TW202217309A - 用於固定劑量組合之測定 - Google Patents
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Abstract
本發明提供分析固定劑量組合的品質及數量屬性的測定。特定而言，本文描述用於兩種抗 HER2 抗體的固定劑量組合之測定，以及用於包含帕妥珠單抗和曲妥珠單抗的皮下製劑的測定。
Description
本發明涉及用以分析固定劑量組合之品質及數量屬性的測定。特定而言，本發明涉及用於兩種抗 HER2 抗體的固定劑量組合之測定，以及用於包含帕妥珠單抗 (pertuzumab) 及曲妥珠單抗 (trastuzumab) 的皮下製劑之測定。
為確保生物醫藥藥劑之安全及療效，必須連續監測產品品質。在發行任何產品批次之前，必須滿足某些特殊準則，包括關鍵品質屬性 (CQA)。關鍵品質屬性 (CQA) 係必須在適當限值、範圍或分佈內以確保期望之產品品質、安全及療效的物理、化學、生物或微生物性質或特性。
執行效力測試以及諸多其他測試以作為產品一致性測試、可比性研究及穩定性測試之一部分。使用該等測試來測量與產品品質及製造控制有關之產品屬性，且經執行以確保在臨床研究之所有階段期間使用之產品的同一性、純度、強度 (效力) 及穩定性。類似地，在臨床研究之所有階段期間及在市場批準後，使用效力測量來證實，僅投予滿足界定規範或接受準則之產品批次。
離子交換層析 (IEX) 廣泛用於詳細表徵治療蛋白且可視為用於定性及定量評估電荷異質性之參考及強大的技術。IEX 通常係放流方法，其中特定地針對單株抗體 (mAb) 設定關於每一酸性物質、主要物質及鹼性物質之分佈的規範。該等帶電物質可視為可影響效力之產物相關雜質。 此外，其係可在天然構象中表徵蛋白質之少數方法之一，原因在於不添加變性劑。IEX 亦可用作某些生物製劑之鑑別方法且係用於穩定性及儲存期限論證的常規測試。
數量係通常測量為蛋白質含量之 CQA。其對於生物技術及生物產品較為關鍵且應使用適當測定、通常物理化學性測定來測定。對於大部分生物醫藥藥劑而言，藉由 UV 吸收測量蛋白質含量。
固定劑量組合 (FDC) 將兩種不同活性成分組合成單劑量製劑。兩種抗 HER2 抗體曲妥珠單抗及帕妥珠單抗與玻尿酸酶之組合係在臨床上首次研發之兩種高度類似之單株抗體的複方製劑。據信，帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之作用機制彼此互補，此乃因二者皆結合至 HER2 受體，但結合至不同位置。人們認為帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組合對 HER 傳訊路徑提供較全面之雙重阻斷。帕捷特 (perjeta) 與 IV 賀癌平 (Herceptin) 及化學療法之組合之標準 IV 製劑 (基於帕捷特之方案) 在 100 多個國家被核准用於治療早期及轉移性 HER2 陽性乳癌。在新輔助早期乳癌 (eBC) 環境中，已展示出，基於帕捷特之方案的 pCR 率幾乎兩倍於 Herceptin 及化學療法。另外，該組合已展示會顯著減小佐劑 eBC 環境中之侵襲性疾病或死亡的復發風險。在轉移性環境中，該組合已在先前未治療 (一線) 之 HER2 陽性轉移性乳癌患者中展示前所未有的存活益處。
FDC 中之玻尿酸酶使得能夠進行適當共投予治療劑的皮下藥物遞送並將該遞送最佳化。重組人類玻尿酸酶 PH20 (rHuPH20) 係暫時性降解玻尿酸 (醣胺聚醣或身體中之天然糖鏈) 以有助於分散及吸收其他所注射治療藥物之酶。
曲妥珠單抗及帕妥珠單抗具有大於 93% 之序列同一性且總共僅相差 30 Da。兩種抗體皆具有大約 148 kDa 之分子量，且具有幾乎相同之等電點。其結合同一標靶 (HER2) 且在活體內具有協同效應。因其結構及功能類似性，故大部分常用分析方法不能應用於此複方製劑。
在一實施例中，提供用於兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 的結合測定，其包含：
a. 將該 FDC 與包含經修飾之 HER2 ECD 次域的捕獲試劑接觸；
b. 將樣品與可檢測抗體接觸；
c. 使用該可檢測抗體的檢測手段來定量與該捕獲試劑結合的抗體的量。
在一實施例中，固定劑量組合包含與 HER2 細胞外次域 II 結合之抗體及與 HER2 細胞外次域 IV 結合之抗體。
在一實施例中，提供用於兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 的結合測定，其中定量結合至 HER2 細胞外次域 II 之抗體的結合。
在一實施例中，捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 II在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 23。在一實施例中，捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 I、II、III。在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 24。在一實施例中，捕獲試劑不包含 HER2 次域 IV。
在一實施例中，提供用於兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 的結合測定，其中定量結合至 HER2 次域 II 之抗體的結合。在一實施例中，捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 IV。
在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 28。在一實施例中，捕獲試劑不包含 HER2 次域 II。在一實施例中，捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 I、III、IV 及 EGFR 之域 II。在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 29。
在一實施例中，提供用於兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 的結合測定，其中該結合測定用於分析該等抗 HER2 抗體中之一者的生物活性。在一實施例中，藉由使結合至捕獲試劑之抗體之含量與在基於細胞之測定中所測量經分離抗體之生物活性建立關聯來定量生物活性。
在一實施例中，將捕獲試劑塗布於微孔盤上。在一實施例中，可檢測抗體靶向抗 HER2 抗體之 F(ab’)2 部分。
在一實施例中，擬在結合測定中分析之固定劑量組合進一步包含玻尿酸酶。
在一實施例中，提供包含 SEQ ID NO: 24 之經分離蛋白質。在一實施例中，提供包含 SEQ ID NO: 29 之經分離蛋白質。
進一步提供用於特異性定量固定劑量組合 (FDC) 中結合至 HER2 細胞外次域 II 之抗體之結合的套組，該固定劑量組合 (FDC) 具有結合至 HER2 細胞外次域 II 之第一抗體及第二抗 HER2 抗體，該套組包含：
a. 容器，其含有作為捕獲試劑之蛋白質，該蛋白質包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 及 SEQ ID NO: 34，
b. 關於定量與 HER2 細胞外次域 II 結合的抗體之該結合的說明。
進一步提供用於特異性定量固定劑量組合 (FDC) 中結合至 HER2 細胞外次域 IV 之抗體之結合的套組，該固定劑量組合 (FDC) 具有結合至 HER2 細胞外次域 IV 之抗體及第二抗 HER2 抗體，該套組包含：
a. 容器，該容器含有作為捕獲試劑之蛋白質，該蛋白質包含 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID NO: 4
b. 關於定量與 HER2 細胞外次域 IV 結合的抗體之該結合的說明。
在本發明之另一方面，提供評估包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法，該方法包含：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，評估上述包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。在一實施例中，擬分析之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合進一步包含玻尿酸酶。
在一實施例中，提供製備組成物之方法，其包含：(1) 生產固定劑量組成物，該固定劑量組成物包含帕妥珠單抗、曲妥珠單抗及其一個或多個變異體，及 (2) 使如此生產的該組成物進行分析測定以評估該 (等) 變異體的量，其中該 (等) 變異體包含： (i) 於 HC-Asn-391 脫醯胺的帕妥珠單抗、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體、及帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體，(ii) 帕妥珠單抗天然抗體，(iii) 曲妥珠單抗天然抗體，(vi) 具有於一條重鏈處將 HC-Asp-102 單異構化為異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供製備組成物之方法，其中步驟 (2) 之分析型測定包含：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，步驟 (2) 之分析型測定進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。
在一實施例中，步驟 (1) 之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合進一步包含玻尿酸酶。
在一實施例中，步驟 (1) 之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合包含 40 - 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 16 % 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 12% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 38% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 16 % 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 9% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 21% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 23% 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 12% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 28% 之波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 16% 之波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 12% 之波峰 8 的波峰面積，如藉由包含以下步驟之方法所確定：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，評估上述包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物另外地包含 rHuPH20。
在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 38% 之波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 16% 之波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 9% 之波峰 8 的波峰面積，如在包含以下步驟之方法中所測定：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，評估上述包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物另外地包含 rHuPH20。
在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 21% 之波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 28% 之波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 23 % 之波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 12% 之波峰 8 的波峰面積，如在包含以下步驟之方法中所測定：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，評估上述包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物另外地包含 rHuPH20。
在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在本發明之又一方面，可藉由包含下列步驟之方法獲得本文所提供之組成物：
a. 將預定量的帕妥珠單抗添加到調配器皿中
b. 以 1:1 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例或以 1:2 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例添加曲妥珠單抗
c. 添加 rHuPH20。
在又一方面，提供用於分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量的方法，其包含
a. 提供 RP-HPLC phenyl (苯基)管柱；
b. 將兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 加載於 RP-HPLC 管柱上；
c. 以 0.2 - 0.4 mL/min 的流速分離該兩種抗 HER2 抗體，其中管柱溫度為 64℃ 至 76℃。
在一實施例中，固定劑量組合包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗。在一實施例中，帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合進一步包含玻尿酸酶。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，使用水- 2-丙醇/乙腈梯度來達成步驟 c) 中之分離。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，步驟 c) 中之流速為約 0.3mL/min。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，抗體係在 10 至 20 分鐘內分離。在一此類實施例中，抗體係在 15 分鐘內分離。在一實施例中，在 0.3 mL/min 之流速下經 15 分鐘來分離抗體。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，管柱溫度為 70℃ +- 2℃。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，phenyl (苯基)管柱為選自以下群組之管柱：Agilent Zorbax RRHD 300- Diphenyl (二苯基)管柱、Acclaim Phenyl(苯基)-1 (Dionex)、Pursuit® XRs Diphenyl(二苯基)、Pinnacle® Biphenyl (聯苯)、Zorbax® Eclipse® Plus Hexyl Phenyl(苯基)、Ascentis Phenyl(苯基) 及 Agilent AdvanceBio RP mAb Diphenyl(二苯基)。
I.
定義
本專利說明書中所用之術語「約」意欲指示所提供具體值可變化某一程度，例如意指在既定值中包括在 + 10 % 範圍內之變化。在一實施例中，在既定值中包括在 +/- 5 % 範圍內之變化。
「HER 受體」係屬 HER 受體家族之受體蛋白質酪胺酸激酶且包括 EGFR、HER2、HER3 及 HER4 受體。HER 受體通常包含：細胞外域，其可結合 HER 配體且/或與另一 HER 受體分子發生二聚合；親脂性跨膜域；保守細胞內酪胺酸激酶域；及羧基-末端傳訊域，其具有若干可磷酸化之酪胺酸殘基。HER 受體可為「天然序列」 HER 受體或其「胺基酸序列變異體」。較佳的是，HER 受體係天然序列人類 HER 受體。
表達「ErbB2」及「HER2」可在本文中互換使用且係指描述於例如 Semba
等人，
PNAS (USA)82:6497-6501 (1985) 及 Yamamoto
等人， Nature319:230-234 (1986) 中之人類 HER2 蛋白 (基因庫登錄號：X03363)。術語「
erbB2」係指編碼人類 ErbB2 之基因且 「
neu」係指編碼大鼠 p185
neu 之基因。較佳 HER2 為天然序列人類 HER2。
在本文中，「HER2 細胞外域」或「HER2 ECD」係指細胞外側之錨定至細胞膜或處於循環中的 HER2 域，包括其片段。HER2 之胺基酸序列展示於圖 1 中。在一實施例中，HER2 之細胞外域可包含以下 4 個次域：「次域 I」 (約胺基酸殘基 1-195；SEQ ID NO:1)、「次域 II」 (約胺基酸殘基 196-319；SEQ ID NO:2)、「次域 III」 (約胺基酸殘基 320-488: SEQ ID NO:3) 及「次域 IV」 (約胺基酸殘基 489-630；SEQ ID NO:4) (殘基編號中不含訊號肽)。參見 Garrett
等人， Mol. Cell.11: 495-505 (2003)；Cho
等人， Nature421: 756-760 (2003)；Franklin
等人， Cancer Cell5:317-328 (2004)；及 Plowman
等人， Proc. Natl. Acad. Sci.90:1746-1750 (1993)；以及本文之圖 1。「重組 HER2 細胞外次域」或「重組 HER2 ECD 次域」包含全長或截短形式之各別天然 HER2 ECD 次域。為使經修飾 HER2 ECD 之構形儘可能接近地類似於天然 HER2 ECD 之構形，可將重組 HER2 ECD 次域較佳地在其 C-末端處截短最多 6 個胺基酸。
「抗 HER2 抗體」或「HER2 抗體」係結合至 HER2 受體之抗體。視情況，HER2 抗體進一步干擾 HER2 之活化或功能。本文之所關注抗 HER2 抗體為帕妥珠單抗及曲妥珠單抗。
「結合至 HER2 之細胞外次域 II」之抗體結合至 HER2 之域 II (SEQ ID NO: 2) 中之殘基及視情況其他次域 (例如次域 I 及 III (分別為 SEQ ID NO: 1 及 3)) 中的殘基。較佳的是，結合至細胞外次域 II 之抗體結合至 HER2 之細胞外次域 I、II 及 III 之間的接點。在一實施例中，結合細胞外次域 II 之抗體為帕妥珠單抗或其變異體。
出於本文之目的，「帕妥珠單抗」及「rhuMAb 2C4」 (其可互換使用) 係指分別包含 SEQ ID NO: 7 及 8 中之可變輕鏈胺基酸序列及可變重鏈胺基酸序列的抗體。在帕妥珠單抗係完整抗體之情形下，其較佳地包含 IgG1 抗體；在一實施例中，其包含 SEQ ID NO: 11 或 15 中之輕鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 12 或 16 中之重鏈胺基酸序列。視情況藉由重組中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞產生抗體。本文之術語「帕妥珠單抗」及「rhuMAb 2C4」涵蓋具有美國採用名 (United States Adopted Name，USAN) 或國際非專利名 (International Nonproprietary Name，INN)：帕妥珠單抗之生物類似藥物形式。
「結合至 HER2 之細胞外次域 IV」之抗體結合至 HER2 之域 IV (SEQ ID NO: 4) 中之殘基及視情況其他次域中的殘基。在一實施例中，結合細胞外次域 IV 之抗體為曲妥珠單抗或其變異體。
出於本文之目的，「曲妥珠單抗」及「rhuMAb4D5」 (其可互換使用) 係指分別包含 SEQ ID No: 13 及 14 內之可變輕鏈胺基酸序列及可變重鏈胺基酸序列的抗體。在曲妥珠單抗係完整抗體之情形下，其較佳地包含 IgG1 抗體；在一實施例中，其包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 14 之重鏈胺基酸序列。視情況藉由中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞產生抗體。本文之術語「曲妥珠單抗」及「rhuMAb4D5」涵蓋具有美國採用名 (USAN) 或國際非專利名 (INN)：曲妥珠單抗的生物類似藥物形式。
術語「複方製劑」在本文中用於係指包含兩種或更多種活性成分之單一備用醫藥製劑，包括例如包含調配至一起以供皮下 (SC) 投予之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的單一備用醫藥製劑。
「固定劑量組合」或「FDC」在本文中用於係指包含兩種或更多種活性成分之單一備用醫藥製劑，包括例如包含調配至一起以供皮下 (SC) 投予之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的單一備用醫藥製劑。「帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC」包含帕妥珠單抗、曲妥珠單抗及視情況玻尿酸酶。
術語「玻尿酸酶 (hyaluronidase 或 hyaluronidase enzyme)」係指一組發現於整個動物界中之通常為中性活性或酸活性的酶。玻尿酸酶因受質特異性及作用機制而有所不同 (WO 2004/078140)。通常存在三類玻尿酸酶：1.哺乳動物型玻尿酸酶 (EC 3.2.1.35)，其係以四醣及六醣作為主要最終產物之內切-β-N-乙醯基己醣胺酶。其具有水解及轉醣苷酶活性，且可降解玻尿酸及硫酸軟骨素 (CS)、通常 C4-S 及 C6-S。2.細菌玻尿酸酶 (EC 4.2.99.1)，其降解玻尿酸且以不同程度降解 CS 及 DS。其係藉由主要產生二醣最終產物之 β 消除反應發揮作用的內切-β-N-乙醯基己醣胺酶。3.來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼類動物之玻尿酸酶 (EC 3.2.1.36)，其係經由 β1-3 鍵聯水解生成四醣及六醣最終產物之內切-β-葡萄糖醛酸苷酶。哺乳動物玻尿酸酶可進一步分成以下兩類：中性活性酶及酸活性酶。玻尿酸酶樣酶之特徵亦可在於通常經由醣基磷脂醯肌醇錨鎖定至漿膜 (例如人類 HYAL2 及人類 PH20) [Danilkovitch-Miagkova 等人，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003；100(8):4580-4585；Phelps 等人，
Science1988；240(4860): 1780-1782] 及通常可溶 (例如人類 HYAL1) [Frost, I. G.等人，「Purification, cloning, and expression of human plasma hyaluronidase」,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997；236(1):10-15]。牛類 PH20 極鬆散地附接至漿膜且並不經由磷脂酶敏感性錨進行錨定 [Lalancette 等人，
Biol. Reprod., 2001；65(2):628-36]。牛類玻尿酸酶之此獨特特徵允許使用可溶性牛類睪丸玻尿酸酶作為用於臨床應用的提取劑 (Wydase
TM, Hyalase
TM)。其他 PH20 物質係通常在不使用洗滌劑或脂肪酶不可溶之脂質錨定酶。舉例而言，人類 PH20 經由 GPI 錨錨定至漿膜。天然獼猴精子玻尿酸酶係以可溶性形式及膜結合形式發現。儘管 64 kDa 膜結合形式在 pH 7.0 下擁有酶活性，但 54 kDa 形式僅在 pH 4.0 下具有活性 [Cherr 等人，
Dev.Biol., 1996；10；175(1): 142-53]。WO2006/091871 描述有利於將治療藥投予下皮中之可溶性玻尿酸酶醣蛋白 (sHASEGP)。藉由使細胞外空間中之 HA 快速解聚合，sHASEGP 減小了間質黏度，由此增加了水力傳導性且容許將較大體積安全且舒適地投予 SC 組織中。較佳玻尿酸酶為人類玻尿酸酶，最佳為稱為 rHuPH20 (福玻尿酸酶 α) 之重組人類玻尿酸酶。rHuPH20 係中性活性及酸活性 β-1,4 醣基水解酶之家族成員，該等水解酶藉由水解 N-乙醯基葡萄糖胺之 C
1位置與葡糖醛酸之 C
4位置之間的 β-1,4 鍵聯來使玻尿酸解聚合。在歐盟國家批準之玻尿酸酶產品包括 Hylase® 「Dessau」及 Hyalase®。在美國批準之動物來源的玻尿酸酶產品包括 Vitrase
TM、Hydase
TM及 Amphadase
TM。
rHuPH20 係當前可用於治療用於之第一及唯一重組人類玻尿酸酶。rHuPH20 (HYLENEX
TM) 之胺基酸序列已眾所周知且可在 CAS 登記號：75971-58-7 下獲得。近似分子量為 61 kDa。在一實施例中，帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 包含視情況濃度為 2000 U/mL 之玻尿酸酶。
本文之「負載」劑量通常包含投予患者之治療劑的初始劑量，且後接一個或多個維持劑量。帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 之負載劑量 (LD) 包含 40 mg/mL 曲妥珠單抗、80 mg/mL 帕妥珠單抗及 2000 U/mL rHuPH20。
本文之「維持」劑量係指在治療期內投予患者的一個或多個治療劑劑量。通常，以隔開之治療間隔投予維持劑量，例如大約每週、大約每 2 週、大約每 3 週或大約每 4 週、較佳地每 3 週。帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 之維持劑量 (MD) 包含 60 mg/mL 曲妥珠單抗、60 mg/mL 帕妥珠單抗及 2000 U/mL rHuPH20。
如本文中所使用，「捕獲試劑」係指能夠結合至分析物 (例如抗 HER2 抗體) 之任何試劑。較佳的是，「捕獲試劑」係指由兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合中之抗 HER2 抗體特異性結合的任何試劑。為特異性分析固定劑量組合中之兩種抗 HER2 抗體中之一者的結合，捕獲試劑必須對該抗體具有特異性；舉例而言，擬分析抗體對捕獲試劑之結合親和力及/或特異性應高於 FDC 的第二抗 HER2 抗體。在一實施例中，所提供測定中之捕獲試劑為經修飾 HER2 ECD。
「經修飾 HER2 ECD」係包含一個或多個重組 HER2 ECD 次域之經基因改造的蛋白質或肽。修飾 HER2 ECD，從而 FDC 中之一種擬評價抗 HER2 抗體可與其結合，而 FDC 中之第二抗 HER2 抗體則不與其結合。此係藉由刪除第二抗 HER2 抗體所結合之 HER2 ECD 次域或藉由將該次域代替為不結合任一抗 HER2 抗體之在結構上緊密的次域來達成。較佳的是，構築經修飾 HER2 ECD 以儘可能接近地模擬天然 HER2 ECD。次域可為全長或在 N-末端或 C-末端縮短幾個胺基酸。本發明之發明者已發現，在使用一個或多個在 C-末端處縮短約 4 至 5 個胺基酸之重組 HER2 ECD 次域時，HER2 ECD 之三維結構的完整性得以保留或改良。
本文之「Fc 域」用於定義免疫球蛋白重鏈之 C-末端域。Fc 域可為各種來源，例如鼠類、大鼠、山羊或人類來源。儘管免疫球蛋白重鏈之 Fc 區之邊界可有所變化，但通常將人類 IgG 重鏈之 Fc 區定義為自 Cys226 或 Pro230 位置之胺基酸殘基延伸至其羧基末端。除非另外指示，否則在本文中免疫球蛋白重鏈中之殘基之編號係 EU 索引的編號，如 Kabat
等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，國立衛生研究院 (National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991) 中所述，該文獻以引用方式明確併入本文中。「如 Kabat 中的 EU 索引」是指人 IgG1 EU 抗體的殘基編號。
本文所用之術語「可檢測抗體」係指連接至能夠生成可檢測訊號之試劑或可檢測標記的抗體，該可檢測訊號可用於評價擬檢測分析物 (亦即抗 HER 2 抗體) 之存在及/或數量。
術語「標記」或「可檢測標記」係可連接至可檢測抗體之任何化學基團或部分。可檢測標記之實例包括發光標記 (例如螢光、磷光、化學發光、生物發光及電化學發光標記)、放射性標記、酶、顆粒、磁性物質、電活性物質及諸如此類。或者，可檢測標記可藉由參與特定結合反應來指示其存在。該等標記之實例包括半抗原、抗體、生物素、鏈黴抗生物素蛋白 (streptavidin)、his 標籤、氮基三乙酸、麩胱甘肽 S-轉移酶、麩胱甘肽及諸如此類。
術語「檢測手段」係指用於經由屆時在本文之測定中讀出之訊號報告檢測可檢測抗體是否存在的部分或技術。「光致發光」係在某一材料吸收光後該材料發光之過程 (或者稱為電磁輻射或 emr)。螢光及磷光係兩種不同類型之光致發光。「化學發光」過程可藉由化學反應產生發光物質。「電化學發光」或「ECL」係在某一物質 (例如所關注抗體) 於適當周圍化學環境中暴露於電化學能後該物質發光的過程。
如本文中所使用，術語「ELISA」 (亦稱為酶聯免疫吸附測定) 係指主要用於檢測在生物樣品中是否存在抗體之生物化學技術。出於本申請案之目的，使用 ELISA 技術來檢測及定量固定劑量組合中之抗 HER2 抗體。通常，對於基於 ELISA 之測定而言，捕獲試劑係固定的或可固定。
在本文中，「效力」係指生物治療藥之治療活性或預期生物效應。生物治療藥之效力可藉由測量或定量該生物治療藥之活性成分的生物活性來測定。
在本文中，單株抗體之「生物活性」係指抗體結合至抗原且產生可測量生物反應的能力，該可測量生物反應可測量於活體外或活體內。在一實施例中，生物活性係指在如本文所提供之結合測定中結合至捕獲劑的能力。在一實施例中，FDC 中之抗 HER2 抗體之結合與單抗體製劑中之抗 HER2 抗體抑制人類乳癌細胞系中之增殖的能力相關。用於測試帕妥珠單抗之適宜人類乳癌細胞系為 MDA-MB-175-VII。用於測試曲妥珠單抗之適宜人類乳癌細胞系為 BT-474。
本文之術語「抗體」係以最廣泛意義使用且具體而言涵蓋單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (
例如雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其展現期望生物活性。
非人類 (
例如齧齒類動物) 抗體之「人類化」形式為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。大部分人類化抗體為人類免疫球蛋白 (接受者抗體)，其中來自接受者的超變區的殘基由非人類物種 (提供者抗體) (例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物) 的超變區中具有期望特異性、親和力及能力的殘基代替。在一些情況下，人類免疫球蛋白的骨架區 (FR) 殘基被相應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可包含不存在於受體抗體或供體抗體中之殘基。這些修飾是進行以進一步改善抗體效能。通常，人源化抗體將包括實質上所有至少一個（且通常兩個）可變域，其中，所有或實質上所有高度變異環對應於非人類免疫球蛋白之高度變異環，並且所有或實質上所有 FR 是人免疫球蛋白序列之 FR。人源化抗體亦視需要將包含免疫球蛋白恆定區 (Fc) 的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白的恆定區。關於其他細節，參見 Jones
等人， Nature321:522-525, 1986；Riechmann
等人， Nature332:323-329, 1988；及 Presta,
Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596, 1992。人類化 HER2 抗體具體而言包括曲妥珠單抗 (HERCEPTIN®)，如美國專利 5,821,337 (以引用方式明確併入本文中) 之表 3 中所描述且如本文所定義；及人類化 2C4 抗體，例如如本文所描述及定義之帕妥珠單抗。
本文之「完整抗體」係包含兩個抗原結合區及 Fc 區者。較佳的是，完整抗體具有功能性 Fc 區。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳地包含其抗原結合區。抗體片段之實例包括 Fab、Fab’、F(ab’)
2及 Fv 片段；二價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「天然抗體」通常為約 150,000 道爾頓之異源四聚體醣蛋白，其係由兩個相同輕 (L) 鏈及兩個相同重 (H) 鏈構成。各輕鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈，而在不同免疫球蛋白同型之重鏈中，二硫鍵數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。每一重鏈在一端具有可變域 (V
H)，隨後為多個恆定域。每一輕鏈在一端具有可變域 (V
L) 且在其另一端具有恆定域。輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。據信，特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面。
本文所用之術語「超變區」係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。超變區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基 (
例如輕鏈可變域中之殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2) 及 89-97 (L3) 以及重鏈可變域中之 31-35 (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3)；Kabat
等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD. (1991)) 及/或來自「超變環」的彼等殘基 (
例如輕鏈可變域中之殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2) 及 91-96 (L3) 以及重鏈可變域中之 26-32 (H1)、53-55 (H2) 及 96-101 (H3)；ChothiA 及 Lesk
J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))。「框架區」或「FR」殘基係除如本文所定義超變區殘基外的彼等可變域殘基。
端視重鏈恆定域之胺基酸序列，完整抗體可歸類為不同「種類」。存在以下五大類完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且該等種類中之若干者可進一步分成「子類」(同型)，
例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 及 IgA2。對應於不同種類之抗體的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。不同種類之免疫球蛋白的亞單元結構及三維組態已眾所周知。
「裸抗體」係未與異源分子 (例如細胞毒性部分或放射性標記) 結合之抗體。
「親和力成熟的」抗體係與不具有改變的親代抗體相比在一個或多個超變區中具有一個或多個改變的抗體，該等改變可改良抗體對抗原的親和力。 較佳的親和力成熟的抗體對靶抗原具有奈米莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度的親和力。藉由業內已知程序產生親和力成熟的抗體。Marks
等人 Bio/Technology10:779-783 (1992) 描述藉由 VH 及 VL 域改組所達成的親和力成熟。CDR 及/或框架殘基的隨機誘變描述於以下文獻中：Barbas
等人， Proc Nat. Acad. Sci, USA91:3809-3813 (1994)；Schier
等人， Gene169:147-155 (1995)；Yelton
等人， J. Immunol.155:1994-2004 (1995)；Jackson
等人， J. Immunol.154(7):3310-9 (1995)；及 Hawkins
等人， J. Mol. Biol.226:889-896 (1992)。
「小瓶」係適於容納液體或凍乾製劑之容器。在一實施例中，小瓶為一次性小瓶，例如具有塞子之 10 mL 或 20 mL 一次性小瓶，例如具有 20mm 塞子之 10 mL 一次性玻璃小瓶。
如本文中所使用，「沖提」係指自陽離子交換材料取出所關注蛋白質 (例如抗體)，此係藉由改變環繞陽離子交換材料之緩衝液之離子強度以便緩衝液與分子競爭離子交換材料上的帶電位點來達成。
