JPS61233629A - 生物学的に活性な蛋白及びその産出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

技術的分野 この発明は、外来性ＤＮＡ配列（例えば真核生物遺伝子
）を原核生物内で発現させる方法に関するものである。 本発明の一つの重要な実施態様は、Ｎ−末端にアラニン
を持つポリペプチドを原核生物内で産出することであり
、及びその方法で作り得る種々のＮ−アラニール　ポリ
ペプチド産出に関１−るものである。産乳ｈ１を予期し
得ないほど著しく増加させる一連のバリンｂＧ　Ｈ（ウ
シ属の成長ホルモン）種も含まれる。 ■見背Ｉ 遺伝子の発現は、真核生物と原核生物とで、遺伝子をメ
ツセンジへ７−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に複写し、その後そ
のｍＲＮＡを蛋白質に翻訳すると云う、共通の基本的過
程を有するが、これら過程での細胞内制御１機構は違っ
たものが用いられる。 更に、真核生物においては、成熟蛋白質の多くが、最初
は成熟蛋白質のアミノ酸配列を含／ｖだ先導又は信号配
列と融合したポリペプチドである、前蛋白質どして翻訳
される。真核生物のｍ　ＲＮ　Ａは、前蛋白質の全長に
ついての暗号を持ち、この全暗号の翻訳後に先導アミノ
酸配列部分を除去して、成熟蛋白質に仕上げるものであ
る。真核生物細胞においては、そのにうな前蛋白質を、
成熟蛋白質に特定してプロセス化するようになっている
が、原核生物細胞は、そのような真核生物にあるプロレ
ス化信号を、通常は認知しない。このため、若し真核生
物のｍＲＮＡから完全に複写した相補的ＤＮＡ　（ｃＤ
ＮＡ）を、原核生物で発現のためのＤＮＡ配列として使
用したならば、成熟蛋白質ではなくて、前蛋白質が作ら
れてしまう。前蛋白質を細胞外で成熟蛋白質に転換する
ことは可能であるが、無視できない費用を必要とする。 原核生物において、成熟蛋白質のＤＮＡ配列を発現させ
る場合、この配列は、真核生物の、翻訳と先導アミノ酸
配列の為のり、ＮＡ配列に通常含まれている翻訳後のプ
ロセス化の信号を欠いている。 従って、クローンにした真核生物遺伝子又は他の外来性
ＤＮＡ配列を原核生物で発現させるためには、効率の悪
さと、真核生物での信号が原核生物の宿主細胞で認知さ
れない可能性の故に、原核生物の制御信号を用いねばな
らないことが確められている。 この叫細書中では、゛外来性１’）　Ｎ　Ａ　”という
用語は、少くと−ｂ一部分が宿主細胞のゲノムに通常含
まれていない組成を持つ１）ＮＡであると定義づＧＪら
れる。外来性ＤＮＡの例としては、ウィルス又は真核生
物の遺伝子、遺伝子断片、対立因子および合成１’）Ｎ
Ａ配列等を含むが、それらに限定されるわ

【Ｊではない
。゛外来性蛋白質″又は“外来性ポリペプチド°′とい
う二つの用語は、この明細書中では、組成の少くとも一
部が、宿主ゲノムに通常はコーディングされていない蛋
白質又はポリペプチドであると定義づけられる。 原核生物の制御信号には、複写開始を発信するブ［１モ
ーターと、リボソーム結合部位、翻訳開始信号および翻
訳停止に信号よりなる翻訳制御信号が含まれる。翻訳停
止信号以外のこれら開信号は、真核生物の遺伝子、或い
は発現すべき他のＤＮＡの前に位置しなければならない
。 外来１！１ＤＮＡ（例えば真核生物遺伝子）を原核生物
で発現させる技法には、幾つかのアプローチが応用され
ている。１法によれば、結果産物である蛋白質をコード
したＤＮＡ断片を、バクテリア蛋白質の全部又は一部を
］−ドしたＤＮＡに、そのバクテリアのプロモーターの
制御下でリゲートすることである。その上、内生の原核
生物のＤＮＡは、リボソーム結合部位と翻訳開始信号と
を持つ必要がある。このようにリゲートされたＤＮＡが
発現されると、真核生物のポリペプチドが、バクテリア
蛋白質の全部又は一部と連結又は融合して含まれる、融
合蛋白質と呼ばれるものを作る。真核生物の蛋白質をこ
れから分離することは、位置特定の酵素又は化学分解を
、内生−真核生物蛋白質の融合位置に応用することで、
又は、原核生物ポリペプチドのアミノ酸配列を選択的に
分解することで達成できる。 真核生物の融合蛋白質をバクテリアで産出することに関
連した公表業績の中には以下の如きものがある。即ち、
融合、非融合蛋白質で牛のプレ成長ホル［ン又は牛の成
長ホルモン（ｂＧＨ”）をカルボキシ（Ｃ−）末端に含
み、原核生物蛋白質をアミノ（Ｎ−）末端に含むか又は
含まないも＝　１０− のについて、］−［１ツバ特許出願第４７，６００号な
９Ｂ　２　”ｉｔ　３月１７日公聞）　：　ｂ　Ｇ　Ｆ
ｌと大腸菌のβ−ラクタマーＵの融合蛋白質に関１ノだ
英田特訂出願第２．０７３．２４５Ａ号な９８１年１０
月１４日公開）：ｂＧｌｌと大腸菌のβ　ラクタマーゼ
の融合蛋白質に関したイー・ケシエツト等（Ｅ、　Ｋｅ
ｓｈｃｔ　ｅｌ：　ａｔ　）にＪ：るＮ　ＩＩ−Ｃｌ　
ｅ　ｉ　ＣＡ　Ｃｉ　（ＩＲｅｓｅａｒｃｈ、　９　：
　１９−１３０　な９８１）　　：順に、Ｎ−末端に内
生蛋白質を１つ、翻訳開始信号１つ、エンテロ−１−ナ
ーＩ！開裂部位１つ、及び外生蛋白質（例えば成長ホル
モン）１つをＣ−末端に持つような融合蛋白質に関する
］−ロッパ特訂出願第９５．３６１号。な９８３年１１
月３０日公開）。この融合蛋白質による方法は、しかし
、純化の後に行うＬシ　ビトロでの精製を必要とするこ
と、商業的量産に用いる酵素の価格がはなはだ高価と（
ｉるために厄介である。 それでも、融合蛋白質は、幾つかの真核生物遺伝子、又
はＩＩ！！の原核細胞内の異質ＤＮＡを発現さＵる場合
に、融合して生成した産物である融合蛋白質が、産物ど
して生成した外来性蛋白質を細胞内分解より保護するた
めに魅力的なシステムになって来ている。バクテリアの
細胞は、自己の細胞で生産された真核生物蛋白質の幾つ
かを外来物と認識して、それらが産出後直ちに又は産出
後傾時間で分解のための処置をするようである。防護の
目的で遺伝子操作された融合蛋白質は、アミノ末端又は
カルボキシル末端のいずれか一方に内在のポリペプチド
配列を置いたものを採用することである。後者の方法の
例は、ヨーロッパ特許出願第１１１．８１４号な９８／
１年６月２７日公開）であり、これは合成前端（アミノ
末端）と、Ｃ−末端に大腸菌のβ−ガラクトシダーゼを
持つｂ　Ｇ　Ｈの形態よりなる融合蛋白質につき記載し
ている。これの利点は、前述のＪ：うに、外来性蛋白質
を内生ポリペプチドから切り離さ２７ければならないこ
とで消去されてしまう。 もう一つの試みでは、バクテリアのプロモータ６父゛ 一支配下での翻訳開始信号であるＡＴＧ奢外来性（例え
ば真核生物の）蛋白質で、Ｎ−末端もＣ−構築で産１１
日ノた蛋白質１５Ｌ１後に開裂操作にＪ：り希望覆る蛋
白質にする必要はないけれども、このＪ−うな蛋白質は
、典型的な場合にはメチオニン（時には）Ａルミール　
メチオニン）をＮ−末端に持ち、この現象は開始信号で
あるＡ　Ｔ　Ｇが、メチオニンのコドンでもあることか
ら起る。このようなわＬ−Ｊで、必要どする成熟蛋白質
がメチオニンで始まる配列を持たない限り、この蛋白質
はＮ−末端がメチオニン残基の追加で変更されているこ
とどくＴる。 １記のような遺伝子構築の例には、ギＡ７ランデ等（６
ｕａｒｅｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ、）、（Ｃｅｌｌな９８０
）２０：５４３−５５３）よるものがあり、これでは、
Ｎ−末端にバリンを持つ兎のβ−グロヒン遺伝了がいま
述べた方法で構築した遺伝子を用いて大腸菌中で発現ざ
【！′ている。この場合“兎のβ−グロブリンではメチ
メニン末端を持たず、ロイシンが３番、１４番、２８番
、３１番、３２番・・・・・・−１３＝ の位置にあるのに対して（放射能で）標識した蛋白質で
は、ロイシンが４番、１５番、２９番、３２番及び３３
番にあり、メチオニンが１番にあることを当該研究者ら
は発見した。このことは、この蛋白質が兎のβ−グロブ
リンにメチオニンのアミノ末端を付加され、大腸菌の中
で除去されなかったものであることを示す。同論文の５
４６−５４７頁参照。 もう１つの例は、上記の遺伝子構築でバクテリア細胞内
での生長ホルモン産出に関Ｊるものである。ショウナー
等（Ｓｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ、）　、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１１．ｓ、Ａ、
　な９８４）　８１　：５４０３−５４．０７によると
、バクテリアによるｂ　Ｇ　ｌ−１の高度発現システム
は、Ｎ−メチオニールｂ　Ｇ　ｌ−１を産出する；即ち
天然産のｂ　Ｇ　ｌ−１のアミノ酸配列を持つ化合物の
、Ｎ−末端にメチオニンが付加されたものに外ならない
。バクテリア中で産出された、種々の生長ホルモン類の
Ｎ−末端にメチオニンが付加されることは、ヨーロッパ
特許出願、第１０３．３９５号な９８’４年３月２１日
公開）とＢ　−＋１ツバ特許出願第７５．４／１４月な
９８３年３月３０１」公開）でＥ’）　Ｇ　Ｈについて
論シラレ、シーバーブ等（Ｓｅｅｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ
、）によりＤＮＡ　な９８３）２　：３７−４５で、ｂ
　Ｇ　ｔｌど豚の生長ホルモン（“’ｐＧＨ”）で論じ
られている。 いる。 天然物のＮ−末端に、Ｎ−末端メチオニンがイ」加する
ことは、幾つかの理由で望ましくない。第一は、そのメ
チオニンの存右する蛋白質は、Ｎ　−末端メチオニンの
無い形を内在蛋白質としている生物で抗原どして働くか
も知れない（現ｆｆ；１点では、ありＩＵそうもないと
信じられているが）ことである。第二は、Ｎ−末端にメ
チオニンが付加すると、その蛋白質の生理活性又は物理
的な性質に好ましくない影響を与える可能性があること
である。第三は、蛋白質の形状が変更されていることで
、天然蛋白類の機能と構造との関係を決定する利学的努
力を妨げるかも知れないことである。更に、生合成蛋白
質を、天然産蛋白質と出来る限り近似の構造にして１行
＜ことが、医学的、獣医学的使用の為に政府の承認を得
るに際して有利なことである。 Ｎ−末端メチオニンを、その蛋白質の産出中、又はその
後に蛋白質から取除く能力のあるバクテリアのような原
核生物は、従って非常に興味のある話題である。例えば
、ウエラー（Ｗａｉｔｅｒ）は、すｏｆ、　Ｂｉｏｌ、
　　な９６３）　７　：４８３−４９６で無細胞大腸菌
抽出液から１９た゛可溶性″蛋白質およびリボソーム蛋
白質についてＮ−末端アミノ酸構成を調査している、又
ヨーロッパ特許出願第１０３．３９５号な９８４年３　
Ｊ］２１日公開）は、大腸菌で産出された真核生物蛋白
質から、Ｎ−末端メチオニンが除去されることを明らか
にした。 即ち、バクテリアで生産された二種のｂ　Ｇ　ｌ−１で
どちらも元来あるＮ−末端メチオニンの直後にセリンを
持つもののうちの一つからメチオニンが特異的に取除か
れている。この研究に用いられた遺伝子構築では、しか
し、５′−メチオニン−セリン−ロイシン−３′の為の
開始信号を］−ドする部分を合成して、ｂ　Ｇ　ｌ−１
の５′端に接して挿入されていて、その挿入部では、天
然にある蛋白質で最初の１分子又は９分子に当る諸アミ
ノ酸を］−ドＪる部分が欠（）ている。こうして大腸菌
で産出される蛋白質は、天然には産出されない蛋白質で
あった。英国１４訂出願第２，０７３，２４５Ａ月な９
８１年１０月１４日公開）は、成熟ｂ　Ｇ　Ｈ蛋白質で
、メチオニンとプロリンがアラニンど入れ換っている時
、“メチオニンはバクテリアで、アミノ酸配列、プロリ
ン、フェニールアラニン、アラニン、プロリンで始まる
修飾されたｔ）　Ｇ　ｌ−Ｉどして産出される″ことを
明らかにした。 このＪ：うに、バクテリアのような微生物に異質（例え
ば真核生物の）蛋白質が、Ｎ−末端メチオニンを持たな
いで経演的でかつ予期できる方法の開発が必要である。 更に、バクテリアで作られた蛋白質が、細胞外での醗酵
後の処理を必要とせず、しかも天然物に無いＮ−末端メ
チオニンの付加が起らない方法の開発が特に望まれる。 成長ホルモン（ソマトトロピンとも呼ばれる）は脳下垂
体細胞で作られ分泌されるポリペプチドであり、その作
用は多くの場合、種特有である。 それは骨格の生育を促寸役割の外に、泌乳促進、膵臓か
らのインシュリン排出とグルカゴンの分泌増大などの代
謝過程に影響を及ぼし、更にリピッド移動の効果を発揮
する。例えば牛にｂ　Ｇ　Ｈを外部投与すると、産乳量
、飼料効率および／又は生長率が増し、肥育期間を短縮
し、赤身／脂肪比を良くする。しかし、ホルモンがどう
してこれらの多重的な効果を発揮するのかは未だ十分に
は判明していない。 人間の成長ホルモン（ｈ　Ｇ　Ｈ）の広範囲な研究によ
って、このホルモンが脳下垂体から分泌されるときは、
１種類の分子としてではなく、幾つかのポリペプチドの
混合物であることが確認されている。種々のｈ　Ｇ　ｌ
−１種を分画すると、そのうち幾つかの両分は、糖尿病
誘発性作用もなく油脂分解作用もない。 同様に、牛のｂ　Ｇ　ｌ−１でも、複数の種類が産出さ
れる。特に、これら４態のｂＧ）−１は、蛋白質の２ケ
所が相互に違って産出される。Ｎ−末端のアミノ酸は、
信号ペプチド（リーダーペプチド）のアミノ酸配１１１
の除去における予想される多様性からみて、変わりうる
ものであって、その結果成熟蛋白質はＮ１１２−フェニ
ールアラニン−プロリン又は、Ｎ　Ｈ２−アラニン−フ
ェニールアラニン−プロリンのどちらかで始まることど
なる。更に、１２６番のアミノ酸が［ｌイシンであるか
バリンであるかにｊ：る不均一１なもある。この現象は
明らかに、牛の集団中にある対立遺伝子の変異によるも
のである。ウオーリスな・１ａｌｌｉｓ　な９６９）Ｆ
ＥＢＳｌ、ｅｔ劃側ｒｓ　　　３：１１８−１２０：）
　　フ　Ｔローズ及びロゴール（Ｆｅｌｌｏｗｓ　＆　
Ｉｌｏｇｏｌな９６９）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　
２４４　：１５６７−１５７５）；フエルナンデス等（
ｒｅｒｎａｎｄｅｚ　ｅｔａｌな９７１）ＰＩ三　Ｂ３
　　　　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　　　１　　８　　　：　　
　５３　−５４）、フエ０−ズ（Ｆｅｌｌｏｗｓ　　な
９７３−）脛鵠叫二Ｐｒｏｏｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｉｌｏｒ
ｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２９　：４０４　）　’
７）私な’Ｊ論Ｆ　；　’Ｊントム（ｓａｒｔｔｏｍｅ
な９７３）ＩＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　３７　
：　１６４−１７０）；グラフ及びり−（Ｇｒａｆ　＆
