorden de un ojo de mamífero comprendiendo poner en contacto al humor vitreo con una cantidad de una proteína de la reivindicación 1 efectiva para licuar dicho humor vitreo con lo cual el desorden es tratado. 79. Un método para reducir la presión infraocular en el ojo de un sujeto comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo, sHASEGP humana caracterizada como: estando libre de enzimas bovinas, ovinas o bacterianas; teniendo mas de alrededor de 40,000 Unidades USP/mg de proteína; y con ello reduciendo la presión infraocular en el suj eto . 80. Un método para promover la entrega de una sHASEGP u otra glicosaminoglicanasa (Enzima GAG) hacia un primer tejido dentro de un mamífero, comprendiendo introducir un volumen de líquido que comprende la Enzima GAG hacia el primer tejido y permitir que el volumen de líquido y la actividad catalítica de la Enzima GAG promueva la entrega de la Enzima GAG hacia el te ido . 81. El método de la reivindicación 80, donde el volumen de líquido es suficiente para ocasionar distensión localizada de primer tejido en o cerca del sitio de introducción del volumen de líquido. 82. El método de la reivindicación 80, comprendiendo además introducir uno o mas agentes farmacológicos u otros adicionales (A-X) dentro del primer tejido. 83. El método de la reivindicación 82, donde A-X se selecciona a partir del grupo que consiste en una molécula detectable u otro agente de diagnóstico, un anestésico u otro agente modificador de tejido, un agente farmacológico o farmacéuticamente efectivo, y un cosmético u otro agente estético. 84. El método de la reivindicación 82, donde A-X es un agente farmacológico o farmacéuticamente efectivo. 85. El método de la reivindicación 82, donde A-X se selecciona a partir del grupo que consiste en un agente quimiote-rapéutico o anti-cáncer, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente anti-microbiano, un agente amebicida, un agente tricomonocida, un agente anti-Parkinson, un agente antimalaria, un agente anti-convulsivo, un agente anti-depresivo, un agente anti-artritis , un agente anti-hongos, un agente antihipertensión, un agente anti-pirético, un agente anti-parásitos, un agente anti-histaminico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador del canal de calcio, un agente de fármacos cardiovasculares, un agente contraceptivo, un agente descongestivo, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un inductor de sueño, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente antiinflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de enzima convertidora de angiotensina . 86. El método de la reivindicación 82, donde A-X se selecciona a partir del grupo que consiste en Adalimumabs (v.gr., Humira) , Agalsidasas Betas (v.gr., Fabrazyme) , Aldesleucinas ( PROLEUKIN IL-2), Alefaceptos (v.gr., Amevive) , Ampicilinas (v.gr., Inyección de UNASYN) , Anaquinras (v.gr., Kineret), Vacunas Antipoliomielíticas (v.gr., PEDIARIX) , Anti-Timocitos (v.gr., THY OGLOBULIN) , Azitromicinas (v.gr., Zithromax IV), Becaplerminas (v.gr., Regranex) , Caspofunginas (v.gr., Cancidas), Cefazolinas (v.gr., ANCEF y CEFAZOLIN) , Cefepimas (v.gr., Maxipime) , Cefotetanos (v.gr., CEFOTAN) , Ceftazidimas (v.gr., FORTAZ) , Ceftriaxonas (v.gr., Rocefin) , Cetuximabs (v.gr., Erbitux) , Cilastatinas (v.gr., Primaxin IV), Ácidos Clavulánicos (v.gr., en conjunto con Amoxicilinas tales como en AUGMENTIN) , Clindamicinas (v.gr., CLEOCIN) , Darbepoetinas Alfas (v.gr., Aranesp) , Deaclizumabs (v.gr., Zenapax) , Toxoides de Difteria (típicamente en combinaciones v.gr., DAPTACEL, Infarix y PEDIARIX) , Efalizumabs (v.gr., Raptiva) , Epinefrinas (v.gr., EPIPEN) , Eritropoietinas Alfas (v.gr., Epogen y Procrit), Etanerceptos (v.gr., Enbrel) , Filgrastimas (v.gr., Neupogen) , Fluconazolas (v.gr., Inyección de DIFLUCAN), Hormonas Estimulantes de Folículos tales como Folitropinas Alfas (v.gr., GONAL-F) y Folitropinas Betas (v.gr., Follistim) , Fosfenitoínas (v.gr., CEREBYX) , Fluconazolas (v.gr., Diflucan) , Gadodiamidas (v.gr., OMNISCAN), Gadopentetatos (v.gr., MAGNEVIST) , Gatifloxacinas (v.gr., Tequin) , Glatirámeros (v.gr., Copaxone) , GM-CSF's (v.gr., Leukine), Gosereiinas (v.gr., Zoladex) , Granisetrones (v.gr., Kytril) , Hemofilus Influenza B's (v.gr., COMVAX y HibTITER) , Haloperidoles (v.gr., HALDOL) , Vacunas de Hepatitis A (v.gr., HAVRIX, TWINRIX y VAQTA) , Vacunas de Hepatitis B (v.gr., recombinantes COMVAX, ENGERIX-B, RECOMBIVAX-HB, TWINRIX, y no recombinantes BAYHEP-B y NABFM-HB) , Ibritumomab Tiuxetanos (v.gr., Zevalin) , Inmunoglobulinas (incluyendo mezclas de inmunoglobulinas tales como GAMMAGARD y similares, así como cualquiera de una variedad de inmunoglobulinas purificadas) , Vacunas del Virus de Influenza (v.gr., FLUMIST) , Infliximabs (v.gr., Remicade) , Insulinas (v.gr., HUMALOG, HUMALOG MIX 75/25, productos HUMULIN (incluyendo 50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra y Ultralente) , y NOVOLIN) , Insulinas Glargines (v.gr., Lantus), Interferones Alfa-2a's (ROFERAN-A) , Interferones Alfa-2b's (v.gr., Intron-A) , Interferones Alfacon-l's (v.gr., INFERGEN) , Interferones Alfa-n3s (v.gr., ALFERON N) , Interferones Betas (v.gr., Betaseron y Betaferon) , Interferones Beta-la's (v.gr., Avonex y Rebif ) , Interferones Gammas (v.gr., ACTIMMUNE) , Iodixanoles (v.gr., VISIPAQUE) , Iohexoles (OMNIPAQUE) , Iopamido-les, Ioversoles (v.gr., OPTIRAY) , Cetorolacos (v.gr., TORADOL) , Laronidasas (v.gr., Aldurazyme) , Levofloxacinas (v.gr., Leva-quin) , Lidocainas, Linezolidas (v.gr., ZYVOX) , Lorazepamos (v.gr., ATI A ) , Vacunas de Sarampión (v.gr., ATTENUVAX) , Vacunas de Virus de Sarampión-Paperas-Rubeola (v.gr., M-M-R II), Medroxiprogesteronas (v.gr., Depo-Provera) , Meropenemos (v.gr., MERREM IV), Metilprednisolonas (v.gr., Solu-Medrol ) , Midazolamos (v.gr., VERSED) , Morfinas (v.gr., ASTRAMORPH/PF) , Octreotidas (v.gr., Sandostatin) , Omalizumabs (v.gr., Xolair) , Ondansetronas (v.gr., Zofran) , Palivizumabs (v.gr., Synagis), Pantoprazolas (v.gr., Protonix) , Pegaspargasas (v.gr., ONCASPAR) , Pegfilgrasti-mas (v.gr., Neulasta) , Peg-Interferones Alfa-2a's (v.gr., PegASYS) , Peg-Interferones Alfa-2b's (v.gr., Peg-Intron) , Pegvisomantos (v.gr., SOMAVERT) , vacunas de Pertussis, Piperaci-linas (v.gr., Zosyn) , Vacunas de Neumococos (v.gr., PNEUMO V AX3) y Vacunas de Conjugado de Neumococos (v.gr., PREVNAR) , Prometazi-nas (v.gr., Phenergan) , Reteplasas (v.gr., Retavase) , Somatropi-nas (v.gr., GENOTROPIN, HUMATROPE, NORDITROPIN, NUTROPIN, SAIZEN, SEROSTI , ZORBTIVE) , Sulbactamas, Sumatriptanos (v.gr., Imitrex) , Tazobactamas , Tenecteplasas (v.gr., Tnkase) , Toxoides Purificados de Tétano, Ticarcilinas (v.gr., TIMENTIN) , Tositumomabs (v.gr., Bexxar) , Triamcinolona Acetonidas, Vancomicinas (v.gr., Vanco-cin) , Vacunas de Varicela (v.gr., VARIVAX) , y otras vacunas. 87. El método de la reivindicación 82, donde A-X es un agente antibiótico o combinación de agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en Aminoglicósidos ; Amfenicoles; Ansamicinas ; Carbacefemos; Carbapenemos ; Cefalosporinas o Cefemos; Cefamicinas ; Clavamos; Lipopéptidos cíclicos; Diaminopi-rimidinas; Cetólidos; Lincosamidas ; Macrólidos; Monobactamas ; Nitrofuranos; Oxacefemos; Oxazolidinonas; Penemos, tienamicinas y beta-lactamas misceláneas ; Penicilinas; Polipéptidos antibióticos; Quinolonas; Sulfonamidas ; Sulfonas; Tetraciclinas ; y otros antibióticos (tales como Clofoctoles, Ácidos fusídicos, Hexedi-nas, Metenaminas, Nitrofurantoínas, Nitroxolinas, Ritipenemos, Taurolidinas, Xibomoles) . 