如本文中所使用，術語「層析」係指藉由經由吸附劑滲濾混合物來分離混合物中之所關注溶質 (例如所關注蛋白質) 與混合物中之其他溶質的過程，該吸附劑在特定過程緩衝條件下會或多或少地強烈吸附或保留溶質 (因溶質性質，例如 pi、疏水性、大小及結構)。
術語「離子交換」及「離子交換層析」係指如下層析過程：其中所關注可離子化溶質 (例如 FDC 之抗體以及其酸性及鹼性變異體) 與連接 (例如藉由共價附接) 至固相離子交換材料之帶相反電荷的配體在適當 pH 及電導性條件下相互作用，從而所關注溶質較混合物中之溶質雜質或污染物或多或少地與帶電化合物非特異性地相互作用。
「離子交換層析」具體而言包括陽離子交換 (CEX) 層析、陰離子交換層析及混合模式層析。
「陽離子交換材料」或「CEX 材料」係指帶負電之固相，其具有用於與通過固相上方或穿過固相之水溶液中之陽離子進行交換的游離陽離子。可使用任何適於形成陽離子交換材料之附接至固相的帶負電配體，例如羧酸酯、磺酸酯及如下文所描述之其他者。市售陽離子交換材料包括但不限於 (例如) 彼等具有以下基團者：基於磺酸酯之基團 (例如來自 GE Healthcare 之 MonoS、MiniS、Source 15S 及 30S、SP Sepharose Fast Flow™、SP Sepharose High Performance、來自 Tosoh 之 Toyopearl SP-650S 及 SP-650M、來自 BioRad 之 Macro-Prep High S、來自 Pall Technologies 之 Ceramic HyperD S、Trisacryl M 及 LS SP 以及 Spherodex LS SP)；基於磺基乙基之基團 (例如來自 EMD 之 Fractogel SE、來自施加 Biosystems 之 Poros S-10 及 S-20)；基於磺基丙基之基團 (例如來自 Tosoh 之 TSK Gel SP 5PW 及 SP-5PW-HR、來自 Applied Biosystems 之 Poros HS-20 及 HS 50)；基於磺基異丁基之基團 (例如來自 EMD 之 Fractogel EMD SO3 ")；基於亞磺醯基乙基之基團 (例如來自 Whatman 之 SE52、SE53 及 Express-Ion S)、基於羧甲基之基團 (例如來自 GE Healthcare 之 CM Sepharose Fast Flow、來自 Biochrom Labs Inc. 之 Hydrocell CM、來自 BioRad 之 Macro-Prep CM、來自 Pall Technologies 之 Ceramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、來自 Millipore 之Matrx Cellufine C500 及 C200、來自 Whatman 之 CM52、CM32、CM23 及 Express -Ion C、來自 Tosoh 之 Toyopearl CM-650S、CM-650M 及 CM-650C)；基於磺酸及羧酸之基團 (例如來自 J.T.Baker 之 BAKERBOND Carboxy-Sulfon)；基於羧酸之基團 (例如來自 J.T Baker 之 WP CBX、來自 Dow Liquid Separations 之 DOWEX MAC-3、來自 Sigma-Aldrich 之 Amberlite 弱陽離子交換劑、DOWEX 弱陽離子交換劑及 Diaion 弱陽離子交換劑以及來自 EMD 之 Fractogel EMD COO-)；基於磺酸之基團 (例如來自 Biochrom Labs Inc. 之 Hydrocell SP、來自 Dow Liquid Separations 之 DOWEX 細網強酸陽離子樹脂、來自 J. T. Baker 之 UNOsphere S、WP Sulfonic、來自 Sartorius 之 Sartobind S 膜、來自 Sigma-Aldrich 之 Amberlite 強陽離子交換劑、DOWEX 強陽離子及 Diaion 強陽離子交換劑)；及基於正磷酸酯之基團 (例如來自 Whatman 之 PI 1)。
端視帶電基團/取代基之化學性質且端視共價結合之帶電取代基的強度，「離子交換層析材料」可分類為強離子交換材料或弱離子交換材料。本文所用之「強陽離子交換材料」或「(SCX) 材料」具有基於磺酸之基團，例如磺酸酯、磺基丙基、聚苯乙烯磺酸鈉或聚 AMPS (聚(2-丙烯醯胺基-2-甲基-1-丙烷磺酸)。
蛋白質或抗體之「等電點」或「pI」對應於蛋白質或抗體之淨電荷為中性時的 pH 值。可藉由標準實驗方法來測定 pI，例如藉由等電聚焦或藉由計算方法 (「理論 pI」)。計算方法之一實例為免費在線標準工具 「ExPASy」 (http://web.expasy.org/compute_pi/)，其基於蛋白質或抗體之胺基酸序列來計算 pI。曲妥珠單抗之理論 pI 為 8.4 且帕妥珠單抗之理論 pI 為 8.7。
「移動相」係流經層析系統以使擬分離材料以不同速率移動通過固定相之液體或氣體。較佳的是，移動相為液體。在一實例中，移動相可為加載緩衝液 (「移動相 A」) 或沖提緩衝液 (移動相 B)。
「加載緩衝液」提供一定條件以確保靶分子與離子交換層析材料之配體有效地相互作用，且在所有其他分子流經管柱時由親和介質保留。
「沖提緩衝液」用於首先洗掉未結合蛋白質且然後以較大濃度自配體釋放電荷變異體及天然抗體。
本文之術語「主要種類抗體」或「天然抗體」係指組成物中之在數量上係組成物中之優勢抗體分子的抗體胺基酸序列結構。就兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合而言，兩種主要種類抗體為組成物之一部分。因此，在一實施例中，主要種類抗體係結合至 HER2 之細胞外次域 II 的抗體及結合至細胞外次域 IV 的抗體。在一實施例中，FDC 之主要種類抗體為帕妥珠單抗及曲妥珠單抗。
「電荷變異體」係主要種類抗體之一種變異體，其具有不同於主要種類抗體之整體電荷。電荷變異體之實例為酸性變異體及鹼性變異體。
「酸性變異體」係主要種類抗體之一種變異體，其酸性大於主要種類抗體。相對於主要種類抗體，酸性變異體已獲得負電荷或損失正電荷。可使用根據電荷分離蛋白質之分離方法 (例如離子交換層析) 來解析該等酸性變異體。 在藉由陽離子交換層析分離後，主要種類抗體之酸性變異體早於主峰沖提出。可分離帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之酸性變異體且藉由本文所描述之離子交換層析方法進行定量。酸性帕妥珠單抗變異體之實例係在位置 391 之重鏈天門冬醯胺酸(HC-Asn-391) 處脫醯胺的帕妥珠單抗、帕妥珠單抗 Fc 唾液酸變異體及帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體。酸性曲妥珠單抗變異體之實例係在 LC-Asn-30 處脫醯胺的曲妥珠單抗及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗。
「鹼性變異體」係主要種類抗體之一種變異體，其鹼性大於主要種類抗體。相對於主要種類抗體，鹼性變異體已獲得正電荷或損失負電荷。可使用根據電荷分離蛋白質之分離方法 (例如離子交換層析) 來解析該等鹼性變異體。 在藉由陽離子交換層析分離後，主要種類抗體之鹼性變異體晚於主峰沖提出。可分離帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之鹼性變異體且藉由本文所描述之離子交換層析方法進行定量。
本文所用之術語「梯度」意指移動相在層析樣品運行期間的性質變化。在「連續梯度」中，移動相之一種或多種條件 (例如 pH、離子強度、鹽濃度及/或移動相流動) 連續改變，亦即升高或降低。該變化可為線性或指數或漸近的。在「逐步梯度」中，與線性變化相比，一種或多種條件 (例如 pH、離子強度、鹽濃度及/或層析流動) 可以遞增方式改變，亦即逐步改變。
術語「RP-UHPLC」意指反相超高效液相層析。術語 RP-HPLC 代表反相高效液相層析。使用 HPLC基於極性及與管柱固定相之相互作用來分離化合物。反相層析係用於液相層析中之沖提程序，其中移動相之極性顯著大於固定相。
本文所用之「RP-HPLC 苯基管柱」係指在管柱填料或樹脂 (固定相) 上存在疏水性苯基的管柱。舉例而言，苯基管柱將流經管柱之材料暴露於未取代苯基。苯基管柱含有例如共價結合至二氧化矽表面之短烷基苯基配體或二苯基相。一些具有苯基之苯基管柱在苯基與二氧化矽表面之間具有烷基間隔體。藉由增加烷基間隔體之長度，可增強空間選擇性及芳香族選擇性。RP-HPLC 苯基管柱之區別在於芳香族基團數 (單苯基對聯苯)、二氧化矽表面與苯基之間之烷基間隔體的長度、鍵結配體上之取代基 (通常係甲基或空間上更為龐大之異丁基) 的性質、在連接體中是否納入氧原子以活化芳香族環中之 π 電子系統及最後是否將二氧化矽固定表面封端。舉例而言，RP-HPLC 苯基管柱可具有下列群組：具有甲基側基之乙基苯基及封端二氧化矽表面、具有延伸 (己基) 配體間隔體甲基側基之苯基己基相、具有空間保護性 (異丁基) 側基之乙基苯基配體、具有甲基側基之己基聯苯、具有甲基側基之聯苯相、具有甲基側基之氧活化苯基乙基苯基相。固定相經苯基 (例如單一苯基、聯苯、二苯基、苯基己基、苯基丙基) 修飾之 HPLC 管柱可易於自大部分主要管柱供應商獲得，例如：Acclaim Phenyl-1 (Dionex)、Pursuit® XRs Diphenyl、Pinnacle® Biphenyl、Zorbax® Eclipse® Plus Hexyl Phenyl、Ascentis Phenyl、Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl 及 Agilent AdvanceBio RP mAb Diphenyl。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調控的細胞生長為特徵的生理病狀。
「晚期」癌症係已藉由局部侵襲 (「局部晚期」) 或轉移 (「轉移性」) 擴散至源部位或器官外部者。據此，術語「晚期」癌症包括局部晚期疾病及轉移性疾病二者。
「轉移性」癌症係指已自一個身體部分 (例如乳房) 擴散至另一身體部分的癌症。
「難治性」癌症係即使正向癌症患者投予抗腫瘤劑 (例如化學療法或生物療法，例如免疫療法) 亦進展者。難治性癌症之一實例係鉑難治性癌症。
「復發性」癌症係在對初始療法 (例如手術) 之反應後已在初始部位處或在遠端部位處再生長者。
「局部復發性」癌症係在治療後於與先前經治療癌症相同之地方重現的癌症。
「非可切除性」或「不可切除性」癌症不能藉由手術去除 (切除)。
本文之「早期乳癌」係指尚未擴散超過乳房或腋窩淋巴結之乳癌。通常使用新輔助或輔助療法治療該癌症。
「新輔助療法」或「新輔助治療」或「新輔助投予」係指在手術之前給予的全身性療法。
「輔助療法」或「輔助治療」或「輔助投予」係指在手術之後給予的全身性療法。
在本文中，「患者」或「個體」為人類患者。患者可為「癌症患者」，
亦即患有癌症、尤其乳癌之一種或多種症狀或處於患有該等症狀的風險下者。
「患者群體」係指一組癌症患者。可使用該等群體來證實藥物 (例如帕妥珠單抗及/或曲妥珠單抗) 之統計學顯著的療效及/或安全性。
「復發」患者係在緩解之後具有癌症的體徵或症狀者。視情況，患者在輔助療法或新輔助療法之後復發。
「顯示 HER 表現、擴增或活化」之癌症或生物樣品係在診斷測試中表現 (包括過度表現) HER 受體、具有經擴增 HER 基因及/或另外顯示 HER 受體的活化或磷酸化者。
「顯示 HER 活化」之癌症或生物樣品係在診斷測試中顯示 HER 受體的活化或磷酸化者。可直接 (
例如藉由使用 ELISA 測量 HER 磷酸化) 或間接 (
例如藉由基因表現剖析或藉由檢測 HER 異源二聚體，如本文所描述) 測定該活化。
具有「HER 受體過度表現或擴增」之癌細胞係 HER 受體蛋白或基因之含量顯著高於同一組織類型的非癌性細胞者。該過度表現可由基因擴增或由轉錄或轉譯增加引起。可在診斷或預後測定中藉由評估存在於細胞表面上之 HER 蛋白的含量增加 (
例如經由免疫組織化學測定 IHC) 來測定 HER 受體過度表現或擴增。替代地或另外，可
例如經由以下方法來測量細胞中之 HER-編碼核酸的含量：
原位雜交 (ISH)；包括螢光
原位雜交 (FISH；參見公開於 1998 年 10 月之 WO98/45479) 及發色
原位雜交 (CISH；參見例如 Tanner 等人，
Am. J. Pathol.157(5): 1467–1472 (2000)；Bella 等人，
J. Clin. Oncol.26：(5 月 20 日增刊；abstr 22147) (2008))；南方印漬；或聚合酶鏈反應 (PCR) 技術，例如定量實時 PCR (qRT-PCR)。亦可藉由測量生物流體 (例如血清) 中之脫落抗原 (
例如HER 細胞外域) 來研究 HER 受體過度表現或擴增 (
例如參見 1990 年 6 月 12 日發行之美國專利第 4,933,294 號；1991 年 4 月 18 日公開之 WO91/05264；1995 年 3 月 28 日發行之美國專利 5,401,638；及 Sias 等人
， J. Immunol. Methods132: 73-80 (1990))。除上述測定外，熟習此項技術者可利用各種
活體內測定。舉例而言，可將患者體內之細胞暴露於視情況經可檢測標記 (
例如放射性標記) 標記的抗體，原位分析放射性或分析自預先暴露於抗體之患者獲取的生檢。
「HER2 陽性」癌症包含 HER2 含量高於正常含量之癌細胞。視情況，HER2 陽性癌症具有 2+ 或 3+ 之免疫組織化學 (IHC) 分數；且/或為
原位雜交 (ISH)、螢光
原位雜交 (FISH) 或發色
原位雜交 (CISH) 陽性，例如具有 ≥2.0 之 ISH/FISH/CISH 擴增比。
「HER2-突變」癌症包含具有 HER2-活化突變 (包括激酶域突變) 之癌細胞，該等癌細胞可例如藉由次世代定序 (NGS) 或實時聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 來鑑別。「HER2-突變」癌症具體而言包括具有以下特性之癌症：HER2 外顯子 20 中之插入、HER2 胺基酸殘基 755-759 周圍之缺失、突變 G309A、G309E、S310F、D769H、D769Y、V777L、P780-Y781insGSP、V842I、R896C 中之任一者 (Bose 等人，Cancer Discov 2013；3:1-14) 以及 COSMIC 資料庫中發現於兩種或更多種獨特樣品中之先前已報導的相同非同義假定活化突變 (或插入缺失)。其他細節可參見例如 Stephens 等人，
Nature2004;431:525-6；Shigematsu 等人，
Cancer Res2005; 65:1642-6；Buttitta 等人，
Int J Cancer2006; 119:2586-91；Li 等人，
Oncogene2008; 27:4702-11；Sequist 等人，
J Clin Oncol2010; 28:3076-83；Arcila 等人，
Clin Cancer Res2012; 18:4910-8；Greulich 等人，
Proc Natl Acad SciU S A 2012; 109:14476-81；及 Herter-Sprie 等人，
Front Oncol2013;3:1-10。
在本文中，「抗腫瘤劑」係指用於治療癌症之藥物。本文之抗腫瘤之非限制性實例劑包括化學治療劑、HER 二聚化抑制劑、HER 抗體、針對腫瘤相關抗原之抗體、抗激素化合物、細胞介素、EGFR 靶向藥、抗血管生成劑、酪胺酸激酶抑制劑、生長抑制性藥劑及抗體、細胞毒性劑、誘導細胞凋亡之抗體、COX 抑制劑、法尼基轉移酶抑制劑、結合癌胚 CA 125 之抗體、HER2 疫苗、Raf 或 ras 抑制劑、脂質體多柔比星 (doxorubicin)、托泊替康 (topotecan)、紫杉烷 (taxane)、雙重酪胺酸激酶抑制劑、TLK286、EMD-7200、帕妥珠單抗、曲妥珠單抗、埃羅替尼 (erlotinib) 及貝伐珠單抗 (bevacizumab)。
「治療」係指治療性治療及防治性或預防性措施。彼等需要治療者包括彼等已患有癌症者以及彼等擬預防癌症者。因此，本文之擬治療患者可能已診斷為患有癌症或可易患或易感癌症。
術語「有效量」係指有效治療患者之癌症的藥物量。治療有效量之藥物可減少癌細胞數；減小腫瘤大小；抑制 (亦即，在一定程度上減緩或較佳地停止) 癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制 (亦即，在一定程度上減緩或較佳地停止)
腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕與癌症有關之一種或多種症狀。在一定程度上，該藥可防止生長和/或殺除現有的癌細胞，它可為抑制細胞生長的和/或細胞毒性的。有效量可延長無進展存活
( 例如如藉由實體腫瘤反應評估準則 (Response Evaluation Criteria for Solid Tumors)、RECIST 或 CA-125 變化所測量)，產生目標反應 (包括部分反應 PR 或完全反應 CR)，增加整體存活時間，且/或改良一種或多種癌症症狀 (
例如如藉由 FOSI 所評價)。
本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞破壞的物質。該術語意欲包括放射性同位素
(例如 At
211, I
131, I
125, Y
90, Re
186, Re
188, Sm
153, Bi
212, P
32及 Lu 之放射性同位素)、化學治療劑及毒素 (例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體)。
「化學療法」使用可用於治療癌症的化學化合物。用於化學療法中之化學治療劑的實例包括烷基化劑，例如噻替派 (thiotepa) 及 CYTOXAN® 環磷醯胺 (cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯，例如白消安 (busulfan)、英丙舒凡 (improsulfan) 及哌泊舒凡 (piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴 (benzodopa)、卡波醌 (carboquone)、米得哌 (meturedopa)及烏得哌 (uredopa)；伸乙亞胺(ethylenimines)及甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺 (altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethiylenethiophosphoramide)及三羥甲基蜜胺( trimethylolomelamine)；TLK 286 (TELCYTA
TM)；番荔枝內酯 (acetogenin) (尤其係布拉他辛 (bullatacin) 及布拉他辛酮 (bullatacinone))；δ-9-四氫大麻醇 (四氫大麻酚 (dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕醌 (β-lapachone)；拉帕醇 (lapachol)；秋水仙鹼 (colchicine)；白樺脂酸 (betulinic acid)；喜樹鹼 (camptothecin) (包括合成類似物托泊替康 (HYCAMTIN®)、CPT-11 (伊立替康 (irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼 (acetylcamptothecin)、莨菪素 (scopolectin) 及 9-胺基喜樹鹼 (9-aminocamptothecin))；苔蘚蟲素 (bryostatin)；卡利斯他汀 (callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新 (adozelesin)、卡折來新 (carzelesin) 及比折來新 (bizelesin) 合成類似物)；鬼臼毒素 (podophyllotoxin)；鬼臼酸 (podophyllinic acid)；替尼泊苷 (teniposide)；念珠藻素 (cryptophycin) (尤其係念珠藻素 1 及念珠藻素 8)；多拉斯他汀 (dolastatin)；多卡米星 (duocarmycin) (包括合成類似物 KW-2189 及 CB1-TM1)；艾榴素 (eleutherobin)；水鬼蕉鹼 (pancratistatin)；匍枝珊瑚醇 (sarcodictyin)；海綿抑制素 (spongistatin)；氮芥 (nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥 (chlornaphazine)、氯磷醯胺 (cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺 (ifosfamide)、雙氯乙基甲胺 (mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖 (melphalan)、新恩比興 (novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯 (phenesterine)、潑尼莫司汀 (prednimustine)、曲磷胺 (trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲(nitrosureas)，例如卡莫司汀 (carmustine)、氯脲黴素 (chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、洛莫司汀 (lomustine)、尼莫司汀 (nimustine) 及雷莫司汀 (ranimnustine)；雙膦酸酯(bisphosphonates)，例如氯磷酸 (clodronate)；抗生素，例如烯二炔抗生素 (例如卡奇黴素 (calicheamicin)、尤其卡奇黴素 γ1I 及卡奇黴素 ωI1 (參見例如
Agnew,
Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) 及蒽環類藥物(anthracyclines)，例如安那霉素 (annamycin)、AD 32、阿柔比星 (alcarubicin)、柔紅黴素 (daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、右雷佐生 (dexrazoxane)、DX-52-1、表柔比星 (epirubicin)、GPX-100、伊達比星 (idarubicin)、戊柔比星 (valrubicin)、KRN5500、美諾立爾 (menogaril)、達內黴素 (dynemicin) (包括達內黴素 A)、埃斯培拉黴素 (esperamicin)、新製癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素(chromoprotein enediyne antiobiotic)發色團、阿克拉黴素 (aclacinomysin)、放線菌素 (actinomycin)、安麯黴素 (authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素 (bleomycin)、放線菌素 C (cactinomycin)、卡拉黴素 (carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌黴素 (carzinophilin)、色黴素 (chromomycin)、更生黴素 (dactinomycin)、地托比星 (detorubicin)、6-重氮-5-側氧-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN® (多柔比星) (包括嗎啉基-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基嗎啉基-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉基-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)、脂質體多柔比星(liposomal doxorubicin)及去氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、依索比星 (esorubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素 (mitomycin) (例如絲裂黴素 C)、黴酚酸 (mycophenolic acid)、諾拉黴素 (nogalamycin)、橄欖黴素 (olivomycin)、培洛黴素 (peplomycin)、泊非黴素 (potfiromycin)、嘌呤黴素 (puromycin)、三鐵阿黴素 (quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、鏈黑黴素 (streptonigrin)、鏈脲黴素 (streptozocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他丁 (zinostatin) 及佐柔比星 (zorubicin)；葉酸類似物，例如二甲葉酸 (denopterin)、蝶羅呤 (pteropterin) 及曲美沙特 (trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱 (fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤 (thiamiprine) 及硫鳥嘌呤 (thioguanine)；嘧啶類似物，例如安西他濱 (ancitabine)、阿紮胞苷 (azacitidine)、6-氮尿苷 (6-azauridine)、卡莫氟 (carmofur)、阿糖胞苷 (cytarabine)、二去氧尿苷 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苷 (doxifluridine)、依諾他濱 (enocitabine) 及氟尿苷 (floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮 (calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、環硫雄醇 (epitiostanol)、美雄烷 (mepitiostane) 及睪內酯 (testolactone)；抗腎上腺素，例如胺魯米特 (aminoglutethimide)、米托坦 (mitotane) 及曲洛司坦 (trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸 (甲醯四氫葉酸 (leucovorin))；乙醯葡醛酸內酯 (aceglatone)；抗葉酸抗腫瘤劑，例如 ALIMTA®、LY231514 (培美曲塞 (pemetrexed))、二氫葉酸還原酶抑制劑 (例如胺甲喋呤 (methotrexate))、抗代謝物 (例如 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 及其前藥，例如 UFT、S-1 及卡培他濱 (capecitabine)) 以及胸苷酸合酶抑制劑(thymidylate synthase inhibitors)及甘胺醯胺核糖核苷酸甲醯基轉移酶抑制劑(glycinamide ribonucleotide formyltransferase inhibitors) (例如雷替曲塞 (raltitrexed) (TOMUDEX
RM, TDX))；二氫嘧啶去氫酶抑制劑(inhibitors of dihydropyrimidine dehydrogenase)，例如恩尿嘧啶 (eniluracil)；醛磷醯胺醣苷 (aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸 (aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；雌二醇-瘤克甯錠複合物 (bestrabucil)；比生群 (bisantrene)；依達曲沙 (edatraxate)；地磷醯胺 (defofamine)；秋水仙胺 (demecolcine)；地吖醌 (diaziquone)；依氟鳥胺酸 (eflornithine)；依利乙銨 (elliptinium acetate)；埃博黴 (epothilone)；依託格魯 (etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達明 (lonidainine)；類美登素 (maytansinoid)，例如美登素 (maytansine) 及柄型菌素 (ansamitocins)；米托胍腙 (mitoguazone)；米托蒽醌 (mitoxantrone)；莫哌達醇 (mopidamol)；尼群克林 (nitraerine)；噴托他丁 (pentostatin)；蛋胺氮芥 (phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；洛索蒽醌 (losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼 (procarbazine)；PSK7 多醣複合物 (JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生 (razoxane)；根黴素 (rhizoxin)；西佐喃 (sizofiran)；螺旋鍺 (spirogermanium)；細格孢氮雜酸 (tenuazonic acid)；三亞胺醌 (triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯 (trichothecene) (尤其係 T-2 毒素、疣皰菌素 A (verrucarin A)、桿孢菌素 (roridin A) 及蛇形菌素 (anguidine))；烏拉坦 (urethane)；長春地辛 (vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪 (dacarbazine)；甘露莫司汀 (mannomustine)；二溴甘露醇 (mitobronitol)；二溴衛矛醇 (mitolactol)；哌泊溴烷 (pipobroman)；噶薩托辛 (gacytosine)；阿糖胞苷 (arabinoside) (「Ara-C」)；環磷醯胺(cyclophosphamide)；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxanes)；瘤克寧錠 (chloranbucil)；吉西他濱 (gemcitabine) (GEMZAR®)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑；鉑類似物或基於鉑之類似物，例如順鉑 (cisplatin)、奧沙利鉑 (oxaliplatin) 及卡鉑 (carboplatin)；長春鹼 (vinblastine) (VELBAN®)；依託泊苷 (etoposide) (VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼 (vincristine) (ONCOVIN®)；長春花生物鹼；長春瑞濱 (vinorelbine) (NAVELBINE®)；諾肖林 (novantrone)；依達曲沙 (edatrexate)；道諾黴素 (daunomycin)；胺基蝶呤 (aminopterin)；希羅達 (xeloda)；伊班膦酸鹽 (ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑 RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸 (DMFO)；類視黃醇，例如視黃酸；上文任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上文中之兩者或更多者之組合，例如 CHOP，其係環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及普賴蘇濃 (prednisolone) 之組合療法的縮寫；及 FOLFOX，其係奧沙利鉑 (ELOXATIN
TM) 與 5-FU 及甲醯四氫葉酸之組合治療方案的縮寫。
此定義中亦包括用於調控或抑制腫瘤激素作用之抗激素劑，例如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑 (SERM)，包括例如他莫昔芬 (tamoxifen) (包括 NOLVADEX® 他莫昔芬)、雷洛昔芬 (raloxifene)、屈洛昔芬 (droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬 (trioxifene)、可莫昔芬 (keoxifene)、LY117018、奧那司酮 (onapristone) 及 FARESTON® 托瑞米芬(toremifene)；芳香酶抑制劑；及抗雄激素，例如氟他胺 (flutamide)、尼魯米特 (nilutamide)、比卡魯胺 (bicalutamide)、柳培林 (leuprolide) 及戈舍瑞林 (goserelin)；以及曲沙他濱 (troxacitabine) (1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其係彼等抑制涉及異常細胞增殖之傳訊路徑中之基因 (例如 PKC-α、Raf、H-Ras 及表皮生長因子受體 (EGF-R)) 的表現者；疫苗，例如基因療法疫苗，例如 ALLOVECTIN ® 疫苗、LEUVECTIN® 疫苗及 VAXID® 疫苗；普留淨 (PROLEUKIN)® rIL-2；LURTOTECAN® 拓撲異構酶 1 抑制劑 (topoisomerase 1 inhibitor)；阿巴瑞克 (ABARELIX)® rmRH；及上文任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
「紫杉烷」係抑制有絲分裂且干擾微管之化學治療劑。紫杉烷之實例包括太平洋紫杉醇 (paclitaxel) (TAXOL®；Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)；太平洋紫杉醇或
nab-太平洋紫杉醇之無克列莫佛 (cremophor)、白蛋白工程化奈米顆粒製劑 (ABRAXANE
TM；American PharmaceuticalPartners, Schaumberg, Illinois)；及多西他賽 (docetaxel) (TAXOTERE®; Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France)。
「蔥環類藥物」係一類源自真菌波賽鏈黴菌 (Streptococcus peucetius) 之抗生素，實例包括：柔紅黴素、多柔比星、表柔比星及任何其他蒽環化學治療劑 (包括彼等列示於前文者)。
「基於蔥環類藥物之化學療法」係指由一種或多種蒽環組成或包括一種或多種蒽環的化學療法方案。實例包括但不限於 5-FU、表柔比星及環磷醯胺 (FEC)；5-FU、多柔比星及環磷醯胺 (FAC)；多柔比星及環磷醯胺 (AC)；表柔比星及環磷醯胺 (EC)；劑量密集之多柔比星及環磷醯胺 (ddAC) 及諸如此類。
出於本文目的，「基於卡鉑之化學療法」係指由一種或多種卡鉑組成或包括一種或多種卡鉑的化學療法方案。一實例為 TCH (多西他賽/TAXOL®、卡鉑及曲妥珠單抗/HERCEPTIN®)。
「芳香酶抑制劑」抑制可調控腎上腺中之雌激素產生的芳香酶。芳香酶抑制劑之實例包括：4(5)-咪唑、胺基格魯米特 (aminoglutethimide)、MEGASE® 醋酸甲地羥孕酮 (megestrol acetate)、AROMASIN® 依西美坦 (exemestane)、福美司坦 (formestanie)、法曲唑 (fadrozole)、RIVISOR® 伏氯唑 (vorozole)、FEMARA® 來曲唑 (letrozole) 及 ARIMIDEX® 阿那曲唑 (anastrozole)。在一實施例中，本文之芳香酶抑制劑為來曲唑或阿那曲唑。
「抗代謝化學療法」使用在結構上類似於代謝物但不能有效用於身體之藥劑。許多抗代謝化學療法干擾核酸、RNA 及 DNA 之產生。抗代謝化學治療劑之實例包括吉西他濱 (GEMZAR®)、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、卡培他濱(capecitabine) (XELODA
TM)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、胺甲喋呤(methotrexat)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞嘧啶 ARA-C 阿糖胞苷(arabinosylcytosine ARA-C cytarabine) (CYTOSAR‑U®)、達卡巴嗪 (dacarbazine)(DTIC-DOME®)、偶氮胞嘧啶(azocytosine)、去氧胞嘧啶(deoxycytosine)、嘧啶、氟達拉濱(fludarabine) (FLUDARA®)、克拉屈濱 (cladrabine)、2‑去氧‑D‑葡萄糖等。
「化學療法抗性」癌症意指，癌症患者在接受化學療法方案的同時發生進展 (
亦即，患者為「化學療法難治性」)，或患者在完成化學療法方案之後 12 個月內 (例如 6 個月內) 發生進展。
術語「鉑類 (platin)」在本文中用於係指基於鉑之化學療法，包括但不限於順鉑、卡鉑及奧沙利鉑。
術語「氟嘧啶」在本文中用於係指抗代謝化學療法，包括但不限於卡培他濱、氟尿苷及氟尿嘧啶 (5-FU)。
本文之治療劑之「固定」或「統一」劑量係指在不考慮患者之體重 (WT) 或體表面積 (BSA) 下投予人類患者的劑量。 因此，固定或統一劑量不以 mg/kg 劑量或 mg/m
2劑量提供，而係以治療劑的絕對量來提供。
II.