　ｌｉな９７／ｌ　）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐ
ｈｙ−ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ＋ｎｍ、　５６　：１６８−１
７６）参照。脳下垂体のｂ　Ｇ　ｌ−ｌの４つの型（種
）は、本明１１１１書中では次のように定義【ノ、略称
する： 一　　２１　− ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）おＪ：びｂＧＨ（Ｖ）種はときとして
集合的にこの明細書中では、バリン゛対Ｓ’Ｚ形質ｂ　
Ｇ　Ｈ種″または゛バリンｂ　Ｇ　ｌ−１種″と称Ｊる
。 同様に、ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）またはｂＧｌｌ（Ｌ）柚は集
合的に゛ロイシン対立形質ｂ　Ｇ　１１種″または゛ロ
イシンｂ　Ｇ　Ｈ種″と称する。上述のように当該ｂ　
Ｇ　Ｈ中のアミノ酸に割り当てられた数字は同定と参照
の目的のみに使用した。 マイルス等（旧ＩＩｓ　ｅｔ、　ａｌ、　　な９７０）
、Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２４５：３４０７−３
４１５）は同様に豚の成長ホルモンの２つのシアン化ブ
ロム分画が、それぞれのＮ−末端で非相同であることを
確認した。特に、１分画はＮ−末端がフに一ルアラニン
であり、もう一方は更にＮ−末端のアラニンを持つ。こ
れらＩ）　Ｇ　ｌ−１の分子型は、それぞれｐＧｌ−ｌ
（Ｐ）どｐＧＨ（Ａ＞と略称する。 ｂＧＨ（＋−）どｐＧＨ（Ｐ）の全ＤＮＡ塩基配列と、
対応するアミノ酸配列は、シーバーブ等（Ｓｅｅｂｕｒ
ｇ　ｅｔ、ａｌ、、ＤＮＡ　＜１９８３）２：３７−４
５）にＪ：り発表され、本明細書中で参考のだめ取り入
れている。 個々の牛の脳下垂体細胞は、通常、少くともｂＧＨ（Δ
、Ｌ）とｂＧＨ（Ｌ）どの混合物又はｂＧＨ（Ａ、Ｖ）
とｂＧｌｌ（Ｖ）の混合物を含むことが判明している。 培養脳下垂体細胞中に産出されたｂＧＨ蛋白のＮ−末端
の分析は、Ｎ−末端にフェニルアラニンまたはアラニン
のいずれかを含む分子のけは５０　：　５０の混合物で
あることを示していた。 多数の牛個体の脳下垂体を用いて作った市販製品は、通
常脳下垂体ｂ　Ｇ　ｌ−１の４型金部を含んでいる。更
に、プールした下垂体から得たｂ　Ｇ　１１１１１剤中
の分子の約３０％は１２６位にロイシンにかわリバリン
を含むことが報告されている。 フ工うンデツ（ｒｅｒａｎｄｅｚ）等ＩＦＢＳ　Ｌｅｔ
ｔｅｒｓｌ　８　：５３−５４　な９７１）参照。これ
らの既知４型のｂ　ａ　Ｈを分離する標準的な生化学技
術では、単独に全４型を又はいずれか１型を商業規模で
生産することはできない。これら４型の生物学的活性の
相異をしらべることと、それぞれの型を実質的に他の３
つの型のひとつまたそれ以上を含まないものの形態で、
及び又はウシ属由来の他の蛋白を含まないものを市販で
きるようにすることが望まれる。この明細書中で特定の
蛋白（単数または複数共に）を表Ｊのに使用する用語゛
実質的に純粋″どは天然の環境下または給源では当該蛋
白と共に結合している蛋白および／または他の物質より
実質的に１Ｈｉｌｌしていることを意味する。上記の目
的及びその他の目的から、本発明には、少くともこれら
の個々のｂ　Ｇ　ｌ−１を若干でも手軽に生産できるよ
うにする方法も含むものである。 従って、原核生物で真核生物またはその他の外来性ポリ
ペプチドであって、Ｎ−末端にメチオニンを有しないも
のを産出さｕ゛ることがこの発明の一つ目的である。 この発明のもう１つの目的は、Ｎ−末端からメチオニン
を除去Ｊ−るために、イン　ビＩ〜ロ操作を必要としな
い、真核生物又はその他の外来１１１ポリペプチドを原
核生物で産出することである。 この発明の更にもう１つの目的は、イン　ビトロ操作を
必要どせずに、Ｎ−末端にアラニンを持　２４　一 つ真核生物又はその他の外来性ポリペプチドを、原核生
物で産出する方法を提供することである。 この発明のもう１つの目的は、アミノ酸配列が、天然産
でＮ−末端メチオニンを持たないものと、実質的に同一
である真核生物又はその他の外来性ポリペプチドを原核
生物で産出することである。 この発明が更に目的とするものの１つは、ｂＧｌｌ　（
Ａ、Ｌ）　、ｂＧｌｌ　（Ａ、Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）な
ど、真核生物の成熟ポリペプチドで見出されるもののア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを原核生物で産出する
方法を提供することである。 この発明の更に次の目的は、牛や豚起原の蛋白質を実質
的に含まないｔ）ＧＨ（Ａ、Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）又
はｐＧＩ−１（Ａ）を提供することである。 この発明の更にもうひとつの目的は、乳牛の産乳量を有
利に著しく増加させる一連のｂ　Ｇ　ｌ−１種を提供せ
んとするものである。 この発明の方法で産出したｂＧＨポリペプチドは、泌乳
量の増加、生長率及び／又は飼糧効率向上などのソマト
１〜［１ビン活竹を可能にする手段を提供するものであ
る。 この発明の、以」−およびその他の目的は、下に示す配
達で全面的に明らかであろう。 発明の要約 この発明のこれらの目的は、一つの実施態様において１
から約３連続のメチオニン　コドンを有し、かつ、開始
信号を一つ含有するものと、その直後に続く当該ポリペ
プチド用のコドンと、更にその後に翻訳停止Ｆ信号二１
トン１つを有するゲノムＤＮＡを特定のバクテリアで当
該ＤＮＡを発現させ、当該バクテリア中に生成したＮ−
末端アラニンを有する外来性ポリペプチド回収すること
によりなる当該Ｎ−末端アラニンを有する外来性ポリペ
プチドを産出する方法によって達成される。 もう１つの実施態様としては、この発明は特定のバクテ
リア中で翻訳開始信号／メチオニン　コドン１つと、そ
の直後に続く当該ペプチドのコドンと、更にその後に続
く翻訳停止信号１つを含有するゲノムＤＮＡを発現させ
、該バクテリア中に生成したＮ−末端アラニンを有する
外来性ポリペプチドを回収することにりなる該Ｎ−末端
アラニンを有する外来性ポリペプチドを産出する方法を
提出するものである。 更に伯の実施態様として、この発明は、バクテリア内で
天然産の真核生物ポリペプチドと実質的に同一のアミノ
酸配列を有する外来性ポリペプチドを生産する方法を提
供するものである。 その他の実施態様としては、この発明はｂＧＨ（Ａ、ｌ
　）　、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）、ｐＧｌ−１（Ａ）又はｂＧ
Ｉ−１（Ａ、　Ｉ　）とｂＧｌ−（（Ａ、Ｖ）の混合物
から選ばれたもので、かつそれぞれ、牛若しくは豚起原
の、又はその他のソマト１ヘロビン種のポリペプチドを
含まない一つのソマトトロピンを含有する組成物を提供
することである。 ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）よりも著しく乳牛の産乳量を増加させ
る一連のバリンｂＧ　Ｌ１秒よりなる組成物を見いだし
たことである。好ましい一態様と１ノでは、ブ 実質的に純粋なり　Ｇｌ〜１種よりな呑、かつかかる産
乳量の増加を可能とするための組成物を提供せんとする
一ｂのである。 その他の実施態様どしては、牛及び／又は豚の泌乳をＯ
Ｎ進し、成牛又は成豚前の生長、及び／又は飼猫転換効
率を高めるために前述の組成物を使用する方法並びに前
）ボの方法に有用な種種の遺伝子、ＤＮＡベクター及び
形質転換されたバクテリアが含まれる。 以下図面に言及しながら更にこの発明について説明する
。 以下の各図面において、斜線の入った箱形は、バクテリ
ア　プロモーターのＤ　Ｎ　Ａ　Ｘ＋−ディング配列を
示し、黒塗りの箱形は、異質ＤＮＡのコーディング配列
、棒形は標識しているにうに、追加ＤＮＡ−１−ディン
グ配列、そして方向矢はＤＮＡ］−ディング配列の５′
から３′へのオリエンテーションを示す。関連制限酵素
の作用部位も又示しである。Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｊｌの位置で
、しかるべくマークしである部分は、表示の目的で行っ
たもので、比例穴に合わせて画いたものではない。 第１図は、Ｍ１３ｍｐ８／ＢＧＩ−１ｏｘ−、の構築を
示し、このものは、Ｍ１３ｍｐ８ベクターのその３ｍａ
■制限酵素（開裂）部位に１つの＞＜ｂａＴｉｌｌ限酊
素（開裂）部位を挿入したものよりなる。 第２図は、Ｍ１３ｍｐ８／ＢＧｌ−ｌｅｘ−１の構築を
示し、このものはｂＧｌ」な，−）に関するＤＮＡ］−
ディング配列を保持するＭ１３ｍｐ８／Ｘｂａ■よりな
る。 出を示す。 出を示す。 第５図は、ｐＭＯＮ３２０９発現ベクターの構築を示し
、このものはｂＧＨな−）に関するＤＮＡコーディング
配列の代りにｂ 　Ｇ　ｔｌ　（Ａ　、　Ｌ　）に関するＤＮＡ：］−デ
ィング配列が入ったρＢ　Ｇ　ｌ−（ｅｘ−１ものにり
なる。 第６図は、ｐＭＯＮ３２１５発現ベクターの構築を示し
、ｂＧＨな−）に関するＤＮＡ−１−ディング配列の代
りに、ｂＧｌｌ（Ａ、Ｖ）に関するｒ）ＮＡＩ−ディン
グ配列を持つｐ　８　Ｇ　ｌ−１８，−１である。 第７図は、Ｍ１３ｒＴ１ｐ９／ＰＧＨｏｘ−１の構築を
示し、このものはｐＧｌ−１（Ｐ）に関するＤ　Ｎ　Ａ
コーディング配列を保持するＭ１３ｍｐ９よりなる。 ｌこ、特定位置の突然変異誘起による創出を示す。 第９図は、ｐＢＧｌ−１＊の構築を示し、このｅｙ、−
１ ものはｐｌ「０に関りるＤＮＡコーディング配夕１１の
５′端から上流に位置するＦＣＯＲＩ制限酵素作用位圃
が除去されている、 ｐ　１３　Ｇ　Ｈｅｘ−１より４【る。 第１０図は、ｐＭＯＮ３２１３発現ベクターの構築を示
し、このものは、ｂＧＨ（Ｌ）に関するＤＮＡ−１−デ
ィング配列の代りにｐＰＧＨ（Ａ＞に関するＤＮＡ−１
−ディング配列を有するｐ　Ｂ　Ｇ　ｌ−ｌ　　　＊よ
りなる。 ｅｘ−１ 発明の詳細な説明 この発明は、真核生物（例えば、哺乳動物や鳥類）のも
ので、Ｎ−末端にアラニンを持つ外来性ポリペプチド蛋
白質を原核生物内で生産する方法を提供せんとするもの
である。このようにして生産されるポリペプチドは、Ｎ
−末端メチオニンを持たないので、Ｎ−末端メチオニン
の無いポリペプチドを得る為のイン　ビトロ操作が不要
である。 遺伝子］−ディング配列には存在するのに、Ｎ−末端に
メチオニンを欠くポリペプチドを一貫産出することは新
規で、かつ、全く予期しなかった結果である。 この発明は、Ｎ−末端にアラニンを有Ｊ−る実質的に純
粋な蛋白質を生産する価値高い／−Ｊ汰を提供Ｖんどす
るものである。そのような蛋白質には、牛又は豚のソマ
ト１・［１ピンの一定種とその変異体、植物蛋白質のり
ブロース−１，５−二燐酸カルボキシラーゼの小リブコ
ニツ１〜、ゲルタブオン硫黄トランスファラーゼ、及び
熱ショツタ蛋白７０イ【とがあるが、これらに限定され
るものではない。 この発明は、また、ぞの他のポリペプチドで、Ｎ−未満
にメチオニンではなく、アラニンがあることが望ましい
ものを生産するのに有用である。Ｎ−末端がメチオニン
ではなくアラニンであることが望まれる場合はあり得る
。どりわｔ−」、Ｎ−アラニールＪｖ！のポリペプチド
は免疫抗原性が弱く、又は異なった物理性を持ったり、
生物学的ｆｉ二用が修飾されたりＪ−ることが少なくな
い。 Ｅ）　Ｇ　ｌ−１又はｐ　Ｇ　Ｈの実質的に純粋な種を
バクテリアによって産出（Ｊるこの発明の実施例に関し
ては、Ｎ−末端からのメチオニンの除去に関する証辿も
教示も明らかに欠けている。実際、バクテリア内で、ｂ
　Ｇ　Ｈを作らせた論文でＮ−末端が天然に存在するｂ
ＧＨ種と同類のＮ−末端アミノ酸配列よりなるＮ−末端
は、全部Ｎ−末端にメチオニンを持つと報告している。 シーブルグ等（Ｓｅｅｂｕｒｏ　ｅｔ、ａｌ、ＤＮＡ　
な９８３）　２　：　３７−４５の４４頁）は、ｂ　Ｇ
　Ｉ−１の一種、例えばＮ−末端がフェニールアラニン
になる遺伝子配列をこと更にｂＧＨ（Ｌ）の大腸菌内で
の発現のために選Ｉυでいる；それは１つには、他のｌ
）　Ｇ　ｌ−（種であるｂＧＨ（Ａ、　ｌ　）の疎水性
のＮ−末端アラニンに更に２つ目の疎水性のアミノＭ（
メチオニン）を付加することを避けるためである。この
ように今日迄に知られている研究結果は、バクテリアを
用いて作ったｂＧＨのＮ−末端にメチオニンが保持され
ることを教示している。これらの報告に満足できず、前
述の理由でｂ　Ｇ　１−１の２種、ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）と
ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）どＩ’）　Ｇ　ｌ−１の１種ｐＧｔ−
１（Ａ）を生産する必要があると本発明者は判断した。 しかし、これらツマｌ−トロピン種をバクテリア内で産
出するには、産出されるポリペプチドがＮ−末端メチオ
ニンを持つものと予測しなｔＪればならなかった。 この発明の実施例′ｃ訂述するように、本発明者が行っ
たバクテリアでのｂＧ）Ｉ　（Ａ、Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ、
Ｖ）及びｐＧＨ（、Ａ）の産出へのアブ［１−子方法は
、略記すれば次のようである。 の突然変異誘発を、フェニールアラニンをＮ　末端に持
った牛と豚のツマ１ヘト［１ピン種に関り゛るＤ　Ｎ　
Ａ　］−ディング配列中に、第３図、第４図、第８図に
示すように起させて構築した。ぞの後に、ｂＧｌｌ　（
Ａ、ｌ　）　、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）及びｐＧｌ−１（Ａ）
の暗号を持つ配列を発現ベクターに挿入し、眉仏子の配
列順が、プロモーター１つ、リボソーム部１ヒ１つ、Ａ
ＴＧｔＭ１始／メチオニンコドンを１つ、ｂＧＨ（Ａ、
１．）、 ｂＧＨ（△、Ｖ）又はｐＧＨ（Ａ）の］−ディング配列
に直接に接して先行させ、最後に翻訳停止コドンを配置
さ１！にものよりなる。次に−・定の発現ベクターで、
所望の遺伝子配列を持ったものを大腸菌に感染させ、そ
れを所望の外来性ＤＮＡの発現が許され、所望の異質蛋
白質が産出される條件で培養した。こうして産出された
蛋白質は、アミノ酸配列を確認し、適切な生物学的活性
について検査した。 このようにして、開始信＠／メチオニン　コドンを有し
、その直後に外来性Ｎ−アラニイル　ポリペプチドに関
する］−ディングが続いているＤＮＡ配列を発現させる
と、原核生物から回収される蛋白質は、メチオニンでは
なく、アラニンをＮ−末端に実際に有することを見出し
た。アラニンのコドンの直前に、３つ迄の連続したメチ
オニンのコドンがあり、そのメチオニン　コドンに所望
のポリペプチド産物の］−ドを複写したｍＲＮＡが翻訳
開始信号コドンが含まれているときには、同様の結果が
