NO302709B1 - Fremgangsmåte ved forbedret produksjon av et polypeptid i en vertscelle - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for å forbedre produksjon av et ønsket polypeptid i en vertscelle ved å identifisere DNA-sekvenser som er optimale for dannelse av proteinet eller,polypeptidet i en vertsorganisme som er transformert med disse DNA-sekvenser. Fremgangsmåten omfatter de trekk som er gitt i krav l's in-gress, og er særpreget ved de trekk som går frem av krav l's karakteriserende del. Mer spesielt omhandler oppfinnelsen identifikasjon av slike modifiserte DNA-sekvenser som er optimale for dannelse av humant somatomedin C ("SMC"). Oppfinnelsen omhandler også rekombinante DNA-molekyler og vertsorganismer særpreget ved disse DNA-sekvenser hvor fremstilling av de aktuelle proteiner med disse DNA-sekvenser og rekombinante DNA molekyler i de aktuelle vertsorganismer forbedrer produksjonen av humant SMC og andre proteiner av prokaryotisk og eukaryotisk opprinnelse.

BAKGRUNNEN FOR OPPFINNELSEN

Somatomedin C ("SMC") er en insulin-lignende vekstfaktor som synes å være det kritiske signalprotein for vevsvekst etter - sekresjon av veksthormon fra hypofysen.

Aminosyresekvensen til humant SMC ble rapportert av E. Rinderknecht og R.E. Humble J. Biol. Chem., 253,pp. 276976

(1978) . Det består av en enkelt polypeptidkjede på 70 aminosyrer kryssforbundet med tre disulfidbroer. Den utregne-de molekylvekt er 7649. SMC oppviser utstrakt homologi til proinsulin. F.eks. er SMC aminosyrene 1 til 2 9 homologe til insulin B-kjede og SMC aminosyrer 42-62 er homologe til insulin A-kjeden. Den forbindende kjede i SMC viser imidlertid ingen homologi til C-peptide av proinsulin og SMC har også et C-terminalt oktapaptid som ikke finnes i proinsulin.

SMC oppviser flere vekstfremmende effekter in vitro såsom stiumlering av DNA, RNA, protein og proteoglykansyntese (E. Rinderknecht og R.E. Humble, Proe. Nati. Acad. Sei USA, 73 pp 2365-69 (1976); B. Morell og E.R. Froesch, Eur. J. Clin. Invest., 3, pp. 119-123 (1973); E.R. Froesch et al. Adv. Mental. Disord., 8, pp. 211-35 (1975); A.E. Zingg og E.R. Froesch , Diabetologia 9, pp. 472-76 (1973); E.R. Froesch et al, Proe. Nati. Acad. Sei USA, 73, pp. 2904-08

(1976)). Det stimulerer også ornitin-dekarboksylase og celle-prolifirering (B. Morell og E.R. Froesch, supra: G.K.Haselbacher og R.E. Humble, J.Cell. Physiol., 88, pp. 239-46 (1976)). In vivo stimulerer SMC vekst i rotter gjort veksthormondefisiente med hypofysectomisering (E. Schoenle et al., Nature, 296, pp. 252-53 (1982)).

Lik vektshormoner er SMC til en viss grad artsspesifikke. Imidlertid kan SMC fra en art være biologisk aktivt i en

annen art som er lavere evolusjonsmessig. F.eks. antas humant SMC å være anvendelig ved å fremme vekst i kyr, griser og kyllinger. I laboratoriedyr har SMC vist vekst-sti-mulerende effekter lignende dem til naturlig humant veksthormon. Imidlertid er SMC antatt å være fordelaktig i forhold til humant veksthormon fordi SMC er en sentral overfører av vekstresponsen. ■ Imidlertid er den en mer-direkte regulator av vekst enn veksthormon.

I tillegg til SMCs bruk ved behandling av visse former vekstforstyrrelser såsom dvergvekst og muskelatropi, er det også anvendlig for å stimulere vevsvekst i spesielle områder såsom i forbindelse med leging av sår, skader og brukne ben.

SMChar imidlertid ikke oppfylt sitt kliniske potenstiale som en vevsvekststimulator fordi det er tilgjengelig kun i små mengder gjennom opprensking fra humant blod. Følgelig kreves andre metoder for å overvinne denne mangel på kom-ersielle og klinisk anvendelige mengder av SMC.

En slik tilnærming kunne innebefatte bruken av rekombinant DNA-teknologi for å danne SMC i vertsorganismer transformert med en DNA-sekvens som koder for dette. Imidlertid har denne fremgangsmåten ikke vist seg å være anvendelig ved fremstilling av store mengder SMC fordi ekspresjons-utbyttene av SMC i forskjellige E. coli vertsorganismer har vært for lav for å gi økonomisk anvendelige eller kommersielle mengder av SMC.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse løser ovenfor angitte problem ved å gi en mulighet til å identifisere DNA-sekvenser som er optimale for produksjon av SMC eller et hvert annet ønsket eukaryot- eller prokaryotprotein eller polypeptid i vertsorganismer transformert med disse DNA-sekvenser. De modifiserte DNA-sekvenser som velges ut, koder ved ekspresjon for disse proteiner, spesielt SMC i den foretrukne utfør-elsesform av oppfinnelsen, og tillater et effektivt høyt produksjonsnivå av disse i forskjellige vertsorganismer. Følgelig, ved hjelp av oppfinnelsen er det for første gang mulig å erholde optimale mengder av polypeptider, og spesielt slike som oppviser de vekststimulerende og over-førende aktiviteter til SMC i klinisk anvendelige mengder.

Som vil bli forstått fra følgende beskrivelse, er i den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen de nye DNA-sekvenser og rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen i stand til å dirigere produksjonen i passende vertsorganismer av store mengder SMC og SMC-lignende polypeptider. Disse polypeptider er så anvendelige i en mengde vekststimulerende og overførende aktiviteter i mennesker såvel som i kyr, griser og kyllinger.

Det vil følgelig forstås at et underliggende aspekt av oppfinnelsen er utførelsen av en fremgangsmåte for å iden tifisere DNA-sekvenser som er optimale for dannelse av SMC eller andre ønskede eukaryot- eller prokaryotproteiner eller polypeptider. Det andre underliggende aspekt av oppfinnelsen omhandler forskjellige nye DNA-sekvenser, rekombinante DNA-molekyler og vertsorganismer som tillater produksjon av disse proteiner og spesielt SMC og SMC-lignende polypeptider med forbedret utbytte.