88. El método de la reivindicación 80, donde la Enzima GAG es una sHASEGP. 89. El método de la reivindicación 88, donde la sHASEGP es una sHASEGP humana. 90. El método de la reivindicación 89, donde la sHASEGP humana es una sHASEGP PH20. 91. El método de la reivindicación 90, donde la sHASEGP es un polipéptido soluble como se expresa en la SEQ ID NO: 4. 92. El método de la reivindicación 88, donde la sHASEGP es una sHASEGP PEGilada o super-sialada . 93. El método de la reivindicación 91, donde la sHASEGP es una sHASEGP PH20 humana PEGilada. 94. Un método para incrementar la permeabilidad de un tejido objetivo de un mamífero, comprendiendo introducir una sHASEGP dentro del tejido. 95. El método de la reivindicación 94, donde la sHASEGP se introduce dentro del tejido por inyección de la sHASEGP dentro del tejido o dentro de un tejido cercano. 96. El método de la reivindicación 94, donde la sHASEGP se introduce dentro del tejido por introducción previa de la sHASEGP hacia el torrente sanguíneo suministrando al tejido. 97. El método de la reivindicación 96, donde la introducción previa hacia el torrente sanguíneo es mediada por inyección intravenosa o infusión de la sHASEGP. 98. El método de la reivindicación 96, donde la introducción previa hacia el torrente sanguíneo es mediada por administración parenteral no intravenosa de la sHASEGP. 99. El método de la reivindicación 94, comprendiendo además introducir A-X hacia el tejido. 100. El método de la reivindicación 99, donde A-X se introduce hacia el tejido mediante inyección hacia el tejido o hacia un tejido cercano. 101. El método de la reivindicación 99, donde A-X se introduce hacia el tejido por introducción previa de la PH20 hacia el torrente sanguíneo suministrando al tejido. 102. El método de la reivindicación 101, donde la introducción previa hacia el torrente sanguíneo es mediada por inyección intravenosa o infusión de la molécula o complejo macromolecular . 103. El método de la reivindicación 101, donde la introducción previa hacia el torrente sanguíneo es mediada por administración parenteral no intravenosa de la molécula o complejo macromolecular. 104. El método de la reivindicación 99, donde el paso para introducir A-X hacia el tejido se inicia dentro de tres horas después del paso de introducir la sHASEGP hacia el tejido. 105. El método de la reivindicación 99, donde el paso de introducir A-X hacia el tejido se inicia dentro de doce horas siguiendo al paso de introducir la sHASEGP hacia el primer tej ido . 106. El método de la reivindicación 99, donde A-X es una molécula seleccionada a partir del grupo que consiste en una molécula pequeña, una proteína, y un ácido nucleico. 107. El método de la reivindicación 99, donde A-X es un complejo macromolecular comprendiendo combinaciones de moléculas seleccionadas a partir del grupo que consiste en moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y moléculas amfífilas. 108. El método de la reivindicación 99, donde A-X se selecciona a partir del grupo que consiste en una molécula separable u otro agente de diagnóstico, un anestésico u otro agente modificador de tejido, un agente farmacológico o farmacéuticamente efectivo, y un agente cosmético u otro estético. 109. El método de la reivindicación 99, donde A-X es un agente farmacológico o farmacéuticamente efectivo. 