LT3916B - Method for production porcine growth hormone - Google Patents

Description

Šis išradimas - tai kiaulės augimo hormono gavimo būdas, apimantis kDNR, koduojančios kiaulės augimo hormoną, gavimą, kDNR įterpimą į bakterinę plazmidę, Escherichia coli kamienų transformacija gauta rekombinantine plazmide, klonų, kuriuose yra rekombinantinės plazmidės, atranką ir kDNR iš šių plazmidžių įterpimą į ekspresijos vektorių po to sekančia Escherichia coli kamienų transformacija gauta rekombinantine, plazmide, transformuotų kamienų atranką, kultivavimą tikslinio produkto išskyrimą ir gryninimą.

Genų ekspresija eukariotuose ir prokariotuose, nors ir naudojamos vienos ir tos pačios pagrindinės genų transkripcijos į informacinę RNR (iRNR) stadijos ir po to sekančios šios iRNR transliavimas į baltymus, naudoja šiose stadijose įvairius viduląstelinius reguliatorių derinius.

Be to, eukariotuose dauguma tikslinių baltymų iš pradžių transliuojami kaip probaltymai, tai yra, kaip polipeptidai, kuriuose be tikslinio baltymo sekos yra lyderinė arba signalinė seka. Eukariotinė iRNR koduoja pilną probaltymą, kuris po transliacijos pakeičiamas taip, kad pašalinama lyderinė seka ir gaunamas tikslinis baltymas. Eukariotų ląstelėse yra procesingo sistema, kurios pagalba probaltymai paverčiami i tikslinius baltymus, prokariotų ląstelės nesugeba atpažinti eukariotiniuose baltymuose esančių procesingo signalų. Tokiu būdu, jei pilna komplementarios eukariotų DNR (kDNR) transkriptai, iRNR, kuri naudojama kaip DNR seka ekspresijai prokariotuose, tai gaunamas probaltymas, o ne tikslinis baltymas, po to laboratorinėmis sąlygomis galima gauti tikslinius baltymus, bet toks būdas labai imlus.

Tuo atveju, kai tikslinio baltymo ekspresijai prokariotuose naudojama DNR seka, koduojanti pilną baltymą, šioje sekoje nėra eukariotų transliacijos ir potransliacinių signalų, kurie bendru atveju yra pagrindinės DNR sekos viduje. Todėl tam, kad ekspresuoti klonuotus eukariotų genus arba kitas heterologines DNR sekas prokariotuose, kaip buvo nustatyta, pageidautina naudoti prokariotinius kontrolės signalus, nes jie yra efektyvesni, o eukariotiniai signalai neatpažįstami prokariotinių recipientų.

Terminas heterologinė DNR, naudojamas šiame išradime, reiškia tokią DNR, kurios bent dalies nėra recipiento ląstelės genome. Heterologines DNR pavyzdžiai yra virusiniai ir eukariotiniai genai, genų fragmentai, alelinės ir sintetinės DNR sekos. Terminas heterologinis baltymas arba heterologinis polipeptidas šiame išradime reiškia baltymą arba polipeptidą, kurių bent dalis nėra koduojama recipiento genome.

Prokariotiniai valdymo signalai yra promotorius, kurio pagalba nurodomas transkripcijos iniciavimas, transliacijos valdymo signalai, kuriuose yra ribosomos surišimo sritis, transliacijos pradžios ir pabaigos signalai. Visi šie signalai, išskyrus transliacijos pabaigos signalą, turi būti prieš eukariotinį geną arba kitą DNR, kuriuos norima ekspresuoti.

Žinomi keli heterologines DNR (pavyzdžiui, eukariotinių genų) ekspresijos prokariotuose būdai. Pagal vieną iš jų, DNR segmentas, koduojantis norimą baltymą, liguojamas su DNR, koduojančia visą bakterinį baltymą arba jo dalį, su bakteriniu promotoriumi. Endogeninėje prokariotinėje DNR būtinai turi būti ribosomos surišimo sritis ir transliacijos pradžios signalas. Tokios liguotos DNR ekspresijos produktas yra sulietas baltymas, kuriame yra eukariotinis polipeptidas sujungtas arba sulietas su visu arba dalimi bakterinio baltymo. Eukariotinį baltymą galima gauti selektyviu fermentiniu arba cheminiu skaldymu eukariotinio ir endogeninio baltymo suliejimo srityje arba selektyviai suskaldant prokariotines sekas.