Generelt skissert omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for å forbedre produksjonen av et ønsket eukaryot-eller prokaryotprotein eller polypeptid i en vertsorganisme transformert med en DNA-sekvens som koder for dette protein eller polypeptid stegene å erstatte en del av den N-terminalkodene ende av en DNA-sekvens som koder for et lett påviselig protein eller polypeptid, med en degenerert serie av DNA-sekvenser som koder for en del av den N-terminale ende av det ønskede eukaryot- eller prokaryotprotein eller polypeptid; uttrykke den resulterende serie av hybride DNA-sekvenser operativt forbundet til en ønsket ekspresjonskontrollsekvens•i en passende vertsorganisme; velge ut de spesielle hybride DNA-sekvenser som tillater optimal produksjon av det lett påviselige protein eller polypeptid, og anvende denne del av den N-terminale ende av disse utvalgte hybride DNA-sekvenser 'som koder for'den N-terminale del av det ønskede polypeptid eller protein, ved ekspresjonen av det ønskede polypeptid eller protein. Fremgangsmåten tillater fordelaktig optimal produksjon av det ønskede polypeptid eller protein.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser skjematisk en metode for fremstilling av en syntetisk DNA-sekvens som koder for f-Met-SMC og et plasmid pLc24muSMCDri inneholdende denne DNA-sekvens nedstrøms for sekvenser avledet fra y.- og en PL-promoter. Fig. 2 viser syntetiske nukleotidsekvenser (begge kjeder) av to fragmenter - SMC A (fragment A) og SMC B (fragment B) brukt i en utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for å forbrede en syntetisk DNA-sekvens som koder for f-Met-SMC. Fig. 2 viser også aminosyresekvensene av fragmentene SMC A og SMC B og de forskjellige oligo-nukleptidsekvenser 1-11, X, Y, og Z brukt for å fremstille disse fragmenter.

Fig. 3 viser skjematisk en fremgangsmåte for å fremstille plasmidene pUCmuSMC AQri, pUCmuSMC A 1-18 og pUCmuSMC 1-18. I sekvensen til den 512 ganger degenererte syntetiske linker angitt midt på fig. 3 betegner "N" alle fire basemu-ligheter, "P" angir puriner og "Y" angir pyrimidiner.

BESTE UTFØRELSESMODUS AV OPPFINNELSEN

For at oppfinnelsen heri beskrevet skal forstås fullsten-dig, angis følgende detaljerte beskrivelse.

I beskrivelsen anvendes de følgende uttrykk:

Nukleotid - En monomerenhet av DNA eller RNA som består av en sukkerenhet (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig .hetrosyklinsk base. Basen er bundet til sukkerenheten via det glykosidiske karbon (l'karbonet til pentosen). Denne kombinasjon av en base og et sukker er kalt et nukleosid. Hvert nukleosid er særpreget ved sin base. De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og tymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U").

DNA- sekvens - En lineær kjede av nukleotider bundet til hverandre ved fosfodiesterbindinger mellom 3'- og 5'-kar-bonene av hosliggende pentoser.

Codon - En DNA-sekvens på tre nukleotider (en triplet) som via mRNA koder for en aminosyre, et translasjonsstartssi-gnal eller et translasjonsstoppsignal.

Gen - En DNA-sekvens som via sitt templat eller budbringer (messenger) RNA ("mRNA") koder for en sekvens av aminosyrer som er særpreget for et spesielt polypeptid.

Transkripsion - Dannelsen av mRNA fra et gen.

Translasjon - Dannelsen av et polypeptid fra mRNA.

Ekspresjon - Prosessen der en DNA-sekvens eller et gen "avleses" for å danne et polypeptid. Dette er en kombinasjon av transkripsjon og translasjon.

Plasmid - En ikke-kromosomal dobbeltkjedet DNA-sekvens som består av et intakt "replicon" slik at plasmidet repli-keres i en vertscelle. Når plasmidet plasseres inne i en encellet organsime kan særtrekkene til denne organisme forandres eller transformeres som et resultat av DNA til plasmidet. F-.eks. transformerer et plasmid som bærer genet for tetrasyklinresistans (Tet<R>) en celle som før var sensi-tiv for tetrasyklin til en som er resistent mot dette. En celle transformert av et plsmid er kalt en "transformant".

Fag eller bakteriofag- - Bakterielt virus hvorav mange består av DNA-sekvenser omhyllet av en proteinomhylning eller kappe ("capsid").

Kloningsvektor - Et plasmid, fag DNA eller annen DNA-sekvens som er i stand til å replisere i en vertscelle og som er særpreget ved et eller et lite antall endonuklease gjenkjennelsesseter ved hvilke slike DNA-sekvenser det kan spaltes på en bestemt måte uten medfølgende tap av en es-sensiell biologisk funksjon til DNA såsom replikasjon produksjon av kappeproteiner eller tap av promoter eller bin-dingsseter og som inneholder en markør passende for bruk i identifikasjonen av transformerte celler f.eks. tetrasy-klinresistanse eller ampicillinresistanse. En kloningsvektor er ofte kalt en vektor.

Klonin<g>- Prosessen å erholde en populasjon av organismer eller DNA-sekvenser avledet fra en slik organisme eller sekvens ved aseksuell reproduksjon.

Rekombinant DNA- molekvl eller hybrid DNA - Et molekyl bestående av segmenter av DNA fra forskjellige genomer som har blitt spleiset ende mot ende og har kapasiteten å infisere enkelte vertsceller og opprettholdes deri.

Eksepresi onkontrollsekvens - En sekvens av nukleotider som kontrollerer og regulerer ekspresjon av gener når de er oprativt forbundet til disse gener. De innebefatter lac systemet, trp systemet, tac systemet, tre systemet, vesentlige operator, og promoter-regioner av fag X , kontrollregionen til fd kappeprotein, de tidlige og sene promotere til SV4 0, promotere avledet fra polyoma, adeno-virus og simianvirus, promoteren for 3-fosforglyseratkinase eller andre glykolytiske enzymer, promoterne for sur gjærfosfotase f.eks. Pho5, promoterne til gjær a-parringsfaktor og andre sekvenser kjent for å kontrollere ekspresjonen av gener i prokaryot- eller euka-ryotceller og deres virus eller kombinasjoner derav.

SMC - Somatomedin C.

