DK175223B1

DK175223B1 - Fremgangsmåde til forbedring af produktionen af et önsket polypeptid, DNA-sekvens og rekombinant DNA-molekyle kodende for polypeptidet, værtscelle transformeret med det rekombinante DNA-molekyle og fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid

Info

Publication number: DK175223B1
Application number: DK198605698A
Authority: DK
Inventors: Gary N Buell; Nageswararao Movva
Original assignee: Biogen Inc
Priority date: 1985-03-26
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 2004-07-12
Also published as: AU594950B2; ATE87977T1; JPH07143896A; JPH07145200A; EP0215110A4; ES553374A0; JPH07102152B2; EP0215110A1; NO864724L; ZA862240B; AU5665786A; CN1034588C; JPH0691832B2; JPH07143885A; CA1339305C; NO302709B1; JP2602628B2; GB8507833D0; IL78278A0; ES8705921A1

Description

I DK 175223 B1 I Beskrivelse I Opfindelsen angår en fremgangsmåde til forbedring af produktionen af et ønsket poly- I peptid i en vært ved identificering af optimale DNA-sekvenser i værter, som er trans- formeret med sådanne DNA-sekvenser. Nærmere betegnet angår opfindelsen identifi- I 5 kationen af de til fremstillingen af human somatomedin C ("SMC") optimale, modifice- I rede DNA-sekvenser. Opfindelsen angår også DNA-sekvenser, rekombinant-DNA- I molekyler og værter, der er karakteriseret ved disse DNA-sekvenser, og fremgangs- I måder til fremstillingen af human SMC og andre proteiner af prokaryotisk og eukaryo- I tisk oprindelse ved dyrkning af den transformerede vært.

I 10 I Baggrund for opfindelsen

I Somatomidin C ("SMC") er en insulin-lignende vækstfaktor, der synes at være det kri- I

I tiske protein, som signalerer vævsvækst efter sekretion af væksthormon fra hypofy- I

I sen. I

I 15 I

I Aminosyresekvensen af human SMC meddeltes af E. Rinderknecht og R.E. Humble i I

I J. Biol, Chem.. 253, pp. 2769-76 (1978). Den består af et enkeltkædet polypeptid med I

I 70 aminosyrer og med tværbindinger i form af tre disulfidbroer. Den beregnede mole- I

I kylvægt er 7649. SMC udviser en høj grad af homoiogi med pro-insulin. Fx er SMC- I

20 aminosyrer 1 til 29 homologe med insulin B kæden og SMC-aminosyrer 42-62 er ho- I

mologe med insulin A kæden. Den forbindende kæde i SMC udviser imidlertid ingen I

homoiogi med C-peptidet i pro-insulin og SMC indeholder også et C-terminalt octa- I

peptid, som ikke findes i pro-insulin. I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

SMC udviser adskillige vækstfremmende virkninger in vitro såsom stimulering af DNA- I

2

RNA-, protein- og proteoglycansynteser (E. Rinderknecht og R.E. Humble, Proc. Natl. I

3

Acad. Sci USA, 73, pp. 2365-69 (1976), B. Morell og E.R. Froesch, Eur. J. Clin. In- I

4

vest.. 3, pp. 119-123 (1973), E.R. Froesch et al., Adv. Mental. Disord.. 8, pp. 211-35 I

5

(1975), A.E. Zingg og E.R. Froesch, Diabetologia. 9, pp. 472-76 (1973), E.R. Froesch I

6

et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, pp. 2904-08 (1976)). Det stimulerer også or- I

7

nithindecarboxylase og celleproliferation (B. Morrel og E.R. Froesch, supra, G.K. Ha- I

8

selbacher og R.E. Humble, J. Cell. Phvsiol.. 88, pp. 239-46 (1976)). In vivo stimulerer I

9

SMC vækst i rotter, som er påført væksthormonmangel ved hjælp af hypofysesektomi I

10

(E. Schoenle et al.. Nature. 296, pp. 252-53 (1982). I

11 DK 175223 B1 2

Ligesom væksthormoner er SMCér i nogen grad artsspecifikke. SMC fra én art kan imidlertid være biologisk aktiv i en anden art, som står på et lavere udviklingstrin. Human SMC formodes fx at kunne anvendes til fremme af vækst hos kvæg, svin og høns. Hos laboratoriedyr har SMC udvist vækststimulerende virkninger svarende til 5 virkningerne af naturligt humant væksthormon. Imidlertid formodes SMC at besidde fordele i forhold til humant væksthormon, da SMC er en central formidler af vækstre-\ ' aktionen. Følgelig er den en mere direkte regulator af vækst end væksthormon.

Foruden SMC’s anvendelse ved behandling af visse former forvækstforstyrrelser så-10 som dværgvækst og muskelatrofi er den også nyttig til stimulering af vævsvækst i specifikke områder såsom i forbindelse med heling af sår, kvæstelser og brækkede knogler.

SMC har imidlertid ikke opfyldt sit kliniske potential som en vævsvækststimulator, da 15 den kun er tilgængelig i små mængder gennem oprensning af humant blod. Følgelig er andre metoder påkrævet for at overkomme denne mangel på kommercielt og klinisk nyttige mængder af SMC.

En sådan fremgangsmåde kunne omfatte anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi 20 til fremstilling af SMC i værter, der er transformeret med en DNA-sekvens, som koder derfor. Denne fremgangsmåde har imidlertid ikke vist sig at være nyttig i forbindelse med fremstillingen af store mængder SMC, da ekspressionsudbytter af SMC i forskellige E. coli værter har været for lave til at frembyde økonomisk nyttige eller kommercielle mængder SMC. Alternativt er SMC blevet produceret i Ion-, htpR- og Ion htpR-25 mutante værstceller [PCT-ansøgning WO 85/03949].

Beskrivelse af opfindelsen

Opfindelsen løser de ovenfor anførte problemer ved at tilvejebringe en fremgangsmåde til identificering af de til fremstilling af SMC eller ethvert andet ønsket eukaryo-30 tisk eller prokaryotisk protein eller polypeptid optimale DNA-sekvenser i værter, som er transformeret med sådanne DNA-sekvenser. De ved denne fremgangsmåde udvalgte modificerede DNA-sekvenser koder ved ekspression for disse proteiner, især for SMC i overensstemmelse med den foretrukne udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og tillader effektiv højniveau-produktion deraf i forskellige værter. Som 35 følge af opfindelsen er det således for første gang i klinisk nyttige mængder muligt at

I DK 175223 B1 I

I 3 I

I opnå polypeptider, som udviser de vækststimulerende og formidlende aktiviteter af I

I SMC. I

I Som det vil fremgå af den følgende beskrivelse, er de hidtil ukendte DNA-sekvenser I

I 5 og rekombinant-DNA-molekyler ifølge opfindelsen i passende værter i stand til at rette I

I produktionen mod store mængder SMC og SMC-lignende polypeptider. Disse poly- I

I peptider ér nyttige med hensyn til et stort antal forskellige vækststimulerende og , .,β

I -formidlende aktiviteter i mennesker såvel som i kvæg, svin og høns. I

I 10 Det er derfor åbenbart, at et grundlæggende formål med opfindelsen er at udforme en I

I fremgangsmåde til identificering af DNA-sekvenser, som er optimale med hensyn til I

I produktionen af SMC eller vilkårligt andet ønsket eukaryotisk eller prokaryotisk protein I

I eller polypeptid. Opfindelsen har endvidere til formål at tilvejebringe forskellige hidtil I

I ukendte DNA-sekvenser, rekombinant-DNA-molekyler og værter, som muliggør pro- I