測定
將治療性單株抗體 (mAb) 的複方製劑對固定劑量組合 (FDC) 會增加藥品之複雜性，且對產物品質之表徵及控制帶來難題。在共調配抗體具有類似物理化學性質 (如類似等電點、序列類似性及大小差異不顯著) 時，此難題有所加劇。此外，每一共調配抗體可在製造期間展現大小、電荷及轉譯後修飾之異質性。出於該等原因，需要表徵及理解固定劑量組合中之 mAb 之間的相互作用。本文描述用以確定兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合之關鍵品質屬性 (CQA) 的分析方法。
在一方面，該等測定適於分析兩種抗 HER2 抗體曲妥珠單抗及帕妥珠單抗之固定劑量組合。曲妥珠單抗及帕妥珠單抗具有大於 93% 之序列同一性 (僅相差 30 Da) 且二者皆具有大約 148 kDa 的分子量。另外，兩種抗體具有極類似等電點，結合至相同標靶 (HER2) 且在活體內具有協同效應。因該等結構及功能類似性，大部分常用已知分析方法不能應用於此複方製劑。另外，經研發用於測試策略之測定考慮到，曲妥珠單抗-帕妥珠單抗固定劑量組合係以兩個不同劑量、亦即負載劑量及維持劑量來提供，該等劑量之區別在於帕妥珠單抗 SC 藥物物質與曲妥珠單抗 SC 藥物物質的比率。
(i)
效力測定
效力係包括於生物治療劑 (包括治療性單株抗體) 之釋放及穩定性測試之控制系統中的 CQA。效力會監測產物品質屬性對生物活性之累積影響，其可潛在地影響安全及療效；亦即，較高效力可引起安全問題，而較低效力可帶來療效考慮。理想地，效力測定將代表產物之作用機制 (亦即相關治療活性或預期生物效應)。根據美國食品藥物監督管理局 (Food and Drug Administration，FDA) 之「Guidance for Industry on Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products」，用於評價生物產物之效力的傳統方式係研發定量生物測定 (生物測定)，該生物測定測量與實現既定結果之特定能力相關的產物活性。生物測定可藉由在活生物系統內評估產物之活性成分來測量效力。生物測定可包括活體內動物研究、活體外器官、組織或細胞培養系統或該等測定之任何組合。用於測定或定量效力之生物測定的廣泛使用性實例為基於細胞之測定。評價兩種不同之基於細胞之測定 (經設計以具體而言測量帕妥珠單抗或曲妥珠單抗之細胞生長抑制，抗增殖測定) 控制帕妥珠單抗-曲妥珠單抗之固定劑量組合之生物活性的適宜性。此評價證實，該等測定並不適用於固定劑量組合，此乃因存在妨礙控制組合成複方製劑之個別抗體之產物品質之相關變化的限制。因結合至相同受體且抑制類似傳訊路徑之兩種抗體之複方製劑的性質，沒有替代 HER2-表現細胞系能夠克服該等限制。
對於結合至相同受體且作用於靶細胞中之類似傳訊路徑的曲妥珠單抗及帕妥珠單抗而言，藉由其與 HER2 上之各別表位之結合活性來調介對 HER2-表現靶細胞之下游傳訊、基因表現及增殖的效應。因此，可在結合層面上觀察抗體中影響其抑制 HER2-驅動性細胞生長之效力的潛在分子變化。已在對比研究中使用所選產物變異體 (電荷及大小變異體以及 CDR 親和突變體) 來評價此假設，如本文之實例中所展示。該研究證實，結合差異 (如藉由其中提供之結合測定所檢測) 反映了大部分所測試產物變異體 (大小變異體除外) 之所觀察抗增殖活性變化。考慮到抗增殖測定中之干擾及其中所提供結合測定檢測影響效力之單一抗體品質變化的能力，其中所提供之新結合測定可視為控制影響標靶結合及 HER2 傳訊之產物品質之相關變化的最佳可能測定。
在一實施例中，藉由特異性測量 HER2 與帕妥珠單抗或曲妥珠單抗之結合以測定效力的結合測定來測試帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 藥品。曲妥珠單抗及帕妥珠單抗皆靶向 HER2，但其結合至 HER2 細胞外域 (ECD) 上之不同且非重疊的表位：曲妥珠單抗識別次域 IV (近膜區)，而帕妥珠單抗識別次域 II (二聚化區) (Rocca A, Andreis D, Fedeli A 等人，,藥物動力學、藥物效力學及帕妥珠單抗在乳癌治療中的臨床療效.Expert Opin Drug Metab Toxicol 2015;11:1647-63.)。曲妥珠單抗與 HER2 次域 IV 之結合藉由阻斷其同源二聚合來抑制配體獨立性 HER2 傳訊 (Junttila TT, Akita RW, Parsons K 等人，Ligand-independent HER2/HER3/PI3K complex is disrupted by trastuzumab and is effectively inhibited by the PI3K inhibitor GDC-0941.Cancer Cell 2009;15:429-40.)，且防止其 ECD 之蛋白水解性裂解，由此阻止相關細胞內傳訊路徑之後續組成型活化Molina MA, Codony-Servat J, Albanell J 等人，Trastuzumab (Herceptin), a humanized anti-HER2 receptor monoclonal antibody, inhibits basal and activated HER2 ectodomain cleavage in breast cancer cells.Cancer Research 2001;61:4744-9)。因此，曲妥珠單抗抑制過度表現 HER2 之人類腫瘤細胞的增殖，如在活體外測定及動物中已展示。帕妥珠單抗與 HER2 次域 II 之結合會阻斷 HER2 與其他 HER 家族成員 (包括 EGFR、HER3 及 HER4) 的配體依賴性異源二聚合 (Franklin MC, Carey KD, Vajdos FF 等人，Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2 pertuzumab complex.Cancer Cell 2004;5:317-28；Adams CW, Allison DE, Flagella K 等人，Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab.Cancer Immunol Immunother 2006;55:717-27；Diermeier-Daucher S, Hasmann M, Brockhoff G. Flow cytometric FRET analysis of erbB receptor interaction on a cell by cell basis.Ann NY Acad Sci 2008;1130:280-6.)。因此，帕妥珠單抗抑制配體引發之細胞內傳訊，從而誘導過度表現 HER2 之人類腫瘤細胞的細胞生長停滯及細胞凋亡。
帕妥珠單抗及曲妥珠單抗在彼此不競爭之情形下結合至 HER2 ECD 上之該等不同及非重疊的表位，且其具有破壞 HER2 傳訊之互補機制。在組合投予帕妥珠單抗及曲妥珠單抗時，此會增大活體外及活體內抗增殖活性 (Scheuer W, Friess T, Burtscher H 等人，Strongly enhanced antitumor activity of trastuzumab and pertuzumab combination treatment on HER2-positive human xenograft tumor models.Cancer Res 2009;69:9330-6.)。在一實施例中，使用兩種不同 HER2 結合測定來確定 FDC 藥品之抗增殖活性及 HER2 傳訊，該等 HER2 結合測定可確保控制帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 藥品中之兩種抗體中之每一者的品質。
在一實施例中，提供用於兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 的結合測定，其包含
a. 使 FDC 與捕獲試劑接觸，其中捕獲試劑為經修飾 HER2 ECD。
b. 使樣品與可檢測抗體接觸。
c. 使用該可檢測抗體的檢測手段來定量與該捕獲試劑結合的抗體的量。
使兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合與捕獲試劑接觸並一起培育，從而捕獲試劑捕獲或結合至一種所關注抗 HER2 抗體以便其可檢測於檢測步驟中。捕獲試劑係包含一個或多個重組 HER2 ECD 次域之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 係包含一個或多個重組 HER2 ECD 次域之基因改造蛋白或肽。在一實施例中，修飾 HER2 ECD，從而 FDC 中之一種擬評價抗 HER2 抗體可發生結合，而 FDC 中之第二抗 HER2 抗體則不與其結合。此係藉由刪除第二抗 HER2 抗體所結合之 HER2 ECD 次域或藉由將該次域代替為不結合任一抗 HER2 抗體之在結構上緊密的次域來達成。結構類似之次域可為在包括於經修飾 HER2 ECD 中時不中斷經修飾 HER2 ECD 之三維構形的任何次域。結構類似之次域之實例係 EGFR、HER3 或 HER4 的相應次域。較佳的是，經修飾 HER2 ECD 具有儘可能接近地模擬天然 HER2 ECD 之三維構形。次域可為全長或在 N-末端或 C-末端縮短幾個胺基酸。本發明之發明者已發現，在使用一個或多個在 C-末端處縮短約 4 至 5 個胺基酸之重組 HER2 ECD 次域時，HER2 ECD 之三維結構的完整性得以保留或改良。
在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 融合至肽或蛋白質以有利於將捕獲試劑固定至固體受質。適宜肽或蛋白質之實例為生物素、牛類血清白蛋白 (BSA) 及 Fc 域。在一種經修飾 HER2 中，細胞外域融合至 Fc 域。在一實施例中，該 Fc 域係來自不同於擬分析抗 HER2 抗體之 Fc 域之物種的物種。舉例而言，若擬分析抗 HER2 抗體包含人類 Fc 域，則捕獲試劑應包含非人類 Fc 域，例如鼠類、豪豬、大鼠、兔等之 Fc 域。在一實施例中，重組 HER2 ECD 次域之 Fc 域為鼠類 Fc 域。在一實施例中，該 Fc 域包含 SEQ ID NO. 35。
在下一步驟中，使包含捕獲試劑及所捕獲抗 HER2 抗體之樣品與可檢測抗體一起培育。在與任一所關注結合抗 HER2 抗體接觸時，可檢測抗體結合至所關注抗體。在下一步驟中，使用一定檢測手段來檢測可檢測抗體上之標記且由此檢測存在於 FDC 中之所關注抗 HER2 抗體的存在或量。
在一實施例中，固定劑量組合包含與 HER2 細胞外次域 II 結合之抗體及與 HER2 細胞外次域 IV 結合之抗體。在一實施例中，結合至 HER2 細胞外次域 II 之抗體為帕妥珠單抗。在一實施例中，結合至 HER2 細胞外次域 IV 之抗體為曲妥珠單抗。在一實施例中，固定劑量組合包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗。在一實施例中，固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。在一此類實施例中，玻尿酸酶為重組人玻尿酸酶酶。在一較佳實施例中，該玻尿酸酶為 rHUPH20。以兩個不同劑量來提供帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 藥品，亦即負載劑量 (LD) 及維持劑量 (MD)。LD 及 MD 具有相同總蛋白質含量且區別在於帕妥珠單抗 SC 藥物物質與曲妥珠單抗 SC 藥物物質之比率。在一實施例中，使用結合測定來分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 之 LD。在一實施例中，使用結合測定來分析包含 40 mg/mL 曲妥珠單抗及 80 mg/mL 帕妥珠單抗之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC。在一實施例中，該帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 另外包含 2000 U/mL rHuPH20。在一實施例中，使用結合測定來分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 之 MD。在一實施例中，使用結合測定來分析包含 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 mg/mL 帕妥珠單抗之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC。在一實施例中，該帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 另外包含 2000 U/mL rHuPH20。
在一實施例中，在兩個單獨結合測定中測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之結合。
帕妥珠單抗結合測定將比生物活性確定為帕妥珠單抗特異性結合至重組 HER2 捕獲試劑之其表位的能力。在一實施例中，定量帕妥珠單抗之結合。在一此類實施例中，捕獲試劑包含 HER2 細胞外次域 II 或其部分。在一實施例中，捕獲試劑包含人類 HER2 細胞外次域 II。在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO.23 或 SEQ ID No: 2。
在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 包含 HER2 ECD 次域 I、II 及 III 或其部分。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 包含人類 HER2 ECD 次域 I、II 及 III 或其部分。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 不包含次域 IV。本發明者已發現，在包括已在 C-末端處截短之重組次域 III 時，可產生具有類似於天然 HER2 ECD 之三維構形的經修飾 HER2 ECD。在一此類實施例中，經修飾 HER2 ECD 包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 及 SEQ ID NO:34。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 包含 SEQ ID NO. 24。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 24 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。
在一實施例中，重組 HER2 細胞外次域 I、II、III 融合至 Fc 域。在一實施例中，該 Fc 域為鼠類、大鼠、兔或豪豬 Fc 域。 在上文任一實施例中，用於評價帕妥珠單抗結合之捕獲試劑不包含 HER2 次域 IV。在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26 或 SEQ ID NO: 27。 在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 25 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 26 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 27 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。
在一實施例中，定量曲妥珠單抗之結合。在一此類實施例中，捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外次域 IV 或其部分。在一此類實施例中，捕獲試劑包含人類重組 HER2 細胞外次域 IV。在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO.28 或 SEQ ID No: 4。
在一實施例中，捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外次域 I、III 及 IV。在一實施例中，捕獲試劑包含人類 HER2 細胞外次域 I、III 及 IV。在一實施例中，捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外次域 I、III 及 IV 以及 EGFR 之 次域 II。在一實施例中，捕獲試劑包含重組人類 HER2 細胞外次域 I、III 及 IV 以及 EGFR 之重組人類次域 II。 本發明者已發現，在包括重組 HER2 細胞外次域 I 及重組 HER2 細胞外次域 IV (其皆已在 C-末端處截短) 時，可產生具有類似於天然 HER2 ECD 之三維構形的經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，經修飾 ECD 包含 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID NO: 28。在一實施例中，經修飾 ECD 包含 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID NO: 28。
在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 包含 SEQ ID NO. 29。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 29 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。
在一實施例中，重組 HER2 細胞外次域 I、III 及 IV 以及 EGFR 之次域 II 融合至 Fc 域。在一實施例中，該 Fc 域為鼠類、大鼠、兔或豪豬 Fc 域。 在上文任一實施例中，用於評價曲妥珠單抗結合之捕獲試劑不包含 HER2 次域 II。在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31 或 SEQ ID NO: 32。 在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 30 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 31 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。在一實施例中，經修飾 HER2 ECD 與 SEQ ID NO. 32 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 之序列同一性。
在上文任一實施例中，可檢測抗體包含容許藉由各種手段對其進行檢測之標記。該等標記包括可直接檢測之部分，例如螢光染料、化學發光標記及放射性標記；以及必須進行反應或衍生化以檢測的部分，例如酶。該等標記之實例包括放射性同位素 32P、14C、125I、3H 及 131I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；釕；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶 (美國專利第 4,737,456 號)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；HRP；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶一起使用；生物素 (可藉由例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白-HRP 及鏈黴抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶與 MUG 進行檢測)；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基；及諸如此類。
可檢測抗體之較佳標記為辣根過氧化物酶 (HRP)。 通常用於 HRP 之受質分成不同類別，包括發色 (例如胺基乙基咔唑 (AEC)、3,3’-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽 (DAB)、氯萘酚與二胺基聯苯胺之組合 (CN/DAB)、四甲基聯苯胺 (TMB)、鄰-苯二胺二鹽酸鹽 (OPD)、2,2’-次偶氮基雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽 (ABTS))、螢光 (例如 ADHP) 及化學發光 (例如增強之化學發光 (ECL)) 受質，此取決於其分別產生彩色、螢光抑或發光之衍生物。較佳受質為 ABTS。
在一實施例中，可檢測抗體靶向人類 IgG 之 F(ab’)2 部分。在一實施例中，可檢測抗體靶向抗 HER2 抗體之 F(ab’)2 部分。
在一實施例中，結合測定為酶聯免疫吸附測定 (ELISA)。在 ELISA 中，捕獲試劑附接至固體受質。用於固定之固相可為基本上不溶於水且可用於免疫測定的任何惰性載體或載劑，包括例如呈表面、顆粒、多孔基質等形式的載體。常用載體之實例包括小片、SEPHADEX® 凝膠、聚氯乙烯、塑料珠及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及諸如此類製成的測定板或試管 (包括 96 孔微孔盤) 以及顆粒材料 (例如濾紙、瓊脂糖、交聯之聚葡萄醣及其他多醣)。或者，適於採用美國專利第 3,969,287 號、第 3,691,016 號、第 4,195,128 號、第 4,247,642 號、第 4,229,537 號及第 4,330,440 號中所描述之反應性水不溶性基質 (例如溴化氰活化之碳水化合物及反應性受質) 使捕獲試劑固定。在一較佳實施例中，將經固定捕獲試劑塗佈於微孔盤上，且特定而言所用較佳固相係可用於一次性分析若干樣品之多孔微孔盤。較佳微孔盤係對蛋白質具有高結合能力之具有高度帶電之聚苯乙烯表面的板，該表面對具有極性或親水性基團之分子具有高親和力。最佳者係 MICROTEST® 或 MAXISORP® 96 孔 ELISA 板，例如以 NUNC MAXISORB® 或 IMMULON® 出售者。
較佳的是，使用捕獲試劑將 96 孔板塗佈至少 30 分鐘、40 分鐘、50 分鐘、60 分鐘、約 20 至 80 分鐘或約 30 至 60 分鐘。較佳的是，使用捕獲試劑在約 4-20℃、更佳地約 2-8℃ 之溫度下塗佈 96 孔板。可在測定之前堆疊板並塗佈，且然後可針對若干樣品以手動、半自動或自動方式 (例如藉由使用機器人) 同時實施測定。
所採用捕獲試劑之量足夠大以得到良好訊號，但不應與樣品中之所關注抗體的最大預計含量相比莫耳過量。在一實施例中，塗佈試劑濃度為約 0.5 µg/mL- 5 µg/mL、較佳地約 1µg/mL -1.5 µg/mL。
然後通常將經塗布之板用封閉劑處理，該封閉劑非特異性結合至結合位點並使其飽和，以防止游離配體不必要地結合至板孔上的過量位點。用於此目的之適當阻斷劑的實例包括例如明膠、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白、酪蛋白及脫脂牛奶。阻斷處理通常在環境溫度條件下進行約 1-4 小時、約 1-3 小時、較佳地約 1-1.5 小時。
在塗佈及阻斷之後，將標準品或擬分析 FDC 樣品以標準稀釋液形式添加至經塗佈板中。在一實施例中，將遞增濃度之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC (標準品、產物對照及擬分析樣品) 添加至經塗佈板中。
選擇 FDC 樣品及經固定捕獲試劑之培育條件以最大化測定敏感性並最小化解離，且確保 FDC 樣品中之擬評價抗 HER2 抗體結合至經固定捕獲試劑。較佳的是，培育係在約 0℃ 至約 40℃ 範圍內之相當恆定的溫度下達成，較佳地在室溫下或約室溫下達成。孵育時間通常不超過約 10 小時。較佳的是，培育時間為在室溫下或約室溫下進行約 0.5 至 3 小時及更佳地約 1 至 1.5 小時以最大化 FDC 樣品中之擬評價抗 HER2 抗體與捕獲試劑的結合。
使結合有任何抗 HER2 抗體之經固定捕獲試劑與可檢測抗體較佳地在約 20-40℃ 之溫度下、更佳地在室溫下接觸，其中二者接觸之確切溫度及時間主要取決於所採用的檢測手段。
在另一實施例中，結合測定為電化學發光 (ECL)。
在一實施例中，使用結合測定來分析一種抗 HER2 抗體之效力。因此，在一實施例中， 結合測定另外包含以下步驟：
d. 使結合至捕獲試劑抗體之含量與該抗體的生物活性建立關聯。
在一實施例中，將針對樣品生成之劑量-反應曲線與標準品的劑量-反應曲線進行比較。在一實施例中，藉由單獨使結合測定中所獲得之結果與基於細胞之測定中經分離抗體之生物活性建立關聯來定量標準品的效力。
在一實施例中，對針對樣品及標準品所生成之非線性 4-參數劑量-反應曲線進行比較。在評價標準品劑量-反應曲線與樣品劑量-反應曲線之間的類似準則後，基於標準品劑量-反應曲線擬合與樣品劑量-反應曲線擬合之間之濃度位移且使用 4-參數平行線分析來計算樣品的相對效力。
在一實施例中，結合測定係用於分批釋放帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合。在一實施例中，結合測定係用於測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合的儲存期限。在一此類實施例中，使用上述實施例之結合測定在儲存期間的若干時間點下來分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC。
(ii)
電荷變異體之分析
在一實施例中，提供評估包含帕妥珠單抗、曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法，該方法包含評價組成物中之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之電荷變異體的量。在一實施例中，該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。在一實施例中，該方法為離子交換層析。離子交換層析 (IEX) 廣泛用於詳細表徵治療蛋白且可視為用於定性及定量評估電荷異質性之參考及強大的技術。離子交換高效液相層析 (IE-HPLC、IEC) 根據電荷異質性來分離溶液中之分子。藉由帶電溶質分子在固定於管柱堆積材料中之相反電荷的離子交換基團上的可逆吸附來進行分離。藉由兩個部分之間之離子型相互作用來驅動分子至固體載體的吸附。相互作用之強度取決於分子上及固定相上之電荷的數量及位置。IEX 通常係放流方法，其中特定地針對 mAb 設定關於每一酸性物質、主要物質及鹼性物質之分佈的規範。該等帶電物質可視為可影響效力之產物相關雜質。 此外，其係可在天然構象中表徵蛋白質之少數方法之一，原因在於不添加變性劑。IEX 亦可用作某些生物製劑之鑑別方法且係用於穩定性及儲存期限論證的常規測試。
分析具有極類似等電點之兩種抗 HER2 抗體 (如曲妥珠單抗及帕妥珠單抗) 之固定劑量組合之電荷變異體的分佈需要特定離子交換層析方案來適當地分離所有相關物質。
在一實施例中，提供評估包含帕妥珠單抗、曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法，該方法包含評價組成物中之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之電荷變異體的量。在一實施例中，該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。在一實施例中，該方法為離子交換層析。在一具體實施例中，該方法為陽離子交換層析。在陽離子交換層析中，如針對帕妥珠單抗/曲妥珠單抗固定-劑量組合 (FDC) 所應用，帶正電分子保留於帶負電固定相上。酸性物質以低於鹼性物質之滯留時間沖提出。
在管柱平衡及樣品施加之後，FDC 之抗 HER2 抗體帕妥珠單抗、曲妥珠單抗吸附至管柱配體上。然後洗滌管柱以去除未吸附蛋白質，且藉由改變移動相之離子強度來執行沖提，而同時將 pH 保持於預定義範圍內。在一實施例中，將 pH 保持於恆定值。
藉由施加遞增鹽濃度之梯度來改變離子強度，該梯度係分級梯度或連續梯度。本發明者發現，在分析兩種抗 HER2 抗體帕妥珠單抗、曲妥珠單抗之 FDC 的電荷變異體時，加載緩衝液 (移動相 A) 及沖提緩衝液 (移動相 B) 之 pH 範圍較為關鍵。使用加載緩衝液 (移動相 A) 之預定義 pH 範圍 pH 7.5 - 7.65 及沖提緩衝液 (移動相 B) 之預定義 pH 範圍 pH 7.5-7.7 來最佳地分離電荷變異體。 在一實施例中，將 pH 保持於恆定值。在一實施例中，加載緩衝液之該恆定 pH 值為 7.5、7.55、7.6 或 7.65。在一實施例中，沖提緩衝液之該恆定 pH 值為 7.5、7.55、7.6、7.65 或 7.7。
在沖提之後，然後使用加載緩衝液 (移動相 A) 再平衡管柱。
在一實施例中，使帕妥珠單抗-曲妥珠單抗固定劑量組合與陽離子交換材料接觸，且使用鹽梯度沖提電荷變異體及天然抗體，而同時將移動相之 pH 保持於預定義範圍內。在一實施例中，鹽梯度為連續鹽梯度。 在一實施例中，加載緩衝液 (移動相 A) 之移動相的 pH 介於 pH 7.5 與 pH 7.65 之間。在一實施例中，沖提緩衝液 (移動相 B) 之移動相的 pH 介於 pH 7.5 與 pH 7.7 之間。
在一實施例中，鹽梯度為氯化鈉梯度。在一實施例中，鹽梯度為氯化鈉梯度且沖提緩衝液 (移動相 B) 之移動相的 pH 介於 pH 7.5 與 pH 7.7 之間。
在一實施例中，提供評估包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法，該方法包含
a. 使用加載緩衝液使抗體結合至離子交換材料，其中加載緩衝液之 pH 介於約 pH 7.5 與約 pH 7.65 之間
b. 使用沖提緩衝液沖提抗體，其中沖提緩衝液之 pH 介於約 pH 7.5 與約 pH 7.7 之間
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b 之沖提。在一實施例中，該鹽梯度為連續鹽梯度。在一實施例中，鹽梯度為鈉 (Na+) 梯度。因此，在一實施例中，該沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉離子 (Na+)。在一實施例中，鈉梯度為氯化鈉 (NaCl) 梯度。在一實施例中，該沖提緩衝液包含 NaCl。用於加載緩衝液及沖提緩衝液之適宜緩衝液為 MES (2-乙磺酸)、ACES (N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸)、HEPES (4-(2-羥乙基)-1-六氫吡嗪乙磺酸)、磷酸鹽緩衝液、MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)、TAPS ([參(羥甲基)甲基胺基]丙磺酸)、CAPSO (N-環己基-2-羥基-3-胺基丙磺酸)、Tris (參(羥甲基)胺基甲烷)、PIPES (六氫吡嗪-N、N′-雙(2-乙磺酸))、TPP (Tris、磷酸鹽、六氫吡嗪)。較佳緩衝液為 ACES 及 HEPES。
在一實施例中，沖提緩衝液 (移動相 B) 之氯化鈉濃度為約 180-220 mM NaCl、約 200 mM NaCl、約 180 mM NaCl、約 190 mM NaCl、約 210 mM NaCl 或約 220 mM NaCl。
在一實施例中，該離子交換材料為陽離子交換材料。 在進一步最佳化本發明方法時，發明者發現，在使用強陽離子交換管柱材料時，電荷變異體之分離得以改良。在一較佳實施例中，使用具有磺酸基之無孔 SCX 管柱且使用 Na+ 作為沖提用相對離子來執行該方法。因此，在一實施例中，陽離子交換材料具有磺酸基。在一此類實施例中，陽離子交換材料為具有磺酸基之強陽離子交換劑 (SCX) 管柱且沖提緩衝液包含鈉。在一此類實施例中，沖提緩衝液包含鈉離子。在一實施例中，該 SCX 管柱無孔。可用於其中之較佳陽離子交換管柱如下：YMC Bio Pro SP-F 管柱、MabPac SCX-10、Waters BioResolve SCX mAb、Sepax Proteomix SCX-NP1.7 或無孔 Agilent Bio SCX。
在一實施例中，在 32℃ 至 40℃ 或約 36℃ 之溫度下執行上述方法之步驟 A 及 b。
在一實施例中，使用總蛋白質量為約 50 µg 至 149 µg 或約 51 µg 至 153 µg 之載量來執行離子交換層析。在一實施例中，使用總蛋白質量為約 50 µg 至 149 µg 負載劑量之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 的載量來執行離子交換層析。在一實施例中，使用總蛋白質量為約 51 µg 至 153 µg 維持劑量之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 的載量來執行離子交換層析。在一實施例中，加載於離子交換層析上之總蛋白質為約 100 µg。
在一實施例中，提供評估包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法，該方法包含：
a. 使用加載緩衝液使抗體結合至離子交換材料，其中加載緩衝液之 pH 介於約 pH 7.5 與約 pH 7.65 之間
b. 使用沖提緩衝液沖提抗體，其中沖提緩衝液之 pH 介於約 pH 7.5 與約 pH 7.7 之間
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，選擇性檢測固定劑量組合中之曲妥珠單抗及帕妥珠單抗的酸性變異體、天然形式及鹼性變異體。
在一實施例中，使用已在加載於層析管柱上之前使用羧肽酶 B 消解的帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合來執行離子交換層析。
在一實施例中，帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。在一此類實施例中，玻尿酸酶為重組人玻尿酸酶酶。在一實施例中，該玻尿酸酶為 rHuPH20。在一實施例中，該帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC 包含約 2000 U/mL rHuPH20。以兩個不同劑量來提供帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 藥品，亦即負載劑量 (LD) 及維持劑量 (MD)。LD 及 MD 具有相同總蛋白質含量且區別在於帕妥珠單抗 SC 藥物物質與曲妥珠單抗 SC 藥物物質之比率。在一實施例中，該方法可用於測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC 之負載劑量的電荷變異體。在一實施例中，同時、亦即在同一方法中測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之電荷變異體。在一實施例中，該方法可用於分析包含 40 mg/mL 曲妥珠單抗及 80 mg/mL 帕妥珠單抗之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 的電荷變異體。在一實施例中，該帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 另外包含 2000 U/mL rHuPH20。在一實施例中，該方法可用於測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC 之維持劑量的電荷變異體。在一實施例中，同時、亦即在同一方法中測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之電荷變異體。在一實施例中，該方法可用於分析包含 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 mg/mL 帕妥珠單抗之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 的電荷變異體。在一實施例中，該帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 另外包含 2000 U/mL rHuPH20。
在一實施例中，在 1–100% (溶劑 B) 鹽梯度中經至少 44 分鐘來沖提天然抗體以及其酸性及鹼性變異體。在一實施例中，鹽梯度經 43 分鐘自 1 % 溶劑 B 增至 47 % 溶劑 B。在一實施例中，鹽梯度自約 1.8 mM NaCl 增至 103.4 mM NaCl。在另一實施例中，鹽梯度自約 2 mM NaCl 增至約 94 mM NaCl。
在一實施例中，離子交換層析之移動相包含 ACES 緩衝液。在一實施例中，移動相 A 及移動相 B 包含 ACES 緩衝液。在一實施例中，離子交換層析溶劑 A 包含約 10-50 mM、約 15-25 mM、約 18- 22 mM 或約 20 mM ACES。在一實施例中，離子交換層析溶劑 B 包含約 10-50 mM、約 15-25 mM、約 18- 22 mM 或約 20 mM ACES 及約 180-220 mM NaCl。在一實施例中，溶劑 B 包含約 20 mM ACES。
(ii)
數量
/
蛋白質含量測定
UV 分光光度測定法係用於測定製劑樣品之總蛋白質含量的典型方法。然而，對於兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 而言，需要不同方式，此乃因習用方法不能單獨且定量地分析 FDC 中之每一抗 HER2 抗體的蛋白質含量。測試不同層析方法，例如疏水性相互作用層析 (HIC) 及反相層析 (RPC)。就單獨且定量地分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 之蛋白質含量而言，已證實反相層析係最適宜方法。
反相超高效液相層析 (RP-UHPLC、RPC) 根據疏水性來分離溶液中之分子。藉由分子在管柱中之非極性固定相上的可逆、疏水性吸附來進行分離。藉由兩個部分之間之疏水性/非極性相互作用來驅動分子至固體載體的吸附。相互作用之強度取決於分子及固定相上之官能基的數量及位置。在反相層析中，非極性分子以高於極性分子之滯留時間自固定相沖提出。因兩種抗 HER2 抗體曲妥珠單抗及帕妥珠單抗具有大於 93% 之序列同一性且僅相差總共 30 Da，故研發提供可靠之整體拆分及波峰分離且不具有顯著樣品殘留 (亦即，在後續分析中殘留不應超過 0.2 %) 的穩定方法。另外，經研發用於測試策略之含量測定考慮到，曲妥珠單抗-帕妥珠單抗固定劑量組合係以兩個不同劑量、亦即負載劑量及維持劑量來提供，該等劑量之區別在於帕妥珠單抗 SC 藥物物質與曲妥珠單抗 SC 藥物物質的比率。本發明者發現，基於苯基之管柱得到尤其溫度的結果，且穩定方法之最關鍵參數為管柱溫度及流速。基於苯基之 RP-UHPLC 管柱為業內所已知且可具有下列群組：具有甲基側基之乙基苯基及封端二氧化矽表面、具有延伸 (己基) 配體間隔體甲基側基之苯基己基相、具有空間保護性 (異丁基) 側基之乙基苯基配體、具有甲基側基之己基聯苯、具有甲基側基之聯苯相、具有甲基側基之氧活化苯基乙基苯基相。固定相經苯基 (例如單一苯基、聯苯、二苯基、苯基己基、苯基丙基) 修飾之 HPLC 管柱可易於自大部分主要管柱供應商獲得。可用於本文中之苯基管柱的一實例為 Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenly 管柱。在一實施例中，該管柱為 2.1 × 100 mm 管柱。