SMC- lignende polypeptid - Et polypeptid som opviser en vekststimulerende eller regulerende aktivitet til SMC. F.eks. kan et SMC-lignende polypeptid innebefatte en N-terminal metionin eller annet peptid koblet til første glycin av det ferdigutviklede SMC. Det kan også innebefatte et treonin i stedet for et metionin ved amino-syreposisjon 59. Et SMC-lignende polypeptid kan også innebefatte forskjellige andre substitusjoner, addisjoner eller delesjoner til aminosyresekvensen av ferdigutviklet

SMC.

Foreliggende oppfinnelse har flere aspekter. For det før- ste omhandler den en fremgangsmåte for å forbedre produksjonen av ethvert eukaryot- eller prokaryotprotein eller polypeptid i en vertscelle transformert med en DNA-sekvens, og som ved ekspresjon koder for dette protein eller polypeptid. Oppfinnelsen gir også mulighet for å velge ut DNA-sekvenser som tillater denne optimale produksjon av ethvert eukaryot- eller prokaryotprotein eller polypeptid i en vertscelle transformert med disse DNA-sekvenser. Den omhandler også DNA-sekvensene valgt ut ved sistnevnte fremgangsmåte og deres bruk for å danne proteinene og polypeptidene kodet for av disse. Endelig omhandler denne oppfinnelse i en foretrukket utførelsesform DNA-sekvenser som koder for SMC-lignende polypeptider samt fremgangsmåter for å velge ut disse DNA-sekvenser og anvende dem ved optimalisering av produksjonen av SMC i vertsorganismer transformert med disse.

En mengde verts/ekspresjonsvektorkombinasjoner kan anven-' des ved ekspresjonen av både hybrid-DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen og de utvalgte DNA-sekvenser som tillater optimal produksjon av det ønskede eukaryot eller prokaryotprotein eller polypeptid. F.eks. kan anvendelige ekspresjonsvektorer omfatte segmenter av kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser såsom mange kjente derivater av SV40 og kjente bakterielle plasmider f.eks. plasmider fra E. coli. innbefattende Col El, pCRl, pBR322, pMB9 og deres derivater, bredere vertsområde-plasmider f.eks RP4, fag DNA f.eks. et antall derivater av fag X, såsom NM 989, og andre DNA-fager f.eks. M13 og filamentøse enkeltkjedete DNA-fager, vektorer anvendelige i gjær såsom 2/x- plasmide vektorer anvendelige i eukaryot-celler og animalske celler såsom dem inneholdende SV40-avledede DNA-sekvenser og vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmider og fag DNA såsom plasmider som har blitt modifisert for å anvende fag DNA eller andre derivater derav.

Blant slike nyttige ekspresjonsvektorer er vektorer som tillater ekspresjon av de klonede DNA-sekvenser i eukaryot- vertsorganismer såsom animalske og humane celler (f.eks. P. J. Southern og P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, pp. 327-41 (1982); S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1, pp. 854-64 (1981); R.J. Kaufmann og P. A. Sharp "Amplification And Expression Of Sequences Cotransfected With A Moduler Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol., 159, pp. 601-21 (1982); R. J. Kaufmann og P. A. Sharp Mol. Cell. Biol. 159, pp. 601-64 (-1982); S. I. Scahill et al., "Expression And Characteri-zation Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, pp. 4654-59 (1983); G. Urlaub og L. A. Chas-in, Proe. Nati. Acad. Sei: USA, 77, pp. 4216-20 (1980)).

Slike ekspresjonsvektorer er også særpreget ved minst en ekspresjonskontrollsekvens som er operativt forbundet- til-den spesielle DNA-sekvens for å kontrollere og regulere ekspresjonen av denne klonede DNA-sekvens. Eksempler på anvendlige ekspresjonkontrollsekvenser er lac-systemet, trp- systemet, tac-systemet, trc-systemet, vesentlige operator- og promoterregioner til fag X, kontrollregionen til fd- kappeprotein, de glykolytiske promotorer til gjær, f.eks. promotorer for 3-fosforglyseratkinase, promoterne til sur gjærfosfotase f.eks. Pho5, promoterne til gjær a-parrende faktorer og promoterne avledet fra polyoma, aden-ovirus og simian virus f.eks. de tidlige og sene promotorer til SV40 og andre sekvenser kjent for å kontrollere ekspresjonen av gener hos prokaryot og eukaryot celler og dere virus eller kombinasjoner derav.

Nyttige ekspresjonsvertsorganismer innebefatter velkjente eukaryot- og prokaryotvertsorganismer såsom stammer av E. coli f.eks. E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DH1(X), og E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, såsom Bacillus subtilis, Str<p>tomyces gjær og andre sopper, dyreceller såsom COS-celler og CHO-celler og humane celler og planteceller i vevskultur.

Selvfølgelig fungerer ikke alle verts/eksprssjonvektor-kombinasjoner med lik effektivitet i å uttrykke DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen eller i å danne de aktuelle polypeptidene. Imidlertid kan en spesiell utvelgelse av en verts/ekspresjonsvektorkombinasjon foretas av fagmannen etter passende vurdering av prinsippene angitt heri uten å fravike bredden av oppfinnelsen. F.eks. bør utvelgelsen baseres på en balanse av et antall faktorer. Disse innebefatter f.eks. kompatibilitet mellom vert og vektor, toksisitet av proteinene kodet av DNA-sekvensene overfor vertsorganismen, gjenvinnelsesletthet av det ønskede protein, ekspresjonskarakteristika til DNA-sekvensene og ekspresjonkontrollsekvensene operativt forbundet til disse, biosikkerhet, omkostninger og foldingen, formen eller enhver annen nødvendig postekspresjonsmodifikasjon av det ønskede protein.