I 15 duktionen af sådanne proteiner og SMC og SMC-lignende polypeptider i forbedrede I

I udbytter. I

I Fremgangsmåden ifølge opfindelsen tit forbedring af produktionen af et ønsket euka- I

I ryotisk eller prokaryotisk polypeptid i en vært, som er transformeret med en DNA-se- I

I 20 kvens, der koder for dette protein eller polypeptid, og som er operativt bundet til en I

ekspressionskontrolsekvens, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man I

I erstatter en del af N-terminalenden af en DNA-sekvens, som koder for et let analyser- I

I bart polypeptid, med en degenereret række DNA-sekvenser, der koder for en del af N- I

I terminalenden af det ønskede eukaryotiske eller prokaryotiske protein eller polypeptid, I

I 25 underkaster den resulterende række hybrid-DNA-sekvenser, som operativt er bundet I

I til den ønskede ekspressionskontrolsekvens, ekspression i en passende vært, udvæl- I

I ger de særlige hybrid-DNA-sekvenser, som muliggør den optimale produktion af det I

I let analyserbare polypeptid, og anvender den del af de udvalgte hybrid-DNA-sekven- I

I sers N-terminalende, som koder for N-terminaldelen af det ønskede polypeptid eller I

I 30 protein, ved ekspression af det ønskede polypeptid. Denne fremgangsmåde tillader I

I fordelagtigt optimal produktion af det ønskede protein eller polypeptid. I

I Kort beskrivelse af tegningen I

I Figur 1 afbilder i skematiske hovedtræk en fremgangsmåde til fremstilling af en synte- I

I 35 tisk DNA-sekvens, som koder for f-Met-SMC og et plasmid, pLc24muSMCori, som in- I

DK 175223 B1 4 deholder denne DNA-sekvens, efter sekvenser, der stammer fra mu og en PL-promo-tor.

Figur 2 afbilder syntetiske nukleotidsekvenser (begge strenge) af to fragmenter -- SMC 5 A (fragment A) og SMC B (fragment B) -- der anvendes i overensstemmelse med en udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, til fremstilling af en syntetisk DNA-sekvens, der koder for f-Met-SMC. Figur 2 afbilder også aminosyresekvenseme af fragmententer SMC A og SMC B og de forskellige oligonukleotidsekvenser 1-11, X, Y og X, der anvendes til fremstilling af disse fragmenter.

10

Figur 3 afbilder i skematiske hovedtræk en fremgangsmåde til fremstilling af plasmider pUCmuSMC Aori, pUCmuSMC A 1-18 og pUCmuSMC 1-18. I sekvensen af den 512 gange degenererede syntetiske linker, som er afbildet i midten af figur 3, betegner "N" alle fire basemuligheder, "P" purin og "Y" pyrimidiner.

15

Bedste måde til udførelse af opfindelsen

Den følgende detaljerede beskrivelse er givet for den her beskrevne opfindelse kan forstås fuldt ud.

I beskrivelsen anvendes følgende udtryk: 20

Nukleotid -- En monomer enhed af DNA eller RNA bestående af en sukkerdel (pentose), et phosphat og en nitrogenholdig heterocyklisk base. Basen er bundet til sukkerdelen via glycosidcarbonat (1' carbonatomet i pentosen). Denne kombination af en base og sukker kaldes et nukleotid. Hvert nukleotid karakteriseres ved basen. De 25 fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og thymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U").

DNA-sekvens - En lineær række af nukleotider, der er indbyrdes forbundet med phosphordiesterbindinger imellem nabopentosedeles 3'- og 5’-carbonatomer.

30

Codon -- En DNA-sekvens med tre nukleotider (en triplet), der koder for en aminosyre via mRNA, et translationsstartdignal eller et translationsslutsignal.

Gen -- En DNA-sekvens, som via sit templat eller budbringer RNA ("mRNA") koder for 35 en sekvens af aminosyrer, der er karakteristisk for et specifikt polypeptid.

I DK 175223 B1 I

I 5 I

I Transkription - Processen, hvorved mRNA dannes ud fra et gen. I

I Translation - Processen, hvorved et polypeptid dannes ud fra mRNA. I

I 5 Ekspression -- Processen, som en DNA-sekvens eller et gen undergår til dannelse af I

I et polypeptid. Den er en kombination af transkription og translation. I

I Plasmid -- En ikke-kromosomal dobbeltstrenget DNA-sekvens, som omfatter et intakt I

I "replikon", således at piamidet replikeres i en værtscelle. Når plasmidet anbringes i en I

I 10 unicellulær organisme, kan egenskaberne af denne organisme forandres eller trans- I

I formeres som et resultat af plasmidets DNA. Således transformerer fx et plasmid, der I

I bærer genet for tetracyclinresistens (TetR), en celle, som tidligere var følsom over for I

I tetracyclin, til én, der er resistent over for tetracyclin. En med et plasmid transformeret I

I celle kaldes en "transformant". I

I 15 I

I Faa eller bakteriofaq - Bakteriel virus, hvoraf mange består af DNA-sekvenser, der er I

I indkapslet i et proteinhylster eller -overtræk ("capsid"). I

I Kloninasvehikel -- Et plasmid, fag-DNA eller anden DNA-sekvens, som er i stand til at I

I 20 replikere i en værtscelle og som er karakteriseret ved et eller et lille antal endonuklea- I

I segenkendelsessteder, hvor sådanne DNA-sekvenser kan skæres på en determiner- I

I bar måde uden ledsagende tab af en essentiel biologisk funktion hos pågældende I

I DNA, fx replikation, produktion af overtræksproteiner eller tab af promotor- eller bin- I

I dingssteder, og som indeholder en markør, der er egnet til anvendelse ved identifika- I

I 25 tion af transformerede celler, fx tetracyclinresistens eller ampicillinresistens. En klo- I

I ningsvehikel kaldes ofte en vektor. I

H

I Kloning - Processen, hvorved opnås en population af organismer eller DNA-sekven- I

I ser, som stammer fra én sådan organisme eller sekvens ved ukønnet reproduktion. I

I 30 I

I Rekombinant-DNA-molekyle eller hvbrid-DNA — Et molekyle, som består af segmenter I

I af DNA fra forskellige genomer, hvilke segmenter er forenede ende-til-ende og som I

I har evnen til at inficere en værtscelle og til at blive bevaret deri. I

I 35 Ekspressionskontrolsekvens -- En sekvens af nukleotider, som kontrollerer og regule- I

I rer genekspressionen ved operativ kobling til disse gener. De omfatter lac-systemet, I

DK 175223 B1 6 trp-systemet, tac-systemet, tre-systemet, hovedoperator- og promotorområder i fag λ kontrolområdet for fd overtræksprotein, de tidlige og sene promotorer i SV40, promotorer stammende fra polyoma, adenovirus og simianvirus, promotoren for 3-phospho-glyceratkinase eller andre glycolytiske enzymer, promotorerne for gær-syrephospha-5 tase, fx Pho5, promotorerne for σ-tilpasningsfaktorerne i gær og andre sekvenser, der vides at kontrollere ekspressionen af gener af prokaryotiske eller eukaryotiske celler samt vira eller kombinationer deraf.

SMC -- Somatomedin C.

10 SMC-lignende oolvpeptid -- Et polypeptid, som udviser en SMC-vækststimulerende eller -formidlende aktivitet. Et SMC-lignende polypeptid kan fx omfatte et N-terminal methionin eller andre peptider, som er bundet til det første glycin i udviklet SMC. Det kan også omfatte threonin i stedet for methionin i aminosyrestilling 59. Et SMC-lig-15 nende polypeptid kan endvidere omfatte forskellige andre substitutioner, additioner eller udeladelser i aminosyresekvensen af udviklet SMC.