得られるものと信じられている。例えば、翻訳開始信号
と、所望のポリペプチド産物に関するコドンを持ったＤ
ＮＡは、適切にメチオニン　アラニン、メチオニン　メ
チオニン　アラニン、メチオニン　メチオニン　メチオ
ニン　アラニン又はそれらのものの機能的な相当物であ
ればどｌυな］−ディング配列でも差支えない。 この明ｌｌｌ書におい−ＵＮ−アラニイル　ポリペプチ
ドは、アラニンをアミノ末端に持ったポリペプチドと定
義する。本発明者は下記の機構の説にしばられることを
好まないが、翻訳の後に、メチオニンのＮ−末端が、次
のアミノ酸がアラニンが又はＮ−メチオニン除去を容易
にする類似の性質を有するもの（例えば極性や疎水性に
おいて）であれば、原核生物によって酵素的に除去が行
われるものと信じられる。更に、外来性及び／又は内在
のポリペプチドで該Ｎ−末端メチオニンが直接アラニン
の隣りにあるときには、どんな原核生物でもＮ−末端メ
チオニンを除去することができると信じられている。 このような原核生物（例えば、ＡＴＣＣなどの良く知ら
れた微生物寄託機関から一般大衆が入手可能な種々の既
知バクテリア）には、大腸菌及びその種々の菌株を含む
が、これに限定されるものではない。実際、Ｎ−末端ア
ラニンを有するポリペプチドを、１から約３の連続メチ
オニン　コドンで始りその直後にアラニンのコドンが続
くＤＮＡ−］−ディング配列から作ることの能力を有す
る原核生物は、この明細書において開示したこの発明の
実施に潜在的に使用可能である。市販され又はそれ以外
の方法で入手可能な原核生物は、そのようなＮ−アラニ
イル　ポリペプチド生産能力について、当該生物のゲノ
ムに当該生物で作用するプロモーター、リボソーム部位
を］−ドしたＤＮＡ、１から約３個の連続メチオニン　
コドンで、その中に翻訳開始信号を持ち、その直後に外
来性Ｎ−アラニイル　ポリペプチドに関するコドンと翻
訳停止信号が続く遺伝子を挿入し、次いで当該遺伝子を
発現させ、そして、このにうに産出されたポリペプチド
のＮ−末端アミノ酸配列を同定することによってスクリ
ーニングすることができる。このような外来性Ｎ−アラ
ニイル　ポリペプチドをこのような原核生物が内部産出
するのを見出した場合には、当該生物は、特許請求の範
囲及び明細書の記載中でいうところの゛選抜された″と
定義された部類に属するものである。 この発明の実施に際して好ましい菌としては、大腸菌に
１２株よりの３種の単離系があり、いずれも、メイラン
ド州ロックビル市のアメリカ　タイプ　カルチャー　コ
レクションに寄託されて居り、寄託番号としてＡＴＣＣ
３９９３６，５３０１０、おにび５３００９が割り当て
られていて、当該Ｎ−末端メチオニンの直後にアラニン
が続いている場合にＮ−末端メチオニンを除去する能力
を示ず。 このことは原核生物で、Ｎ−末端がアラニンである外来
性ポリペプチドを作らせる方法を提供することどなるの
で有意義なことである。 この発明の方法の好ましい実施態様の１つに、２つのｂ
　Ｇ　８種、ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）と１）ＧＨ（Ａ、Ｖ）及
び１つのＯＧ　８種であるｐＧＨ（Ａ）を、牛や豚の他
の蛋白質や他種のｂ　Ｇ　Ｈ又はＤ　Ｇ　Ｉ−１を含ま
ない形でそれぞれ産出させる方法がある。特に、この方
法は ｂＧＨ（Ａ、ｌ　＞、ｂＧｌ−（（Ａ、Ｖ）又はｐＧｌ
−１（Ａ）を単一種としての生産を可能にする。 天然産のソマトトロピンと同属のアミノ酸配列を有する
ｂ　Ｇ　ｌ−１又はｐ　Ｇ　８種を夫々単独に生産する
能力は、各ｂ　Ｇ　ｌ−１やｌ）　Ｇ　８種の既に一般
的に述べたｂＧＨ種とｌ’）　Ｇ　ｌ−１種との種々の
潜在的機能によってもたらされる生物学反応性を正確に
決める上で大ぎな意義を有し、実際、２つのＮ−アラニ
イルｂ　Ｇ　ｌ−１種のどちらか一方だ【Ｊの投与で、
例えば、産乳のようなりＧＨの機能を発揮することを見
出した報告がある。更に、ある研究では、この発明に従
って産出したｂＧＨ（Ａ、Ｖ）を泌乳促進量投与するこ
とで、同様に作出したｂＧＨ（Ａ、Ｌ）を投与した場合
より、乳牛の産乳量が統泪学的に（例えば、Ｐ＜０．０
５）著るしく増進することが見出された。 産乳中の哺乳動物の産乳量増加についての特定のｂＧ）
ｌの形態（種）に関する相対的効果にたいする教示は今
までのどころ無い。更に、ｂ　Ｇ　Ｈ種間の生物活性に
ついての差異に関して、イン　ビトロ、イン　ビボ共に
示唆する先行文献は無い。 につて、バリン対立形質のｂ　Ｇ　８種がロイシン対立
形質の１’）　Ｇ　８種にりち産乳ｈ４の増加効果がよ
り大きいと言う所見は驚くべきことであり、又予期りざ
るものである。この所見は更に飼判り１率増加や成育促
進のＪ、うな他の成長ホルモンとしての性質を増強する
作用についてもｂ　Ｇ　Ｉ−１種の相対的効果の差異を
同様に明確化できることを示唆している。このように、
実質的に純粋な形態で脳下垂体のｂ　Ｇ　ｌ−１の少な
くとも二種の分子形態をバクテリア中で産出させるこの
発明の方法を用い、及び／又は他の利用可能な技術を用
いて、特定の成長ホルモンにより誘導化された反応を達
成するのに最も効果的なり　Ｇ　ｌ−１種が得られる。 そのような利用可能な技術には、全ｂ　Ｇ　Ｈ蛋白又は
ぞの断片の化学合成、及び／又は既知の組み換えＤＮＡ
技術を使用した酵母などの他の微生物又は哺乳動物の細
胞中での産出も含むが、これらに限定される訳では無い
。 加えて、天然に存在する夫々の種の生物活性が一度決定
されると、各種毎に既存のものより、ソマトトロピン活
性が増大させたポリペプチド変異を作ることが可能とな
ると考えられる。従ってソマトトロピンの変種、ヌクレ
オチドかアミノ酸の欠失、置換及び／又は添加して作出
することによ変種としては、ｂＧＨ（Ｖ）の変異型で、
メチオニンをアミノ末端に附加することをも含む。そし
てこのような変種は、遺伝的に形質転換されたバクテリ
アで作られ、泌乳を促進する量投与することで乳牛の泌
乳を驚く程増大することが見出されている。 更に、このｂＧＨ（Ｖ）変種の投与に関連し産乳につい
て観察された増加の程度は、１２６位のアミノ酸がロイ
シンであることを除きその他の点では同等である変種の
投与に関連して観察された産乳量の増加よりも測定可能
な程に著しいことが判明した。 出願人は以下の機作に関する理論に拘束されることを望
まないが、１２６位でのロイシンの代わりにバリンで置
換することは有意にこのようなソマト１〜［１ピン蛋白
のバイオアビリティ及び／又は生物反応性を増加させる
にうである。特に、ソマト１−ロピン蛋白について実施
しＩＣＸ線結晶学は、当該蛋白の約アミノ酸９０位から
約１３５位の領域は比較的（構造的に）柔軟１１に富む
領域を構成していることを示している。その他の蛋白の
研究から柔軟性に富む領域は閘生物反応性の部位（即ち
、生物活性形態を達成するために、生物学的受容体及び
／又は同一の蛋白の他の部分ど相方に反応する部位）よ
りなる。かくして、 ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）の追加の変種、例えば、ここに記載の
柔軟性に富む領域内及び／又はこの領域外で（［１イシ
ン以外の点を除き）その他の魚では同等である［１イシ
ンｂ　Ｇ　８種又はｂＧＨ（Ａ、　ｌ−）よりも多く泌
乳（即ら、産乳量）を測定可能な稈増加ざＵる結果どな
るアミノ酸の置換体、削除、イ１加及び／又は転化より
なる変異体が作出可能である。例えば、上述の産乳量の
増大を耐え勤いほどは減退させないで、１２６位又はそ
の附近のアミノ酸を替えることの中には（ロイシンに比
較して）他のより疎水性及び／又はより小さいアミノ酸
による置換をも含むものである。 更に、Ｎ−末端ｐｈｅ１又はＮ−末端ａｊｉａ−１を有
するバリンｂＧＨ種は、乳牛に投与するど上述の如く産
乳量を増加させることができるが想起される。また、天
然に存在するｂ　Ｇ　ｌ−１の末端と実質的には差異の
ないアミノ末端にお４−Ｊる変更（例えばｎｅｔ−１）
は、（ロイシン以外の点を除き）その他の点では同等で
あるロイシンｂ　Ｇ　８種又はｂＧＩ−１（Ａ、Ｌ）よ
りも測定可能なほどに著しく産乳量を増大させるバリン
ｂ　Ｇ　ｌ−１種の能力について耐え難いほどには阻害
しないであろうことらまた想起されうるものである。更
に、プールした脳下垂体ｂ　Ｇ　Ｈ調整物中のバリンｂ
　Ｇ　ｌ−１ｉ１’ｊ１度が、（その中に含まれる）全
ｂ　Ｇ　ｌ−１の重量にもとづいて（比較するどき）、
同様にロイシンを含むものの１１度より実質的に高い濃
度であるｂＧＨ組成物は、十−記（Ｄ結果を同様に達成
Ｊ−るであろうことも容易に想起されることである。 最す広範囲なこの発明の実施態様どしては組換ＤＮＡの
技術の手法を、原核生物内で外来性ポリペプチドを直接
生産できるように極限まで改良したことである。この明
細書中の記載では、ポリペプチドに関する］−ディング
をしたＤＮＡを分離し、クローン化し、クローンＤＮＡ
の塩基配列を再配列したり修飾したが、これらはクロー
ン化したり修飾したりした［）Ｎへ配列を使って微生物
に形質転換させる基礎技術の知識を前捉とするものであ
る。このような技術は、この分野にお【」る常套手段で
ある。（例えばマニアチス、フリシコ、ザムブルーク）
編　Ｈａｎｉａｔｉｓ　Ｆｒ目ｓｃｈ及びＳａｍｂｒｏ
ｏｋ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　　＾
ｔ、ａ＋）ｏｒａｔｏｒｙ川す籾−ａｌ；１９８２年を
参照）。 タト来１！ｔ、　Ｉ）　Ｎ△の分離及び／又は構築この
発明の実施態様の一つとして、原核生物内で作らせる所
望の外来性ポリペプチドに関りる］−デイングをしたＤ
ＮＡ配夕１１は、選抜分離するか、その］−ディング配
列のＤＮＡを構築するか或いは化学合成をする。多くの
重要な実施態様においては、そのポリペプチドは真核生
物蛋白質である。 若しこのポリペプチドが小さく、アミノ酸配列が既知の
揚台、合成［）ＮＡ分子、換言すれば、そのポリペプチ
ドのコーディング配列を有するＤＮＡは合成できる。若
しそのペプチドのアミノ酸配列が未知であり、又は対応
するｒ′）ＮＡ配列が長過ぎて合成には向かない場合に
は、ｃＤＮＡ　（相補性ＤＮＡ）を当該ポリペプチドを
発現する組織や細胞から得た対応するｍＲＮＡから逆転
写して調製することができる。例えば、この発明の実施
態様の１つに、グツ１−マン等（Ｇｏｏｄｍａｎ　ｅｔ
　ａｌ　　：ＭｅｔｈｏｄＳｉｎ　ｌｌｙｍｏｌｏ（Ｉ
Ｖ　６８　：　７５−９０な９７９））に説明され、今
では常法になっている方法で、牛の脳下垂体から得たも
のを用いてｂ　Ｇ　ｌ−１用のＤＮＡ配列を作出するこ
とができる。 或いは、ｃＤＮＡの配列は、天然にあるシーンバンクか
らゲノムのＤＮＡを分離して、それによって形質転換を
受けた細胞からｍＲＮＡを適当なプローブを用いて単離
し、それからの逆転写で作出Ｊ−ることができる。ゲノ
ムＤＮ／ｌよ、原核生物でＤＮＡが発現されるような種
々のベクターシスデムの中で修飾することができる。こ
れらの技術は、常套手段の範１川内にある。 一度所望のポリペプチドに関する諸コドンを揃えた外来
性ＤＮＡ配列が手に入ると、その分子の核酸配列を修飾
しにうと云う欲望が生じるだろう。 例えば、ｍＲＮＡ（７）ｕ型からＤＮＡ分子が逆転写で
作出したとすると、少なくとも蛋白質のリーダー配列を
コードしたＤＮＡ部分が含まれることがしばしば起る。 こうなると、所望の蛋白質に関する最初のコドンより前
の部分に当るリーダー配列ＤＮＡ部分を全部取り除くこ
とが必要となる。場合によっては、所望の蛋白質のコド
ンのＮ−末端用がアラニン　コドンである場合以外は、
アラニン　コドンを所望の蛋白質に関する諸コドンの先
端部に追加したり、又はその先端部を置換したりする必
要が生じることがある。その時には、翻訳開始信号（そ
れは、メチオニンのコドンでもある）がアラニン　コド
ンに接して直ぐ上流に挿入される。その間始／メチオニ
ンのコドンは通常（そして好ましくは）ヌクレオチド配
列Ａ　Ｔ　Ｇであるが、時にはＧＴＧが開始／メヂＡニ
ンのコドンに使われることがある。イの上、１つ以上２
．３又は更に多くの連続したメチオニン用諸コドンがあ
っても、当発明の方法の範囲内に含まれるものであるこ
とは云うまでもない。 若し既に存在していないならば、最少１個の翻訳停止信
号が、Ｃ−末端アミノ耐用コドンの後に挿入されていな
【Ｊればならａい。停止信号の例としては、デオキシ核
酸トリブレットのＴ　Ａ　Ａ　。 ＴＧＡ、及びＴ　Ａ　Ｇである。従って、主要点は、翻
訳開始信号／メチオニン　コドンに、所望のポリペプチ
ドでＮ−末端がアラニンである諸コドン連鎖が直らに従
い、それのＣ−末端アミノ耐用コドンの後に続いて最少
１つの停止信号が来ると云う順序になるような組換ＤＮ
Ａを、ＤＮＡ組換技術を用いて構築すると云うことであ
る。 ｍＲＮＡの中に、二つの核ｇ塩基の相補的なシリーズの
水素結合によって形成される二次構造を作って、イれが
ｍＲＮＡの効率良い発現を妨げる場合があることが知ら
れている。このＪ：うな相補的配列が、特にＮ　末端部
分を］−ドしている場所に存在Ｊ−るど、それを除去す
ることがリボソームのｍ　ＲＮ　Ａへの結合を助【Ｊる
ので、これにより発現の水準が高められる。 このことから、このにうむ二次構造に関与する諸コドン
を、同じアミノ酸を意味覆るが、他の塩基組合せの核Ｍ
トリプレット ましい。ヨーロッパ特Ｗ［出願第７５．４４４号な９８
３年３月３０日公開）；シーブルク等（Ｓｅｅｂｕｒｇ
　　ｅｔ　　ａｌ　　、　（　１　９８３）ｒ）ＮΔ　
　２　：３７−４５）及びショーナー等（ｓｈｏｎｃｒ
　ａｔ　ａｌ（　１　９　Ｂ　４　）　Ｐｒｏｃ．　ｌ
ｊａｌ’１．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｉｌ．Ｓへ８　
１　：　５　４　０　３　−　５　／Ｉ　Ｏ　７　）を
参照。 他の外来性Ｄ　Ｎ　Ａ配列構築の方策はこの分野におい
て通常の知識を右Ｊ−る者にとって自明のことである。 例えばＮ−末端が、 Ｎ　Ｈ　２　　ｍ　ｅレーｘ　−　ｙ　・・・の構）告
で、Ｘがアラ二ン以外のアミノ酸であるようなポリペプ
チド用のコードを有するＤＮＡがある場合、翻訳開始信
号／メチオニン　コドンと、Ｘ用のコドンとの間にアラ
ニン　コドンを挿入することができる。こうして、Ｎ−
末端構造がＮｌ−１２−ａｌａ　−　Ｘ　−　Ｖ・・・
又はＮＨ２−ａｊ！ａ　　ｙ・・・になったポリペプチ
ドが、この発明による方法を使って、夫々生産できる。 同様にして、どんなアミノ酸用のコドンの除去、添加及
び／又は置換を所定の遺伝子配列内で行う１工 ことが可能で、このことによりこの発明襄、かかる方法
によって変異ポリペプチドを発現することができる。“
変異″ポリペプチドは、この明細書中では、所定のポリ
ペプチドが天然に持つアミノ酸配列に対し、１つ又は複
数のアミノ酸の欠失、置換及び／又は添加させたポリペ
プチドと定義する。そのような゛変異体″の例は、 ｍｅｔ　−　ｂＧＨ　（Ｌ）およびｍｅ　ｔ　−　ｂＧ
Ｈ　（Ｖ）を含み、しかしそれだけに局限されるもので