Darbų, kuriuose aprašyta eukariotinių baltymų ekspresija bakterijose, pavyzdžiai yra paraiška Europos patentui Nr. 47 600 (publikuota 1982 m. kovo 17 d.), joje aprašomas sulietų baltymų ir vientisų baltymų, kuriuose yra jaučio augimo prohormonas arba jaučio augimo hormonas (jAH) baltymo C gale ir prokariotinio baltymo dalis N baltymo gale gavimas, paraiška Didžiosios Britanijos patentui Nr. 2073 245A (publikuota 1981 m. spalio 14 d.), joje aprašomas sulieto baltymo jAH ir E. coli β-laktamazės gavimas; E. Kešet ir kt. Nucleic acid Research, 9: 19-30 (1981) aprašomas sulieto baltymo jAH ir E. coli β-laktamazės gavimas; paraiškoje Europos patentui Nr. 95361 (publikuota 1988 m. lapkričio 30 d.) aprašomas sulieto baltymo, kurio N gale yra endogeninis baltymas, amino rūgšties liekana transkripcijos pradžios signalas - enterokinazės skėlimo sritis ir egzogeninis baltymas (pavyzdžiui, augimo hormonas) C baltymo gale. Toks būdas nėra tinkamas, nes, išgryninus sulietą baltymą, reikia jį laboratorinėmis sąlygomis perskelti fermentu, o šio fermento kaina, tai darant pramoniniu būdu, gali būti limituojanti .

Vis dėlto, sulietų baltymų sistema tapo patrauklia sistema kai kurių eukariotinių genų arba kitų heterologinių DNR ekspresijai prokariotų ląstelėse, nes sulietas baltymas nėra veikiamas proteinazių ir heterologinis baltymas lieka nepažeistas. Bakterijų ląstelės atpažįsta kai kuriuos eukariotinius baltymus, produkuojamus ląstelėje kaip svetimus ir tokiu būdu stengiasi suskaldyti šiuos baltymus iš karto po jų sintezės arba po tam tikro trumpo intervalo. Sulietuose baltymuose, sudarytuose, norint išvengti tikslinio baiLT 3916 B tymo proteinolizės, gali būti endogeninės polipeptidų sekos N gale arba C heterologinio baltymo gale. Tokios konstrukcijos pavyzdys aprašomas paraiškoje Europos patentui Nr. 111814 (publikuota 1984 m. birželio 27 d.); aprašomas sulieto baltymo, kuriame yra tam tikra jAH forma, turinti sintetinę baltymo pradžią (N galas), ir E. coli β-galaktozidazę C baltymo gale. Bet visi privalumai vėl sumenkėja, nes reikia sulietą baltymą atskelti nuo endogeninio baltymo, aukščiau aprašytu būdu.

Pagal kitą būdą transliacijos pradžios signalas ATG, esant reguliuojamam bakteriniam promotoriui, yra prieš pat DNR seką, koduojančią heteroiogini, (pavyzdžiui, eukariotinį) baltymą, kurio nei N, nei C gale nėra endogeninio baltymo. Nors tokių baltymų ir nereikia po išskyrimo skaldyti, bet šiuo būdu gauti baltymai turi N gale metioniną (atskirais atvejais - formilmetioniną), nes startinis kodonas ATG yra ir metionino kodonas. Jei tikslinis baltymas prasideda ne metioninu, tai tokiu būdu gauto baltymo N gale bus papildoma amino/rūgšties liekana - metioninas.

Tokios konstrukcijos pavyzdys yra: Harent ir kt., Cell, (1980), t. 20, p. 543-553, kur triušio β-globino genas, kurio N gale yra valino liekana, ekspresuojamas E. coli ląstelėse, naudojant tik ką aprašytą konstrukciją. Ištyrus, buvo nustatyta, kad triušio β-globino N gale nėra metionino liekanos, o leucino liekanos yra 3, 14, 28, 31, 32 ... padėtyse. Žymėtam baltyme leucino liekanos buvo nustatytos 4, 15, 29, 32 ir 33 padėtyse, o metionino liekana nustatyta 1 padėtyje. Tai demonstruoja, kad šis baltymas yra triušio β-globinas plius metionino liekana N baltymo gale, kuri nėra nuskeliama E. coli ląstelėje, žiūr. ten pat p. 546-547.