Opfindelsen har flere aspekter. Først angår den en fremgangsmåde til forbedring af produktionen af et vilkårligt eukaryotisk eller prokaryotisk protein eller polypeptid i en 20 værtscelle, der er transformeret med en DNA-sekvens, som ved ekspression koder for dette protein eller polypeptid. Ved fremgangsmåden er det muligt at udvælge DNA-se-kvenser, som tillader denne optimale produktion af et vilkårligt eukaryotisk eller prokaryotisk protein eller polypeptid i en værtscelle, der er transformeret med sådanne DNA-sekvenser. Den angår også DNA-sekvenserne, der er udvalgt ved fremgangs-25 måden samt anvendelsen deraf ved fremstillingen af de proteiner og polypeptider, som disse DNA-sekvenser koder for. Endelig angår en foretrukket udførelsesform af opfindelsen DNA-sekvenser, som koder for SMC-lignende polypeptider, samt fremgangsmåder til udvælgelse af sådanne DNA-sekvenser og anvendelse deraf ved optimering af fremstillingen af SMC i værter, der er transformeret dermed.

30

Et stort antal forskellige værts-/ekspressionsvektorkombinationer kan anvendes ved omhandlede ekspression af både hybrid-DNA-sekvenserne ifølge opfindelsen og de udvalgte DNA-sekvenser, som tillader den optimale produktion af det ønskede eukaryotiske eller prokaryotiske protein eller polypeptid. Nyttige ekspressionsvektorer 35 kan fx bestå af segmenter af kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser såsom forskellige kendte derivater af SV40 og kendte bakterieplasmider, fx

I DK 175223 B1 I

I 7 I

I plasmider fra E. coli, herunder Col E1, pCR1, pBR322, pMB9 samt derivater deraf, I

I plasmider af en mere omfattende klasse, fx RP4, fag DNAér, fx de talrige derivater af I

I fag Λ, fx NM 989, og andre DNA-fager, fx M13 og filamentagtige enkeltstrengede DNA- I

I fager, vektorer, der er nyttige i gær såsom 2μ plasmidet, vektorer, der er nyttige i I

I 5 eukaryotiske celler og i dyreceller såsom vektorer indeholdende SV40-afledte DNA- I

I sekvenser, og vektorer stammende fra kombinationer af plasmider og fag DNAér så- I

I som plasmider, der er modificeret til at anvende fag DNA eller andre derivater deraf. I

I Blandt sådanne nyttige ekspressionsvektorer findes vektorer, der muliggør ekspres- I

I 10 sionen af de klonede DNA-sekvenser i eukaryotiske værter såsom dyreceller og hu- I

I mane celler (fx P.J. Southern og P. Berg, J, Mol. AddI. Genet.. 1, pp. 327-41 (1982), S. I

I Subramani et al., Mol, Cell. Biol.. 1, pp. 854-64 (1981), R.J. Kaufmann og P.A. Sharp, I

I "Amplification and Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofo- I

I late Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol.. 159, pp. 601-21 (1982), R.J. I

I 15 Kaufmann og P.A. Sharp, Mol. Cell. Biol.. 159. pp. 601-64 (1982). S.l. Scahill et al., I

I "Expression and Characterization of the Product of a Human Immune Interferon DNA I

I Gene in Chinese Hamster Ovary Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, pp. 4654-59 I

I (1983), G. Urlaub og L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4216-20 (1980)). I

I 20 Sådanne ekspressionsvektorer er også karakteriseret ved mindst én ekspressions- I

I kontrolsekvens, som operativt er bundet til den særlige DNA-sekvens for at kontrollere I

I og regulere ekspressionen af den klonede DNA-sekvens. Eksempler på nyttige eks- I

I pressionskontrolsekvenser er lac-systemt, trp-systemet, tac-systemet, tre-systemet, I

I hovedoperator- og promotorområderne af fag λ, kontrolområderne for fd overtræks- I

I 25 protein, de glycolytiske promotorer fra gær, promotoren for 3-phosphoglyceratkinase, I

I promotorerne for gær-syrephosphatase, fx Pho5, promotorerne for σ-tilpasningsfakto- I

I rerne i gær samt promotorer, der stammer fra polyoma, adenovirus og simianvirus, fx I

I de tidlige og sene promotorer SV40, og andre sekvenser, som vides at kontrollere I

I ekspressionen af gener af prokaryotiske eller eukaryotiske celler samt vira derfor eller I

I 30 kombinationer deraf. I

I Nyttige ekspressionsværter omfatter velkendte eukaryotiske og prokaryotiske værter I

I såsom stammer af E. coli såsom E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli I

I ϋΗΙ(Λ) og E. coli MRCI, Pseudomonas, Bacillus såsom Bacillus subtilis, Streptomyces, I

I 35 gær og andre svampearter, dyr såsom COS-celler og CHO-celler samt humane celler I

I og planteceller i vævskultur. I

DK 175223 B1 8

Naturligvis fungerer ikke alle værts-/ekspressionsvektorkombinationer med samme effektivitet med hensyn til ekspression af DNA-sekvenserne ifølge opfindelsen eller med hensyn til produktion af polypeptiderne ifølge opfindelsen. Under passende hen-5 syn til de ovenfor anførte principper og uden at afvige fra opfindelsens ånd og rammer kan fagmanden imidlertid foretage en særlig udvælgelse af en værts-/ekspressionsvektorkombination. Udvælgelsen bør fx baseres på en afbalancering af et antal faktorer. Disse omfatter fx kompatibilitet mellem vært og vektor, toxiciteten over for værten af de proteiner, der kodes for ved DNA-sekvensen, den lethed, hvor-10 med det ønskede protein kan udvindes, ekspressionskaraktaristika af DNA-sekvenserne og de dertil operativt bundne ekspressionskontrolsekvenser, biologisk sikkerhed, omkostninger og foldning, form eller andre nødvendige postekspressionsmodifikationer af det ønskede protein.

15 Inden i hver specifik ekspressionsvektor kan der ydermere udvælges forskellige steder til indføjelse af DNA-sekvenserne ifølge opfindelsen. Nævnte steder udpeges sædvanligvis af restriktionsendonukleasen, som klipper disse. De er velkendte af fagmanden. Det er åbenbart, at en nyttig ekspressionsvektor ifølge opfindelsen ikke behøver at indeholde et endonukleaserestriktrionssted til indføjelse af det valgte DNA-fragment.

20 I stedet vil vektoren kunne forenes med fragmentet på alternativ måde. Ekspressionsvektoren og især det deri valgte sted til indføjelse af et udvalgt DNA-fragment og dets operative binding deri til en ekspressionskontrolsekvens bestemmes af et antal forskellige faktorer, fx antallet af steder, som er følsomme over for et særligt restriktionsenzym, størrelsen af det protein, der skal dannes ved ekspression, følsomheden 25 af det ønskede protein over for proteolytisk nedbrydning af værtscelleenzymer, kontaminering eller binding af proteinet, der skal dannes ved ekspression, til værtscelleproteiner, som er vanskelige at fjerne under oprensning, ekspressionskarakteristika såsom placeringen af start- og stopkodoner i relation til vektorsekvenserne samt andre af fagmanden kendte faktorer. Valget af en vektor og indføjelsesstedet for en DNA-se-30 kvens bestemmes ved en afbalancering af disse faktorer, idet ikke alle valg er lige effektive i et givet tilfælde.

