JP2023533813A - 一定用量配合剤のアッセイ - Google Patents

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Abstract

一定用量配合剤の品質および量の属性を分析するアッセイが提供される。特に、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤について、ならびにペルツズマブおよびトラスツズマブを含む皮下製剤についてのアッセイが、本明細書に記載される。【選択図】なし

Description

本発明は、一定用量配合剤の品質および量の属性を分析するアッセイに関する。特に、本発明は、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤について、ならびにペルツズマブおよびトラスツズマブを含む皮下製剤についてのアッセイに関する。
生物医薬品剤の安全性および有効性を確実にするためには、製品品質を連続的にモニターする必要がある。製品バッチが放出される前には、重要品質属性（ＣＱＡ）を含むある特有の基準が満たされる必要がある。重要品質属性（ＣＱＡ）は、所望の製品品質、安全性および有効性を確実にする適切な限度、範囲または分配の範囲内でなければならない物理的、化学的、生物学的または微生物学的性質または特性である。
力価試験は、他の多数の試験と共に、製品の適合試験、比較可能性研究および安全性試験の一部として実施される。これらの試験は、製品品質および製造管理に関連する製品属性を測定するために使用され、臨床試験の全段階に使用される製品の素性、純度、強度（力価）および安全性を確実にするために実施される。同様に、力価測定は、定義された特異化または許容基準を満たす製品ロットのみが臨床調査の全段階に投与されることを実証するため、および後の販売許可のために使用される。
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、治療用タンパク質の詳細な特徴づけに広く使用され、電荷不均一性の定性的および定量的評価の参照的で強力な技術と考慮することができる。ＩＥＸは、典型的には、特異化が特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の酸性種、主要種および塩基性種それぞれの分配によって設定される放出方法である。これらの荷電種は、力価に影響を与えうる製品関連不純物と考慮される。さらに、変性が加えられていない天然であることの確証によってタンパク質を特徴づけることができる、数少ない方法のうちの１つである。ＩＥＸはまた、ある特定の生物学的製剤の素性方法として使用することもでき、安定性および貯蔵寿命の正当化のための常套的試験である。
量は、通常、タンパク質含有量として測定されるＣＱＡである。生物工学的および生物学的製品にとって重要であり、通常は物理化学的性格の適切なアッセイを使用して決定されるべきである。大部分の生物医薬品剤では、タンパク質含有量は、ＵＶ吸収により測定される。
一定用量配合剤（ＦＤＣ）は、２つの異なる活性成分を単一投与製剤に組み合わせる。２つの抗ＨＥＲ２抗体のトラスツズマブおよびペルツズマブとヒアルロニダーゼ酵素との組み合わせは、２つの高度に類似したモノクローナル抗体の合剤（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の史上初の臨床開発である。ペルツズマブおよびトラスツズマブの作用機序は、両方ともＨＥＲ２受容体に結合するが異なる場所に結合するので、互いに補完すると考えられる。ペルツズマブとトラスツズマブの配合剤は、ＨＥＲシグナル伝達経路のより包括的な二重遮断を提供すると考えられる。ＩＶハーセプチンおよび化学療法と組み合わせたパージェタの標準ＩＶ製剤（パージェタベースレジメン）は、早期および転移性ＨＥＲ２陽性乳がんの両方の治療のために１００を超える国々で承認されている。ネオアジュバント早期乳がん（ｅＢＣ）設定では、パージェタベースレジメンは、ハーセプチンおよび化学療法と比較して、ほぼ二倍のｐＣＲ率を示している。加えて、配合剤は、アジュバントｅＢＣ設定において浸潤性疾患の再発または死亡のリスクを有意に低減することを示している。転移性設定において、配合剤は、ＨＥＲ２陽性転移性乳がんを有する、これまで治療を受けていない（第一線）患者に前例のない生存利益を示している。
ＦＤＣ中の酵素ヒアルロニダーゼは、適切な共投与治療薬のＳＣ薬物送達を可能にし、最適化する。組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）は、体内のグリコサミノグリカンまたは天然糖類鎖であるヒアルロナンを一時的に分解して、他の注射治療薬の分散および吸収を助ける酵素である。
トラスツズマブおよびペルツズマブは、９３％を超える配列同一性を有し、合計で３０Ｄａだけが異なっている。両方の抗体は、およそ１４８ｋＤａの分子量を有し、ほぼ同じ等電点を有する。これらは同じ標的（ＨＥＲ２）に結合し、ｉｎ ｖｉｖｏで相乗効果を有する。構造的および機能的な類似性のために、大部分の通常分析方法をこの合剤に適用することができない。
一実施形態において、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）の結合アッセイであって、
ａ．ＦＤＣを、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを含む捕獲試薬と接触させることと；
ｂ．試料を検出可能な抗体と接触させることと；
ｃ．捕獲試薬に結合した抗体のレベルを、検出可能な抗体の検出手段を使用して定量化することと、
を含む、結合アッセイが提供される。
一実施形態において、一定用量配合剤は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体、およびＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体を含む。
一実施形態において、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）のための結合アッセイが提供され、ここでＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合が定量化される。
一実施形態において、捕獲試薬は、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩＩを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２または配列番号２３を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２４を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、ＨＥＲ２サブドメインＩＶを含まない。
一実施形態において、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）のための結合アッセイが提供され、ここでＨＥＲ２サブドメインＩＩに結合する抗体の結合が定量化される。一実施形態において、捕獲試薬は、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩＶを含む。
一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号４または配列番号２８を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、ＨＥＲ２サブドメインＩＩを含まない。一実施形態において、捕獲試薬は、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＥＧＦＲのドメインＩＩを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２９を含む。
一実施形態において、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）のための結合アッセイが提供され、ここで結合アッセイは抗ＨＥＲ２抗体のうちの１つの生物活性を分析するためのものである。一実施形態において、生物活性は、細胞ベースアッセイにおいて測定して、捕獲試薬に結合した抗体のレベルを、単離抗体の生物活性と相関させることによって定量化される。
一実施形態において、捕獲試薬は、マイクロタイタープレートにコートされる。一実施形態において、検出可能な抗体は、抗ＨＥＲ２抗体のＦ（ａｂ’）２部分を標的にする。
一実施形態において、結合アッセイにより分析される一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。
一実施形態において、配列番号２４を含む単離タンパク質が提供される。一実施形態において、配列番号２９を含む単離タンパク質が提供される。
さらに提供されるものは、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する第１の抗体および第２の抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合を特異的に定量化するキットであって、
ａ．配列番号１、配列番号２および配列番号３４を含むタンパク質を捕獲試薬として含有する容器と、
ｂ．ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合を定量化するための指示書と、
を含むキットである。
さらに提供されるものは、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体および第２の抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体の結合を特異的に定量化するキットであって、
ａ．配列番号３３、配列番号３６、配列番号３および配列番号４を含むタンパク質を捕獲試薬として含有する容器と、
ｂ．ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体の結合を定量化するための指示書と、
を含む、キット。
本発明の別の態様において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法であって、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５であることと、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７であることと、
を含む、方法が提供される。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む。
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、上記のペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法は、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。一実施形態において、分析されるペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。
一実施形態において、組成物を作製する方法であって、（１）ペルツズマブ、トラスツズマブおよびこれらの１つまたは複数の変異体を含む一定用量配合剤を生産すること、ならびに（２）そのように生産された組成物を分析アッセイに付して、変異体の量を評価することを含み、変異体が、（ｉ）ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ、ペルツズマブＦＣシアル酸変異体およびペルツズマブリジン糖化変異体、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体、（ｖｉ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを含む、方法が提供される。
一実施形態において、組成物を作製する方法であって、工程（２）の分析アッセイが、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５であることと、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７であることと、
を含む方法が提供される。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む。
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、工程（２）の分析アッセイは、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。
一実施形態において、工程（１）のペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。
一実施形態において、工程（１）のペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２３％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２３％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも３８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを９％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２１％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも２３％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ピーク１～３の合計の２３％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも２８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも１６％のピーク領域、およびピーク８の１２％未満のピーク領域を含み、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５である工程と、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７である工程と、
を含む方法によって決定される。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、上記のペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法は、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ピーク１～３の合計の２３％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも３８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも１６％のピーク領域、およびピーク８の９％未満のピーク領域を含み、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５である工程と、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７である工程と、
を含む方法によって決定される。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む。
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、上記のペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法は、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ピーク１～３の合計の２１％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも２８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも２３３％のピーク領域、およびピーク８の１２％未満のピーク領域を含み、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５である工程と、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７である工程と、
を含む方法によって決定される。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む。
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、上記のペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法は、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
本発明の更なる態様において、本明細書に提供される組成物は、以下の工程：
ａ．所定量のペルツズマブを配合容器に添加する工程と、
ｂ．トラスツズマブを、トラスツズマブとペルツズマブの１：１の比またはトラスツズマブとペルツズマブの１：２の比で添加する工程と、
ｃ．ｒＨｕＰＨ２０を添加する工程と、
を含む方法により得られる。
さらなる態様において、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法であって、
ａ．ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカラムを準備することと；
ｂ．２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）をＲＰ－ＨＰＬＣカラムに装填することと；
ｃ．２つの抗ＨＥＲ２抗体を０．２～０．４ｍＬ／分の流量で分離し、カラム温度が６４℃～７６℃であることと、
を含む方法が提供される。
一実施形態において、一定用量配合剤は、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、工程ｃ）の分離は、水－２－プロパノール／アセトニトリル勾配で達成される。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、工程ｃ）の流量は約０．３ｍＬ／分である。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、抗体は１０～２０分間にわたって分離される。１つのそのような実施形態において、抗体は１５分間にわたって分離される。一実施形態において、抗体は、約０．３ｍＬ／分の流量で１５分間にわたって分離される。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、カラム温度は７０℃＋－２℃である。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、フェニルカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラム、Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｈｅｎｙｌ－１（Ｄｉｏｎｅｘ）、Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）ＸＲｓ Ｄｉｐｈｅｎｙｌ、Ｐｉｎｎａｃｌｅ（登録商標）Ｂｉｐｈｅｎｙｌ、Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｈｅｘｙｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ａｓｃｅｎｔｉｓ ＰｈｅｎｙｌおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ ｍＡｂ Ｄｉｐｈｅｎｙｌの群から選択されるカラムである。
ＨＥＲ２タンパク質構造、およびその細胞外ドメインのドメインＩ～ＩＶ（それぞれ、配列番号１～４）についてのアミノ酸配列の模式図を提供する。 マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（それぞれ、配列番号５および６）の可変軽鎖（ＶＬ）（図２Ａ）ドメインおよび可変重鎖（ＶＨ）（図２Ｂ）ドメイン；変異体５７４／ペルツズマブ（それぞれ、配列番号７および８）のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍ κ１、軽鎖カッパサブグループＩ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖サブグループＩＩＩ）（それぞれ、配列番号９および１０）のアミノ酸配列のアライメントを描画する。アスタリスクは、ペルツズマブの可変ドメインとマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間の、またはペルツズマブの可変ドメインとヒトフレームワークとの間の差異を明らかにする。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、角括弧内にある。 ペルツズマブ軽鎖（図３Ａ：配列番号１１）および重鎖（図３Ｂ：配列番号１２）のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲを太線で示す。軽鎖および重鎖の計算された分子量は、２３，５２６．２２Ｄａおよび４９，２１６．５６Ｄａである（還元型におけるシステイン類）。炭化水素部分を重鎖のＡｓｎ２９９に結合させる。 トラスツズマブ軽鎖（配列番号１３）のアミノ酸配列を示す。可変軽鎖ドメインの境界を矢印で示す。 トラスツズマブ重鎖（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す。可変重鎖ドメインの境界を矢印で示す。 ペルツズマブ変異体の軽鎖配列（配列番号１５）を描写する。 ペルツズマブ変異体の重鎖配列（配列番号１６）を描写する。 ＨＥＲ２細胞外ドメイン、および本明細書に記載されるＥＬＩＳＡアッセイに有用な捕獲試薬の模式図を描写する。Ｐ－ＨＥＲ２変異体：ペルツズマブ力価を分析するための修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤである。Ｔ－ＨＥＲ２変異体：トラスツズマブ力価を分析するための修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤである。 細胞ベースアッセイにおける選択的感受性を描写する。図７Ａ：ＭＤＡ－ＭＢ－１７５ ＶＩＩ細胞を使用したペルツズマブ抗増殖アッセイである。図７Ｂ：ＢＴ－４７４細胞を使用したトラスツズマブ抗増殖アッセイである。 細胞ベース抗増殖アッセイにおけるペルツズマブおよびトラスツズマブの相補性機構を描写する。図８Ａ：ペルツズマブ抗増殖アッセイ：トラスツズマブを１：１比で添加すると、用量応答曲線は低濃度に向かってシフトする。図８Ｂ：トラスツズマブ抗増殖アッセイ：ペルツズマブを１：１比で添加すると、用量応答曲線は低濃度に向かって僅かにシフトする。 細胞ベース抗増殖アッセイにおける遮蔽効果を描写する。図９Ａ：ペルツズマブ抗増殖アッセイ：ＨＥＲ２に対するペルツズマブ突然変異体（ＨＣ Ｓ５５Ａ）の大きく低減された親和性であり（中実シンボル）、トラスツズマブの添加によりペルツズマブ突然変異体の親和性損失が遮蔽される（中空シンボル）。図９Ｂ：トラスツズマブ抗増殖アッセイ：ＨＥＲ２に対するトラスツズマブ突然変異体（ＬＣ Ｈ９１Ａ）の大きく低減された親和性であり（中実シンボル）、ペルツズマブの添加によりトラスツズマブ突然変異体の親和性損失が遮蔽される（中空シンボル）。 ペルツズマブＥＬＩＳＡの代表的な用量応答曲線を描写する。 トラスツズマブＥＬＩＳＡの代表的な用量応答曲線を描写する。 ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ電荷変異体を分析する、本明細書に提供されるＩＥＣ方法の代表的なクロマトグラムを示す。 ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ薬品、ペルツズマブおよびトラスツズマブのＩＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムを描写する。 ＥＬＩＳＡによりＨＥＲＴ２親和性突然変異体を示す。図１４Ａ：ペルツズマブＥＬＩＳＡ：ペルツズマブ（中実シンボル）と比較したＨＥＲ２（中空シンボル）へのペルツズマブ突然変異体（ＨＣ Ｓ５５Ａ）の大きく低減された結合活性である。図１４Ｂ：トラスツズマブＥＬＩＳＡ：トラスツズマブ（中実シンボル）と比較したＨＥＲ２（中空シンボル）へのトラスツズマブ突然変異体（ＬＣ Ｈ９１Ａ）の大きく低減された親和性である。 ＦＤＣ ＬＤ参照標準のタンパク質含有量を分析するＲＰ－ＵＨＰＬＣクロマトグラムの例を描写する。 ＦＤＣ ＭＤ参照標準のタンパク質含有量を分析するＲＰ－ＵＨＰＬＣクロマトグラムの例を描写する。
Ｉ．定義
「約」という用語は、本特許明細書に使用される場合、提供される特定の値がある程度まで変動しうることを明記することが意図され、例えば、＋１０％の範囲の変動が所定値に含まれることを意味する。一実施形態において、＋／－５％の範囲の変動が所定値に含まれる。
「ＨＥＲ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４受容体が挙げられる。ＨＥＲ受容体は、一般に、ＨＥＲリガンドが結合しうる、および／または別のＨＥＲ受容体分子により二量体化しうる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；ならびにリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ＨＥＲ受容体は、「天然配列の」ＨＥＲ受容体またはその「アミノ酸配列変異体」であってもよい。好ましくは、ＨＥＲ受容体は、天然配列のヒトＨＥＲ受容体である。
「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」という表現は、本明細書において互換的に使用され、例えば、Ｓｅｍｂａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２巻：６４９７～６５０１頁（１９８５年）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９巻：２３０～２３４頁（１９８６年）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｘ０３３６３）に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「ｅｒｂＢ２」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。好ましいＨＥＲ２は、天然配列のヒトＨＥＲ２である。
本明細書において、「ＨＥＲ２細胞外ドメイン」または「ＨＥＲ２ ＥＣＤ」は、細胞膜に固定されている、または循環中にその断片を含んでいる、のいずれか一方で細胞の外側にあるＨＥＲ２のドメインを指す。ＨＥＲ２のアミノ酸配列を図１に示す。一実施形態において、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、４つのサブドメイン：「サブドメインＩ」（約１～１９５のアミノ酸残基；配列番号１）、「サブドメインＩＩ」（約１９６～３１９のアミノ酸残基；配列番号２）、「サブドメインＩＩＩ」（約３２０～４８８のアミノ酸残基；配列番号３）および「サブドメインＩＶ」（約４８９～６３０のアミノ酸残基；配列番号４）（シグナルペプチドなしの残基番号付け）を含むことができる。Ｇａｒｒｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１１巻：４９５～５０５頁（２００３年）、Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ ４２巻：７５６～７６０頁（２００３年）、Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５巻：３１７～３２８頁（２００４年）およびＰｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０巻：１７４６～１７５０頁（１９９３年）、ならびに本明細書の図１を参照のこと。「組換えＨＥＲ２細胞外サブドメイン」または「組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメイン」は、対応する完全長または切断型天然ＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを含む。修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤの立体構造が天然ＨＥＲ２ ＥＣＤに可能な限りよく似るように、組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを６個のアミノ酸まで、好ましくはＣ末端で切断することができる。
「抗ＨＥＲ２抗体」または「ＨＥＲ２抗体」は、ＨＥＲ２受容体に結合する抗体である。任意選択で、ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２の活性化または機能にさらに干渉する。本明細書の目的の抗ＨＥＲ２抗体は、ペルツズマブおよびトラスツズマブである。
ＨＥＲ２の「細胞外サブドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩ（配列番号２）の残基に結合し、任意選択でＨＥＲ２の他のサブドメイン、例えば、サブドメインＩおよびＩＩＩ（それぞれ配列番号１および３）の残基に結合する。好ましくは、細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２の細胞外サブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの間の接合部に結合する。一実施形態において、細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体は、ペルツズマブまたはその変異体である。
本明細書における目的のために、「ペルツズマブ」および「ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４」は、互換的に使用され、それぞれ配列番号７および８の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。ペルツズマブがインタクトな抗体である場合、それは、好ましくはＩｇＧ１抗体を含み、一実施形態では、配列番号１１または１５の軽鎖アミノ酸配列および配列番号１２または１６の重鎖アミノ酸配列を含む。抗体は、任意選択で組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される。本明細書における「ペルツズマブ」および「ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４」という用語は、米国一般名称（ＵＳＡＮ）または国際一般名（ＩＮＮ）：ペルツズマブに関する薬物のバイオシミラーバージョンを網羅する。
ＨＥＲ２の「細胞外サブドメインＩＶに結合する」抗体は、ドメインＩＶ（配列番号４）の残基に結合し、任意選択でＨＥＲ２の他のサブドメインの残基に結合する。一実施形態において、細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体は、トラスツズマブまたはその変異体である。
本明細書における目的のために、「トラスツズマブ」および「ｒｈｕＭＡｂ４Ｄ５」は、互換的に使用され、それぞれ配列番号１３および１４の範囲内の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。トラスツズマブがインタクトな抗体である場合、それは、好ましくはＩｇＧ１抗体を含み、一実施形態では、配列番号１３の軽鎖アミノ酸配列および配列番号１４の重鎖アミノ酸配列を含む。抗体は、任意選択でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される。本明細書において、用語「トラスツズマブ」および「ｒｈｕＭＡｂ４Ｄ５」は、米国一般名称（ＵＳＡＮ）または国際一般名称（ＩＮＮ）：トラスツズマブに関する薬物のバイオシミラーバージョンを網羅する。
「合剤」という用語は、２つ以上の活性成分を含む単一のすぐに使用できる医薬製剤、例えば、皮下（ＳＣ）投与のために一緒に製剤化されたペルツズマブおよびトラスツズマブを含む単一のすぐに使用できる医薬製剤を指すために本明細書で使用される。
「一定用量配合剤」または「ＦＤＣ」という用語は、２つ以上の活性成分を含む単一のすぐに使用できる医薬製剤、例えば、皮下（ＳＣ）投与のために一緒に製剤化されたペルツズマブおよびトラスツズマブを含む単一のすぐに使用できる医薬製剤を指すために本明細書で使用される。「ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ」は、ペルツズマブ、トラスツズマブおよび任意選択でヒアルロニダーゼを含む。
「ヒアルロニダーゼ」または「ヒアルロニダーゼ酵素」という用語は、動物界全体に見出される一般に中性活性または酸活性酵素の群である。ヒアルロニダーゼは、基質の特異性および作用機序に関して異なっている（国際公開第２００４／０７８１４０号）。ヒアルロニダーゼには３つの一般的なクラスが存在する：１．主な最終生成物として四糖および六糖を有するエンド－β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼである、哺乳動物型ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）。それらは加水分解性活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸（ＣＳ）、一般にＣ４－ＳおよびＣ６－Ｓを分解することができる。２．細菌性ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．９９．１）は、ヒアルロナンを、様々な程度でＣＳおよびＤＳへと分解する。それらは、主に二糖の最終生成物を生じるベータ脱離反応により作動する、エンド－β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼである。３．ヒル、他の寄生生物および甲殻類からのヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）は、β１－３連結の加水分解を介して四糖および六糖の最終生成物を生成するエンド－ベータ－グルクロニダーゼである。哺乳動物ヒアルロニダーゼは、２つの群：中性活性酵素および酸活性酵素にさらに分けることができる。ヒアルロニダーゼ様酵素はまた、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー、例えば、ヒトＨＹＡＬ２およびヒトＰＨ２０を介して原形質膜に一般にロックされているもの［Ｄａｎｉｌｋｏｖｉｔｃｈ－Ｍｉａｇｋｏｖａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年；１００巻（８号）：４５８０～４５８５頁；Ｐｈｅｌｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８年；２４０巻（４８６０号）：１７８０～１７８２頁］、ならびに一般的に可溶性であるもの、例えばヒトＨＹＡＬ１［Ｆｒｏｓｔ，Ｉ．Ｇ．ら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７年；２３６巻（１号）：１０～１５頁］により特徴づけることもできる。ウシＰＨ２０は、原形質膜に非常に緩く結合し、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して固定されていない［Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２００１年；６５巻（２号）：６２８～３６頁］。このウシヒアルロニダーゼの独自の特色は、臨床使用のための抽出物としての可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素（Ｗｙｄａｓｅ（商標）、Ｈｙａｌａｓｅ（商標））の使用を可能にしている。他のＰＨ２０種は、一般に洗剤またはリパーゼの使用なしでは可溶性にならない脂質アンカー酵素である。例えば、ヒトＰＨ２０は、ＧＰＩアンカーを介して原形質膜に固定される。天然に存在するマカク精子ヒアルロニダーゼは、可溶性形態と膜結合形態の両方に見出される。６４ｋＤａの膜結合形態はｐＨ７．０で酵素活性を有するが、５４ｋＤａ形態はｐＨ４．０でのみ活性である［Ｃｈｅｒｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年；１０版；１７５巻（１号）：１４２～５３頁］。国際公開第２００６／０９１８７１号は、皮下組織への治療薬の投与を促進する、可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）を記載する。細胞外空間においてＨＡを素早く脱重合することによって、ｓＨＡＳＥＧＰは間質の粘性を低減し、それにより水伝導度を増加して、より大きな容量を安全および快適にＳＣ組織中に投与することが可能になる。好ましいヒアルロニダーゼ酵素は、ヒトヒアルロニダーゼ酵素、最も好ましくは、ｒＨｕＰＨ２０（ボルヒアルロニダーゼアルファ）として公知の組換えヒトヒアルロニダーゼ酵素である。ｒＨｕＰＨ２０は、Ｎ－アセチルグルコサミンのＣ１位置とグルクロン酸のＣ４位置との間のβ－１，４連結の加水分解によりヒアルロナンを脱重合する、中性および酸活性β－１，４グリコシルヒドロラーゼのファミリーのメンバーである。ＥＵ加盟国において承認されたヒアルロニダーゼ製品には、Ｈｙｌａｓｅ（登録商標）「Ｄｅｓｓａｕ」およびＨｙａｌａｓｅ（登録商標）が挙げられる。米国において承認された動物由来のヒアルロニダーゼ製品には、Ｖｉｔｒａｓｅ（商標）、Ｈｙｄａｓｅ（商標）およびＡｍｐｈａｄａｓｅ（商標）が挙げられる。