Kitas pavyzdys yra augimo hormono gavimas bakterijose, naudojant aukščiau aprašytą konstrukciją. Šoter ir kt.,

Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1984), t. 81, p. 5403-5407, kur aprašoma jAH aukštos ekspresijos bakterijose sistema, kurios pagalba gaunamas N-metioninis jAH, t.y., junginys, kurio amino rūgščių liekanų seka yra tokia pat kaip ir vieno iš gamtoje sutinkamų jAH formų plius metionino liekana N baltymo gale. Metionino liekanos prijungimas įvairių augimo hormono formų N gale, sintetinamų bakterijose, buvo nagrinėjamas paraiškoje Europos patentui Nr. 103395 (publikuota 1984 m. kovo 30 d.) ir paraiškoje Europos patentui Nr. 74 444 (publikuota 1983 kovo 30 d.) jAH atveju ir Siburg ir kt., DNA (1983), t. 2, p. 37-45 jAH ir kiaulės augimo hormono ( kAH ) atvejais.

Metionino liekanos prijungimas natyvaus baltymo N gale gali būti nepageidautinas dėl kelių priežasčių. Pirmiausia, gali būti (nors šiuo metu tai mažai tikėtina) , kad baltymas su papildoma metionino liekana yra antigenas tame organizme, kur šis baltymas be metionino liekanos baltymo N gale yra endogeninis. Antra, papildoma metionino liekana N baltymo gale gali sumažinti šio baltymo biologinį aktyvumą arba pakeisti jo fizikines savybes. Trečia, ši modifikuota baltymo forma gali būti netinkama natyvaus baltymo funkcijos priklausomybės nuo jo struktūros tyrimams. Be to, pageidautina medicininiams ir veterinariniams tikslams naudoti biosintetini baltymą, kuris yra labiausiai artimas gamtiniam.

Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas prokariotų, tokių kaip bakterijos, sugebėjimui pašalinti metionino liekaną baltymo N gale sintezės metu ir po jos. Pavyzdžiui, Waller, J. Mol. Biol., (1963), t. 7, p. 483-496 ištyrė E. coli beląstelinio ekstrakto tirpių ir ribosominių baltymų amino liekanas N baltymų galuose, paraiškoje Europos patentui Nr. 103 395 (publikuota 1984 m. kovo 21 d.) pateikiamas metionino lie6 kanos eukariotinio baltymo, sintetinamo E. coli, N gale pašalinimo būdas. Metionino liekana pašalinama iš dviejų minimų jAH, susintetintų bakterijose, šiuose abiejuose baltymuose po metionino liekanos N baltymų gale yra serino liekana. Geno konstrukcija, kuri buvo naudojama šiuose tyrimuose, buvo sudaryta iš sintetinės startinės sekos, kuri kodavo 5'-metioninas-serinasleucinas-3', ir kuri buvo įterpiama prie 5'-galo sekos, koduojančios jAH, iš kurios buvo iš anksto pašalinamos pirmosios 4 arba 9 gamtinio baltymo aminorūgščių liekanos. Tokiu būdu, sintetinamas E. coli ląstelėse baltymas, nebuvo natyvus. Paraiškoje Didžiosios Britanijos patentui Nr. 2073245A (publikuota 1981 m. spalio 14 d.) nurodoma, kad jei Met ir Pro, tiksliniame jAH baltyme yra pakeisti Ala, tai Met nuskeliamas bakterijose, ir gaunamas modifikuotas jAH, prasidedantis aminorūgščių liekanų seka Pro-Phe-Ala-Pro.

Tokiu būdu, reikalingas ekonomiškas ir aprašomas heterologinių (pavyzdžiui, eukariotų) baltymų, kuriuose nebūtų pirmos aminorūgšties liekanos - metionino - tokiuose mikroorganizmuose, kaip bakterijos, gavimo būdas. Ypatingai pageidaujamas toks būdas, kurio pagalba tokie baltymai gaunami bakterijose, kurias naudojant nereikėtų papildomo baltymo apdorojimo po fermentacijos ir gaunamas baltymas neturėtų papildomos metionino liekanos baltymo N gale.