Forskellige DNA-sekvenser, som koder for let analyserbare proteiner eller polypepti-der, kan også anvendes ifølge opfindelsen. I en foretrukket udførelsesform ifølge opfindelsen anvendes fx li-galactosidase, da dannelsen af dette protein let kan overvå-35 ges under anvendelse af velkendte colorimetriske pladeanalyser. Også andre DNA-

I DK 175223 B1 I

I 9 I

I sekvenser vil kunne anvendes, fx galaktokinase eller lægemiddeiresistente gener som I

I fx ampicillinresistente gener. I

I Endelig er fremgangsmåderne ifølge opfindelsen og DNA-sekvenseme, som udvæl- I

I 5 ges derved og benyttes deri, anvendelige til produktion af et vilkårligt prokaryotisk eller I

I eukaryotisk protein eller polypeptid. Blandt disse er humane og animalske lymfokiner, I

I herunder interferoner, interleukiner og TNF-typer, humane og animalske hormoner, I

I herunder væksthormoner og insuliner, humane og animalske blodfaktorer, herunder I

I faktor VIII og tPA, enzymer, antigener og andre proteiner og polypeptider af interesse. I

I 10 1 overensstemmelse med den i det foreliggende beskrevne udførelsesform af opfindel- I

I sen anvendes fremgangsmåderne ifølge opfindelsen til optimering af produktionen af I

I SMC-lignende polypeptider. I

I De følgende eksempler er givet for en bedre forstående af den heri beskevne opfin- I

I 15 delse. I

I Fremstilling af et rekombinant-DNA-molekvIe med en DNA-sekvens. som koder for et I

I SMC-lignende polypeptid I

Idet der nu henvises til figur 1, vises i skematiske hovedtræk en udførelsesform af I

I 20 fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et rekombinant-DNA-molekyle I

I (pLc24muSMC0ri), som ér karakteriseret ved, at det indeholder en DNA-sekvens, som I

I koder for human f-Met-SMC, hvilken DNA-sekvens er koblet til en DNA-sekvens, der I

I stammer fra mu og bærer en Shine-Dalgarno-sekvens fra mu, idet den kombinerede I

I DNA-sekvens er operativt bundet til en PL-promotor, der stammer fra bakteriofag λ. I

I 25 I

I Til fremstilling af pLc24muSMC0fj syntetiseredes først 14 oligodeoxynukleotider (se fi- I

I gur 1 og 2), sekvenser 1-11, X, Y og Z) under anvendelse af den for human SMC op- I

I lyste aminosyresekvens (Rinderknecht og Humble, supra, D.G. Klapper et al., Endo- I

I crinol,. 112, pp. 2215-17 (1983)). Til syntese anvendtes fastfasephosphotriestermet- I

I 30 hoden (H. Ito et al., Nucleic Acids Res.. 10, pp. 1755-69 (1982)). Efter afbeskyttelse af I

I de rå oligomere afsaltedes de ved hjælp af gelfiltrering på "Sephadex G-50" og de I

I rensedes ved hjælp af elektroforese på denaturerende præparative polyacrylamidgel- I

I plader indeholdende urinstof (T. Maniatis et al., Biochem.. 14, pp. 3787-94 (1975)). I

Båndene lokaliseredes ved hjælp af UV-skyggen og oligodeoxynukleotiderne isolere- I

35 des ved elektroeluering fra gelskiverne. Derpå phsophoryleredes de gelrensede oligo- I

deoxynukleotider under anvendelse af T4 polynukleotidkinase og rensedes atter på DK 175223 B1 10 15% polyacrylamid/77M urinstofgeler, idet DNA blev udvundet ved elektroeluering (T. Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). De 14 oligodeoxynukleotider varierede i størrelse fra 13 til 37 baser.

5 Under disse synteser blev der taget hensyn til kodonanvendelsen i højekspressionsgener af E. coli (R. Grantham et al., Nucleic Acids Res.. 8, pp. 1983-92 (1980)) og overskydende E. coli tRNA (T. Ikemura, J. Mol, Biol.. 151, pp. 389-409 (1981)). Endvidere inkluderedes et antal forskellige bekvemme endonukleasegenkendelsessteder i forskellige positioner langs oligonukleotidsekvenserne.

10

Derpå ligeredes sekvenserne 1-4 og X, Y og Z og sekvenserne 5-11 og de forlængedes med Klenow-polymerase til dannelse af to sammensatte DNA-sekvenser - dels fragment A, der er et 98-baseparfragment med afstumpet ende ("SMC A"), og dels fragment B, et 138-baseparfragment med afstumpet ende ("SMC B") (J.R. Rossi et al., 15 J. Biol. Chem.. 257, pp. 9226-29 (1982)) (figur 1 og 2). Fragment A koder for N-termi-nalenden af SMC og fragment B for den resterende del af SMC (figur 2).

Fragment SMC A fremstilledes ved opvarmning af 200 pmol af hver af sekvenserne 1-4, X, Y og Z til 95oC i 20 μΙ renormaliserende puffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 10 mM 20 MgCI2) og derpå langsom afkøling af blandingen til 4oC. Derpå tilsattes dithiothreitol, ATP og T4 DNA ligase til slutkoncentrationer på hhv. 5 mM, 70 μΜ og 20 μ/ml, hvorpå reaktionsblandingen inkuberedes ved 4°C i 10 timer. Efter ethanolfældning overførtes blandingen til en 8% polyacrylamid/7M urinstofgel og 77- og 78-baseparstrengene elueredeS. Derpå forenedes 25 pmol af hver streng i 5 μΙ renormaliserende puffer, og 25 reaktionsblandingen opvarmedes til 95°C og afkøledes langsomt til 15°C. Derpå tilsattes hhv. 5 mM, 250 μΜ og 2 enhder af dithiothreitol, dNTPér og Klenow-frag-mentet af DNA-polymerase, hvorefter blandingen fik lov at stå ved stuetemperatur i 30 minutter. Reaktionsprodukterne rensedes som ovenfor og 7 pmol af 98-basepar SMC A isoleredes. 20 pmol af 114-basepar SMC B fremstilledes på i alt væsentligt samme 30 måde under anvendelse af 200 pmol af hver af sekvenserne 5-11.

Hvert af disse fragmenter indføjedes så i en M13mp8-vektor med afstumpet ende og fremstillet ved restriktion af 2 pg RF DNA med BamHI (for fragment A) og med BamHI og Hindlll (for fragment B), reparation af de forskudte ender med 1 enhed E. coli DNA-35 polymerase (Klenow-fragment) i nærvær af de fire deoxynukleotidtriphosphater (dNTPér), fældning med ethanol og 5’-dephosphorylering med kalveintestinal phos-

I DK 175223 B1 I

I 11 I

I phatase (20 enheder i 10 mM Tris-HCI (pH 9,2), 0,2 mM EDTA) i 30 minutter (J. Mes- I

I sing. Methods in Enzymolodv. 101, pp. 20-78 (1983)). Til ligering anvendtes 20 ng af I

I den lineariserede vektor og 0,1 pmol af DNA-fragmentet i 10 μΙ ligeringspuffer og 40 I

I enheder T4 DNA polymerase ved 15°C i 24 timer (figur 1). I

I 5 I

I Når fragment A ligeredes med M13mp8-vektoren med afstumpet ende, opnåedes en I

I rekombinant fag, hvori BamHI-stederne var genskabt ved afslutningen af SMC-frag- I

I mentet og hvori der yderligere var dannet et Ncol-sted (GGATCCATGG) (mp8SMC A) I

I (figur 1). Når fragmentet B ligeredes med den med dobbelt afstumpede ender forsy- I