はないが、これらの変異ｂ　Ｇ　ｌ−１種のアミノ酸配
列が、Ｎ−末端に句加されたメチオニン以外は天然に牛
の脳下垂体細胞で生ｉ！されるｂＧＨな−）及びｂＧＨ
（Ｖ）と同一のものである。これら変異ポリペプチドは
、その生物学活性が耐えがたい程に消滅しない限り、天
然産ポリペプチドと実質的に同一アミノ酸配列を有する
にうに構築される。変異ポリペプチドの作出どその発現
は、蓄積ｍの増加、蛋白安定性の増大、ポリペプチド純
化の助長、及び／又は生物活性を最適にすることなどの
ために望まれる。 上記した、所望のポリペプチドに関Ｊる］−ディング配
列を持つＤＮＡの構築は、制限酵素、エクソヌクレアー
ゼ、エンドヌクレアーゼなどを用いて、この分野にお【
ノる通常の知識を有するものが既に知っている方法で達
成できる。オリゴヌクレＡヂドで方向付けられた特定位
置突然変異誘起の一般技術も、−１−記の、ＤＮＡｌａ
造又は配列の修飾を実行づ−るのに使用することができ
、この分野にお（）る通常の知識を有Ｊるものは既に知
っていることである。例えば、シーラー及びスミス（Ｚ
ｏｌｌｅｒ　　＆　　Ｓｍ１ｔｈ　な９８２）Ｎｕｃ、
Ａｃ１ｄｓ　　Ｔｔｅｓ。 １０：６４８７−６５００）：ゾーラー及びスミス（Ｚ
ｏｌｌｅｒ　＆　Ｓｍ１ｔｂ、　な９８３）　Ｈｅｔｂ
。 ｌＥｎｚｖｍｏｌ、１００　：　４６８−５００　：　
）ノーリス等（Ｎｏｒｒｉｓ、ｅｔ　　ａｌ　　、　　
な９８３）Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ。 １１　：５１０３−５１１２）を参照。 組換ＤＮ△技術により、所望の異質ＤＮＡ配列が得られ
れば、この配列は、ＤＮＡ配列を増殖する手段となる適
切なりローニング　ベクターに挿入される。適切なりロ
ーニング　ベクターを使用する場合、どれでもマーカー
機能があることが望ましく、その例として、大賜菌ブラ
ズミド　ベクターでＣ０ＩＦＩを持つものについては、
バージフィールド等（ｌｌｅｒｓＭｉｅｌｄ　ｅｔ、ａ
ｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１１．ｓ、Ａ、　　な９７４）
　７１　：３４５５　：　）ｐＢＲ３２２、ポリバー等
（Ｂｏｌｉｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｇｅｎｅな９７７
）　２　：９５　；ｐＢＲ３２５）、ソベロン等（Ｓｏ
ｂｅｒｏｎ　ｅｔ、ａｌ。 ｌこ 吋展な９７Ｂ）４：１２１）を；及びｐＫＣ７にライＴ
　Ｌｔ、ラオ等（Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｇｅｎｅな
９７９）７：７９）を；及び大腸菌バクテリオファージ
　ベクターでシＸフロン（Ｃｈａｒｏｎ）λＬ１７．１
を含むものについては、ローネン等（ｌ−ｏｅｎｅｎ　
ｅｔ　ａｌ　、眩すな９８０）１０　：　２４９）１乙
１乙 を；更に、Ｍ　　ｍｐ８どＭ１３ｍｐ９についでは、メ
ツシング等（ｌ（ｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ
　な９８２）１９：２６９）に記載されている。当該ｒ
）ＮＡ配列をクローニング用ベクターに挿入して、組換
ベクターとり−る一般技術は、この分野における通常の
知識を有するものにとっては常套手段である。 例えば、フリツシュ及びサムブルーフ（ｒｒｉｔｓｃｈ
＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）編Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　：
　Ｈａｎｉａｔｉｓ、　　な９８２）参照のこと。 所望の外来＋ｔ！ｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の複製が沢山１ｑ
られれば、これらの配列を以下に詳述する如く当該組み
換えベクターから除去して所望の外来性蛋白を産出させ
単離するための発現システムへと挿入できる。当該外来
性１’）ＮＡ配列の修飾は、発現ベクターへの当該配が
１の挿入に先立って、あるいは当該挿入にひきつづいて
、この分野における通常の知識を有する：ｂのに知られ
た方法により行なうことが可能である。 この発明における実施例においては、メツシング等（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｔ　、　Ｇｅｎｅな９８２）　
１９　：２６９）が記述している如く第１図に示すＸｂ
ａＩ制限（酵素）部位を含むように修飾したＭ１３ｍｐ
８と、同上論文に記載されているＭ１３ｍｐ９を共に、
クローニング　ベクターとして用いた。これらを総称し
て“Ｉ”１３ベクター″ど呼ぶ。Ｍ　　ｍｐ８及びＭ１
３ｍｐ９ベクターは、組換ベクターを、二重鎖（ｄｓ）
又は複製型の（ＲＦ）、及び−重鎖の（ＳＳ）型のＤＮ
Ａとしてでも分離できる。ＲＦ型ＤＮＡ組換ベクターを
単離すれば、後に複製した所望の１）ＮＡＩｉ！列を、
第５図、第６図、第１０図に示すように、発現ベクター
に挿入することも可能になる。一方、−重鎖型の組換Ｄ
ＮＡを単離すれば、所望のＤＮＡシーケンスを、発現に
際して正規の５′→３′の方向性を有するベクターを単
離することと、オリゴヌクレオチドで方向付けた特定位
置突然変異誘起技術によるＩ）ＮＡ配列修飾とが、第３
図、第４図及び第８図に示すにうに可能になる。更に、
これらのＭ１３ベクターは、真核生物の遺伝子塩繕配列
の標準的な全長をクローニングするに十分な、４ギＯベ
ースにＨる遺伝子断片を収容することができる。 Ｍ１３ベクターに採用された標識機能には、メツシング
等な４ｅｓｓｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｇｅｎｅ　な９
８２）１９：２６９）が述べたように、β−ガラクトシ
ダーゼについての酵素が含まれる。特に、所望の外来（
！ｌＤＮΔ配列が、Ｍ１３」二のＪａＣＺ３１１伝子断
片に挿入子断片その結果、このＭ１３上のｌ、、−ａ　
ｃ　Ｚ断片は、宿主細胞（例えば大腸菌ＪＭ１０１）の
染色体ＤＮＡが持つＪａＣＺ遺伝子断片の一部との正常
な相補関係が乱され、そのため当該宿主は、バクテリア
成育培地に含まれているラクトースを、もはや代謝する
ことができなくなる。ベクターにあるｊ！ａｃＺ３Ｗ伝
子断片に外束子断片配列が挿入されていイ１いＭ１３ベ
クターで大腸菌を感染させたときには、バクテリア成育
培地に含まれているラクトースは代謝することができる
ので、そのバクテリアが０．８％（Ｗ／Ｖ）のトリジ１
〜ン、０．５％（Ｗ／Ｖ　）のＭＷ　ｆｌ　Ｉキス、０
．５％１７）食塩及びβ−ガラク１ヘシダーゼ指標色素
を含んだＩ　ＸＹＴ寒天寒天上地上育させると、特徴あ
る青のプラークを作る。Ｍ１３１ａＣＺ遺伝子断片に外
来性ＤＮＡ配列が挿入された組換ベクターで感染させた
大腸菌のプラーク発色は、当該バクテリアを同一培地で
生育させたとき、透明又は無色である。従って、クロー
ニング用ベクターに外来性ＤＮＡ配列を挿入すると、大
腸菌宿主が組換ベクターに感染した後に無色のプラーク
ができることで判定できる。ｂＧＨ（Ｌ）及びｐＧｌ−
１（Ｐ）の］−ディング配列を持つＤＮＡをＭ１３ベク
ターに挿入する手順は第２図と第９図に夫々示しである
。 好ましい実施態様としては、シーブーグ等（Ｓｅｅｄｕ
ｒｏ　ｅｔ　ａｌ　、　ＤＮＡ　な９８３）　２　な）
　：３Ｌ−４５）ににり記載されているにうに、バクテ
リア　プラスミドのＤ　Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１及びｐＰ　
Ｇ　ｌ−１の各々が持つｂＧＨ（Ｌ）ど０Ｘ−１’ ｐＧＩｌ（Ｐ）に関するＤＮＡ］−ディング配列が、特
定位置制限エンドヌクレアーゼによる開裂により、これ
らのプラスミドから単離された。バクテリ）′性プラス
ミドｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１またはｐ’Ｐ　Ｇ　Ｌｌ　
ｅｘ−１でそれぞれトランスフェクトしたバクテリアを
、続いてｐＧｌ−１な）及びｐＧｌ（（Ｐ）を］−ド化
している配列をそれぞれ発現させ、Ｎ−末端メヂＡニン
を伴うツマ１〜トロピン（例えば、それぞれｍｅ　１−
−　ＰＧｔｉ　（Ｐ）またはｍｅ　ｉ：　−ＰＧＩ−ｌ
　（Ｐ）　）　ヲ産出ｔル条件下テ培！させたと−古う
ことに着目しな（」ればならない。 該当Ｊ−る配夕１１は、次に、第２図と第７図に示した
Ｊ：うに、修飾したＭ１３ｍｐ８ベクター（Ｍ１３ｍｐ
８／ｘｂａ■）どＭ１３ｍｐ９ベクターのＲＦ　　ｌ）
　Ｎ　Ａの中にそれぞれ挿入した。再び第２図と第７図
に示Ｊ゛ように、所望のｂＧＨ（Ｌ）どｐＧＨ（Ｐ）に
関ＪるＤＮＡ配列をＭ１３ｍｐ９１１Ｆ　　ＤＮＡへの
挿入は、特定部位制限エンドヌクレアーＵを用いた開裂
ににり確認し朴だ。 大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１は、メツシング等（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　Ｅｎｚｖｍｏ
ｌｏｇｙな９８３）１０１　：　２０）の記述と同様に
して、これら組換ベクターの１つで導入感染させ、そし
てメツシング等（ｔ（ｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　、　
Ｇｅｎｅな９８２）１９：２６９）の記載と同様に、組
換ベクターのＳＳ　　ＤＮＡを分離した。メッシング等
（Ｈｅｓｓｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ　）の論文の関連部分を
、ここに引用として挿入した。 組換ベクターの一重鎖ＤＮＡは、一度単離されると、オ
リゴヌクレオチドで方向付けた特定位置での突然変異誘
起によって、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ’）、ｂＧＨ（Ａ、ｌ　）
、ｂＧＨ（Ｖ）及びｐＧｌ−１（Ａ）のＤＮＡコーディ
ング配列になるように修飾した。 特に、ｂＧＨ（Ｌ）は第３図に示すように、ｂＧＨ（Ｌ
）用のコーディング配列の５′末端にアラニンのコドン
、例えば、ＧＣＣを加えて修飾した。ここで採用した発
現系での最適ソマトトロピンの収量にとって好ましいア
ラニン　コドンはＧＣＣである。アラニン用の４種のコ
ドンは、どれでもこのように添加できると期待される。 アラ二ンのコドンが添加されて、ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）用の
］−ディング配列が出来たことのｒＭ認は、サンガー等
（５ａｎｏｅｒ等、Ｐｒｏｃ、　　Ｈａｔｏｌ、　　Ａ
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　。 １１、な９７７）７４　：５＝ｌＩ６３ド鴇法に依って
、ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）用ＤＮＡ配列の５′末端を全部ＤＮ
Ａ配列分析を行うことで達成できる。 ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）用コーディング配列は、オリゴヌクレ
オチドで方向付けた特定位置の突然変異誘起により、第
４図に示すように、アミノ酸位置１２７　［ｂＧＨ（Ａ
、　ｌ　）にお番ノる］のロイシンコドンを、バリン　
］コドン例えば、Ｇ　Ｔ　Ｇに転換することにより、ｂ
Ｇｉ−１（Ａ、Ｌ）用コーディング配列に起させ、作出
した。この場合も同様に、とのバリン用コドンでも、こ
の転換に採用できるものど考えられる。ｂＧＨ（Ａ、Ｖ
）用コーディング配列の創出については、産出したｂＧ Ｉ−１（Ａ、Ｖ）用コーディング配列のＤＮＡ配列分析
で、同様に確認された。 当該ｂＧＨ（Ｖ）］−ド化配列よりなる発現ベクターで
トランスフ■り］〜させたバクテリア中でｍｅ　ｔ　−
ｂＧＨ（Ｖ）蛋白を産出することとなるｂＧＨ（Ｖ）’
：］−ド化配列配列同様にして当該ｂＧＨ（Ｌ）コード
化配列をオリゴヌクレオチドで方向付【Ｊた部位特定の
突然変位で［ｂＧｌ−［１）中のコアミノ酸の位置１２
６のロイシン　コドンをバリン　コドン、例えば、ＧＴ
Ｇに変えることににり創出した。 ｂＧＨ（Ｐ）用］−ディング配列からの、オリゴヌクレ
オチドで方向付Ｉ−Ｊた特定位置の突然変異によるｐＧ
ｌ−１（Ａ）用コーディング配列の創出は、第８図と、
下に更に詳述するように行われ、ＤＮＡ配列分析によっ
て確認された。 今　、　　ｂＧＨ（Ａ、　　　Ｌ）　　　、　　ｂＧ　
　ト１（Ａ、Ｖ）　　　、ｂＧＨ（Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ
）について例示した如く所望の外来性ＤＮＡ配列を、単
離し、構築したがこの分野において通常の知識を有する
者にとって常套手段でありかつ引用した方法によりこれ
らの配列を複製し、多数の］ビーを産出できる。 これらの外来性ＤＮＡ配列は、所望の外来性ポリペプチ
ドを原核生物内で産出さＩるのに適したベフタ−に挿入
される。 Ｎ−末端がアラニンのポリペプチドの産出既に）ホベた
如く、適切な発現ベクターは、外来性ポリペプチドを選
ばれた宿主細胞内で生産するのに必要な、転写と翻訳用
開信号を備えていなｔプればならないだけでなく、これ
ら発現ベクターに所望の外来性１）ＮＡ配列が挿入され
ていることを識別Ｊるマーカー機能もあわｌ有していな
ければならない。原核生物の発現ベクターを用いること
によって、その組換ＤＮＡ配列は、形質導入、形質転換
又は１ヘランスフエクシヨン（ここでは“トランスフェ
クション″ど総称する）を通じて原核生物の遺伝子補体
の中に加えることができ、そうして、当該生物を、次に
所望のポリペプチド製造を誘起する条件で（一般に、プ
ロモーター及び用いる宿主と双方に支配される）培養す
る。このように、この発明に用いられる生物のパゲノム
″ＤＮＡは、染色体と■ピソームＤＮＡどの両方を含有
する。 多くの発現ベクターの原核り一物宿主細胞での外来性遺
伝子の発現と、外来性蛋白質の産出について、記述され
ており、これらはこの分野において通常の知識を有する
者に既に知られていることである。 この発明の好ましい実施態様の１つにおいては、ベクタ
ーｐ　Ｂ　Ｇ　ｌ−１（シーバーブ等ｅ×−１ゝ （Ｓｅｅｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ　、　ＤＮＡ　な９８３
）　２　な）　：３７−４５参照）、とその修飾ｐＢ　
Ｇ　ｌ−１であｅｘ−す るｐＧＨ＊とが用いられる。 ｅｘ−１ ｂ　Ｇ　ｌ−１ｅｘ−１発現ベクターは、ｂＧＨ（Ｌ）
に関する遺伝子を持つバクテリア　プラスミド、１）Ｂ
Ｒ３２２である。この遺伝子は、順に、１〜リプトフア
ンのプロモーター（＋）ｔｒｒｌ）　１個、シンーデル
ガルノ（Ｓｈｉｎｅ−ロｅ１ｇａｒｎｏ）の配列を１個
、ＡＴＧの翻訳開始／メチオニンのコドンをｂＧＨ（Ｌ