110. El método de la reivindicación 99, donde A-X se selecciona a partir del grupo que consiste en un agente quimiote-rapéutico o anti-cáncer, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente anti-microbiano, un agente amebicida, un agente tricomonocida, un agente anti-Parkinson, un agente antimalaria, un agente anti-convulsivo, un agente anti-depresivo, un agente anti-artritis, un agente anti-hongos, un agente antihipertensión, un agente anti-pirético, un agente anti-parásitos , un agente anti-histamínico , un agente agonista alfa-adrenérgico , un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador del canal de calcio, un agente de fármacos cardiovasculares, un agente contraceptivo, un agente descongesti- vo, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un inductor de sueño, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente antiinflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de enzima convertidora de angiotensina . 111. El método de la reivindicación 99, donde A-X es un agente anti-cáncer o combinación de agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en Aclacinomicinas, Actinomicinas, Adriamicinas , Ancitabinas, Antramicinas , Azacitidinas , Azaseri-nas, 6-Azauridinas , Bisantrenos, Bleomicinas, Cactinomicinas , Carmofuros, Carmustinas, Carubicinas, Carzinofilinas , Cromomici-nas, Cisplatinas, Cladribinas, Citarabinas, Dactinomicinas , Daunorabicinas , Denopterinas , 6-Diazo-5-oxo-L-norleucinas, Doxifluridinas, Doxorubicinas, Edatrexatos, Emitefuros , Enocita-binas, Fepirubicinas, Fludarabinas, Fluorouracilos, Gemcitabinas, Idarubicinas , Loxuridinas, Menogarilos, 6-Mercaptopurinas , Metotrexatos , Mitramicinas, Mitomicinas , Ácidos micofenólicos, Nogalamicinas , Olivomicinas , Peplomicina, Pirarubicinas , Piritreximos, Plicamicinas, Porfiromicinas , Pteropterinas , Puromicinas, Ácidos retinoicos, Estreptonigrinas, Estreptozoci- nas, Tagafuros, Tamoxifenos, Tiamiprinas , Tioguaninas, Triamcino-lonas, Trimetrexatos, Tubercidinas , Vinblastinas , Vincristinas , Zinostatinas , y Zorubicinas. 112. El método de la reivindicación 99, donde A-X es un anticuerpo u otra proteina teniendo actividad anti-cáncer o quimioterapéutica . 113. El método de la reivindicación 99, donde A-X es un agente antibiótico o combinación de agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en Aminoglicósidos ; Amfenicoles ; Ansamicinas ; Carbacefemos ; Carbapenemos ; Cefalosporinnas o Cefemos; Cefamicinas; Clavamos; Lipopéptidos cíclicos; Diaminopi-rimidinas; Cetólidos; Lincosamidas ; Macrólidos; onobactamas ; Nitrofuranos; Oxacefemos; Oxazolidinonas ; Penemos, tienamicinas y beta-lactamas misceláneas; Penicilinas; Polipéptidos antibióticos; Quinolonas; Sulfonamidas; Sulfonas; Tetraciclinas ; y otros antibióticos (tales como Clofoctoles, Ácidos fusídicos, Hexedi-nas, Metenaminas, Nitrofurantoínas, Nitroxolinas, Ritipenemos, Taurolidinas , Xibomoles). 114. El método de la reivindicación 94, donde la sHASEGP es una sHASEGP humana. 115. El método de la reivindicación 114, donde la sHASEGP humana es una sHASEGP PH20. 116. El método de la reivindicación 115, donde la sHASEGP es un polipéptido soluble como se expresa en la SEQ ID NO: 4. 117. El método de la reivindicación 94, donde la sHASEGP es una sHASEGP PEGilada o super-sialada . 118. El método de la reivindicación 116, donde la sHASEGP es una sHASEGP PH20 humana PEGilada. 119. Un método para mejorar las consecuencias de apoplejía u otra lesión del SNC en un mamífero, comprendiendo introducir una sHASEGP hacia un mamífero siguiendo dicha apoplejía o lesión del SNC. 120. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 12 o 19, donde el polímero es PEG. 121. El polipéptido de la reivindicación 120, donde el polipéptido comprende por lo menos tres fracciones PEG por polipéptido . 122. El polipéptido de la reivindicación 120, donde dichas fracciones PEG son ramificadas. 123. El polipéptido de la reivindicación 120, donde dichas fracciones PEG se seleccionan a partir del grupo que consiste en mPEG-SBA (5 kDA) , mPEG-SBA (20 kDa) , mPEG-SBA (30 kDa), mPEG-SMB (20 kDa), mPEG-SMB (30 kDa), mPEG-butiraldehído (30 kDa), mPEG-SPA (20 kDa), mPEG-SPA (30 kDa), mPEG2-NHS (10 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (20 kDa, ramificado), mPEG-NHS (40 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (60 kDa, ramificado), PEG-NHS-biotina (5 kDa, biotinilado) , PEG-p-nitrofenil-carbonato (30 kDa) y PEG-propionaldehído (30 kDa) . 124. Un método para preparar un polipéptido PEGilado, comprendiendo hacer reaccionar un polipéptido de cualquiera una de las reivindicaciones 12 o 19 con un exceso molar de un reactivo PEG seleccionado a partir del grupo que consiste en un PEG-butanoato de succinimidilo, un PEG-metilbutanoato de succinimidilo, un PEG-propionato de succinimidilo, un PEG-N-hidroxisuccinimida, un PEG-aldehido, un PEG-carbonato, un PEG-propionaldehido y un PEG-maleimida . 125. El método de la reivindicación 124, donde el reactivo PEG se selecciona a partir del grupo que consiste en mPEG-SBA (5 kDA) , mPEG-SBA (20 kDa) , mPEG-SBA (30 kDa) , mPEG-SMB (20 kDa), mPEG-SMB (30 kDa), mPEG-butiraldehido (30 kDa), mPEG-SPA (20 kDa), mPEG-SPA (30 kDa), mPEG2-NHS (10 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (20 kDa, ramificado), mPEG-NHS (40 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (60 kDa, ramificado), PEG-NHS-biotina (5 kDa, biotini-lado) , PEG-p-nitrofenil-carbonato (30 kDa) y PEG-propionaldehido (30 kDa) . 126. Un polipéptido PEGilado producido de acuerdo con el método de la reivindicación 124. 127. Un polipéptido PEGilado producido de acuerdo con el método de la reivindicación 125. 128. Una hialuronidasa PEGilada, donde la hialuronida-sa comprende por lo menos alrededor de tres fracciones PEG por polipéptido . 129. La hialuronidasa de la reivindicación 128, donde dichas fracciones PEG son ramificadas. 130. La hialuronidasa de la reivindicación 128, donde dichas fracciones PEG se seleccionan a partir del grupo que consiste en mPEG-SBA (5 kDA) , mPEG-SBA (20 kDa) , mPEG-SBA (30 kDa), mPEG-SMB (20 kDa), raPEG-SMB (30 kDa), mPEG-butiraldehido (30 kDa), mPEG-SPA (20 kDa), mPEG-SPA (30 kDa), mPEG2-NHS (10 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (20 kDa, ramificado), mPEG-NHS (40 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (60 kDa, ramificado), PEG-NHS-biotina (5 kDa, biotinilado) , PEG-p-nitrofenil-carbonato (30 kDa) y PEG-propionaldehido (30 kDa). 131. La hialuronidasa de la reivindicación 128, donde la hialuronidasa es una sHASEGP PEGilada. 132. La hialuronidasa de la reivindicación 128, donde la hialuronidasa es una rHuPH20 PEGilada. 133. La hialuronidasa de la reivindicación 128, donde la hialuronidasa es una hialuronidasa derivada de animales o derivada de bacterias PEGilada. 134. Un método para preparar una hialuronidasa PEGilada, comprendiendo hacer reaccionar una hialuronidasa con un exceso molar de un reactivo PEG seleccionado a partir del grupo que consiste en un PEG-butanoato de succinimidilo, un PEG-metilbutanoato de succinimidilo, un PEG-propionato de succinimidilo, un PEG-N-hidroxisuccinimida, un PEG-aldehido, un PEG-carbonato, un PEG-propionaldehido y un PEG-maleimida . 