I 10 nede M13mp8-vektor, opnåedes en rekombinant fag, hvori var genskabt BamHI- og I

I Hindlll-stederne ved afslutningen af SMC-fragmentet (mp8SMC B) (figur 1). I

I Dernæst transformeredes E. coli JM101 (J. Messing og J. Vieira, Gene. 19, pp. 269-76 I

I (1982)) med hver af disse rekombinantfager og de transformerede værter overførtes I

I 15 på L-næringsmediumplader, der indeholdt 5-brom-4-chlor-3-indolyl^-galactopyranosid I

I (X-GAL). Derpå rensedes fag DNA fra 24 hvide pletter af E. coli JM101, som var I

I transformeret med mp8SMC A og mp8SMC B, og pågældende DNA sekvensopdeltes I

I ved dideoxy-kædeterminering (A.J.H. Smith, Methods in Enzymol.. 65, pp. 560-80 I

I (1980)). Derpå fremstilledes intracellulært RF DNA ud fra mp8SMC A og mp8SMC B, I

I 20 idet førstnævnte blev nedbrudt med Ncol/ BamHI og sidstnævnte med BamHI/ Hindlll, I

I og de SMC-beslægtede fragmenter isoleredes ved hjælp af gelelektroforese (figur 1). I

I Derpå blandedes de to fragmenter (SMC A og SMC B) med et 67-baseparfragment fra I

I ner-genet i bakteriofag mu (en gave fra B. Allet) (G. Gray et al., Gene, 32, under tryk- I

I 25 ning). Dette fragment består af nukleotider 1043-96 (H. Priess et al., Mol. Gen. Genet.. I

I 186, pp. 315-21 (1982), figur 4) med et forudgående EcoRI-endonukleaserestriktions- I

I sted og efterfølgende Nco1-sted (CCATGG), idet den indre sekvens ATG fra Ncol- I

I stedet danner en translationsstartkodon. Dette fragment indeholder også et næsten I

I optimalt ribosomalbindingssted (J. Shine og L. Dalgarno, Nature. 254, pp. 34-38 I

I 30 (1975)). Som et resultat af denne ligering isoleredes et 303-basepar EcoRI- Hindlll- I

I fragment, der omfattede mu genfragmentet, SMC A og SMC B (figur 1). Ligeringen I

I forløb således, at ATG-startkodonen i mu fragmentets Ncol-sted kobledes direkte og I

I med korrekt læseramme til SMC A (figur 1 og 2). I

I 35 Dette fragment introduceredes i pLc24 (E. Remaut et al., Gene,15, pp. 81-93 (1981)), I

I som forud var restriktionsbehandlet med EcoRI og Hindlll til dannelse af plasmid I

DK 175223 B1 12 pLc24muSMCori. Dette plasmid er karakteristisk ved, at det indeholder SMC-genet og start-ATG under kontrol af PL-promotoren fra bakteriofag λ (figur 1).

Ekspression af SMC-lionende polypeptider under anvendelse af plasmid 5 pLc24muSMCnri E. coli HB101 (T. Maniatis et al., Molecular Cloning. (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)) cotransformeredes med pLc24muSMCori og pcl857, der er et derivat af pACYC 184, som koder for en temperaturfølsom PL-repressor (E. Remaut et al., Gene. 22, pp.

103-13 (1983)). Da de to plasmider bærer gener for forskellig antibiotisk resistens --10 penicillinase (pLc24muSMC0n) og kanamycin (pcl857) -- kan korrekt cotransformerede kulturer udvælges ved dyrkning i 50 pg/ml ampicillin og 40 pg/ml kanamycin.

5 ml kulturer fra plader indeholdende korrekt transformeret E. coli HB101 (pLc24muSMCori) (pcl857) inokuleredes i L-næringsmedium indeholdende 50 pg/ml 15 ampicillin og 40 pg/ml kanamycin, og kulturerne dyrkedes natten over ved 28°C. Derpå sattes 2 ml af den natten over dyrkede kultur til 10 ml L-næringsmedium, der var forvarmet til 42°C, og kulturerne omrystedes kraftigt i en 100 ml Erlenmayer-kolbe ved 42°C i 2 timer. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35

Med henblik på at undersøge SMC-lignende polypeptidproduktion centrifugeredes 2 cellerne fra 1 ml alikvoter af kulturen (A550=20), og cellerne lyseredes ved kogning 3 (100°C) i 10 minutter i 50 pi SDS^-mercaptoethanollyseringspuffer (U.K. Laemmli, 4

Nature, 227, pp. 680-85 (1970)). Eventuel SMC-aktivitet undersøgtes derpå ved hjælp 5 af en radioimmunoprøve under anvendelse af et kommercielt prøvesæt (Nichols Insti- 6 tute Diagnostics), hvis standarder forud var efterprøvet med renset IGF-1 (en gave fra 7 R. Humbel). Til afprøvning fremstilledes SMC-holdige lysater som til gelelektroforese, 8 hvorefter lysaterne fortyndedes mindst 20 gange i prøvepufferen og undersøgtes in 9 duplo. Det viste sig, at human SMC, der var denatureret under standard lyseringsbe 10 tingelser, var ligeså reaktiv ved denne radioimmunoprøve som det naturlige hormon.

11

Denne prøve viste, at E. coli HB101 (pLC24muSMC0ri) (pcl857) ved temperaturinduktion producerer meget lidt SMC-aktivitet - 1,4 pg/ml ifølge radioimmunoprøven - og en mængde, der er upåviselig ved hjælp af coomassie blue farvning, på proteingeler.

Det ansloges, at størrelsesordenen af den SMC-lignende polypeptidproduktion i denne transformerede vært kun var nogle 100 molekyler per celle.

I DK 175223 B1 I

i 13 I

I Forsøg på forbedring af produktionen af SMC-lignende polypeptider I

I Som et resultat af den meget lave produktion af SMC-lignende polypeptider ved an- I

I vendelse af pLc24muSMCori forsøgtes fremstillet forskellige andre plasmider med for- I

I øgede ekspressionsniveauer.

I 5 I

I Under et sådant forsøg fremstilledes ekspressionsvektorer med en DNA-sekvens, som I

I koder for SMC, hvilken DNA-sekvens er koblet til en DNA-sekvens, som koder for et I

I andet protein. Ved denne fremgangsmåde fremstilledes et koblet protein, som i ami- I

I noterminalenden bestod af et non-SMC-protein og i carboxyterminalenden af et SMC- I

I 10 lignende polypeptid. Skønt sådanne koblede proteiner ville kunne fremstilles i højt ud- I

I bytte fra omhandlede vektorer, kan de være mindre foretrukne ved behandlingen af I

I dyr og mennesker end f-met-SMC eller SMC selv. Som et resultat heraf kræver så- I

I danne koblede proteiner af hensyn til den mest fordelagtige udnyttelse I

I yderligere behandling til fjernelse af non-SMC-delene derfra. Skønt sådanne metoder I

I 15 eksisterer (se fx US-patentskrift nr. 4.425.437, 4.338.397 og 4.366.246), kan de være I

I mindre foretrukne, bortset fra i tilfælde af direkte sekretion og afsondring, end den di- I

I rekte ekspression af et ønsket SMC-lignende polypeptid. I

I Følgelig anvendtes ved et andet forsøg på at forbedre produktionen af SMC-lignende

I 20 polypeptider den deletionsstrategi, som har vist sig nyttig til forøgelse af ekspressions- I

I niveauerne ved produktion af kvægvæksthonmon og svinevæksthormon. I denne for- I