ｒＨｕＰＨ２０は、治療用途に現在利用可能な最初で唯一の組換えヒトヒアルロニダーゼ酵素である。ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（商標））のアミノ酸配列は周知であり、ＣＡＳ登録番号７５９７１－５８－７で入手可能である。およその分子量は６１ｋＤａである。一実施形態において、ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、ヒアルロニダーゼを任意選択で２０００Ｕ／ｍＬの濃度で含む。
本明細書における「負荷」量は、一般に、患者に投与される治療剤の初期量を含み、その後、１つまたは複数の維持量が続く。ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの負荷量（ＬＤ）は、４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブおよび２０００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含む。
本明細書における「維持」量は、治療期間にわたって患者に投与される治療剤の１つまたは複数の用量を指す。通常、維持量は、間隔を置いた治療間隔によって、例えば、ほぼ毎週、ほぼ２週間ごと、ほぼ３週間ごと、またはほぼ４週間ごと、好ましくは３週間ごとに投与される。ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの維持量（ＭＤ）は、６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブおよび２０００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含む。
本明細書に使用される場合、「捕獲試薬」は、被分析物に結合することができる任意の薬剤（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）を指す。好ましくは、「捕獲試薬」は、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤において抗ＨＥＲ２抗体により特異的に結合される任意の薬剤を指す。一定用量配合剤における２つの抗ＨＥＲ２抗体のうちの１つの結合を具体的に分析するため、捕獲試薬は、その抗体に特異的でなければならず、例えば、分析される抗体は、ＦＤＣの第２の抗ＨＥＲ２抗体より捕獲試薬に高い結合親和性および／または特異性を有するべきである。一実施形態において、アッセイに提供される捕獲試薬は、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤである。
「修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤ」は、１つまたは複数の組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを含む遺伝子操作されたタンパク質またはペプチドである。ＨＥＲ２ ＥＣＤは、ＦＤＣにおいて査定される抗ＨＥＲ２抗体のうちの１つが結合し、ＦＤＣにおける第２の抗ＨＥＲ２抗体が結合しないように修飾される。これは、第２の抗ＨＥＲ２抗体が結合するＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを省くこと、またはそれを抗ＨＥＲ２抗体のいずれにも結合しない構造的に近いサブドメインに置き換えること、のいずれかによって達成される。好ましくは、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、天然ＨＥＲ２ ＥＣＤを限りなく近く模倣するように構築される。サブドメインは、完全長でありうる、またはＮもしくはＣ末端で数個のアミノ酸により短縮されうる。ＨＥＲ２ ＥＣＤの三次元構造の完全性は、Ｃ末端で約４～５個のアミノ酸により短縮されている１つまたは複数の組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを使用すると保持または改善されることが、本発明の発明者たちによって見出されている。
本明細書における「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ドメインを定義するように使用される。Ｆｃドメインは、様々なものに由来し、例えば、マウス、ラット、ヤギまたはヒト由来のものでありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わりうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸びることが定義される。別途指示がない限り、本明細書において、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年）のようなＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
「検出可能な抗体」という用語は、本明細書に使用される場合、検出可能なシグナルを生成することができる薬剤または検出可能な標識に連結している抗体を指し、これを使用して、検出される被分析物（すなわち、抗ＨＥＲ２抗体）の存在および／または量を査定することができる。
「標識」または「検出可能な標識」という用語は、検出可能な抗体に連結することができる任意の化学基または部分である。検出可能な標識の例には、発光標識（例えば、蛍光標識、リン光標識、化学発光標識、生物発光標識および電気化学発光標識）、放射性標識、酵素、粒子、磁気物質、電気活性種などが挙げられる。あるいは、検出可能な標識は、特異的結合反応に関与することによってその存在をシグナル伝達しうる。このような標識の例には、ハプテン、抗体、ビオチン、ストレプトアビジン、Ｈｉｓタグ、ニトリロ三酢酸、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、グルタチオンなどが挙げられる。
「検出手段」という用語は、本明細書におけるアッセイで読み取られるシグナル報告を介して、検出可能な抗体の存在を検出するために使用される部分または技法を指す。「フォトルミネセンス」は、材料による光（電磁放射線．またはｅｍｒと代替的に称される）の吸収の後に、その材料が発光する過程である。蛍光およびリン光は、２つの異なるタイプのフォトルミネセンスである。「化学発光」の過程は、化学反応による発光種の創出を伴う。「電気化学発光」または「ＥＣＬ」は、ある種が、例えば目的の抗体が、適切な周辺化学環境下でその種の電気化学的エネルギーへの曝露時に発光する過程である。
本明細書に使用される場合、「ＥＬＩＳＡ」（酵素結合免疫吸着法としても公知である）という用語は、主に、生物学的試料中の抗体の存在を検出するために使用される生化学技術を指す。本出願の目的において、ＥＬＩＳＡ技術は、一定用量配合剤中の抗ＨＥＲ２抗体の検出および定量化のために使用される。ＥＬＩＳＡベースアッセイにとって典型的には、捕獲試薬は、固定化される、または固定化可能である。
本明細書において、「力価」は、生物治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ）の治療活性または意図される生物学的効果を指す。生物治療薬の力価は、前記生物治療薬の活性成分の生物活性を測定または定量化することによって決定することができる。
本明細書において、モノクローナル抗体の「生物活性」は、抗原に結合して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測定することができる測定可能な生物学的応答をもたらす抗体の能力を指す。一実施形態において、生物活性とは、本明細書に提供される結合アッセイにおいて捕獲試薬に結合する能力を指す。一実施形態において、ＦＤＣ中の抗ＨＥＲ２抗体の結合は、単一抗体製剤中の抗ＨＥＲ２抗体がヒト乳がん細胞株の増殖を阻害する能力に相関する。ペルツズマブを試験するために好適なヒト乳がん細胞株は、ＭＤＡ－ＭＢ－１７５－ＶＩＩである。トラスツズマブを試験するために好適なヒト乳がん細胞株は、ＢＴ－４７４である。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物活性を呈する限り抗体断片を網羅する。
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の超可変領域の残基を、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の超可変領域の残基で置き換えた抗体である。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、超可変ループのうちのすべて、または実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちのすべて、または実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、任意選択で免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２～５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３～３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２巻：５９３～５９６頁（１９９２年）を参照のこと。ヒト化ＨＥＲ２抗体には、参照により本明細書所に明示的に組み込まれる米国特徴５，８２１，３３７号の表３に記載され、本明細書に定義されているトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；ならびにヒト化２Ｃ４抗体、例えば、本明細書に記載および定義されているペルツズマブが具体的に挙げられる。
本明細書における「インタクトな抗体」は、２つの抗原結合領域および１つのＦｃ領域を含むものである。好ましくは、インタクトな抗体は、機能性Ｆｃ領域を有する。
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと位置が揃っており、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと位置が揃っている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に接触面を形成すると考えられている。
本明細書に使用されるとき、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン中の残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１年））、ならびに／または「超可変ループ」の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１～９１７頁（１９８７年））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、それらの、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体には、異なる「クラス」を割り当てることができる。インタクトな抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２にさらに分けてもよい。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
「ネイキッド抗体」は、異種分子、例えば細胞障害性部分または放射標識にコンジュゲートされない抗体である。
「親和性成熟」抗体は、その１つまたは複数の超可変領域内に１つまたは複数の改変を有し、これらの改変が、これらの改変を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改善をもたらす抗体である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル、またはさらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野に公知の手順によって産生される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：７７９～７８３頁（１９９２年）はＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１巻：３８０９～３８１３頁（１９９４年）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ １６９巻：１４７～１５５頁（１９９５年）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５巻：１９９４～２００４頁（１９９５年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４巻（７号）：３３１０～９頁（１９９５年）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６巻：８８９～８９６頁（１９９２年）に記載されている。
「バイアル」は、液体または凍結乾燥調製物を保持するのに好適な容器である。一実施形態において、バイアルは、使い捨てバイアル、例えば、栓の付いた１０ｍＬまたは２０ｍＬの使い捨てバイアル、例えば、２０ｍｍの栓が付いた１０ｍＬの使い捨てガラスバイアルである。
本明細書に使用される場合、「溶出」は、陽イオン交換材料を囲むバッファーのイオン強度を、バッファーがイオン交換材料の荷電部位の分子と競合するように改変することによって、陽イオン交換材料から目的のタンパク質（例えば、抗体）を除去することを指す。
本明細書に使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、混合物中の目的の溶質、例えば、目的のタンパク質を、方法の特定の緩衝条件下で溶質の性質、例えば、パイ、疎水性、サイズおよび構造に起因して多少は強く吸着または保持する吸着剤を通した混合物のパーコレーションによって、混合物中の他の溶質から分離する方法を指す。
「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、目的の溶質が混合物中の溶質不純物または夾雑物より多少は非特異的に荷電化合物と相互作用するようなｐＨおよび伝導性の適切な条件下で、目的のイオン化可能な溶質（例えば、ＦＤＣの抗体、ならびにこれらの酸性および塩基性変異体）が、固体相イオン交換材料に連結した（例えば、共有結合により）逆荷電リガンドと相互作用するクロマトグラフィーの方法を指す。
「イオン交換クロマトグラフィー」には、具外的に、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーが挙げられる。
「陽イオン交換材料」または「ＣＥＸ材料」は、負に荷電している、および固体相を通過する、または中を通る水溶液中の陽イオンとの交換のために遊離陽イオンを有する固体相である。陽イオン交換材料を形成するのに好適な固体相に結合した任意の負荷電リガンドを使用することができ、例えば、下記に記載されるカルボキシレート、スルホネートなどでありうる。市販の陽イオン交換材料には、例えば、スルホネートに基づいた基を有するもの（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商標）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ－６５０ＳおよびＳＰ－６５０Ｍ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｐａｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｓ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＭおよびＬＳ ＳＰ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＳＰ）；スルホエチルに基づいた基を有するもの（例えば、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ Ｓ－１０およびＳ－２０）；スルホプロピルに基づいた基を有するもの（例えば、ＴｏｓｏｈからのＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ ５ＰＷおよびＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ ＨＳ－２０およびＨＳ ５０）；スルホイソブチルに基づいた基を有するもの（例えば、ＥＭＤからの「Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３」）；スルホエチルに基づいた基を有するもの（例えば、ＷｈａｔｍａｎからのＳＥ５２、ＳＥ５３およびＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｓ）；カルボキシメチルに基づいた基を有するもの（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＣＭ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＣＭ、Ｐａｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＣＭ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭａｔｒｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ５００およびＣ２００、ＷｈａｔｍａｎからのＣＭ５２、ＣＭ３２、ＣＭ２３およびＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｃ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ－６５０Ｓ、ＣＭ－６５０ＭおよびＣＭ－６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸に基づいた基を有するもの（例えば、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＢＡＫＥＲＢＯＮＤ Ｃａｒｂｏｘｙ－Ｓｕｌｆｏｎ）；カルボン酸に基づいた基を有するもの（例えば、Ｊ．Ｔ ＢａｋｅｒからのＷＰ ＣＢＸ、Ｄｏｗ Ｌｉｑｕｉｄ ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ ＭＡＣ－３、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ ＥｘｃｈａｎｇｅｒおよびＤｉａｉｏｎ Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ－）；スルホン酸に基づいた基を有するもの（例えば、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＳＰ、Ｄｏｗ Ｌｉｑｕｉｄ ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ Ｓｔｒｏｎｇ Ａｃｉｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ、ＷＰ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ Ｓｔｒｏｎｇ ＣａｔｉｏｎおよびＤｉａｉｏｎ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；ならびにオルトホスフェートに基づいた基を有するもの（例えば、ＷｈａｔｍａｎからのＰＩ １）が挙げられるが、これらに限定されない。
荷電基／置換基の化学性に応じて、「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、共有結合荷電置換基の強さによって強または弱イオン交換材料と分類されうる。「強陽イオン交換材料」または「（ＳＣＸ）材料」は、本明細書に使用される場合、スルホン酸に基づいた基、例えば、スルホネート、スルホプロピル基、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムまたはポリＡＭＰＳ（ポリ（２－アクリルアミド－２－メチル－１－プロパンスルホン酸））を有する。
タンパク質または抗体の「等電点」または「ｐＩ」は、タンパク質または抗体の実効電荷が中性であるｐＨ値に対応する。ｐＩは、標準的な実験方法により、例えば、等電点電気泳動法または計算法（「理論的ｐＩ」）により決定することができる。計算法の例は、フリーオンライン標準ツールの「ＥｘＰＡＳｙ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／）であり、これはタンパク質または抗体のアミノ酸配列に基づいてｐＩを計算する。トラスツズマブの理論的ｐＩは８．４であり、ペルツズマブの理論的ｐＩは８．７である。
「移動相」は、クロマトグラフィー系の中を流れる液体または気体であり、分離されるべき材料を固定相において異なる速さで動かす。好ましくは、移動相は液体である。一例において、移動相は、ローディングバッファー（「移動相Ａ」）または溶出バッファー（「移動相Ｂ」）でありうる。
「ローディングバッファー」は、標的分子がイオン交換クロマトグラフィー材料のリガンドと有効に相互作用して、親和性媒体に保持され、他のすべての分子がカラムから洗い流されることを確実にする条件を提供する。
「溶出バッファー」を使用して、最初に非結合タンパク質を洗い出し、より大きな濃度で電荷変異体および天然抗体をリガンドから遊離させる。
本明細書における「主要種抗体」または「天然抗体」という用語は、組成物中で量的に優勢な抗体分子である、組成物中の抗体アミノ酸配列構造を指す。２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤に関して、２つの主要種抗体は組成物の一部である。よって、一実施形態において、主要種抗体は、ＨＥＲ２の細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体、および細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体である。一実施形態において、ＦＤＣの主要種抗体は、ペルツズマブおよびトラスツズマブである。
「電荷変異体」は、主要種抗体の変異体であり、主要種抗体と全体的に異なる電荷を有する。電荷変異体の例は、酸性変異体および塩基性変異体である。
「酸性変異体」は、主要種抗体の変異体であり、主要種抗体よりも酸性である。酸性変異体は、主要種抗体と比べて負電荷を得ている、または正電荷を失っている。そのような酸性変異体は、電荷に従ってタンパク質を分離する分離方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用して分解することができる。主要種抗体の酸性変異体は、陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離すると、主ピークより早く溶出する。ペルツズマブおよびトラスツズマブの酸性変異体は、本明細書に記載されているイオン交換クロマトグラフィーにより分離および定量化されうる。酸性ペルツズマブ変異体の例は、３９１位（ＨＣ－Ａｓｎ－３９１）の重鎖アスパラギンで脱アミド化されているペルツズマブ、ペルツズマブＦｃシアル酸変異体およびペルツズマブリジン糖化変異体である。酸性トラスツズマブ変異体の例は、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブおよびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブである。
「塩基性変異体」は、主要種抗体の変異体であり、主要種抗体よりも塩基性である。塩基性変異体は、主要種抗体と比べて正電荷を得ている、または負電荷を失っている。そのような塩基性変異体は、電荷に従ってタンパク質を分離する分離方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用して分解することができる。主要種抗体の塩基性変異体は、陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離すると、主ピークより遅く溶出する。ペルツズマブおよびトラスツズマブの塩基性変異体は、本明細書に記載されているイオン交換クロマトグラフィーにより分離および定量化されうる。
「勾配」という用語は、本明細書に使用される場合、クロマトグラフィー試料を流している最中の移動相の性質変化を意味する。「連続勾配」において、移動相の１つまたは複数の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度および／または移動相の流れは連続的に変化する、すなわち、上昇または低下する。変化は、直線的または指数関数的または漸近的でありうる。「段階的勾配」において、１つまたは複数の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度および／またはクロマトグラフィーの流れは、直線的変化と対照的に増加的に、すなわち段階的に変化しうる。
「ＲＰ－ＵＨＰＬＣ」という用語は、逆相超高速液体クロマトグラフィーを意味する。ＲＰ－ＨＰＬＣという用語は、逆相高速液体クロマトグラフィーを表す。ＨＰＬＣは、化合物を、化合物の極性およびカラムの固定相との相互作用に基づいて分離するために使用される。逆相クロマトグラフィーは、移動相が固定相より有意に極性である液体クロマトグラフィーに使用される溶出手順である。
「ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカラム」は、本明細書に使用される場合、カラム充填材料または樹脂（固定相）に存在する疎水性フェニル基を有するカラムを指す。例えば、フェニルカラムは、カラムの中を流れる材料を非置換フェニル基に曝露する。フェニルカラムは、例えば、シリカ表面またはジフェニル相に共有結合した短アルキルフェニルリガンドを含有する。一部のフェニルカラムは、フェニル基とシリカ表面の間にアルキルスペーサーを有するフェニル基を有する。アルキルスペーサーの長さを増加することによって、立体選択性および芳香族選択性が増強されうる。ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカルムは、芳香族基の数（モノフェニル対ビフェニル）、シリカ表面とフェニル基との間のアルキルスペーサーの長さ、結合リガンドの置換基の特質（典型的にはメチル、またはより立体的に嵩高のイソブチル基）、芳香族環のπ電子系を活性化するためのリンカー中への酸素原子の包含、および最後にシリカ固定表面がエンドキャップされているか否かにより異なっている。例えば、ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカルムは、以下の基：メチル側基およびエンドキャップされたシリカ表面を有するエチルフェニル、伸長した（ヘキシル）リガンドスペーサーメチル側基を有するフェニルヘキシル相、立体保護（イソブチル）側基を有するエチルフェニルリガンド、メチル側基を有するヘキシルビフェニル、メチル側基を有するビフェニル相、メチル側基を有する酸素活性化フェニルエチルフェニル相を有することができる。フェニル（例えば、単一フェニル、ビフェニル、ジフェニル、フェニルヘキシル、フェニルプロピル）で修飾された固定相を有するＨＰＬＣカラムは、大部分の主要なカラム供給会社から容易に入手可能であり、例えば、Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｈｅｎｙｌ－１（Ｄｉｏｎｅｘ）、Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）ＸＲｓ Ｄｉｐｈｅｎｙｌ、Ｐｉｎｎａｃｌｅ（登録商標）Ｂｉｐｈｅｎｙｌ、Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｈｅｘｙｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｐｈｅｎｙｌ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－ＤｉｐｈｅｎｙｌおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ ｍＡｂ Ｄｉｐｈｅｎｙｌである。
「がん」および「がん性」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す、または説明する。
「進行」がんは、元の部位または臓器の外側に、局所浸潤（「局所進行性」）または転移（「転移性」）のいずれかによって広がっているがんである。したがって、「進行」がんという用語は、局所進行性疾患および転移性疾患の両方を含む。
「転移性」がんは、身体の１つの部分（例えば、乳房）から身体の別の部分へ広がっているがんを指す。
「難治性」がんは、抗腫瘍剤、例えば化学療法、または生物学的療法、例えば免疫療法が、がん患者に投与されているにもかかわらず進行するがんである。難治性がんの例は、白金難治性がんである。
「再発」がんは、初期療法、例えば手術への応答後に、初期部位または遠位部位のいずれかにおいて再成長したがんである。
「局所再発」がんは、治療後に以前に治療されたがんと同じ場所で再発するがんである。
「切除不能な（ｎｏｎ－ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」または「切除不能な（ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」がんは、手術によって除去（切除）することができない。
本明細書において「早期乳がん」は、乳房または腋窩リンパ節を越えて広がらない乳がんを指す。そのようながんは、一般にネオアジュバントまたはアジュバント療法により治療される。
「ネオアジュバント療法」または「ネオアジュバント治療」または「ネオアジュバント投与」は、手術の前に与えられる全身療法を指す。
「アジュバント療法」または「アジュバント治療」または「アジュバント投与」は、手術の後に与えられる全身療法を指す。
本明細書において、「患者」または「対象」は、ヒト患者である。患者は「がん患者」、すなわち、がん、特に乳がんの１つまたは複数の症状を罹患している、または罹患するリスクがあるがん患者でありうる。
「患者集団」は、がん患者の群を指す。このような集団を使用して、薬物、例えばペルツズマブおよび／またはトラスツズマブの統計的に有意な有効性および／または安全性を実証することができる。
「再発」患者は、寛解後にがんの兆候または症状を有する患者である。任意選択で、患者は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法後に再発している。
「ＨＥＲ発現、増幅または活性化を示す」がんまたは生物学的試料は、診断試験において、ＨＥＲ受容体を発現する（過剰発現を含む）もの、増幅したＨＥＲ遺伝子を有するもの、および／またはそうでなければＨＥＲ受容体の活性化もしくはリン酸化を実証するものである。
「ＨＥＲ活性化を示す」がんまたは生物学的試料は、診断試験において、ＨＥＲ受容体の活性化またはリン酸化を示すものである。そのような活性化は、直接的に（例えば、ＥＬＩＳＡによりＨＥＲリン酸化を測定することによって）、または間接的に（例えば、本明細書に記載されるように、遺伝子発現プロファイリングによって、またはＨＥＲヘテロ二量体を検出することによって）決定することができる。
「ＨＥＲ受容体過剰発現または増幅」を伴うがん細胞は、同じ組織型の非がん性細胞と比較して有意に高いレベルのＨＥＲ受容体タンパク質または遺伝子を有するがん細胞である。そのような過剰発現は、遺伝子の増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって引き起こされることもある。ＨＥＲ受容体過剰発現または増幅は、細胞の表面に存在するＨＥＲタンパク質の増加したレベルを評価すること（例えば、免疫組織化学アッセイ、ＩＨＣを介して）によって、診断または予後アッセイにおいて決定することができる。代替としてまたは加えて、細胞中のＨＥＲコード核酸のレベルを、例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月発行の国際公開第９８／４５４７９を参照のこと）およびクロモジェニックｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ；例えば、Ｔａｎｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７巻（５号）：１４６７～１４７２頁（２０００年）；Ｂｅｌｌａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６巻：（５月２０日付録；抄録２２１４７）（２００８年）を参照のこと）、サザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を含むｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を介して測定することができる。また、ＨＥＲ受容体過剰発現または増幅は、生体液、例えば血清中の脱落抗原（例えば、ＨＥＲ細胞外ドメインを測定することによっても研究することができる（例えば、１９９０年６月１２日発行の米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日公開の国際公開第９１／０５２６４号；１９９５年３月２８日発行の米国特許第５，４０１，６３８号、およびＳｉａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２巻：７３～８０頁（１９９０年）を参照のこと）。上記のアッセイの他に、様々なｉｎ ｖｉｖｏアッセイが当業者に利用可能である。例えば、患者の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射能のｉｎ ｓｉｔｕ放射性により任意選択で標識されている抗体に曝露することができる、またはこの抗体に以前に曝露された患者から採取された生検を分析することができる。
「ＨＥＲ２陽性」がんは、正常レベルよりも高いレベルのＨＥＲ２を有するがん細胞を含む。任意選択で、ＨＥＲ２陽性がんは、免疫組織化学（ＩＨＣ）スコアの２＋もしくは３＋を有する、および／またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）もしくはクロモジェニックｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）陽性であり、例えば、ＩＳＨ／ＦＩＳＨ／ＣＩＳＨ増幅非の≧２．０を有する。
「ＨＥＲ２突然変異」がんは、例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって確認することができるキナーゼドメイン突然変異を含む、ＨＥＲ２活性化突然変異を有するがん細胞を含む。「ＨＥＲ２突然変異」がんは、具体的には、ＨＥＲ２のエクソン２０への挿入、ＨＥＲ２のアミノ酸残基７５５～７５９の周囲での欠失、突然変異Ｇ３０９Ａ、Ｇ３０９Ｅ、Ｓ３１０Ｆ、Ｄ７６９Ｈ、Ｄ７６９Ｙ、Ｖ７７７Ｌ、Ｐ７８０－Ｙ７８１ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ８４２Ｉ、Ｒ８９６Ｃ（Ｂｏｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１３年；３巻：１～１４頁）のいずれか、ならびに２つまたは複数の独特な標本に見出されたＣＯＳＭＩＣデータベースにおける以前に報告された同一の非同義推定活性化突然変異（または、インデル）を特徴とする、がんを含む。さらなる詳細については、例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２００４年；４３１巻：５２５６頁；Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５年；６５巻：１６４２６頁；Ｂｕｔｔｉｔｔａら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００６年；１１９巻：２５８６９１頁；Ｌｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００８年；２７巻：４７０２１１頁；Ｓｅｑｕｉｓｔら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１０年；２８巻：３０７６８３頁；Ａｒｃｉｌａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２年；１８巻：４９１０８頁；Ｇｒｅｕｌｉｃｈら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１２年；１０９巻：１４４７６８１頁；およびＨｅｒｔｅｒ－Ｓｐｒｉｅら、Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ２０１３年；３巻：１１０頁を参照のこと。