）ポリペプチドの第１アミノ酸、Ｎ−末端フエニアラニ
ンを］−ド化する配列の直前に有し、ｂＧＨな）］−デ
ィング配列と翻訳停止コドン１個より成っている。ｐ　
Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１発現ベクターのマーカー機能は、抗
生物質耐性である。 特に、ｐ　Ｆ３　Ｇ　Ｉ−１ａｘ−１は２つの抗生物質
耐性遺伝子を持ち、１つはアンピシリンに対するもの（
ａｍｐ　　）もう１つはテトラザイクリンに対するもの
な：ｅｔ）であって、発現ベクターと一緒に、安定した
形で形質転換させた、元来は非耐性の宿主を、特定の抗
生物質への耐性を与える。 このように、安定した形質転換菌は、テ１〜ラサイクリ
ン、アンピシリン又は両方の抗生物質を含む、いずれか
の１８１１！Ｉ上で成育させて選抜することができる。 この発明の実施例にＪ：す、ｂＧｌ４（＋−）用の］−
ディング配列の代りに、ｂＧＨ（Ａ、　Ｌ　）とｂＧｌ
ｌ（Ａ、Ｖ）川の］−ディング配列をそれぞれ含む発現
ベクターｐＭＯＮ３２０９とｐＭＯＮ３２１５を第５図
及び第６図に示すようにして構築した。これらの発現ベ
クターの１つで、その後大腸菌のようなバクテリアを、
安定的に形質転換をさ往、形質転換菌を適切な抗生物質
を含む培地での成育で選抜した。形質転換したバクテリ
アに含まれる発現ベクターは、次にｂＧＨ（Ａ、Ｌ）及
びｂＧＨ（Ａ、Ｖ）のコーディング配列を５′→３′の
方向性で正しく存在しているか否かについて、制限酵素
分断法によつてスクリーニングをした。 した。 この発明での実施例の１においてｐｔｒｐｌ−ディング
配列の５′−末端の上流にあるＥＣ０ＲＩ制限（Ｍ索）
部位除去により修飾したｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１である
ｐＢＧｌ〜１　　＊が、ｂＧｌ−（な−）用コープｘ−
１ インク配列の代りにｂＧＨ（Ａ）用コーディング配列を
保持する発現ベクターであるｐＭＯＮ３２１３の作出に
使用督。産出物であるＤＢＧＨ＊は、第９図に示すよう
に Ｘ−１ ＥｃｏＲＩ　（切断）部位を１つしか含まない。発現ベ
クターｐＭＯＮ３２１３を創出する為にＦ）ＢＧＩ−１
＊のＤＧＨ（Ａ）用］−ディング配ｘ−１ 列のｐＧｔｉ（Ｌ）用での置換についての過程は第１０
図に示している。当該混合物を用いて、次に大腸菌を形
質転換し、その形質転換菌を、抗生物質を含んだ培地上
で生育させスクリーニングした。 形質転換菌に含まれた発現プラスミドは制限（Ｍ素）開
裂法にｊ；って、ＤＧＩ−１（Ａ）：ｌ−ディング配列
を右するものをスクリーニングした。 ｂＧＮ　（Ａ、Ｖ）又はＤＧＨ（Ａ）を産出するさつ 計は、ＡＴＣＣに寄託してあり、その寄託番号がそれぞ
れ３９９３６．５３０１０及び５３００９である大腸菌
Ｗ３１１０株、大腸菌１−　Ｆ　３９２株又は大腸菌２
９４株を、発現ベクター ｐＭＯＮ３２０９、Ｆ）ＭＯＮ３２１５又はｐＭＯＮ３
２１３のいずれかで、下に更に詳述する方法で形質転換
することにより達成された。形質転換した大腸菌Ｗ３１
１０を、そのツマ１−トロピンが発現され、所望のポリ
ペプチド産出が可能な条件で培養した。 生産されたポリペプチドのｉＩ！Ｉ製は、選んだ蛋白質
と宿主細胞との両方に依存Ｊる。例えば、大腸菌のにう
なバクテリアで産出された蛋白質は、細する理由は、こ
の物体が位相差顕微鏡で実際に観察できるからである。 生物学的活性を持った形で外来性蛋白質を回収するのに
有用な方法の１つは、ヨーロッパ特許出願箱１１４．．
５０６号な９８４年８月１日公開）に記述され、引用文
献としてここに取入れられている。要約すれば、この精
製法は、宿主細胞を濃縮し、当該細胞を細胞抽出物又は
そのホモジナートを作る為に溶菌し、次に分別遠心分離
で屈光体を単離するもので、工程はすべて、当該技術分
野に属する通常の知識を有する者には既に知られたもの
である。単離した屈光体は、グアニヂン塩酸のような強
度性剤に溶解し、この可溶化させた蛋白質を、次に適当
な溶剤で（例えば尿素）に入れ換え、クロマトグラフの
手段で精製し、Ｒ後に生物学的に活性化、すなわちぞの
活性構造を果すようにさせて置ぎ、次に酸化するとその
活性構造は、ヨーロッパ特許出願箱１１４，５０６号に
記述されているように、適切なシスティン残基間の、ジ
スルファイド結合によって保持される。このような、外
来性蛋白質の更に微に入った精製法の１つが同時に出願
された米国１４許出■１の２（′１に述べられている。 １つは、ニス・ビイ−ス１〜−ルズ（Ｓ、　Ｂ、５ｔｏ
ｒｒｓ　）“ソマトト［１ピンの可溶化法″であって、
ここに引用記載されている。もう１つはエル・エイ・ベ
ン１ヘルな−１八、　Ｂｅｎｔｌｅ）　、ニス−ｅ−（
−・ス１−−ルス（Ｓ、　Ｂ、　５ｔｏｒｒｓ）および
シイ−・ダブリコラ・ミツヂエ）Ｌｉ　（，１，Ｗ、旧
ｔｃｈｅｌｌ）によるもので゛ツマ１−１−ロピンの天
然化法″に関するものであって同してモンザン１〜会′
４１に譲渡されたものである。その後の外来性ポリペプ
チドを、夾雑物であるバクテリア蛋白質から分１１Ｉｔ
精製するのは、ゲル濾過や、イオン交換クロマトグラフ
など旧来のクロマ１〜グラフ法で達成できる。曲型的４
Ｔ場合には、粕！ｘＩ後の構成は、重は比でＮ−アラニ
イル　ポリペプチドが約９０％から約９９．５％であっ
て、約０．５％から約１０％が、ポリペプチドの産出原
核生物宿１山来のものである。 この発明の方法で発現した外来性ポリペプチドー　〇〇
　− の少なくとも約８０％は、Ｎ−末端構造が、Ｎ　ｌ−１
２−アラニンである。残余は主としてメチオニール型で
、Ｎ−末端がＮＨ２−メチオニン−アラニン・・・であ
る。しかし培養条件及び／又は遺伝子発現誘発の時期を
変更】−ると、アラニンをＮ−末端に持つポリペプチド
の比率を少なくとも９５％又は更に高めることができる
。 この発明で特に好ましい実ｍ態様の１つとして、上述し
たようにして産出、単離されたソマト］・ロピンのポリ
ペプチド種は、ツマ１〜１−ロビン様の生物学的活性を
示すことが、ツシマ及びフリーソン（Ｔｓｕｓｉｍａ　
＆　ｒｒｉｅｓｅｎ　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｐ　Ｅ面ｏｅｒ
ｉｎｏｌ。 Ｈｅｔａｂ、　　な９７３）　３７　：　３３４−３３
７　）が述べている兎肝臓の受容体検定とラットの重量
増加生物検定で示されたことである。後者の検定におい
て、大賜菌生産のソマトトロピンは、既知単位のソマト
トロピン（例えば牛又は豚の脳下垂体ソマトトロピン）
と比較して、種々の注射量で起る脳下垂体切除ラットの
体重増加機で検定される。 特に、既知又は標準のソマトトロピン試料を、滴　６７
一 定した投！ｊＦＡ　（０ど６０ミリグラムの間）で脳下
垂体を除去したラツ１−（９５へ・１３５ｇ）に毎日７
日間又はそれ以上継続し注射した。多重回帰を用いて既
知、未知のホルモン単位を対数変換した投ち量に対して
回帰する。その傾斜を、非平行現象で゛あることと、イ
ンターセブ１〜Ｊｔ通性を確ａＸ　−Ｊるために検定Ｊ
る。生物学的活性は、傾斜度に、標準品の活性を乗じた
ものどして表わされる。 この発明によるＮ−アラニンｂ　Ｇ　Ｈ産物の使用は、
牛の産乳量を増し、（その結果）ぞの牛の−・定産乳量
に対する飼糊必要聞を減するものど考えられる。乳牛に
、ｂ　Ｇ　ｔ−１種で成熟ｂＧ　ｌ−１蛋白質の１２６
番かその附近にバリンを持つものを泌乳促進量投与する
ことは、これら乳牛の産乳促進に特に適切なことである
。この発明によるそのような産物を牛に投与する場合、
注射、輸血、又は手合体に１４人し植込むこと等、又は
必要な投与量の循環系への配送を達成できるものであれ
ば他のどんな方法も用いられる。医薬品用として使用可
能な基礎製剤、例えば溶液、懸濁液又はゲルなどを、−
６８＝ カプセル封入し又は封入せずに用いられる。これらの製
剤は、単一のｂ　Ｇ　ｌ−１種又は変種、又は天然産及
び／又は変異ポリペプチド［例えばｂＧＨ（Ａ、Ｖ）ど
ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）の混合物、及び／又はｂＧｌｌ（Ａ、
Ｖ）とメチオニン−ｂＧＩ−１（Ａ）の混合物］の予め
調剤された組合せも含むものである。投与量は、１頭１
日当り、最少０．００５１１１ｇから約２００■の範囲
であるが、１頭１日約５　ｔｒｒｙから約４０１１１！
Ｊが好ましい。産乳量及び／又は飼糧対乳量効率にもつ
とも有効な量は、常法の試験で決定できるであろう。実
際に好ましいｂＧＨ投薬投薬五番特定の動物の大きさ、
一般健康状態と栄養状態などにより決定される。産乳量
は、牛に対するｂＧＨの影響判定に用いることができる
が、牛の他の生産性、即ち成育率と、自生産性にも同様
に使用できる。若し望むなら、ｂ　Ｇ　Ｈは、他の生物
学的に活性のある蛋白質、抗原、又はそれらの相当物な
どの有用物質と共に投与でき、かつ増強効果が得られる
。 前述の如く、この発明は、Ｎ−末端にアラニンを有し、
かつ欠失、添付、及び／又は置換をポリペプチド鎖に沿
って有するｂ　Ｇ　ｌ−１変異体の生産も目的とするも
のである。そのような修飾で望まれる、泌乳及び／又は
生長促進特性を持つものは、牛で常法のテストを行って
同定できる。 以下の実施例はこの発明で好ましい実施態様を示すもの
であって、この発明の技術的範囲がそれらに限定される
ものでは勿論ない。この発明を好ましい実施態様どの関
係で説明するが、明細書の記載にもとづいてこれらの実
施態様を種々変更することは、この分野に属する技術に
ついて通常の知識を有する者にとっては自明のことであ
る。 微生物とプラスミド 下記の微生物は米国メリーラント州日ツクヒル市パーク
［１−ンのアメリカン　タイプ　カルチャー　］レクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃと称す）、１２
３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ、　　Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、　　Ｍａｒｙｌａｎｄ　　。 ２０８５２、Ｕ、Ｓ、Ａ、）　から入手可能テアル：Ａ
ＴＣＣ３９９３６−大腸菌Ｗ３１１０ＡＴＣＣ５３０１
０−＊ｍｍ　　ＬＥ３９２ＡＴＣＣ５３００９−大腸菌
　２９４株ＡＴＣＣ５３０２４−大腸菌Ｗ３１１０（ｐ
ＭＯＮ３２０９）ＡＴＣＣ５３０２２−大腸菌Ｗ３１１
０（ｐＭＯＮ３２１５）ＡＴＣＣ５３０２３−大腸菌Ｗ
３１１０（ｐＭＯＮ３２１３）これら寄託筒は、この出
願の譲受人モンサント礼に、米国での特許が付与された
場合には、一般公衆が入手可能どなる。これら寄託筒は
、この特許出願口にもとづく利益を享受する米国特許の
有効期間中は入手可能どなる。しかしながら、この寄託
筒が一般公衆が入手できることが、政府の決定で保証さ
れた特許権を減損させてこの主題の発明の実施権を設定
するものではないことを理解すべきである。更にこの発
明は、寄託された微生物によってその技術的節回が限定
されるわけではない。それは、寄託した実施態様物は、
単に、発明のうち特定な例示として意図したのものに過
ぎないからである。 実施例１ オリゴヌクレオチドは総て、モンサントの生物科学部門
において、アップライド　バイオシステムズのＯＮ八へ
成装置を用い、製造元であるアンプライト　バイＡシス
テムズ社（カルホルニア州ホスター市）の定めた手順に
従って合成した。制限酵素とＤＮＡ修飾酵素とは、ニュ
ー　イングランド　バイオラブズ礼（マサチュウセツツ
州ビバレー市）ニュー　イングランド　ヌクレアー社（
７１Ｊヂユウセツツ州ボストン市）及びベセスダリーリ
゛−チ　ラボラトリーズ′４ｔ：　な’３　Ｒ１，−ど
称す）（メリーランド州ゲｊイスバーク市）から購入し
た。ＸｂａＴリンカ−は、コラボレーテイプ　リサーチ
社（マサチ」−ウセツツ州しキシン］〜ン市）から人手
した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＢＲＬ礼から購入した。３
２Ｐ標識ヌクレＡチドは、アメルシャム（イリノイ州ア
ーリン］ヘン　ハイツ市）から購入した。大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片は、ニ
ュー　イングランド　ヌクレオチド１から購入した。大
腸菌Ｊ　Ｍ　１０１はミネソタ大学（ミネソタ州セン１
〜ボール市）のジョ−　メツシング博士から入手した。 制限酵素での消化、Ｔ４ＤＮΔリガーゼ反応、及び大腸
菌ポリメラーゼ■、フレノウ断片での反応等は、製造業
者の定めた手順に従って行うことができる。下記Ｉ＋１
１限酵素の反応に好ましい緩衝液は次のようである：Ｘ
ｂａＩ用：１００ｍＭＮａＣｊ！、５０ｍＭ　　ｔｒｉ
ｓ、　Ｉ）１１７　、５．１０ｍＭＭｏｎｏ４：Ｅｃｏ
ＲＩ用、ト１ｉｎｄＩ［［用及びＳｍａＩ用：５０ｍＭ
　　ＮａＣｊ！、１．０ｍＭｔｒｉｓ、　ｐＨ７，５，
１０ｍＭ　Ｍｏ５０４゜Ｔ４ＤＮＡ４ＤＮＡリガーゼ２
５ｍＭｔｒｉｓ　。 ｐＨ８，０，１０ｍＭ　　ＩＶＨ）Ｃ！　、１０ｍＭジ
チオスリトール（ＤＴＴ）、２ｍＭスペルミヂン及び０
．２ｍＭ　　ＡＴＰの緩衝液中で進行させた。 大腸菌ポリメラーゼ１１クレノウ断片は、２０ｍＭ　　
ｔｒｉｓ、　ｐＨ７、２，１０ｍＭＭｏＣｊ！　　、１
０ｍＭ（ＤＴＴ）、１ｍＭＡＴＰ及び各１ｍＭのｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ。 ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む緩衝液を用いた。アルファー
３２Ｐ　−ｄＡＴＰ　（４００ｃｉ／＋ｎ　ｍｏｌ！　
）　ハ、新に合成したＤＮＡ染色分体の放剛能ににる標
識が望まれるときにフレノウ反応に添加した。 オリゴヌクレオチドは、ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ（ｓｐ
、　ａｃｔ、、５０００ｃｉ／ｍ　ｍｏ１以−ト）と１
００ｍＭ　　　ｔｒｉｓ、Ｄ１１８．０、１０ｍＭＭｏ
Ｃｊ！　　、５ｍＭ　　ＤＴＴの緩衝液中でＴ４ＤＮＡ
キナーゼを用いて標識した。 ｂＧＨ（Ｌ）及びｐＧｌ−１（Ｐ）に関する］−ディン
グ配列を持ったプラスミド（それぞれ、ｐ　Ｂ　Ｇ　ｌ
−１及び１）ＰＧＨ’）は、ジネテツａｘ−１ｅｘ−１ り社（カルホルニア州すンフランシスコ市）から入手し
た。これらプラスミドは、次に述べる諸方法に従って調
製できる。即ち、ヨーロッパ特許出願箱７５．／Ｉ４４
番な９８３年３月３０日公開）；シーハーグ等（Ｓｅｅ
ｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄ　Ｎ　Ａな９８３）２　
な）：３７−４５）；ギオデール等（Ｇｏｅｄｄｅｌ　
ｅｔ　ａｔ　、　Ｎａｔｕｒｅ　な９７９）２８１　：
５４４−５４８）：エム、ジエー・キャンベリン及びア