I bindelse kan fx henvises til europæisk patentansøgning nr. 103.395 og 104.920. Un- I

I der anvendelse af disse fremgangsmåder fremstilledes forskellige modificerede SMC- I

I kodningssekvenser, der producerede SMC-lignende polypeptider, som var karakteri- I

I 25 seret ved aminoterminaldeletioner. Fx fremstilledes ekspressionsvektorer, som produ- I

I cerede en f-Met-A3-SMC og en f-Met-A6-SMC. Skønt produktionsniveauet for disse I

I modificerede SMC’er var en smule højere end produktionsniveauerne for f-Met-SMC I

I fra vektor pLc24muSMCori, var ekspressionsniveauerne stadig meget lave. I

I 30 Ved en tredje fremgangsmåde anvendtes endelig forskellige kombinationer af promo- I

I tor- og ribosombindingspladser til kontrol af ekspressionen af SMC-kodningssekven- I

I sen. Disse modifikationer var imidlertid om muligt endnu ringere med hensyn til SMC- I

I produktion end pLc24muSMC0ri· I

I 35 I

DK 175223 B1 14

Udvælgelse af optimale DNA-sekvenser. der koder for produktionen af SMC-liqnende polvpeptider

Da de to tidligere beskrevne fremgangsmåder enten var mislykkedes eller i mange tilfælde førte til produktion af en mindre foretrukket form af et SMC-lignende polypep-5 tid, besluttedes det at udforme en fremgangsmåde, som ville kunne gøre det muligt at udvælge optimale sekvenser, som koder for produktionen af et vilkårligt protein, og nærmere betegnet at udvælge de optimale DNA-sekvenser, som koder for produktionen af SMC-lignende polypeptider.

10 Denne fremgangsmåde var baseret på den hypotese, at stumme mutationer i DNA-sekvenserne, der indkoder N-terminaldelen af et vilkårligt gen, og i den særlige udførelsesform beskrevet i dette eksempel genet, der koder for f-Met-SMC, vil kunne tilvejebringe forbedret sekundær RNA-struktur og derfor føre til højere ekspressionsniveauer i en udvalgt vært. P.g.a. de mange mulige stumme mutationer, som det imid-15 lertid vil være nødvendigt at analysere for at bestemme, hvilken virkning de om muligt vil kunne have på ekspressionen med henblik på udvælgelse af de optimale kodningssekvenser, behøvedes en hurtig og simpel screeningsmetode for sådanne sekvenser.

Uden sådanne metoder ville klonscreening være besværlig, om ikke i realiteten umulig og metoden ville slå fejl.

20

Indkoblinger med lacZ har tidligere været anvendt til overvågning af produktionen af proteiner i mangel af analyser for deres genprodukter (L. Quarente et al., Cel|. 20, pp.

543-53 (1980), B.A. Castilho et al., J. Bacteriol.. 158, pp. 486-95 (1984)). β-galakto-sidaseproduktionen kan ydermere let overvåges under anvendelse af kolorimetriske 25 pladeanalyser. Følgelig besluttedes det at anvende denne screeningsmetode til udvælgelse af de optimale DNA-kodningssekvenser. Det er naturligvis åbenbart, at andre screeningsmetoder, skønt mindre foretrukne, også er nyttige i forbindelse med udvælgelsen af optimale DNA-sekvenser ifølge opfindelsen. 1 2 3 4 5 6

For at variere den sekundære struktur af SMC-kodningssekvenser i denne illustre 2 rende udførelsesform af fremgangsmåderne ifølge opfindelsen, fremstilledes en serie 3 syntetiske linkere, som omfattede de 256 mulige DNA-sekvenser, som koder for ami 4 nosyrer 2-6 i SMC. Skønt der kan kodes for aminosyrerne 2-6 i SMC med de 256 for 5 skellige sekvenser, anvendtes en 512 gange degenereret linker (figur 3) for at tage 6 hensyn til alle mulige leucinkodoner (SMC position 5), herunder TTY, som koder for phenylalanin. Det er naturligvis åbenbart, at længere eller kortere oligonukleotider

I DK 175223 B1 I

I 15 I

I også kunne have været anvendt ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen. Fx kunne I

I længere syntetiske linkere, fx sådanne, der koder for op til SMC-aminosyre 20, være I

I nyttige at anvende til bestemmelse af effekten af disse længere sekvenser ved eks- I

I pression af SMC. De overskydende DNA-sekvenser i omhandlede serie af 512 gange I

I 5 linkere er afbildet i figur 3. I

I Idet der nu henvises til figur 3, er der afbildet en udførelsesform af en fremgangsmåde I

I til anvendelse af disse overskydende DNA-sekvenser i forbindelse med SMC-produk- I

I tion. Som det fremgår af figur 3, subklonedes først 165 basepar EcoRI- BamHI-frag- I

I 10 mentet af pl_c24muSMCori i EcoRI- BamHI-kløvet pUC8, hvorved der i fasen dannedes I

I en kobling imellem lacZ og SMC ved BamHl-stedet. Denne vektor betegnedes I

I pUCmuSMCAon (figur 3). pUC8 valgtes p.g.a. dens ringe størrelse og dets enestående I

I restriktionssteder, som afbryder lacZ, og fordi den kan anvendes i en lac'-vært. Det er I

I imidlertid åbenbart, at andre plasmider, som bærer et lacZ-gen, også vil kunne anven- I

I 15 des ved ovennævnte screeningsproces. I

I Da koblingen foretages ved at indføje SMC-kodningssekvenserne i det proksimale I

I promotorområde for lacZ-genet, er ekspressionen af hybridgenet under kontrol af lac- I

I promotoren fra pUC8. I

I 20 I

I Ribosomer kan starte translationen i pUCmuSMCAon ved lac-ribosombindingsstedet. I

I Imidlertid vil en sådan translation hurtigt standse ved stopkodonerne i rammen af mu- I

I fragmentet, der stammer fra pLc24muSMCori. Alternativt kan ribosomerne starte I

I translationen ved mu-ribosombindingsstedet til frembringelse af et koblingsprotein, I

I 25 som består af en aminoterminaldel fra SMC og en carboxyterminaldel fra lacZ. SMC- I

I β-galactosidasekoblingen i pUCmuSMCAon indeholdt 35 aminosyrer af SMC ved N- I

I terminalen. I

Skønt koblingsgenet i pUCmuSMCAon er i fase, når E. coli JM83 transinficeres (J. I

I 30 Vieira og J. Messing, Gene. 19, pp. 259-68 (1982)) med plasmidet og den transforme- I

I rede vært dyrkes på LB-agarplader indeholdende 5-brom-4-chlor-3-indolyl-R-D-galac- I

I topyranosid (X-GAL), iagttages kun hvide kolonier efter 16 timer ved 37°C. Skønt I

I disse kolonier efterhånden blev meget lyseblå efter 40 timer, påviste den hvide farve I

efter 16 timer, at de kun producerede meget lidt af SMC-ii-gal-koblingsproteinet. Dette I

I 35 resultat stemmer naturligvis overens med det tidligere iagttagne lave ekspressionsni- I

veau i pLc24muSMCorj. I

DK 175223 B1 16 I plasmid pUCmuSMCAon indførtes så hver samling af omhandlede 512 gange degenererede syntetiske DNA-linkere (Avail- Haell-fragmenter), som koder for aminosyrer 2-6 i SMC, som erstatning for kodningssekvenserne for disse aminosyrer i det 5 oprindelige plasmid. Disse linkere phosphoryleredes ikke før ligering for at undgå sammenkædning af linkerbestanddele. Disse sekvenser introduceredes i plasmid pUCmuSMCAon ved at ligere hver især med fragmentet, som koder for mu-ribo-sombindingsstedet plus SMC-aminosyre 1 (70 basepar EcoRI-Avall-fragmentet af pUCmuSMCAori), og fragmentet, som koder for aminosyrer 7-32 af SMC (71 base-10 par Haell- BamHI-fragmentet af pUCmuSMCAon), og derpå indføje det resulterende EcoRI-BamHI-kombinationsfragment i EcoRI-BamHI-restriktionsbehandlet pUCmuSMCAon (se figur 3).