本文提供分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量的方法，其包含
a. 提供 RP-HPLC phenyl 管柱
b. 將該兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 裝載於 RP-HPLC 管柱上
c. 以 0.2 - 0.4 mL/min 的流速分離該兩種抗 HER2 抗體，其中管柱溫度為 64℃ 至 76℃。
RP-HPLC 分離原理係基於多肽溶質與層析樹脂表面上之疏水性配體之間的疏水性締合。RP-HPLC 管柱通常係 UHPLC 系統之一部分，該 UHPLC 系統配備有在線真空除氣器、具有樣品冷卻器之自動採樣儀、管柱加熱器及 UV/VIS 檢測器。適宜 UHPLC 系統之實例為 Waters Aquity 及 Thermo Ultimate 3000 RS。
藉由將樣品注入 RP-HPLC 系統中來將兩種抗 HER2 抗體之 FDC 加載於管柱上。通常，將樣品稀釋至例如大約 0.5 - 5 mg/mL 或 1 mg/mL 之濃度。本發明者發現，1.0 mg/mL 之樣品濃度使得能夠良好地檢測次要物質而不使檢測器訊號飽和。在一實施例中，使用製劑緩衝液稀釋樣品。在一實施例中，該製劑緩衝液包含 L-組胺酸、L-組胺酸鹽酸鹽單水合物、L-甲硫胺酸、α,α-海藻糖二水合物、蔗糖及聚山梨醇酯 20。藉由使用製劑緩衝液作為稀釋劑，因使用不同於先前之稀釋劑而改變樣品及參考溶液的風險不復存在。未觀察到製劑緩衝液到 RP-HPLC 方法之相關干擾。在一實施例中，注入體積為 0.5 - 100 µL、1- 50 µL、5 – 10 µL 或 10 µL。在一實施例中，注入體積為 10 µL。在一實施例中，管柱上之總蛋白質負荷為 10 µg。
蛋白質結合至水性移動相中之 RP-HPLC 管柱且藉由增加移動相之疏水性自管柱沖提出。然後根據疏水性來分離蛋白質。在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，使用水- 2-丙醇/乙腈梯度來達成步驟 c) 中之分離。在一此類實施例中，蛋白質結合至包含水:2-丙醇 (98:2) + 0.1 % 三氟乙酸 (TFA) 之水相 (沖提劑 A) 中之管柱且然後使用遞增濃度之包含乙腈的有機相沖提。在一此類實施例中，有機相 (沖提劑 B) 包含 2-丙醇:乙腈:沖提劑 A (70:20:10)。因基於苯基之管柱類型，故達成改良特異性且僅使用 2-丙醇檢測到新物質，但使用純乙腈則未檢測到。達成不同特異性，此乃因基於苯基之管柱經由經典疏水性相互作用亦及其他 π-π 相互作用與分析物相互作用。在文獻中已展示，純乙腈會阻礙該等相互作用、而 2-丙醇則不 (Yang, M., Fazio, S., Munch, D. & Drumm, P. Impact of methanol and acetonitrile on separations based on π–π interactions with a reversed-phase phenyl column.Journal of Chromatography A 1097, 124-129)。然而，考慮到 2-丙醇之高黏度及與其有關之增加的背壓，添加20 % 乙腈以降低系統中之背壓。
在一實施例中，水性移動相包含 70 % 沖提劑 A 及 30 % 沖提劑 B，其中沖提劑 A 包含水: 2-丙醇 (98:2) + 0.1 % 三氟乙酸 (TFA) 且沖提劑 B 包含 2-丙醇 :乙腈 :沖提劑 A (70:20:10)。在一此類實施例中，將有機相 (沖提劑 B) 增至 55 % 沖提劑 A 及 45 % 沖提劑 B。在一實施例中，梯度經 15 分鐘增至 45% 沖提劑 B。
在一實施例中，將有機相 (沖提劑 B) 增至 10 % 沖提劑 A 及 90 % 沖提劑 B。在一實施例中，梯度經 20 分鐘增至 90% 沖提劑 B。
測試 0.4 mL/min 及 0.2 mL/min 之流速且發現其對方法性能並無顯著影響。在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，步驟 c) 中之流速為約 0.3 mL/min。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，抗體係在 10 至 20 分鐘內分離。在一此類實施例中，抗體係在 15 分鐘內分離。在一實施例中，在 0.3 mL/min 之流速下經 15 分鐘來分離抗體。
除加載及沖提 (分離) 步驟外，RP-HPLC 純化亦可包括其他步驟，如平衡、洗滌及再生。在一實施例中，使用 70 % 沖提劑 A 及 30 % 沖提劑 B 平衡 RP-HPLC 苯基管柱，其中沖提劑 A 包含水: 2-丙醇 (98:2) + 0.1 % 三氟乙酸 (TFA) 且沖提劑 B 包含 2-丙醇 :乙腈 :沖提劑 A (70:20:10)。在一實施例中，使用 10 % 沖提劑 A 及 90% 移動相 B 洗滌 RP-HPLC 苯基管柱，其中沖提劑 A 包含水: 2-丙醇 (98:2) + 0.1 % 三氟乙酸 (TFA) 且沖提劑 B 包含 2-丙醇 :乙腈 :沖提劑 A (70:20:10)。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，管柱溫度為 70℃ +- 2℃。與室溫相比，70℃ 之管柱溫度可產生較高再現性，去除拖尾效應，展示較低系統背壓且整體而言產生較佳之拆分及分離。已測試若干管柱溫度，且 70℃ 展示改良之波峰型，而未達到系統及管柱類型所容許之最大溫度。分別測試 64℃ - 76℃ 及 66℃ - 74℃ 之溫度且發現其對方法性能並無顯著影響。
在分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法的一實施例中，苯基管柱為選自以下群組之管柱：Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl 管柱、Acclaim Phenyl-1 (Dionex)、Pursuit® XRs Diphenyl、Pinnacle® Biphenyl、Zorbax® Eclipse® Plus Hexyl Phenyl、Ascentis Phenyl、BioResolve RP mAb Polyphenyl 及 Agilent AdvanceBio RP mAb Diphenyl。在一實施例中，苯基管柱為 Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl管柱。在另一實施例中，基管柱為 BioResolve RP mAb Polyphenyl 管柱。
在一實施例中，藉由 UV 檢測蛋白質。在一實施例中，檢測波長為 280 nm。
在一實施例中，固定劑量組合包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗。在一實施例中，帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組合進一步包含玻尿酸酶。在一此類實施例中，玻尿酸酶為重組人玻尿酸酶酶。在一實施例中，該玻尿酸酶為 rHuPH20。在一實施例中，該帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC 包含約 2000 U/mL rHuPH20。以兩個不同劑量來提供帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 藥品，亦即負載劑量 (LD) 及維持劑量 (MD)。LD 及 MD 具有相同總蛋白質含量且區別在於帕妥珠單抗 SC 藥物物質與曲妥珠單抗 SC 藥物物質之比率。在一實施例中，該方法可用於測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC之負載劑量的蛋白質含量。在一實施例中，同時、亦即在相同方法中測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之蛋白質含量。在一實施例中，使用該方法來分析包含 40 mg/mL 曲妥珠單抗及 80 mg/mL 帕妥珠單抗之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 的蛋白質含量。在一實施例中，該帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 另外包含 2000 U/mL rHuPH20。在一實施例中，該方法可用於測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC之維持劑量的蛋白質含量。在一實施例中，同時、亦即在相同方法中測定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之蛋白質含量。在一實施例中，使用該方法來分析包含 60 mg/mL 曲妥珠單抗及60 mg/mL 帕妥珠單抗之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 的蛋白質含量。在一實施例中，該帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 另外包含 2000 U/mL rHuPH20。
III.
抗
HER2
抗體及組成物
(i)
抗
HER2
抗體
擬用於產生抗體之 HER2 抗原可為
例如含有期望表位之 HER2 受體之細胞外域或其一部分的可溶性形式。或者，可使用在細胞表面處表現 HER2 之細胞 (
例如經轉變以過度表現 HER2 之 NIH-3T3 細胞；或癌細胞系，例如 SK-BR-3 細胞，參見 Stancovski
等人， PNAS (USA)88:8691-8695 (1991)) 來生成抗體。可用於生成抗體之其他形式的 HER2 受體為熟習此項技術者所明瞭。
業內可利用製備本文之單株抗體的各種方法。舉例而言，單株抗體可使用首先由 Kohler
等人， Nature,256:495 (1975) 中描述的雜交瘤方法、藉由重組 DNA 方法 (美國專利第 4,816,567 號) 進行製備。
本發明所用之抗 HER2 抗體帕妥珠單抗及曲妥珠單抗市面有售。
美國專利第 6,949,245 描述結合 HER2 且阻斷 HER 受體之配體活化之實例性人類化 HER2 抗體的產生。
人類化 HER2 抗體具體而言包括曲妥珠單抗，如以引用方式明確併入本文中之美國專利 5,821,337 之表3中所描述且如本文所定義；及人類化 2C4 抗體，例如如本文所描述及定義之帕妥珠單抗。
本文之人類化抗體可例如包含納入人類可變重鏈域中的非人類超變區殘基，且可進一步在選自由 69H、71H 及 73H 組成之群組的位置處包含框架區 (FR) 取代，該等位置利用 Kabat
等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD (1991) 中所陳述之可變域編號系統。在一實施例中，人類化抗體在位置 69H、71H 及 73H 中之兩者或全部處包含 FR 取代。
本文所關注之實例性人類化抗體包含可變重鏈域互補決定殘基 GFTFTDYTMX (SEQ ID NO: 17)，其中 X 較佳係 D 或 S；DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO:18)；及/或 NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:19)，視情況包含該等 CDR 殘基之胺基酸修飾，
例如其中該等修飾基本上維持或改良抗體之親和力。舉例而言，用於本發明方法中之抗體變異體可在上述可變重鏈 CDR 序列中具有約一個至約七個或約五個胺基酸取代。可藉由親和力成熟來製備該等抗體變異體，
例如如下文所描述。
舉例而言，除前一段落中之彼等可變重鏈域 CDR 殘基外，人類化抗體亦可包含可變輕鏈域互補決定殘基 KASQDVSIGVA (SEQ ID NO:20)；SASYX
1X
2X
3，其中 X
1較佳係 R 或 L，X
2較佳係 Y 或 E，且 X
3較佳係 T 或 S (SEQ ID NO:21)；及/或 QQYYIYPYT (SEQ ID NO:22)。該等人類化抗體視情況包含上述 CDR 殘基之胺基酸修飾，
例如其中該等修飾基本上維持或改良抗體之親和力。舉例而言，所關注抗體變異體可在上述可變輕鏈 CDR 序列中具有約一個至約七個或約五個胺基酸取代。可藉由親和力成熟來製備該等抗體變異體，
例如如下文所描述。
本申請案亦考慮結合 HER2 之親和力成熟抗體。親代抗體可為人類抗體或人類化抗體，
例如分別包含 SEQ ID No. 7 及 8 之可變輕鏈序列及/或可變重鏈序列 (
亦即包含帕妥珠單抗之 VL 及/或 VH) 者。 帕妥珠單抗之親和力成熟變異體較佳地以優於鼠類 2C4 或帕妥珠單抗之親和力結合至 HER2 受體，
例如約兩倍或約四倍至約 100 倍或約 1000 倍改良之親和力，
例如如藉由 ELISA 評價。用於取代之實例性可變重鏈 CDR 殘基包括 H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99 或兩者或更多者 (
例如該等殘基中之二者、三者、四者、五者、六者或七者) 之組合。用於改變之實例可變輕鏈 CDR 殘基包括 L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97 或兩者或更多者 (
例如該等殘基中之二者至三者、四者、五者或最高約十者) 之組合。
在以下文獻中描述使鼠類 4D5 抗體人類化以生成其人類化變異體 (包括曲妥珠單抗)：美國專利第 5,821,337 號、第 6,054,297 號、第 6,407,213 號、第 6,639,055 號、第 6,719,971 號及第 6,800,738 號以及 Carter 等人，PNAS (USA), 89:4285-4289 (1992)。HuMAb4D5-8 (曲妥珠單抗) 以 3 倍於小鼠 4D5 抗體之緊密性結合 HER2 抗原，且具有二級免疫功能 (ADCC) 以容許人類化抗體在人類效應細胞存在下具有定向細胞毒性活性。HuMAb4D5-8 包含納入 V
Lκ子組 I 共有框架中之可變輕鏈 (V
L) CDR 殘基及納入 V
H子組 III 共有框架中之可變重鏈 (V
H) CDR 殘基。抗體進一步在 V
H之位置 71、73、78 及 93 (FR 殘基之 Kabat 編號) 處包含框架區 (FR) 取代；且在 V
L之位置 66 (FR 殘基之 Kabat 編號) 處包含 FR 取代。曲妥珠單抗包含非 A 異型人類 γ 1 Fc 區。
考慮各種形式之人類化抗體或親和力成熟抗體。舉例而言，人類化抗體或親和力成熟抗體可為抗體片段。或者，人類化抗體或親和力成熟抗體可為完整抗體，例如完整 IgG1 抗體。
(ii)
帕妥珠單抗組成物
在 HER2 抗體組成物之一實施例中，該組成物包含天然帕妥珠單抗抗體及一種或多種其變異體之混合物。本文中帕妥珠單抗天然抗體之較佳實施例係包含 SEQ ID No. 7 及 8 中之可變輕鏈胺基酸序列及可變重鏈胺基酸序列且最佳地包含 SEQ ID No. 11 之輕鏈胺基酸序列及 SEQ ID No. 12 的重鏈胺基酸序列者。在一實施例中，該組成物包含天然帕妥珠單抗抗體及包含胺基-末端前導延伸之其胺基酸序列變異體的混合物。較佳的是，胺基-末端前導延伸位於抗體變異體之輕鏈上 (
例如位於抗體變異體之一條或兩條輕鏈上)。主要種類 HER2 抗體或抗體變異體可為全長抗體或抗體片段 (
例如F(ab=)2 片段之 Fab)，但較佳地二者皆為全長抗體。本文之抗體變異體可在其重鏈或輕鏈中之任一者或多者上包含胺基-末端前導延伸。較佳的是，胺基-末端前導延伸位於抗體之一條或兩條輕鏈上。胺基-末端前導延伸較佳地包含 VHS- 或由其組成。可藉由各種分析技術來檢測組成物中之胺基-末端前導延伸的存在，包括但不限於 N-末端序列分析、電荷異質性測定 (例如陽離子交換層析或毛細管區帶電泳)、質譜等。組成物中之抗體變異體量通常介於構成用於檢測變異體之任何測定 (較佳地 N-末端序列分析) 之檢測限值之量至小於主要種類抗體之量 的量之間。通常，組成物中之約 20% 或更少 (
例如約 1% 至約15%，例如 5% 至約15%) 之抗體分子包含胺基-末端前導延伸。較佳地使用定量 N-末端序列分析或陽離子交換分析 (較佳地使用高拆分度、弱陽離子交換管柱，例如 PROPAC WCX‑10
TM陽離子交換管柱) 來測定該等百分比量。除胺基-末端前導延伸變異體外，亦考慮主要種類抗體及/或變異體之其他胺基酸序列改變，包括但不限於在一條或兩條重鏈上包含 C-末端離胺酸殘基之抗體、脫醯胺化抗體變異體等。
此外，主要種類抗體或變異體可進一步包含醣基化變化，其非限制性實例包括含有附接至 Fc 區之 G1 或 G2 寡醣結構的抗體、含有附接至輕鏈之碳水化合物部分 (
例如附接至抗體之一條或兩條輕鏈、例如附接至一個或多個離胺酸殘基的一或兩個碳水化合物部分，例如葡萄糖或半乳糖) 的抗體、含有一個或兩個非醣基化重鏈的抗體或含有附接至一條或兩條重鏈之唾液酸化寡醣的抗體等。
組成物可自經基因改造之細胞系 (
例如表現 HER2 抗體之中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞系) 回收，或可藉由肽合成製得。
關於實例性帕妥珠單抗組成物之更多資訊，參見美國專利第7,560,111 號及第 7,879,325 號以及 US 2009/0202546A1。
(iii)
曲妥珠單抗組成物
曲妥珠單抗組成物通常包含主要種類抗體 (分別包含 SEQ ID NO: 13 及 14 之輕鏈序列及重鏈序列) 及其變異體形式、尤其酸性變異體 (包括脫醯胺變異體) 之混合物。較佳的是，組成物中之該等酸性變異體的量小於約 25% 或小於約 20% 或小於約 15%。參見美國專利第 6,339,142 號。關於可藉由陽離子交換層析拆分之曲妥珠單抗形式，亦參見 Harris 等人，
J. Chromatography, B752:233-245 (2001)，該等形式包括波峰 A (在兩條輕鏈中 Asn30 脫醯胺至 Asp)；波峰 B (在一條重鏈中 Asn55 脫醯胺至 isoAsp)；波峰 1 (在一條輕鏈中 Asn30 脫醯胺至 Asp)；波峰 2 (在一條輕鏈中 Asn30 脫醯胺至 Asp 且在一條條重鏈中 Asp102 異構化至 isoAsp)；波峰 3 (主峰形式或主要種類抗體)；波峰 4 (在一條條重鏈中 Asp102 異構化至 isoAsp)；及波峰 C (在一條條重鏈中 Asp102 變為琥珀醯亞胺 (Asu))。
(iv)
固定劑量組合中之曲妥珠單抗
-
帕妥珠單抗組成物
本發明實例揭示對於發現於曲妥珠單抗-帕妥珠單抗固定劑量組合中之各種電荷變異體的廣泛研究。基於臨床經驗以及對生物活性/PK及安全性/免疫原性型態之假設影響來建立接受準則。本文所提供之組成物可視為具有安全生物藥劑所需之生物活性及 PK，且並不增加免疫原性及安全性之風險。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 16 % 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 12% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 38% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 16 % 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 9% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 21% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 23% 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 12% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，藉由離子交換層析分析包含帕妥珠單抗、曲妥珠單抗及其電荷變異體之組成物。在一實施例中，根據上文任一實施例使用離子交換層析來分析包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗以及其電荷變異體之組成物。在一實施例中，天然抗體及電荷變異體之百分比等於根據上文任一實施例藉由離子交換層析所測定的波峰面積，其中 (i) 在 HC-Asn-391 處脫醯胺之帕妥珠單抗變異體、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體、帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體、在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗及在 HC-Asn-55 處脫醯胺之曲妥珠單抗在波峰 1 至 3 中沖提出且由此組成物內之該等變異體之百分比等於波峰面積 1 至 3 之總和，(ii) 帕妥珠單抗天然抗體在波峰 4 中沖提出且由此組成物中之帕妥珠單抗天然抗體之百分比等於波峰 4 的波峰面積，(iii) 曲妥珠單抗天然抗體在波峰 7 中沖提出且由此組成物中之曲妥珠單抗天然抗體之百分比等於波峰 7 的波峰面積，(iv) 在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天門冬胺酸之曲妥珠單抗在波峰 8 中沖提出且由此組成物中之此變異體之百分比等於波峰 8 的波峰面積。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 28% 之波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 16 % 之波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 12% 之波峰 8 的波峰面積，如藉由上文任一實施例中所描述之方法所確定。在一方面，該方法包含以下步驟：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，評估上述包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物另外地包含 rHuPH20。
在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 23% 之波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 38% 之波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 16 % 之波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 9% 之波峰 8 的波峰面積，如藉由上文任一實施例中所描述之方法所確定。在一方面，該方法包含以下步驟：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，評估上述包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物另外地包含 rHuPH20。
在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 21% 之波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 28% 之波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 23 % 之波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 12% 之波峰 8 的波峰面積，如藉由上文任一實施例中所描述之方法所確定。在一方面，該方法包含以下步驟：
a. 使用加載緩衝液將該等抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間；
b. 以沖提緩衝液沖提抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
在一實施例中，離子交換材料為陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。在一實施例中，陽離子交換材料包含磺酸基。
在一實施例中，使用鹽梯度執行步驟 b。在一實施例中，沖提緩衝液包含鈉。在一實施例中，沖提緩衝液包含氯化鈉。
在一實施例中，評估上述包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之固定劑量組成物的方法進一步包含以下步驟：
c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
在一實施例中，該方法係在 32-40℃ 之溫度下執行。在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物另外地包含 rHuPH20。
在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 22% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 29.2% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 21.8 % 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 5% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 22% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 39.4% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 21.8 % 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 4.1% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，提供包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其中該組成物包含小於 19.8% 之選自 HC-Asn-391 脫醯胺化變異體、Fc 唾液酸變異體及離胺酸醣化變異體之酸性帕妥珠單抗變異體及在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗變異體以及在 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體、至少 29.2% 之帕妥珠單抗天然抗體、至少 31% 之曲妥珠單抗天然抗體及小於 5% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
在本發明之又一方面，可藉由包含下列步驟之方法獲得本文所提供之組成物：
a. 將預定量的帕妥珠單抗添加到調配器皿中
b. 以 1:1 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例或以 1:2 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例添加曲妥珠單抗
c. 添加 rHuPH20。
在一實施例中，1:1 曲妥珠單抗/帕妥珠單抗比可產生包含 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60mg/mL 帕妥珠單抗之組成物。在一實施例中，1:2 曲妥珠單抗/帕妥珠單抗比可產生包含 40 mg/mL 曲妥珠單抗及 80mg/mL 帕妥珠單抗之組成物。在一實施例中，將 rHuPH20 添加至組成物中以達成 2000 U/ml rHuPH20 之最終濃度。
IV.
重組
HER2
細胞外域
本發明者已發現，在包括已在 C-末端處截短之重組次域 III 時，可產生具有類似於天然 HER2 ECD 之三維構形之缺乏次域 IV 的經修飾 HER2 ECD。在一此類實施例中，經修飾 HER2 ECD 包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 及 SEQ ID NO: 34。在一實施例中，提供包含 SEQ ID NO. 24 之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 24 具有 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。
在一實施例中，重組 HER2 細胞外次域 I、II、III 融合至 Fc 域。在一實施例中，該 Fc 域為鼠類、大鼠、兔或豪豬 Fc 域。在一實施例中，提供包含 SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26 或 SEQ ID NO: 27 之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 25 具有 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 26 具有 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 27 具有 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。
在一實施例中，提供包含 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID NO: 4 之經修飾 ECD。在一實施例中，經修飾 ECD 包含 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID NO: 4。
本發明者已發現，在包括已在 C-末端處截短之重組次域 I 且使用 EGFR 次域 II 代替 HER2 ECD 次域 II時，可產生具有類似於天然 HER2 ECD 之三維構形之缺乏次域 II 的經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供包含 SEQ ID NO. 29 之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 29 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。
在一實施例中，重組 HER2 細胞外次域 I、III 及 IV 以及 EGFR 之次域 II 融合至 Fc 域。在一實施例中，該 Fc 域為鼠類、大鼠、兔或豪豬 Fc 域。在上文任一實施例中，用於評價曲妥珠單抗結合之捕獲試劑不包含 HER2 ECD 次域 II。在一實施例中，提供包含 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31 或 SEQ ID NO: 32 之重組 HER2 細胞外域。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 30 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 31 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。在一實施例中，提供與 SEQ ID NO. 32 具有至少 99%、98%、97%、96%、95% 或 90% 序列同一性之經修飾 HER2 ECD。
可藉由業內已知方法來產生及純化重組 HER2 細胞外域。在一實施例中，提供製備重組 HER2 細胞外域之方法，其中該方法包含在適於表現重組 HER2 細胞外域的條件下培養包含編碼重組 HER2 細胞外域的核酸的宿主細胞，且視情況自宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 回收該重組 HER2 細胞外域。在重組產生重組 HER2 細胞外域時，將編碼重組 HER2 細胞外域之核酸分離並插入一個或多個載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該等核酸可易於使用習用程序來分離及定序或藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。
用於選殖或表現編碼重組 HER2 細胞外域之載體的宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，可在細菌中產生重組 HER2 細胞外域。有關抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。在表現後，重組 HER2 細胞外域可與可溶性部分中的細菌細胞糊分離，並可進一步純化。
除原核生物外，真核微生物 (例如絲狀真菌或酵母) 亦係用於編碼重組 HER2 細胞外域之載體的適宜選殖或表現宿主。用於表現重組 HER2 細胞外域之適宜宿主細胞亦衍生自多細胞生物體 (無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。植物細胞培養物也可以用作宿主。脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞係。有用哺乳動物宿主細胞系的其他實例係由 SV40 (COS-7) 轉變的猴腎 CV 1 細胞系；人類胎腎細胞系 (如以下文獻中所描述之 293 或 293T 細胞，例如：Graham, F.L. 等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74)；幼倉鼠腎細胞 (BHK)；小鼠支持細胞 (如以下文獻中所描述之 TM4 細胞，例如 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人類子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK；水牛鼠肝細胞 (BRL 3A)；人類肺細胞 (W138)；人類肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如以下文獻中所描述：例如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl.Acad.Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，例如 Y0、NS0 及 Sp2/0。在一方面，宿主細胞為例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
V.
套組
本發明亦提供用於特異性定量固定劑量組合 (FDC) 中與 HER2 細胞外次域 II 結合之抗體之結合的套組，該固定劑量組合含有與 HER2 細胞外次域 II 結合之第一抗體及第二抗 HER2 抗體，該套組包含：
(a) 容器，其含有包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 及 SEQ ID NO: 34 之蛋白質作為捕獲試劑。
(b) 關於定量與 HER2 細胞外次域 II 結合之抗體之結合的說明。
在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 24。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 24 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。
在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26 或 SEQ ID NO: 27。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 25 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 26 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 27 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。
在一實施例中，該等說明另外包含關於使與 HER2 細胞外次域 II 結合之第一抗體之結合與其效力建立關聯的說明。
在一實施例中，第二抗體結合至與第一抗體不同之表位。在一實施例中，第二抗體係抗體結合至 HER2 細胞外次域 IV。
在一實施例中，第一抗體為帕妥珠單抗。在一實施例中，第二抗體為曲妥珠單抗。
在一實施例中，帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。在一此類實施例中，玻尿酸酶為重組人玻尿酸酶酶。在一實施例中，該玻尿酸酶為 rHuPH20。在一實施例中，該帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC 包含約 2000 U/mL rHuPH20。
本發明亦提供關於特異性定量固定劑量組合 (FDC) 中與 HER2 細胞外次域 IV 結合之抗體之結合的套組，該固定劑量組合含有與 HER2 細胞外次域 IV 結合之抗體及第二抗 HER2 抗體，該套組包含：
(a) 容器，其含有包含 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID NO: 4 之蛋白質作為捕獲試劑
(b) 關於定量與 HER2 細胞外次域 IV 結合之抗體之結合的說明。
在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 29。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 29 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。
在一實施例中，捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31 或 SEQ ID NO: 32。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 30 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 31 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。在一實施例中，捕獲試劑與 SEQ ID NO. 32 具有至少 99%、98%、97%、96%、95%或 90% 之序列同一性。
在一實施例中，該等說明另外包含關於使與 HER2 細胞外次域 IV 結合之抗體之結合與其效力建立關聯的說明。
在一實施例中，第二抗體結合至與第一抗體不同之表位。在一實施例中，第二抗體係抗體結合至 HER2 細胞外次域 II。
在一實施例中，第一抗體為曲妥珠單抗。在一實施例中，第二抗體為帕妥珠單抗。
在一實施例中，帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。在一此類實施例中，玻尿酸酶為重組人玻尿酸酶酶。在一實施例中，該玻尿酸酶為 rHuPH20。在一實施例中，該帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 FDC 包含約 2000 U/mL rHuPH20。
VI.