Augimo hormonai (taip pat vadinami somatotropinais) yra polipeptidai, produkuojami ir sekretuojami hipofizio ląstelėse, jie pasižymi rūšiniu specifiškumu. Be skeleto augimo padidinimo, augimo hormonai įtakoja daugumą metabolizmo procesų: stimuliuoja pieno išsiskyrimą, padidina insulino ir gliukagono išsiskyrimą; jų pagalba pasireiškia lipidų mobilizacijos efektas. Naudojant jAH stambiems raguočiams, pavyzdžiui, padidėdavo primelžto pieno kiekis, efektyviau buvo naudojami pašarai ir/arba padidėdavo prieaugis, trumpėdavo penėjimo laikas ir padidėdavo liesos mėsos kiekis palyginus su riebalais. Bet iki šiol pilnai neaišku, kokiu būdu šis hormonas iššaukia šiuos efektus.

Platūs tyrimai, atlikti su žmogaus augimo hormonu (žAH), parodė, kad hipofizyje yra sekretuojamas ne vienas augimo baltymas, o polipeptidų mišinys. Frakcionuojant šias įvairias žAH formas, buvo gautos žAH frakcijos, kurios nepasižymėjo diabetogeniniu aktyvumu ir frakcijos, kurios nepasižymėjo lipolitiniu aktyvumu.

Taip pat jAH sutinkamas stambiuose raguočiuose yra kelių formų. Sintetinamos keturios jAH formos, kuriose yra skirtingos aminorūgščių liekanos dvejose padėtyse. Baltymo N gale aminorūgšties liekana gali varijuoti dėl nepilno signalinės sekos pašalinimo, todėl subrendęs baltymas prasideda NH₂-Phe-Pro arba NH₂-Ala-Phe-Pro. Be to, gali būti skirtingos aminorūgščių liekanos 126 padėtyje: tai gali būti arba Leu, arba Vai. Tai, matyt, apspręsta aielinėmis populiacijos variacijomis. Wllis (1969) FEBS Letters, 3, p. 118-120; Fellous ir Rogol (1969) J. Biol. Chem. 224, p. 1567-1575; Feriades ir kt. (1971) FEBS Letters, 18, p. 53-54, Felloys (1973) personalus komentaras, pateikiamas Recent Progress in Hormone Research, 29, p. 404; Santoyn (1973) Eur. J. Biochem., 37, p. 164-170; Graf ir Li (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm., 56, p. 168-176. Šiuose darbuose išskiriamos keturios molekulinės hipofizinio jAH formos :

Sutrumpinimas

Seka

jAH(L)		NH2-Phe(1)-Pro (2) . .	.Leu(126)..	.COOH
jAH(A,	L)	NH2-Ala(-1)-Phe(1)-Pro(2) . .	.Leu(126)..	.COOH
jAH(V)		NH2-Phe(1)-Pro(2)..	.Vai(126)..	.COOH
jAH(A,	V)	NH2-Ala(-1)-Phe(1)-Pro(2) . .	.Vai(126)..	.COOH

Formos jAH (A, V) ir jAH(V) kartais vadinamos bendru pavadinimu Valininės alelinės jAH formos arba Valininės jAH formos. Lygiai taip pat jAH(A, L) ir jAH(L) formos kartais vadinamos bendru pavadinimu Leucininės alelinės jAH formos arba Leucininės jAH formos. Skaičiai prie aminorūgščių liekanų aukščiau nurodytose jAH baltymų sekose, naudojami tik identifikacijai ir nuorodų patogumui.

Mills ir kt. (1970) J. Biol. Chem. 245, p. 3407-3415, taip pat identifikavo du bromciano pagalba perskeltus kiaulės augimo hormono (kAH) fragmentus, kurių N galai buvo skirtingi. Viename fragmento N gale buvo fenilalaninas, kitame - papildomas N gale alaninas. Šios kAH molekulinės formos toliau, atitinkamai, trumpinamos kAH(F) ir kAH(A).

Pilnos DNR sekos, koduojančios atitinkamas jAH(L) ir kAH(F) amino-rūgščių liekanų sekas buvo paskelbtos Siburgo ir kt. DNA (1983), 2, p. 37-45, šis darbas naudojamas šiame išradime nuoroda.