5000 kolonier af E. coli JM83, der var transformeret med ovennævnte blanding af 15 plasmider, pladedyrkedes på L-næringsmediumplader indeholdende X-GAL. Ca. 10% af de resulterende kolonier var mørkere blå end pUC8muSMCAon efter 40 timer ved 37eC. Derpå analyseredes 14 (både blå og hvide) af de 5000 kolonier (E. coli JM83 (pUCmuSMCA 1-14)) ved hjælp af forskellige metoder: DNA-sekvensopdeling af det degenererede område, β-galactosidase-enzymatisk aktivitet og SMS-ekspression i E.

20 coli C600 (T. Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)) efter substitution af 165 basepar EcoRI- BamHI-fragmentet af hver pUCmuSMCA 1-18 i pLc24muSMCori. Disse sidstnævnte plasmider betegnes pLc24muSMC 1-18 i figur 3. Af de til analyse udvalgte 14 kolonier var 10 blå og 4 var hvide på X-GAL-pladerne. I tabel I er resultaterne af de forskellige analyser vist.

I DK 175223 B1 I

I 17 B

I Tabel I I

I 2 3 4 5 6 pUC8 kob- pL-plasmid B

I Plasmid pro glu thr leu cys lingsenheder pg/ml SMC B

I β-gal* OD20-lysat I

I oprindelig 2-6 CCA GAA ACC CTG TGC 0,4 1,4 B

I sekvens

I pUCmuSMCAorj I

I blå kolonier B

I pUCmuSMCA 1 CCC GAA ACT CTG TGT 3,1 33 I

I 2 CCT GAA ACT TT G TGC 2,6 45 I

I 3 CCA GAG ACG TTG TGC 0,9 35 I

I 4 CCA GAG ACG TTG TGT 0,9 43 I

I 5 CCT GAA ACT TTG TGT 2,9 33 I

I 6 CCT GAG ACG TTG TGT 1,2 58 I

I 7 CCG GAA ACG TTA TGT 1,9 50 I

I 8 CCG GAA ACA TTG TGT 1,2 65 I

I 9 CCA GAA ACG TTG TGT 1,1 32 I

I 10 CCT GAG ACT CTA TGT 2,3 42 I

I

I hvide kolonier B

I pUCmuSMCA 11 CCC GAA ACC CTC TGT <0,1 0,10 B

I 12 CCT GAA ACC CTC TGT <0,1 0,11 I

I 13 CCG GAA ACC CTC TGT <0,1 0,10 I

I 14 CCA GAA ACC CTC TGT <0,1 0,09

I β-galactosidase-aktiviteten undersøgtes ved hjælp af o-nitro- I

I phenyl-p-D-galactosid (ONPG), i alt væsentligt som beskrevet

I i J.H. Miller, Expreiments in Molecular Genetics (Cold Spring I

I Harbor Laboratories) (1972). I

DK 175223 B1 18

Som det fremgår af tabel I, producerede de blå kolonier, som indeholdt pUC8muSMCA 1-10, 2,5-8 gange flere enheder β-galactosidase end E. coli JM83 (pUC8muSMCAori)- I modsætning hertil producerede de hvide kolonier indeholdende pUCmuSMCA 11-14 ingen påviselig β-galactosidasemængde. Skønt β-galactosidase-5 produktionen af pUC8muSMCA 1-10 var 2,5-8 gange højere end for parentalplasmi-det, når Eco-RI- BamHI-fragmenterne fra disse plasmider indføjedes i pLc24muSMCori, frembragtes der overraskende plasmider, som i E. coli HB101 producerede 23-46 gange mere SMC end parentalplasmidet. Der var ligeledes ingen umiddelbar specifik sammenhæng mellem enheder β-galactosidase for en given kobling og pg SMC for 10 den tilsvarende ekspression under PL-kontrol. Den blå/hvide forske! mellem kolonierne på X-GAL-pladerne muliggjorde imidlertid tydeligt udvælgelsen af DNA-sekvenser, som kodede for høj ekspression af SMC. Denne metode kan således generelt anvendes til at udvælge optimale DNA-sekvenser til produktion af et vilkårligt, ønsket euka-ryotisk eller prokaryotisk polypeptid.

15

Skønt det ikke er hensigten at være bundet af en teori, formodes det, at de forskellige ekspressionsniveauer, som udvises af de degenererede DNA-sekvenser, er relateret til den sekundære RNA-struktur af de nukleotider, som koder for de N-terminale aminosyrer i SMC. Omhandlede resultater antyder fx, at den mulige CCC-sekvens, der 20 dannes af kodonerne for threonin-leucin (ACN-CTN) (SMC-positioner 4 og 5), er særligt skadelig for SMC-syntesen. Alle de analyserede hvide kolonier og pUCmuSMCon var karakteriseret ved denne sekvens, som kunne danne hydrogenbindinger med ribosombindingsstedet i pLc24muSMC. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Skønt der i den ovenfor beskrevne udførelsesform af opfindelsen anvendes en DNA- 2 sekvens, som koder for den ønskede protein-lacZ-kobling, der frembragte et koblings- 3 • protein med 35 SMC-aminosyrer ved N-terminalenden, må de relative længder af de 4 to dele af koblingsproteinet af hensyn til den mest effektive screening ifølge omhand 5 lede fremgangsmåde bestemmes empirisk. De ovennævnte eksperimentelle resultater 6 har identificeret nogle af de faktorer, som bør tages i betragtning ved foretagelse af 7 dette valg. Fx er styrken af ribosombindingsstedet vigtig. Når et trp-ribosombindings- 8 sted anvendtes i stedet for bindingsstedet fra mu, frembragte koblinger, der indeholdt 9 35 SMC-aminosyrer, ikke blå kolonier. De relative dele af β-galactosidasen og det ud 10 valgte protein i koblingsproteinet er også vigtige. Genkoblinger, der frembringer kob- 11 lingsproteiner med kun 14 SMC-aminosyrer ved N-terminalenden, tillod fx ikke blå/hvid udvælgelse. I dette tilfælde var β-galactosidase-aktiviteten i koblingsproteinet åbenbart

I DK 175223 B1 I

I 19 I

I for høj til, at detektion af optimale N-terminalbindingssekvenser kunne lade sig gøre. I

I Endelig er detektionssystemets følsomhed vigtig. Det viste sig, at det β-galactosidase- I

I aktivitetsområde, som var nyttigt ved screeningen, udgjorde 1-8% af det af det oprin- I

I delige pUC8 producerede β-galactosidaseniveau. Ved at tage passende hensyn til I

I 5 disse faktorer samt andre, der tilsvarende kan bestemmes som beskrevet ovenfor, kan I

I fagmanden udvælge det passende koblingsprotein og foretage screening ved hjælp af I

I de beskrevne metoder uden at afvige fra opfindelsens ånd og rammer. I

I Skønt det specifikke SMC-lignende polypeptid, der frembringes i ovennævnte udføret- I

I 10 seseksempel, er en f-Met-SMC, er det åbenbart, at f-Met kan Ijernes fra SMC på et I