135. El método de la reivindicación 134, donde el reactivo PEG se selecciona a partir del grupo que consiste en mPEG-SBA (5 kDA) , mPEG-SBA (20 kDa), mPEG-SBA (30 kDa), mPEG-SMB (20 kDa), mPEG-SMB (30 kDa), mPEG-butiraldehido (30 kDa) , mPEG-SPA (20 kDa) , mPEG-SPA (30 kDa) , mPEG2-NHS (10 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (20 kDa, ramificado), mPEG-NHS (40 kDa, ramificado), mPEG2-NHS (60 kDa, ramificado), PEG-NHS-biotina (5 kDa, biotini-lado) , PEG-p-nitrofenil-carbonato (30 kDa) y PEG-propionaldehido (30 kDa) . 136. Una hialuronidasa PEGilada producida de acuerdo con el método de la reivindicación 134. 137. Una hialuronidasa PEGilada producida de acuerdo con el método de la reivindicación 135. 138. Un método para suministrar una molécula a un tejido conteniendo cantidades en exceso de glicosaminoglicano, comprendiendo: administrar una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128 a un tejido en una cantidad suficiente para degradar glicosaminoglicanos lo suficiente para abrir canales menores que alrededor de 500 nm de diámetro; y administrar una molécula al tejido que comprende los glicosaminoglicanos degradados . 139. Una composición farmacéutica, comprendiendo una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128 y un portador farmacéutico . 140. Un método para incrementar la difusión de una sustancia terapéutica u otra molécula o complejo macromolecular (cada uno un Agente) menor que alrededor de 0.5 mieras de diámetro en un sujeto, que comprende: administrar a un sujeto una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128 en una cantidad suficiente para abrir o para formar canales menores que alrededor de 0.5 mieras de diámetro y un Agente, con lo cual la difusión del Agente se incrementa . 141. El método de la reivindicación 140, donde el Agente se selecciona a partir del grupo de agentes que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente anti-inflamatorio, un agente anti-microbiano, un agente amebici-da, un agente tricomonocida, un agente anti-Parkinson, un agente anti-malaria, un agente anti-convulsivo, un agente anti-depresi-vo, un agente anti-artritis , un agente anti-hongos, un agente anti-hipertensión, un agente anti-pirético, un agente antiparásitos, un agente anti-histaminico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador del canal de calcio, un agente de fármacos cardiovasculares, un agente contraceptivo, un agente descongestivo, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un inductor de sueño, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente anti-inflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de enzima convertidora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, o una molécula orgánica . 142. Un kit, comprendiendo: (a) una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128 en una dosis entre 0.1 y 1,500 Unidades/ml en un portador aceptable; (b) por lo menos una sustancia terapéutica u otra molécula o complejo macromolecular (cada uno un Agente) en un portador aceptable; y (c) opcionalmente, instrucciones para entregar sustancias terapéuticas u otros Agentes. 143. Un método para remoción de glicosaminoglicanos del humor vitreo que comprende: administración de una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128. 144. Un método para inducir licuefacción del humor vitreo para tratar un desorden de un ojo de mamífero comprendiendo poner en contacto el humor vitreo con una cantidad de una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128 para efectivamente licuar dicho humor vitreo con lo cual el desorden es tratado. 