Videre kan forskjellige seter innenfor hver spesifikk eks-presjonsvektor velges ut for innskudd av DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen. Disse seter er vanligvis betegnet ved restriksjonsendonukleasen som spalter dem. De er velkjent for fagmannen. Det er selvfølgelig underforstått at en ekspersjonsvektor anvendelig i denne oppfinnelsen ikke behøver et restriksjonsendonukleasesete for innskudd av det valgte DNAfragment. I stedet kan vektoren bindes til fragmentet via alternative måter. Eksepresjonsvektoren og spesielt setet valgt deri for innskudd av et utvalgt DNAfragment og dets operative binding deri til en eks-pres j onskontrollsekvens , bestemmes av et antall faktorer f.eks. antall seter som angripes av et spesielt restrik-sjonsenzym, størrelsen av proteinet som skal uttrykkes, tilbøyeligheten av et ønsket enzym for proteolytisk ned-brytning av verts-celleenzymer, forurensning eller binding av proteinet som skal uttrykkes til vertscelleproteiner som er vanskelig å fjerne under opprensking, ekspresjonskarakteristika såsom beliggenheten av start- og stopp-kodoner relativt til vektorsekvensene og andre faktorer gjenkjent av fagmannen. Valget av en vektor og et innskud-dssete for en DNA-sekvens er bestemt av en balanse av-disse . f aktorer hvor ikke alle utvelgelser.er like effektive for et gitt tilfelle.

Forskjellige DNA-sekvenser som koder for lett påviselige proteiner eller polypeptider kan også bli brukt i denne oppfinnelsen. F.eks. er det i en foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen benyttet /3-galactosidase fordi dannelsen av dette protein lett kan følges ved å bruke velkjente kolorimetriske plateforsøk. Det kunne også brukes andre såsom galaktokinase eller drogeresistensgener f.eks. ampicillinrésistens.

Endelig kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og DNA-sekvensene valgt ut og brukt i-disse være anvendelige til ekspresjon av ethvert prokaryot- eller eukaryotprotein eller polypeptid. Blandt disse er humane og animalske lymfokiner innebefattende inteferoner, interleukiner og TNF, humane og animalske hormoner innebefattende veksthor-moner og insulin, humane og animalske blodfaktorer innebefattende faktor VIII og tPA, enzymer, antigener og andre proteiner og polypeptider av interesse. I den foretrukne utførelsesform beskrevet heri er det brukt fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen for å optimalisere produksjonen av SMC-lignende polypeptider.

For at oppfinnelsen heri beskrevet skal bli forstått bedre er de følgende eksempler gitt.

FREMSTILLING AV ET REKOMBINANT DNA- MOLEKYL MED EN DNASE-KVENS SOM KODER FOR ET SMC- LIGNENDE POLYPEPTID

Under referanse til fig. 1 er det vist deri skjematisk en utførelsesform av en fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant DNA-molekyl (pLc24muSMCori) særpreget ved at det har en DNA-sekvens som koder for humant f-Met-SMC bundet til en DNA-sekvens avledet fra mu og som bærer en Shine Dalgarno-sekvens fra mu hvor den kombinerte DNA-sekvens er operativt forbundet til .en PL-promoter avledet fra bakteriofag X.

For å danne pLc24muSMCorible det først syntetisert 14 oligodeoxynukleotider (se fig. 1 og 2, sekvensene 1-11 X,

Y og Z) ved å bruke den angitte aminosyresekvens til humant SMC (Rinderknecht og Humble, supra; D.G. Klapper et al., Endocrional., 112, pp. 2215-17 (1983)). For syntese ble det brukt fastfase-fosfotriestermetoden (H. Ito et al., Nucleic Acids Res., 10, pp. 1755-69 (1982)). Etter deblokkering av de urensede oligomere ble disse av saltet ved gelfiltrering på Sephadex G-50 og opprenset ved elek-troforese på denaturerende plyakrylamid preparativ slab-geler inneholdende urea (T. Maniatis et al., Biochem., 14, pp. 3787-94 (1975)). Båndene ble lokalisert ved å bruke UV-påvisning og oligodeoksynukleotidene ble isolert ved elektroeluering fra gelskivene. De gelrensede oligodeoksynukleotider ble så fosforylert ved å bruke T4polynu-• kleotid-kinase og igjen opprensket på15% polyakrylamid/7M ureageler og å gjenvinne DNA ved elektroeluering (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) . De 14 oligodeoksynukleotider varierte i størrelse fra 13-37 baser.

I disse synteser ble det vurdert kodonanvendelse i høyt uttrykte gener av E. coli (R. Grantham et al., Nucleic Acids Res., 8, pp. 1983,92 (1980)) og E.coli tRNA over-skudd (T. Ikemura, J. Mol. Biol., 151, pp. 389-409 (-1981)). Det ble også innebefattet et antall passende endo-nukleasegjenkjennelsesseter ved forskjellige posisjoner langs oligonukleotidsekvensene.

Sekvensene 1-4 og X, Y og Z og sekvensene 5-11 ble så ligert og forlenget med Klenow plymerase for å danne to sam-mensatte DNA-sekvenser - fragment A, et 98 basepar buttendet fragment ("SMC A") og fragment B, et 138 basepar buttendet fragment ("SMC B") (J. R. rossi et al., J. Biol. Chem., 257, pp 9226-29 (1982)) (fig. 1 og 2). Fragment A koder for den Nterminale ende av SMC og fragment B for det gjenværende av SMC (fig. 2).

Fragment A ble fremstilt ved å oppvarme 200 pmol hver av sekvensene 1-4 X, Y og Z til 95°C i 2O/il gjendannende buf-fer (50 mM Tris-HCL (pH 7,6), 10 mM MgCl2) og så sakte av-kjøling av blandingen til 4°C. Ditiotreitol, ATP og T4 DNA-ligase ble tilsatt til endelig konsentrasjon på henholdsvis 5 mM, 70/iM og 20/i/ml, og så ble reaksjonsblandingen inkubert ved 4°C i 10 timer. Etter etanolutfelling ble blandingen satt på en 8% polyakrylamid/7M urea-gel og de 77 og 78 baseparkjedene ble eluert. 25pmol av hver kjede ble så kombinert i 5/il av gjendannelsesbuf f er, reaks j ons-blandingen ble oppvarmet til 95°C og sakte avkjølt til 15°C. Det ble så tilsatt ditiotreitol, dNTP og Klenow fragmentet av DNA-polymerase til henholdsvis 5 mM 250/im og 2 enheter, og blandingen ble oppbevart ved romtempera-■ tur i 3 0 min. Reaksjonsproduktene som angitt ovenfor og 7 pmol av 98 basepar SMC A, ble isolert. Det ble fremstilt 20 pmol av det 114 basepar store SMC B i hovedsak på samme måte ved å bruke 200 pmol hver av sekvensene 5-11.