ール・ロドリンゲス（Ｈ，Ｊ。 Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ　＆　Ｉｔ、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅ
ｚ　）編、２９３章デボア等著（ＤｅＢｏｅｒ　ｅｔ　
ａｔ）　、　、　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　：５ｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　な９８２）　）　
：ミオザリー及びヤノフスキー（旧ｏｚｚａｒｉ　＆　
Ｙａｎｏｆｓｋｙ　。 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　な９７８）１３３：１４
５７−１４６６）：及びロゼンベルグ及び］−１〜（Ｒ
ｏｓｅｎｂｅｒｏ　＆　Ｃｏｕｒｔ、　Ａｎｎｕａｌ’
　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ　　１３　：　
３１９−３５３　）　Ｅ−ロツパ特許出願第７５．４／
１４号（デボア等）、に示されるＪ：うに、ｂＧＨ（Ｌ
）に関するＤＮＡから翻訳される最初の２１個の諸コド
ンは、ＡＴＧＴＴＣ’　　ＣＣＡ　　ＧＣＴ　　ＡＴＧ
　　ＴＣＴＣＴＡ　　ＴＣＴ　　ＧＧＴ　　ＣＴＡ　　
ＴＴＣＧＣＴ　　ＡＡＣＧＣＴ　　ＧＴＴ　　−ＣＴＴ
ＣＧＴ　　ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＣＡＴ　　ＣＴＴ又は
これら諸コドンの機能的な相当物である。（これら諸コ
ドンに相当する機能のものは、勿論いずれも代替させて
使用できる。）これら諸公表物の、他の関連部分も、こ
こに引用している。 Ｍ　　ｍｐ８とＭ１３ｍｐ９とは、ジョー　メツセング
博士（ミネソタ大学）から入手した。 ＝　７５− バクテリア生育培地の成分全部と、抗生物質とは、シグ
マ社（ミゾリー州セン；〜ルイス市）又はデイフ］　ラ
ボラ１〜リーズネ１（ミシガン州デ１〜ロイ１〜市）か
ら入手した。 実施例２ 下記の例は、ブを現さｌたどきに、Ｎ−末端アラニンを
右するポリペプチドが、バクテリア中で直接に産出され
る為の、三種のＤＮＡ−１−ディング配列の構築を示す
ものである。特に、そのＤＮＡ］−ディング配列は、翻
訳開始／メヂＡニンのコドン（ＡＴＧ＞の直後にアラニ
ンのコドン（例えばＧ　ＣＣ）が来るＪ、うに構築され
た。この実施例は、バクテリア中で発現させたどき、 ｍｅ　１：　−ｂＧｌ−Ｉ　（Ｖ）の産出をもたらｔ　
ｂ　Ｇ　ｌ−１（ｖ）ｔ）Ｎ△］−ド化配列の構築につ
いても示−１ものである。ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）、ｂＧＩ−
１（Ａ、Ｖ）及びＤＧＩＩ（Ａ＞から成る三種のＤＮＡ
−１−ディング配列は、前もって中離しであるソマト１
へロピン用ＤＮＡ配列に、オリゴヌクレＡヂドで方向付
けた特定位向の突然変異誘起で構築した。 虹　ｂＧＨ、（Ａ、　ｌ　）用ＤＮＡコーディング配列
の構築 ソマト１〜ロピン、ｂＧｌｌな）のＤＮＡ：Ｉ−ディン
グ配列をｏ　Ｇ　ｌ−１ｅｘ、からＸｂａＩ断片どして
切り出し、修飾Ｍ１８ｍｐ８／ｘｂａ■ベクター（Ｍ１
３ｍｌ）８／ＸｂａＩ）のＸｂａＩ部位にクローニング
した。元来はｓｍａＩ部位に、Ｘｂａ■リンカ−を１つ
含むＭ１３ｒｎｐ８／ＸｂａＩベクターの構築は、第１
図に示しである。第２図に示すように、ＸｂａＩは、ｂ
ＧＨ（Ｌ）用ＤＮＡ−］−ディング配列のどちらかの端
を切断し、完全ｂＧＨな−）コーディング配列を切り取
っである。 ＸｂａＩ制限（酵素）切断ｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１プラ
スミドを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在ｔでＸｂａＩ制限酵
素による開裂により線状にしたＲＦ Ｍ１３ｍｐ８／Ｘｂａ■　ＤＮＡと混合し、牛大腸のア
ルカリ　フォスファターゼで処理した。この混合物を１
４℃で１夜インキユベートした。牛大腸アルカリ　フォ
スファターゼで処理すると、Ｍ１３ｍｐ８／ＸｂａＩベ
クターが環状に戻ることが阻止される。ｂＧＨな，、−
）に関するＤＮＡ−１−ディング配列がＭ１３ｍｐ８／
ＸｂａＴベクターに挿入され、組換ベクターＭ１３ｍｐ
８／Ｘｂａ■　　になつ／；ｌ：ことは、マニタリス、
フリｘ−１ ツシュ、ザンブルーク編の（Ｈａｎｉｔａｔｉｓ、　Ｆ
ｒ１ｔｓｃｈ＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎｏ　　：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ、　　な９８２）６４頁、に述べられた
方法、すなわち、Ｉ　ＸＹＴ培地を軟寒天積層法により
調整したものの一トに生育した大腸菌ＪＭＩＯＩが無色
のプラークを発生Ｊることで確認できる、そしてこの培
地は、１０ｔ１１１００ｍＭ　　Ｉ　ＰＴＧ（イソプ［
１ピール−β−Ｄ−ヂＡガラクトピラノサイド）及び５
０ｕ１２％（Ｗ／Ｖ） Ｘ−ＧＡＩ　　（５−ブロモ−４−り旧ト３−インドリ
ールーβ−Ｄ−ガラク１ヘピラノザイド）を３−の最」
一層寒天に含み、その大腸菌は、前に述べたにうな組換
ベクターでトランスフエクションさゼたものである。ｂ
ＧＨ（＋−）用　コーディング配ケ１の挿入は前述のマ
ニタリスら編の、 ＨＯＩＯＣＩＩＩａｒ　　Ｃｌ０ｎ−ｉｎ（］　　　：
　　Ａ　　ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｈａｎｌｌａｌ　
　、　　第三章に示す、ＸｂａＩを持つ組換ベクターか
ら単離したＩＩＦ　　ｌ’）ＮＡの分断で挿入された配
列である５９０塩基り・１の断片を得ることから確認で
きる。 この５９０塩基対断片を、同書で示された１パーセント
（Ｗ／Ｖ）アガロースのアガロース　ゲル電気泳動で同
定した。その後の制限（酵素）断片はすべて、引用した
この方法で同定した。挿入されたｂＧＨ’（＋）用］−
ディング配列の方向性は、ＲＦ組換ベクターをＳｍａ■
と１−１　ｉ　ｎ　ｄ　■で切断することにより確認で
きる。１−ディング配列が正しく５′→３′方向の場合
には、これら制限酵素での切断で２０７塩基対の断片が
得られるに違いない。−重鎖（８８）のファージＩ）Ｎ
Ａ単離は、メツシング等の方法（Ｈｅｓｓｉｎｏ　ｅｔ
　ａｌ、　Ｇｅｎｅな９８２）１９：２６９）に従って
実行した。 そのＭ　　ｍ　Ｄ　８　／　Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１ベクタ
ーは、次にゾ一う−及びスミス（Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｓ
ｍ１ｔｈ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ。 Ｒｅｓ、な９８２）１０：６４８７−６５００＞　　、
及びＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　な９
８３）　１００　：４６８−５００゜）、ノーリス等（ Ｎｏｒｒｉｓ　　ａｔ　　ａｌ）　　、　Ｎｕｃ、八ｃ
ｉｄ　　Ｒｅｓ、　　　な９８３）１１　：　５１０３
〜５１１２）が記述している方法と、実質的に相同に、
オリゴヌクレオチド特定位置の突然変異配列に際し鋳型
として用い、この文献の関連部分はここに引用して記述
しである。 第３図には、ｂＧＨ（Ａ、ｌ）に関するＤＮＡ＝１−デ
ィング配列をｂＧｔｌな）用のものから創ＩＩ−ｄるた
め突然変革操作手順を図解している。簡単に説明すれば
、オリゴメクレオチドのプライマーで（下記表１参照）
、所望の突然変異配列を右するものを、単鎖ＤＮＡのＭ
１３ｍｐ８／Ｆ３　Ｇ　Ｈｅｘ−１の鋳型として使用す
る閉環１’）ＮＡコピーを作る時の第一次合成に使用す
る。こうして創出された複鎖ＤＮＡの環は、不完全品や
、単鎖ＤＮＡ環のようなものから、シーラー及びスミス
（７ｏｌｌｅｒ　　＆　　Ｓｍ１ｔｈ、　　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　　ｉｎ　　［ｎｚｙｍｏ↓。 な９８３）１００　：　４６８−５００＞に記述されて
いるアルカリ蔗糖傾斜遠心分離を用いて分離される。こ
の閉環二本鎖ＤＮＡ分子で、メツシング等（Ｈｅｓｓｉ
ｎｏ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｇｅｎｅな９８２）　１９　：
２６９−２７６）の記載の如く、大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１
を形質転換し、得られた無色のプラークを、ボール　ウ
ルトラファイン　フィル１〜レーシヨン社にュー・ヨー
ク州グレン　コウブ市）から入手した、ボール　フィル
ター上に拾い上げ、特定部位突然変異誘発に用いる３２
ｐ−標識型オリゴヌクレオチド　プライマーどのハイブ
リダイゼーションについてスクリーニングした。当該プ
ラークの拾い上げは、ボール濾紙製造業者によって記述
された方法に従って実行した。ハイブリダイゼーション
　スクリーニングは、ナイロンのバイダイン　フィルタ
ーで、ボール　ウルトラファイン　フィルトレージョン
社がその使用方法について記載している手順書”Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ＤＮＡＴｒａｎｓｆ
ｅｒ、　ｔｏ　Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ”　Ａ　Ｎｙ
ｌｏｎ　Ｆｉｌｔｅｒｓ”な９８３）に従って実行した
。フィルターは次第に温度を昇げながら、放射能シグナ
ルが、Ｍ１３ｍ　ｐ　８　／　ｂ　Ｇ　ｌ−１８ｘ、フ
ァージを用いて調製した対照フィルターから消滅するま
で洗浄した。典型的な洗浄のプロ１−］−ル（操作手順
書）は、室温で、６ｘＳＳＣ（０，９Ｍ　　ＮａＣ１及
び０．０９Ｍクニ［ン酸ソーダ）中での１０分間洗洗浄
その後ｅ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｇ中での５０°Ｃ５分間洗浄、
及びその後の５℃づつ臂温しての洗浄である。放射線標
識をしたＡリボヌクレオチドブライマーと、対照のファ
ージよりも高温でハイブリダイゼーションを起したプラ
ークは、新しく生成しＩこｂＧＨ（Ａ、　ｌ−）の］−
ディング配列を右するものと仮定し、潜在的陽性と命名
した。別に、大腸菌ＪＭＩＯＩの形質転換体から個別に
無色のプラークをつまみとり５ミリリック−（ｍｆ！、
）の２　Ｘ　Ｙ−ｒ培地な，６％（ｗ／ｖ）１〜リプト
ン、１．０％（Ｗ／Ｖ）酵ＢＴ　Ｉギス、０．５％（ｗ
／ｖ）Ｎａなりで培養した。メツシング等にな４ｅｓｓ
ｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｇｅｎｅな９８２）　１９　
：２６９に）従って調製したファージＤＮＡは、放射線
標識をしたプライマーでハイブリダイゼーションしたニ
トロセルロースの上に点染し、上述の病氾洗浄を行った
。ファージのＤＮＡで対照のＭ１３ｍ　ｐ　８　／　ｂ
　Ｇ　ｌ−１ｏｘ−１よりもハイブリダイゼージョン温
度の高かったものは、前と同様に潜在的陽性と命名した
。上記２つのいずれのスクリーニング手段で得た潜在的
陽性のプラークも、上述のように培養し、単鎖ファージ
［）ＮＡを作る為に使用され、それは、その前にザンガ
ー等（Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ　、ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　１１．ｓ、Ａ。 な９７７）７＝１　：５４−６３）の手法で、ｂＧＨ（
Ａ、Ｌ）に関する］−ディング配列を有することを確認
するために塩基配列決定を行った。 Ｍ　　ｍｐ８／ＢＧＨｏｘ−１（ａｌａ）のＲＦ　　Ｄ
ＮＡは同様に、１ｌａｃ　［１を用いた制限酵素分析で
スクリーニングし、１つの付加アラニン　コドンが、開
始信号／メチオニンの１トンであるＡＴＧの後にあるこ
とを確認することによりスクリーニングした。というの
はアラニンのコドンがもう１つ別に１１ａｅ　ｌ［制限
（酵素）部位を作出するからである。 アラニンのコドンが、ｂＧＨ（Ｌ）用ＤＮＡｌ−ディン
グ配列に追加される頻度は約２％であった。 ｂ、　　ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）用ＤＮＡコーディング配列の
構築 ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）用ＤＮＡ］−ディング配列、スクリー
ニング、及び配列確認は、−１−記と同様の手順で、第
４図に示すように鋳型がＭ、３ｍｐ８／（ａｌａ）であ
ることと、以下の表１に示Ｂ　Ｇ　Ｅｌ　ｅ　Ｘ−１ すにうに異るオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実
施した。ロイシンのコドンがバリンのコドンに変換され
る頬面は約１０％であった。 ｃ、　　ｂＧＨ（Ａ−、Ｖ）　ＤＮＡＤ−ト化配）ＩＩ
（７）１築 当該ｂＧｌ−Ｉ　（Ｖ）ＤＮＡＤ−ド化配列の構築、ス
クリーニングおよび配列の確認は上記と同じ手順を使用
して実施した。特に、鋳型は Ｍ　ｍｐ８／ＢＧ１−１８ｘ−１で、オリゴヌクレオチ
ドブライマーはＥ）　Ｇ　ｌ−１（Δ、Ｖ）を創出する
のに用いたものと同じものを用いた。ロイシン　コドン
のバリン　コドンへの転換率は再び約１０％であつ　ｌ
こ　。 ｄ、　　ＤＧＨ（Ａ）用１）ＮＡＩ−ディング配列のり オリゴヌクレオチドで方面づけた部位特定の突然変異誘
起を、アラニンのコドンをｐＧＩ−１（Ｐ）用ＤＮＡコ
ーディング配列に添加する際、シーブーグ等（Ｓｅｅｂ
ｕｒｇ　ｅｔ　ａｔ　、　Ｄ　ＮＡな９８３）２な）：
３７−４５）の記述に従い行なった。第８図に図解した
突然変異誘起の手順は、次のように実施した。 ｐＰＧＨｏ、Ａ−１プラスミドを有する、ｐＧＨ（Ｐ）
の５９０塩基対ＤＮＡは、ＦＣＯＲＴとｔｌｉｎｄｌ［
制限酵素による切断でプラスミドから切り離され、これ
ら酵素は、プラスミドを夫々ｐＧＨ（Ｐ）に関するコー
ディング配列５′−末端と３′−末端で、第７図に示す
ように開裂する。制限酵素切断を受けたＤ　Ｐ　Ｇ　Ｈ
ｅｘ−１プラスミドは、［：ｃｏＲＩと旧ｎｄ［［で同
様に切断されたＭ１３ｍｐ９ＲＦＤＮＡと混合したが、
その時牛の大腸アルカリフォスファターゼで前処理をし
て、Ｍ１３ｍｐ９の制限酵素切断物が再すゲートするの
を阻止した。 次に当該混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼを加えた。 制限酵素２つで切断したＲ「ファージとｐＧＨ（Ｐ）用
ＤＮＡコーディング配列とは、皆−８５＝ 両端が乱れている為に、ｐＧｌ−１（Ｐ）■ＤＮＡは選