製造方法
在一實施例中，提供製備組成物之方法，其包含：(1) 生產固定劑量組成物，該固定劑量組成物包含帕妥珠單抗、曲妥珠單抗及其一個或多個變異體，及 (2) 使如此生產的該組成物進行分析測定以評估該 (等) 變異體的量，其中該 (等) 變異體包含：(i) 在 HC-Asn-391 處脫醯胺之帕妥珠單抗、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體、帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體、在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗、在 HC-Asn-55 處脫醯胺之曲妥珠單抗、(ii) 帕妥珠單抗天然抗體、(iii) 曲妥珠單抗天然抗體、(vi) 在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天門冬胺酸之曲妥珠單抗。
在一實施例中，變異體包含 (i) 小於 23% 之下列變異體：在 HC-Asn-391 處脫醯胺之帕妥珠單抗、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體及帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體、在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗、在 HC-Asn-55 處脫醯胺之曲妥珠單抗；(ii) 至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體；(iii) 至少 16% 之曲妥珠單抗天然抗體；(iv) 小於 12% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天門冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，變異體包含 (i) 小於 23% 之下列變異體：在 HC-Asn-391 處脫醯胺之帕妥珠單抗、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體、帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體、在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗、在 HC-Asn-55 處脫醯胺之曲妥珠單抗；(ii) 至少 38% 之帕妥珠單抗天然抗體；(iii) 至少 16% 之曲妥珠單抗天然抗體；(iv) 小於 9% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天門冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，變異體包含 (i) 小於 21% 之下列變異體：在 HC-Asn-391 處脫醯胺之帕妥珠單抗、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體及帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體、在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗、在 HC-Asn-55 處脫醯胺之曲妥珠單抗；(ii) 至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體；(iii) 至少 23% 之曲妥珠單抗天然抗體；(iv) 小於 12% 之在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天門冬胺酸的曲妥珠單抗。
在一實施例中，該分析型測定為離子交換層析。在一實施例中，該分析型測定為上文任一實施例之離子交換層析。在一實施例中，該等百分比等於藉由上文任一實施例之離子交換層析測得的波峰面積，其中 (i) 在 HC-Asn-391 處脫醯胺之帕妥珠單抗變異體、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體、帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體、在 LC-Asn-30 處脫醯胺之曲妥珠單抗及在 HC-Asn-55 處脫醯胺之曲妥珠單抗在波峰 1 至 3 中沖提出且由此組成物內之該等變異體之百分比等於波峰面積 1 至 3 之總和，(ii) 帕妥珠單抗天然抗體在波峰 4 中沖提出且由此組成物中之帕妥珠單抗天然抗體之百分比等於波峰 4 的波峰面積，(iii) 曲妥珠單抗天然抗體在波峰 7 中沖提出且由此組成物中之曲妥珠單抗天然抗體之百分比等於波峰 7 的波峰面積，(iv) 在一條重鏈處 HC-Asp-102 單異構化至異天門冬胺酸之曲妥珠單抗在波峰 8 中沖提出且由此組成物中之此變異體之百分比等於波峰 8 的波峰面積。
在一實施例中，在分析型測定中分析下列其他變異體之量：(v) 在重鏈及輕鏈上具有 N-末端 VHS 之帕妥珠單抗、在重鏈處具有 C-末端離胺酸之帕妥珠單抗、具有 HC-Asn-392 脫醯胺化之曲妥珠單抗、具有離胺酸醣化之曲妥珠單抗及 Fc 唾液酸含量有所增加之曲妥珠單抗。
在一實施例中，該分析型測定為離子交換層析。在一實施例中，該分析型測定為上文任一實施例之離子交換層析。在一實施例中，該等百分比等於藉由上文任一實施例之離子交換層析測得之波峰面積，其中 (vii) 在重鏈及輕鏈上具有 N-末端 VHS 之帕妥珠單抗、在重鏈處具有 C-末端離胺酸之帕妥珠單抗、具有 HC-Asn-392 脫醯胺化之曲妥珠單抗、具有離胺酸醣化之曲妥珠單抗及 Fc 唾液酸含量有所增加之曲妥珠單抗在波峰 5-6 中沖提出，由此組成物中之該等變異體之百分比等於波峰 5-6 的波峰面積。
在一實施例中，在分析型測定中分析下列其他變異體之量：(vi) 在一條重鏈處 HC Asp102 單異構化至琥珀醯亞胺之曲妥珠單抗及具有 Fc 氧化之曲妥珠單抗。
在一實施例中，該分析型測定為離子交換層析。在一實施例中，該分析型測定為上文任一實施例之離子交換層析。在一實施例中，該等百分比等於藉由上文任一實施例之離子交換層析測得之波峰面積，其中 (vi) 在一條重鏈處 HC Asp102 單異構化至琥珀醯亞胺之曲妥珠單抗及具有 Fc 氧化之曲妥珠單抗
在波峰 9-10 中沖提出。因此，組成物中之該等變異體之百分比等於波峰 9-10 的波峰面積。
在一實施例中，該方法係用於製備另外包含 rHuPH20 之組成物。在一實施例中，該組成物包含 2000 U/ml rHuPH20。在一實施例中，該方法係用於製備包含 40 - 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 – 80mg/mL 帕妥珠單抗之組成物。在一實施例中，該組成物包含 40 mg/mL 曲妥珠單抗及 80mg/mL 帕妥珠單抗。在一實施例中，該組成物包含 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60mg/mL 帕妥珠單抗。
在一實施例中，如上文所描述之製備方法的步驟 (1) 包含下列步驟：
a. 將預定量的帕妥珠單抗添加到調配器皿中
b. 以 1:1 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例或以 1:2 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例添加曲妥珠單抗
c. 添加 rHuPH20。
在一實施例中，1:1 曲妥珠單抗/帕妥珠單抗比可產生包含 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60mg/mL 帕妥珠單抗之組成物。在一實施例中，1:2 曲妥珠單抗/帕妥珠單抗比可產生包含 40 mg/mL 曲妥珠單抗及 80mg/mL 帕妥珠單抗之組成物。
在一實施例中，將 rHuPH20 添加至組成物中以達成 2000 U/ml rHuPH20 之最終濃度。
VII.
選擇用於療法之患者
HER2 表現或擴增之檢測可用於選擇用於本發明治療的患者。可利用若干 FDA-核準之商業測定來鑑別 HER2 陽性、HER2-表現、HER2-過度表現或 HER2-擴增之癌症患者。該等方法包括 HERCEPTEST
®(Dako) 及 PATHWAY
®HER2 (免疫組織化學 (IHC) 測定) 以及 PathVysion
®及 HER2 FISH pharmDx™ (FISH 測定)。關於每一測定之驗證及性能的資訊，使用者應參照具體測定套組之包裝插頁。
舉例而言，可藉由 IHC、
例如使用 HERCEPTEST
®(Dako) 來分析 HER2 表現或過度表現。來自腫瘤生檢之石蠟包埋之組織切片可經歷 IHC 測定且符合以下 HER2 蛋白染色強度準則：
分數 0：未觀察到染色或在小於 10% 之腫瘤細胞中觀察到膜染色。
分數 1+：在大於 10% 之腫瘤細胞中檢測到微弱/幾乎不可察覺的膜染色。僅細胞之膜部分發生染色。
分數 2+：在大於 10% 之腫瘤細胞中觀察到較弱至中等的完全膜染色。
分數 3+：在大於 10% 之腫瘤細胞中觀察到中等至較強的完全膜染色。
HER2 過度表現評價分數為 0 或 1+ 之彼等腫瘤可表徵為 HER2 陰性，而具有 2+ 或 3+ 分數之彼等腫瘤可表徵為 HER2 陽性。
可根據對應於每一細胞所表現之 HER2 分子拷貝數之免疫組織化學分數來對過度表現 HER2 的腫瘤進行評級，且可以生物化學方式進行確定：
0 = 0-10,000 個拷貝/細胞，
1+ =至少約 200,000 個拷貝/細胞，
2+ =至少約 500,000 個拷貝/細胞，
3+ =至少約 2,000,000 個拷貝/細胞。
3+ 等級下之 HER2 過度表現會引起酪胺酸激酶之配體獨立性活化 (Hudziak
等人，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84:7159-7163 (1987))，發生於大約 30% 之乳癌中，且在該等患者中，無復發存活及整體存活有所減弱 (Slamon
等人，
Science,244:707-712 (1989)；Slamon
等人，
Science,235:177-182 (1987))。
HER2 蛋白過度表現之存在與基因擴增高度相關，因此，替代地或另外，亦可採用用以檢測基因擴增之
原位雜交 (ISH) (例如螢光
原位雜交 (FISH)) 測定來選擇適於根據本發明進行治療的患者。可在福爾馬林 (formalin) 固定、石蠟包埋之腫瘤組織上實施 FISH 測定 (例如 INFORM™ (由 Ventana, Arizona 出售) 或 PathVysion
®(Vysis, Illinois)) 以確定腫瘤中的 HER2 擴增程度 (若存在)。
最通常地，使用存檔石蠟包埋性腫瘤組織且使用前述方法中之任一者來證實 HER2 陽性狀態。
較佳的是，選擇具有 2+ 或 3+ IHC 分數及/或為 FISH 或 ISH 陽性之 HER2 陽性患者進行本發明治療。具有 3+ IHC 分數及 FISH/ISH 陽性之患者尤其適用於本發明治療。
亦已鑑別出與 HER2-定向療法反應性有關之 HER2 突變。該等突變包括但不限於 HER2 外顯子 20 中之插入、HER2 胺基酸殘基 755-759 周圍之缺失、突變 G309A、G309E、S310F、D769H、D769Y、V777L、P780-Y781insGSP、V842I、R896C 中之任一者 (Bose 等人，Cancer Discov 2013；3:1-14) 以及 COSMIC 資料庫中發現於兩種或更多種獨特樣品中之先前已報導的相同非同義假定活化突變 (或插入缺失)。
關於篩選用於帕妥珠單抗療法之患者的替代測定及實例，亦參見美國專利第 7,981,418 號。
表
1
：序列
| 說明 | SEQ ID NO | 圖 |
| HER2 域 | 1 | 1 |
| HER2 域 II | 2 | 1 |
| HER2 域 III | 3 | 1 |
| HER2 域 IV | 4 | 1 |
| 2C4 可變輕鏈 | 5 | 2A |
| 2C4 可變重鏈 | 6 | 2B |
| 574/帕妥珠單抗可變輕鏈 | 7 | 2A |
| 574/帕妥珠單抗可變重鏈 | 8 | 2B |
| 人類 V L共有框架 | 9 | 2A |
| 人類 V H共有框架 | 10 | 2B |
| 帕妥珠單抗輕鏈 | 11 | 3A |
| 帕妥珠單抗重鏈 | 12 | 3B |
| 曲妥珠單抗輕鏈 | 13 | 4A |
| 曲妥珠單抗重鏈 | 14 | 4B |
| 變異帕妥珠單抗輕鏈 | 15 | 5A |
| 變異帕妥珠單抗重鏈 | 16 | 5B |
| GFTFTDYTMX | 17 | |
| DVNPNSGGSIYNQRFKG | 18 | |
| NLGPSFYFDY | 19 | |
| KASQDVSIGVA | 20 | |
| SASYX 1X 2X 3 | 21 | |
| QQYYIYPYT | 22 | |
| 重組 HER2 細胞外域 II | 23 | |
| 用於與 ECD 域 II 之結合抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 24 | |
| 用於與連結至 Fc 域之 ECD 域 II 結合之抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 25 | |
| 用於與連結至 Fc 域之 ECD 域 II 結合之抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 26 | |
| 用於與連結至 Fc 域之 ECD 域 II 結合之抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 27 | |
| 重組 HER2 細胞外域 IV | 28 | |
| 用於與 ECD 域 IV 之結合抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 29 | |
| 用於與連結至 Fc 域之 ECD 域 IV 結合之抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 30 | |
| 用於與連結至 Fc 域之 ECD 域 IV 結合之抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 31 | |
| 用於與連結至 Fc 域之 ECD 域 IV 結合之抗 HER2 抗體的捕獲劑 | 32 | |
| 重組 HER2 細胞外域 I | 33 | |
| 重組 HER2 細胞外域 III | 34 | |
| 鼠類 Fc 域 | 35 | |
| EGFR ECD 次域 II | 36 |
表
2 -
術語之縮寫及定義的列表
| 縮寫 | 定義 |
| ABTS | 2,2'-次偶氮基雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽 |
| ACES | N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸 |
| BSA | 牛血清白蛋白 |
| CDR | 互補決定區 |
| CoA | 分析證書 |
| CpB | 羧基肽酶 B |
| DPBS | 達爾伯克氏磷酸鹽緩衝生理鹽水 (Dulbecco's phosphate-buffered saline) |
| EC 50 | 半數最大有效濃度 |
| ECD | 細胞外域 |
| EGFR | 表皮生長因子受體 |
| ELISA | 酵素連結免疫分析法 |
| FDC | 固定劑量組合 |
| FDC 藥品 | 用於皮下注射之帕妥珠單抗-曲妥珠單抗固定劑量組合藥品 |
| HER | 人類表皮生長因子受體 |
| HER2 | 人類表皮生長因子受體 2 |
| HPLC | 高效液相層析 |
| HRP | 辣根過氧化物酶 |
| HSR | 希爾斜率 (Hill slope) 比 |
| IE-HPLC | 離子交換高效液相層析 |
| IgG | 免疫球蛋白 G |
| iv | 用於靜脈內注射 |
| LAD | 下漸近線偏差 |
| LC-MS | 液相層析-質譜 |
| LD | 加載劑量 |
| mAB | 單株抗體 |
| MD | 維持劑量 |
| NA | 不適用 |
| OD | 光學密度 |
| rHuPH20 | 重組人類玻尿酸酶 |
| RP-UHPLC | 反相超高效液相層析 |
| R 2 | 測定係數 |
| SC | 皮下 |
| U | 單位 |
| UAD | 上漸近線偏差 |
| UV | 紫外光 |
| WFI | 注射用水 |
實例
1:
帕妥珠單抗
-
曲妥珠單抗
FDC
帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 (FDC 藥品 LD 及 MD 之兩種活性成分) 係針對 HER2 細胞外域之 IgG1 子類的重組人類化單株抗體。rHuPH20 (FDC 藥品之第三活性成分) 係用作局部滲透增強劑以容許經皮下遞送在傳統上經靜脈內遞送之治療劑的瞬時活性酶 (重組人類玻尿酸酶)。
FDC 藥品提供為用於皮下注射之無菌、無色至淺微褐色溶液。其不含防腐劑。存在如下文所描述之兩種製劑：
加載劑量：
FDC
藥品
LD
在標靶 pH 5.5 下，每一 20 mL 單劑量小瓶含有 1200 mg (標稱) 帕妥珠單抗、600 mg (標稱) 曲妥珠單抗及 2000 U/mL 玻尿酸酶 (rHuPH20，福玻尿酸酶 α)。藥品調配為 80 mg/mL 帕妥珠單抗及 40 mg/mL 曲妥珠單抗。製劑中所使用之賦形劑為 L-組胺酸、L-組胺酸鹽酸鹽單水合物、L-甲硫胺酸、α,α-海藻糖二水合物、蔗糖及聚山梨醇酯 20。
維持劑量：
FDC
藥品
MD
在標靶 pH 5.5 下，每一 15 mL 單劑量小瓶含有 600 mg (標稱) 帕妥珠單抗、600 mg (標稱) 曲妥珠單抗及 2000 U/mL 玻尿酸酶 (rHuPH20，福玻尿酸酶 α)。藥品調配為 60 mg/mL 帕妥珠單抗及 60 mg/mL 曲妥珠單抗。製劑中所使用之賦形劑為 L-組胺酸、L-組胺酸鹽酸鹽單水合物、L-甲硫胺酸、α,α-海藻糖二水合物、蔗糖及聚山梨醇酯 20。
實例
2:
藉由基於細胞之測定測得之帕妥珠單抗
_
曲妥珠單抗
FDC
的效力
此方法確定帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之效力，該效力量度其分別抑制 MDA-MB-175-VII 或 BT-474 細胞之增殖的能力。在典型測定中，向 96 孔微孔盤接種 MDA-MB-175-VII 細胞或 BT-474 細胞並在 37℃ 及 5% 二氧化碳下於加濕培育器中一起培育過夜。在培育之後，去除培養基，且將不同濃度之參考標準品、測定對照及樣品添加至板中。然後將板培育 3 天，且使用氧化還原染料 alamarBlue 間接定量活細胞之相對數量。
使用 530 nm 下激發及 590 nm 下發射測量螢光。
alamarBlue 染料在其氧化態下為藍色及非螢光的，但其由細胞之細胞內環境還原至具有高度螢光性的粉紅色形式。色彩及螢光之變化與活細胞數成正比。將結果 (以 RFU 形式表示) 針對抗體濃度繪圖，且使用平行線分析程式來估計 FDC 樣品相對於參考標準品之抗增殖活性。
基於細胞之測定對 FDC 藥品中之一種抗體或另一抗體選擇性敏感，但不對兩種抗體皆敏感，如圖 7 A 及 B 中所展示。在個別地分析時，曲妥珠單抗對 BT-474 具有抗增殖活性，但對 MDA-MD-175 VII 細胞並無抗增殖活性；而帕妥珠單抗對 MDA-MB-175 VII 具有抗增殖活性，但其對 BT-474 細胞之活性強烈移位至較高濃度。兩種細胞系之敏感性差異可能基於不同 HER2 表現程度 (BT-474 及 MDA-MB-175 VII 分別為高表現及中等表現)，而非基於 HER2 親和力之差異。另外，HER3-表現程度及涉及整體抗增殖活性之其他潛在參數 (例如 HER3 內源性配體調節蛋白之存在或不存在) 可造成敏感性差異。另外，在藥物物質之基於細胞之測定中，一種抗體之存在會影響另一者的反應，從而遮蔽發生於一種抗體或另一抗體中之潛在品質變化。帕妥珠單抗及曲妥珠單抗具有互補之破壞 HER2 傳訊的作用機制，從而在二者皆存在時產生較高抗增殖活性 (圖 8 A 及 B)。儘管僅曲妥珠單抗不能在帕妥珠單抗抗增殖測定中抑制 MDA-MB-175 VII 細胞之增殖 (圖 7 A 及 B)，但將其添加至帕妥珠單抗中會使曲妥珠單抗劑量-反應曲線移位至較低 EC50 值，此反映了在組合曲妥珠單抗及帕妥珠單抗時之較高效力 (圖 8 A)。因此，在 MDA-MB-175 VII 抗增殖測定中，未檢測到 FDC 藥品中之帕妥珠單抗的輕微品質變化。在 BT-474 抗增殖測定中，針對帕妥珠單抗獲得類似觀察，但較不明顯 (圖 8 B)。另外，抗體沿相對方向之輕微品質變化可產生 100% 效力。
為證實在抗增殖測定中未檢測到 FDC 藥品中之任一抗體的實質性品質變化，在帕妥珠單抗及曲妥珠單抗抗增殖測定中測試在 CDR 中具有定向變化的帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 HER2 親和突變體 (分別為 HC S55A 及 LC H91A 突變) (圖 9 A 及 B)。突變體對 HER2 之親和力大大減小與其在各別基於細胞之測定中的抗增殖活性有所減小相關。將帕妥珠單抗添加至曲妥珠單抗突變體中 (或將曲妥珠單抗添加至帕妥珠單抗突變體中) 可部分地恢復劑量-反應曲線形狀且由此恢復抗增殖活性。
總而言之，基於選擇性敏感性、互補機制及抗增殖測定中所觀察之遮蔽效應，可認為該等測定不適於檢測複方製劑中之任一抗體的相關活性變化。該等限制使得抗增殖測定不能用於確定及控制 FDC 藥品之生物活性。因此，已設計不受該等交叉干擾影響之兩種選擇性效力 ELISA 來控制 FDC 藥品中之兩種抗體之結合活性的相關變化。藉由使用 HER2 受體之不同結合表位作為主要結合標靶來確保 ELISA 選擇性。
實例
3:
藉由
ELISA
測得之
FDC
中之帕妥珠單抗的效力
使用兩個單獨 ELISA 來控制 FDC 藥品之效力。此處，對控制 FDC 藥品之帕妥珠單抗組分之生物活性的 ELISA 進行描述。
帕妥珠單抗係針對 HER2、具體而言針對 HER2 之細胞外次域 II 的單株 IgG1 抗體。在結合時，帕妥珠單抗藉由防止 HER2 與 HER 受體家族之配體活化成員發生異源二聚合來阻斷 HER2 活化。此會抑制 HER2-過度表現細胞之下游傳訊路徑。
帕妥珠單抗 ELISA 將比生物活性確定為帕妥珠單抗特異性結合重組 HER2 之其表位 (亦即次域 II) 的能力。圖 6 繪示用於帕妥珠單抗 ELISA 及曲妥珠單抗 ELISA 之捕獲試劑的示意圖 (細節可參見實例 6)。
使用與過氧化物酶結合之二級抗體來測量結合。針對樣品及標準品所生成之劑量反應曲線提供了定量基礎。對於 ELISA 而言，在稀釋液製備中考慮帕妥珠單抗之實際蛋白質含量 (而非 FDC 藥品之總實際蛋白質含量)。將帕妥珠單抗 ELISA 用於 FDC 藥品 LD 及 MD 二者。
設備及材料
96 孔免疫板 (例如 Maxisorp ELISA)
吸光度讀板儀
具有 4-參數資料縮減軟體及平行性分析軟體 (例如 SoftMaxPro) 之電腦
微量板洗滌器
試劑
帕妥珠單抗塗佈試劑：融合至鼠類 Fc 之重組 HER2 細胞外域 I、II、III；不含域 IV (含有曲妥珠單抗表位) (SEQ ID NO: 27)。
檢測抗體：HRP-結合之山羊抗人類抗體 (對人類 IgG 之 F(ab’)2 部分具有特異性) (例如 Jackson ImmunoResearch)
1X DPBS，不含鈣及鎂
純化水，例如 Milli-Q。
BSA 第五組分
Tween 20
ABTS 受質溶液
濃磷酸 (85%)
溶液
註：配方係針對標稱量之試劑且可根據測定需求按比例調節。
洗滌緩衝液：1X DPBS、0.05% Tween 20
測定稀釋劑：1X DPBS、0.05% Tween 20、0.5% BSA 第五組分
塗佈溶液：於 1X DPBS 中之帕妥珠單抗塗佈試劑 (1 µg/mL)
檢測抗體：0.8 mg/mL HRP-結合之山羊抗人類抗體
檢測溶液：藉由將檢測抗體 (0.8 mg/mL) 在測定稀釋劑中稀釋至濃度為 16 ng/mL 來製備檢測溶液。在使用之前新製。
終止溶液：1 M 磷酸
參考標準品FDC MD 參考標準品
塗佈板
–將 100 µL 塗佈溶液轉移至微孔盤之每一孔中。
–將經塗佈板在 2℃-8℃ 下培育 30-60 分鐘。
阻斷板
–藉由使用 300 µL/孔之洗滌緩衝液將所有經塗佈板洗滌三次來去除過量塗佈溶液。
–藉由將 100 µL 測定稀釋劑添加至每一孔中來阻斷所有板。
–將板在環境溫度及輕微振盪下培育 60-90 分鐘。
–使用 300 µL/孔之洗滌緩衝液將經阻斷板洗滌三次。
樣品轉移
–將 100 µL/孔之 FDC 參考標準品、產物對照及樣品之稀釋液轉移至免疫板的孔中。
–將板在環境溫度及輕微振盪下培育 60-90 分鐘。
檢測
–將 100 µL 檢測溶液 (16 ng/mL) 轉移至板之每一孔中。
–將板在環境溫度及輕微振盪下培育 30-90 分鐘。
–使用 300 µL/孔之洗滌緩衝液將板洗滌三次。
受質轉移及測量
–將 100 µL/孔之 ABTS 受質溶液轉移至板之每一孔中。
–將板在環境溫度及輕微振盪下培育 20-35 分鐘。
–為終止反應，將 100 µL/孔之終止溶液轉移至板之每一孔中。
–藉由輕輕攪動至少 1 分鐘來混合板。
–在 30 分鐘內，在吸光度讀板儀上於 405 nm 波長下 (參考波長為 490 nm) 來測量 OD 值。
評估
–如下所述來計算每一孔之 OD 值：OD (405 nm) - OD (490 nm)
其中：OD (405 nm)：405 nm 下之檢測吸光度，OD (490 nm)：490 nm 下之參考吸光度
–對平行測定之 OD 值取平均值以測定平均 OD。
–藉由將平均 OD (y) 針對帕妥珠單抗抗體濃度 (以 ng/mL 表示) (x) 繪圖來生成標準品、產物對照及樣品的劑量-反應曲線。
–使用下列 4-參數方程式來應用非線性回歸：
其中：
A：下漸近線
B：希爾斜率
C：EC50 值
D：下漸近線
–計算標準品曲線、產物對照曲線及樣品曲線之
R
2 。
–如下所述來計算標準 Δ OD：
標準 Δ OD = (標準品之平均最大 OD) - (標準品之平均最小 OD)
–如下所述來測定最大 OD：
最大 OD 值係在 405 nm 下於劑量-反應曲線之所有平行測定內所獲得的最大 OD 值。
效力計算
–使用 4-參數平行線分析來計算標準品曲線及樣品 (或產物對照) 曲線之一組公共希爾斜率、下漸近線及下漸近線。
–標準品及樣品 (或產物對照) 之所得曲線方程式為：
其中：
A = 公共下漸近線
B = 公共希爾斜率
C標準=標準 EC50 值
D = 公共下漸近線
ρ = 樣品及產物對照相對於參考標準品之效力
–如下所述來計算相對效力：
相對效力= ρ × 參考標準之活性
參考標準效力指派
FDC 藥品之帕妥珠單抗效力係基於帕妥珠單抗蛋白質含量而非FDC 藥品的總蛋白質含量。因此，所測效力與 FDC 藥品中之兩種分子的比率無關，且可使用一種單分子參考標準品來測定 FDC 藥品 MD 及 LD 樣品之效力。選擇 FDC MD 參考標準品作為效力參考標準品。
FDC MD 參考標準品之效力指派的細節提供於下文中：
-將效力設定至 1.00 × 10
4U/mg。
-藉由 ELISA 相對於商業帕妥珠單抗 IV 參考標準品 anti2C4907-2 來測定帕妥珠單抗效力。
-藉由 ELISA 相對於商業曲妥珠單抗 SC 參考標準品 G005.03EP1 來測定曲妥珠單抗效力。
結果：在帕妥珠單抗 ELISA 測定中分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗固定劑量組合中之帕妥珠單抗的結合。代表性劑量-反應曲線繪示於圖 10 中。
實例
4:
帕妥珠單抗
ELISA
之特異性
為評價實例 3 之帕妥珠單抗 ELISA 的特異性，一式兩份在單一板上於最高測定濃度下來測試製劑緩衝液及結構相關之分子。倘若觀察到結構相關之分子的干擾 (平行測定之平均值三倍於參考標準品劑量-反應曲線的下漸近線平均值)，則擴展至全劑量-反應曲線且確定一個可報告結果 (n = 1)。
該等結果證實，帕妥珠單抗 ELISA 對帕妥珠單抗具有特異性：
含 rHuPH20 FDC LD 及 MD 製劑緩衝液皆展示不干擾測定，從而證實該測定適於分析調配 於該等基質中之 FDC 藥品樣品。
結構相關之分子 (包括曲妥珠單抗，帕妥珠單抗除外，參見下文)並不干擾帕妥珠單抗 ELISA。此可藉由以下結果來展示：平行測定之平均 OD 值低於參考標準品劑量-反應曲線的下漸近線 OD 平均值三倍。
如所預計，調配於 FDC 藥品製劑中之帕妥珠單抗 SC 藥物物質及 IV 帕妥珠單抗展示帕妥珠單抗 ELISA 干擾，此乃因其結合至同一 HER2 域 II。
結果顯示於表 3 中。
表
3
：帕妥珠單抗之
ELISA
特異性
| 樣品 名稱/說明 | 可檢測反應 | 相對效力 (%) | 平行測定之 OD 平均值 |
| IV 帕妥珠單抗 | 是 | 92 | NA |
| SC 帕妥珠單抗 | 是 | 93 | NA |
| IV 曲妥珠單抗 | 否 | NA | NA |
| SC 曲妥珠單抗 | 否 | NA | NA |
| 曲妥珠單抗-艾坦辛 | 否 | NA | NA |
| 含 rHuPH20 FDC LD 調配緩衝液 | 否 | NA | 0.07 |
| 含 rHuPH20 FDC MD 調配緩衝液 | 否 | NA | 0.07 |
| 依泊汀β | 否 | NA | 0.07 |
| 聚乙二醇干擾素 α-2a | 否 | NA | 0.07 |
| 干擾素 α-2a | 否 | NA | 0.07 |
| 甲氧基聚乙二醇-依泊汀β | 否 | NA | 0.08 |
| 阿特柔珠單抗 | 否 | NA | 0.07 |
| 奧瑞組單抗 (Ocrelizumab) | 否 | NA | 0.07 |
| IV 利妥昔單抗 (Rituximab IV) | 否 | NA | 0.09 |
| 貝伐珠單抗 (Bevacizumab) | 否 | NA | 0.07 |
| SC 托珠單抗 (Tocilizumab SC) | 否 | NA | 0.07 |
| 艾羅珠單抗 (Etrolizumab) | 否 | NA | 0.07 |
| 艾美賽珠單抗 (Etrolizumab) | 否 | NA | 0.07 |
| 福玻尿酸酶 α (Vorhyaluronidase Alfa) | 否 | NA | 0.07 |
| 萊布基珠單抗 (Lebrikizumab) | 否 | NA | 0.07 |
| 薩拉麗珠單抗 (Satralizumab) | 否 | NA | 0.07 |
| PEG-非格司亭 | 否 | NA | 0.07 |
| 非格司亭 (Filgrastim) | 否 | NA | 0.08 |
| 泊拉妥珠單抗 (Polatuzumab) | 否 | NA | 0.07 |
| 參考標準品劑量-反應曲線之下漸近線平均值 | NA | NA | 0.08 |
| 3 × 參考標準品最低值 | NA | NA | 0.23 |
實例
5:
帕妥珠單抗
ELISA
之穩健性
藉由作為實踐中之潛在變化源之測定參數之特意變化 來評價帕妥珠單抗 ELISA 的穩健性。藉由比較所獲得劑量-反應曲線參數、系統適宜性及類似性準則與方法程序條件來評估穩健性結果。整體穩健性結果匯總於表 4 中。
表 4 ：帕妥珠單抗 ELISA 之穩健性結果。
| 穩定性參數 | 測試條件 | 結果 | |
| 塗佈試劑 濃度 | 0.5,1,1.5μg/mL | 該測定耐受介於 1-1.5 μg/mL 之間的塗佈試劑濃度 | 10 |
| 塗佈培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 30-60 分鐘之間的塗佈培育時間 | |
| 阻斷培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 60-90 分鐘之間的阻斷培育時間 | |
| FDC 藥品培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 60-90 分鐘之間的 FDC 藥品培育時間 | 15 |
| 檢測抗體批次 | 3 批 | 該測定耐受源自 Jackson ImmunoResearch 之不同檢測抗體批次的使用 | |
| 檢測抗體培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 30-90 分鐘之間的檢測抗體培育時間 | |
| 受質培育時間 | 20、30、40 分鐘 | 該測定耐受介於 20-35 分鐘之間的受質培育時間 | 20 |
| 不同讀數儀之使用 | SpectraMax M5,i3x | 該測定耐受兩種分子裝置 SpectraMax M5 及 i3x 之使用 |
實例
6:
藉由
ELISA
測得之
FDC
中之曲妥珠單抗的效力
使用兩個類似 ELISA 來控制 FDC 藥品之效力。此章節描述 FDC 藥品之曲妥珠單抗組分之生物活性的 ELISA 控制。
曲妥珠單抗係針對 HER2、具體而言針對 HER2 之細胞外次域 IV的單株 IgG1 抗體。在結合時，曲妥珠單抗藉由防止 HER2 同源二聚合且使 HER2 細胞外域脫落來阻斷 HER2 活化。
此會抑制 HER2-過度表現細胞之下游傳訊路徑。
曲妥珠單抗 ELISA 將比生物活性確定為曲妥珠單抗特異性結合重組 HER2 之其表位 (亦即次域 IV) 的能力。圖 6 繪示用於曲妥珠單抗 ELISA 之捕獲試劑的示意圖。
使用與過氧化物酶結合之二級抗體來測量結合。針對樣品及標準品生成之劑量-反應曲線提供了定量基礎。對於 ELISA 而言，在稀釋液製備中考慮曲妥珠單抗之實際蛋白質含量 (而非 FDC 藥品之總實際蛋白質含量)。將曲妥珠單抗 ELISA 用於 FDC 藥品 LD 及 MD 二者。
試劑、緩衝液及程序係如實例 3 中所概述，塗佈試劑及塗佈溶液除外：
曲妥珠單抗塗佈試劑：融合至鼠類 Fc 之重組 HER2 細胞外域 I、III、IV；域 II 由 EGFR 中不能結合帕妥珠單抗之結構相關之域 II (SEQ ID NO: 32) 代替。
塗佈溶液：於 1X DPBS 中之曲妥珠單抗塗佈試劑 (1 µg/mL)
評估
–如下所述來計算每一孔之 OD 值：OD (405 nm) - OD (490 nm)
其中：OD (405 nm)：405 nm 下之檢測吸光度，OD (490 nm)：490 nm 下之參考吸光度
–對平行測定之 OD 值取平均值以測定平均 OD。
–藉由將平均 OD (y) 針對曲妥珠單抗抗體濃度 (以 ng/mL 表示) (x) 繪圖來生成標準品、產物對照及樣品的劑量-反應曲線。
–使用下列 4-參數方程式來應用非線性回歸：
其中：
A：下漸近線
B: 希爾斜率
C：EC50 值
D：下漸近線
–計算標準品曲線、產物對照曲線及樣品曲線之
R
2 。
–如下所述來計算標準 Δ OD：
標準 Δ OD = (標準品之平均最大 OD) - (標準品之平均最小 OD)
–如下所述來測定最大 OD：
最大 OD 值係在 405 nm 下於劑量-反應曲線之所有平行測定內所獲得的最大 OD 值。
效力計算
–使用 4-參數平行線分析來計算標準品曲線及樣品 (或產物對照) 曲線之一組公共希爾斜率、下漸近線及下漸近線。
–標準品及樣品 (或產物對照) 之所得曲線方程式為：
其中：
A = 公共下漸近線
B = 公共希爾斜率
C標準=標準 EC50 值
D =公共下漸近線
ρ = 樣品及產物對照相對於參考標準品之效力
–如下所述來計算相對效力：
相對效力= ρ × 參考標準之活性
參考標準效力指派
FDC 藥品之曲妥珠單抗效力係基於曲妥珠單抗蛋白質含量而非FDC 藥品的總蛋白質含量。因此，所測效力與 FDC 藥品中之兩種分子的比率無關，且可使用一種單分子參考標準品來測定 FDC 藥品 MD 及 LD 樣品之效力。選擇 FDC MD 參考標準品作為效力參考標準品。
FDC MD 參考標準品之效力指派的細節提供於下文中：
將效力設定至 1.00 × 10
4U/mg。
藉由 ELISA 相對於商業帕妥珠單抗 IV 參考標準品 anti2C4907-2 來測定帕妥珠單抗效力。
藉由 ELISA 相對於商業曲妥珠單抗 SC 參考標準品 G005.03EP1 來測定曲妥珠單抗效力。