本明細書において、「抗腫瘍剤」は、がんを治療するために使用される薬物を指す。本明細書において、抗腫瘍剤の非限定的な例には、化学療法剤、ＨＥＲ二量体化阻害剤、ＨＥＲ抗体、腫瘍関連抗原に対する抗体、抗ホルモン化合物、サイトカイン、ＥＧＦＲ標的薬、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、成長抑制剤および抗体、細胞傷害性剤、アポトーシスを誘導する抗体、ＣＯＸ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、がん胎児性タンパク質ＣＡ１２５に結合する抗体、ＨＥＲ２ワクチン、Ｒａｆまたはｒａｓ阻害薬、リポソームドキソルビシン、トポテカン、タキサン、二重チロシンキナーゼ阻害剤、ＴＬＫ２８６、ＥＭＤ－７２００、ペルツズマブ、トラスツズマブ、エルロチニブ、ならびにベバシズマブが挙げられる。
「治療」は、治療的処置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）および予防的または防止的手段の両方を指す。治療を必要とする者には、がんを既に有する者が挙げられ、同様にがんが防止されるべき者が挙げられる。したがって、本明細書において治療される患者は、がんを有していると診断されていることがある、またはがんの素因がありうる、もしくはがんになりやすいことがある。
「有効量」という用語は、患者においてがんを治療するのに有効な薬物の量を指す。有効量の薬物は、がん細胞の数を低減する、腫瘍サイズを低減する、末梢臓器へのがん細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延し、好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅延し、好ましくは停止させる）、腫瘍成長をある程度阻害する、および／またはがんと関連する症状の１つもしくは複数をある程度軽減することができる。既存のがん細胞の成長を防止する、および／またはそれらを死滅させることができる程度まで、薬物は、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性でありうる。有効量は、無増悪生存を延ばす（例えば、固形腫瘍の反応評価基準、ＲＥＣＩＳＴもしくはＣＡ－１２５変化により測定される）、客観的応答をもたらす（部分応答、ＰＲもしくは完全応答、ＣＲを含む）、全生存期間を増加する、および／またはがんの１つもしくは複数の症状を改善する（例えば、ＦＯＳＩにより査定される）ことができる。
「細胞傷害性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害または防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、ならびに毒素、例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の低分子毒素または酵素的に活性な毒素を含むことが意図され、これらの断片および／または変異体が含まれる。
「化学療法」は、がんの治療に有用な化学化合物の使用である。化学療法に使用される化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；ＴＬＫ２８６（ＴＥＬＣＹＴＡ（商標））；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）および９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ－１０６５（このアドゼレシン、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビセレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリニック酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体のＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロメタミンオキシド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３巻：１８３～１８６頁（１９９４年）を参照のこと）、およびアントラサイクリン、例えば、アンナマイシン（ａｎｎａｍｙｃｉｎ）、ＡＤ３２、アルカルビシン（ａｌｃａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、デクスラゾキサン、ＤＸ－５２－１、エピルビシン、ＧＰＸ－１００、イダルビシン、バルルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネマイシン、エスペラミシン、ネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、リポソームドキソルビシンおよび デオキシドキソルビシンを含む）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；葉酸類似体、例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリンおよびトリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）およびチオグアニン；ピリジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン（ｄｉｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン；副腎皮質ホルモン合成阻害薬（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸（ロイコボリン）；アセグラトン；葉酸代謝拮抗剤抗悪性腫瘍剤（ａｎｔｉ－ｆｏｌａｔｅ ａｎｔｉ－ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、例えば、ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）、ＬＹ２３１５１４ペメトレキセド、メトトレキセートなどのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗薬およびそのプロドラッグ、例えば、ＵＦＴ、Ｓ－１およびカペシタビン、ならびにチミジル酸シンターゼ阻害剤およびグリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ阻害剤、例えば、ラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸ（登録商標）、ＴＤＸ）；ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの阻害剤、例えばエニルウラシル；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エロフニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ－２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金；白金類似体または白金ベース類似体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメトルヒルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、および５－ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））の治療レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸが挙げられる。
また、この定義に含まれるものは、腫瘍へのホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗エストロゲン薬および選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）などの抗ホルモン剤であり、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；アロマターゼ阻害剤；および抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、たとえば、ＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓおよび上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）などの異常な細胞増殖と関連付けられたシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの；遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼＩ阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
「タキサン」は、有糸分裂を阻害し、マイクロチューブに干渉する化学療法である。タキサンの例には、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；パクリタキセルまたｎａｂ－パクリタキセルのクレモフォール無含有のアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）；およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）；Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられる。
「アントラサイクリン」は、真菌のストレプトコッカス・ピウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）から生じるタイプの抗生物質であり、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、および前記に列挙されたものを含む任意の他のアントラサイクリン化学療法剤が挙げられる。
「アントラサイクリンベース化学療法」は、１つまたは複数のアントラサイクリンからなる、またはこれらを含む化学療法レジメンを指す。例には、限定されることなく、５－ＦＦＵ、エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＦＥＣ）；５－ＦＵ、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド（ＦＡＣ）；ドキソルビシンおよびシクロホスファミド（ＡＣ）；エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＥＣ）；投与集中ドキソルビシンおよびシクロホスファミド（ｄｄＡＣ）などが挙げられる。
本明細書における目的のために、「カルボプラチンベース化学療法」は、１または複数のカルボプラチンからなる、またはこれらを含む化学療法レジメンを指す。例は、ＴＣＨ（ドセタキセル／ＴＡＸＯＬ（登録商標）、カルボプラチンおよびトラスツズマブ／ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））である。
「アロマターゼ阻害剤」は、副腎内でエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害する。アロマターゼ阻害剤の例には、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールが挙げられる。一実施形態において、本明細書におけるアロマターゼ阻害剤は、レトロゾールまたはアナストロゾールである。
「代謝拮抗薬化学療法」は、代謝産物と構造的に類似しているが、産生方式によって身体で使用することができない薬剤についての用途である。多くの代謝拮抗薬化学療法は、核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの産生に干渉する。代謝拮抗化学療法剤の例には、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（商標））、６－メルカプトプリン、メトトレキセート、６－チオグアニン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシンＡＲＡ－Ｃシタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ－Ｕ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－ＤＯＭＥ（登録商標））、アゾシトシン（ａｚｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、デオキシシトシン、ピリドミデン（ｐｙｒｉｄｍｉｄｅｎｅ）、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、クラドリビン、２－デオキシ－Ｄ－グルコースなどが挙げられる。
「化学療法抵抗性」がんとは、がん患者が化学療法レジメンを受けている間に進行している（すなわち、患者が「化学療法難治性」である）こと、または患者が化学療法レジメン完了後の１２か月以内に（たとえば、６か月以内に）進行していることを意味する。
「プラチン」という用語は、限定されることなくシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが挙げられる白金ベース化学療法を指すため、本明細書において使用される。
「フルオロピリミジン」という用語は、限定されることなくカペシタビン、フロクスウリジンおよびフルオロウラシル（５－ＦＵ）が挙げられる代謝拮抗薬化学療法を指すために本明細書において使用される。
本明細書における治療剤の「一定」または「フラット」用量は、ヒト患者に、患者の体重（ＷＴ）または体表面積（ＢＳＡ）に関係なく投与される用量を指す。したがって一定またはフラット用量は、ｍｇ／ｋｇ用量またはｍｇ／ｍ２用量として提供されず、むしろ治療剤の絶対量として提供される。
ＩＩ．アッセイ
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と一定用量配合剤（ＦＤＣ）との合剤は、薬品の複雑性を増加し、特徴づけ、および製品品質の管理にとって難題をもたらす。この難題は、合剤抗体が、類似した等電点、配列類似性およびサイズに有意な差がないなどの類似した物理化学的性質を有する場合に悪化する。さらに、合剤抗体のそれぞれは、製造の際にサイズ、電荷および翻訳後修飾に不均一性を呈することがありうる。これらの理由から、一定用量配合剤中のｍＡｂ間の相互作用を特徴づけ、理解する必要がある。本明細書に記載されているものは、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤の重要な品質属性（ＣＱＡ）を決定する分析方法である。
一態様において、これらのアッセイは、２つの抗ＨＥＲ２抗体のトラスツズマブおよびペルツズマブの一定用量配合剤を分析するために好適である。トラスツズマブおよびペルツズマブは、９３％を超える配列同一性を有し、３０Ｄａのみが異なり、両方ともおよそ１４８ｋＤａの分子量を有する。さらに、両方の抗体は、非常に類似した等電点を有し、同じ標的（ＨＥＲ２）に結合し、ｉｎ ｖｉｖｏで相乗効果を有する。これらの構造的および機能的な類似性のために、大部分の通常の公知の分析方法をこの合剤に適用することができない。加えて、試験戦略のために開発されたアッセイは、トラスツズマブ・ペルツズマブ一定用量配合剤がペルツズマブＳＣ原体とトラスツズマブ原体の比が異なっている２つの異なる投与量、すなわち、負荷量および維持量で提供されることを考慮している。
（ｉ）効力検定
力価は、治療用モノクローナル抗体を含む生物治療薬の放出および安全性試験において、制御系に含まれるＣＱＡである。力価は、生物活性起因するに対する製品品質属性の累積的影響をモニターし、安全性および有効性に潜在的に影響を与えることがあり、すなわち、高い力価は安全性の懸念を与えることがあり、一方で低い力価は有効性に関しての考慮が生じる。理想的には、効力アッセイは、製品の作用機序（すなわち、関連する治療活性または意図される生物学的効果）を表す。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の「細胞および遺伝子治療用製品の効力試験に関する産業界への指針（「Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｏｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」）に従って、生物学的製品の力価を査定する伝統的な手法は、所定の結果をもたらす特定の能力に関連する製品の活性を測定する、定量生物学的アッセイ（バイオアッセイ）を開発することである。バイオアッセイは、生体系内で製品の活性成分を評価することによって、力価の測定を提供することができる。バイオアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏ動物研究、ｉｎ ｖｉｔｒｏ臓器、組織もしくは細胞培養系、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。力価を決定または定量化するバイオアッセイの広く使用されている例は、細胞ベースアッセイである。細胞成長の阻害を測定するために設計された、具体的にはペルツズマブまたはトラスツズマブのための２つの特有の細胞ベースアッセイ（抗増殖アッセイ）を、ペルツズマブ・トラスツズマブ一定用量配合剤の生物活性を制御する適合性について査定した。この査定は、合剤に配合された場合に個々の抗体の製品品質の関連する変化の制御を妨げる制約のため、アッセイが一定用量配合剤には適していないことを実証した。同じ受容体に結合し、かつ類似したシグナル伝達経路を阻害する２つの抗体の合剤の特質のため、これらの制約を克服することができる代替的なＨＥＲ２発現細胞株はない。
同じ受容体に結合し、かつ標的細胞において類似したシグナル伝達経路を阻害するトラスツズマブおよびペルツズマブでは、下流シグナル伝達、遺伝子発現、およびＨＥＲ２発現標的細胞の増殖に対する効果は、ＨＥＲ２の対応するエピトープへの結合化性によって媒介される。したがって、ＨＥＲ２駆動細胞成長を阻害する力価に影響する、抗体の潜在的な分子変化を、結合レベルで観察することができる。この仮説を、選択した製品の変異体（電荷およびサイズの変異体、ならびにＣＤＲ親和性の突然変異体）による比較研究で査定し、本明細書の実施例において示されている。この研究は、本明細書に提供される結合アッセイにより検出された結合の差が、サイズの変異体を除いて、試験した大部分の製品変異体の抗増殖活性に観察された変化を反映することを確証した。力価に影響する単一抗体品質変化を検出するための、本明細書に提供される抗増殖アッセイにおける干渉および結合アッセイの能力を考慮すると、本明細書に提供される新たな結合アッセイは、標的結合およびＲＥＲ２シグナル伝達に影響する製品品質の関連する変化を制御することが可能な最良のアッセイであると考慮される。
一実施形態において、ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ薬品は、力価を決定するためにペルツズマブまたはトラスツズマブへのＨＥＲ２結合を特異的に測定する結合アッセイによって試験される。トラスツズマブおよびペルツズマブは、両方ともＨＥＲ２を標的にするが、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の別個の重複しないエピトープに結合し、トラスツズマブは、膜近傍領域であるサブドメインＩＶを認識し、ペルツズマブは、二量体化領域であるサブドメインＩＩを認識する（Ｒｏｃｃａ Ａ、Ａｎｄｒｅｉｓ Ｄ、Ｆｅｄｅｌｉ Ａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ ２０１５年；１１巻：１６４７～６３頁）。ＨＥＲ２サブドメインＩＶへのトラスツズマブの結合は、リガンド独立ＨＥＲ２シグナル伝達を、そのホモ二量体化をブロックすることによって阻害し（Ｊｕｎｔｔｉｌａ ＴＴ、Ａｋｉｔａ ＲＷ、Ｐａｒｓｏｎｓ Ｋら、Ｌｉｇａｎｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｂｙ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＰＩ３Ｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＧＤＣ－０９４１．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００９年；１５巻：４２９～４０頁）、ＥＣＤのタンパク質分解性切断を防止し、それによって、続く関連細胞内シグナル伝達経路の構成的活性化を禁止する（Ｍｏｌｉｎａ ＭＡ、Ｃｏｄｏｎｙ－Ｓｅｒｖａｔ Ｊ、Ａｌｂａｎｅｌｌ Ｊら、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ （Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ），ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂａｓａｌ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＥＲ２ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１年；６１巻：４７４４～９頁）。結果として、トラスツズマブは、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび動物の両方において示されている。ＨＥＲ２サブドメインＩＩへのペルツズマブの結合は、ＨＲ２と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびへＲ４を含む他のＨＥＲファミリーメンバーとのリガンド依存性ヘテロ二量体化をブロックする（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＭＣ、Ｃａｒｅｙ ＫＤ、Ｖａｊｄｏｓ ＦＦら、Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＥｒｂＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥｒｂＢ２ ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００４年；５巻：３１７～２８頁；Ａｄａｍｓ ＣＷ、Ａｌｌｉｓｏｎ ＤＥ、Ｆｌａｇｅｌｌａ Ｋら、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＨＥＲ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００６年；５５巻：７１７～２７頁；Ｄｉｅｒｍｅｉｅｒ－Ｄａｕｃｈｅｒ Ｓ、Ｈａｓｍａｎｎ Ｍ、Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ Ｇ．Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ＦＲＥＴ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｒｂＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｃｅｌｌ ｂｙ ｃｅｌｌ ｂａｓｉｓ．Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２００８年；１１３０巻：２８０～６頁）。結果として、ペルツズマブは、リガンド開始細胞内シグナル伝達を阻害し、細胞成長の阻止を誘導し、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。
ペルツズマブおよびトラスツズマブは、互いに競合することなくＨＥＲ２ ＥＣＤの別個の重複しないエピトープに結合し、ＨＥＲ２シグナル伝達を破壊する相補性機構を有する。このことは、ペルツズマブおよびトラスツズマブが配合剤で投与されると、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで増大された抗増殖活性をもたらす（Ｓｃｈｅｕｅｒ Ｗ、Ｆｒｉｅｓｓ Ｔ、Ｂｕｒｔｓｃｈｅｒ Ｈら、Ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９年；６９巻：９３３０～６頁）。一実施形態において、ＦＤＣ薬品の抗増殖活性およびＨＥＲ２シグナル伝達は、ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ薬品における２つの抗体のそれぞれの品質の制御を確実する２つの別個のＨＥＲ２結合アッセイを使用して決定される。
一実施形態において、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）の結合アッセイであって、
ａ．ＦＤＣを捕獲試薬と接触させ、捕獲試薬が修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤであることと、
ｂ．試料を検出可能な抗体と接触させることと、
ｃ．捕獲試薬に結合した抗体のレベルを、検出可能な抗体の検出手段を使用して定量化することと、
を含む、結合アッセイが提供される。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤を、捕獲試薬が目的の抗ＨＥＲ２抗体のうちの１つを捕獲して、または１つに結合して検出工程で検出されうるように、捕獲試薬と接触させ、インキュベートする。捕獲試薬は、１つまたは複数の組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを含む修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤである。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、１つまたは複数の組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを含む遺伝子操作されたタンパク質またはペプチドである。一実施形態において、ＨＥＲ２ ＥＣＤは、ＦＤＣにおいて査定される抗ＨＥＲ２抗体のうちの１つが結合し、ＦＤＣにおける第２の抗ＨＥＲ２抗体が結合しないように修飾される。これは、第２の抗ＨＥＲ２抗体が結合するＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを省くこと、またはそれを抗ＨＥＲ２抗体のいずれにも結合しない構造的に近いサブドメインに置き換えること、のいずれかによって達成される。構造的に近いサブドメインは、修飾ＨＥＲ２ ＥＤＣとインキュベートしたときに修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤの三次元立体構造を妨害しない、任意のサブドメインでありうる。構造的に近いサブドメインの例は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４の対応するサブドメインである。好ましくは、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、天然ＨＥＲ２ ＥＣＤを限りなく近く模倣する三次元立体構造を有する。サブドメインは、完全長でありうる、またはＮもしくはＣ末端で数個のアミノ酸により短縮されうる。ＨＥＲ２ ＥＣＤの三次元構造の完全性は、Ｃ末端で約４～５個のアミノ酸により短縮されている１つまたは複数の組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを使用すると保持または改善されることが、本発明の発明者たちによって見出されている。
一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤはペプチドまたはタンパク質と融合して、捕獲試薬を固体基質に固定化することを促進する。好適なペプチドまたはタンパク質の例は、ビオチン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＦｃドメインである。１つの修飾ＨＥＲ２細胞外ドメインはＦｃドメインに融合する。一実施形態において、前記Ｆｃドメインは、分析される抗ＨＥＲ２抗体のＦｃドメインの種と異なる種からのものである。例えば、分析される抗ＨＥＲ２抗体がヒトＦｃドメインを含む場合、捕獲試薬は、非ヒトＦｃドメイン、例えば、マウス、ヤマアラシ、ラット、ウサギなどのものを含むべきである。一実施形態において、組換えＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインのＦｃドメインは、マウスＦｃドメインである。一実施形態において、前記Ｆｃドメインは配列番号３５を含む。
次の工程では、捕獲試薬および捕獲抗ＨＥＲ２抗体を含む試料を、検出可能な抗体と共にインキュベートする。検出可能な抗体は、結合した目的の抗ＨＥＲ２抗体のいずれかと接触すると、目的の抗体に結合する。次の工程では、検出手段を使用して、検出可能な抗体の標識を検出し、よってＦＤＣに存在する目的の抗ＨＥＲ２抗体の存在または量を検出する。
一実施形態において、一定用量配合剤は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体、およびＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体を含む。一実施形態において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体はペルツズマブである。一実施形態において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体はトラスツズマブである。一実施形態において、一定用量配合剤は、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む。一実施形態において、一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。１つのそのような実施形態において、ヒアルロニダーゼは組換えヒトヒアルロニダーゼである。１つ好ましい実施形態において、前記ヒアルロニダーゼはｒＨＵＰＨ２０である。ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ薬品は、２つの異なる投与量、すなわち、負荷量（ＬＤ）および維持量（ＭＤ）により提供される。ＬＤおよびＭＤは、同じ総タンパク質含有量を有し、ペルツズマブＳＣ原体とトラスツズマブ原体の比が異なっている。一実施形態において、結合アッセイを使用してペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣのＬＤを分析する。一実施形態において、結合アッセイを使用して、４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含むペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣを分析する。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、ｒＨｕＰＨ２０を２０００Ｕ／ｍＬで追加的に含む。一実施形態において、結合アッセイを使用してペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣのＭＤを分析する。一実施形態において、結合アッセイを使用して、６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含むペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣを分析する。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、ｒＨｕＰＨ２０を２０００Ｕ／ｍＬで追加的に含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブの結合は、２つの別々の結合アッセイにより決定される。
ペルツズマブ結合アッセイは、ペルツズマブが組換えＨＥＲ２捕獲試薬のエピトープに特異的に結合する能力として特定の生物活性を決定する。一実施形態において、ペルツズマブの結合は定量化される。１つのそのような実施形態において、捕獲試薬は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩまたはその一部を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、ヒトＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２３または配列番号２を含む。
一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、ＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩまたはこれらの一部を含む。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、ヒトＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩまたはこれらの一部を含む。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、サブドメインＩＶを含まない。修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、Ｃ末端で短縮されている組換えサブドメインＩＩＩを含む場合、天然ＨＥＲ２ ＥＣＤに似ている三次元立体構造で産生されうることを本発明者たちは見出している。１つのそのような実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号１、配列番号２および配列番号３４を含む。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号２４を含む。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号２４に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩはＦｃドメインに融合している。一実施形態において、前記Ｆｃドメインは、マウス、ラット、ウサギまたはヤマアラシＦｃドメインである。上記の実施形態のいずれかにおいて、ペルツズマブの結合を査定するための捕獲試薬は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶを含まない。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７を含む。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号２５に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号２６に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号２７に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、トラスツズマブの結合は定量化される。１つのそのような実施形態において、捕獲試薬は、組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶまたはその一部を含む。１つのそのような実施形態において、捕獲試薬は、ヒト組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２８または配列番号４を含む。
一実施形態において、捕獲試薬は、組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、ヒトＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶ、ならびにＥＧＦＲのサブドメインＩＩを含む。一実施形態において、捕獲試薬は、組換えヒトＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶ、ならびにＥＧＦＲの組換えヒトサブドメインＩＩを含む。修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、両方ともＣ末端で短縮されている組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩおよび組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶを含む場合、天然ＨＥＲ２ ＥＣＤに似ている三次元立体構造で産生されうることを本発明者たちは見出している。一実施形態において、修飾ＥＣＤは、配列番号３３、配列番号３および配列番号２８を含む。一実施形態において、修飾ＥＣＤは、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３および配列番号２８を含む。