択的にＲＦファージのＤＮＡに挿入され、第７図に示す
にうに、５′から３′への正しく挿入が行われる。Ｍ　
　ｍ　ｐ　８　／　Ｂ　Ｇ　Ｈについて記１３　　　　
　　　　ｅｘ−１’ 述した如く大腸菌ＪＭ１０１は、次にｐＧＨ（Ｐ）に関
するＤＮＡｌ−ディング配列を有する組換ｖ　　ｍ　ｐ
　９　／　Ｐ　Ｇ　Ｈｅｙ；　−１で形質転換した。形
質転換した大腸菌ＪＭＩＯＩは、着色用試薬を含んだＩ
　ＸＹＴ培地上で培養され、前述のように、無色のプラ
ーク形成の有無によりスクリーニングした。 ｐＧＩ−１（Ｐ）に関するＤＮＡ：］−ディング配列の
挿入は、次のようにしてＭ１認した。無色のプラークを
採取し、前述のようにして単離したＲＦＭ　　ｍｐ９／
ＰＧＨＤＮＡをＥｃｏＲＩと１３　　　　　　　　ｅｘ
−１ １１ｉｎｄｌｌで切断し、アガロース　ゲル電気泳動に
か４−１て、挿入されたｐＧｔ−１（Ｐ）　　ＤＮＡよ
りなる５９０塩基対断片が得られた。Ｍ１３ｍｐ９／Ｐ
　Ｇ　Ｈｅｘ−１フアージは、大腸菌ＪＭ１０１で増殖
され、単鎖のファージＤＮＡが上述のように単離された
。 当該Ｍ１３ｍｐ９／ＰＧＨｏｘ−１ＤＮＡは、次に第８
図に示すように、オリゴメクレオチドで方向付４−Ｊた
部位特定の突然変異誘起の鋳型として、上記の、ｂＧＨ
（Ａ、Ｌ）用コーディング配列の創出に特定のプライマ
ーを使用した（以下の表１を参照）時の手順に従って使
用した。アラニンのコドン、ここではＧＣＣであるが、
ｐＧｌ−１（Ｐ）に関する］−ディング配列に追加され
る傾度は約１２％であった。得られたｐＧＨ（Ａ）用］
−ディング配列は、再びＤＮＡシーケンス分析を行って
確認されＩこ。 実施例３ ここでは、Ｎ−末端にアラニン１つを右Ｊるポリペプチ
ドを、バクテリアの中で直接に産出させる、３種の組換
発現ベクターの、構築及び発現について実施例を挙げて
説明する。こうして創出された３種のポリペプチドは、
ｂＧｌｌ（Ａ、Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）及びｐＧｌ−Ｉ
（Ａ）である。この実施例では、ｂＧＨ（Ｖ）の構築及
び発現並びにｂＧＨ（Ｌ）の発現についても説明する。 こうして創出されたポリペプチドは、それぞれｍｅ　ｔ
　−ｂＧＨ（Ｖ）とｍｅ　ｔ　−ｂＧＨ（Ｌ）である。 ある。 （ｖａｌ）に夫々保持された Ｍ１３ｍｐ８／ＢＧＨ，−１ ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）　、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）及びｂＧＨ（Ｖ
）に関するＤＮＡ］−ディング配列は、ｐ　Ｇ　Ｈｅｘ
−１発現プラズミドに保持されたＥ）ＧＨな）用Ｄ　Ｎ
Δ］−ディング配列を置き変えるのに用いられた（第５
図と第６図を参照）。 これば、夫々該当するＭ１３　ＲＦ　ＤＮＡをｘｂａ■
で消化Ｊることで実施された。発現プラスミドｐ　Ｂ　
Ｇ　Ｈｅｘ−１も矢張りＸｂａ■で消化させ、次いで牛
大賜アルカリフォスファターゼで制限切断断片の再すゲ
ー１〜阻止のため処理した。消化されたＲＦ　　ＤＮＡ
は、夫々別個に消化され、処理されたＤ　Ｆ３　Ｇ　Ｈ
Ｄ　Ｎ　Ａと混合し、前述のＪ：ｅｘ−１ うに１夜１４℃に保ってリゲー１へさせた。こうして形
成された組換発現ベクターは、夫々ＤＭＯＮ３２０９、
Ｉ）ＭＯＮ３２１５及びｐＭＯＮ３２１４ど命名され、
夫々 ｂＧＨ（Ａ、　ｌ　）　、ｂＧＨ（Δ、Ｖ）及びｂＧＨ
（Ｖ）に関Ｊる］−ディング配列を有する。 これらＩ）ＭＯＮ３２０９、ｌ）ＭＯＮ３２１４、ｐＭ
ＯＮ３２１５又はｐＲＧ　ｔｌ　ｅｘ−１のいずれかを
含むリゲーション混合物を用いて大腸菌Ｗ３１１０を形
質転換させ、１％（ｗ／ｖ）ｔ−リプシン、０．５％（
Ｗ／Ｖ）酵母エキス、及び０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｊ
！より成り、１２．５μ！？／＃１１！テトラサイクリ
ンと、２００　ＩＩ　ｇ／　ｍＱファンシリンを含んだ
［１−リア（Ｌａｕｒｉａ）ブロス（ｌ　Ｂ＞上で培養
した。ｐＭＯＮ３２０９を含む大腸菌Ｗ３１１０はＡＴ
ＣＣ寄託番号５３０２４を有する。大腸菌Ｗ３１１０で
ｐＭＯＭ３２１５を含むものは、ＡＴＣＣ寄託番号５３
０２２を有する。形質転換は、簡単に説明すれば、以下
のように実施された。大腸菌Ｗ３１１０を約５０ｄのＬ
　Ｂ培地中で０Ｄ＝０．６０となる迄生育させた。 培養細胞を次に遠心沈澱によりペレット化し、１０−の
２５ｍＭ　　ＴｒｉｓＳｐｔ１７．６．１０ｍＭＮａＣ
ｊ！より成る緩衝液入に再懸濁させた。これらの細胞を
、再び遠心沈澱しペレット化し１ｍの緩衝液入に再懸濁
させた。それに２５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ。 ｐＨ７，６，１０ｍＭ　　ＮａＣｊ！、５０ｍＭＣａＣ
！２の緩衝液Ｂを１４ｒｄ加え、氷上で３０分培養させ
た。細胞を、又遠心沈澱しペレット化し、３ｄの緩衝液
Ｂに再懸濁させた。この再懸濁液０．２ｍと、０．１＃
Ｉｉ！の緩衝液Ｂと、０．１から０．５μりの所望の発
現ベクター （ｐＭＯＮ３２０９、Ｄ　Ｍ　ＯＮ　３２１５、ｐＭＯ
Ｎ３２１４又はＲＧＩ−１）と混合し、氷ｘ−１ 上で６０分間インキュベー１−シた。 インキコベ−１へした混合物は、次に１分間３７°Ｃに
加温し、モの後３−のＬ　Ｂ培地を加え、その混合物を
３７℃で６０分間インキュベートした。 この細胞（よ、次に遠心沈澱しペレット化し、３００威
のＬ　１３培地に再懸濁させ、既に）ホべた抗生物質を
含む１−８平板培地中で生育させた。耐性コロニーを選
抜し、ｐＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２１４、ｐＭＯＮ
３２１５及びｐ　Ｂ　Ｇ　ｌ−１ｅｘ−１発現ベクター
ＤＮＡを前述のマニアテスら編のｔ４ｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙＱａ
ｎｕａｌ、記載の手順で単離した。そのＤＭＯＮ３２０
９、ｐＭＯＮ３２１４、ｐＭＯＮ３２１５及びｐ　Ｂ　
Ｇ　ｆ−１ｌ）　Ｎ　Ａを、ｅｘ−１ ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）、ｂＧＨ（Ｖ）及び ｂＧＩＩ　（Ａ、Ｖ）用のＤ　Ｎ　Ａ　Ｔｌ−ディング
配列の正しい方向での存在を示す５９０塩基対のＸｂａ
Ｉ断片１つと、２００塩基対の１ｌｉｎｄｕｌ／Ｓｍａ
Ｉ断片１つの存在についてスクリーニングをした。それ
らｐＭＯＮ３２０９ど ｐＭＯＮ３２１５の発現プラスミドは更に、　・Ｈａｅ
ｌｌｌ制限（酵素）分析によって、新しいＨａ　ｅ　Ｉ
［［部位が、ＧＣＣ（アラニン）コドンの添加で出現し
ているか否かについてスクリーニングした。最後にｐＭ
ＯＮ３２０９と、 １）ＭＯＮ３２１４及びｐＭＯＮ３．２１５のベクター
の５９０塩基対断片を、前述のように、ｂＧＨ（Ａ、Ｌ
）　、ｂＧＨ（Ｖ）及びｂＧＨ（Δ、■）に関するＤＮ
Ａコーディング配列が、これら発現ベクターに存在する
ことを確認するために、前述のように、部分的な配列決
定操作を行なった。 ＤＭＯＮ３２０９、ｐＭＯＮ３２．１４、ＢＧＩ−１ｐ
ＭＯＮ３２１５のいずれか一つをｅｘ−ｉ、 保有する大腸菌Ｗ３１１０単一コロニーを別々に１２．
５μｇ／Ｉｒｄｌテトラサイクリンを含む５　ｍＱのＬ
Ｂ培地に接種し、３７℃で１夜通気し生育させた。この
−晩培養物を、０．５ａｇづつ、別々に２５０ｍのフラ
スコに、（培地１．ｉ！中に）１００ｍＱ（Ｊ）１０Ｘ
塩（Ｎａ　　ＦｌＰＯ７０ｇ、Ｋ　ト１２　　Ｐ　Ｏ４
３０ｇ　、　　Ｎ　ａｃ　　１　　　　！ＩＪ　　、Ｎ
１−１４Ｃ１１０ｇ、を総量１ｏｏｏ−中ニ含ム）、１
　、２ｎｄｌ　　Ｉ　Ｍ　　ＭＯ８Ｏ４，０，２５ｍｆ
１０．１％　Ｂ、１２．５威　２０％（Ｗ／Ｖ　）蔗糖
、０．０２５ｚｉｅ　　ＩＭＣａＣｊ！２を含み、０．
５％カザミノ酸ど、６．２５μ９　／　ｍＱＱ１０ラサ
イクリンを補充したＭ９培地を２５　ｔｈＱ入れたもの
に接種Ｊ−るのに用いた。接種後は各個別に３７℃で通
気し、０Ｄ６００　（光学密度６００ナノメーター）−
１，０になる迄生育さけた。培養液を各０．２ｍＱづつ
当該フラスコから取出し、個別にす１〜リウム　トデシ
ール　リールフｌ１−（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド
電気泳動緩衝液中で溶菌ざけ、すｌ＼リー（Ｌａｅｍｍ
ｌ　ｉ、川す１な９７０）２２７　：　６８０−６８５
）に従って５Ｏ８−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅを用いて検定した。 どちらの遺伝子構築物を含む大腸菌Ｗ３１１０にも、２
２．（’）００夕ルトンの蛋白質が高濃度にあつ７ｊ。 更に、ウェスタンプロット検定（キリ−ビー及びローウ
ォールド、Ｉｌｙｂｒｉｄｏｍａ　　な９８４）　３　
：　２５２−２６２を参照）によりモノクロナール抗体
Ｆ１１−Ａ１−Ｂ６で牛脳下垂体ソマトトロピンに対し
て産出したもの（同論文参照）に２２．０．００ダルト
ンの蛋白質がいづれも結合したので、このポリペプチド
が、脳下垂体のソマトトロピンに関係あることがこれに
より確定した。親ｐＢＲ３２２プラズミドを保持する大
腸菌Ｗ３１１０細胞は、抗ソマトトロピン抗体に結合す
る２２．０００ダルトンの蛋白質を産出しない。 発現プラスミドｐＭＯＮ３２０９、 ｐＭＯＮ３２１４、ｐＢＧｔ−＋ｅｘ−１及び１）ＭＯ
Ｎ３２１５を保有するバクテリアは、下記のようにして
貯蔵した。これらプラスミド（ｐＭＯＮ３２０９、ｐＭ
ＯＮ３２１５、ｐＭＯＮ３２１／ｌ又はｌ）　Ｂ　Ｇ　
Ｈｅｘ−１）のいづれか１つで形質転換した大腸菌Ｗ３
１１０の単一］口二一は、５ＩＩｊ！のｌ−Ｂと１２．
５μｇ／ｄテ１〜う１ノイタリン中で３７℃で通気し、
−晩生台させた。 その各−晩培養物から１　ｍＱを取出し、それを２５ｍ
（！ＩＲ培地に１２．５μｇ／ｄテトラザイクリンを添
加した一フラスコに個別に加え、０Ｄ６００＝１．０に
達づる迄（ｌ＝育さμた。（の後各フラス］の細胞は、
次に４℃で５分間、６０００ｘｙの遠心分離により収集
した。それら遠心沈澱により得られたペレツ１〜を各個
別に１２ｍ（ｌのＬ　Ｂに７．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ
を加えたものに再懸濁し、直ちに１ｄづつに分液してド
ライ　アイス上で凍結した。これ、ら細胞を、次に液体
窒素冷凍庫に貯蔵した。加えて、約１０マイクログラム
の純化プラスミドＤＮＡを一８０℃で貯蔵した。 １）−ＤＧＩ−１（Ａ）に関するＤＮＡｌ−ディング配
列の魚貝 第１０図に示Ｊように、組換ベクターの（ａｌａ）に保
持された Ｍ　１３ｍ　Ｄ　９　／　Ｄ　Ｇ　Ｅｌ　ｅｘ−１ＤＧ
Ｈ（Ａ＞に関するＤ　Ｎ　Ａ　＝１−ディング配列は、
修飾したｐ　Ｂ　Ｇ　ｔ−Ｉ　ｅｘ−１発現ベクターに
保持されたｂ　Ｇ　ｌ−１な−、）に関するＤＮＡｌ−
ディング配列と入れ変えるのに用いた。修飾発現ベクタ
ーｐＢＧｌ−１＊は、ｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈ、−１発現ベクタ
ーのｅｘ−１ トリプ］−ファン　プロモーター（ｐｔｒｒ＋）の」１
流にあるＥｃｏＲＩ制限部位を除去したく第９図を参照
）ものである。この修飾発現ベクターｐＢＧｌ」　　＊
は、ｐＢＧＨ＊を部分的にｅｘ−１ｅｘ−１ ＥｃｏＲＩで消化して、その後、接着末端を取除くため
の８１ヌクレアーゼ処理をしたものである。 この制限（酵素）切断ｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１ベクター
は、次に７４ＤＮＡリガーゼでリゲートシて環状に復元
し、総て前述のように、大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１の形質転
換に使用した。単一］口二一からのプラスミドＤＮＡは
、次に５９０塩基対のＥｃｏＲＩ／１１ｉｎｄｌｆｉ断
片で、ｐＧＨ（Ａ＞用のＩＮＮ　Ａ　］−ディング配列
を有するものと、１０５０塩基対のＥＣ０ＲＩ／ｒ’ｓ
ｔ４断片でｐｔｒｐ配列（第９図を参照）のものについ
てスクリーニングした。このＦ　ｃ、ｏ　ＲＩ制限（酵
素）部位を除去することは、特定部位にｐＧｌ−１（Ａ
）に関するコーディング配列を、第１０図に示す正しい
方向性で ｐＢ　Ｇ　Ｈ本発現ベクターに挿入することを助ｅ×−
１ （）る。こうして形成された発現ベクターは、今後ｐＭ
ＯＮ３２１３と称する。ｌ）ＭＯＮ３２１３を含む混合
物で、次に大腸菌Ｗ３１１０を形質転換し、形質転換菌
は、前述のようにスクリーニングした。Ｉ）ＭＯＮ３２
１３を保有する大腸菌Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣ寄託番号
５３０２３を持つ。Ｉ’）　Ｂ　Ｇ　Ｈ”発現ベクター
にあるｅｘ−１ ｐＢＧｌ−ｌ（Ｌ）に関する］−ディング配列をｐＧＨ
（Ａ＞に関するものでの置換は、ＤＭＯＮ３２１３ＤＮ
ΔをｉＩｉ離し、当該発現ベクターをＥ　ｃ　ｏ　Ｃり
Ｉ及び旧ｎｄｌ［で切断して、５９０塩基対の断片が生
じることと、ｔ＋ａｅ　ｍでの切断により、アラニン　
コドンがｐＧＨ（Ａ＞に関するＤＮＡ：］−ディング配
列の中に存在することによりもう一個別の１ｌａｅ　ｍ
の制限部位が存在することにより確認された。ｐＧ）−
１（Ａ＞に関する］−ディング配列がｐＭＯＮ３２１３
発現ベクターに存在することの最終的確認は、Ｅ　ｃ　
ｏ　ＲＴ　／１ｌｉｎｄｎ１５９０塩基対断片を前述の
ように１部分的に塩基配列を決定することで達成された
。 ｐＧｌ−１（Ａ）に関するＤＮＡｌ−ディング配列の発
現と、ｐＧｌ−１（Ａ）の大腸菌Ｗ３１１０内での産出
は、前述のｂＧＨ（Ａ、Ｌ）と ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）生産で実施した方法で達成された。 前述の５ＤＳ−ＰＡＧＥで実証しうる、２２．０００ダ
ルトン蛋白質の高濃度についても同様に達成された。 ｐＭＯＮ３２１３発現ベクターを内蔵した大腸菌Ｗ３１
１０を前述のように貯蔵し、これも前述したように、ｐ
Ｇｌ−１（Ａ）産出の大量培養な０〜１００ｊ！の醗Ｉ
Ｉ）に用いた。１００リツトルバツチのＩＩＷｊ液中に
含まれるｐＧＨ（Ａ）蛋白質含量は、ロスナー等（Ｒｏ
ｓｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　ＩＩｌｍｕｎｏｌ。 Ｍｅｔｈｏｄｓ　な９８２）５２：１７５−１８１）に
よる放射免疫検定により約１ｇ／培養液１１であった。 実施例４ この実施例は、バクテリ内で産出された外来性蛋白質、
ｂＧＨ（Δ、Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）、ｍｅｔニーｂＧ
Ｈ（Ｖ）　　　、　　ｍｅｔニーｂＧＨな）　　　及び