結果：在曲妥珠單抗 ELISA 測定中分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗固定劑量組合中之曲妥珠單抗的結合。代表性劑量-反應曲線繪示於圖 11 中。
實例
7:
曲妥珠單抗
ELISA
之特異性
為評價曲妥珠單抗 ELISA 之特異性，一式兩份在單一板上於最高測定濃度下來測試製劑緩衝液及結構相關之分子。倘若觀察到結構相關之分子的干擾 (平行測定之平均值三倍於參考標準品劑量-反應曲線的下漸近線平均值)，則擴展至全劑量-反應曲線且確定一個可報告結果 (n = 1)。
結果證實，曲妥珠單抗 ELISA 對曲妥珠單抗具有特異性：
含 rHuPH20 FDC LD 及 MD 製劑緩衝液皆展示不干擾測定，從而證實該測定適於分析調配 於該等基質中之 FDC 藥品樣品。
結果相關之分子 (包括帕妥珠單抗，曲妥珠單抗除外，參見下文)並不干擾曲妥珠單抗 ELISA。此可藉由以下結果來展示：平行測定之平均 OD 值低於參考標準品劑量-反應曲線的下漸近線 OD 平均值三倍。
如所預計，曲妥珠單抗 (IV 及 SC) 及曲妥珠單抗-艾坦辛 (trastuzumab emtansine) 展示曲妥珠單抗 ELISA 干擾，此乃因其結合至同一 HER2 域 IV。
結果顯示於表 5 中。
表
5
：曲妥珠單抗之
ELISA
特異性
| 樣品 名稱/說明 | 可檢測反應 | 相對效力 (%) | 平行測定之 OD 平均值 |
| IV 曲妥珠單抗 | 是 | 88 | NA |
| SC 曲妥珠單抗 | 是 | 92 | NA |
| 曲妥珠單抗-艾坦辛 | 是 | 76 | NA |
| IV 帕妥珠單抗 | 否 | NA | NA |
| SC 帕妥珠單抗 | 否 | NA | NA |
| 含 rHuPH20 FDC LD 調配緩衝液 | 否 | NA | 0.03 |
| 含 rHuPH20 FDC MD 調配緩衝液 | 否 | NA | 0.03 |
| 依泊汀β | 否 | NA | 0.03 |
| 聚乙二醇干擾素 α-2a | 否 | NA | 0.03 |
| 干擾素 α-2a | 否 | NA | 0.04 |
| 甲氧基聚乙二醇-依泊汀β | 否 | NA | 0.04 |
| 阿特柔珠單抗 | 否 | NA | 0.03 |
| 奧瑞組單抗 (Ocrelizumab) | 否 | NA | 0.03 |
| IV 利妥昔單抗 (Rituximab IV) | 否 | NA | 0.03 |
| 貝伐珠單抗 (Bevacizumab) | 否 | NA | 0.03 |
| SC 托珠單抗 (Tocilizumab SC) | 否 | NA | 0.03 |
| 艾羅珠單抗 (Etrolizumab) | 否 | NA | 0.03 |
| 艾美賽珠單抗 (Etrolizumab) | 否 | NA | 0.03 |
| 福玻尿酸酶 α (Vorhyaluronidase Alfa) | 否 | NA | 0.03 |
| 萊布基珠單抗 (Lebrikizumab) | 否 | NA | 0.03 |
| 薩拉麗珠單抗 (Satralizumab) | 否 | NA | 0.03 |
| PEG-非格司亭 | 否 | NA | 0.03 |
| 非格司亭 (Filgrastim) | 否 | NA | 0.04 |
| 泊拉妥珠單抗 (Polatuzumab) | 否 | NA | 0.03 |
| 參考標準品劑量-反應曲線之下漸近線平均值 | NA | NA | 0.04 |
| 3 × 參考標準品最低值 | NA | NA | 0.11 |
實例
8:
曲妥珠單抗
ELISA
之穩健性
藉由作為實踐中之潛在變化源之測定參數之特意變化 來評價曲妥珠單抗 ELISA 的穩健性。藉由比較所獲得劑量-反應曲線參數、系統適宜性及類似性準則與方法程序條件來評估穩健性結果。整體穩健性結果匯總於表 6 中。
表 6 ：曲妥珠單抗 ELISA 之穩健性結果。
| 穩定性參數 | 測試條件 | 結果 | |
| 塗佈試劑 濃度 | 0.5,1,1.5μg/mL | 該測定耐受介於 1-1.5 μg/mL 之間的塗佈試劑濃度 | 10 |
| 塗佈培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 30-60 分鐘之間的塗佈培育時間 | |
| 阻斷培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 60-90 分鐘之間的阻斷培育時間 | |
| FDC 藥品培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 60-90 分鐘之間的 FDC 藥品培育時間 | |
| 檢測抗體批次 | 3 批 | 該測定耐受源自 Jackson ImmunoResearch 之不同檢測抗體批次的使用 | 15 |
| 檢測抗體培育時間 | 30、60、90 分鐘 | 該測定耐受介於 30-90 分鐘之間的檢測抗體培育時間 | |
| 受質培育時間 | 20、30、40 分鐘 | 該測定耐受介於 20-35 分鐘之間的受質培育時間 | |
| 不同讀數儀之使用 | SpectraMax M5,i3x | 該測定耐受兩種分子裝置 SpectraMax M5 及 i3x 之使用 | 20 |
實例
9:
用以分析
FDC
電荷變異體之
IEC
的研發
已測試各種離子交換層析方案以拆分 FDC 電荷變異體。已測試下列參數：管柱類型、緩衝液類型及濃度、鹽濃度、流速、注入體積、pH 值、管柱溫度及梯度型態。
研發測試方法以分離下列波峰/波峰組且測定其相對豐度 (以總波峰面積 % 表示)：
-波峰 1-3 之總和
-波峰 4 (帕妥珠單抗主峰)
-波峰 5-6 之總和
-波峰 7 (曲妥珠單抗主峰)
-波峰 8
-波峰 9-10 之總和
已研發 FDC IE-HPLC 方法且最佳化以使得能夠達成帕妥珠單抗電荷變異體與曲妥珠單抗電荷變異體之最佳分離。藉由單獨分析 SC 曲妥珠單抗及 SC 帕妥珠單抗，可外推預期電荷變異體。個別地以及共混合地使用 SC 帕捷特 (批次：GB0005，c= 120mg/mL) 及 SC Herceptin (批次：P0003，c=120 mg/mL) 來執行實驗。
在第一步驟中，測試 IV 帕捷特及 IV/SC Herceptin 之個別分子的註冊 IE-HPLC 方法。該等方法已公開於例如 Zephania W. Kwong Glover 等人，Compatibility and Stability of Pertuzumab and Trastuzumab Admixtures in i.v.Infusion Bags for Coadministration, Pharmaceutical Biotechnology，第 02 卷，第 3 期，P794-812，2013 年 3 月 01 日，DOI:https://doi.org/10.1002/jps.23403 中。在該等方法中，使用弱陽離子交換管柱 (WCX-10) (參見表 7 之方法 1 及 2)。在下一步驟中，使用成功用於另一與帕妥珠單抗/曲妥珠單抗具有類似 pI 值之 mAb 產物的操作條件來測試 ProPac WCX-10 管柱 (參見表 7 中之方法 3)。在下一步驟中，使用強陽離子交換管柱，且測試不同之緩衝液及 pH 值。所用參數及結果匯總於下文之表 7 中。
在下一步驟中，篩選不同管柱。最佳拆分係使用強陽離子交換管柱 (Mab PAC SCX-10) 達成。測試不同之緩衝液及 pH 值(方法 4 至 6)。所用參數及結果匯總於表 7 中。基於方法 6 實施又一系列，其得到最佳結果 (參見表 8)。
結果
方法 1 ：在使用方法 1 之條件分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 時，波峰拆分對於產物釋放測定之需求而言並不令人滿意：波峰 7 (曲妥珠單抗主峰) 與波峰 8 (曲妥珠單抗之 IsoAsp102) 之間的拆分較差且鹼性帕妥珠單抗區與曲妥珠單抗主峰重疊。
方法 2 ：在使用方法 2 之條件分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 時，波峰拆分對於產物釋放測定之需求而言並不令人滿意：鹼性帕妥珠單抗區與曲妥珠單抗主峰 (波峰 7) 及波峰 8 完全重疊且由此不可接受。
方法 3 ：曲妥珠單抗及帕妥珠單抗之主峰皆可分離且僅觀察到鹼性帕妥珠單抗區的較小重疊。然而，酸性曲妥珠單抗區與帕妥珠單抗主峰重疊。
方法 4 ：鹼性帕妥珠單抗區與曲妥珠單抗主峰及曲妥珠單抗之 IsoAsp102 波峰(波峰 8) 重疊。
方法 5 ：1:pH 7.5: 充分分離兩個主峰及波峰 8，鹼性帕妥珠單抗區與曲妥珠單抗主峰僅具有較小重疊
方法 5 ：2: pH 8.0: 充分波峰 8，但鹼性帕妥珠單抗區與曲妥珠單抗主峰之重疊強於使用pH 7.5 之方法 5
方法 6 ：充分分離所有所關注物質。
表
7
：用以分析
FDC
電荷變異體之
IEC
方案的研發。
| 方法 1 | 方法 2 | 方法 3 | 方法 4 | 方法 5 | 方法 6 | |
| 管柱 | ProPac WCX-10 | MabPac SCX-10 | ||||
| 溶劑 A | 20mM MES + 1mM Na2EDTA | 20 mM ACES | 10mM NaHPO 4 | 20mM MES + 1mM Na2EDTA | 20mM HEPES | 20 mM ACES |
| 溶劑 B | 緩衝液 A+ 250mM NaCl | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl | 緩衝液 A + 100mM NaCl | 緩衝液 A+ 250mM NaCl | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl |
| pH | pH 6.0 | pH 7.5 | pH 7.5 | pH 6.0 | 1: pH 7.5 2: pH 8.0 | pH 7.5 |
| 梯度 | 在 65 min 內18 % 至 58 %B | 在 40 min 內 8 % 至 45 %B | 在 30 min 內 15 % 至 55 %B | 在 65 min 內18 % 至 58 %B | 1 ：在 40 min 內 1 % 至 47 %B 2 ：在 40 min 內 0 % 至 47 %B | 在 40 min 內 8 % 至 45 %B |
| 管柱溫度 | 34°C | 35°C | 23°C | 34°C | 40°C | 35°C |
| 流速 | 0.8 mL/min | 0.5 mL/min | 0.8 mL/min | 0.8 mL/min | 0.8 mL/min | 0.5 mL/min |
| 注入量 | 50 µg 蛋白質 | 100 µg 蛋白質 | 50 µg 蛋白質 | 50 µg 蛋白質 | 100 µg 蛋白質 | 100 µg 蛋白質 |
表
8
：用以分析
FDC
電荷變異體之
IEC
方案的研發。探究上述方法
6
之測試參數。
| 方法 6 | 方法 6A | 方法 6B | 方法 6C | 方法 6D | |
| 管柱 | MabPac SCX-10 | ||||
| 溶劑 A | 20 mM ACES | 20 mM ACES | 20 mM ACES | 20 mM ACES | 20 mM ACES |
| 溶劑 B | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl | 緩衝液 A+ 200 mM NaCl |
| pH | pH 7.5 | pH 6.8 | pH 7.5 | pH 7.5 | pH 7.5 |
| 梯度 | 在 40 min 內 8 % 至 45 %B | 在 40 min 內 8 % 至 45 %B | 在 30 min 內 3 % 至 40 %B | 在 30 min 內 0 % 至 35 %B | 在 40 min 內 1 % 至 47 %B |
| 管柱溫度 | 35°C | 35°C | 35°C | 40°C | 40°C |
| 流速 | 0.5 mL/min | 0.5 mL/min | 1.0 mL/min | 0.8 mL/min | 0.8 mL/min |
| 注入量 | 100 µg 蛋白質 | 100 µg 蛋白質 | 100 µg 蛋白質 | 100 µg 蛋白質 | 100 µg 蛋白質 |
基於上述表 8 中所描述之 HPLC 參數，實施若干實驗設計 (實驗設計，DoE)。測試下列參數：
梯度型態
流速 (0.5 – 1.0 mL/min)
移動相 A 及移動相 B 之 pH 值(7.4 -7.6 及 6.8)
移動相 B 中之 NaCl 濃度 (100-300 mM)
管柱溫度 (25-40℃)
藉由分析在該等實驗設計之框架中獲得之資料，下列測試參數展示最佳結果：
沖提劑 A：20mM ACES, pH 7.5
沖提劑 B：20mM ACES, 200mM NaCl, pH 7.5
管柱 MabPac SCX-10, BioLC, 4×250mm
管柱溫度：40℃
流速：0.8 mL/ min
注入量：10 μL (100 μg 蛋白質)
梯度：在 40 min 內 1 % 至 47 %B
為分析此研發方法之穩健性，執行基於 DoE 之實驗因子設計。因此，下列參數在基質中有所變化：
ACES 濃度：18 – 22 mM
NaCL 濃度：180 – 220 mM
管柱溫度：36-44℃
流速：0.7-0.9 mL/min
pH: 7.4-7.6
注入體積：8 -12 µL (80 – 120 µg)
該等實驗之結果展示，測試方法在關於曲妥珠單抗主峰 (波峰 7) 及波峰 8 之測試範圍內較為穩定。然而，觀察到針對帕妥珠單抗主峰 (波峰 4) 及中間區 (帕妥珠單抗主峰與曲妥珠單抗主峰之間的區域) 獲得之純度值高度可變。此可變性主要取決於 pH 及管柱溫度。此實驗之統計學評估可產生用於最終方法的設置：
沖提劑 A：20mM ACES, pH 7.6
沖提劑 B：20mM ACES, 200mM NaCl, pH 7.6
管柱溫度：36°C
流速：0.8 mL/ min
注入量：10 μL (100 μg 蛋白質)
梯度：在 40 min 內 1 % 至 47 %B
評估用於確定帕妥珠單抗 /曲妥珠單抗 FDC 變異體之電荷異質性的可能替代方式。在該等替代方式中，評價不同管柱類型及 pH 梯度方法之適宜性。
亦使用弱陰離子交換管柱 ProPac WAX-10 bio LC (4×250mm)在下列層析條件下來實施若干分離嘗試：
製備下列沖提劑 A 及 B 並進行測試：
1.A = 20mM CAPSO (pH 10.0), B = 20mM CAPSO + 250mM NaCl (pH 10.0)
2.A = 20mM 六氫吡嗪 (pH 10.0), B = 20mM 六氫吡嗪 + 250mM NaCl (pH 10.0)
3.A = 20mM trisma (pH 10.5), B = 20mM trisma + 250mM NaCl (pH 10.5)
4.A = 20mM trisma (pH 8.0), B = 20mM trisma + 250mM NaCl (pH 8.0)
5.A = 20mM 磷酸鹽 (pH 11.0), B = 20mM 磷酸鹽 + 250mM NaCl (pH 11.0)
管柱溫度：30°C
流速：0.8 mL/ min；1.0 mL/ min
注入量：5 μL (50 μg 蛋白質)
梯度 1：在 60 min 內 0 至 100 %B
梯度 2：在 40 min 內 0 至 100 %B
對於針對弱陰離子交換管柱所測試之所有條件而言，所關注物質並不保留於管柱上且與注入波峰一起沖提出，由此展示，該等實驗條件根本不適於分離帕妥珠單抗 /曲妥珠單抗 FDC 之電荷變異體。
pH-梯度分離模式之實驗
將基於 pH 梯度之 IEC 方法之適宜性評價為鹽梯度方法的可能替代方式。使用強陽離子交換管柱 (MabPac SCX-10 管柱) 以及下列 HPLC 測試參數：
沖提劑 A：10 mM Tris、10 mM 磷酸鹽、10 mM 六氫吡嗪，pH 6.0
沖提劑 B：10 mM Tris、10 mM 磷酸鹽、10 mM 六氫吡嗪，pH 11.0
沖提劑 C：100 mM NaCl
沖提劑 D：純水
管柱 MabPac SCX-10, BioLC, 4×250mm
管柱溫度：35°C
流速：0.5 mL/ min
注入量：10 μL (10 μg 蛋白質)
梯度：在 45 min 內 10 % 至 50 %B (參見下文之細節)
設備：Waters Alliance
組合沖提劑 C 及 D 以分別提供 0 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM 及 50 mM NaCl 之恆定鹽濃度。因此，沖提劑 C/沖提劑 D 之比率自 0% 沖提劑 C / 50% 沖提劑 D (0 mM NaCl) 至 50% 沖提劑 C / 0% 沖提劑 D (50 mM NaCl) 有所變化。個別地以及共混合地使用 SC 帕捷特 (批次：GB0005，c= 120mg/mL) 及 SC Herceptin (批次：P0003，c=120 mg/mL) 來執行實驗。使用 90 % 沖提劑 A / 10% 沖提劑 B 將測試樣品稀釋至最終濃度為 1 mg/ mL。
使用 40 mM NaCl 獲得最佳分離；然而，在該等條件下，波峰極早地沖提出，且兩個主峰呈現較寬形狀及較小高度。
使用設定於 40 mM NaCl 之鹽濃度且同時在改變梯度型態及流速的情形下來實施實驗設計 (DoE)。然而，不能建立統計學模型，從而展示所探究方法缺乏穩健性，即使小幅修改測試
條件。
根據上文所實施之實驗，IEC 方法之最關鍵參數似乎為：1. pH 值，2.管柱類型，3.管柱溫度，4.梯度型態。該等參數對拆分具有顯著影響。另一方面，緩衝液類型及濃度、鹽濃度、流速及注入體積對拆分具有較小影響。
實例
10:
用以分析
FDC
電荷變異體之
IEC
目的及原理
IE-HPLC 根據溶解狀態中之電荷性質來分離存在於藥品中的蛋白質。此分離係基於蛋白質之表面電荷與存在於管柱堆積表面上之帶電基團的相互作用。在此分析程序中所用之陽離子交換 HPLC 中，酸性物質在鹽梯度中首先沖提出且較鹼性物質隨後沖提出。將同一方法應用於 FDC 藥品 LD 及 MD。使用 FDC MD 參考標準品來測試 FDC 藥品 LD 及 MD。
設備及材料
配備有 UV 檢測器之 HPLC 系統 (具有 2487/2489 檢測器或等效裝置之 Waters Alliance 2695/e2695)
HPLC 管柱 (Thermo Scientific MAbPac SCX-10, 4 mm-250 mm，粒度：10 µm 或等效粒度)
溶液
藥物產物稀釋緩衝液：20 mM L-組胺酸 / L-組胺酸單鹽酸鹽、105 mM 海藻糖、100 mM蔗糖、10 mM 甲硫胺酸、0.04% [w/v] 聚山梨醇酯 20，pH 5.5 ± 0.2
移動相 A：20 mM ACES, pH 7.60 ± 0.05
移動相 B：20 mM ACES、200 mM氯化鈉，pH 7.60 ±0.05
CpB 溶液：1 mg/mL CpB (於移動相 A 中)
樣品溶液之製備：
使用移動相 A 稀釋 FDC 藥品以製備總蛋白質濃度為大約 10 mg/mL 且 CpB 為大約 0.08 mg/mL 之樣品溶液。
空白溶液之製備：
以與樣品相同之方式稀釋藥品稀釋緩衝液。
CpB 消解
將參考標準品溶液、樣品溶液及空白溶液在 37℃ ±2℃ 下培育 20±5 分鐘。
將樣品儲存於 10℃ ± 4℃ 下直至分析且必須在 24 小時內完成HPLC 分析。
程序
在注入第一樣品之前，使用 99% 移動相 A 沖洗管柱直至獲得穩定基線為止。視情況，注入用於管柱條件化目的之參考溶液直至層析圖的目測評估顯示至少兩個連續注入具有連續型態為止。
操作參數
檢測波長：280 nm
注入體積：10 µL
流速：0.8 mL/min
管柱溫度：36℃ ± 2℃
自動採樣儀溫度：10℃±4℃
運行時間：60 min
梯度
| 時間 (min) | 移動相 A ( % ) | 移動相 B(%) |
| 0 | 99 | 1 |
| 3 | 99 | 1 |
| 43 | 53 | 47 |
| 44 | 0 | 100 |
| 50 | 0 | 100 |
| 51 | 99 | 1 |
| 60 | 99 | 1 |
注入方案
以下列順序執行注入：
1.移動相 A
2.空白溶液
3.參考標準品
4.樣品 (最多 10 個樣品)
5.參考標準品
6.空白溶液
註：若擬分析多於 10 個樣品，則將每 10 個樣品與參考標準注入液置於一起。
結果：
已研發 FDC 藥品 IE-HPLC 方法且最佳化以使得能夠達成帕妥珠單抗電荷變異體與曲妥珠單抗電荷變異體之最佳分離。因帕妥珠單抗 (pI 8.7) 及曲妥珠單抗 (pI 8.4) 具有類似等電點，故 IE-HPLC 不能完全分離兩種抗體分子之所有電荷變異體 (參照圖 13)。可控制 FDC 藥品中之個別分子的所有重要電荷變異體，此乃因可拆分所有相關波峰。FDC 藥品之所報告測定參數為波峰 1-3 之總和、波峰 4 (帕妥珠單抗主峰)、波峰 5-6 之總和、波峰 7 (曲妥珠單抗主峰)、波峰 8 及波峰 9-10 之總和。一實例性層析圖展示於圖 12 中。
實例
11: HPLC
穩健性及重複性研究
執行不同實驗以針對不同輸入變量評估實例 10 之分析程序的穩健性。該等輸入變量尤其為：
管柱溫度 (32℃、36℃、40℃)
流速 (0.7 mL/ min、0.8 mL/min、0.9 mL/min)
移動相 A 及 B 之 pH (pH 7.5 - 7.7)
移動相 B 中之氯化鈉濃度 (180 mM 至 220 mM)
將在改變所關注參數之後獲得之分析型態及結果與根據標靶參數的分析型態及結果進行比較。使用波峰 4、波峰 7、波峰 1-3 之總和及波峰 8 之相對波峰面積 (以面積 % 表示) 來計算結果之間的相對差。該等結果滿足接受準則，由此證實該程序對於其預期目的而言適宜地穩定。
針對波峰 4、波峰 7、波峰 1-3 之總和及波峰 8 在以下範圍內顯示分析程序的重複性：
– 50 µg 至 149 µg 之 FDC 藥品 LD 之注入蛋白質，涵蓋 50% 至 149% 標稱工作量 (100 µg 蛋白質)
– 51 µg 至 153 µg 之 FDC 藥品 MD 之注入蛋白質，涵蓋 51% 至 153 標稱工作量 (100 µg 蛋白質)。
實例
12:
穩定性指示性質
使用實例 10 之方法測試非受力及應力 FDC 藥品 MD 及 LD 樣品，且證實該程序在不同應力條件下分離、鑑別抗體及測定其純度之能力。測試下列應力條件：熱應力、強制氧化、高-pH (pH 7.4) 應力、低-pH (pH 4) 應力及光應力。分離具有不同電荷之雜質及相關物質。與非受力樣品 (圖 12 及圖 13) 相比，受力樣品之層析圖展示增加量的波峰 1–3 之總和及波峰 8 (資料未展示)。總而言之，該程序可指示穩定性。
實例
13
藉由
ELISA
測得
FDC
中之曲妥珠單抗及帕妥珠單抗電荷變異體以及
CDR
親和突變體的效力
證實 ELISA 反映電荷變異體及 CDR 親和突變體之抗增殖活性的能力：
在抗增殖測定及 ELISA 中測試如上文所描述之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗 HER2 親和突變體 (分別為圖 9 及圖 14)。針對 HER2 親和突變體觀察到劑量-反應曲線不存在或移位至較高濃度以及不能滿足類似性準則 (分別為抗增殖測定及 ELISA 之平行性及上漸近線偏差) 可證實類似效力之大幅降低。
為評估電荷變異體，使用含有曲妥珠單抗或帕妥珠單抗之 FDC 藥品 MD 製劑緩衝液之支持性技術批次來排除 FDC 藥品在基於細胞之測定中的上文所提及交叉干擾。
所有 IE-HPLC 餾分皆在基於細胞之測定及 ELISA 中展示類似效力 (考慮各別方法精確度)，波峰 9 (具有增加之 Fc Met261 氧化的曲妥珠單抗) 除外。儘管 Met261 處之此 Fc 氧化不應影響 CDR 的標靶結合活性，但此變異體在曲妥珠單抗 ELISA 中展示減小之效力 (73% vs. 基於細胞之測定中的 91%)。
不能完全判定僅以極小量存在之該等同種型的分級分離過程是否有助於此發現及兩個測定之效力值是否可真正地視為不同。然而，曲妥珠單抗 ELISA 就此而言可視為保守，此乃因其指示未由基於細胞之抗增殖測定反映的效力降低。
ELISA 控制已知影響生物活性之產物變異體之生物活性的能力與抗增殖測定相等，如下文所詳述：
在兩個測定中，波峰 1 中之曲妥珠單抗脫醯胺產物變異體 HC Asn55/isoAsp55 及 LC Asn30/Asp30 皆展示減小的活性。
在兩個測定中，波峰 10 中之在一條條重鏈中之 Asp102 位置處具有琥珀醯亞胺且具有增加之 Fc Met 氧化之曲妥珠單抗產物變異體皆展示減小的活性。
在兩個測定中，如所預計，所有其他 IE-HPLC 餾分 (包括波峰 4 及 7，分別對應於帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之主峰) 皆展示介於 80% 與 120% 之間的不變活性。
另外，儘管在基於細胞之測定及 ELISA 中獲得類似之波峰 8 效力，但已確認，在此研究中未觀察到 HC IsoAsp102 對曲妥珠單抗 IV 效力的已知負面影響。在沖提於 IE-HPLC 波峰 4 中之曲妥珠單抗之一條重鏈處之 HC Asp102 至 IsoAsp 異構化對應於 FDC 藥品中的 IE-HPLC 波峰 8。在研發 SC 曲妥珠單抗期間所執行關於 HC Asp102/isoAsp102 形式對抗增殖活性之影響的其他研究展示，SC 曲妥珠單抗之影響顯著性小於 IV 曲妥珠單抗。
此可有助於最佳化配方 (例如 pH 變化) 且增加 SC 曲妥珠單抗之穩定性。最後，應注意，經由 IE-HPLC 之所定義接受準則來維持 FDC 藥品中之此變異體的控制。
表 9 ： 曲妥珠單抗及帕妥珠單抗之結合活性與抗增殖活性的關聯
a 關於餾分表徵，參照實例 14。
b 提供相對於參考標準品之定性估計，此乃因樣品及參考標準品之劑量-反應曲線並不類似且由此相對效力不可報告 (n ≥ 3 個單板結果)。
c FDC 藥品 IE-HPLC 波峰 7 至 10 僅含曲妥珠單抗同種型。
| 樣品 | FDC 藥品 MD 調配緩衝液 (批次：GTK0003) 中之帕妥珠單抗 | FDC 藥品 MD 調配緩衝液 (批次：GTK0004) 中之曲妥珠單抗 | ||
| 藉由 ELISA 測得之帕妥珠單抗的相對效力 (%) | 藉由抗增殖分析測得之 帕妥珠單抗 的 MDA-MB-175 VII 相對效力 (%) | 藉由 ELISA 測得之曲妥珠單抗的相對效力 (%) | 藉由 BT-474 抗增殖分析測得之曲妥珠單抗的相對效力 (%) | |
| IE-HPLC 餾分 ( 非受力) a | ||||
| 波峰 1 | 88 | 等效 b | 75 | 61 |
| 波峰2 | 95 | 84 | 87 | 90 |
| 波峰 3 | 93 | 112 | 95 | 114 |
| 波峰 4 | 113 | 107 | 86 | 83 |
| 波峰 5 | 109 | 109 | 89 | 109 |
| 波峰 6 | 81 | 等效 b | 102 | 116 |
| 波峰 7 | NA c | NA c | 101 | 109 |
| 波峰 8 | NA c | NA c | 100 | 105 |
| 波峰 9 | NA c | NA c | 73 | 91 |
| 波峰 10 | NA c | NA c | 71 | 73 |
實例
14:
電荷變異體之表徵
表徵藉由 FDC 藥品 IE-HPLC 方法分離及隔離之 FDC 藥品的電荷變異體 (圖 13)。另外，藉由同一 IE-HPLC 方法分離 FDC 製劑中之個別抗體在釋放時的電荷變異體並進行表徵 (圖 13)。
執行使用下列方法之全面波峰表徵研究來證實 FDC 藥品的電荷變異體：
用於評價化學降解位點之胰蛋白酶抗體肽的 LC-MS/MS。
用於評估離胺酸醣化程度之硼酸親和層析
與 HILIC 組合用於分析 Fc 醣基化之 2-AB 標記
LC-MS 肽定位：
如 Schmid 等人在 2018 年所描述來實施相關胺基酸修飾之 LC-MS/MS 肽定位及定量 (Schmid I, Bonnington L, Gerl M 等人，Assessment of susceptible chemical modification sites of trastuzumab and endogenous human immunoglobulins at physiological conditions.Commun Biol 2018;1:28)。簡言之，使用 8 mol/L 胍鹽酸鹽 (pH 6.0) 使所有樣品變性並使用二硫蘇糖醇在 50℃ 下還原 1 h。
對樣品進行緩衝液交換 (0.02 mol/L 組胺酸鹽酸鹽，pH 6.0) 且使用胰蛋白酶在 37℃ 下進一步消解 18 h。在 ACQUITY UPLC 系統之 BEH C18 管柱上執行肽分離。使用 Synapt G2 HDMS Q-ToF 質譜儀達成在線質譜檢測。對於經修飾肽之相對定量，使用 GRAMS AI 軟體。
硼酸親和層析：
使用 TSKgel Boronate-5PW 親和管柱實施硼酸親和層析。使用由 100 mmol/L Hepes、70 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、500 mmol/L 山梨醇 (pH 8.6) 組成之沖提緩衝液在配備有 UV 檢測之 HPLC 系統上於 280 nm 下進行層析分離。如以下文獻中所描述來執行波峰積分及醣化定量 (Fischer S, Hoernschemeyer J, Mahler HC.Glycation during storage and administration of monoclonal antibody formulations.Eur J Pharm Biopharm.2008;70:42–50.)。
聚醣分析：
為評價 Fc 醣基化，使用甲酸銨緩衝液 (pH 8.6) 對樣品進行緩衝液交換並與 PNGase F 一起在 45℃ 下培育 1 h。在 65℃ 下執行聚醣 2-AB 標記 2 h。對經標記聚醣結構實施 HILIC-分離及螢光-檢測以供後續波峰積分及聚醣定量，如文獻中所描述 (Reusch D, Haberger M, Maier B 等人，Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles--part 1: separation-based methods.MAbs.2015;7:167-79。)
結果及結論：
亦在 FDC 藥品中檢測到針對 FDC 製劑中之個別帕妥珠單抗及曲妥珠單抗分子發現的所有電荷變異體 (相對豐度 ≥1%)。與在釋放時及在儲存之後 FDC 調配物中之個別抗體相比，在 FDC 藥品中未檢測到新電荷變異體。表 10 匯總該等發現。
表 10 ： FDC 藥品之 IE-HPLC
波峰表徵結果
| 樣品 | IE-HPLC 波峰 1 | IE-HPLC 波峰 2 | IE-HPLC 波峰 3 | IE-HPLC 波峰 4 | IE-HPLC 波峰 5 |
| 帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC MD (批次：GTK0002) | 以下位置之脫醯胺化： HC-Asn-55 及 LC-Asn-30 (曲妥珠單抗)； Lys 醣化 (帕妥珠單抗) | 以下位置之脫醯胺化： HC-Asn-55 及 LC-Asn-30 (曲妥珠單抗)； Fc 唾液酸及 Lys 醣化 (帕妥珠單抗) | 以下位置之脫醯胺化： LC-Asn-30 (曲妥珠單抗)； HC-Asn-391 及 HC-Asn-327 之脫醯胺化 (痕量)， Fc 唾液酸及 Lys 醣化 (帕妥珠單抗) | 以下位置之脫醯胺化： LC-Asn-30 及 HC-Asp-102 異構化 (曲妥珠單抗)； IE-HPLC 主峰 (帕妥珠單抗) | Lys 醣化 (曲妥珠單抗)； 重鏈及輕鏈上之 N-末端 VHS 及焦麩胺酸鹽 (帕妥珠單抗) |
| FDC 藥品 MD 製劑中之帕妥珠單抗 | Lys 醣化 | Fc 唾液酸及 Lys 醣化 | 低程度之 HC-Asn-391 及 HC-Asn-327 脫醯胺化、 Fc 唾液酸及 Lys 醣化 | IE-HPLC 主峰 | 重鏈及輕鏈上之 N-末端 VHS 及焦麩胺酸 |
| FDC 藥品 MD 製劑中之曲妥珠單抗 | 以下位置之脫醯胺化： HC-Asn-55 及 LC-Asn-30 | 以下位置之脫醯胺化： HC-Asn-55 及 LC-Asn-30 | 以下位置之脫醯胺化： LC-Asn-30 | 以下位置之脫醯胺化： LC-Asn-30 及 HC-Asp-102 異構化 | Lys 醣化 |
表
10 (
續
)
：
FDC
藥品之
IE-HPLC
波峰表徵結果
| 樣品 | IE-HPLC 波峰 6 | IE-HPLC 波峰 7 | IE-HPLC 波峰 8 | IE-HPLC 波峰 9 | IE-HPLC 波峰 10 |
| 帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC MD (批次：GTK0002) | 以下位置之脫醯胺化： HC-Asn-392 及 HC-Asn-328 (痕量)、Fc 唾液酸及 Lys 醣化 (曲妥珠單抗)； N-末端 VHS 輕鏈以及重鏈處之 C-末端離胺酸及脯胺酸醯胺 (帕妥珠單抗) | IE-HPLC 主峰 (曲妥珠單抗) | 以下位置之異構化： HC-Asp-102 (曲妥珠單抗) | 增加之 Fc 氧化 (曲妥珠單抗) | 以下位置之異構化： HC-Asp-102 及增加之 Fc 氧化 (曲妥珠單抗) |
| FDC 藥品 MD 製劑中之帕妥珠單抗 | N-末端 VHS 輕鏈以及重鏈處之 C-末端離胺酸及脯胺酸醯胺 | NA | NA | NA | NA |
| FDC 藥品 MD 製劑中之曲妥珠單抗 | 以下位置之脫醯胺化： HC-Asn-392 及 HC-Asn-328 (痕量)、Fc 唾液酸及 Lys 醣化 | IE-HPLC 主峰 (曲妥珠單抗) | 以下位置之異構化： HC-Asp-102 (曲妥珠單抗) | 增加之 Fc 氧化 (曲妥珠單抗) | 以下位置之異構化： HC-Asp-102 及增加之 Fc 氧化 (曲妥珠單抗) |
波峰 1-3 之總和含有帕妥珠單抗 (HC-Asn-391 脫醯胺化、FC 唾液酸及離胺酸醣化) 及曲妥珠單抗 (LC-Asn-30 脫醯胺化及 HC-Asn-55) 之酸性變異體。
波峰 4 含有帕妥珠單抗主要電荷變異體 (亦即天然抗體) 及較低量之酸性曲妥珠單抗變異體 (LC-Asn-30 脫醯胺化及 HC-Asp-102 異構化)。
波峰 5-6 之總和含有帕妥珠單抗鹼性變異體 (重鏈及輕鏈上之 N-末端 VHS 及重鏈處之 C-末端離胺酸) 及曲妥珠單抗酸性變異體(HC-Asn-392 脫醯胺化、離胺酸醣化及增加之 Fc 唾液酸含量)。
波峰 7 含有曲妥珠單抗之主要電荷變異體 (亦即天然抗體)，且不展示與帕妥珠單抗變異體之重疊。
波峰 8 含有 HC-Asp-102 單異構化至異天門冬胺酸 (在一條重鏈處) 之曲妥珠單抗，且不展示與帕妥珠單抗電荷變異體之重疊。
波峰 9-10 之總和含有具有增加之 FC 氧化 (在 HC-Met-255 及 -431處) 及 HC-Asp-102 異構化之曲妥珠單抗電荷變異體，且不展示與帕妥珠單抗變異體之重疊。
亦在 FDC 藥品中檢測到所有發現於帕妥珠單抗 SC 藥物物質及曲妥珠單抗 SC 藥物物質中之豐富電荷變異體。在釋放時及在儲存之後於 FDC 藥品材料中未檢測到新電荷變異體。可控制 FDC 藥品中之個別分子的所有關鍵電荷變異體。
在穩定性測試期間未觀察或預料到額外共沖提或現有波峰共沖提之增加，此乃因帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之應力誘導性電荷變異體分別移向較早及較晚沖提時間：受力帕妥珠單抗之波峰圖案移向層析圖之酸性區，而受力曲妥珠單抗之波峰圖案移向鹼性區。
實例
15: FDC
組成物
藉由
IE-HPLC
測得之
FDC
藥品之波峰
1-3
的總和
FDC 藥品之波峰 1-3 的總和係由下列變異體構成：
帕妥珠單抗之酸性變異體 (HC Asn391 脫醯胺化、Fc 唾液酸及離胺酸醣化)。
帕妥珠單抗中之 Asn327 脫醯胺化，其僅以痕量觀察於 FDC 藥品 IE-HPLC 波峰表徵研究中。