一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号２９を含む。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号２９に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶ、ならびにＥＧＦＲのサブドメインＩＩは、Ｆｃドメインに融合している。一実施形態において、前記Ｆｃドメインは、マウス、ラット、ウサギまたはヤマアラシＦｃドメインである。上記の実施形態のいずれかにおいて、トラスツズマブの結合を査定するための捕獲試薬は、ＨＥＲ２サブドメインＩＩを含まない。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２を含む。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号３０に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号３１に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号３２に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
上記の実施形態のいずれかにおいて、検出可能な抗体は、様々な方法による検出が可能になる標識を含む。これらの標識には、直接検出されうる部分、例えば、蛍光色素標識、化学発光標識および放射性標識、ならびに検出のために反応または誘導体化させなければならない部分、例えば酵素が挙げられる。そのような標識の例には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ルテニウム、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化させる酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペルオキシダーゼとカップリングされた複素環式オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ビオチン（例えば、ＭＵＧを用いたアビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼにより検出可能）、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカルなどが挙げられる。
検出可能な抗体に好ましい標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＨＲＰに一般的に使用される基質は、異なるカテゴリーに入り、それぞれ着色、蛍光また発光誘導体を生成するか否かに応じて、色素原基質（例えば、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、３，３’－ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）、ジアミノベンジジンと組み合わせたクロロナフトール（ＣＮ／ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）、２，２’－アジノビス［３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸］－二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ））、蛍光原基質（例えば、ＡＤＨＰ）、および化学発光（例えば、増強化学発光（ＥＣＬ））基質が挙げられる。好ましい基質はＡＢＴＳである。
一実施形態において、検出可能な抗体は、ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分を標的にする。一実施形態において、検出可能な抗体は、抗ＨＥＲ２抗体のＦ（ａｂ’）２部分を標的にする。
一実施形態において、結合アッセイは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡにおいて、捕獲試薬は固体基質に結合している。固定化に使用される固体相は、本質的に非水溶性であり、免疫測定アッセイに有用である任意の不活性支持体または担体であってもよく、例えば、表面、粒子、多孔性マトリックスなどの形態の支持体が挙げられる。一般に使用される支持体の例には、小さなシート、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ゲル、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、およびポリエチレン、ポリプロピレ、ポリスチレンなどから製造されるアッセイプレートまたは試験管が挙げられ、これには、９６ウェルマイクロタイタープレート、ならびに粒子材料、例えば、ろ紙、アガロース、架橋デキストランおよび他の多糖類が挙げられる。あるいは、反応性非水溶性マトリックス、例えば、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号および同第４，３３０，４４０号に記載されている臭化シアン活性化炭水化物および反応基質は、捕獲試薬の固定化に好適に用いられる。好ましい実施形態において、固定化された捕獲試薬は、マイクロタイタープレートにコートされ、特に、使用される好ましい固体相は、いくつかの試料を一度に分析することに使用できるマルチウェルマイクロタイタープレートである。好ましいマイクロタイタープレートは、極性または親水性基を有する分子に高い親和性のある高度に荷電されたポリスチレン表面を有するプレートであり、タンパク質に対して高い結合能を有する。最も好ましいものは、ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ（登録商標）またはＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートであり、例えば、ＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＢ（登録商標）またはＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）として販売されているものである。
９６ウェルプレートは、好ましくは、捕獲試薬により少なくとも３０分、４０分、５０分、６０分、約２０～８０分、または約３０～６０分にわたってコートされる。９６ウェルプレートは、捕獲試薬により好ましくは約４～２０℃の温度、より好ましくは約２～８℃でコートされる。プレートをアッセイに先立って積層およびコートしてもよく、次いでアッセイを、手動、半自動または自動様式で、例えば、ロボット工学によって、いくつかの試料に同時に実行することができる。
用いられる捕獲試薬の量は、良好なシグナルを与えるのに十分な大きさであるが、試料中の目的の抗体の最大曝露レベルと比較して過剰モルではない。一実施形態において、コート試薬濃度は、約０．５μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、好ましくは約１μｇ／ｍＬ～１．５μｇ／ｍＬである。
次いでコートされたプレートを、典型的には、結合部位に非特異的に結合し、結合部位を飽和させるブロッキング剤で処理して、プレートのウェルの過剰部位への遊離リガンドの望ましくない結合を防止する。この目的のために適切なブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼインおよび脱脂乳が挙げられる。ブロッキング処理は、典型的には、常温の条件下で約１～４時間、約１～３時間、好ましくは約１～１．５時間行われる。
コーティングおよびブロッキングした後、分析される標準またはＦＤＣ試料を標準希釈剤によって、コートされたプレートに添加する。一実施形態において、漸増濃度のペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ（標準、製品対照、および分析される試料）を、コートされたプレートに添加する。
ＦＤＣ試料と固定化された捕獲試薬とのインキュベーションの条件は、アッセイの感受性を最大限にし、解離を最小限にするように、およびＦＤＣ試料において査定される抗ＨＥＲ２抗体が、固定化された捕獲試薬に結合することを確実にするように選択される。好ましくは、インキュベーションは、約０℃～約４０℃の範囲のほぼ一定した温度、好ましくは室温または概ね室温で達成される。インキュベーションの時間は、一般に約１０時間以下である。好ましくは、ＦＤＣ試料において査定される抗ＨＥＲ２抗体の、捕獲試薬への結合を最大限するため、インキュベーション時間は、室温または概ね室温で約０．５～３時間、より好ましくは約１～１．５時間である。
任意の結合抗ＨＥＲ２抗体を有する固定化された捕獲試薬を、検出可能な抗体と、好ましくは約２０～４０℃の温度、より好ましくは室温で接触させ、２つを接触させる正確な温度および時間は、主に、用いられる検出手段によって左右される。
別の実施形態において、結合アッセイは、電気化学発光（ＥＣＬ）である。
一実施形態において、結合アッセイは、抗ＨＥＲ２抗体のうちの１つの力価を分析するために使用される。よって、一実施形態において、結合アッセイは、
ｄ．捕獲試薬に結合した抗体のレベルを、前記抗体の生物活性と相関させる工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、試料により生成された用量応答曲線を標準の用量応答曲線と比較する。一実施形態において、標準の力価は、結合アッセイで得られた結果を、細胞ベースアッセイにおける単離抗体の生物活性と別々に相関させることによって定量化する。
一実施形態において、試料および標準により生成された非線形４パラメーター用量応答曲線を比較する。標準と試料の用量応答曲線の類似性基準が査定されると、試料の相対力価は、標準および試料の用量応答曲線フィット間の濃度シフトに基づき、４パラメーター平行線分析を使用して計算される。
一実施形態において、結合アッセイは、ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤のバッチ放出のためである。一実施形態において、結合アッセイは、ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤の貯蔵寿命を決定するためである。１つのそのような実施形態において、ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、貯蔵の最中のいくつかの時点で上記実施形態の結合アッセイにより分析される。
（ｉｉ）電荷変異体の分析
一実施形態において、ペルツズマブとトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法であって、組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体の量を査定することを含む方法が提供される。一実施形態において、前記一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。一実施形態において、前記方法はイオン交換クロマトグラフィーである。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、治療用タンパク質の詳細な特徴づけに広く使用され、電荷不均一性の定性的および定量的評価の参照的で強力な技術と考慮することができる。イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ、ＩＥＣ）は、溶液中の分子を電荷の不均一性に従って分離する。分離は、カラム充填材料に固定化された逆の電荷のイオン交換基への荷電溶質分子の可逆的な吸着によって起こされる。固体支持体への分子の吸着は、２つの部分のイオン相互作用によって駆動される。相互作用の強さは、分子および固定相における電荷の数および位置によって決定される。ＩＥＸは、典型的には特異化が特にｍＡｂの酸性種、主要種および塩基性種それぞれの分配によって設定される放出方法である。これらの荷電種は、力価に影響を与えうる製品関連不純物と考慮される。さらに、変性が加えられていない天然であることの確証によってタンパク質を特徴づけることができる、数少ない方法のうちの１つである。ＩＥＸはまた、ある特定の生物学的製剤の素性方法として使用することもでき、安定性および貯蔵寿命の正当化のための常套的試験である。
トラスツズマブおよびペルツズマブなどの非常に類似した等電点を有する２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤の電荷変異体の分布を分析することは、すべての関連種の正確な隔離が可能になる特異的イオン交換クロマトグラフィープロトコールを必要とする。
一実施形態において、ペルツズマブとトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法であって、組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体の量を査定することを含む方法が提供される。一実施形態において、前記一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。一実施形態において、前記方法はイオン交換クロマトグラフィーである。１つの特定の実施形態において、前記方法は陽イオン交換クロマトグラフィーである。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、ペルツズマブ／トラスツズマブ一定用量配合剤（ＦＤＣ）に適用されると、正荷電分子が負荷電固定相に保持される。酸性種は、塩基性種より少ない保持時間で溶出する。
カラムおよび試料適用を平衡にした後、ＦＤＣの抗ＨＥＲ２抗体のペルツズマブとトラスツズマブは、カラムリガンドに吸着される。次いでカラムを洗浄して、非吸着タンパク質を除去し、ｐＨを事前規定範囲内に保ちながら、移動相のイオン強度を変えることによって溶出を実施する。一実施形態において、ｐＨは一定値に保たれる。
イオン強度は、漸増塩濃度の勾配を適用することによって変化させ、勾配は、段階勾配または連続勾配のいずれかである。本発明の発明者たちは、２つの抗ＨＥＲ２抗体のペルツズマブとトラスツズマブのＦＤＣの電荷変異体の分析において、ローディングバッファー（移動相Ａ）および溶出バッファー（移動相Ｂ）のｐＨ範囲が重要であることを見出した。電荷変異体の最高の分離は、ローディングバッファー（移動相Ａ）の事前規定ｐＨ範囲のｐＨ７．５～７．６５、および溶出バッファー（移動相Ｂ）の事前規定ｐＨ範囲のｐＨ７．５～７．７によって得られる。一実施形態において、ｐＨは一定値に保たれる。一実施形態において、ローディングバッファーの前記一定ｐＨ値は７．５、７．５５、７．６または７．６５である。一実施形態において、溶出バッファーの前記一定ｐＨ値は、７．５、７．５５、７．６、７．６５または７．７である。
溶出した後、カラムをローディングバッファー（移動相Ａ）で再び平衡にする。
一実施形態において、ペルツズマブ・トラスツズマブ一定用量配合剤を陽イオン交換材料と接触させ、電荷変異体および天然抗体を、移動相のｐＨを事前規定範囲内に保ちながら、塩勾配で溶出させる。一実施形態において、塩勾配は連続塩勾配である。一実施形態において、ローディングバッファーの移動相（移動相Ａ）のｐＨは、ｐＨ７．５～ｐＨ７．６５である。一実施形態において、溶出バッファーの移動相（移動相Ｂ）のｐＨは、ｐＨ７．５～ｐＨ７．７である。
一実施形態において、塩勾配は塩化ナトリウム勾配である。一実施形態において、塩勾配は塩化ナトリウム勾配であり、溶出バッファーの移動相（移動相Ｂ）のｐＨは、ｐＨ７．５～ｐＨ７．７である。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法であって、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５であることと、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７であることと、
を含む方法が提供される。
一実施形態において、工程ｂの溶出は塩勾配を使用して実施される。一実施形態において、前記塩勾配は連続塩勾配である。一実施形態において、塩勾配はナトリウム（Ｎａ＋）勾配である。よって、一実施形態において、前記溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムイオン（Ｎａ＋）を含む。一実施形態において、ナトリウム勾配は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）勾配である。一実施形態において、前記溶出バッファーはＮａＣｌを含む。ローディングバッファーおよび溶出バッファーに好適なバッファーは、ＭＥＳ（２－エタンスルホン酸）、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、リン酸バッファー、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシル－３－アミノプロパンスルホン酸）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＴＰＰ（トリス、リン酸塩、ピペラジン）である。好ましいバッファーは、ＡＣＥＳおよびＨＥＰＥＳである。
一実施形態において、溶出バッファー（移動相Ｂ）の塩化ナトリウム濃度は、約１８０～２２０ｍＭのＮａＣｌ、約２００ｍＭのＮａＣｌ、約１８０ｍＭのＮａＣｌ、約１９０ｍＭのＮａＣｌ、約２１０ｍＭのＮａＣｌ、または約２２０ｍＭのＮａＣｌである。
一実施形態において、前記イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。本発明の方法をさらに最適化する場合、本発明者たちは、電荷変異体の分離が強陽イオン交換カラム材料を使用したときに改善されることを見出した。好ましい実施形態において、方法は、Ｎａ＋を溶出の対イオンとして使用する、スルホネート基を有する非多孔性ＳＣＸカラムを使用して実施される。よって、一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を有する。１つのそのような実施形態において、陽イオン交換材料は、スルホネート基を有する強陽イオン交換（ＳＣＸ）カラムであり、溶出バッファーはナトリウムを含む。１つのそのような実施形態において、溶出バッファーはナトリウムイオンを含む。一実施形態において、前記ＳＣＸカラムは非多孔性である。本明細書に有用な好ましい陽イオン交換カラムは、ＹＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏ ＳＰ－Ｆカラム、ＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＳＣＸ ｍＡｂ、Ｓｅｐａｘ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ ＳＣＸ－ＮＰ１．７または非多孔性Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＣＸである。
一実施形態において、上記の方法の工程ａおよびｂは３２℃～４０℃の温度または約３６℃で実施される。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、約５０μｇ～１４９μｇまたは約５１μｇ～１５３μｇの総タンパク質量を負荷して実施される。一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、約５０μｇ～１４９μｇのペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの負荷量で総タンパク質量を負荷することにより実施される。一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、約５１μｇ～１５３μｇのペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの維持量で総タンパク質量を負荷することにより実施される。一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーに負荷される総タンパク質は、約１００μｇである。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法であって、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５であることと、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７であることと、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出することと、
を含む方法が提供される。
一実施形態において、一定用量配合剤中のトラスツズマブおよびペルツズマブの酸性変異体、天然形態および塩基性変異体は、選択的に検出される。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、クロマトグラフィーカラムに負荷される前にカルボキシペプチダーゼＢで消化されている、ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤で実施される。
一実施形態において、前記ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。１つのそのような実施形態において、ヒアルロニダーゼは組換えヒトヒアルロニダーゼである。一実施形態において、前記ヒアルロニダーゼはｒＨｕＰＨ２０である。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、約２０００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含む。ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ薬品は、２つの異なる投与量、すなわち、負荷量（ＬＤ）および維持量（ＭＤ）により提供される。ＬＤおよびＭＤは、同じ総タンパク質含有量を有し、ペルツズマブＳＣ原体とトラスツズマブ原体の比が異なっている。一実施形態において、方法は、ペルツズマブおよびトラスツズマブＦＤＣの負荷量の電荷変異体を決定するために有用である。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブの両方の電荷変異体は、同時に、すなわち同じ方法によって決定される。一実施形態において、方法を使用して、４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含むペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの電荷変異体を分析する。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、ｒＨｕＰＨ２０を２０００Ｕ／ｍＬで追加的に含む。一実施形態において、方法は、ペルツズマブおよびトラスツズマブＦＤＣの維持量の電荷変異体を決定するために有用である。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブの両方の電荷変異体は、同時に、すなわち同じ方法によって決定される。一実施形態において、方法を使用して、６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含むペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの電荷変異体を分析する。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、ｒＨｕＰＨ２０を２０００Ｕ／ｍＬで追加的に含む。
一実施形態において、天然抗体、ならびにこれらの酸性および塩基性変異体は、少なくとも４４分かけて１～１００％（溶媒Ｂ）の塩勾配で溶出される。一実施形態において、塩勾配は、４３分かけて１から４７％の溶媒Ｂに増加される。一実施形態において、塩勾配は、約１．８から１０３．４ｍＭのＮａＣｌに増加される。別の実施形態において、塩勾配は、約２ｍＭのＮａＣｌから約９４ｍＭのＮａＣｌに増加される。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーの移動相はＡＣＥＳバッファーを含む。一実施形態において、移動相Ａおよび移動相ＢはＡＣＥＳバッファーを含む。一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーの溶媒Ａは、約１０～５０ｍＭ、約１５～２５ｍＭ、約１８～２２ｍＭまたは約２０ｍＭのＡＣＥＳを含む。一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーの溶媒Ｂは、約１０～５０ｍＭ、約１５～２５ｍＭ、約１８～２２ｍＭまたは約２０ｍＭのＡＣＥＳ、および約１８０～２２０ｍＭのＮａＣｌを含む。一実施形態において、溶媒Ｂは約２０ｍＭのＡＣＥＳを含む。
（ｉｉ）含量／タンパク質含有量アッセイ
ＵＶ分光測光法は、製剤試料の総タンパク質含有量を決定する典型的な方法である。しかし、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）では、異なる手法が必要であり、それは従来の方法が、ＦＤＣ中の抗ＨＥＲ２抗体それぞれについて別々で定量的なタンパク質含有量の分析が可能ではないからである。異なるクロマトグラフィー方法を試験し、例えば、疎水性相互作用（ＨＩＣ）および逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）であった。ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの別々の定量的タンパク質含有量の分析に関しては、逆相クロマトグラフィーが最も好適な方法であることが証明された。
逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＨＰＬＣ、ＲＰＣ）は、溶液中の分子を疎水性に従って分離する。分離は、カラム中の非極性固定相への分子の可逆的な疎水性吸着によって起こされる。固体支持体への分子の吸着は、２つの部分の疎水性／非極性相互作用によって駆動される。相互作用の強さは、分子および固定相における官能基の数および位置によって決定される。逆相クロマトグラフィーにおいて、非極性分子は、極性分子より多い保持時間で固定相から溶出する。２つの抗ＨＥＲ２抗体のトラスツズマブおよびペルツズマブが９３％を超える配列同一性を有し、合計で３０Ｄａだけが異なっているので、信頼のおける全体分解能およびピーク分離を提供し、かつ有意な持ち越し汚染を有さない（すなわち、持ち越し汚染は後続の分析において０．２％を超えるべきではない）頑健的な方法を開発した。加えて、試験戦略のために開発された含有量アッセイは、トラスツズマブ・ペルツズマブ一定用量配合剤がペルツズマブＳＣ原体とトラスツズマブ原体の比が異なっている２つの異なる投与量、すなわち、負荷量および維持量で提供されることを考慮している。フェニルベースカラムは特に頑健な結果を与えること、および頑健な方法にとって最も重要なパラメーターはカラム温度および流量であることが、本発明者たちによって見出された。フェニルベースＲＰ－ＵＨＰＬＣカルムは、当該技術に公知であり、以下の基：メチル側基およびエンドキャップされたシリカ表面を有するエチルフェニル、伸長した（ヘキシル）リガンドスペーサーメチル側基を有するフェニルヘキシル相、立体保護（イソブチル）側基を有するエチルフェニルリガンド、メチル側基を有するヘキシルビフェニル、メチル側基を有するビフェニル相、メチル側基を有する酸素活性化フェニルエチルフェニル相を有することができる。フェニル（例えば、単一フェニル、ビフェニル、ジフェニル、フェニルヘキシル、フェニルプロピル）で修飾された固定相を有するＨＰＬＣカラムは、大部分の主要なカラム供給会社から容易に入手可能である。本明細書に有用なフェニルカルムの一例は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｌｙカラムである。一実施形態において、前記カラムは、２．１×１００ｍｍカラムである。
本明細書に提供されるものは、２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法であって、
ａ．ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカラムを準備することと、
ｂ．２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）をＲＰ－ＨＰＬＣカラムに負荷することと、
ｃ．２つの抗ＨＥＲ２抗体を０．２～０．４ｍＬ／分の流量で分離し、カラム温度が６４℃～７６℃であることと、
を含む方法である。
ＲＰ－ＨＰＬＣの分離原理は、クロマトグラフィー樹脂表面におけるポリペプチド溶質と疎水性リガンドの疎水性会合に基づいている。ＲＰ－ＨＰＬＣカラムは、通常、真空脱ガス器、試料冷却器を有するオートサンプラー、カラム加熱器およびＵＶ／ＶＩＳ検出器を直列で備えたＵＨＰＬＣ系の一部である。好適なＵＨＰＬＣ系の例は、Ｗａｔｅｒｓ ＡｑｕｉｔｙおよびＴｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳである。
２つの抗ＨＥＲ２抗体のＦＤＣは、その試料をＲＰ－ＨＰＬＣ系に注入することによってカラムに負荷される。通常、試料は、例えば、およそ０．５～５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈される。試料濃度の１．０ｍｇ／ｍＬは、検出器のシグナルを飽和することなく微量種の良好な検出を可能にすることが、本発明者たちによって見出された。一実施形態において、試料は製剤バッファーで希釈される。一実施形態において、前記製剤バッファーは、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ－メチオニン、α，α－トレハロース二水和物、スクロースおよびポリソルベート２０を含む。製剤バッファーを希釈剤として使用することによって、以前と異なる希釈剤の使用が試料および参照溶液を変化させるリスクが存在しなくなる。ＲＰ－ＨＰＬＣ方法を用いると、製剤バッファーからの関連する干渉は観察されなかった。一実施形態において、注入容量は、０．５～１００μＬ、１～５０μＬ、５～１０μＬ、または１０μＬである。一実施形態において、注入容量は１０μＬである。一実施形態において、カラムへの総タンパク質負荷量は１０μｇである。
タンパク質は水性移動相でＲＰ－ＨＰＬＣカラムに結合し、移動相の疎水性を増加することによってカラムから溶出される。次いでタンパク質は、これらの疎水性に従って分離される。２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、工程ｃ）の分離は、水－２－プロパノール／アセトニトリル勾配で達成される。１つのそのような実施形態において、タンパク質は、水：２－プロパノール（９８：２）＋０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水性相（溶出剤Ａ）でカラムに結合され、アセトニルを含む有機相の漸増濃度により溶出される。１つのそのような実施形態において、有機層（溶出剤Ｂ）は、２－プロパノール：アセトニル：溶出剤Ａ（７０：２０：１０）を含む。フェニルベースカラムのタイプのおかげで、改善された特異性が達成され、新たな種が２－プロパノールだけで検出されたが、純粋なアセトニトリルでは検出されなかった。異なる特異性が達成され、それはフェニルベースカラムが伝統的な疎水性相互作用を介し、また追加的にπ－π相互作用を介しても被分析物と相互作用したからである。純粋なアセトニトリルはこれらの相互作用を妨げること、一方で２－プロパノールは妨げないことが文献から示されている（Ｙａｎｇ，Ｍ．、Ｆａｚｉｏ，Ｓ．、Ｍｕｎｃｈ，Ｄ．およびＤｒｕｍｍ，Ｐ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ π－π ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｐｈｅｎｙｌ ｃｏｌｕｍｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １０９７巻、１２４～１２９頁）。しかし、２－プロパノールの高い粘性およびそれに関連する逆圧の増加を考慮して、２０％のアセトニトリルを添加して、系の逆圧を低下させた。
一実施形態において、水性移動相は、７０％の溶出剤Ａおよび３０％の溶出剤Ｂを含み、ここで溶出剤Ａは、水：２－プロパノール（９８：２）＋０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含み、溶出剤Ｂは、２－プロパノール：アセトニトリル：溶出剤Ａ（７０：２０：１０）を含む。１つのそのような実施形態において、有機層（溶出剤Ｂ）は、５５％の溶出剤Ａおよび４５％の溶出剤Ｂに増加される。一実施形態において、勾配は、１５分かけて４５％の溶媒Ｂに増加される。
一実施形態において、有機層（溶出剤Ｂ）は、１０％の溶出剤Ａおよび９０％の溶出剤Ｂに増加される。一実施形態において、勾配は、２０分かけて９０％の溶媒Ｂに増加される。
０．４および０．２ｍＬ／分の流量を試験し、実施した方法に有意な影響を与えないことが見出された。２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、工程ｃ）の流量は約０．３ｍＬ／分である。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、抗体は１０～２０分間にわたって分離される。１つのそのような実施形態において、抗体は１５分間にわたって分離される。一実施形態において、抗体は、約０．３ｍＬ／分の流量で１５分間にわたって分離される。
負荷および溶出（分離）工程に加えて、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、平衡、洗浄および再生などの追加の工程を含むことができる。一実施形態において、ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカルムは、７０％の溶出剤Ａおよび３０％の溶出剤Ｂで平衡を保ち、ここで溶出剤Ａは、水：２－プロパノール（９８：２）＋０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含み、溶出剤Ｂは、２－プロパノール：アセトニトリル：溶出剤Ａ（７０：２０：１０）を含む。一実施形態において、ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカルムは、１０％の溶出剤Ａおよび９０％の溶移動相で洗浄され、ここで溶出剤Ａは、水：２－プロパノール（９８：２）＋０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含み、溶出剤Ｂは、２－プロパノール：アセトニトリル：溶出剤Ａ（７０：２０：１０）を含む。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、カラム温度は７０℃＋－２℃である。室温と比較して、７０℃のカラム温度は高い再現性を導き、テーリング効果を除去し、系の低い逆圧を示し、全体的な結果おいて良好な分解能および分離を示す。いくつかのカラム温度を試験し、７０℃が改善されたピークパターンを示し、同時に系およびカラムタイプが可能とする最大温度に達していない。６４℃と７６℃、および６６℃と７４℃の温度をそれぞれ試験し、実施した方法に有意な影響を与えないことが見出された。
２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法の一実施形態において、フェニルカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラム、Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｈｅｎｙｌ－１（Ｄｉｏｎｅｘ）、Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）ＸＲｓ Ｄｉｐｈｅｎｙｌ、Ｐｉｎｎａｃｌｅ（登録商標）Ｂｉｐｈｅｎｙｌ、Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｈｅｘｙｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｐｈｅｎｙｌ、ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ ＰｏｌｙｐｈｅｎｙｌおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ ｍＡｂ Ｄｉｐｈｅｎｙｌの群から選択されるカラムである。一実施形態において、フェニルカルムはＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラムである。別の実施形態において、フェニルカルムはＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌカラムである。
一実施形態において、タンパク質はＵＶにより検出される。一実施形態において、検出波長は２８０ｎｍである。