145. Un método para mejorar las consecuencias de apoplejía u otra lesión del SNC en un mamífero, comprendiendo introducir una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128 en un mamífero después de dicha apoplejía o lesión del SNC. 146. Un método para introducir uno o mas agentes farmacológicos u otros (A-X) dentro de un tejido del cuerpo comprendiendo administrar una hialuronidasa PEGilada de la reivindicación 128 a dicho tejido previo a o coincidente con administrar dicho agente. 147. El método de la reivindicación 146, donde A-X se selecciona a partir del grupo que consiste en una molécula detectable u otro agente de diagnóstico, un anestésico u otro agente modificador de tejido, un agente farmacológico o farmacéuticamente efectivo, y un cosmético u otro agente estético. 148. El método de la reivindicación 146, donde A-X es un agente anti-cáncer o un agente anti-infectivo . 149. El método de la reivindicación 146, donde A-X es un agente farmacológico modificador de sangre. 150. El método de la reivindicación 146, donde A-X es una molécula o complejo macromolecular de entre alrededor de 20 y 200 nm de diámetro. 151. El método de la reivindicación 146, donde A-X se selecciona a partir del grupo que consiste en Adalimumabs (v.gr., Humira) , Agalsidasas Betas (v.gr., Fabrazyme) , Aldesleucinas (PROLEUKIN IL-2) , Alefaceptos (v.gr., Amevive), Ampicilinas (v.gr., Inyección de UNASYN) , Anaquinras (v.gr., Kineret) , Vacunas Antipoliomieliticas (v.gr., PEDIARIX) , Anti-Timocitos (v.gr., THYMOGLOBULIN) , Azitromicinas (v.gr., Zithromax IV), Becaplerminas (v.gr., Regranex), Caspofunginas (v.gr., Cancidas) , Cefazolinas (v.gr., ANCEF y CEFAZOLIN) , Cefepimas (v.gr., Maxipime) , Cefotetanos (v.gr., CEFOTAN) , Ceftazidimas (v.gr., FORTAZ) , Ceftriaxonas (v.gr., Rocefin) , Cetuximabs (v.gr., Erbitux) , Cilastatinas (v.gr., Primaxin IV), Ácidos Clavulánicos (v.gr., en conjunto con Amoxicilinas tales como en AUGMENTIN) , Clindamicinas (v.gr., CLEOCIN) , Darbepoetinas Alfas (v.gr., Aranesp) , Deaclizumabs (v.gr., Zenapax) , Toxoides de Difteria (típicamente en combinaciones v.gr., DAPTACEL, Infarix y PEDIARIX), Efalizumabs (v.gr., Raptiva) , Epinefrinas (v.gr., EPIPEN) , Eritropoietinas Alfas (v.gr., Epogen y Procrit), Etanerceptos (v.gr., Enbrel) , Filgrastimas (v.gr., Neupogen) , Fluconazolas (v.gr., Inyección de DIFLUCAN) , Hormonas Estimulantes de Folículos tales como Folitropinas Alfas (v.gr., GONAL-F) y Folitropinas Betas (v.gr., Follistim) , Fosfenitoínas (v.gr., CEREBYX) , Fluconazolas (v.gr., Diflucan) , Gadodiamidas (v.gr., OMNISCAN) , Gadopentetatos (v.gr., MAGNEVIST) , Gatifloxacinas (v.gr., Tequin) , Glatirámeros (v.gr., Copaxone) , G -CSF's (v.gr., Leukine) , Gosereiinas (v.gr., Zoladex) , Granisetrones (v.gr., Kytril), Hemofilus Influenza B's (v.gr., COMVAX y HibTITER) , Haloperidoles (v.gr., HALDOL) , Vacunas de Hepatitis A (v.gr., HAVRIX, T INRIX y VAQTA) , Vacunas de Hepatitis B (v.gr., recombinantes COMVAX, ENGERIX-B, RECOMBIVAX-HB, TWINRIX, y no recombinantes BAYHEP-B y NABFM-HB) , Ibritumomab Tiuxetanos (v.gr., Zevalin) , Inmunoglobulinas (incluyendo mezclas de inmunoglobulinas tales como GA MAGARD y similares, asi como cualquiera de una variedad de inmunoglobulinas purificadas) , Vacunas del Virus de Influenza (v.gr., FLUMIST) , Infliximabs (v.gr., Remicade), Insulinas (v.gr., HUMALOG, HUMALOG MIX 75/25, productos HUMULIN (incluyendo 50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra y Ultralente) , y NOVOLIN) , Insulinas Glargines (v.gr., Lantus), Interferones Alfa-2a's (ROFERAN-A) , Interferones Alfa-2b's (v.gr., Intron-A) , Interferones Alfacon-l's (v.gr., INFERGEN) , Interferones Alfa-n3s (v.gr., ALFERON N) , Interferones Betas (v.gr., Betaseron y Betaferon) , Interferones Beta-la' s (v.gr., Avonex y Rebif ) , Interferones Gammas (v.gr., ACTIMMUNE) , Iodixanoles (v.gr., VISIPAQUE) , Iohexoles (OMNIPAQUE) , Iopamido-les, Ioversoles (v.gr., OPTIRAY) , Cetorolacos (v.gr., TORADOL) , Laronidasas (v.gr., Aldurazyme) , Levofloxacinas (v.gr., Leva-quin) , Lidocainas, Linezolidas (v.gr., ZYVOX) , Lorazepamos (v.gr., ATIVAN) , Vacunas de Sarampión (v.gr., ATTENUVAX) , Vacunas de Virus de Sarampión-Paperas-Rubeola (v.gr., M-M-R II), Medroxiprogesteronas (v.gr., Depo-Provera) , Meropenemos (v.gr., MERREM IV), Metilprednisolonas (v.gr., Solu-Medrol ) , Midazolamos (v.gr., VERSED) , Morfinas (v.gr., ASTRAMORPH/PF) , Octreotidas (v.gr., Sandostatin) , Omalizumabs (v.gr., Xolair) , Ondansetronas (v.gr., Zofran) , Palivizumabs (v.gr., Synagis), Pantoprazolas (v.gr., Protonix) , Pegaspargasas (v.gr., ONCASPAR) , Pegfilgrasti-mas (v.gr., Neulasta) , Peg-Interferones Alfa-2a's (v.gr., PegASYS), Peg-Interferones Alfa-2b's (v.gr., Peg-Intron) , Pegvisomantos (v.gr., SOMAVERT) , vacunas de Pertussis, Piperaci-linas (v.gr., Zosyn), Vacunas de Neumococos (v.gr., PNEU O V AX3) y Vacunas de Conjugado de Neumococos (v.gr., PREVNAR) , Prometazi-nas (v.gr., Phenergan) , Reteplasas (v.gr., Retavase) , Somatropi-nas (v.gr., GENOTROPIN, HUMATROPE, NORDITROPIN, NUTROPIN, SAIZEN, SEROSTIM, ZORBTIVE) , Sulbactamas, Sumatriptanos (v.gr., Imitrex) , Tazobactamas , Tenecteplasas (v.gr., Tnkase) , Toxoides Purificados de Tétano, Ticarcilinas (v.gr., TIMENTIN) , Tositumomabs (v.gr., Bexxar) , Triamcinolona Acetonidas, Vancomicinas (v.gr., Vanco-cin) , Vacunas de Varicela (v.gr., VARIVAX) , y otras vacunas. 152. El método de la reivindicación 146, donde A-X es un agente antibiótico o combinación de agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en Aminoglicósidos ; Amfenicoles; Ansamicinas; Carbacefemos ; Carbapenemos ; Cefalosporinas o Cefemos; Cefamicinas ; Clavamos; Lipopéptidos cíclicos; Diaminopi-rimidinas; Cetólidos; Lincosamidas ; Macrólidos; Monobactamas ; Nitrofuranos ; Oxacefemos; Oxazolidinonas; Penemos, tienamicinas y beta-lactamas misceláneas ; Penicilinas; Polipéptidos antibióticos; Quinolonas; Sulfonamidas ; Sulfonas; Tetraciclinas ; y otros antibióticos (tales como Clofoctoles, Ácidos fusídicos, Hexedi-nas, Metenaminas, Nitrofurantoínas, Nitroxolinas, Ritipenemos, Taurolidinas , Xibomoles) . 153. El método de la reivindicación 146, donde A-X es un agente anti-cáncer o combinación de agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en Aclacinomicinas, Actinomicinas , Adriamicinas, Ancitabinas, Antramicinas , Azacitidinas, Azaseri-nas, 6-Azauridinas , Bisantrenos, Bleomicinas, Cactinomicinas, Carmofuros, Carmustinas, Carubicinas, Carzinofilinas, Cromomici-nas, Cisplatinas, Cladribinas, Citarabinas, Dactinomicinas, Daunorabicinas , Denopterinas , 6-Diazo-5-oxo-L-norleucinas , Doxifluridinas , Doxorubicinas, Edatrexatos, Emitefuros, Enocita-binas, Fepirubicinas, Fludarabinas , Fluorouracilos , Gemcitabinas , Idarubicinas , Loxuridinas, Menogarilos, 6-Mercaptopurinas, Metotrexatos, Mitramicinas, Mitomicinas, Ácidos micofenólicos, Nogalamicinas , Olivomicinas, Peplomicina, Pirarubicinas, Piritreximos , Plicamicinas, Porfiromicinas, Pteropterinas, Puromicinas, Ácidos retinoicos, Estreptonigrinas, Estreptozoci-nas, Tagafuros, Tamoxifenos, Tiamiprinas, Tioguaninas, Triamcino-lonas, Trimetrexatos , Tubercidinas , Vinblastinas , Vincristinas , Zinostatinas , y Zorubicinas.
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