曲妥珠單抗之酸性變異體 (主要係 LC Asn30 及 HC Asn55 之脫醯胺化)。與 LC Asn30 相比，在生物過程及生理學條件下驗證 HC Asn55 之低降解易感性 (Schmid I, Bonnington L, Gerl M 等人，Assessment of susceptible chemical modification sites of trastuzumab and endogenous human immunoglobulins at physiological conditions.Commun Biol 2018;1:28)。
基於臨床經驗及對 PK/生物活性及安全性/免疫原性型態之預期影響來證實 FDC 藥品儲存期限末接受準則。所提出接受準則適於控制產物品質且涵蓋藥物物質及藥品處理及儲存之潛在影響。
對於 FDC 藥品而言，確立下列儲放壽命末接受準則： 波峰 1-3 之總和：≤ 23.0 面積 % (LD) / ≤21.0 面積 % (MD)。基於臨床經驗及對生物活性/PK及安全性/免疫原性型態之假設影響來確立該等接受準則。超出當前臨床經驗之擴展可視為合理的，此乃因對生物活性及 PK之影響較低且對免疫原性/安全性並無風險。
安全性及免疫原性考慮：因發現於帕妥珠單抗及曲妥珠單抗材料中之酸性變異體係通常發現於 IgG 抗體中的修飾，故接受準則內之任何酸性變異體含量增加預計不代表新形式且由此預計不會增加毒性風險及 ADA 發生率。此可藉由 FDC 藥品臨床研究中之低 ADA 發生率及良好安全型態予以證實。在關鍵研究期間，將具有最多 18.7 面積 % FDC 藥品 LD 及 16.0 面積 % FDC 藥品 MD 之陳化臨床研究材料投予患者。在儲存或處理期間未生成新酸性變異體。此外，針對曲妥珠單抗已公開，溶劑可及性殘基之降解位於保守 Fc (HC Asn387、Asn392 及 Asn393 之脫醯胺化)亦及 CDR (主要係 LC Asn30 脫醯胺化及 HC Asp102 異構化) 中且通常在活體內之發生 (數天內) 顯著快於生物過程及實時儲存條件 (Schmid 等人，2018)。內源性人類抗體中之相同 Fc Asn脫醯胺化位點之降解程度顯著高於彼等針對儲存於 5℃ 下的液體藥品製劑所觀察者。由此推斷出，該等降解並不增加患者之安全性/免疫原性風險 (Liu YD, van Enk JZ, Flynn GC.Human antibody Fc deamidation in vivo.Biologicals 2009;37:313-22)。此結論亦可適用於帕妥珠單抗脫醯胺化，其中在此波峰區中僅檢測到一個脫醯胺化位點且位於 Fc 部分中 (HC Asn391)。
總而言之，波峰 1-3 之總和超過患者暴露值之潛在 4.3 面積 % 增加預計不會改變產物的免疫原性及安全型態。
生物活性考慮：相對於帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之酸性變異體 (波峰 1-3 之總和) 在18.7 面積 % (LD) 及 16.5 面積 % (MD) 下的最大臨床經驗，23.0 面積 % (LD) 及 21.0 面積 % (MD) 之規格界限可使帕妥珠單抗及曲妥珠單抗結合活性降低最多大約 4% (根據藉由表 8 中所描述之 ELISA 值所獲得的效力)。4% 之生物活性變化並不視為有影響的。因此，若在規格界限下存在波峰 1-3 之總和，則預計可維持療效。
PK 考慮：抗體 Fc 參與清除 (Jefferis R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection.Expert Opin Biol Ther 2007;7:1401-13.)；因此，CDR 中之脫醯胺化預計不會影響 PK。儘管已知電荷性質會影響抗體之 PK 行為，但藉由脫醯胺化引入之單一負電荷不應影響 PK (Khawli 等人，2010)。值得注意地，在 FDC 藥品穩定性測試期間僅觀察到較低程度之 Fc脫醯胺化改變 (IE-HPLC 波峰 3：帕妥珠單抗 HC Asn391；IE-HPLC 波峰 6：曲妥珠單抗 HC Asn392)。因此，若在規格界限中存在波峰 1-3 之總和，則PK 預計不受影響。
藉由
IE-HPLC
測得之
FDC
藥品的波峰
4
FDC 藥品之波峰 4 係 IE-HPLC 方法之所報告測定參數之一部分且構成帕妥珠單抗的期望主要電荷同種型。其在規範中之納入可確保一致之產物純度。
藥物物質及藥品之釋放及穩定性測試之接受準則係根據 IE-HPLC的其他所報告測定參數所設定，且考慮製造經驗及穩定性效應。在儲放壽命結束時 ≥38 面積 % (LD) 及 ≥28 面積 % (MD) 之 FDC 藥品接受準則可確保產物純度及製造過程的適當控制。
藉由
IE-HPLC
測得之
FDC
藥品之波峰
5-6
的總和
FDC 藥品之波峰 5-6 的總和係由下列變異體構成：
帕妥珠單抗之鹼性變異體 (重鏈及輕鏈上之 N-末端 VHS、N-末端焦麩胺酸鹽及重鏈處之 C-末端離胺酸及脯胺酸醯胺)
曲妥珠單抗之酸性變異體 (HC Asn392 脫醯胺化、離胺酸醣化及增加之 FC 唾液酸含量)
波峰 5-6 之總和在 FDC 藥品釋放或穩定性測試中不受控制，此乃因歷史資料已展示，帕妥珠單抗之鹼性變異體及曲妥珠單抗之該等酸性變異體在藥品製造及儲存期間保持不變且由此不能視為穩定性指示參數。
藉由
IE-HPLC
測得之
FDC
藥品的波峰
7
FDC 藥品之波峰 7 係 IE-HPLC 方法之輸出之一部分且構成曲妥珠單抗的期望主要電荷同種型。其規範可確保一致之產物純度。藥品釋放及穩定性測試之接受準則係根據 IE-HPLC的其他所報告測定參數所設定，且考慮製造經驗及穩定性效應。在儲放壽命結束時 ≥ 16.0 面積 % (LD) 及 ≥ 23.0 面積 % (MD) 之 FDC 藥品接受準則可確保產物品質及製造過程的適當控制。
藉由
IE-HPLC
測得之
FDC
藥品的波峰
8
FDC 藥品之波峰 8 係由 HC Asp102 單異構化至異天門冬胺酸 (在一條重鏈處) 之曲妥珠單抗構成且並不展示與帕妥珠單抗電荷變異體的共沖提。
在 FDC 藥品釋放及穩定性測試中可控制波峰 8。
基於臨床經驗及對 PK/生物活性及安全性/免疫原性型態之預期影響來證實 ≤ 9.0 面積 % (LD) / ≤12.0 面積 % (MD) 的 FDC 藥品儲放壽命末接受準則。所提出接受準則適於控制產物品質且涵蓋藥物物質及藥品處理及儲存之潛在影響。
安全性及免疫原性考慮：因發現於曲妥珠單抗材料中之酸性變異體係通常發現於 IgG 抗體中的修飾，故接受準則內之任何酸性變異體含量增加不可能代表新形式且不可能增加毒性風險及 ADA 發生率。FDC 藥品通常較為安全且充分耐受。安全型態與 IV 帕妥珠單抗+ IV 曲妥珠單抗 (P + H IV) 之安全型態相當、ADA 發生率較低 (≤ 5%) 且並無關於 PK、療效或安全性之臨床後果。
在關鍵研究期間，將具有最多 6.4 面積 % 之 FDC 藥品 LD 波峰 8 及9.4 面積 % 之 FDC 藥品 MD 波峰 8 的陳化臨床研究材料投予患者。在儲存或處理期間未生成新電荷變異體。此外，針對曲妥珠單抗已公開，溶劑可及性殘基之降解位於保守 Fc (HC Asn387、Asn392 及 Asn393 之脫醯胺化) 亦及 CDR (主要係 LC Asn30 脫醯胺化及 HC Asp102 異構化) 中且通常在活體內之發生 (數天內) 顯著快於生物過程及實時儲存條件 (Schmid 等人，2018)。內源性人類抗體中之相同 Fc Asn 脫醯胺化位點之降解程度顯著高於彼等針對儲存於 5℃ 下的液體藥品製劑所觀察者。由此推斷出，該等降解並不增加患者之安全性/免疫原性風險 (Liu 等人，2009)。波峰 8 (HC Asp102 異構化至異天門冬胺酸)之超過患者暴露值之潛在 2.5 面積 % 增加預計不會改變產物的免疫原性型態。
生物活性考慮：與參考標準品相比，富集峰 8 (92% 之波峰純度，其主要含有在一條重鏈處 HC Asp102 至異天門冬胺酸之單異構化) 具有類似曲妥珠單抗活性 (100% 之結合活性)。因此，若在規格界限下存在波峰 8，則預計可維持 FDC 藥品之療效。
PK 考慮：在帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之 CDR 中天門冬胺酸鹽異構化至異天門冬胺酸不會改變電荷且預計不影響 PK。因此，曲妥珠單抗 HC Asp102 之單一天門冬胺酸鹽異構化不應影響 PK。
藉由
IE-HPLC
測得之
FDC
藥品之波峰
9-10
的總和
FDC 藥品 之波峰 9-10 之總和係由 HC Asp102 單異構化至 琥珀醯亞胺 (在一條重鏈處) 的曲妥珠單抗構成，且不展示與帕妥珠單抗電荷變異體之重疊。另外，在該等波峰中檢測到低程度之曲妥珠單抗 Fc 氧化。因程度較低，故預計並無影響。因琥珀醯亞胺 (波峰 9-10 之總和) 與波峰 8 (iso-Asp) 及波峰 7 (Asp) 處於平衡中，故其經由波峰 8 及波峰 7 之接受準則 來間接控制。
因此，在控制系統中波峰 9-10 之總和無需接受準則。
實例
16: FDC
組成物之產生
將帕妥珠單抗 SC 藥物物質自藥物物質儲存容器轉移至經蒸汽滅菌之不銹鋼調配器皿中。可組合多個帕妥珠單抗 SC 藥物物質批次以供藥品製造。
基於添加至調配器皿中之帕妥珠單抗的量 (取決於所轉移之帕妥珠單抗 SC 藥物物質質量、密度及帕妥珠單抗含量)，定義曲妥珠單抗之標靶量 (例如在維持劑量中為 1:1 API 比率)。然後將曲妥珠單抗 SC 藥物物質添加 (基於密度及曲妥珠單抗含量) 至調配器皿中。可組合多個曲妥珠單抗 SC 藥物物質批次以供 FDC 藥品製造。
基於添加至調配器皿中之帕妥珠單抗 SC 藥物物質及曲妥珠單抗 SC 藥物物質的體積 (取決於質量及密度)，將所需量之解凍 rHuPH20 添加至調配器皿中 (基於 rHuPH20 溶液含量及活性)。可組合多個 rHuPH20 批次以供藥品製造。
在將所有組分皆轉移至調配器皿中之後，然後藉由混合將溶液均質化。
實例
17:
用以測定
FDC
含量之
RP-UPHLC
測定的研發
設備
可使用等效儀器及適當操作條件。
HPLC 系統： 配備有資料獲取軟體之 HPLC 系統 (具有在線真空除氣器)
檢測器： UV/可見光吸光度檢測器或光二極體陣列檢測器
膜過濾器： 0.2 μm 過濾器 (例如 Corning 目錄號：430049)
管柱： TSK-Gel G3000SWXL, 7.8 × 300 mm, 5 μm (Tosoh Bioscience，目錄號：08541)；或 BioSuite 250, 7.8 × 300 mm, 5 μm (Waters，目錄號：186002165)
試劑純化水 (經 Milli-Q 處理之水)
三氟乙酸 (TFA) (Fluka, Cat. Nr. 40967)
乙腈 (Merck, Cat. Nr. 1.00030.2500)
無水 L-組胺酸 (Sigma, Cat. Nr. H8000)
蔗糖 (Merck, Cat. Nr. 1.07687)
L-甲硫胺酸 (Sigma, Cat. Nr. 64319)
冰乙酸 (Merck.Cat. Nr. 1.00063.1000)
聚山梨醇酯 20 (Sigma, Cat. Nr. 93773)
溶劑 A： 於 Milli-Q 水中之 0.1 % TFA
溶劑 B： 於乙腈中之 0.1% TFA
製劑緩衝液： 20 mM 乙酸組胺酸、240 mM 蔗糖、10 mM 甲硫胺酸及聚山梨醇酯 20，0.02 % [w/v]，pH 5.7 ± 0.2
稀釋緩衝液： 20 mM 乙酸組胺酸，pH5.5
管柱儲存溶液： 60% 乙腈 (v/v)
樣品溶液： 使用製劑緩衝液將樣品稀釋至大約 10 mg/mL。使用稀釋緩衝液將 10 mg/mL 測試樣品溶液稀釋至大約1 mg/mL。
空白： 未經稀釋即注入製劑緩衝液及稀釋緩衝液 。
流速： 0.4 mL/min
最大壓力： 400巴 / 6000 psi
波長： 280 nm
運行時間： 29 min
管柱溫度設置： 60°C
自動採樣儀溫度設置： ≤ 10℃
注入量： 樣品及參考標準品：25 μg 蛋白質 (標稱) 空白及移動相：注入體積與參考標準相同
梯度
| 時間 (分鐘) | 溶劑 A ( % ) | 溶劑 B(%) |
| 0.0 | 64 | 36 |
| 2.0 | 64 | 36 |
| 20.0 | 40 | 60 |
| 20.5 | 5 | 95 |
| 21.0 | 5 | 95 |
| 22.0 | 64 | 36 |
| 29.0 | 64 | 36 |
儘管使用此方法可充分分離帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之波峰，但上述方法之主要遺留問題變得較為明顯。在注入 5 個空白樣品 (製劑緩衝液) 之後，仍可檢測到痕量 Herceptin /帕捷特。因此，需要進一步研發方法。測試不同層析技術且選擇反相層析 (RPC) 作為用於蛋白質含量分析之最適宜方法。針對方法準確度及重複性評估多個參數。
管柱類型對分離之影響
針對帕妥珠單抗/曲妥珠單抗 FDC 測試不同類型之管柱。
表
11
：經測試用於
RP-UHPLC
蛋白質含量方法之管柱、其所測試各別溫度
| 柱 | 管柱溫度[℃] | 解析度 |
| BEH300 C4 | 70 | -- |
| 80 | + | |
| 90 | ++ | |
| Agilent AdvanceBio RP mAb Diphenyl | 70 | -- |
| 80 | + | |
| 90 | ++ | |
| Zorbax 300SB C3 | 70 | + |
| 80 | ++ | |
| Poroshell 300 SB-C8 | 70 | -- |
| 80 | - | |
| 90 | - | |
| Hamilton PRP | 70/80/90 | --- |
| Baker Wide Pore C4 | 70/80/90 | -- |
| Baker Wide Pore C18 | 70/80 | --- |
| Grace Aquapore RP-300 | 70/80/90 | - |
| Agilent PLRP-S 300 | 80/90 | + |
| Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl | 70 | +++ |
| 80 | ++ | |
| 90 | ++ |
發現用於帕妥珠單抗/曲妥珠單抗 FDC 之若干潛在管柱。舉例而言，BEH300C4 展示良好分離，但需要高管柱溫度 (90℃)。Agilent AdvanceBio
RP mAb 與 Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl 具有類似分離，但整體拆分度較低。經測定，最適宜管柱為 Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl (2.1 × 100 mm) 管柱，其與初始方法相比展現低殘留且改良了兩種抗體之分離。
Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl
管柱之
DoE (
實驗設計
)
在 Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl (2.1 × 100 mm) 管柱上測試移動相、流速、梯度及管柱室溫度。使用 MODDE® 設定用於研發反相蛋白質含量方法之 DoE。在 DoE 範圍內測試之因素的匯總列示於表 12 中。
表
12
：經測定用於
DoE
篩選之各種因素。
| 名稱 | 縮寫 | 單位 | 類型 | 設置 | 精度 |
| 流動 | 流動 | mL/min | 定量 | 0.6-0.8mL/min | 0.005mL/min |
| 溫度 | 溫度 | ℃ | 定量 | 70-90℃ | 0.5℃ |
| 保持時間 | 保持 | Min | 定量 | 0-3min | 0.05min |
| 梯度 | Grad | Min | 定量 | 10-20min | 0.3min |
| 開始 | 開始 | %B | 定量 | 20-30%B | 0.05%B |
「曲妥珠單抗
/
帕妥珠單抗之拆分」的評估：
總而言之，用於蛋白質含量測定之反相層析方法的拆分度受流速及梯度長度強烈影響。較低流速及較長梯度長度可改良拆分度。管柱室溫度及起始條件對方法具有較弱但不顯著之影響。70℃ 之溫度及 30 % B 之相對較高起始條件已證實可產生最佳結果。增加額外保持時間對拆分度並無效應。
「次要形式之總和」的評估：
次要形式之總和高度取決於起始濃度 (高) 及管柱溫度 (低)。流速及梯度時間僅具有微小影響。單獨之保持時間無足輕重，但在與流速及管柱溫度組合後展示一定效應。
「曲妥珠單抗高度比」之評估：
為達成較高高度比 (亦即曲妥珠單抗主峰無額外肩部)，必須降低溫度。流速分析並不明確。梯度時間及起始條件理想地應處於較高範圍內。同樣，額外保持時間並不展示效應。
「帕妥珠單抗
USP
拖尾」之評估：
為減小帕妥珠單抗主峰之拖尾，應增加流速且降低梯度以及起始條件。同樣，額外保持時間並不展示效應。
根據 DoE 結果，選擇下列參數：
流速：0.8 mL/min
波長：280 nm
管柱溫度：70°C
自動採樣儀溫度：10℃
運行時間：20 min
表
13
：
DoE
梯度
| 時間 [min] | %B |
| 0 | 30 |
| 20 | 50 |
| 25 | 90 |
| 26 | 30 |
| 30 | 30 |
基於該等結果，進一步最佳化管柱溫度、梯度及流速。
管柱溫度對分離之影響
反相層析中之高溫可對波峰分離、拖尾效應及系統壓力具有顯著效應。選擇三個不同溫度以在 Agilent Zorbax RRHD 300 Diphenyl 管柱上進行測試。溫度測試係在 DoE 範圍內執行 (結果未展示)。總而言之，隨著管柱室溫度之升高，滯留時間移向較早沖提。此係預料之中的，此乃因沖提劑黏度及二級管柱相互作用隨著溫度升高而降低。然而，隨著管柱室溫度升高，整體拆分度有所降低。因此，實驗範圍內之最適宜管柱室溫度為 70℃。
梯度型態對分離之影響
梯度對分析物分離具有顯著影響。對於藉由反相層析測定蛋白質含量而言，在 Agilent Zorbax RRHD 300 Diphenyl 管柱上測試 4 個主要梯度 (參見表 14)。為直接比較梯度，始終將管柱室溫度設定於 70℃ 且將流速設定於 0.6 mL/min。在最終流速已設定後，必須再評價梯度。RP 蛋白質含量方法之最終梯度列示於表 14 之梯度 5 中。改變初始 DoE 梯度 (表 13) 以使用新流速 (0.3 mL/min) 達成最佳分離及平衡時間。
表
14
：所篩選
5
個梯度之型態。使用
0.6 mL/min
之流速篩選梯度
1-4
，而使用一半流速
(0.3 mL/min)
篩選梯度
5
。
| 梯度 1 | 梯度 2 | 梯度 3 | 梯度 4 | 梯度 5 | |||||
| 時間 [min] | %B | 時間 [min] | %B | 時間 [min] | %B | 時間 [min] | %B | 時間 [min] | %B |
| 0 | 30 | 0 | 20 | 0 | 20 | 0 | 30 | 0 | 30 |
| 10 | 50 | 3 | 20 | 20 | 50 | 3 | 30 | 15 | 45 |
| 15 | 90 | 13 | 50 | 25 | 90 | 23 | 50 | 20 | 90 |
| 16 | 30 | 18 | 90 | 26 | 20 | 28 | 90 | 21 | 30 |
| 21 | 30 | 19 | 20 | 31 | 20 | 29 | 30 | 30 | 30 |
| 24 | 20 | 34 | 30 |
觀察：
所有 5 個測試梯度皆展示充分蛋白質滯留及精選之起始條件 (介於 20-30% B 之間)。此範圍內之任何起始條件皆適用於帕妥珠單抗/曲妥珠單抗 FDC 分離。然而，為縮短梯度及運行時間，選擇 30% 之起始條件。考慮梯度時間，所測試範圍 (10-20 min) 係精選的。因梯度時間亦由流速顯著影響，故最終選擇在 0.3 mL/min 之流速下 15 min 的分離時間。
使用 10-分鐘分離時間、尤其使用 30% B 之梯度陡度，兩種抗體皆在僅 1-2 分鐘之窗口內沖提出。然而，20-分鐘分離及 20% B 梯度陡度會產生較寬沖提型態及較小強度之檢測器訊號。
將最終 15 min 分離時間與 15% B 梯度陡度組合。與緩慢流速 (0.3 mL/min) 一起，其展示兩種抗體之良好基線分離 且並不損失過多訊號強度。
流速對分離之影響
最後，必須測定最適宜流速。較迅速流速通常意味著較早沖提，但可損失拆分度。使用 0.6 或 0.8 mL/min 之流速執行初始實驗。隨後發現，較低流速更有益於此特定 RP 蛋白質含量方法。在 Agilent Zorbax RRHD 300 Diphenyl 管柱上使用含有單一 mAb之樣品測試四個不同流速(0.3 mL/min 至 0.6 mL/min)。為直接比較，將管柱室溫度始終設定於 70℃ 且使用表 13 中所列示之梯度較小所有分離。
降低流速會產生較窄波峰形及較高訊號強度。滯留時間位向較晚沖提。拆分 (尤其針對側峰) 隨著流速降低而改良，因此，對於此方法而言，0.3 mL/min 之流速較為理想。將梯度運行時間設定於 30 min 且在 0.3 mL/min 下展示充分之管柱再平衡。
基於該等實驗發現，此方法之最關鍵參數為管柱類型、管柱溫度及流速。使用基於苯基之管柱可改良拆分度且並無殘留問題。測試 64℃-76℃ 及 66℃-74℃ 之溫度且其對方法性能並無顯著影響。在 III 期及 BLA/MAA 方法驗證之穩健性實驗的範圍內，測試 0.4 mL/min 及 0.2 mL/min 之流速且發現其對方法性能並無顯著影響。
實例
18:
用以測定
FDC
中之含量之
RP-UPHLC
測定
註：可使用等效儀器、適當操作條件及具有等效品質之溶劑、化學品及試劑。
藉由 RP-UHPLC 使用 UV 檢測來測定 FDC 藥品中之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的含量。帕妥珠單抗及曲妥珠單抗係基於其疏水性差異來分離。自外部校準曲線為計算帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之各別含量，該外部校準曲線係在每一分析序列中藉由注入不同體積之 FDC 參考標準品所生成。將相同方法應用於 FDC 藥品 LD 及 MD。針對相應參考標準品測量每一劑型。
設備及材料
配備有 UV 檢測器之 UHPLC 系統 (Thermo Ultimate 3000 RS 或等效系統)
UHPLC 管柱 (Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl, 2.1 mm × 100 mm，粒度：1.8µm 或等效粒度)
試劑
2-丙醇
乙腈
TFA
無水 L-組胺酸
L-組胺酸單鹽酸鹽單水合物
蔗糖
海藻糖
L-甲硫胺酸
聚山梨醇酯 20
氫氧化鈉
鹽酸
純化水 (例如 MilliQ)
溶液
藥物產物稀釋緩衝液
20 mM L-組胺酸/L-組胺酸單鹽酸鹽、105 mM 海藻糖、100 mM 蔗糖、10 mM 甲硫胺酸、0.04% (w/v) 聚山梨醇酯 20，pH 5.5 ±0.2
移動相 A
2% (v/v) 2-丙醇、0.1% (v/v) TFA/水
移動相 B
70% (v/v) 2-丙醇、20% (v/v) 乙腈、10% (v/v) 移動相 A
參考標準品溶液之製備
註：為測量 FDC 藥品 LD 及 MD 樣品，必須分別製備 FDC LD 參考標準品及 FDC MD 參考標準品。必須一式兩份來製備各別參考溶液 (參考 A 溶液及參考 B 溶液)。使用藥品稀釋緩衝液將各別參考標準品稀釋至總蛋白質濃度為 1 mg/mL。
樣品溶液之製備
使用藥品稀釋緩衝液稀釋 FDC 藥品以製備含有 1 mg/mL 之總蛋白質濃度的樣品溶液。
程序
在注入第一樣品之前，使用 70% 移動相 A/30% 移動相 B 沖洗管柱直至獲得穩定基線為止。視情況，注入用於管柱條件化目的之參考溶液直至層析圖的目測評估顯示至少兩個連續注入具有連續型態為止。
操作參數
檢測波長：280 nm
注入體積：參見下文之注入方案
流速：0.3 mL/min
管柱溫度：70℃ ±2℃
自動採樣儀溫度：10°C ±4°C
運行時間：30 min
梯度
表
15
：二元梯度
| 時間 (min) | 移動相 A ( % ) | 移動相 B ( % ) |
| 0 | 70 | 30 |
| 15 | 55 | 45 |
| 20 | 10 | 90 |
| 21 | 70 | 30 |
| 30 | 70 | 30 |
注入方案
對於每一劑型，必須使用相應參考標準品執行單獨序列。按表 16 中所展示之順序來注入樣品。
表
16
：注入方案
| 樣品類型 | 說明 | 注入體積 (μL) |
| 空白試樣 | 藥品稀釋緩衝液 | 10 |
| 標準曲線 | 參考 A 溶液 | 6 |
| 參考 A 溶液 | 8 | |
| 參考 A 溶液 | 10 | |
| 參考 A 溶液 | 12 | |
| 參考 A 溶液 | 14 | |
| 測定對照 | 參考 B 溶液 | 10 |
| 樣品 | 樣品溶液 (1 至 n) | 10 |
| 測定對照 | 參考 B 溶液 | 10 |
| 空白試樣 | 藥品稀釋緩衝液 | 10 |
| 注意：對於 10 個以上樣品而言，將每 10 個樣品注入液與對照溶液置於一起 (參考 B)。 |
結果
典型層析型態展示於圖 15 (FDC 藥品 LD) 及圖 16(FDC 藥品 MD) 中。
使用最終方法 (實例 18)，可實質性改良初始蛋白質含量方法，包括改良整體拆分/波峰分離並消除樣品殘留，亦即在後續分析中殘留不超過 0.2 %。另外，最終方法容許對維持劑量及負載劑量中之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗進行定量蛋白質含量測定。基於苯基之不同 RP 管柱展示關於兩種抗體之改良的特異性，僅檢測到少量樣品殘留且容許準確地測定蛋白質含量。用於測定帕妥珠單抗 /曲妥珠單抗 FDC 中之蛋白質含量的最終反相 U-HPLC 方法在 70℃ 下於基於苯基之反相管柱 (Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl) 上使用水 – 2-丙醇/乙腈梯度及 0.1% TFA 來分離兩種分子。
圖 15 繪示用以分析 FDC LD 參考標準品之蛋白質含量的實例性 RP-UHPLC 層析圖，圖 16 繪示用以分析 FDC MD 參考標準品之蛋白質含量的實例性 RP-UHPLC 層析圖。
資料分析
對參考 A 及 B溶液及樣品溶液之層析圖中之帕妥珠單抗及曲妥珠單抗波峰進行積分。藉助圖 15 (FDC 藥品 LD) 及圖 16 (FDC 藥品 MD) 中之代表性層析圖來定義積分。
藉由將波峰面積對每一標準等級之注入量 (µg) 繪圖來生成每一抗體的標準曲線。使用線性回歸擬合標準曲線資料。勿強制曲線穿過零。
使用標準曲線方程式且使用每一樣品溶液及參考 B 注入之各別波峰面積，計算帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之量。
斜率校準曲線
為計算帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之含量，將該量除以各別注入體積並乘以稀釋因子。
實例
19:
用以測定
FDC
中之含量的
HI-HPLC
評估疏水性相互作用層析 (HI-HPLC)。HI-HPLC 係用於用於分析抗體、尤其用以鑑別其分子變異體 (例如轉譯後修飾或抗體-藥物結合物質) 之常用方法。另外，可鑑別錯誤摺疊之蛋白質或構形變化，此乃因 HI-HPLC 為非變性層析方法。
與 RP-UHPLC 相比，HI-HPLC 之主要差異如下：
HI-層析係非破壞性且蛋白質保持摺疊
因天然蛋白質摺疊，蛋白質-管柱相互作用僅源自位於蛋白質表面上之胺基酸。
沖提不能藉由增加有機溶劑濃度來促進，但可藉由降低例如硫酸銨之量以弱化蛋白質與固定相之間的疏水性-疏水性相互作用來促進。因此，疏水性較小之物質較早沖提出。
測試用於 HIC-HPLC 之兩種管柱：
- TSKgel Ether 管柱，75 mm × 7.5 mm，10 μm 粒度
- TSKgel Butyl 管柱，35 mm × 4.6 mm，2.5 μm 粒度
移動相測試：
-沖提劑 A：50 mM 磷酸鈉，pH 7.0 ± 0.05，5 % (v/v) 乙醇
-沖提劑 B：50 mM 磷酸鈉、2 M硫酸銨，pH 7.0 ± 0.05
結果：
HI-HPLC 能夠使用任一管柱類型分離帕妥珠單抗/曲妥珠單抗 FDC 之分子。對於共調配樣品而言，Butyl 管柱之拆分度遠優於 Ether 管柱(資料未展示)。就 RP-UHPLC 及 HI-HPLC 對比 (尤其用於蛋白質含量分析) 而言，RPUHPLC 優於 HI-HPLC。HI-層析可分離兩種抗體，但缺乏整體拆分且展示明顯拖尾效應。
反相層析較 HI-HPLC 可改良帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之拆分。特定而言，帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之肩峰在 RPC 上的拆分優於 HIC。另外，RPC 中所產生之水平基線優於 HIC 中之傾斜基線。另外，較高 –低鹽梯度，在 HPLC 系統上更易於使用水-有機溶劑梯度。
表
18
：用於
HI-HPLC
測試方法之工作條件及
HIC
梯度
| 流速 | 0.5mL/min | |
| 最大壓力 | 20bar/290psl | |
| 波長 | 214min | |
| 運行時間 | 55min | |
| 管柱溫度 | 25℃ ±3℃ | |
| 樣品溫度 | 5℃ ±3℃ | |
| 樣品濃度 | n.a. | |
| 注入體積 | 10μL | |
| 梯度 | 分鐘 | % 沖提劑 B |
| 0 | 70 | |
| 5 | 70 | |
| 35 | 0 | |
| 40 | 0 | |
| 45 | 70 | |
| 55 | 70 |
儘管本發明之某些實施例已展示及描述於本文中，但熟習此項技術應理解者，該等實施例僅係藉由實例方式提供。熟習此項技術者將構想出諸多變化、改變及取代，此並不背離本發明。應理解，本文所描述之本發明實施例的各種替代形式可用於實踐本發明。下列申請專利範圍意欲界定本發明範圍，且意欲由此涵蓋該等申請專利範圍及其等效形式之範圍內的方法及結構。
圖 1 提供 HER2 蛋白結構之示意圖及其細胞外域之域 I-IV 的胺基酸序列 (分別為 SEQ ID No.1-4)。
圖 2A 及 2B 繪示以下胺基酸序列的比對：鼠類單株抗體 2C4 之可變輕鏈 (V
L) (圖 2A) 及可變重鏈 (V
H) (圖 2B) 域 (分別為 SEQ ID No. 5 及 6)；變異體 574/帕妥珠單抗之 V
L及 V
H域 (分別為 SEQ ID NO.7 及 8)；及人類 V
L及 V
H共有框架 (hum κ1，輕鏈 κ 子組 I；humIII，重鏈子組 III) (分別為 SEQ ID No. 9 及 10)。星號指示帕妥珠單抗與鼠類單株抗體 2C4 之可變域之間或帕妥珠單抗與人類框架之可變域之間的差異。互補決定區 (CDR) 位於方括號中。
圖 3A 及 3B 展示帕妥珠單抗輕鏈 (圖 3A；SEQ ID NO. 11) 及重鏈 (圖 3B；SEQ ID No. 12) 之胺基酸序列。以粗體展示 CDR。輕鏈及重鏈之計算分子質量為 23,526.22 Da 及 49,216.56 Da (半胱胺酸呈還原形式)。碳水化合物部分附接至重鏈之 Asn 299。
圖 4A 及 4B 分別展示曲妥珠單抗輕鏈 (圖 4A；SEQ ID NO. 13) 及重鏈 (圖 4B；SEQ ID NO. 14) 之胺基酸序列。可變輕鏈及可變重鏈域之邊界由箭頭指示。
圖 5A 及 5B 分別繪示變異帕妥珠單抗輕鏈序列 (圖 5A；SEQ ID NO. 15) 及變異帕妥珠單抗重鏈序列 (圖 5B；SEQ ID NO. 16)。
圖 6 繪示 HER2 細胞外域及可用於本文所描述之 ELISA 測定中之捕獲試劑的示意圖。P-HER2 變異體：用於分析帕妥珠單抗效力之經修飾 HER2 ECD。T-HER2 變異體：用於分析曲妥珠單抗效力之經修飾 HER2 ECD。
圖 7A 及 7B 繪示基於細胞之測定的選擇性敏感性。圖 7A：使用 MDA-MB-175 VII 細胞之帕妥珠單抗抗增殖測定。圖 7B：使用 BT-474 細胞之曲妥珠單抗抗增殖測定。
圖 8A 及 8B 繪示在基於細胞之抗增殖測定中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的互補機制。圖 8A：帕妥珠單抗抗增殖測定：在以 1:1 比率添加曲妥珠單抗後，劑量-反應曲線移向較低濃度。圖 8B：曲妥珠單抗抗增殖測定：在以 1:1 比率添加帕妥珠單抗後，劑量-反應曲線輕微移向較低濃度。
圖 9A 及 9B 繪示基於細胞之抗增殖測定的遮蔽效應。圖 9A：帕妥珠單抗抗增殖測定：帕妥珠單抗突變體 (HC S55A) 與 HER2 之親和力大大減小 (實心符號)；在添加曲妥珠單抗後帕妥珠單抗突變體親和力損失得以遮蔽 (空心符號)。圖 9B：曲妥珠單抗抗增殖測定： 曲妥珠單抗突變體 (LC H91A) 與 HER2 之親和力大大減小 (實心符號)；在添加帕妥珠單抗後曲妥珠單抗突變體親和力損失得以遮蔽 (空心符號)。
圖 10 繪示帕妥珠單抗 ELISA 之代表性劑量-反應曲線。
圖 11 繪示曲妥珠單抗 ELISA 之代表性劑量-反應曲線。
圖 12 展示所提供 IEC 方法之代表性層析圖，其用於分析帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 電荷變異體。
圖 13 繪示帕妥珠單抗-曲妥珠單抗 FDC 藥品、帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之 IE-HPLC 層析圖。
圖 14 A 及圖 14B 展示 ELISA 中之 HER2 親和突變體。圖 14A：帕妥珠單抗 ELISA：帕妥珠單抗突變體 (HC S55A) 與 HER2 之結合活性 (空心符號) 遠小於帕妥珠單抗 (實心符號)。圖 14B：曲妥珠單抗 ELISA：曲妥珠單抗突變體 (LC H91A) 與 HER2 之親和力 (空心符號) 遠小於曲妥珠單抗 (實心符號)。
圖 15 繪示用以分析 FDC LD 參考標準品之蛋白質含量的實例性 RP-UHPLC 層析圖。
圖 16 繪示用以分析 FDC MD 參考標準品之蛋白質含量的實例性 RP-UHPLC 層析圖。
<![CDATA[<110> 美商建南德克公司(GENENTECH, INC.)]]>
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 (F. HOFFMANN-LA ROCHE AG)
<![CDATA[<120> 用於固定劑量組合之測定]]>
<![CDATA[<130> P36263-WO]]>
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<![CDATA[<170> PatentIn 3.5 版]]>
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Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg
195
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Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr
1 5 10 15
Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His
20 25 30
Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu
35 40 45
Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser
50 55 60
Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr
65 70 75 80
Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu
85 90 95
Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln
100 105 110
Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val