一実施形態において、一定用量配合剤は、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。１つのそのような実施形態において、ヒアルロニダーゼは組換えヒトヒアルロニダーゼである。一実施形態において、前記ヒアルロニダーゼはｒＨｕＰＨ２０である。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、約２０００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含む。ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ薬品は、２つの異なる投与量、すなわち、負荷量（ＬＤ）および維持量（ＭＤ）により提供される。ＬＤおよびＭＤは、同じ総タンパク質含有量を有し、ペルツズマブＳＣ原体とトラスツズマブ原体の比が異なっている。一実施形態において、方法は、ペルツズマブおよびトラスツズマブＦＤＣの負荷量のタンパク質含有量を決定するために有用である。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブの両方のタンパク質含有量は、同時に、すなわち同じ方法によって決定される。一実施形態において、方法を使用して、４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含むペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣのタンパク質含有量を分析する。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、ｒＨｕＰＨ２０を２０００Ｕ／ｍＬで追加的に含む。一実施形態において、方法は、ペルツズマブおよびトラスツズマブＦＤＣの維持量のタンパク質含有量を決定するために有用である。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブの両方のタンパク質含有量は、同時に、すなわち同じ方法によって決定される。一実施形態において、方法を使用して、６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含むペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣのタンパク質含有量を分析する。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、ｒＨｕＰＨ２０を２０００Ｕ／ｍＬで追加的に含む。
ＩＩＩ．抗ＨＥＲ２抗体および組成物
（ｉ）抗ＨＥＲ２抗体
抗体の産生に使用されるＨＥＲ２抗原は、例えば、所望のエピトープを含むＨＥＲ２受容体またはその一部分の細胞外ドメインの可溶形態でありうる。あるいは、細胞表面にＨＥＲ２を発現する細胞（例えば、ＨＥＲ２を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞；またはＳＫ－ＢＲ－３細胞などの癌細胞株、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８巻：８６９１～８６９５頁（１９９１年）を参照のこと）を使用して、抗体を生成することができる。抗体の生成に有用なＨＥＲ２受容体の他の形態は、当業者に明らかである。
本明細書のモノクローナル抗体を作製する様々な方法が当該技術において利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製してもよく、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製してもよい。
本発明により使用される、抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ、およびペルツズマブは、市販されている。
米国特許第６，９４９，２４５号は、ＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ受容体のリガンド活性化をブロックする例示的なヒト化ＨＥＲ２抗体の産生を記載する。
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、参照により本明細書所に明示的に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載され、本明細書に定義されているトラスツズマブ；ならびにヒト化２Ｃ４抗体、例えば、本明細書に記載および定義されているペルツズマブが具体的に挙げられる。
本明細書のヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重ドメインに組み込まれた非ヒト超可変領域残基を含んでもよく、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年）に記述された可変ドメイン番号付けシステムを利用して６９Ｈ、７１Ｈおよび７３Ｈからなる群から選択される位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換をさらに含んでもよい。一実施形態において、ヒト化抗体は、６９Ｈ、７１Ｈおよび７３Ｈの位置のうちの２つ、またはすべてにＦＲ置換を含む。
本明細書において目的の例示的なヒト化抗体は、可変重ドメイン相補性決定残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（配列番号１７）（ここでＸは、好ましくは、ＤもしくはＳである）；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号１８）；および／またはＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号１９）を含み、任意選択でこれらのＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含み、例えば、修飾は抗体の親和性を本質的に維持または改善する。例えば、本発明の方法に使用される抗体変異体は、上記の可変重ＣＤＲ配列に約１～約７個、または約５個のアミノ酸置換を有してもよい。このような抗体変異体は、例えば下記に記載されている親和性成熟によって調製されうる。
ヒト化抗体は、可変軽ドメイン相補性決定残基ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号２０）；ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３（ここでＸ１は、好ましくはＲもしくはＬであり、Ｘ２は、好ましくはＹもしくはＥであり、Ｘ３は、好ましくはＴもしくはＳである）（配列番号２１）；および／またはＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号２２）を、例えば、前段落のこれらの可変重ドメインＣＤＲ残基に加えて含んでもよい。このようなヒト化抗体は、上記のＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を任意選択で含み、例えば、修飾は抗体の親和性を本質的に維持または改善する。例えば、目的の抗体変異体は、上記の可変軽ＣＤＲ配列に約１～約７個、または約５個のアミノ酸置換を有してもよい。このような抗体変異体は、例えば下記に記載されている親和性成熟によって調製されうる。
本出願はまた、ＨＥＲ２に結合する親和性成熟抗体を企図する。親抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよく、例えば、それぞれ配列番号７および８の可変軽配列および／または可変重配列を含む（すなわち、ペルツズマブのＶＬおよび／またはＶＨを含む）ものであってもよい。ペルツズマブの親和性成熟変異体は、好ましくは、マウス２Ｃ４またはペルツズマブより優れた親和性（例えばＥＬＩＳＡにより査定すると、例えば、約２倍または約４倍から約１００倍または約１０００倍まで改善された親和性）によってＨＥＲ２受容体に結合する。置換の例示的な可変重ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、または２個以上（例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、または７個）の組み合わせが挙げられる。改変のための可変軽ＣＤＲ残基の例には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７または２個以上（例えば、これらの残基の２個から３、４、５または約１０個まで）の組み合わせが挙げられる。
トラスツズマブのものを含むヒト化変異体を生成するマウス４Ｄ５抗体のヒト化は、米国特許第５，８２１，３３７号、同第６，０５４，２９７号、同第６，４０７，２１３号、同第６，６３９，０５５号、同第６，７１９，９７１号および同第６，８００，７３８号、ならびにＣａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８９巻：４２８５～４２８９頁（１９９２年）に記載されている。ＨｕＭＡｂ４Ｄ５－８（トラスツズマブ）は、マウス４Ｄ５抗体より３倍密接してＨＥＲ２抗原に結合し、ヒトエフェクター細胞の存在下でヒト化抗体の指向型細胞傷害活性が可能になる二次免疫機能（ＡＤＣＣ）を有した。ＨｕＭＡｂ４Ｄ５－８は、可変軽（ＶＬ）κサブグループＩのコンセンサスフレームワークに組み込まれたＶＬＣＤＲ残基、および可変重鎖（ＶＨ）サブグループＩＩＩのコンセンサスフレームワークに組み込まれたＶＨＣＤＲ残基を含んだ。抗体は、さらに、ＶＨの位置７１、７３、７８および９３（フレームワーク領域（ＦＲ）残基のＫａｂａｔ番号付け）にＦＲ置換、ならびにＶＬの位置６６（ＦＲ残基のＫａｂａｔ番号付け）にＦＲ置換を含んだ。トラスツズマブは、非Ａアロタイプヒトγ１Ｆｃ領域を含む。
様々な形態のヒト化抗体または親和性成熟抗体が企図される。例えば、ヒト化抗体または親和性成熟抗体は、抗体断片であってもよい。あるいは、ヒト化抗体または親和性成熟抗体は、インタクトな抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体であってもよい。
（ｉｉ）ペルツズマブ組成物
ＨＥＲ２抗体組成物の一実施形態において、この組成物は、天然のペルツズマブ抗体およびその１つまたは複数の変異体の混合物を含む。ペルツズマブ天然抗体の本明細書における好ましい実施形態は、配列番号７および８の可変軽および可変重アミノ酸配列を含むものであり、最も好ましくは、配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列および配列番号１２の重鎖アミノ酸配列を含むものである。一実施形態において、この組成物は、天然ペルツズマブ抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むアミノ酸配列変異体との混合物を含む。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体変異体の軽鎖（例えば、抗体変異体の１つまたは２つの軽鎖）にある。主要種ＨＥＲ２抗体または抗体変異体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ＝）２断片のＦａｂ）でありうるが、好ましくは、両方とも完全長抗体である。本明細書における抗体変異体は、その重鎖または軽鎖のうちのいずれか１つまたは複数にアミノ末端リーダー伸長を含んでもよい。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体の１つまたは２つの軽鎖にある。アミノ末端リーダー伸長は、好ましくは、ＶＨＳを含む、またはＶＨＳからなる。組成物中のアミノ末端リーダー伸長の存在は、Ｎ末端配列解析、電荷不均一性についてのアッセイ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動）、質量分析などが挙げられるが、これらに限定されない様々な分析技法によって検出することができる。組成物中の抗体変異体の量は、一般に、変異体を検出するために使用される任意のアッセイ（好ましくは、Ｎ末端配列解析）の検出限界を構成する量から、主要種抗体の量未満の量までの範囲である。一般に、組成物中の抗体分子の約２０％以下（例えば、約１％～約１５％、例えば、５％～約１５％）が、アミノ末端リーダー伸長を含む。そのような量の百分率は、好ましくは、定量的Ｎ末端配列解析または陽イオン交換分析を使用して（好ましくは、高分解能弱陽イオン交換カラム、例えば、ＰＲＯＰＡＣ ＷＣＸ－１０（商標）陽イオン交換カラムを使用して）決定される。アミノ末端リーダー伸長変異体とは別に、主要種抗体および／または変異体のさらなるアミノ酸配列改変が企図され、重鎖の一方または両方にＣ末端リジン残基を含む抗体、脱アミド化抗体変異体などが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、主要種抗体または変異体は、グリコシル化変形をさらに含んでもよく、その非限定的な例には、Ｆｃ領域に結合されるＧ１もしくはＧ２オリゴ糖を含む抗体、軽鎖に結合される炭水化物部分を含む抗体（例えば、抗体の１つもしくは２つの軽鎖に結合される、例えば、１つもしくは複数のリジン残基に結合される、１つもしくは２つの炭水化物部分、例えば、グルコースもしくはガラクトース）、１つもしくは２つの非グリコシル化重鎖を含む抗体、または１つもしくは２つの重鎖に結合されるシアリデート化（ｓｉａｌｉｄａｔｅｄ）オリゴ糖を含む抗体が挙げられる。
組成物は、遺伝子操作された細胞株、例えば、ＨＥＲ２抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から回収されうるか、またはペプチド合成によって調製されうる。
例示的なペルツズマブ組成物に関するさらなる情報については、米国特許第７，５６０，１１１号および同第７，８７９，３２５号、ならびに米国特許出願第２００９／０２０２５４６Ａ１号を参照のこと。
（ｉｉｉ）トラスツズマブ組成物
トラスツズマブ組成物は、一般に、主要種抗体（それぞれ配列番号１３および１４の軽鎖配列および重鎖配列を含む）と、これらの変異体形態、特に酸性変異体（脱アミド化変異体を含む）との混合物を含む。好ましくは、組成物中のそのような酸性変異体の量は、約２５％未満、または約２０％未満、または約１５％未満である。米国特許第６，３３９，１４２号を参照のこと。また、ピークＡ（両方の軽鎖でＡｓｐに脱アミドされたＡｓｎ３０）；ピークＢ（一方の重鎖でｉｓｏＡｓｐに脱アミドされたＡｓｎ５５）；ピーク１（一方の軽鎖でＡｓｐに脱アミドされたＡｓｎ３０）；ピーク２（一方の軽鎖でＡｓｐに脱アミドされたＡｓｎ３０、および一方の重鎖でｉｓｏＡｓｐに異性化されたＡｓｐ１０２）；ピーク３（主ピーク形態、または主要種抗体）；ピーク４（一方の重鎖でｉｓｏＡｓｐに異性化されたＡｓｐ１０２）；ならびにピークＣ（一方の重鎖にＡｓｐ１０２スクシンイミド（Ａｓｕ））を含む、陽イオン交換クロマトグラフィーによって分解可能なトラスツズマブの形態については、Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｂ７５２巻：２３３～２４５頁（２００１年）を参照のこと。
（ｉｖ）一定用量配合剤中のトラスツズマブ・ペルツズマブ組成物
本実施例は、トラスツズマブ・ペルツズマブ一定用量配合剤に見出された様々な電荷変異体に対する広範囲な研究を開示している。許容基準を、臨床経験、ならびに生物活性／ＰＫおよび安全性／免疫原性プロファイルに対す想定される影響に基づいて確立した。本明細書に提供される組成物は、追加的な免疫原性および安全性のリスクを有することなく、安全なバイオ医薬品（ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）に必要な生物活性およびＰＫを有すると考慮される。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２３％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２３％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも３８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを９％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２１％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも２３％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブ、トラスツズマブおよびこれらの電荷変異体を含む組成物は、イオン交換クロマトグラフィーにより分析される。一実施形態において、ペルツズマブ、トラスツズマブおよびこれらの電荷変異体を含む組成物は、上記の実施形態のいずれかに従ってイオン交換クロマトグラフィーを用いて分析される。一実施形態において、天然抗体および電荷変異体の百分率は、上記の実施形態のいずれかに従ってイオン交換クロマトグラフィーにより決定されるピーク領域に等しく、（ｉ）ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ変異体、ペルツズマブシアル酸変異体、ペルツズマブリジン糖化変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブおよびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブはピーク１～３で溶出し、よって組成物内のこれらの変異体の百分率はピーク領域１～３の合計と等しく、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体はピーク４で溶出し、よって組成物中のペルツズマブ天然抗体の百分率はピーク４のピーク領域に等しく、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体はピーク７で溶出し、よって組成物中のトラスツズマブ天然抗体の百分率はピーク７のピーク領域と等しく、（ｉｖ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブはピーク８で溶出し、よって組成物中のこの変異体の百分率はピーク８のピーク領域に等しい。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、上記の実施形態のいずれかに記載されている方法により決定して、ピーク１～３の合計の２３％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも２８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも１６％のピーク領域、およびピーク８の１２％未満のピーク領域を含む。一態様において、前記方法は、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５である工程と、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７である工程と、
を含む。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む。
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、上記のペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法は、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、上記の実施形態のいずれかに記載されている方法により決定して、ピーク１～３の合計の２３％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも３８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも１６％のピーク領域、およびピーク８の９％未満のピーク領域を含む。一態様において、前記方法は、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５である工程と、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７である工程と、
を含む。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む。
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、上記のペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法は、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、上記の実施形態のいずれかに記載されている方法により決定して、ピーク１～３の合計の２１％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも２８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも２３％のピーク領域、およびピーク８の１２％未満のピーク領域を含む。一態様において、前記方法は、
ａ．ローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させ、ローディングバッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５である工程と、
ｂ．溶出バッファーで抗体を溶出し、溶出バッファーのｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７である工程と、
を含む。
一実施形態において、イオン交換材料は、陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換材料である。一実施形態において、陽イオン交換材料はスルホネート基を含む。
一実施形態において、工程ｂは塩勾配で実施される。一実施形態において、溶出バッファーはナトリウムを含む。一実施形態において、溶出バッファーは塩化ナトリウムを含む。
一実施形態において、上記のペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法は、
ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
を追加的に含む。
一実施形態において、方法は３２～４０℃の温度で実施される。一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２２％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２９．２％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも２１．８％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを５％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２２％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも３９．４％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも２１．８％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを４．１％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物が提供され、組成物は、ＨＣ－Ａｓｐ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を１９．８％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２９．２％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも３１％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを５％未満含む。
一実施形態において、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
本発明の更なる態様において、本明細書に提供される組成物は、以下の工程：
ａ．所定量のペルツズマブを配合容器に添加する工程と、
ｂ．トラスツズマブを、トラスツズマブとペルツズマブの１：１の比またはトラスツズマブとペルツズマブの１：２の比で添加する工程と、
ｃ．ｒＨｕＰＨ２０を添加する工程と、
を含む方法により得られる。
一実施形態においてトラスツズマブとペルツズマブの１：１の比は、６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物をもたらす。一実施形態においてトラスツズマブとペルツズマブの１：２の比は、４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物をもたらす。一実施形態において、ｒＨｕＰＨ２０を組成物に添加して、２０００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０の最終濃度を達成する。
ＩＶ．組換えＨＥＲ２細胞外ドメイン
サブドメインＩＶを欠いている修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、Ｃ末端で短縮されている組換えサブドメインＩＩＩを含む場合、天然ＨＥＲ２ ＥＣＤに似ている三次元立体構造で産生されうることを本発明者たちは見出している。１つのそのような実施形態において、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、配列番号１、配列番号２および配列番号３４を含む。一実施形態において、配列番号２４を含む修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。一実施形態において、配列番号２４に９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。
一実施形態において、組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩはＦｃドメインに融合している。一実施形態において、前記Ｆｃドメインは、マウス、ラット、ウサギまたはヤマアラシＦｃドメインである。一実施形態において、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７を含む修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。一実施形態において、配列番号２５に９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。一実施形態において、配列番号２６に９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。一実施形態において、配列番号２７に９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。
一実施形態において、配列番号３３、配列番号３および配列番号４を含む修飾ＥＣＤが提供される。一実施形態において、修飾ＥＣＤは、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３および配列番号４を含む。
サブドメインＩＩを欠いている修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤは、Ｃ末端で短縮され、かつＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインＩＩがＥＧＦＲサブドメインＩＩに置き換えられている組換えサブドメインＩを含む場合、天然ＨＥＲ２ ＥＣＤに似ている三次元立体構造で産生されうることを本発明者たちは見出している。一実施形態において、配列番号２９を含む修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。一実施形態において、配列番号２９に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。
一実施形態において、組換えＨＥＲ２細胞外サブドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶ、ならびにＥＧＦＲのサブドメインＩＩは、Ｆｃドメインに融合している。一実施形態において、前記Ｆｃドメインは、マウス、ラット、ウサギまたはヤマアラシＦｃドメインである。上記の実施形態のいずれかにおいて、トラスツズマブの結合を査定するための捕獲試薬は、ＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインＩＩを含まない。一実施形態において、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２を含む組換えＨＥＲ２細胞外ドメインが提供される。一実施形態において、配列番号３０に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。一実施形態において、配列番号３１に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。一実施形態において、配列番号３２に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤが提供される。
組換えＨＥＲ２細胞外ドメインは、当該技術に公知の方法によって産生および精製されうる。一実施形態において、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインを作製する方法が提供され、方法は、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインの発現に好適な条件下で組換えＨＥＲ２細胞外ドメインをコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意選択で組換えＨＥＲ２細胞外ドメインを宿主細胞（または、宿主細胞培地）から回収することを含む。組換えＨＥＲ２細胞外ドメインの組換え産生では、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインをコードする核酸が単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、容易に、従来の手順を使用して単離および配列決定すること、または組換え方法により産生すること、または化学合成によって得ることができる。
組換えＨＥＲ２細胞外ドメインコードベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載されている原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインは細菌より産生されうる。細菌中の抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、および米国特許第５，８４０，５２３号を参照のこと。発現後、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインを可溶性画分で細菌細胞ペーストから単離してもよく、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインコードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。組換えＨＥＲ２細胞外ドメインの発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が確認されており、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。脊椎動物細胞も、宿主として使用されうる。例えば、懸濁液で成長するように適合された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６巻（１９７７年）５９～７４頁に記載されている２９３または２９３Ｔ細胞）；仔ハムスター腎蔵細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３巻（１９８０年）２４３～２５２頁に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット腎臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３巻（１９８２年）４４～６８頁に記載されているもの）；ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＨＯ）細胞が挙げられ、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７巻（１９８０年）４２１６～４２２０頁）；および骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が含まれる。一態様において、宿主細胞は真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
Ｖ．キット
本発明はまた、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する第１の抗体および第２のＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合を特異的に定量化するキットであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３４を含むタンパク質を捕獲試薬として含有する容器と、
（ｂ）ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合を定量化するための指示書と、
を含むキットである。
一実施形態において、捕獲試薬は配列番号２４を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２４に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２５に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２６に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２７に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、前記指示書は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する第１の抗体結合の結合を、その力価と相関させる指示書を含む。
一実施形態において、第２の抗体は第１の抗体と異なるエピトープに結合する。一実施形態において、第２の抗体は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体である。一実施形態において、第１の抗体はペルツズマブである。一実施形態において、第２の抗体はトラスツズマブである。
一実施形態において、前記ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。１つのそのような実施形態において、ヒアルロニダーゼは組換えヒトヒアルロニダーゼである。一実施形態において、前記ヒアルロニダーゼはｒＨｕＰＨ２０である。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、約２０００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含む。
本発明はまた、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体および第２のＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体の結合を特異的に定量化するキットであって、
ａ．配列番号３３、配列番号３６、配列番号３および配列番号４を含むタンパク質を捕獲試薬として含有する容器と、
（ｂ）ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体の結合を定量化するための指示書と、
を含むキットである。
一実施形態において、捕獲試薬は配列番号２９を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号２９に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２を含む。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号３０に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号３１に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、捕獲試薬は、配列番号３２に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％または９０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、前記指示書は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体の結合を、その力価と相関させる指示書を含む。
一実施形態において、第２の抗体は第１の抗体と異なるエピトープに結合する。一実施形態において、第２の抗体は、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体である。一実施形態において、第１の抗体はトラスツズマブである。一実施形態におい第２の抗体はペルツズマブである。