Hver av disse fragmenter ble så skutt inn i en buttendet M13mp8-vektor fremstilt ved å kutte 2 /ig RF DNA med BamHI (for fragment A) og med BamHI og HindiII (for fragment B), fylle ut de ujevne endene med en enhet E. coli DNA polymerase (Klenow-fragment) i nærvær av de fire deokynukleotid-trifosfåtene (dNTP), utfelling med etanol og 5'-defosfor-ilering med kalvetarmfosfotase (20 enheter i 10 mM TrisHCl (pH 9,2), o,2 mM EDTA) i 30 min. (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, pp. 20-78 (1983)) . For ligering ble det brukt 2 0 ng av den lineariserte vektor og 0,1 pmol av DNA-fragmentet i 10 jil ligeringsbuf f er og 20 enheter av T4DNA-polymerase ved 15°C i 24 timer (fig. 1).

Når fragment A ble ligert til den buttendede M13mp8-vektor, ble det erholdt en rekombinant fag som hadde omdannet BamHI-setene ved endene av SMC-fragmentene og i tillegg hadde det dannet seg et Ncol-sete (GGATCCATGG) (mp8SMC A)

(fig. 1). Når fragment B ble ligert til den doble buttendede M13mp8 vektor, ble det erholdt en rekombinant fag som hadde omdannet BamHI- og Hindlll-setene ved endene av SMC-fragmentet (mp8SMC B) (fig. 1) .

E.coli JM101 (J. Messing og J. Vieira, Gene 19, pp. 269-76

(1982)) ble så transformert med hver av disse rekombinante fager og de transformerte vertsorganismer ble så platet på L-buljong-plater inneholdende 5-brom-4-klor-3-indonyl-/3-galactopyranosid (X-GAL). Fag DNA ble så opprenset fra 24 hvite plakker av E.coli JM101 transformert med mp8SMC A og mp8SMC B og DNA ble sekvensert ved dideoksykjedeter-minering (A. J. H. Smith, Method in Enzymol., 65, pp. 560-80 (1980)) . Intracellulært RF DNA ble så fremstilt fra mp8SMC A og mp8SMC B, førstnevnte ble så fordøyet med Ncol/Bam HI og sistnevnte med BamHI/Hindlll og SMC-rela-terte fragmenter ble isolert ved gelelektrofofese (fig. 1) .

De to fragmenter (SMC A og SMC B) ble så blandet med et 67 basepars stort fragment fra ner-genet av bakteriofag mu (en gave fra B. Allet) (G. Gray et al., Gene, 32, under trykking). Dette fragment består av nukleotider 1043-96 (H. Priess et'al., Mol. Gen. Genet., 186, pp. 315-21 (-1982), fig. 4) etter et EcoRI endonuklease restriksjons-sete og fulgt av et Ncol sete (CCATGG) hvor den invendige ATG av Ncol-setet danner et translasjonsinitieringscodon. Dette fragmentet inneholder også et nesten optimalt ribos-omalbindene sete (J. Shine og L. Dalgarno, Nature, 2 54, pp. 34-38 (1975)). Som et resultat av denne ligering ble det isolert et 303 basepar stort EcdRI-Hindlllfragment omfattende mu-gen-fragmentet SMC A og SMC B (fig. 1). Denne ligering var slik at ATG initieringscodonet for mu-fragmentets Ncol-sete ble fusert direkte og i den korrekte leserammen til SMC A (fig. 1 og 2).

Dette fragment ble satt inn i pLc24 (E. Remaut et al., Gene, 15, pp. 81-93 (1981)) som på forhånd hadde blitt spallet med EcoRI og HindiII for å danne plasmid pLc24mu-SMCori. Dette plasmid er særpreget ved å ha SMC-genet og dets initi-erende ATG under kontroll av PL promotoren av bakteriofag X (fig. 1).

EKSPRESJON AV SMC- LIGNENDE POLYPEPTIDER VED Å BRUKE PLASMID pLc24muSMCori

E. coli HB101 (T. Måniatis et al., Molecular Clonin, (Cold Spring Harbod Laboratory) (1982)) ble kotransformert med pLc24muSMCoriog pcI857, et derivat av pACYC 184 som koder for en temperatursensitiv repressor av PL (E. Remaut et al Gene 22, pp. 103-13 (1983)). Fordi de to plasmider bærer forskjellige antibiotiske resistensgener - penicillinase (pLc24muSMCoir:i;) og kanamycin (pcI857) - kan. korrekte transformerte kulturer velges ut ved vekst i 50/xg/ml ampicillin og 4 0 ug/ml kanamycin.

Det ble inokulert 5 ml kulturer i L-buljong inneholdene 50/zg/ml ampicillin og 4 0/xg/ml kanamycin fra plater inneholdende korrekte transformerte E. coli HB 101 (pLc24muSMCori)

(pcI857) og dyrket kulturene over natten ved 28°C. Det ble så tilsatt 2 ml av den kulturen som var dyrket over natten til 10 ml L-buljong forvarmet til 42°C og kulturene ble

kraftig omrørt i en 100 ml Erlenmeyerkolbe ved 42°C i 2 timer.

For å undersøke produksjon av SMC-lignende polypeptider ble cellene sentrifugert fra 1 ml alikvoter av kulturen (A550=20) og lysert ved koking i 10 min. i 50 fil SDS-/3-marcaptoetalnol lysisbuffer (U. K. Laemmli, Nature 227, pp. 680-85 (1970)). Enhver SMC-aktivitet ble så undersøkt ved radioimmunoassay ved å bruke et kommersielt analyse-system (Nichols Institute Diagnostics) hvis standarder på forhånd hadde blitt verifisert med renset IGF-1 (en gave fra R. Humbel)'. For undersøkelse ble det fremstilt SMC-inneholdende lysater som for gelelektroforese ble fortyn-net minst 2 0 ganger i assaybufferen og undersøkt i dupli-kat . Det ble observert at human SMC denaturert under stan-dard lysis betingelser, var like reaktivt i denne RIA som det native hormon.

Dette assay viste at E. coli HB101 (pLC24muSMCori) (pcI857) ved temperaturinduksjon dannet meget lite SMC-aktivitet -1,4 ug/ ml ved RIA - og en mengde som var upåviselig av coomassive blue farging på protein-geler. Følgelig ble det beregnet at nivået av SMC-lignende polypeptidproduksjon i denne transformerte vert var kun noen hundre molekyler pr. celle.

FORSØK PÅ Å FORBEDRE PRODUKSJONEN AV SMC- LIGNENDE

POLYPEPTIDER

Som et resultat av de meget lave nivået av SMC-lignende polypeptidproduksjon ved å bruke pLc24muSMCori, ble det forsøkt å konstruere forskjellige andre plasmider med økede ekspresjonsnivå.