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Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr
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Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser
20 25 30
Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr
35 40 45
Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu
50 55 60
Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp
65 70 75 80
Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His
85 90 95
Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu
100 105 110
Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His
115 120 125
His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu
130 135 140
Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu
145 150 155 160
Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala
165
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Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr
1 5 10 15
Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu
20 25 30
Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg
35 40 45
His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val
50 55 60
Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr
65 70 75 80
Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro
85 90 95
Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala
100 105 110
Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp
115 120 125
Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
130 135 140
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Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Arg Ile Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
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Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
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Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
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Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile
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Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
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370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
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Gly
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> MISC_FEATURE]]>
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<![CDATA[<223> 註=「序列中所給出之殘基對於該位置之注釋中的殘基並無偏好」]]>
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Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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260 265 270
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305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
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340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
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Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
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65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
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100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
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Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn
500 505 510
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp
515 520 525
Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp
530 535 540
Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn
545 550 555 560
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys
675 680 685
Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys
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Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe
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Ser Arg Thr Pro Gly
725
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<![CDATA[<220>]]>
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Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Leu Glu Ser Thr
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Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro
35 40 45
Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val
50 55 60
Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu
65 70 75 80
Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala
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100 105 110
Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn
115 120 125
Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly
130 135 140
Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile
165 170 175
Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu
180 185 190
Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys
195 200 205
Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu
210 215 220
Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu
225 230 235 240
Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro
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Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile
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Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly
325 330 335
Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr
340 345 350
Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala
355 360 365
Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala
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Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro
385 390 395 400
Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr
405 410 415
Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser
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Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly
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Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu
450 455 460
Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn
465 470 475 480
Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg
485 490 495
Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu
500 505 510
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Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val
545 550 555 560
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
565 570 575
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
580 585 590
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Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu
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Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser
725 730 735
Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser
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Arg Thr Pro Gly
755
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<![CDATA[<400> 27]]>
Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg
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Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Leu Glu Ser Thr
20 25 30
Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro
35 40 45
Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val
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Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro
245 250 255
Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile
260 265 270
Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe
275 280 285
Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys
290 295 300
Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys
305 310 315 320
Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly
325 330 335
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340 345 350
Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala
355 360 365
Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala
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Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro
385 390 395 400
Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr
405 410 415
Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser
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Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly
435 440 445
Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu
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Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln
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Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr
1 5 10 15
Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser
20 25 30
Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr
35 40 45
Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu
50 55 60
Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp
65 70 75 80
Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His
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Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu
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Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His
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His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu
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Asp Glu Cys Val
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Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
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Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
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Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
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His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
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Pro Gly
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Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
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Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
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Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
35 40 45
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
50 55 60
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
65 70 75 80
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
85 90 95
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
100 105 110
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
115 120 125
Claims (57)
- 一種用於兩種抗 HER2 抗體的固定劑量組合 (FDC) 之結合測定，其包含： a. 將該 FDC 與包含經修飾之 HER2 ECD 次域的捕獲試劑接觸； b. 將樣品與可檢測抗體接觸； c. 使用該可檢測抗體的檢測手段來定量與該捕獲試劑結合的抗體的量。
- 如請求項 1 之結合測定，其中該固定劑量組合包含與 HER2 細胞外次域 II 結合的抗體及與 HER2 細胞外次域 IV 結合的抗體。
- 如請求項 1 或 2 中任一項之結合測定，其中對與 HER2 細胞外次域 II 結合的抗體之結合進行定量。
- 如請求項 1 至 3 之結合測定，其中該捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 II。
- 如請求項 4 之結合測定，其中該捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 23。
- 如請求項 1 至 5 中任一項之結合測定，其中該捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 I、II、III。
- 如請求項 6 之結合測定，其中該捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 24。
- 如請求項 3 至 6 中任一項之結合測定，其中該捕獲試劑不包含 HER2 次域 IV。
- 如請求項 1 或 2 中任一項之結合測定，其中對與 HER2 次域 IV 結合的抗體之結合進行定量。
- 如請求項 9 之結合測定，其中該捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 IV。
- 如請求項 10 之結合測定，其中該捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 28。
- 如請求項 9 至 11 中任一項之結合測定，其中該捕獲試劑不包含 HER2 次域 II。
- 如請求項 9 至 12 中任一項之結合測定，其中該捕獲試劑包含重組 HER2 細胞外域 I、III、IV 及 EGFR 之域 II。
- 如請求項 9 至 13 中任一項之結合測定，其中該捕獲試劑包含 SEQ ID NO: 29。
- 如前述請求項中任一項之結合測定，其用於分析該等抗 HER2 抗體中之一者的效力。
- 如請求項 15 之結合測定，其中藉由將與該捕獲試劑結合的抗體的量與在基於細胞的測定中測量的分離抗體的生物活性相關聯來定量效力。
- 如前述請求項中任一項之結合測定，其中該捕獲試劑是塗布於微孔盤上。
- 如前述請求項中任一項之結合測定，其中該可檢測抗體靶向該抗 HER2 抗體之 F(ab’)2 部分。
- 如前述請求項中任一項之結合測定，其中該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。
- 一種經分離的蛋白質，其包含 SEQ ID NO: 24。
- 一種經分離的蛋白質，其包含 SEQ ID NO: 29。
- 一種套組，其用於在與 HER2 細胞外次域 II 結合的第一抗體及第二抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 中特異性定量與 HER2 細胞外次域 II 結合的抗體之結合，該套組包含： a. 容器，其含有作為捕獲試劑之蛋白質，該蛋白質包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 及 SEQ ID NO: 34， b. 關於定量與 HER2 細胞外次域 II 結合的抗體之該結合的說明。
- 一種套組，其用於在與 HER2 細胞外次域 IV 結合的抗體及第二抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 中特異性定量與 HER2 細胞外次域 IV 結合的抗體之結合，該套組包含： a. 容器，該容器含有作為捕獲試劑之蛋白質，該蛋白質包含 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID NO: 4 b. 關於定量與 HER2 細胞外次域 IV 結合的抗體之該結合的說明。
- 一種評估包含帕妥珠單抗(Pertuzumab)及曲妥珠單抗(Trastuzumab)的固定劑量組成物之方法，該方法包含： a. 使用加載緩衝液將抗體與離子交換材料結合，其中該加載緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.65 之間； b. 以沖提緩衝液沖提該等抗體，其中該沖提緩衝液的 pH 為約 pH 7.5 至約 pH 7.7 之間。
- 如請求項 24 之方法，其中該離子交換材料為陽離子交換材料。
- 如請求項 25 之方法，其中陽離子交換層析材料為強陽離子交換材料。
- 如請求項 25 或 26 之方法，其中該陽離子交換材料包含磺酸基。
- 如請求項 24 至 27 中任一項之方法，其中步驟 b 以鹽梯度進行。
- 如請求項 24 至 28 中任一項之方法，其中該沖提緩衝液包含鈉。
- 如請求項 24 至 29 中任一項之方法，其中該沖提緩衝液包含氯化鈉。
- 如請求項 24 至 30 中任一項之方法，其另外包含下列步驟 c. 選擇性檢測該組成物中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的電荷變異體。
- 如請求項 24 至 31 中任一項之方法，其中該方法於 32 至 40℃ 之溫度進行。
- 如請求項 24 至 32 中任一項之方法，其中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。
- 一種製造所提供之組成物之方法，其包含：(1) 生產固定劑量組成物，該固定劑量組成物包含帕妥珠單抗、曲妥珠單抗及其一個或多個變異體，及 (2) 使如此生產的該組成物進行分析測定以評估該 (等) 變異體的量，其中該 (等) 變異體包含： (i) 於 HC-Asn-391 脫醯胺的帕妥珠單抗、帕妥珠單抗 FC 唾液酸變異體、及帕妥珠單抗離胺酸醣化變異體，(ii) 帕妥珠單抗天然抗體，(iii) 曲妥珠單抗天然抗體，(vi) 具有於一條重鏈處將 HC-Asp-102 單異構化為異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
- 如請求項 35 之方法，其中該分析測定為如請求項 24 至 33 中任一項之測定。
- 如請求項 34 或 35 之方法，其中該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。
- 如請求項 34 至 36 中任一項之方法，其中該組成物包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 至 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
- 一種包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其包含少於 23% 之酸性帕妥珠單抗變異體，該等酸性帕妥珠單抗變異體選自 HC-Asn-391 之脫醯胺、Fc 唾液酸及離胺酸醣化，及於 LC-Asn-30 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體和於 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體；至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體；至少 16% 之曲妥珠單抗天然抗體；及少於 12% 之具有於一條重鏈處將 HC-Asp-102 單異構化為異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
- 如請求項 38 之組成物，其包含少於 23% 之酸性帕妥珠單抗變異體，該等酸性帕妥珠單抗變異體選自 HC-Asn-391 之脫醯胺、Fc 唾液酸及離胺酸醣化，及於 LC-Asn-30 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體及於 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體；至少 38% 之帕妥珠單抗天然抗體；至少 16% 之曲妥珠單抗天然抗體；及少於 9% 之具有於一條重鏈處將 HC-Asp-102 單異構化為異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
- 如請求項 38 之組成物，其包含少於 21% 之酸性帕妥珠單抗變異體，該等酸性帕妥珠單抗變異體選自 HC-Asn-391 之脫醯胺、Fc 唾液酸及離胺酸醣化，及於 LC-Asn-30 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體及於 HC-Asn-55 處脫醯胺的曲妥珠單抗變異體；至少 28% 之帕妥珠單抗天然抗體；至少 23% 之曲妥珠單抗天然抗體；及少於 12% 之具有於一條重鏈處將 HC-Asp-102 單異構化為異天冬胺酸的曲妥珠單抗。
- 一種包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗之組成物，其包含小於 23% 的波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 28% 的波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 16% 的波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 12% 的波峰 8 的波峰面積，如於請求項 24 至 33 之方法中所確定。
- 如請求項 41 之組成物，其包含小於 23% 的波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 38% 的波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 16% 的波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 9% 的波峰 8 的波峰面積，如於請求項 24 至 33 之方法中所確定。
- 如請求項 41 之組成物，其包含小於 21% 的波峰 1 至 3 之總和的波峰面積、至少 28% 的波峰 4 (帕妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積、至少 23 % 的波峰 7 (曲妥珠單抗天然抗體) 的波峰面積及小於 12% 的波峰 8 的波峰面積，如於請求項 24 至 33 之方法中所確定。
- 如請求項 38 至 43 中任一項之組成物，其另外包含 rHuPH20。
- 如請求項 38 至 44 中任一項之組成物，其包含 40 至 60 mg/mL 曲妥珠單抗及 60 至 80 mg/mL 帕妥珠單抗。
- 如請求項 38 至 45 中任一項之組成物，其可藉由下列步驟獲得 a. 將預定量的帕妥珠單抗添加到調配器皿中 b. 以 1:1 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例或以 1:2 的曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的比例添加曲妥珠單抗 c. 添加 rHuPH20。
- 一種分析兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 之蛋白質含量之方法，其包含 a. 提供 RP-HPLC phenyl 管柱 b. 將該兩種抗 HER2 抗體之固定劑量組合 (FDC) 裝載於 RP-HPLC 管柱上 c. 以 0.2 - 0.4 mL/min 的流速分離該兩種抗 HER2 抗體，其中管柱溫度為 64℃ 至 76℃。
- 如請求項 47 之方法，其中該固定劑量組合包含帕妥珠單抗及曲妥珠單抗。
- 如請求項 47 或 48 之方法，其中帕妥珠單抗及曲妥珠單抗的該固定劑量組合另外包含玻尿酸酶。
- 如請求項 47 至 49 中任一項之方法，其中該分離是以水-2-丙醇/乙腈梯度達成。
- 如請求項 47 至 50 中任一項之方法，其中該流速為約 0.3mL/min。
- 如請求項 47 至 51 中任一項之方法，其中該抗體經 10 至 20 分鐘分離。
- 如請求項 52 之方法，其中該抗體經 15 分鐘分離。
- 如請求項 52 或 53 之方法，其中該抗體以 0.3 mL/min 之流速經 15 分鐘分離。
- 如請求項 47 至 54 中任一項之方法，其中該管柱溫度為 70℃ +- 2℃。
- 如請求項 47 至 55 中任一項之方法，其中該 Phenyl (苯基) 管柱為選自由以下所組成之群組之管柱：Acclaim Phenyl (苯基)-1 (Dionex)、Pursuit® XRs Diphenyl (二苯基)、Pinnacle® Biphenyl (聯苯)、Zorbax® Eclipse® Plus Hexyl Phenyl (苯基)、Ascentis Phenyl (苯基) 及 Agilent AdvanceBio RP mAb Dipheny (二苯基) 和 Agilent Zorbax RRHD 300-Diphenyl (二苯基) 管柱。
- 基本上如上文所述之方法、套組及組成物。
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