一実施形態において、前記ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤は、ヒアルロニダーゼを追加的に含む。１つのそのような実施形態において、ヒアルロニダーゼは組換えヒトヒアルロニダーゼである。一実施形態において、前記ヒアルロニダーゼはｒＨｕＰＨ２０である。一実施形態において、前記ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣは、約２０００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０を含む。
ＶＩ．製造方法
一実施形態において、組成物を作製する方法であって、（１）ペルツズマブ、トラスツズマブおよびこれらの１つまたは複数の変異体を含む一定用量配合剤を生産すること、ならびに（２）そのように生産された組成物を分析アッセイに付して、変異体の量を評価することを含み、変異体が、（ｉ）ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ、ペルツズマブＦＣシアル酸変異体、ペルツズマブリジン糖化変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ、ＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体、（ｖｉ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを含む、方法が提供される。
一実施形態において、変異体は、（ｉ）次の変異体：ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ、ペルツズマブＦＣシアル酸変異体およびペルツズマブリジン糖化変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ、ＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブを２３％未満、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、（ｉｖ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む。
一実施形態において、変異体は、（ｉ）次の変異体：ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ、ペルツズマブＦＣシアル酸変異体、ペルツズマブリジン糖化変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ、ＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブを２３％未満、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体を少なくとも３８％、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、（ｉｖ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを９％未満含む。
一実施形態において、変異体は、（ｉ）次の変異体：ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ、ペルツズマブＣシアル酸変異体およびペルツズマブリジン糖化変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ、ＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブを２１％未満、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体を少なくとも２３％、（ｉｖ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む
一実施形態において、前記分析アッセイはイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態において、前記分析アッセイは、上記の実施形態のいずれかによるイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態において、百分率は、上記の実施形態のいずれかに従ってイオン交換クロマトグラフィーにより決定されるピーク領域に等しく、（ｉ）ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ変異体、ペルツズマブＦＣシアル酸変異体、ペルツズマブリジン糖化変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブおよびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブはピーク１～３で溶出し、よって組成物内のこれらの変異体の百分率はピーク領域１～３の合計に等しく、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体はピーク４で溶出し、よって組成物中のペルツズマブ天然抗体の百分率はピーク４のピーク領域に等しく、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体はピーク７で溶出し、よって組成物中のトラスツズマブ天然抗体の百分率はピーク７のピーク領域に等しく、（ｉｖ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブはピーク８で溶出し、よって組成物中のこの変異体の百分率はピーク８のピーク領域に等しい。
一実施形態において、以下の追加的な変異体の量は分析アッセイによって分析される：（ｖ）重鎖および軽鎖にＮ末端ＶＨＳを有するペルツズマブ、重鎖でＣ末端リジンを有するペルツズマブ、ＨＣ－Ａｓｎー３９２の脱アミド化を有するトラスツズマブ、リジン糖化を有するトラスツズマブ、および増加したＦｃシアル酸含有量を有するトラスツズマブ。
一実施形態において、前記分析アッセイはイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態において、前記分析アッセイは、上記の実施形態のいずれかによるイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態において、百分率は、上記の実施形態のいずれかに従ってイオン交換クロマトグラフィーにより決定されたピーク領域に等しく、（ｖｉｉ）重鎖および軽鎖にＮ末端ＶＨＳを有するペルツズマブ、重鎖でＣ末端リジンを有するペルツズマブ、ＨＣ－Ａｓｎ－３９２の脱アミド化を有するトラスツズマブ、リジン糖化を有するトラスツズマブ、および増加したＦｃシアル酸含有量を有するトラスツズマブは、ピーク５～６で溶出し、よって、組成物中のこれらの変異体の百分率は、ピーク５～６のピーク領域に等しい。
一実施形態において、以下の追加的な変異体の量は分析アッセイによって分析される：（ｖｉ）一方の重鎖にスクシンイミドへのＨＣ Ａｓｐ １０２の単独の異性化を有し、かつトラスツズマブＦｃ酸化を有するトラスツズマブ。
一実施形態において、前記分析アッセイはイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態において、前記分析アッセイは、上記の実施形態のいずれかによるイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態において、百分率は、上記の実施形態のいずれかに従ってイオン交換クロマトグラフィーにより決定されたピーク領域に等しく、（ｖｉ）一方の重鎖にスクシンイミドへのＨＣ Ａｓｐ１０２の単独の異性化を有し、かつトラスツズマブＦｃ酸化を有するトラスツズマブは、ピーク９～１０で溶出する。よって、組成物中のこれらの変異体の百分率は、ピーク９～１０のピーク領域に等しい。
一実施形態において、方法は、ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む組成物を作製するための方法である。一実施形態において、組成物は２０００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０を含む。一実施形態において、方法は、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物を作製するための方法である。一実施形態において、組成物は、４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。一実施形態において、組成物は、６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。
一実施形態において、上記に記載された作製方法の工程（１）は、以下の工程：
ａ．所定量のペルツズマブを配合容器に添加する工程と、
ｂ．トラスツズマブを、トラスツズマブとペルツズマブの１：１の比またはトラスツズマブとペルツズマブの１：２の比で添加する工程と、
ｃ．ｒＨｕＰＨ２０を添加する工程と、
を含む。
一実施形態においてトラスツズマブとペルツズマブの１：１の比は、６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物をもたらす。一実施形態においてトラスツズマブとペルツズマブの１：２の比は、４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物をもたらす。
一実施形態において、ｒＨｕＰＨ２０を組成物に添加して、２０００Ｕ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０の最終濃度を達成する。
ＶＩＩ．治療のための患者の選択
ＨＥＲ２発現または増幅の検出を使用して、本発明による治療のために患者を選択することができる。いくつかのＦＤＡ承認済みの市販アッセイは、ＨＥＲ２陽性、ＨＥＲ２発現、ＨＥＲ２過剰発現またはＨＥＲ２増幅がんの患者を確認するために利用可能である。これらの方法には、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）およびＰＡＴＨＷＡＹ（登録商標）ＨＥＲ２（免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ）、ならびにＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ（登録商標）およびＨＥＲ２ ＦＩＳＨ ｐｈａｒｍＤｘ（商標）（ＦＩＳＨアッセイ）が挙げられる。使用者は、各アッセイの妥当性および性能の情報について特異的アッセイキットの添付文書を参照するべきである。
例えば、ＨＥＲ２発現または過剰発現は、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）を使用してＩＨＣにより分析することができる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに付し、以下のＨＥＲ２タンパク質染色強度基準に一致させることができる：
スコア０：染色が観察されない、または膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋：かすかな／ほとんど知覚できない膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて検出される。これらの細胞は、それらの膜の一部のみが染色されている。
スコア２＋：弱度から中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。
スコア３＋：中程度から強度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。
ＨＥＲ２過剰発現査定の０または１＋のスコアを有するこれらの腫瘍を、ＨＥＲ２陰性と特徴づけることができ、２＋または３＋のスコアを有するこれらの腫瘍をＨＥＲ２陽性と特徴づけることができる。
ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍は、細胞１個あたりの発現されるＨＥＲ２分子のコピー数に対応する免疫組織化学スコアによって評価されてもよく、生化学的に決定されうる：
０＝０～１０，０００個のコピー／細胞、
１＋＝少なくとも約２００，０００個のコピー／細胞、
２＋＝少なくとも約５００，０００個のコピー／細胞、
３＋＝少なくとも約２，０００，０００個のコピー／細胞。
３＋レベルでのＨＥＲ２の過剰発現は、チロシンキナーゼのリガンド非依存性活性化を導き（Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：７１５９～７１６３頁（１９８７年））、乳がんのおよそ３０％で起こり、これらの患者では無再発生存期間および全生存期間が減少する（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：７０７～７１２頁（１９８９年）；Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５巻：１７７～１８２頁（１９８７年））。
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現および遺伝子増幅の存在は高く相関しており、したがって代替的または追加的に、遺伝子増幅を検出するアッセイであるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の使用を、本発明による治療に適切な患者の選択のために用いることもできる。ＦＩＳＨアッセイ、例えば、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ、Ａｒｉｚｏｎａにより販売）またはＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ（登録商標）（Ｖｙｓｉ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織に実行して、腫瘍中のＨＥＲ２増幅の程度（存在する場合）を決定することができる。
最も一般的には、ＨＥＲ２陽性状態は、前述の方法のいずれかを使用し、アーカイブのパラフィン包埋腫瘍組織を使用して確証される。
好ましくは、２＋もしくは３＋のＩＨＣスコアを有する、および／またはＦＩＳＨもしくはＩＳＨ陽性であるＨＥＲ２陽性患者は、本発明による治療に選択される。３＋のＩＨＣスコアおよびＦＩＳＨ／ＩＳＨ陽性を有する患者は、本発明による治療に特に好適である。
ＨＥＲ２指向型療法への応答性と関連するＨＥＲ２突然変異も確認されている。そのような突然変異には、限定されることなく、ＨＥＲ２のエクソン２０への挿入、ＨＥＲ２のアミノ酸残基７５５～７５９周囲の欠失、Ｇ３０９Ａ、Ｇ３０９Ｅ、Ｓ３１０Ｆ、Ｄ７６９Ｈ、Ｄ７６９Ｙ、Ｖ７７７Ｌ、Ｐ７８０－Ｙ７８１ｉｎｓＧＳＰ、Ｖ８４２Ｉ、Ｒ８９６Ｃ（Ｂｏｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１３年；３巻：１１４頁）のいずれかの突然変異、ならびに２つ以上の独自標本に見出されるＣＯＳＭＩＣデータベース中の以前に報告された同一の非同義推定活性化突然変異（または、インデル）が挙げられる。
ペルツズマブによる療法について患者をスクリーニングするための代替的アッセイについては、米国特許第７，９８１，４１８号および実施例も参照のこと。
Figure 2023533813000001
Figure 2023533813000002
実施例１
ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ
ＦＤＣ薬品ＬＤおよびＭＤにおける２つの活性成分であるペルツズマブおよびトラスツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに対するＩｇＧ１サブクラスの組換えヒト化モノクローナル抗体である。ＦＤＣ薬品の第３の活性成分であるｒＨｕＰＨ２０は、局所透過エンハンサーとして機能して、伝統的に静脈で送達される治療薬の皮下送達が可能になる一過性の活性酵素（組換えヒトヒアルロニダーゼ）である。
ＦＤＣ薬品は、無色から僅かに茶色を帯びた滅菌の皮下注射用液剤として提供される。防腐剤を含有しない。以下に記載されている２つの製剤である。
負荷量ＦＤＣ薬品ＬＤ
各２０ｍＬの単回用量バイアルは、１２００ｍｇ（公称）のペルツズマブ、６００ｍｇ（公称）のトラスツズマブおよび２０００Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（ｒＨｕＰＨ２０、ボルヒアルロニダーゼアルファ）を目標ｐＨの５．５で含有する。薬品は、８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブおよび４０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブで製剤化される。製剤に使用される添加物は、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ－メチオニン、α，α－トレハロース二水和物、スクロースおよびポリソルベート２０である。
維持量ＦＤＣ薬品ＭＤ
各１５ｍＬの単回用量バイアルは、６００ｍｇ（公称）のペルツズマブ、６００ｍｇ（公称）のトラスツズマブおよび２０００Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（ｒＨｕＰＨ２０、ボルヒアルロニダーゼアルファ）を目標ｐＨの５．５で含有する。薬品は、６０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブおよび６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブで製剤化される。製剤に使用される添加物は、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ－メチオニン、α，α－トレハロース二水和物、スクロースおよびポリソルベート２０である。
実施例２
細胞ベースアッセイによるペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの力価
この方法は、ＭＤＡ－ＭＢ－１７５－ＶＩＩ細胞またはＢＴ－４７４細胞それぞれの増殖を阻害する能力を測定して、ペルツズマブおよびトラスツズマブの力価を決定する。典型的なアッセイにおいて、９６ウェルマイクロタイタープレートにＭＤＡ－ＭＢ－１７５－ＶＩＩ細胞またはＢＴ－４７４細胞を播種し、加湿インキュベーターにおいて５％の二酸化炭素と共に３７℃で一晩インキュベートする。インキュベートした後、培地を取り出し、様々な濃度の参照標準、アッセイ対照および試料をプレートに添加する。次いでプレートを３日間インキュベートし、生細胞の相対数を、レドックス色素のａｌａｍａｒＢｌｕｅを間接的に使用して定量化する。
蛍光は、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎｍでの放出を使用して測定する。
ａｌａｍａｒＢｌｕｅ色素は酸化状態では青色および非蛍光性であるが、細胞の細胞内環境で還元されて、ピンク色の形態になり、これは極めて蛍光性である。色および蛍光の変化は、生細胞の数に比例している。ＲＦＵで表されている結果を抗体濃度に対してプロットし平行線分析プログラムを使用して、参照標準に対するＦＤＣ試料の抗増殖活性を推定する。
細胞ベースアッセイは、ＦＤＣ薬品の一方またはもう一方の抗体に選択的に感受性があるが、図７ＡおよびＢに示されているように、抗体の両方に感受性があるわけではない。個々に分析すると、トラスツズマブは、ＢＴ－４７４細胞に抗増殖活性を有するが、ＭＤＡ－ＭＤ－１７５－ＶＩＩ細胞には有さず、ペルツズマブは、ＭＤＡ－ＭＢ－１７５－ＶＩＩ細胞に抗増殖活性を有するが、ＢＴ－４７４細胞に対する活性は、高濃度へ強くシフトしている。２つの細胞株における感受性の差は、ＨＥＲ２への親和性の差ではなく、異なるＨＥＲ２発現レベル（ＢＴ－４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－１７５－ＶＩＩそれぞれに対して高度および中程度）に基づいている可能性がある。また、全体的な抗増殖活性に関与するＨＥＲ３発現レベルおよび他の潜在的なパラメーター（例えば、ＨＥＲ３内因性リガンドヘレグリンの存在または非存在）が、感受性の差に寄与する可能性がある。加えて、原体細胞ベースアッセイにおいて、一方の抗体の存在がもう一方の抗体の応答に影響を及ぼし、一方またはもう一方の抗体で起こる潜在的な品質変化を遮蔽する。ペルツズマブおよびトラスツズマブは、ＨＥＲ２シグナル伝達を破壊する相補的な作用機序を有し、両方が存在する場合に高い抗増殖活性をもたらす（図８ＡおよびＢ）。トラスツズマブ単独では、ペルツズマブ抗増殖アッセイにおいてＭＤＡ－ＭＢ－１７５－ＶＩＩ細胞の増殖を阻害することができないが（図７ＡおよびＢ）、ペルツズマブの添加は、トラスツズマブ用量応答曲線を低いＥＣ５０値にシフトし、トラスツズマブおよびペルツズマブが組み合わせた場合の高い力価を反映している（図８Ａ）。したがって、ＦＤＣ薬品中のペルツズマブの僅かな品質変化は、ＭＤＡ－ＭＢ－１７５－ＶＩＩ抗増殖アッセイによって検出されない。同様の観察は、あまり際立っていないが、ＢＴ－４７４抗増殖性アッセイのペルツズマブにおいて行われた（図８Ｂ）。さらに、逆方向への抗体の僅かな品質変化は、１００％の力価をもたらしうる。
ＦＤＣ薬品のいずれかの抗体の実質的な品質変化が抗増殖アッセイにより検出できないことを実証するため、ＣＤＲに指向型変化（それぞれ、ＨＣ Ｓ５５Ａ突然変異およびＬＣ Ｈ９１Ａ突然変異）を有するペルツズマブおよびトラスツズマブＨＥＲ２親和性突然変異体を、ペルツズマブおよびトラスツズマブ抗増殖アッセイにおいて試験した（図９ＡおよびＢ）。ＨＥＲ２に対して大きく低減した突然変異体の親和性は、対応する細胞ベースアッセイにおける抗増殖活性の低減と相関する。トラスツズマブ突然変異体へのペルツズマブ（または、ペルツズマブ突然変異体へのトラスツズマブ）の添加は、用量応答曲線の形状を部分的に回復し、したがって抗増殖活性を回復する。
要約すると、抗増殖アッセイにおいて観察された選択的感受性、相補性機序および遮蔽効果に基づいて、これらのアッセイは、合剤中のどちらかの抗体の活性に関連する変化を検出するために好適ではないと考慮される。これらの制限が、抗増殖アッセイをＦＤＣ薬品の生物活性の決定および制御に使用するには不適格にする。したがって、そのような交差干渉に影響を受けない２つの選択的力価のＥＬＩＳＡを設計して、ＦＤＣ薬品中の２つの抗体の結合活性における関連する変化を制御する。ＥＬＩＳＡの選択性は、ＨＥＲ２受容体の異なるエピトープを一次結合標的として使用することによって確実になる。
実施例３
ＥＬＩＳＡによるＦＤＣ中のペルツズマブの力価
ＦＤＣ薬品の力価を、２つの別々のＥＬＩＳＡを使用して制御する。ここに、ＦＤＣ薬品のペルツズマブ成分の生物活性を制御するＥＬＩＳＡを記載する。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外サブドメインＩＩに特異的である、ＨＥＲ２に対するモノクローナルＩｇＧ１抗体である。結合すると、ペルツズマブはＨＥＲ２のヘテロ二量体化をＨＥＲ受容体ファミリーのリガンド活性化メンバーで防止して、ＨＥＲ２の活性化をブロックする。このことは、ＨＥＲ２過剰発現細胞の下流のシグナル伝達経路の阻害をもたらす。ペルツズマブのＥＬＩＳＡは、ペルツズマブが組換えＨＥＲ２のエピトープ（すなわち、サブドメインＩＩ）に特異的に結合する能力として特定の生物活性を決定する。図６は、ペルツズマブのＥＬＩＳＡおよびトラスツズマブのＥＬＩＳＡに使用される捕獲試薬の模式図を描写する（詳細は実施例６を参照のこと）。
結合は、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を使用して測定する。試料および標準で生成された用量応答曲線は、定量化の基礎を提供する。ＥＬＩＳＡでは、ペルツズマブの実際のタンパク質含有量（ＦＤＣ薬品の実際のタンパク質総含有量ではない）が、希釈調製物において考慮される。ペルツズマブのＥＬＩＳＡは、ＦＤＣ薬品のＬＤとＭＤの両方に使用される。
機器および材料
９６－ウェル免疫プレート（例えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡ）
吸収度プレート読取り機
４パラメーターデータ整理ソフトウエアおよび並列処理分析ソフトウエア（例えば、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ）を備えたコンピューター
マイクロプレート洗浄機
試薬
●ペルツズマブコート試薬：マウスＦｃに融合されている組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ；ドメインＩＶ（トラスツズマブエピトープに含有されている）は欠失している（配列番号２７）。
●検出抗体：ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体（
ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分に特異的である）（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）
●カルシウムおよびマグネシウムのない１×ＤＰＢＳ
●精製水、例えば、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ
●ＢＳＡ画分Ｖ
●Ｔｗｅｅｎ２０
●ＡＢＴＳ基質溶液
●リン酸濃縮液（８５％）
溶液
注：処方箋は試薬の名目量のものであり、アッセイ要件に対応して調整することができる。
洗浄バッファー：１×ＤＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０
アッセイ希釈剤：１×ＤＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．５％のＢＳＡ画分Ｖ
コーティング溶液：１×ＤＰＢＳ中のペルツズマブコート試薬（１μｇ／ｍＬ）
検出抗体：０．８ｍｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体
検出溶液：検出抗体（０．８ｍｇ／ｍＬ）をアッセイ希釈剤に希釈して、１６ｎｇ／ｍＬの濃度にすることによって、検出溶液を調製する。使用前に新たに調製する。
停止溶液：１Ｍのリン酸
参照標準：ＦＤＣのＭＤ参照基準
プレートのコーティング
－１００μＬのコーティング溶液をマイクロタイタープレートの各ウェルに移す。
－コートされたプレートを２℃～８℃で３０～６０分間インキュベートする。
プレートのブロッキング
－、コートされたすべてのプレートを３００μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄して、過剰量のコーティング溶液を除去する。
－１００μＬのアッセイ希釈剤を各ウェルに添加して、すべてのプレートをブロックする。
－プレートを、穏やかに振とうしながら常温で６０～９０分間インキュベートする。
－プレートを３００μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄ブロックする。
試料の移動
－１００μＬ／ウェルのＦＤＣ参照基準、製品対照および試料希釈液をイムノプレートのウェルに移す。
－プレートを、穏やかに振とうしながら常温で６０～９０分間インキュベートする。
検出
－１００μＬの検出溶液（１６ｎｇ／ｍＬ）をプレートの各ウェルに移す。
－プレートを、穏やかに振とうしながら常温で３０～９０分間インキュベートする。
－プレートを３００μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄する。
基質の移動および測定
－１００μＬ／ウェルのＡＢＴＳ基質溶液をプレートの各ウェルに移す。
－プレートを、穏やかに振とうしながら常温で２０～３５分間インキュベートする。
－反応を停止させるために、１００μＬ／ウェルの停止溶液をプレートの各ウェルに移す。
－プレートを少なくとも１分間軽く撹拌して混合する。
－３０分以内に、０Ｄ値を吸収度プレート読取り機により波長４０５ｎｍ（参照波長４９０ｎｍ）で測定する。
評価
－各ウェルのＯＤ値を次のように計算する：ＯＤ（４０５ｎｍ）－ＯＤ（４９０ｎｍ）。
式中、ＯＤ（４０５ｎｍ）：４０５ｎｍでの検出吸光度、ＯＤ（４９０ｎｍ）：４９０ｎｍでの参照吸収度。
－複製のＯＤ値を平均して、平均ＯＤを決定する。
－平均ＯＤ（ｙ）をペルツズマブ抗体濃度ｎｇ／ｍＬ（ｘ）の濃度に対してプロットして、標準、製品対照および試料の用量応答曲線を生成する。
－以下の４パラメーター方程式を使用して、非線形回帰を適用する：
Figure 2023533813000003
式中：
Ａ：下方漸近線
Ｂ：ヒルスロープ
Ｃ：ＥＣ５０値
Ｄ：上方漸近線
－標準、製品対照および試料曲線のＲ２を計算する。
－標準デルタＯＤを以下のように計算する：
標準デルタＯＤ＝（標準の平均最大ＯＤ）－（標準の平均最小ＯＤ）
－最大ＯＤを以下のように決定する：
最大ＯＤ値は、用量応答曲線のすべての複製内で得た、４０５ｎｍでの最大ＯＤ値である。
力価の計算
－４パラメーター平行線分析を使用して、標準および試料（または、製品対照）曲線のヒルスロープ、上方漸近線および下方漸近線の共通セットを計算する。
－標準および試料（または、製品対照）の得られた曲線方程式は、下記である：
Figure 2023533813000004
式中：
Ａ＝共通の下方漸近線
Ｂ＝ヒルスロープ
Ｃ標準＝標準ＥＣ５０値
Ｄ＝共通の上方漸近線
ρ＝参照標準に対する試料および製品対照の力価
－相対力価を以下のように計算する：
相対力価＝ρ×参照標準の活性
参照標準力価割当
ＦＤＣ薬品のペルツズマブ力価は、ＦＤＣ薬品の総タンパク質含有量ではなく、ペルツズマブのタンパク質含有量に基づいている。したがって、力価測定は、ＦＤＣ薬品中の２つの分子の比と無関係であり、１個の単一分子参照標準を使用して、ＦＤＣ薬品のＭＤおよびＬＤ試料の力価を決定することができる。ＤＣのＭＤ参照標準を力価の参照標準として選択した。
ＦＤＣのＭＤ参照基準の力価割当の詳細は、以下のように提供される：
－力価は、１．００×１０４Ｕ／ｍｇと設定した。
－ＥＬＩＳＡによるペルツズマブ力価の決定は、市販のペルツズマブＩＶ参照標準ａｎｔｉ２Ｃ４９０７－２に対して実施した。
－ＥＬＩＳＡによるトラスツズマブ力価の決定は、市販のトラスツズマブＳＣ参照標準Ｇ００５．０３ＥＰ１に対して実施した。
結果：ペルツズマブ・トラスツズマブ一定用量配合剤におけるペルツズマブの結合を、ペルツズマブＥＬＩＳＡアッセイで分析した。代表的な用量応答曲線を図１０に描写する。
実施例４
ペルツズマブＥＬＩＳＡの特異性
実施例３のペルツズマブＥＬＩＳＡの特異性を査定するため、製剤バッファーおよび構造的に関連する分子を単一プレートに最高アッセイ濃度で二重に試験した。構造的に関連する分子による干渉が観察される（複製の平均値が参照標準用量応答曲線の下方漸近線平均値より３倍高い）場合、１つの報告可能な決定結果（ｎ＝１）を有する完全用量応答曲線の増大が実施される。
結果は、ペルツズマブＥＬＩＳＡがペルツズマブに特異的であることを実証する：
●ｒＨｕＰＨ２０含有ＦＤＣのＬＤおよびＭＤ製剤バッファーの両方がアッセイに干渉を示さず、これらのマトリックスで製剤化されたＦＤＣ薬品使用を分析するためのアッセイへの適合性を実証した。
●トラスツズマブを含む（ペルツズマブを除く、下記を参照のこと）構造的に関連する分子は、ペルツズマブＥＬＩＳＡに干渉しなかった。このことは、参照標準用量応答曲線の下方漸近線ＯＤ平均値より３倍低い複製の平均ＯＤ値によって示されている。
●予想されたように、ＦＤＣ薬品製剤およびペルツズマブＩＶで製剤化されたペルツズマブＳＣ原体は、同じＨＥＲ２ドメインＩＩに結合するので、ペルツズマブＥＬＩＳＡに干渉を示した。
結果を表３に示す。
Figure 2023533813000005
実施例５
ペルツズマブＥＬＩＳＡの頑健性
ペルツズマブＥＬＩＳＡの頑健性を、実践における変動の潜在源であるアッセイパラメーターの恣意的変動によって査定した。頑健性の結果は、得られた用量応答曲線パラメーター、系への適合性および類似性基準を方法の手順条件と比較して評価した。全体的な頑健性の結果を表４に要約する。
Figure 2023533813000006
実施例６
ＥＬＩＳＡによるＦＤＣ中のトラスツズマブの力価
ＦＤＣ薬品の力価を、２つ類似したＥＬＩＳＡを使用して制御する。このセクションは、ＦＤＣ薬品のトラスツズマブ成分の生物活性を制御するＥＬＩＳＡを記載する。トラスツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外サブドメインＩＶに特異的である、ＨＥＲ２に対するモノクローナルＩｇＧ１抗体である。結合すると、トラスツズマブはＨＥＲ２細胞外ドメインのホモ二量体化およびシェディングを防止して、ＨＥＲ２の活性化をブロックする。
このことは、ＨＥＲ２過剰発現細胞の下流のシグナル伝達経路の阻害をもたらす。トラスツズマブのＥＬＩＳＡは、トラスツズマブが組換えＨＥＲ２のエピトープ（すなわち、サブドメインＩＶ）に特異的に結合する能力として特定の生物活性を決定する。図６は、トラスツズマブのＥＬＩＳＡに使用される捕獲試薬の模式図を描写する。
結合は、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を使用して測定する。試料および標準で生成された用量応答曲線は、定量化の基礎を提供する。ＥＬＩＳＡでは、トラスツズマブの実際のタンパク質含有量（ＦＤＣ薬品の実際のタンパク質総含有量ではない）が、希釈調製物において考慮される。トラスツズマブのＥＬＩＳＡは、ＦＤＣ薬品のＬＤとＭＤの両方に使用される。
試薬、バッファーおよび手順は、コート試薬およびコーティング溶液を除いて、実施例３に概説されているとおりである。
●トラスツズマブコート試薬：マウスＦｃに融合されている組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ；ドメインＩＩは、ペルツズマブに結合することができないＥＧＦＲの構造的に関連するドメインＩＩ（配列番号３２）に置き換えられている。
●コーティング溶液：１×ＤＰＢＳ中のトラスツズマブコート試薬（１μｇ／ｍＬ）
評価
－各ウェルのＯＤ値を次のように計算する：ＯＤ（４０５ｎｍ）－ＯＤ（４９０ｎｍ）。
式中、ＯＤ（４０５ｎｍ）：４０５ｎｍでの検出吸光度、ＯＤ（４９０ｎｍ）：４９０ｎｍでの参照吸収度。
－複製のＯＤ値を平均して、平均ＯＤを決定する。
－平均ＯＤ（ｙ）をトラスツズマブ抗体濃度ｎｇ／ｍＬ（ｘ）の濃度に対してプロットして、標準、製品対照および試料の用量応答曲線を生成する。
－以下の４パラメーター方程式を使用して、非線形回帰を適用する：
Figure 2023533813000007
式中：
Ａ：下方漸近線
Ｂ：ヒルスロープ
Ｃ：ＥＣ５０値
Ｄ：上方漸近線
－標準、製品対照および試料曲線のＲ２を計算する。
－標準デルタＯＤを以下のように計算する：
標準デルタＯＤ＝（標準の平均最大ＯＤ）－（標準の平均最小ＯＤ）
－最大ＯＤを以下のように決定する：
最大ＯＤ値は、用量応答曲線のすべての複製内で得た、４０５ｎｍでの最大ＯＤ値である。
力価の計算
－４パラメーター平行線分析を使用して、標準および試料（または、製品対照）曲線のヒルスロープ、上方漸近線および下方漸近線の共通セットを計算する。
－標準および試料（または、製品対照）の得られた曲線方程式は、下記である：
Figure 2023533813000008
式中：
Ａ＝共通の下方漸近線
Ｂ＝共通のヒルスロープ
Ｃ標準＝標準ＥＣ５０値
Ｄ＝共通の上方漸近線
ρ＝参照標準に対する試料および製品対照の力価
－相対力価を以下のように計算する：
相対力価＝ρ×参照標準の活性
参照標準力価割当
ＦＤＣ薬品のトラスツズマブ力価は、ＦＤＣ薬品の総タンパク質含有量ではなく、トラスツズマブのタンパク質含有量に基づいている。したがって、力価測定は、ＦＤＣ薬品中の２つの分子の比と無関係であり、１個の単一分子参照標準を使用して、ＦＤＣ薬品のＭＤおよびＬＤ試料の力価を決定することができる。ＦＤＣのＭＤ参照標準を力価の参照標準として選択した。
ＦＤＣのＭＤ参照基準の力価割当の詳細は、以下のように提供される：
－力価は、１．００×１０４Ｕ／ｍｇと設定した。
－ＥＬＩＳＡによるペルツズマブ力価の決定は、市販のペルツズマブ参照標準ａｎｔｉ２Ｃ４９０７－２に対して実施した。
－ＥＬＩＳＡによるトラスツズマブ力価の決定は、市販のトラスツズマブＳＣ参照標準Ｇ００５．０３ＥＰ１に対して実施した。
結果：ペルツズマブ・トラスツズマブ一定用量配合剤におけるトラスツズマブの結合を、トラスツズマブＥＬＩＳＡアッセイで分析した。代表的な用量応答曲線を図１１に描写する。
実施例７
トラスツズマブＥＬＩＳＡの特異性
トラスツズマブＥＬＩＳＡの特異性を査定するため、製剤バッファーおよび構造的に関連する分子を単一プレートに最高アッセイ濃度で二重に試験した。構造的に関連する分子による干渉が観察される（複製の平均値が参照標準用量応答曲線の下方漸近線平均値より３倍高い）場合、１つの報告可能な決定結果（ｎ＝１）を有する完全用量応答曲線の増大が実施される。
結果は、トラスツズマブＥＬＩＳＡがトラスツズマブに特異的であることを実証する：
●ｒＨｕＰＨ２０含有ＦＤＣのＬＤおよびＭＤ製剤バッファーの両方がアッセイに干渉を示さず、これらのマトリックスで製剤化されたＦＤＣ薬品使用を分析するためのアッセイへの適合性を実証した。
●ペルツズマブを含む（トラスツズマブを除く、下記を参照のこと）構造的に関連する分子は、トラスツズマブＥＬＩＳＡに干渉しなかった。このことは、参照標準用量応答曲線の下方漸近線ＯＤ平均値より３倍低い複製の平均ＯＤ値によって示されている。