Ved én fremgangsmåte ble det fremstilt ekspresjonsvektorer med en DNA-sekvens som koder for SMC fusert til en DNA-sekvens som koder- for et annet protein. Ved denne metode ble det dannet et fusjonsprotein omfattende, ved sin ami-noterminale ende, et ikke-SMC-protein og ved sin karboksy-terminale ende et SMC-lignende polypeptid. Selv om slike fusjonsproteiner kunne dannes med høyt utbytte fra de fremstilte vektorer kan de være mindre foretrukket ved animalsk og human behandling enn f-met-SMC eller SMC i seg selv. Som et resultat for den mest fordelaktige anvendel-se, krever slike fusjonsproteiner ytterligere behandling for å fjerne ikke-SMC delene fra disse. Selv om slike metoder er tilgjengelige (se f.eks. United States patent 4 425 437, 4 338 397 og 4 336,246), kan de være mindre foretrukket bortsett fra i tilfeller med direkte sekresjon og utvikling enn den direkte ekspresjon av et ønsket SMC-lignende polypeptid.

Følgelig i en annen fremgangsmåte, for å forsøke å forbedre produksjonen av SMC-ligenende polypeptider, ble det tillempet en delesjonsstrategi som hadde vist seg anvendelig ved å øke ekspresjonsnivåene av bovint veksthormon og svineveksthormon. Se f.eks. europeisk patentansøkning 103,395 og 104,920. Ved å bruke disse metoder ble det fremstilt forskjellige modifiserte SMC-kodene sekvenser som dannet SMC-lignende polypeptider særpreget ved amino-terminale delesjoner. F.eks. ble det fremstilt ekspresjonsvektorer som dannet f-Met-a3-SMC og et f-Met-a6-SMC. Selv om produksjonsnivåene for disse modifiserte SMC var noe høyere enn produksjonsnivået til f-Met-SMC fra vektor pL'c24muSMCori, var ekspresj onsnivåene fremdeles meget lave.

Endelig ble det i en tredje metode anvendt forskjellige

kombinasjoner av promotorer og ribosombindene seter for å kontrollere ekspresjonen av den SMC-kodende sekvens. Imidlertid var om mulig disse modifikasjoner værre med hensyn til SMC-produksjon enn pLc24muSMCori.

UTVELGELSE AV OPTIMALE DNA- SEKVENSER SOM KODER FOR PRODUKSJONEN AV SMC- LIGNENDE POLYPEPTIDER.

Fordi de to fremgangsmåter beskrevet tidligere enten var dårlige eller førte til dannelse i mange tilfeller av en mindre foretrukket form av et SMC-lignende polypeptid, ble det valgt å lage en fremgangsmåte som kunne tillate å velge ut optimale sekvenser som koder for produksjonen av ethvert protein og mer spesielt å velge ut de optimale DNA-sekvenser som koder for produksjon'av SMC-ligende polypeptider.

Denne fremgangsmåte var basert på hypotesen at stumme mutasjoner i DNA-sekvensene som koder for' den N-terminale del av ethvert gen, og spesielt utførelsesformen beskrevet i dette eksempel genet som koder for f-Met-SMC, kunne gi en forbedret RNA sekundærstruktur og følgelig føre til et høyere ekspresjonsnivå i en gitt vertsorganisme. Imidlertid, på grunn av de mange mulige stumme mutasjoner som måtte analyseres for å bestemme hvilken effekt om noen som de kunne ha på ekspresjonen•for å velge ut de optimalt kodende sekvenser, var det nødvendig å danne en rask og enkel utvelgelsesmetode for slike sekvenser. Uten slike metoder ville klonutvelgelse være arbeidskrevende om ikke så og si umulig og metoden ville feile.

Genfusjoner med lacZ har blitt brukt tidligere for å følge produksjonen av proteiner ved fravær av undersøkelsesmeto-der for deres genprodukter (L. Guarente'et al., Cell, 20, pp. 543-53 (1980); B. A. Castilho et al., J. Bacteriol., 158, pp. 488-95 (1984)). Dessuten kan /3-galactosidase-produksjon lett følges ved å bruke kolorimetriske plateas-says. Følgelig ble det valgt å anvende denne utvelgelsesmetode for å velge de optimale DNA-kodende sekvenser. Selv-følgelig er det underforstått at andre utvelgelsesmetoder, om enn mindre foretrukket, også er anvendlige ved å velge ut de optimale DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen.

For å variere sekundærstrukturen til den SMC-kodende sekvens i denne illustratoriske utførelsesform av metodene ifølge oppfinnelsen, ble det fremstilt en serie av syntetiske linkere som omfattet de 256 mulige DNA-sekvenser som koder for aminosyrene 2-6 av SMC. Selv om aminosyrene 2-6 av SMC kan kodes for av 256 forskjellige sekvenser ble det brukt en 512 ganger degenerert linker (fig. 3) for å innebefatte alle mulige leucincodoner (SMC posisjon 5) innebefattende TTY som koder for fenylalanin. Det er selvføl-gelig underforstått at lengre eller kortere oligonu-kleotider også kunne ha blitt brukt i metodene ifølge oppfinnelsen. F.eks. kunne lengre syntetiske linkere f.eks.

de som koder for opptil SMC aminosyrer 2 0 med hell bli brukt for å bestemme effekten av disse lengre sekvenser ved ekspresjon av SMC. De overflødige DNAsekvenser av seriene til 512 linkerne er angitt i fig. 3.

Under referanse til fig. 3 har det blitt angitt deri en utførelsesform av en metode for å bruke disse overskytende DNA-sekvenser ved SMC-produksjon. Som vist i fig. 3 ble

det først subklonet det. 165 basepar EcoRI-BamHI fragment av pLc24muSMCoriinne EcoRI-BamHI-spaltet pUC8, for å danne • en i fasefusjon mellom lacZ og SMC ved BamHI-setet. Denne vektor er betegnet pUCmuSMC<A>ori (fig. 3) . pUC8 ble valgt ut på grunn av sin lille størrelse og sine unike restrik-sjonsseter som forstyrrer lacZ og lad" verten. Imidlertid er det underforstått at andre plasmider som bærer et lacZ-gen også kan brukes ved utvelgelsesprosessen.