ｐＧｌ−Ｉ（Ａ）のＮ−末端アミノ酸配列を決定するた
めに、この発明の実施態様として実施したものである。 大腸菌で生産したソマトトロピン　ボリペプヂドは、粗
製の、可溶化した屈光体で、 ｂＧＨ（Ａ、ｌ−）　、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）、ｍｅ　ｔ　
−ｂＧＨ（Ｖ）　、ｍｅ　ｔ　−ｂＧＨ（Ｌ）又はｐＧ
ｔ−＋（Ａ＞かのいずれかを含むものから、キリビー等
（Ｋｒｉｖｉ　＆　Ｒｏｗｏｌｄ、　ｌｌｙｂｒｉｄｏ
ｍａな９８４）３：１５１−１６１）により記述された
、免疫吸着クロマトグラフによって精製した。 免疫吸着クロマトグラフにより精製したツマ１〜１〜ロ
ビンは、三種共、ラムリー（Ｌａｅｖｎｌｉ　、　Ｎａ
ｔｕｒｅな９７０）２２７：６８０−６８５）に従った
、７．５から１５％（Ｗ／Ｖ）の傾斜ゲルを通した１μ
り純化蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により９５％より
も高いようで思われた。純化されたｂ　Ｇ　Ｉ−１種の
蛋白濃度は高速度液体クロマ１〜グラフの分析により測
定した。 Ｎ−末端配列分析に用いる、免疫親和性クロマトグラフ
で純化された蛋白質は、水に対して徹底的に透析し、そ
の後凍結乾燥した。Ｎ−末端配列分析の前に、純化した
蛋白質は、５０ｍｔｖｌ酸アンモニアと、０．１％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳの緩衝液に再懸濁し、残留するトリス（水
酸化メチル）アミノメタンな〜リス）とグリシンを除く
為に、同緩衝液に対して透析した。アプライド　バイオ
システムズ蛋白質配列決定１４７０Ａ型（Ａｒ１１ｌｌ
　ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、　Ｆｏｓｔ
ｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を、バンカピラー等（Ｈｕｎ
ｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ　、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ…Ｍ、リユ９１：３９９−４１３な９８３））及
びバンカピラー等、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、　９１　：４８６−４９３　な９８３））に記
述されているように、Ｎ−末端配列分析の総てに用いた
。 以下の表２は、ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）、 ｂＧＨ（Ａ、　　　Ｖ）　　　、　　ｍｅ　　ｔ　　−
ｂＧＨ（Ｖ）　　　、ｎｅｔ−ｂＧＨ（Ｌ）及びｐＧＩ
−１（Ａ）のポリペプチドの幾つかの試料について行っ
たアミノ酸配列分析の結果を示す。Ｎ−末端がメチオニ
ンの蛋白質は、この表で、試料中の全ソマト１〜ロビン
のパーセンテージどしてポしている。メチオニンの定石
には、三方法が用いられた。間接法では、主成分のＮＨ
，、−ａ　Ｉ　ａ　−ｐｈｅ・・・中にあるＮ　Ｈ２−
ｍｅｔ−ａｌａ−ｐｈｅ・・・の量を、遅延信号の相異
からｉｔ　筒した。この手順は、“正常″配列遅延の推
定に準拠し、それは、サイクル毎に変異があって、存在
するＮＨ−ａｌａ−ｐｈｅ−配列のおおざっばな推定に
過ぎない。■デマン分解反応にりなる直接法でＰ　Ｔ　
Ｈ−ＩＩ　ｅ　ｔを高速液体クロマトグラフ（トＩＰＬ
ｃ）で、化学的ノイズから分離した後にＰＴＩ−１−ｍ
ｅｔのＰＴＩ−１−ａｌａに対する信号強度を比較する
ものである。“Ｐ　Ｔ　Ｈ”は、フエニール−チオ上ダ
ン１−インを示ず。特に、１デマン分解配列検、定反応
は、Ｎ−末端アミノ酸を、アミノ酸の開裂とその後に起
るイのアミノ酸のＰ　Ｔ　１−１−誘導体の遊離を引起
す試薬で反応させることである。後者の手順は、％ｍｅ
ｔ−ａｌａ−ｐｈｅ・・・の推定を、混在、遊離アミノ
酸が微少量であれば、良好なものにするものである。 以下の表２に示したように、Ｎ−末端配列決定の結果、
Ｎ−末端メチオニンの次が７エニールアラニンであるど
きには、メチオニンのプロセシングの証拠はない。しか
し、ＭＢＳ　（Ａ、Ｌ）とＭＢＳ　（Ａ、Ｖ）との遺伝
子構築から作出された蛋白質分子の８０％又はそれ以上
がＮ−末端にメチオニンではなくアラニンを有している
。Ｎ−末端メチオニンのプロセシング程度は、細胞内で
、醗酵バッチが異なる毎に相異する。しかし、ソマトト
ロピン分子の少くとも８０％に起る。加えて、形質転換
した微生物内で生産されるソマトトロピンのレベルは、
バクテリア全蛋白質中で概略１０から１５％とすること
に成功した。 表２ ｍｅ　ｔ　−ｂＧｌ−Ｉ　（Ｌ）　、ｂＧＨ　（Ａ、　
ｌ−）、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）及びｐＧＨ（Ａ）蛋白質のＮ
−末端配列分析 ｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｌ）　　　　　９２．　　０　　　　
１００．　　０ｂＧ　　ト１（Ａ、　　　Ｌ）　　　　
　　　　　　　　２０．　　３　　　　　　　１Ｂ、　
　　ＩＩ　　２１０．８　　　＜６．０ ｂＧＩ−１（Ａ、Ｖ）　　　　　　７．５　　　＜３．
０２１６．７　　　９．０ １）Ｇｌｌ（Ａ）　　　　　　１６．７　　１７．０ｍ
ｅ　ｔ　−ｂＧｌ−Ｉ　（Ｖ）　　　木実／Ｊ１１００
．０註：１．Ｎ−末端がメチオニンである蛋白質量は怠
゛ 資料中の全ソマトトロピンの％として示しである。 註：２．　　ここの２つの数値は、別個に行った２回の
醗酵から精製した蛋白質のものを示す。 実施例５ この実施例は、乳牛に於ける産乳の促進に関してバクテ
リア中で産出されたｂ　Ｇ　Ｈ秤の活性の測定を目的と
して行ったものである。表３に示す如く、ｂＧ）（（Ａ
、Ｖ）もｍｅｔ−ｂＧＨも共ニＤイシンを含有する類縁
体であるｂＧＨ（Ａ、Ｌ）とｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｌ）より
も予想を越えて著しく産乳を促進した。更に、供試した
バリンｂ　Ｇ　ｌ−１種はロイシンｂ　Ｇ　ｌ−１種に
対して全体として比較すると統計学的に（Ｐ＜０．０２
）産乳を促進した。 要約すればこの試験は以下の如〈実施した。第二及び第
三泌乳期のホルスタイン種乳牛に炭酸水素ナトリウム溶
液、ｐＨ９，８±０．５、単独（以後対照試料という）
を５＃＋１！または約２５ｍｙのｂＧＨ（Ａ、Ｖ）、ｂ
ＧＨ（Ａ、Ｖ）およびｍｅｔ　−ｂＧＨ（Ｌ）（以後総
称して試験ソマトトロピンという）を毎日与えた。試験
ソマトトロピンと対照試料はいずれも２１日間連続して
毎日半肘様筋への筋肉内注射ににり非経口的に投与した
。各乳牛の各産乳量を各午前と午後に分は最初の注射の
６日前から２１日間の投与期間の間記録した。乳中の脂
肪、蛋白および体細胞について毎週ミズリー州スプリン
グフィルド市、６５８０３、のディ　］ニイチ　アイ　
エイ（ＤトＩＩＡ）テステング　レンターの同試験室で
分析した。以下の表３に示した結果は、乳牛へのｂＧＨ
（Δ、Ｖ）の投与にＪ：すｂＧＨ（Ａ、Ｌ）を使用した
場合より約５０％以上、ｍｅ　ｔ　−ｂＧＨ（Ｖ）では
ｍｅｔ：　−ｂＧＨな−）より約１７％以上産乳量が増
加したことを示している。この発明のバリンｂ　Ｇ　Ｉ
−１１１ｉによりもたらされたこの様な予期しない生産
性の利点は、酪農家にとって潜在的ではあるが大変経済
的４丁利益を右することは明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｍ　１３ｍ　１０８７　Ｂ　Ｇ　Ｈｅｘ−１
の構築を示す。 第２図は、Ｍ　　ｍＭ８／ＢＧＩ−１８，−１の構築を
示す。 第３図は、ｂＧＨ（Ａ、　ｌ　）に関するＤＮＡｌ−デ
ィング配列が、オリゴヌクレオチドで方向付けた、特定
部位での突然変異誘起で創出されることを示す。 第４図は、ｂＧＨ（Ａ、■）に関する０ＮＡＩ−ディン
グ配列が、オリゴヌクレオチドで方向付けた特定部位の
突然変異誘起で創出されることを示す。 第５図は、ＤＭＯＮ３２０９発現ベクターの構築を示す
。 第６図は、ｐＭＯＮ３２１５発現ベクターの構築を示す
。 第７図は、Ｍ　　ｍ　ｐ　９　／　Ｐ　Ｇ　Ｈｏｘ−１
の構築を示す。 第８図は、ｐＧＨ（Ａ）に関するＤＮＡコープイング配
列が、オリゴヌクレオヂドで方向付けた、特定部位の突
然変異誘起で創出されることを示す。 第９図は、ｐ　Ｂ　Ｇ　ｌ−１＊の構築を示す。 ｘ−１ 第１０図は、ｐＭＯＮ３２１３発現ベクターの構築を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プールした脳下垂体ｂＧＨ中に１２６位又はその付
   近にバリンを含有するｂＧＨ少なくとも一つ以上よりな
   り、且つ当該ｂＧＨの濃度が、全ｂＧＨの重量にもとず
   いて、同様にバリンを含むものの濃度よりも実質的に高
   いものである組成物。 ２、全ｂＧＨが実質的にバリン含有種である特許請求の
   範囲第１項記載の組成物。 ３、乳牛に投与するに適した特許請求の範囲第１項記載
   の組成物。 ４、乳牛に投与したとき、同様に投与したプールした脳
   下垂体ｂＧＨの等量投与で得られる産乳量の増加を越え
   た産乳量の増加を提供する特許請求の範囲第１項記載の
   組成物。 ５、乳牛に投与したとき、同様に投与した ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）の等量投与で得られる産乳量の増加を
   越えた産乳量の増加を提供する特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ６、実質的に純粋なバリンｂＧＨ種よりなる組成物。 ７、当該バリンｂＧＨ種がｂＧＨ（Ａ、Ｖ）よりなる組
   成物。 ８、その他の点では同等であるロイシンｂＧＨ種の等量
   よりも測定可能な程に著しく乳牛の産乳量を増加させる
   ことのできる実質的に純粋のバリンｂＧＨ種よりなる組
   成物。 ９、当該実質的に純粋なｂＧＨ種が ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）又はｍｅｔ−ｂＧＨ（Ｖ）である特許
   請求の範囲第８項記載の組成物。 １０、組み換えＤＮＡ技術によりバクテリアに産出させ
   たバリンｂＧＨ種よりなる組成物。 １１、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の
   組成物を産乳を増加させる量、乳牛に投与することより
   なる乳牛の産乳量を増加させる方法。 １２、特許請求の範囲第１項、第２項、第６項又は第１
   ０項の組成物を産乳を増加させる量、乳牛に投与するこ
   とよりなる乳牛の産乳量を増加させる方法であって、当
   該増加量がプールした脳下垂体ｂＧＨを等量別に投与し
   て得られる産乳量を越える産乳増加方法。 １３、特許請求の範囲第１項、第６項又は第１０項記載
   の組成物を産乳を増加させる量、乳牛に投与することよ
   りなる乳牛の産乳量を増加させる方法であって、当該増
   加量が、その他の点では同等であるロイシンｂＧＨ種の
   等量投与して得られる産乳量を越える産乳増加方法。 １４、実質的に純粋なバリンｂＧＨ種を産乳量を増加さ
   せる量よりなる組成物を乳牛に投与して産乳量を増加さ
   せる方法。 １５、当該バリンｂＧＨ種がｂＧＨ（Ａ、Ｖ）よりなる
   特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、Ｎ−末端アラニン１分子を有する外来性ポリペプ
   チドに関する諸コドンを含み、その直前に１分子から約
   ３分子の連続したメチオニンの諸コドンを有し、その中
   には翻訳開始信号／メチオニンのコドンをも含むゲノム
   ＤＮＡを選択されたバクテリア内で発現させ、産出され
   た当該ポリペプチドを回収することからなる、当該ポリ
   ペプチドを微生物学的に製造する方法。 １７、該バクテリア中で、当該ＤＮＡの発現によって産
   出されたポリペプチドの、最低約８０重量％が、１分子
   のＮ−末端アラニンを含む特許請求の範囲第１６項記載
   の方法。 １８、バクテリアが大腸菌である特許請求の範囲第１６
   項記載の方法。 １９、該産出ポリペプチドが、天然産の真核生物ポリペ
   プチドのアミノ酸配列に実質的に相当するアミノ酸配列
   を有するものである特許請求の範囲第１６項記載の方法
   。 ２０、該真核生物ポリペプチドが、ソマトトロピン活性
   を有するものである特許請求の範囲第１９項記載の方法
   。 ２１、該産出ポリペプチドが、産乳促進活性を有するも
   のである特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２２、特許請求の範囲第１９項記載の方法で調製された
   、Ｎ−末端アラニンを１分子持つポリペプチド。 ２３、特許請求の範囲第１９項記載の方法で調製された
   ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）又はｂＧＨ（Ａ、Ｖ）であり、かつ当
   該組成が他種の牛ソマトトロピンを実質的に含まないポ
   リペプチドから成る組成物。 ２４、実質的に他種の豚ソマトトロピンを含まず、特許
   請求の範囲第１９項記載の方法で調製されるｐＧＨ（Ａ
   ）からなる組成物。 ２５、実質的に豚起源の蛋白質を含まない ｐＧＨ（Ａ）から成る組成物。 ２６、成豚前生育促進に有用な特許請求の範囲第２５項
   記載の組成物。 ２７、１つのバクテリアプラスミドと、１つのバクテリ
   オファージで、それぞれがその中に挿入ＤＮＡを有し、
   それは１から約３の連続するメチオニンの諸コドンを含
   み、その直後に ｂＧＨ（Ａ、Ｌ）、ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）及び ｐＧＨ（Ａ）のいずれか一つのポリペプチドに関する諸
   コドンが続き、該メチオニンの諸コドンは、１つの翻訳
   開始信号／メチオニンのコドンを含み、該ベクターは、
   バクテリア内で該ＤＮＡの発現を支配する能力のあるも
   のから選択された１つの組換ＤＮＡベクター。 ２８、バクテリア内で機能する１つのプロモーターと１
   つのリボソーム結合部材と、１つから約３つ迄の連続し
   たメチオニンの諸コドンと、その直後にＮ−末端がアラ
   ニン１分子である外来性ポリペプチドをコードする配列
   があり、次に１つの翻訳停止信号を有するものであり、
   当該メチオニンの諸コドンには、翻訳開始／メチオニン
   のコドンが含まれる遺伝子。 ２９、実質的に牛起源の蛋白質を含まない ｂＧＨ（Ａ、Ｖ）を産乳促進に充分な量で投与すること
   からなる乳牛の産乳促進法。