●予想されたように、トラスツズマブ（ＩＶおよびＳＣ）、ならびにトラスツズマブ エムタンシンは、同じＨＥＲ２ドメインＩＶに結合するので、トラスツズマブＥＬＩＳＡにおいて干渉を示した。
結果を表５に示す。
Figure 2023533813000009
実施例８
トラスツズマブＥＬＩＳＡの頑健性
トラスツズマブＥＬＩＳＡの頑健性を、実践における変動の潜在源であるアッセイパラメーターの恣意的変動によって査定した。頑健性の結果は、得られた用量応答曲線パラメーター、系への適合性および類似性基準を方法の手順条件と比較して評価した。全体的な頑健性の結果を表６に要約する。
Figure 2023533813000010
実施例９
ＦＤＣ電荷変異体を分析するＩＥＣの開発
様々なイオン交換クロマトグラフィープロトコールを試験して、ＦＤＣ電荷変異体を分解した。以下のパラメーターを試験した：カラムタイプ、バッファータイプおよび濃度、塩濃度、流量、注入容量、ｐＨ値、カラム温度、ならびに勾配プロファイル。
試験方法を開発して以下のピーク／ピーク群の相対存在度（総ピーク領域の％）を分離および決定する。
－ピーク１～３の合計
－ピーク４（ペルツズマブの主ピーク）
－ピーク５～６の合計
－ピーク７（トラスツズマブの主ピーク）
－ピーク８
－ピーク９～１０の合計
ＦＤＣのＩＥ－ＨＰＬＣ法を開発し、ペルツズマブ電荷変異体およびトラスツズマブ電荷変異体の最高の分離を達成できるように最適化した。トラスツズマブＳＣおよびペルツズマブＳＣを別々に分析して、予測される電荷変異体を推論することができる。パージェタＳＣ（ロットＧＢ０００５、ｃ＝１２０ｍｇ／ｍＬ）およびハーセプチンＳＣ（ロットＰ０００３、ｃ＝１２０ｍｇ／ｍＬ）を個々に、また共混合物（ｃｏ－ｍｉｘｔｕｒｅ）として使用して、実験を実施した。
第１の工程では、パージェタＩＶおよびハーセプチンＩＶ／ＳＣの個々の分子への登録ＩＥ－ＨＰＬＣ法を試験した。これらの方法は、例えば、Ｚｅｐｈａｎｉａ Ｗ．Ｋｗｏｎｇ Ｇｌｏｖｅｒら、Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ａｄｍｉｘｔｕｒｅｓ ｉｎ ｉ．ｖ．Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｂａｇｓ ｆｏｒ Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、０２巻、３版、７９４～８１２頁、２０１３年３月１日、ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｐｓ．２３４０３に公開されている。これらの方法では、弱陽イオン交換カラム（ＷＣＸ－１０）が使用される（表７、方法１および２を参照のこと）。次の工程では、ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ－１０カラムを、ペルツズマブ／トラスツズマブの類似したｐＩ値を担持する別のｍＡｂ製品で成功を収めた作動条件で試験した（表７の方法３を参照のこと）。次の工程では、強陽イオン交換カラムを使用し、異なるバッファーおよびｐＨ値を試験した。使用したパラメーターおよび結果を下記の表７に要約する。
次の工程では、異なるカラムをスクリーニングした。最高の分解能を、強陽イオン交換カラム（Ｍａｂ ＰＡＣ ＳＣＸ－１０）で達成した。異なるバッファーおよびｐＨ値を試験した（方法４～６）。使用したパラメーターおよび結果を表７に要約する。さらなる一連の処理を方法６に基づいて行い、最高の結果を得た（表８を参照のこと）。
結果
方法１：ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣを方法１の条件で分析すると、ピークの分解能は製品放出アッセイの要件を満たさなかった。ピーク７（トラスツズマブ主ピーク）とピーク８（トラスツズマブのＩｓｏＡｓｐ１０２）の分解能は十分ではなく、ペルツズマブの塩基性領域はトラスツズマブの主ピークと重複していた。
方法２：ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣを方法２の条件で分析すると、ピークの分解能は製品放出アッセイの要件を満たさなかった。ペルツズマブの塩基性領域は、トラスツズマブ主ピーク（ピーク７）およびピーク８と完全に重複しており、したがって許容されない。
方法３：トラスツズマブとペルツズマブの両方の主ピークを分離することができ、ペルツズマブの塩基性領域の僅かな重複のみが観察された。しかし、トラスツズマブの酸性領域はペルツズマブの主ピークと重複していた。
方法４：ペルツズマブの塩基性領域を、トラスツズマブの主ピークおよびトラスツズマブのＩｓｏＡｓｐ１０２ピーク（ピーク８）と重複させる。
方法５：１：ｐＨ７．５：主ピークとピーク８の両方とも良好な分離があり、ペルツズマブの塩基性領域とトラスツズマブの主ピークでは僅かな重複のみである。
方法５２：ｐＨ８．０：ピーク８に良好な分離があるが、ｐＨ７．５の方法５と比較して、ペルツズマブの塩基性領域とトラスツズマブの主ピークに強い重複がある。
方法６：目的のすべての種に良好な分離がある。
Figure 2023533813000011
上記の表８に記載されたＨＰＬＣパラメーターに基づいて、いくつかの実験計画（実験計画（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ、ＤｏＥ）を実行した。以下のパラメーターを試験した。
●勾配プロファイル
●流量（０．５～１．０ｍＬ／分）
●移動相ＡおよびＢのｐＨ値（７．４～７．６および６．８）
●移動ＢのＮａＣｌ濃度（１００～３００ｍＭ）
●カラム温度（２５～４０℃）
これらに実験設計の枠内で得たデータを分析すると、以下の試験パラメーターが最高の結果を示した。
●溶出剤Ａ ２０ｍＭのＡＣＥＳ、ｐＨ７．５
●溶出剤Ｂ ２０ｍＭのＡＣＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５
●カラムＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、ＢｉｏＬＣ、４×２５０ｍｍ
●カラム温度４０℃
●流量 ０．８ｍＬ／分
●注入量１０μＬ（１００μｇのタンパク質）
●勾配 ４０分で１～４７％のＢ
この開発された方法の頑健性を分析するため、Ｄｏｅに基づいた要因実験計画（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｄｅｓｉｇｎ）を実施した。したがって、以下のパラメーターはマトリックスによって変動した。
●ＡＣＥＳ濃度：１８～２２ｍＭ
●ＮａＣｌ濃度：１８０～２２０ｍＭ
●カラム温度：３６～４４℃
●流量：０．７～０．９ｍＬ／分
●ｐＨ：７．４～７．６
●注入容量：８～１２μＬ（８０～１２０μｇ）
これらの実験の結果は、試験方法がトラスツズマブの主ピーク（ピーク７）およびピーク８に関して試験範囲内で頑健であることを示した。しかし、ペルツズマブ主ピーク（ピーク４）および中間領域（ペルツズマブの主ピークとトラスツズマブの主ピークの間の領域）で得られた純度値に、高い変動性が観察された。この変動性は、ｐＨおよびカラム温度に強く依存していた。この実験の統計的評価は、最終方法の設定をもたらした。
●溶出剤Ａ ２０ｍＭのＡＣＥＳ、ｐＨ７．６
●溶出剤Ｂ ２０ｍＭのＡＣＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐ７．６
●カラム温度３６℃
●流量０．８ｍＬ／分
●注入量１０μＬ（１００μｇのタンパク質）
●勾配 ４０分で１～４７％のＢ
ペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣ変異体の電荷不均一性を決定することが可能である代替案を評価した。これらの代替案のうち、異なるカラムタイプおよびｐＨ勾配方法の適合性を査定した。
陰イオン交換カラムのＰｒｏＰａｃ ＷＡＸ－１０ ｂｉｏ ＬＣ、４×２５０ｍｍを以下のクロマトグラフィー条件下で使用して、いくつかの分離の試みも行った。
●以下の希釈剤ＡおよびＢを調製し、試験した。
１．Ａ＝２０ｍＭのＣＡＰＳＯ ｐＨ１０．０、Ｂ＝２０ｍＭのＣＡＰＳＯ＋２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ１０．０
２．Ａ＝２０ｍＭのピペラジン ｐＨ１０．０、Ｂ＝２０ｍＭのピペラジン＋２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ１０．０
３．Ａ＝２０ｍＭのトリズマ（ｔｒｉｓｍａ） ｐＨ１０．５、Ｂ＝２０ｍＭのトリズマ＋２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ１０．５
４．Ａ＝２０ｍＭのトリズマ ｐＨ８．０、Ｂ＝２０ｍＭのトリズマ＋２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０
５．Ａ＝２０ｍＭのホスファット ｐＨ１１．０、Ｂ＝２０ｍＭのホスファット＋２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ１１．０
●カラム温度３０℃
●流量０．８ｍＬ／分；１．０ｍＬ／分
●注入量５μＬ（５０μｇのタンパク質）
●勾配１ ６０分で０～１００％のＢ
●勾配２ ４０分で０～１００％のＢ
弱陰イオン交換カラムで試験したすべての条件では、目的の種はカラムに保持されず、注入ピークと一緒に溶出し、よって、これらの実験条件がペルツズマブ・トラスツズマブＦＤＣの電荷変異体の分離にはすべて好適ではないことを示している。
ｐＨ勾配分離モードの実験
ｐＨ勾配に基づいたＩＥＣ方法の適合性を、塩勾配方法の可能な代替案として査定した。強陽イオン交換カラム（ＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０カラム）を、以下のＨＰＬＣ試験パラメーターで使用した。
●溶出剤Ａ １０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのホスファット、１０ｍＭのピペラジン、ｐＨ６．０
●溶出剤Ｂ １０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのホスファット、１０ｍＭのピペラジン、ｐＨ１１．０
●溶出剤Ｃ １００ｍＭのＮａＣｌ
●溶出剤Ｄ 純水
●カラムＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、ＢｉｏＬＣ、４×２５０ｍｍ
●カラム温度３５℃
●流量０．５ｍＬ／分
●注入量１０μＬ（１０μｇのタンパク質）
●勾配 ４５分で１０～５０％のＢ（詳細は下記を参照のこと）
●機器 Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ
溶出剤ＣおよびＤを組み合わせて、一定の塩濃度の０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭおよび５０ｍＭのＮａＣｌを提供した。したがって、溶出剤Ｃ／溶出剤Ｄの比は、０％の溶出剤Ｃ／５０％の溶出剤Ｄ（０ｍＭのＮａＣｌ）から５０％の溶出剤Ｃ／０％の溶出剤Ｄ（５０ｍＭのＮａＣｌ）に変動した。パージェタＳＣ（ロットＧＢ０００５、ｃ＝１２０ｍｇ／ｍＬ）およびハーセプチンＳＣ（ロットＰ０００３、ｃ＝１２０ｍｇ／ｍＬ）を個々に、また共混合物として使用して、実験を実施した。試験試料を９０％の溶出剤Ａ／１０％の溶出剤Ｂで希釈して、最終濃度の１ｍｇ／ｍＬにした。
最高の分離は、４０ｍＭのＮａＣｌを使用して得たが、そうであっても、これらの条件下ではピークが非常に早期に溶出し、２つの主ピークが幅広の形状および低減された高さを提示した。
実験計画（ＤｏＥ）を、勾配プロファイルおよび流量を変えながら４０ｍＭのＮａＣｌの塩濃度設定で行った。それにもかかわらず設計モデルを確立することができ、試験条件の僅かな変更でさえも本発明の方法の頑健性を欠くことを示した。
上記で行った実験から、ＩＥＣ方法に最も重要なパラメーターは、１．ｐＨ値、２．カラムタイプ、３．カラム温度、４．勾配プロファイルであると思われる。これらのパラメーターは、分解能に有意な影響を有する。一方、バッファータイプおよび濃度、塩濃度、流量、ならびに注入量は分解能に小さい影響しか有さない。
実施例１０
ＦＤＣ電荷変異体を分析するＩＥＣ
目的および原理
ＩＥ－ＨＰＬＣは、薬品に存在するタンパク質を溶解状態の電荷性質に従って分離する。この分離は、タンパク質の表面電荷と、カラム充填物の表面に存在する荷電基との相互作用に基づいている。この分析手順に使用される陽イオン交換ＨＰＬＣでは、塩勾配において酸性種が最初に溶出し、より塩基性の種が後に溶出する。同じ方法がＦＤＣ薬品のＬＤとＭＤに適用される。ＦＤＣのＭＤ参照標準が、ＦＤＣ薬品のＬＤとＭＤの両方の試験に使用される。
機器および材料
●ＵＶ検出器（２４８７／２４８９検出器または同等を有するＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５／ｅ２６９５）を備えたＨＰＬＣ系
●ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＡｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、４ｍｍ～２５０ｍｍ、粒径：１０μｍまたは１０μｍ相当）
溶液
●薬品希釈バッファー：２０ｍＭのＬ－ヒスチジン／Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩、１０５ｍＭのトレハロース、１００ｍＭのスクロース、１０ｍＭのメチオニン、０．０４％［ｗ／ｖ］のポリソルベート２０、ｐＨ５．５±０．２
●移動相Ａ：２０ｍＭのＡＣＥＳ、ｐＨ７．６０±０．０５
●移動相Ｂ：２０ｍＭのＡＣＥＳ、２００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．６０±０．０５
●ＣｐＢ溶液：１ｍｇ／ｍＬのＣｐＢ（移動相Ａ中）
試料溶液の調製：
ＦＤＣ薬品を移動相Ａで希釈して、およそ１０ｍｇ／ｍの総タンパク質濃度およびおよそ０．０８ｍｇ／ｍＬのＣｐＢを含有する試料溶液を調製する。
ブランク溶液の調製：
薬品希釈バッファーを試料と同じ方法で希釈する。
ＣｐＢの消化
参照標準、試料およびブランク溶液を３７℃±２℃で２０±５分間インキュベートする。試料を分析するまで１０℃±４℃で保管し、ＨＰＬＣ分析を２４時間以内に完了させる必要がある。
手順
最初の試料を注入する前に、カラムを安定したベースラインが得られるまで９９％の移動相Ａですすぐ。任意選択で、クロマトグラムの視覚評価が少なくとも２つの連続注入で一定したプロファイルを実証するまで、参照溶液をカラム条件づけの目的で注入する。
動作パラメーター
●検出波長：２８０ｎｍ
●注入容量：１０μＬ
●流量：０．８ｍＬ／分
●カラム温度：３６℃±２℃
●オートサンプラー温度：１０℃±４℃
●運転時間：６０分
Figure 2023533813000013
注入プロトコール
注入は、以下の順番で実施される
１．移動相Ａ
２．ブランク溶液
３．参照標準
４．試料（１０個の試料まで）
５．参照標準
６．ブランク溶液
注：１０個を超える試料が分析される場合、１０個ごとの試料を参照標準の注入で一括して取り扱う。
結果：
ＦＤＣの薬品のＩＥ－ＨＰＬＣ法を開発し、ペルツズマブ電荷変異体およびトラスツズマブ電荷変異体の最高の分離を達成できるように最適化した。ペルツズマブ（ｐＩ８．７）とトラスツズマブ（ｐＩ８．４）の類似した等電点のため、ＩＥ－ＨＰＬＣは、２つの抗体分子の電荷変異体を完全に分離することができない（図１３を参照のこと）。個々の分子のすべての重要な電荷変異体を、すべての関連ピークが分解されるので、ＦＤＣ薬品により制御することができる。ＦＤＣ薬品の報告されているアッセイパラメーターは、ピーク１～３の合計、ピーク４（ペルツズマブの主ピーク）ピーク５～６の合計、ピーク７（トラスツズマブの主ピーク）、ピーク８およびピーク９～１０の合計である。例示的なクロマトグラムが図１２に示されている。
実施例１１
ＨＰＬＣの頑健性および反復性研究
様々な実験を実施して、異なる入力変数に対する実施例１０の分析的手順の頑健性を評価した。これらの入力変数は、とりわけ下記である。
●カラム温度（３２℃、３６℃、４０℃）
●流量（０．７ｍＬ／分、０．８ｍＬ／分、０．９ｍＬ／分）
●移動相ＡおよびＢのｐＨ（ｐＨ７．５～７．７）
●移動相Ｂの塩化ナトリウム濃度（１８０ｍＭ～２２０ｍＭ）
目的のパラメーターを変えた後の分析で得られたプロファイルおよび結果を、目標パラメーターに従った分析のプロファイルおよび結果と比較した。ピーク４、ピーク７、ピーク１～３の合計およびピーク８の相対ピーク領域（領域％）を、結果の相対的な差の計算に使用した。結果は許容基準を満たし、よって手順が意図される目的にとって好適に頑健であることを実証した。
分析手順の反復性は、ピーク４、ピーク７、ピーク１～３の合計およびピーク８において下記の範囲で実証された：、
－ＦＤＣ薬品のＬＤでは５０μｇ～１４９μｇの注入タンパク質であり、名目処理量（タンパク質１００μｇ）の５０％～１４９％を網羅し、
－ＦＤＣ薬品のＭＤでは５１μｇ～１５３μｇの注入タンパク質であり、名目処理量（タンパク質１００μｇ）の５１％～１５３％を網羅した。
実施例１２
安定性指標性
ＦＤＣ薬品の非ストレスおよびストレスＭＤおよびＬＤ試料を実施例１０の方法で試験し、手順が異なるストレス条件下で抗体を分離、確認およびその純度を決定する能力を実証した。以下のストレス条件を試験した：熱ストレス、強制酸化、高ｐＨ（ｐＨ７．４）ストレス、低ｐＨ（ｐＨ４）ストレスおよび光ストレス。不純物および異なる電荷の関連物質を分離した。非ストレス試料と比較して（図１２および図１３）、ストレス試料のクロマトグラフは、ピーク１～３の合計およびピーク８の量の増加を示す（データは示されず）。結論として、手順は安定性指標的である。
実施例１３
ＥＬＩＳＡによるＦＤＣ中のトラスツズマブおよびペルツズマブの電荷変異体およびＣＤＲ親和性突然変異体の力価
抗増殖活性を反映するＥＬＩＳＡの能力を、電荷変異体およびＣＤＲ親和性突然変異体で実証した。
上記に記載されたペルツズマブおよびトラスツズマブＨＥＲ２親和性突然変異体を、抗増殖アッセイおよびＥＬＩＳＡで試験した（それぞれ、図９および図１４）。ＨＥＲ２親和性突然変異体で観察された用量応答曲線の非存在または高濃度へのシフトは、類似性基準を満たせなかったことと共に（それぞれ、抗増殖アッセイおよびＥＬＩＳＡの並行処理および高い漸近線偏）、同様に力価の大きな低減を実証している。電荷変異体の評価では、ＦＤＣ薬品のＭＤ製剤バッファーにトラスツズマブまたはペルツズマブのいずれかを含有する支持的技術バッチを使用して、細胞ベースアッセイにより上述のＦＤＣ薬品の交差干渉を除外した。
すべてのＩＥ－ＨＰＬＣ画分は、ピーク９（Ｆｃ Ｍｅｔ２６１の酸化が増加したトラスツズマブ）を除いて、細胞ベースアッセイとＥＬＩＳＡの両方に（対応する方法の精度を考慮して）類似した力価を示した。このＭｅｔ２６１でのＦｃ酸化がＣＤＲの標的結合活性に影響を与えるはずではないが、この変異体は、トラスツズマブＥＬＩＳＡにおいて力価の低減を示した（細胞ベースアッセイにおいて７３％対９１％）。
非常に少量でのみ存在するこれらのアイソフォームの断片化過程が、この知見に寄与するか否か、および両方のアッセイの力価値が本当に異なっているか否かを、完全に解決することができなかった。しかし、トラスツズマブＥＬＩＳＡはこの観点から保存的であると考慮され、それは、細胞ベース抗増殖アッセイで反映されない力価の減少を示すからである。
ＥＬＩＳＡは、生物活性に影響を与えることが公知である製品変異体の生物活性を制御する能力において、抗増殖アッセイに等しく、下記に詳述される。
●ピーク１のトラスツズマブ脱アミド化製品変異体ＨＣ Ａｓｎ５５／ｉｓｏＡｓｐ５５およびＬＣ Ａｓｎ３０／Ａｓｐ３０は、両方のアッセイに低減された活性を示した。
●一方の重鎖のＡｓｐ１０２位でスクシンイミドを有し、かつピーク１０に増加したＦｃ Ｍｅｔ酸化を有するトラスツズマブ製品変異体は、両方のアッセイに低減された活性を示した。
・それぞれペルツズマブおよびトラスツズマブの主ピークに対応するピーク４および７を含む他のＩＥ－ＨＰＬＣ画分は、すべて、予想されたように、両方のアッセイに８０％～１２０％の不変の活性を示した。
ピーク８の類似した力価が細胞ベースアッセイおよびＥＬＩＳＡの両方で得られたが、トラスツズマブＩＶの力価に対するＨＣ ＩｓｏＡｓｐ１０２の公知の負の影響は、この研究で観察されなかったことが認められる。ＩＥ－ＨＰＬＣのピーク４で溶出するトラスツズマブの一方の重鎖でのＩＳｏＡｓｐへのＨＣ Ａｓｐ１０２の異性化は、ＦＤＣ薬品のＩＥ－ＨＰＬＣのピーク８に対応する。トラスツズマブＳＣの開発の際に実施された抗増殖活性に対するＨＣ Ａｓｐ１０２／ｉｓｏＡｓｐ１０２形態の影響についての追加の研究は、トラスツズマブＩＶと比べてトラスツズマブＳＣにあまり際だった影響を示さなかった。
このことは、製剤の最適化（例えば、ｐＨの変化）およびトラスツズマブＳＣの増加した安定性に起因しうる。最後に、この変異体の制御は、ＩＥ－ＨＰＬＣによる確定許容基準を介してＦＤＣ薬品において維持されたことが留意される。
Figure 2023533813000014
実施例１４
電荷変異体の特徴づけ
ＦＤＣ薬品のＩＥ－ＨＰＬＣ方法により分離および単離されたＦＤＣ薬品の電荷変異体を、特徴づけた（図１３）。加えて、放出時のＦＤＣ製剤の個々の抗体の電荷変異体を、同じＩＥ－ＨＰＬＣ方法で単離し、特徴づけた（図１３）。
以下の方法を使用した包括的なピーク特徴づけ研究を実施して、ＦＤＣ薬品の電荷変異体を確証した。
●化学分解部位の査定のためのトリプシン抗体ペプチドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
●リジン糖化含有量の評価のためのボロン酸アフィニティークロマトグラフィー
●Ｆｃグリコシル化の分析のためのＨＩＬＩＣと組み合わせた２－ＡＢ標識化
ＬＣ－ＭＳペプチドマッピング：
関連するアミノ酸修飾のＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピングおよび定量化を、Ｓｃｈｍｉｄら、２０１８年（Ｓｃｈｍｉｄ Ｉ、Ｂｏｎｎｉｎｇｔｏｎ Ｌ、Ｇｅｒｌ Ｍら、Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ａｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ ２０１８年；１巻：２８頁）に記載されたように行った。簡潔には、すべての試料を８ｍｏｌ／Ｌのグアニジン塩酸塩（ｐＨ６．０）で変性し、ジチオスレイトールにより５０℃で１時間還元した。
試料をバッファー交換し（０．０２ｍｏｌ／Ｌ、ヒスチジン塩酸塩、ｐＨ６．０）、トリプシンにより３７℃で１８時間さらに消化した。ＢＥＨ Ｃ１８カラムのペプチド分離をＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ系で実施した。オンライン質量分析検出を、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳ Ｑ－ＴｏＦ質量分析計で達成した。修飾ペプチドの相対的定量化では、ＧＲＡＭＳ ＡＩソフトウエアを使用した。
ボロン酸アフィニティークロマトグラフィー：
ボロン酸アフィニティークロマトグラフィーを、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｏｒｏｎａｔｅ－５ＰＷアフィニティーカラムを使用して実行した。１００ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、７０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５００ｍｍｏｌ／Ｌのソルビトール（ｐＨ８．６）からなる溶出バッファーを、２８０ｎｍのＵＶ検出を備えたＨＰＬＣ系によるクロマトグラフィー分離に使用した。ピーク積分および糖化定量化を、記載されたように実施した（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓ、Ｈｏｅｒｎｓｃｈｅｍｅｙｅｒ Ｊ、Ｍａｈｌｅｒ ＨＣ．Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００８年；７０巻：４２～５０頁）。
グリカンの分析：
Ｆｃグリコシル化の査定のため、試料をギ酸アンモニウムバッファー（ｐＨ８．６）にバッファー交換し、ＰＮＧａｓｅ Ｆにより４５℃で１時間インキュベートした。グリカン２－ＡＢ標識化を６５℃で２時間実施した。標識グリカン構造をＨＩＬＩＣ分離し、続くピーク積分およびグリカン定量化を記載されたように蛍光検出した（Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ、Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ、Ｍａｉｅｒ Ｂら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ Ｆｃ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ－－ｐａｒｔ １：ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ．ＭＡｂｓ．２０１５年；７巻：１６７～７９頁）。
結果および結論：
ＦＤＣ製剤の個々のペルツズマブ分子およびトラスツズマブ分子に見出されたすべての電荷変異体（≧１％の相対存在度）はまた、ＦＤＣ薬品においても検出された。放出時および保管後のＦＤＣ製剤の個々の抗体と比較して、ＦＤＣ薬品には新たな電荷変異体は検出されなかった。表１０は知見を要約する。
Figure 2023533813000015
Figure 2023533813000016
ピーク１～３の合計は、ペルツズマブの酸性変異体（ＨＣ－Ａｓｎ－３９１の脱アミド化、ＦＣシアル酸およびリジン糖化）、ならびにトラスツズマブの酸性変異体（ＬＣ－Ａｓｎ－３０およびＨＣ－Ａｓｎ－５５の脱アミド化）を含有する。
ピーク４は、ペルツズマブの主要電荷変異体（すなわち、天然の抗体）、ならびに低量のトラスツズマブ酸性変異体（ＬＣ－Ａｓｎ－３０の脱アミド化およびＨＣ－Ａｓｐ－１０２の異性化）を含有する。
ピーク５～６の合計は、ペルツズマブの塩基性変異体（重および軽鎖にＮ末端ＶＨＳ、および重鎖にＣ末端リジン）、ならびにトラスツズマブの酸性変異体（ＨＣ－Ａｓｎ－３９２の脱アミド化、リジン糖化、およびＦｃシアル酸含有量の増加）を含有する。
ピーク７は、トラスツズマブの主要電荷変異体（すなわち、天然の抗体）を含有し、ペルツズマブ変異体との重複を示さない。
ピーク８は、イソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを含有し、ペルツズマブ電荷変異体との重複を示さない。
－ピーク９～１０の合計は、ＦＣ酸化が（ＨＣ－Ｍｅｔ－２５５および－４３１で）増加したトラスツズマブ電荷変異体を含有し、ＨＣ－Ａｓｐ－１０２の異性化はペルツズマブ変異体との重複を示さない。
ペルツズマブＳＣ原体およびトラスツズマブＳＣ原体に見出された豊富な電荷変異体は、すべてＦＤＣ薬品においても検出された。放出時および保管後のＦＤＣ薬品材料には、新たな電荷変異体は検出されなかった。個々の分子のすべての重要な電荷変異体を、ＦＤＣ薬品において制御することができる。
追加の共溶出または現存するピーク共溶出の増加がないことは、ペルツズマブおよびトラスツズマブのストレス誘導電荷変異体が、早いおよび遅い溶出時間にそれぞれシフトするので、安定性の際に観察される、または予想される。ストレスを受けたペルツズマブのピークパターンはクロマトグラムの酸性領域にシフトし、ストレスを受けたトラスツズマブのピークパターンは塩基性領域にシフトする。
実施例１５
ＦＤＣ組成物
ＩＥ－ＨＰＬＣによるＦＤＣ薬品のピーク１～３の合計
ＦＤＣ薬品のピーク１～３の合計は、以下の変異体から構成される：
●ペルツズマブの酸性変異体（ＨＣ Ａｓｎ３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化）。
●ＦＤＣ薬品のＩＥ－ＨＰＬＣ特徴づけ研究により微量レベルでのみ観察された、ペルツズマブにおけるＡｓｎ３２７の脱アミド化
●トラスツズマブの酸性変異体（主にＬＣ Ａｓｎ３０およびＨＣ Ａｓｎ５５の脱アミド化）。ＬＣ Ａｓｎ３０比較して、ＨＣ Ａｓｎ５５の低い分解感受性がバイオプロセスおよび生理条件で検証された（Ｓｃｈｍｉｄ Ｉ、Ｂｏｎｎｉｎｇｔｏｎ Ｌ、Ｇｅｒｌ Ｍら、Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ａｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ ２０１８年；１巻：２８頁）。
ＦＤＣ薬品の貯蔵寿命終了の許容基準は、臨床経験、ならびにＰＫ／生物活性および安全性／免疫原性プロファイルに対する予測される影響に基づいて正当化される。提案される許容基準は、製品品質を制御するため、ならびに原体、および薬品加工および保管に対する潜在的な影響を網羅するために好適である。
ＦＤＣ薬品では、以下の貯蔵寿命終了の許容基準を確立した：ピーク１～３の合計：≦２３．０領域％（ＬＤ）／≦２１．０領域％（ＭＤ）。これらの許容基準を、臨床経験、ならびに生物活性／ＰＫおよび安全性／免疫原性プロファイルに対する想定される影響に基づいて確立した。現在の臨床経験を超えた拡大は、生物活性およびＰＫに対する低い影響、ならびに免疫原性／安全性に対するリスクがないことによって正当化されると考慮される。
安全性および免疫原性のついての考慮：ペルツズマブおよびトラスツズマブの材料に見出される酸性変異体がＩｇＧ抗体に一般的に見出される修飾であるので、許容基準内の酸性変異体のレベルの任意の増加は、新たな形態を表すと予想されず、よって毒性およびＡＤＡの出現のリスクを増加すると予測されない。これは、ＦＤＣ薬品臨床研究および良好な安全性プロファイルにおける低いＡＤＡ出現によって支持される。ＦＤＣ薬品ＬＤの１８．７領域％まで、およびＦＤＣ薬品ＭＤの１６．０領域％までの老化臨床研究材料が、中心的研究の際に患者に投与された。新たな酸性変異体は、保管および取り扱いの際に生成されない。さらに、保存Ｆｃ（ＨＣ Ａｓｎ３８７、Ａｓｎ３９２およびＡｓｎ３９３の脱アミド化）に位置する、またＣＤＲ（主にＬＣ Ａｓｎ３０の脱アミド化およびＨＣ Ａｓｎ１０２の異性化）にも位置する溶媒露出残基の分解は、バイオプロセスおよびリアルタイム保管条件と比較して、一般にｉｎ ｖｉｖｏで有意に速く起こる（数日以内）ことがトラスツズマブについて公開された（Ｓｃｈｍｉｄら、２０１８年）。内因性ヒト抗体の同じＦｃ Ａｓｎ脱アミド化部位の分解レベルは、５℃で保管された液体薬品製剤で観察されるより有意に高かった。したがって、これらの分解は、患者に安全性／免疫原性の増加したリスクを課さないことが結論づけられている（Ｌｉｕ ＹＤ、ｖａｎ Ｅｎｋ ＪＺ、Ｆｌｙｎｎ ＧＣ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２００９年；３７巻：３１３～２２頁）。この結論を、唯一の脱アミド化部位がＦｃ部分（ＨＣ Ａｓｎ３９１）に位置するこのピーク領域で検出されるので、ペルツズマブ脱アミド化にも当てはめることができる。
まとめると、患者が曝露されるレベルを超えるピーク１～３の合計における潜在的な４．３領域％の増加は、製品の免疫原性および安全性プロファイルを変えると予想されない。
生物活性についての考慮：ペルツズマブおよびトラスツズマブの酸性変異体（ピーク１～３の合計）における１８．７領域％（ＬＤ）および１６．５領域％（ＭＤ）での最大臨床経験に対して、規格限界の２３．０領域％（ＬＤ）および２１．０領域％（ＭＤ）は、（表８に記載されたＥＬＩＳＡ値の力価によると）およそ４％までの減少をペルツズマブおよびトラスツズマブ結合活性に導くことができた。生物活性における４％の変化は、影響を与えうるものであると考慮されない。したがって、ピーク１～３の合計が規格限界に存在しても、有効性は維持されることが予想される。
ＰＫについての考慮：Ｆｃの抗体は、クリアランスに関与し（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ Ｒ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｉｓｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２００７年；７巻：１４０１～１３頁）、したがって、ＣＤＲにおける脱アミド化はＰＫに影響を与えるとは予想されない。電荷性質は抗体のＰＫ挙動に影響を与えることが公知であるが、脱アミド化により導入される単一負電荷はＰＫに影響を与えない（Ｋｈａｗｌｉら、２０１０年）。注目すべきは、Ｆｃ脱アミド化における低レベルの改変（ＩＥ－ＨＰＬＣのピーク３：ペルツズマブＨＣ Ａｓｎ３９１；ＩＥ－ＨＰＬＣのピーク６：トラスツズマブＨＣ Ａｓｎ３９２）のみが、ＦＤＣ薬品安定性の際に観察された。したがって、ピーク１～３の合計が規格限界に存在しても、ＰＫは影響を受けないことが予想される。
ＩＥ－ＨＰＬＣによるＦＤＣ薬品のピーク４
ＦＤＣ薬品のピーク４は、ＩＥ－ＨＰＬＣ方法の報告されたアッセイパラメーターの一部であり、ペルツズマブの所望の主要電荷アイソフォームを構成する。規格に含めることは、製品の一貫した純度を確実にする。
原体および薬品の放出および安定性試験の許容基準を、ＩＥ－ＨＰＬＣによる他の報告されたアッセイパラメーターに関連して、製造経験および安定性効果についての考慮と共に設定した。貯蔵寿命の終了時の≧３８領域％（ＬＤ）および≧２８領域％（ＭＤ）のＦＤＣ薬品許容基準は、製品の純度を確実にし、製造過程の適当な制御を確実する。
ＩＥ－ＨＰＬＣによるＦＤＣ薬品のピーク５～６の合計
ＦＤＣ薬品のピーク５～６の合計は、以下の変異体から構成される。
●ペルツズマブの塩基性アミノ酸（重および軽鎖のＮ末端ＶＨＳ、Ｎ末端ピログルタメート、ならびに重鎖でのＣ末端リジンおよびプロリンアミド）
●トラスツズマブの酸性変異体（ＨＣ Ａｓｎ３９２の脱アミド化、リジン糖化、およびＦＣシアル酸含有量の増加）
ピーク５～６の合計は、ＦＤＣ薬品放出または安定性試験により制御されず、それは、ペルツズマブの塩基性変異体およびトラスツズマブの酸性変異体が薬品製造および保管の際に不変のままであり、したがって安定性指標パラメーターであると考慮されないからである。
ＩＥ－ＨＰＬＣによるＦＤＣ薬品のピーク７
ＦＤＣ薬品のピーク７は、ＩＥ－ＨＰＬＣ方法の出力の一部であり、トラスツズマブの所望の主要電荷アイソフォームを構成する。この規格は、製品の一貫した純度を確実にする。薬品の放出および安定性試験の許容基準を、ＩＥ－ＨＰＬＣによる他の報告されたアッセイパラメーターに関連して、製造経験および安定性効果についての考慮と共に設定した。貯蔵寿命の終了時の≧１６．０領域％（ＬＤ）および≧２３．０領域％（ＭＤ）のＦＤＣ薬品許容基準は、製品の品質を確実にし、製造過程の適当な制御を確実にする。
ＩＥ－ＨＰＬＣによるＦＤＣ薬品のピーク８
ＦＤＣ薬品のピーク８は、（一方の重鎖に）イソアスパラギン酸へのＨＣ Ａｓｐ１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを含有し、ペルツズマブ電荷変異体と共溶出を示さない。ピークは、ＦＤＣ薬品の放出および安定性試験で制御される。
ＦＤＣ薬品の貯蔵寿命終了の許容基準の≦９．０領域％（ＬＤ）／≦１２．０領域％（ＭＤ）は、臨床経験、ならびにＰＫ／生物活性および安全性／免疫原性プロファイルに対する予測される影響に基づいて正当化される。提案される許容基準は、製品品質を制御するため、ならびに原体、および薬品加工および保管に対する潜在的な影響を網羅するために好適である。
安全性および免疫原性のついての考慮：トラスツズマブの材料に見出される酸性変異体がＩｇＧ抗体に一般的に見出される修飾であるので、許容基準内の酸性変異体のレベルの任意の増加は、新たな形態を表すと思われず、よって毒性およびＡＤＡの出現のリスクを増加すると思われない。ＦＤＣ薬品は、一般に安全であり、良好な耐容性を示した。酸性プロファイルは、ペルツズマブＩＶ＋トラスツズマブＩＶ（Ｐ＋Ｈ ＩＶ）の安全性プロファイルに匹敵した。ＡＤＡの出現は低く（≦５％）、ＰＫ、有効性または安全性に関する臨床的帰結はなかった。ＦＤＣ薬品ＬＤのピーク８の６．４領域％まで、およびＦＤＣ薬品ＭＤのピーク８の９．４領域％までの老化臨床研究材料が、中心的研究の際に患者に投与された。新たな電荷変異体は、保管および取り扱いの際に生成されない。さらに、保存Ｆｃ（ＨＣ Ａｓｎ３８７、Ａｓｎ３９２およびＡｓｎ３９３の脱アミド化）に位置する、またＣＤＲ（主にＬＣ Ａｓｎ３０の脱アミド化およびＨＣ Ａｓｎ１０２の異性化）にも位置する溶媒露出残基の分解は、バイオプロセスおよびリアルタイム保管条件と比較して、一般にｉｎ ｖｉｖｏで有意に速く起こる（数日以内）ことがトラスツズマブについて公開された（Ｓｃｈｍｉｄら、２０１８年）。内因性ヒト抗体の同じＦｃ Ａｓｎ脱アミド化部位の分解レベルは、５℃で保管された液体薬品製剤で観察されるより有意に高かった。したがって、これらの分解は、患者に安全性／免疫原性の増加したリスクを課さないことが結論づけられた（Ｌｉｕら、２００９年）。患者が曝露されるレベルを超えるピーク８（イソアスパラギン酸へのＨＣ Ａｓｐ１０２の異性化）における潜在的な２．５領域％の増加は、製品の免疫原性プロファイルを変えると予想されなかった。
生物活性についての考慮：豊富化ピーク８（ピーク純度９２％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ Ａｓｐ１０２の単独の異性化を主に含有する）は、参照標準と比較すると、類似したトラスツズマブ活性（１００％の結合活性）を有する。したがって、ピーク８が規格限界に存在しても、ＦＤＣ薬品の有効性は維持されることが予想される。