Fordi fusjonen blir foretatt ved å sette inn de SMC-kodende sekvenser i den promoterproksimale region av lacZ-genet, er ekspresjonen av hybridgenet under kontroll av lac-promotoren av pUC8.

Ribosomer kan begynne translasjon i pUCmuSMCAorived det lac-ribosombindende sete. Imidlertid vil slik translasjon raskt stoppe ved de i leseramme eksisterende stoppkodonene til mu-fragmentet avledet fra pLc24muSMCori. Alternativt kan ribosomene begynne translasjon ved det mu-ribosombindende sete for å danne et fusjonsprotein bestående av en aminoterminal del fra SMC og en karboksyterminal del fra lacZ. Fusjonen av SMC-/3-glactosidase i pUCmuSMCAoriinneholdt 35 aminosyrer av SMC ved N-teminalen.

Selv om fusjonsgenene i pUCmuSMC<A>ori er i fase når E. coli JM83 (J. vieira og J. Messing, Gene, 19, pp. 259-68 (-1982)) ble transfektert med plasmidet og den transformerte vert ble dyrket på LB-agarplater inneholdende 5-brom-4-klor-3-indonyl-/3-D-galactopyranosid (X-GAL) , ble det observert kun hvite kolonier etter 16 timer ved 37°C. Mens disse kolonier til slutt ble meget lyse blå etter 40 timer, viser deres hvite farge etter 16 timer at de dannet meget lite av SMC- /3-gal fusjonsproteinet. Dette resultat er selvfølgelig i samsvar med de tidliger observerte lavere ekspresjonsnivåer i pLc24muSMCori .

Inn i plasmid pUCmuSMCAorible det så innført hver av sam-lingen av de 512 ganger degenererte syntetiske DNA-linkere (Avall-HaeTI fragmenter) som koder for aminosyrene 2-6 av SMC som en erstatning for de kodende sekvenser for disse aminosyrer i det opprinnlige plasmid. Disse linkere ble ikke fosforylert før ligering for å unngå linkerkonkate-mere. Disse sekvenser ble innført i plasmid pUCmuSMCAorived å ligere hver av disse med fragmentet som koder for det muribosombindende belte + SMC aminosyre 1 (det 70 bp-EcoRIAvall fragment av pUCmuSMCAori) og fragmentet som koder for aminosyrene 7-3 2 av SMC (det 71 bp Haell-BamHI fragment av pUCmuSMCAori) og så sette inn det resulterende EcoRIBamHI kombinasjonsfragment i EcoRI-BamHI-kuttet pUCmuSMCAori(se fig. 3) .

5000 kolonier av E. coli JM83 som hadde blitt transformert med ovenfor nevnte blanding av plasmider, ble satt på plater av L-buljong inneholdende X-GAL. Ca. 10% av de resulterende kolonier var mørkere blå enn pUC8muSMCAorietter 4 0 timer ved 37°C. 14 kolonier (både blå og hvite) av de 5000 kolonier (E.coli JM83 (pUCmuSMCA 1-14)) ble så analysert ved et antall metoder: DNA-sekvensering av den degenererte

region, /?-galactosidase-enzymatisk aktivitet og SMC-ekspresjon i E.coli C600 (T. Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)) etter substitusjon av det 165 bp EcoRI-BamHI fragment av hver av pUCmuSMCA 1-14 inn i pLc24muSMCori. Sistenevnte plasmider er betegnet pLc24muSMC.1-18 på fig. 3. Av de 14 kolonier valgt ut for analyse, var 10 blå og 4 hvite på X-GAL plat-en. Tabell 1 viser resultatene av disse forskjellige ana-lyser :

Som beskrevet i tabell I, dannet de blå kolonier inneholdende pUC8muSMCA 1-10, 2,5-8 ganger f ler enheter av /3-galactosidase enn E.coli JM83 (pUC8muSMCAori) . I motsetning til dette dannet de hvite kolonier inneholdende pUCmuSMCA11-14 ingen påviselig /3-galactosidase. Overraskende, selv omjS-galactosidaseproduksjonen av pUC8muSMCA 1-10 var 2,5-8ganger høyere enn det parentale plasmid ble når EcoRI-BamHI fragmentene fra disse plasmider ble satt inn i pLc-24muSMCori-plasmidet, dannet E. coli HB101 23- 46 ganger mer SMC- aktivitet enn det parentale plasmid. Det var heller ingen tilsynelatende spesifik korrelasjon mellom enheter av S-galactosidase for en gitt fusjon og fig av SMC for den tilsvarende ekspresjon under PL-kontroll. Imidlertid tillater den blå/ hvite forskjell av koloniene på X- GAL platertydeligvis utvelgelse av DNA- sekvenser som gir for stor eks<p>resjon av SMC. Følgelig kan denne metoden anvendes generelt for utvalgte optimale DNA-sekvenser for dannelsen av ethvert' ønsket eukaryot eller prokaryotpolypeptid.

Selv om det ikke ønskes å.være begrenset av teori, er det antatt at de forskjellige ekspresjonsnivåer oppvist av de degenererte DNA-sekvenser står i forhold til den sekundære RNA-struktur av nukleotidene som koder for de N-terminale aminosyrer av SMC. F.eks. indikerer resultatene at det muliple CCC dannet av kodonene for treonin-leucin (ACN-CTN) (SMC posisjon 4 og 5) er spesielt utskillende til SMC- syntese. Alle av de analyserte hvite kolonier og pUCmuSMCorierkarakterisert veddenne sekvens som kunne danne hydrogenbindinger med det ribosombindende sete i pLc24muSMC.

Selv om det i utførelsesformen av oppfinnelsen beskrevet ovenfor ble anvendt en DNA-sekvens som koder for den ønskede protein-lacZ-fusjon som dannet et fusjonsprotein med 3 5 aminosyrer av SMC ved den N-terminale ende, må de relative lengder av de to deler av fusjonsproteinet bli bestemt empirisk for den mest effektive utvelgelse i meto den. De eksperimentelle resultater har identifisert enkelte av faktorene som kunne tas i betraktning ved dette valg. F.eks. er styrken av de ribosombindende sete viktig. Når det blir brukt et trp ribosombindende sete i stedet for det fra mu, dannet- funsjonene som inneholdt 3 5 aminosyrer .av SMC ikke blå kolonier. De relative mengder @-galctosidase og det utvalgte protein i fusjonsproteinet er også viktig. F.eks. tillot genfusjonene som dannet fusjonsproteiner med kun 14 SMC aminosyrer ved N-terminalen, ikke blå/hvit seleksjon. I dette tilfelle var tydligvis/3-galactosideseaktivitet til fusjonsproteinet for høy for å tillate påvisning av optimale N-terminalkodede sekvenser. Imidlertid er sensitiviteten av påvisningssystemet viktig. Det ble bestemt at /3-galactosidaseaktivitetsområdet som var anvendelig i utvelgelsesmetoden, var 1-8% av nivået av S-galactosidase dannet av det opprinnelige pUC8. Under hensyntagen til disse faktorer og andre som på lignende måte kan bestemmes som beskrevet ovenfor, . kan en fagmann velge ut det passende fusjonsprotein og foreta en utvelgelse ved metodene beskrevet heri uten å. fravike fra bredden av oppfinnelsen.