I antal forskellige kendte måder. I

I De ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen fremstillede SMC-lignende polypeptider I

I kan formuleres under anvendelse af konventionelle metoder til farmaceutisk anvende- I

I 15 lige præparater. Disse præparater omfatter en farmaceutisk effektiv mængde af det I

I SMC-lignende polypeptid til fremkaldelse af den ønskede vævsvækststimulering I

I og fortrinsvis en farmaceutisk acceptabel bærer. Egnede bærere er velkendte. Som I

I tidligere anført er præparaterne så nyttige ved fremgangsmåder til stimulering af I

I vævsvækst og ved behandlingen af dværgvækst, muskelatrofi, brækkede knogler, sår I

I 20 eller andre vævskvæstelser. I

I Mikroorganismer og rekombinant-DNA-molekyler, som er fremstillet ved ovennævnte I

I fremgangsmåder, er eksemplificeret ved kulturer, som er deponeret ved kultursamlin- I

I gen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Gbttingen, Vesttyskland, d. 23. marts I

I 25 1985, og identificeret som SMC-1 og SMC-2. I

I SMC-1: E. coli HB101 (pcl857) (pl_c24muSMCori). I

I SMC-2: E. coli HB101 (pcl857) (pLc24muSMC 8). I

I 30 Disse kulturer blev hhv. tildelt accessionsnummer DSM 3276 og 3277. I

I Skønt der i det ovenstående er angivet et antal udførelsesformer af opfindelsen, er det I

I åbenbart, at basisprincippet kan ændres til tilvejebringelse af andre udførelsesformer, I

I der anvender fremgangsmåderne og præparaterne ifølge opfindelsen. Det ér derfor I

I 35 åbenbart, at opfindelsens rammer er defineret ved hjælp af kravene nedenfor frem for I

I ved de specifikke udførelsesformer, der ovenfor er fremført som eksempler. I

Claims

1. Fremgangsmåde til forbedring af produktionen af et ønsket polypeptid i en vært, som er transformeret med en DNA-sekvens, der koder for dette polypeptid, og som er 5 operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens, KENDETEGNET ved, at man erstatter en DNA-sekvens, som koder for en del af N-terminalenden af et let analyserbart polypeptid, med en degenereret række DNA-sekvenser, der koder for en del af N-ter-minalenden af det ønskede polypeptid, hvilken erstatning i alt væsentligt ikke påvirker analyserbarheden; i en vært udtrykker den resulterende række af hybrid-DNA-sekven-10 ser, der er operativt bundet til den ønskede ekspressionskontrolsekvens; udvælger de særlige hybrid-DNA-sekvenser, som muliggør den optimale produktion af det let analyserbare polypeptid; og anvender de udvalgte DNA-sekvenser, som koder for N-ter-minaldelen af det ønskede polypeptid, ved ekspression af polypeptidet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det let analyserbare poly peptid er udvalgt fra gruppen bestående af li-galactosidase, galactokinase og lægemiddelresistente markører.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det ønskede polypeptid er 20 udvalgt fra gruppen bestående af interferoner, interleukiner og andre lymfokiner, blodfaktorer, enzymer, virale antigener, SMC, væksthormoner og andre hormoner samt andre polypeptider af animalsk og human oprindelse.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at ekspressionskontrolse-25 kvensen er valgt fra gruppen bestående af lac-systemet, trp-systemet, tac-systemet, tre-systemet, hovedoperator- og promotorregionerne i fag λ, kontrolregionen i fd overtræksprotein, de tidlige og sene promotorer af SV40, promotorer afledt af polyom, adenovirus og simianvirus og promotorerne af gærglykolytiske enzymer, σ-tilpasings-faktorer og syrephosphatase. 30

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at værten er udvalgt fra gruppen bestående af stammer af E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, gær, andre svampearter, dyreceller og planteceller. 1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at DNA-sekvensen koder for et polypeptid, som udviser vækststimulerende eller -formidlende aktivitet af SMC, og I DK 175223 B1 I I 21 I I er udvalgt blandt DNA-indføjelserne af pl_c24muSMC 1 og pLc24muSMC 3 til I I pLc24muSMC 10 som beskrevet i tabel I og figur 3. I

7. DNA-sekvens, KENDETEGNET ved, at det koder for et ønsket polypeptid, der I I 5 fremstilles ved en fremgangsmåde omfattende de trin, at man erstatter en DNA-se- I I kvens, som koder for en del af N-terminalenden af et let analyserbart polypeptid, med I I en degenereret række DNA-sekvenser, der koder for en del af N-terminalenden af det I I ønskede polypeptid, hvilken erstatning i alt væsentligt ikke påvirker analyserbarheden; I I i en vært udtrykker den resulterende række af hybrid-DNA-sekvenser, der er operativt I I 10 bundet til den ønskede ekspressionskontrolsekvens; udvælger de særlige hybrid-DNA- I I sekvenser, som muliggør den optimale produktion af det let analyserbare polypeptid; I I og erstatter en del af en DNA-sekvens, som koder for N-terminalenden af det ønskede I I polypeptid, med de udvalgte DNA-sekvenser, der koder for N-terminaldelen af det øn- I I skede polypeptid. I I 15 I

8. DNA-sekvens ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at den koder for et polypeptid ud- I I valgt fra gruppen bestående af interferoner, interleukiner og andre lymfokiner, blod- I I faktorer, enzymer, virale antigener, SMC, væksthormoner og andre hormoner samt I I andre polypeptider af animalsk og human oprindelse. I I 20 I

9. DNA-sekvens ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at den koder for et polypeptid, I I der udviser vækststimulerende eller -formidlende aktivitet af SMC, og er udvalgt I I blandt DNA-indføjelserne plc24muSMC 1 og pLc24muSMC 3 til pLc24muSMC 10 I I som beskrevet i tabel I og figur 3. I I 25 I

10. Rekombinant-DNA-molekyle, KENDETEGNET ved en DNA-sekvens ifølge krav 7. I

11. Rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 10, KENDETEGNET ved, at DNA-sekven- I I sen er operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens i rekombinant-DNA-mole- I I 30 kylet. I

12. Rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 11, KENDETEGNET ved, at ekspres- I I sionskontrolsekvensen er udvalgt fra gruppen bestående af lac-systemet, trp-syste- I I met, tac-systemet, tre-systemet, hovedoperator- og promotorregioneme i fag λ, kon- I I 35 trolregionen i fd overtræksprotein, de tidlige og sene promotorer af SV40, promotorer I DK 175223 B1 22 afledt af polyom, adenovirus og simianvirus og promotorerne af gærglykolytiske enzymer, o-tilpasingsfaktorer og syrephosphatase.

13. Rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 12, KENDETEGNET ved, at den er ud-5 valgt fra gruppen besåtende af pLc24muSMC 1 og pl_c24muSMC 3 til pLc24muSMC 10 som beskrevet i tabel 1 og figur 3.

14. Vært KENDETEGNET ved, at den er transformeret med mindst et rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 10. 10

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket polypeptid, KENDETEGNET ved det trin, at man dyrker en vært transformeret med et rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 10.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, som udviser vækststimulerende eller -formidlende aktivet af SMC, KENDETEGNET ved det trin, at man dyrker en vært transformeret med et rekombinant-DNA-molekyle ifølge krav 13.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, KENDETEGNET ved, at værten er udvalgt fra 20 gruppen bestående af stammer af E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, gær, andre svampearter, dyreceller og planteceller. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 17, KENDETEGNET ved, at den transformede vært er E. coli HB101 (pcl857) (pLc24muSMC 8) DSM 3277. 25