ＰＫについての考慮：ペルツズマブおよびトラスツズマブのＣＤＲにおけるイソアスパラギン酸へのアスパラギン酸異性化は電荷を変えず、ＰＫに影響を与えることが予想されない。したがって、トラスツズマブＨＣ Ａｓｐ１０２の単一アスパラギン酸異性化は、ＰＫに影響を与えることはない。
Ｅ－ＨＰＬＣによるＦＤＣ薬品のピーク９～１０の合計
ＦＤＣ薬品のピーク９～１０の合計は、（一方の重鎖に）スクシンイミドへのＨＣ Ａｓｐ１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブから構成され、ペルツズマブ電荷変異体との重複を示さない。加えて、低レベルのトラスツズマブＦｃ酸化がこれらのピークで検出される。低レベルのため、影響は予想されない。スクシンイミド（ピーク９～１０の合計）がピーク８（ｉｓｏ－Ａｓｐ）およびピーク７（Ａｓｐ）と平衡するので、ピーク８およびピーク７の許容基準によって間接的に制御される。したがって、制御系においてピーク９～１０の合計には許容基準が必要ない。
実施例１６
ＦＤＣ組成物の製造
ペルツズマブＳＣ原体を薬品保管容器から蒸気滅菌ステンレススチール配合容器に移す。複数のペルツズマブＳＣ原体バッチを、薬品製造のために組み合わせることができる。
配合容器に添加されるペルツズマブの量に基づいて（移したペルツズマブＳＣ原体質量、密度、およびペルツズマブ含有量によって決定される）、標的量のトラスツズマブが定義される（すなわち、維持量には１：１のＡＰＩ比）。次いでトラスツズマブＳＣ原体を（密度およびトラスツズマブ含有量に基づいて）、配合容器に添加する複数のトラスツズマブＳＣ原体バッチを、ＦＤＣ薬品製造のために組み合わせることができる。
配合容器に添加されるペルツズマブＳＣ原体およびトラスツズマブＳＣ原体の容量（質量および密度によって決定される）に基づいて、（ｒＨｕＰＨ２０溶液含有量および活性に基づいて）必要量の解凍ｒＨｕＰＨ２０を配合容器に添加する。複数のｒＨｕＰＨ２０バッチを、薬品製造のために組み合わせることができる。
すべての成分を配合容器に移した後、溶液を混合により均一化する。
実施例１７
ＦＤＣの含有量を決定するＲＰ－ＵＰＨＬＣアッセイの開発
機器
同じ器具類および適切な作動条件を使用することができる。
ＨＰＬＣ系：データ取得ソフトウエアを備えたＨＰＬＣ系（直列の真空脱ガス器を有する）
検出器：ＵＶ／可視吸収度検出器またはフォトダイオードアレイ検出器
膜フィルター：０．２μｍフィルター（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４３００４９）
カラム：ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、５μｍ（Ｂｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号０８５４１）またはＢｉｏＳｕｉｔｅ ２５０、７．８×３００ｍｍ、５μｍ（Ｗａｔｅｒｓカタログ番号１８６００２１６５）
試薬
●精製水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑで処理した水）
●トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｆｌｕｋａカタログ番号４０９６７）
●アセトニトリル（Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０００３０．２５００）
●Ｌ－ヒスチジン無水物（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ８０００）
●スクロース（Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０７６８７）
●Ｌ－メチオニン（Ｓｉｇｍａカタログ番号６４３１９）
●氷酢酸（Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０００６３．１０００）
●ポリソルベート２０（Ｓｉｇｍａカタログ番号９３７７３）
溶媒Ａ：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中０．１％のＴＦＡ
溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ
製剤バッファー：２０ｍＭのヒスチジン酢酸塩、２４０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのメチオニンおよびポリソルベート２０、０．０２％［ｗ／ｖ］、ｐＨ５．７±０．２
希釈バッファー：２０ｍＭのヒスチジン酢酸塩、ｐＨ５．５
カラム保管溶液：６０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）
試料溶液：試料を製剤バッファーでおよそ１０ｍｇ／ｍＬに希釈する。１０ｍｇ／ｍＬの試験試料溶液を希釈バッファーでおよそ１ｍｇ／ｍＬに希釈する。
ブランク：製剤バッファーおよび希釈バッファーを未希釈で注入する。
流量：０．４ｍＬ／分
最大圧力：４００ｂａｒ／６０００ｐｓｉ
波長：２８０ｎｍ
運転時間：２９分
カラム温度設定：６０℃
オートサンプラー温度設定：≦１０℃
注入量 試料および参照標準：２５μｇのタンパク質（公称）
ブランクおよび移動相：参照標準と同じ注入容量
Figure 2023533813000017
ペルツズマブおよびトラスツズマブのピークはこの方法により明確に分離されたが、この上記方法の主要な持ち越し問題が明らかになった。ブランク試料（製剤バッファー）の５回の注入の後、微量のハーセプチン／パージェタが依然として検出可能であった。したがって、さらなる方法の開発が必要であった。異なるクロマトグラフィー技法を試験し、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）をタンパク質含有量分析に最も好適な方法として選択した。複数のパラメーターを、方法の精度および反復性に関して評価した。
分離に対するカラムタイプの影響
異なるタイプのカラムをペルツズマブ／トラスツズマブＦＤＣで試験した。
ペルツズマブ／トラスツズマブＦＤＣのためにいくつかの潜在的なカラムを見出した。例えば、ＢＥＨ３００ Ｃ４は、良好な分離を示すが、高いカラム温度（９０℃）を必要とした。Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ ｍＡｂはＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌと類似した分離を有したが、全体的に低い分解能を有した。最も好適なカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ、２．１×１００ｍｍカラムと決定され、これは低い持ち越しを呈し、初期方法と比較して２つの抗体の分離が改善された。
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－ＤｉｐｈｅｎｙｌカラムのＤｏＥ（実験計画）
移動相、流量、勾配およびカラムコンパートメント温度をＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ、２．１×１００ｍｍカラムで試験した。逆相タンパク質含有量の方法の開発のＤｏＥは、ＭＯＤＤＥ（登録商標）を使用して設定した。ＤｏＥの範囲内で試験した要因の要約を表１２に列挙する。
「トラスツズマブ／ペルツズマブの分解能」の評価
全体的に、タンパク質含有量決定のための逆相クロマトグラフィー方法の分解能は、流量および勾配長さに強く影響を受ける。低い流量および長い勾配長さは、改善された分解能をもたらした。カラムコンパートメント温度および出発条件は方法に対して弱いが無視できない影響を有した。７０℃の温度および３０％Ｂの相対的に高い出発条件は、最高の結果を生じることが証明された。追加的な保持時間を加えることは、分解能に影響がなかった。
「微量形態の合計」の評価
微量形態の合計は、出発条件（高い）およびカラム温度（低い）に強く依存していた。流量および勾配時間は、僅かな影響しかなかった。保持時間は、単独では無視できるものであったが、流量およびカラム温度と組み合わせると影響を示した。
「高いトラスツズマブ比」の評価
高い比を達成するため、すなわち、トラスツズマブ主ピークに肩を加えないため、温度は低くする必要があった。流量分析は不明瞭であった。勾配時間および出発条件は、理想的には高い範囲内にあるべきである。ここでも、追加の保持時間は影響を示さなかった。
「ペルツズマブのＵＳＰテーリング」の評価
ペルツズマブ主ピークのテーリングを低減するため、流量は増加させるべきであり、勾配と出発条件は減少させるべきである。ここでも、追加の保持時間は影響を示さなかった。
ＤｏＥの結果に従って、以下のパラメーターを選択した。
流量０．８ｍＬ／分
波長２８０ｎｍ
カラム温度７０℃
オートサンプラー温度１０℃
運転時間２０分
Figure 2023533813000020
これらの結果に基づいて、カラム温度、勾配および流量をさらに最適化した。
分離に対するカラム温度の影響
逆相クロマトグラフィーにおける上昇された温度は、ピーク分離、テーリング効果および系圧に有意な影響を有しうる。３つの異なる温度を選択して、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００ Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラムで試験した。温度の試験は、ＤｏＥの範囲内で実施した（結果は示されず）。全体的に、保持時間は、カラムコンパートメント温度を増加すると早期溶出にシフトした。このことは、溶出剤の粘度および二次カラム相互作用が温度増加により減少するので予想された。しかし、カラムコンパートメント温度を増加すると、全体的な分解能は減少した。したがって、実験の範囲内で最も好適なカラムコンパートメント温度は７０℃であった。
分離に対する勾配プロファイルの影響
勾配は、被分析物の分離に劇的な影響を有する。逆相クロマトグラフィーによるタンパク質含有量決定のため、４つの主要勾配をＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００ Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラムで試験した（表１４を参照のこと）。直接勾配比較では、カラムコンパートメント温度を７０℃で一定に設定し、流量を０．６ｍＬ／分に設定した。最終流量が設定されると、勾配の再査定を行う必要があった。ＲＰタンパク質含有量方法の最終勾配を表１４の勾配５に列挙する。初期ＤｏＥ勾配（表１３）を最適分離のため、および新たな流量（０．３ｍＬ／分）との平衡時間のために変更した。
観察：
試験した５つの勾配は、すべて、十分なタンパク質保持および２０～３０％Ｂの範囲の精選された出発条件を示した。この範囲内の任意の出発条件がペルツズマブ／トラスツズマブＦＤＣの分離に好適である。しかし、勾配時間および実行時間を短縮するため、３０％の出発条件を選択した。勾配時間を考慮すると、試験した範囲（１０～２０分）が精選された。勾配時間は流量によっても大きく影響を受けるので、最終的に０．３ｍＬ／分の流量で１５分の分離時間が精選された。
１０分の分離時間により、特に３０％Ｂの急傾斜勾配では、両方の抗体は、僅か１～２分の時間帯の範囲内で溶出した。しかし、２０分の分離および２０％Ｂの急傾斜勾配は、広い溶出プロファイル、およびあまり強くない検出シグナルをもたらした。
最後に１５分の分離時間を１５％Ｂの急傾斜勾配と組み合わせた。遅い流量（０．３ｍＬ／分）と一緒にすると、あまり多くのシグナル強度を失うことなく両方の抗体の良好なベースライン分離を示した。
分離に対する流量の影響
最終的に、最も好適な流量を決定する必要があった。速い流量は、通常、早期溶出を意味するが、分解の損失を導くことがある。初期実験を０．６または０．８ｍＬ／分の流量で実施した。流量が低いほど、この特定のＲＰタンパク質含有量方法にとって有益であることが後に発見された。４つの異なる流量を、単一ｍＡｂ含有試料を使用してＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００ Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラムで試験した（０．３ｍＬ／分～０．６ｍＬ／分）。直接比較では、カラムコンパートメント温度を７０℃に一定に設定し、表１３に列挙された勾配をすべての分離に使用した。
流量を減少すると、より狭いピーク形状および高いシグナル強度をもたらした。保持時間は後期溶出にシフトした。特にサイドピークの分解能は遅い流量で改善された。したがって、この方法では０．３ｍＬ／分の流量が理想的である。勾配実行時間を３０分に設定し、０．３ｍＬ／分で十分なカラム再平衡を示した。
これらの実験に基づいて、この方法に最も重要なパラメーターは、カラムタイプ、カラム温度および流量であることが見出された。フェニルベースカラムの使用は、改善された分解能をもたし、持ち越し問題はなかった。６４℃～７６℃および６６℃～７４℃の温度を試験し、方法の性能に有意な影響を有さなかった。フェーズＩＩＩの頑健性実験およびＢＬＡ／ＭＡＡ方法の妥当性の範囲内で、０．４および０．２ｍＬ／分の流量を試験し、方法の性能に有意な影響を有さないことが見出された。
実施例１８
ＦＤＣの含有量を決定するＲＰ－ＵＰＨＬＣアッセイ
注：同等の機器類、適切な作動条件、ならびに同等の品質の溶媒、化学薬品および試薬を使用することができる。
ＦＤＣ薬品中のペルツズマブおよびトラスツズマブの含有量は、ＵＶ検出によるＲＰ－ＵＨＰＬＣで決定される。ペルツズマブおよびトラスツズマブは、疎水性の差に基づいて分離される。ペルツズマブおよびトラスツズマブの対応する含有量は、様々な用量のＦＤＣ参照標準を注入する一連の分析のそれぞれによって生成された、外部較正曲線で計算される。同じ方法がＦＤＣ薬品のＬＤとＭＤに適用される。それぞれの投与形態が、対応する参照標準に対して測定される。
機器および材料
●ＵＶ検出器を有するＵＨＰＬＣ系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳまたは同等物）
●ＵＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ、２．１×１００ｍｍ、粒径：１．８μｍまたは１．８μｍ相当）
試薬
●２－プロパノール
●アセトニトリル
●ＴＦＡ
●Ｌ－ヒスチジン無水物
●Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物
●スクロース
●トレハロース
●Ｌ－メチオニン
●ポリソルベート２０
●水酸化ナトリウム
●塩酸
●精製水（例えば、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）
溶液
薬品希釈バッファー
２０ｍＭのＬ－ヒスチジン／Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩、１０５ｍＭのトレハロース、１００ｍＭのスクロース、１０ｍＭのメチオニン、０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、ｐＨ５．５±０．２
移動相Ａ
２％（ｖ／ｖ）の２－プロパノール、水中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ
移動相Ｂ
７０％（ｖ／ｖ）の２－プロパノール、２０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル、１０％（ｖ／ｖ）の移動相Ａ
参照標準溶液の調製
注：ＦＤＣ薬品のＬＤおよびＭＤ試料の測定のために、ＦＤＣ ＬＤ参照標準およびＦＤＣ ＭＤ参照標準をそれぞれ調製する必要がある。対応する参照溶液を二重に調製しなければならない（参照Ａ溶液および参照Ｂ溶液）。対応する参照標準を、薬品希釈バッファーを使用して１ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度に希釈する。
試料溶液の調製
ＦＤＣ薬品を希釈バッファーで希釈して、およそ１ｍｇ／ｍの総タンパク質濃度を含有する試料溶液を調製する。
手順
最初の試料を注入する前に、カラムを安定したベースラインが得られるまで７０％の移動相Ａ／３０％の移動相Ｂですすぐ。任意選択で、クロマトグラムの視覚評価が少なくとも２つの連続注入で一定したプロファイルを実証するまで、参照溶液をカラム条件づけの目的で注入する。
動作パラメーター
●検出波長：２８０ｎｍ
●注入容積：下記の注入プロトコールを参照のこと
●流量：０．３ｍＬ／分
●カラム温度：７０℃±２℃
●オートサンプラー温度：１０℃±４℃
・ 運転時間３０分
Figure 2023533813000022
注入プロトコール
それぞれの投与形態では、対応する参照標準を使用して別々の順番を実施する必要がある。試料の注入は、表１６に示されている順序で実施される。
Figure 2023533813000023
結果
典型的なクロマトグラフィープロファイルは、ＦＤＣ薬品ＬＤでは図１５に示され、ＦＤＣ薬品ＭＤでは図１６に示されている。
最終方法（実施例１８）では、初期タンパク質含有量方法に実質的な改善が得られ、改善された全体的分解能／ピーク分析および試料持ち越しの排除が挙げられ、すなわち、持ち越しは、後続の分析において０．２％を超えない。さらに最終方法は、維持量および負荷量のペルツズマブおよびトラスツズマブの定量的タンパク質含有量決定を可能にする。異なるフェニルベースＲＰカラムは、２つの抗体に関して改善された特異性を示し、僅かに微量の試料持ち越しが検出され、正確なタンパク質含有量決定が可能になった。ペルツズマブ／トラスツズマブＦＤＣにおけるタンパク質含有量決定のための最終逆相Ｕ－ＨＰＬＣ方法は、２個の分子をフェニルベース逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）において、水－２－プロパノール／アセトニトリル勾配および０．１％のＴＦＡを使用して７０℃で分離する。
図１５は、ＦＤＣ ＬＤ参照標準のタンパク質含有量を分析するＲＰ－ＵＨＰＬＣクロマトグラムの例を描写し、図１６は、ＦＤＣ ＭＤ参照標準のタンパク質含有量を分析するＲＰ－ＵＨＰＬＣクロマトグラムの例を描写する。
データ分析
参照ＡおよびＢ溶液のクロマトグラムにおける、および試料溶液におけるペルツズマブピークおよびトラスツズマブピークを積分する。積分は、ＦＤＣ薬品ＬＤでは図１５およびＦＤＣ薬品ＭＤでは図１６の代表的なクロマトグラムの助けを借りて定義される。それぞれの標準レベルの注入量（μｇ）に対してピーク領域をプロットすることによって、それぞれの抗体の標準曲線を生成する。標準曲線データを、線形回帰を使用して当てはめる。ゼロを介して曲線をフォースしないこと。
標準曲線方程式を使用することにより、各試料揺曳器および参照Ｂの注入の対応するピーク領域を使用して、ペルツズマブおよびトラスツズマブの量を計算する。
Figure 2023533813000024
スロープ較正曲線
ペルツズマブおよびトラスツズマブの含有量を計算するため、量を対応する注入容積で割り、希釈係数を掛ける。
Figure 2023533813000025
実施例１９
ＦＤＣの含有量を決定するＨＩ－ＨＰＬＣ
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ－ＨＰＬＣ）を評価した。ＨＩ－ＨＰＬＣは、特に分子変異体、例えば、翻訳後修飾または抗体薬物コンジュゲート種を確認する、抗体分析の一般的な方法である。加えて、ＨＩ－ＨＰＬＣは非変性クロマトグラフィー方法であるので、ミスフォールドタンパク質または立体構造変化を確認することが可能である。
ＲＰ－ＵＨＰＬＣと比較すると、ＨＩ－ＨＰＬＣとの主な差は下記である；
●ＨＩクロマトグラフィーは非破壊的であり、タンパク質はフォールドしたままである。
●天然タンパク質フォールディングのため、タンパク質カラム相互作用はタンパク質表面に位置するアミノ酸でのみ生じる。
●溶出は、有機溶媒濃度を増加しても促進されないが、例えば、硫酸アンモニウムの量を減少して、タンパク質と固定相の疎水性－疎水性相互作用を弱める。したがって疎水性種を少なくすると、早期に溶出する。
ＨＩＣ－ＨＰＬＣの２つのカラムを試験した。
－ＴＳＫｇｅｌエーテルカラム、７５ｍｍ×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ
－ＴＳＫｇｅｌブチルカラム、３５ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相を試験した。
－溶出剤Ａ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０±０．０５、５％（ｖ／ｖ）のエタノール
－溶出剤Ｂ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０±０．０５
結果：
ＨＩ－ＨＰＬＣは、いずれのカラムタイプでもペルツズマブ／トラスツズマブＦＤＣの分子を分離することができる。ブチルカラムは、合剤試料においてエーテルカラムと比較して遙かに優れた分解能を有する（データ示されず）。ＲＰ－ＵＨＰＬＣとＨＩ－ＨＰＬＣの比較に関して、特にタンパク質含有量分析においては、ＲＰＵＨＰＬＣのほうがＨＩ－ＨＰＬＣより好ましかった。ＨＩクロマトグラフィーは、２つの抗体を分離したが、前提的な分解能を欠いており、際だったテーリング効果を示した。逆相クロマトグラフィーは、ＨＩ－ＨＰＬＣと比べて、ペルツズマブおよびトラスツズマブの改善された分解能を示す。特に、ペルツズマブおよびトラスツズマブの肩ピークは、ＨＩＣよりＲＰＣで良好に分解されている。さらに、ＲＰＣでは水平ベースラインをもたらし、これはＨＩＣの傾いたベースラインより好ましい。加えて、水－有機溶媒勾配の使用は、高－低塩勾配よりＨＰＬＣ系にストレスが少ない。
Figure 2023533813000026
本発明のある特定の実施形態が本明細書に示され、説明されたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には理解されるであろう。ここで、当業者は、多数の変化形、変更および置換を本発明から逸脱することなく想定するであろう。本明細書に記載されている実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物を包含することが意図される。

Claims (57)

  1. ２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）の結合アッセイであって、
    ａ．ＦＤＣを、修飾ＨＥＲ２ ＥＣＤサブドメインを含む捕獲試薬と接触させることと；
    ｂ．試料を検出可能な抗体と接触させることと；
    ｃ．捕獲試薬に結合した抗体のレベルを、検出可能な抗体の検出手段を使用して定量化することと、
    を含む、結合アッセイ。
  2. 一定用量配合剤が、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体、およびＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体を含む、請求項１に記載の結合アッセイ。
  3. ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合が定量化される、請求項１または２に記載の結合アッセイ。
  4. 捕獲試薬が、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩＩを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  5. 捕獲試薬が、配列番号２または配列番号２３を含む、請求項４に記載の結合アッセイ。
  6. 捕獲試薬が、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  7. 捕獲試薬が、配列番号２４を含む、請求項６に記載の結合アッセイ。
  8. 捕獲試薬が、ＨＥＲ２サブドメインＩＶを含まない、請求項３から６のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  9. ＨＥＲ２サブドメインＩＶに結合する抗体の結合が定量化される、請求項１または２に記載の結合アッセイ。
  10. 捕獲試薬が、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩＶを含む、請求項９に記載の結合アッセイ。
  11. 捕獲試薬が、配列番号４または配列番号２８を含む、請求項１０に記載の結合アッセイ。
  12. 捕獲試薬が、ＨＥＲ２サブドメインＩＩを含まない、請求項９から１１のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  13. 捕獲試薬が、組換えＨＥＲ２細胞外ドメインＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＥＧＦＲのドメインＩＩを含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  14. 捕獲試薬が、配列番号２９を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  15. 抗ＨＥＲ２抗体のうちの１つの力価を分析するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  16. 力価が、細胞ベースアッセイにおいて測定して、捕獲試薬に結合した抗体のレベルを、単離抗体の生物活性と相関させることによって定量化される、請求項１５に記載の結合アッセイ。
  17. 捕獲試薬が、マイクロタイタープレートにコートされる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  18. 検出可能な抗体が、抗ＨＥＲ２抗体のＦ（ａｂ’）２部分を標的にする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  19. 一定用量配合剤が、ヒアルロニダーゼを追加的に含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合アッセイ。
  20. 配列番号２４を含む単離タンパク質。
  21. 配列番号２９を含む単離タンパク質。
  22. ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する第１の抗体および第２の抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合を特異的に定量化するキットであって、
    ａ．配列番号１、配列番号２および配列番号３４を含むタンパク質を捕獲試薬として含有する容器と、
    ｂ．ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＩに結合する抗体の結合を定量化するための指示書と、
    を含む、キット。
  23. ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体および第２の抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＤＣ）において、ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体の結合を特異的に定量化するキットであって、
    ａ．配列番号３３、配列番号３６、配列番号３および配列番号４を含むタンパク質を捕獲試薬として含有する容器と、
    ｂ．ＨＥＲ２細胞外サブドメインＩＶに結合する抗体の結合を定量化するための指示書と、
    を含む、キット。
  24. ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む一定用量組成物を評価する方法であって、
    ａ．ｐＨが約７．５～約ｐＨ７．６５のローディングバッファーを使用して、イオン交換材料に抗体を結合させることと、
    ｂ．ｐＨが約７．５～約ｐＨ７．７の溶出バッファーで抗体を溶出することと、
    を含む、方法。
  25. イオン交換材料が陽イオン交換材料である、請求項２４に記載の方法。
  26. 陽イオン交換クロマトグラフィー材料が強陽イオン交換材料である、請求項２５に記載の方法。
  27. 陽イオン交換材料がスルホネート基を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 工程ｂが塩勾配で実施される、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 溶出バッファーがナトリウムを含む、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 溶出バッファーが塩化ナトリウムを含む、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. ｃ．組成物中のペルツズマブおよびトラスツズマブの電荷変異体を選択的に検出する工程、
    を追加的に含む、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ３２～４０℃の温度で実施される、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤が、ヒアルロニダーゼを追加的に含む、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 組成物を作製する方法であって、（１）ペルツズマブ、トラスツズマブおよびこれらの１つまたは複数の変異体を含む一定用量配合剤を生産すること、ならびに（２）そのように生産された組成物を分析アッセイに付して、その中の変異体の量を評価することを含み、変異体が、（ｉ）ＨＣ－Ａｓｎ－３９１で脱アミド化されているペルツズマブ、ペルツズマブＦＣシアル酸変異体およびペルツズマブリジン糖化変異体、（ｉｉ）ペルツズマブ天然抗体、（ｉｉｉ）トラスツズマブ天然抗体、（ｖｉ）一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを含む、方法。
  35. 分析アッセイが、請求項２４から３３のいずれか一項に記載のアッセイである、請求項３５に記載の方法。
  36. 一定用量配合剤が、ヒアルロニダーゼを追加的に含む、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 組成物が、４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物であって、ＨＣ－Ａｓｎ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２３％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む、組成物。
  39. ＨＣ－Ａｓｎ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２３％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも３８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも１６％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを９％未満含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. ＨＣ－Ａｓｎ－３９１の脱アミド化、Ｆｃシアル酸およびリジン糖化から選択されるペルツズマブ酸性変異体、ＬＣ－Ａｓｎ－３０で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体、およびＨＣ－Ａｓｎ－５５で脱アミド化されているトラスツズマブ変異体を２１％未満、ペルツズマブ天然抗体を少なくとも２８％、トラスツズマブ天然抗体を少なくとも２３％、一方の重鎖にイソアスパラギン酸へのＨＣ－Ａｓｐ－１０２の単独の異性化を有するトラスツズマブを１２％未満含む、請求項３８に記載の組成物。
  41. ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む組成物であって、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法により決定して、ピーク１～３の合計の２３％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも２８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも１６％のピーク領域、およびピーク８の１２％未満のピーク領域を含む、組成物。
  42. 請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法により決定して、ピーク１～３の合計の２３％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも３８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも１６％のピーク領域、およびピーク８の９％未満のピーク領域を含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. 請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法により決定して、ピーク１～３の合計の２１％未満のピーク領域、ピーク４（ペルツズマブ天然抗体）の少なくとも２８％のピーク領域、ピーク７（トラスツズマブ天然抗体）の少なくとも２３％のピーク領域、およびピーク８の１２％未満のピーク領域を含む、請求項４１に記載の組成物。
  44. ｒＨｕＰＨ２０を追加的に含む、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. ４０～６０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブおよび６０～８０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む、請求項３８から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  46. ａ．所定量のペルツズマブを配合容器に添加することと、
    ｂ．トラスツズマブを、トラスツズマブとペルツズマブの１：１の比またはトラスツズマブとペルツズマブの１：２の比で添加することと、
    ｃ．ｒＨｕＰＨ２０を添加すること、
    により得られる、請求項３８から４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. ２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）のタンパク質含有量を分析する方法であって、
    ａ．ＲＰ－ＨＰＬＣフェニルカラムを準備することと、
    ｂ．２つの抗ＨＥＲ２抗体の一定用量配合剤（ＦＣＤ）をＲＰ－ＨＰＬＣカラムに負荷することと、
    ｃ．２つの抗ＨＥＲ２抗体を０．２～０．４ｍＬ／分の流量で分離し、カラム温度が６４℃～７６℃であることと、
    を含む、方法。
  48. 一定用量配合剤が、ペルツズマブおよびトラスツズマブを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. ペルツズマブおよびトラスツズマブの一定用量配合剤が、ヒアルロニダーゼを追加的に含む、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 分離が、水－２－プロパノール／アセトニトリル勾配で達成される、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 流量が約０．３ｍＬ／分である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 抗体が１０～２０分間にわたって分離される、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 抗体が１５分間にわたって分離される、請求項５２に記載の方法。
  54. 抗体が、約０．３ｍＬ／分の流量で１５分間にわたって分離される、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. カラム温度が７０℃＋－２℃である、請求項４７から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. フェニルカラムが、Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｈｅｎｙｌ－１（Ｄｉｏｎｅｘ）、Ｐｕｒｓｕｉｔ（登録商標）ＸＲｓ Ｄｉｐｈｅｎｙｌ、Ｐｉｎｎａｃｌｅ（登録商標）Ｂｉｐｈｅｎｙｌ、Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｈｅｘｙｌ Ｐｈｅｎｙｌ、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｐｈｅｎｙｌ、ならびにＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ ｍＡｂ ＤｉｐｈｅｎｙｌおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００－Ｄｉｐｈｅｎｙｌカラムの群から選択されるカラムである、請求項４７から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 本質的に本明細書前記に記載されている方法、キットおよび組成物。
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