Selv om det spesifike SMC-lignende polypeptid dannet i ovenfor angitte eksempel er et f-Met-SMC, er det underforstått at f-Met kan fjernes fra SMC ved et antall tilgjengelige metoder.

De SMC-ligende polypeptider dannet ved metodene ifølge oppfinnelsen kan dannes ved å bruke vanlige metoder i farmasøytiske nyttige blandinger. Disse blandinger omfatter en farmasøytiske effektiv mengde av det SMC-lignende polypeptid for å forårsake den ønskede vevsvekst-stimulering og fortrinnsvis et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel. Passende bæremidler er velkjent. Som tidligere nevnt er blandingene derpå nyttige i metoder for å stimulere vevsvekst og ved behandling av dvergvekst, muskelatropi, brukne ben, sår eller andre skader på vev. Mikroorganismer og rekombinante DNA-molekyler fremstilt ved fremgangsmåte beskrevet heri er eksemplifisert av kulturer deponert i kultursamlingen Deutsche Sammling von , Mikroorganismen i Gottingen, Vest-Tyskland 23.mars 1985 og identifisert som SMC-1 og SMC-2.

SMC-1: E.coli HB101 (pcI857) (pLc24muSMCori) SMC-2: E.coli HB101 (pcI857) (pLc24muSMC 8)

Disse kulturer ble gitt henholdsvis tilgangsnummere DSM 3276 og 3277.

Selv om det tidligere har blitt beskrevet et antall utfør-elsesformer av oppfinnelsen, er det tydelig at de underliggende konstruksjoner kan forandres for å gi andre ut-førelsesf ormer som benytter fremgangsmåten av blandingene ifølge oppfinnelsen. Derfor vil det forstås at bredden av oppfinnelsen bør defineres ved de etterfølgende, krav i stedet for de spesielle utføreslsesformer som har blitt presentert tidligere som eksempler.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved forbedring av produksjonen av et ønsket polypeptid i en encellet vertsorganisme transformert med et rekombinant DNA-molekyl som er særpreget ved en DNA-sekvens som koder for det ønskede polypeptid, hvilken DNA-sekvens er operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens i det rekombinante DNA-molekyl,karakterisert vedat den omfatter trinnene a) å erstatte en DNA-sekvens som koder for en del av den N-terminale enden av et lett påvisbart polypeptid, eksem-pelvis /3-galaktosidase, galaktokinase og markører for medikament-resistens, med en degenerert serie av DNA-sekvenser som koder for en del av den N-terminale ende av det ønskede polypeptid, hvor erstatningen ikke i vesentlig grad påvirker påviseligheten: b) å uttrykke i en transformert encellet vertsorganisme den resulterende serie av hybride DNA-sekvenser operativt forbundet med en ekspresjonskontroll-sekvens; c) velge ut for de spesielle hybride DNA-sekvenser som tillater den optimale produksjon av det lett påviselige polypeptid; d) og å anvende disse utvalgte DNA-sekvenser som koder for en del av den N-terminale enden av det ønskede polypeptid sammen med det gjenværende av DNA-sekvenser som koder for det ønskede polypeptid ved ekspresjonen av dette polypeptid.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det ønskede polypeptid er valgt fra gruppen omfattende interferoner, interleukiner og andre lymfokiner, blodfaktorer, enzymer, virale antigener, SMC, vekst-hormoner og andre hormoner samt andre polypeptider av animalsk og human opprinnelse.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat det ønskede polypeptid er et SMC-lignende polypeptid, kodet for ved ekspresjon av en DNA-sekvens valgt fra DNA-innskuddene pLc24muSMC 1 til pLc24muSMC 10.

4. DNA-sekvens, karakterisert vedat den koder for et SMC-liknende polypeptid fremstilt ved en fremgangsmåte omfattende trinnene å erstatte en DNA-sekvens som koder for en del av den N-terminale ende av et lett påviselig polypeptid med en degenerert serie av DNA-sekvenser som koder for en del av den N-terminale ende av det SMC-liknende polypeptid, hvor erstatningen ikke i vesentlig grad påvirker påviseligheten,- å uttrykke i en transformert encellet vertsorganisme den resulterende serie av hybride DNA-sekvenser operativt forbundet med en ekspresjons-■ kontrollsekvens; å velge ut de spesielle hybride DNA-sekvenser som tillater optimal produksjon av det påviselige polypeptid; og erstatte DNA-sekvenser som koder for en del av den N-terminale ende av det ønskede polypeptid med de utvalgte DNA-sekvenser som koder for en del av den N-terminale ende av det SMC-liknende polypeptid.

5. DNA-sekvens ifølge krav 4,karakterisert vedat DNA-sekvensen er valgt fra DNA-innskuddene pLc24muSMC 1 til pLc24muSMC 10.

6. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 4 eller 5, hvilken DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspresjonskontrollsekvens valgt fra gruppen omfattende lac-systemet, trp-systemet, tac-systemet, trc-systemet, hoved-operator og promoter-området av fag X, kontroll-regionen av fd kappeprotein, de tidligere og sene promotere til SV40, promotere avledet fra polyoma-, adeno- og simian-virus, samt promotere til glykolytiske enzymer fra gjær a-formeringsfaktorer og sur fosfatase, og spesielt hoved-operator og promoter-området av fag X.

7. Encellet vertsorganisme, karakterisert vedat den er transformert med i det minste et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 6, og hvor vertsorganismen foretrukket er E. coli HB 101 (-pcI857)(pLc24muSMC 1) til pLc24muSMC 10), mer spesielt (pLc24muSMC 8).