Atskirų rūšių stambių raguočių hipofizio ląstelės, kaip buvo nustatyta bendru atveju, produkuoja augimo hormonų mišinį: jAH(A, L) ir jAH(L) arba jAH(A, V) ir jAH(V). Analizuojant jAH, gautų, kultivuojant hipofizio ląsteles baltymų N galus, buvo nustatyta, kad preparatuose yra molekulių mišinys santykiu 50:50; vienose N baltymo gale yra fenilalaninas (Phe), kitose - alaninas (Ala). Preparatuose, pagamintuose pramoniniu būdu iš surenkamų daugelio gyvūnų hipofizių, yra visos keturios jAH formos. Be to, žinoma, kad jAH preparatuose, gautuose iš surenkamų hipofizių, maždaug 30% molekulių yra leucinas 126 pozicijoje pakeistas valinu (Fernandes ir kt., (1971) FEBS Letters, t. 18, p. 53-54). Standartiniais biocheminiais metodais negalima atskirti arba išskirti šias keturias formas pramoniniu būdu.

Pageidautina ištirti ir pagaminti augimo hormono preparatus pramoniniais kiekiais, kuriuose būtų paminėtos atskiros jAH formos, besiskiriančios savo biologiniu aktyvumu, naudojant vieną iš keturių paminėtų hormono formų, kurių preparatuose nebūtų vienos formos arba kitų iš likusių trijų, ir/arba kad šiuose preparatuose nebūtų kitų jaučio baltymų priemaišų. Terminas pagrindinai Švarus” šiame išradime naudojamas, charakterizuojant specialaus baltymo arba baltymų; reiškia, kad baltymo preparate nėra baltymų ir/arba kitų medžiagų, su kuriomis baltymas (baltymai) yra susirišę natyviomis sąlygomis arba jo šaltinyje. Dėl šios ir kitų priežasčių, šio išradimo tikslas yra kiaulės augimo hormono gavimas, išskiriant kDNR, koduojančią kiaulės augimo hormoną, Įterpiant kDNR į bakterinę plazmidę, transformuojant E. coli kamienus gauta rekombinantine plazmide, atrenkant klonus, kuriuose yra rekombinantine plazmide, ir įterpiant kDNR iš šių plazmidžių į ekspresijos vektorių ir po to sekančia transformacija gauta rekombinantine plazmide, tam kad ekspresuoti baltymą E. coli kamienuose, atrenkant transformuotus kamienus, kultivuojant kultūrinėje terpėje, išskiriant ir išgryninant tikslinį produktą.

Konkrečiai šio išradimo tikslas yra kAH(A) gavimas.

kAH polipeptidai, gauti pagal šio išradimo būdą, pasižymi tokiomis somatotropinėmis savybėmis, kaip pieno išsiskyrimo padidėjimas, augimo padidėjimas ir/arba efektyvesnis pašarų panaudojimas.

Pateikiamuose brėžiniuose diagramose punktyriniu kontūru pavaizduota DNR seka, koduojanti bakterinį promotorių, ištušuotas kontūras yra heterologinės DNR koduojanti seka, brūkšneliais pavaizduota papildomos koduojančios DNR sekos (jos konkrečiai pavaizduotos piešinėliuose) rodykle parodoma koduojančių DNR sekų orientacija 5' ir 3'. Taip pat nurodomos atitinkamos skėlimo sritys. Pažymėtos DNR sritys yra pateikiamos vaizdumui ir jos nesusietos su realiais šių sričių dydžiais.

Fig. 1 pavaizduota konstrukcija M13mp8/Xbal, kurioje yra vektorius M13mp8, kuriame SmaI restrikcijos srityje įterptas Xbal fragmentas.

Fig. 2 pavaizduota konstrukcija M13mp8/BGH_ex__lz kurioje yra M13mp8/Xbal, koduojanti jAH(L) DNR seka.

Fig. 3 pavaizduota konstrukcija DNR, koduojančios jAH(A, L), naudojant kryptingą oligonukleotidų mutagenezę specialioje srityje.

Fig. 4 pavaizduota konstrukcija DNR, koduojančios jAH(A, V), naudojant kryptingą oligonukleotidų mutagenezę specialioje srityje.

Fig. 5 pavaizduota ekspresijos vektoriaus pMON3209 konstrukcija su pBGH^.i, kurioje yra koduojanti jAH (A, L) DNR seka vietoje koduojančios jAH(L) DNR sekos.

Fig. 6 pavaizduota ekspresijos vektoriaus pMON3215 konstrukcija su pBGH_ex__x, kurioje yra koduojanti jAH (A, V) DNR seka vietoje koduojančios jAH DNR sekos.

Fig. 7 pavaizduota konstrukcija M13mp9/PGH_ex_₁, kurioje yra M13mp9, kurioje yra koduojanti kAH(F) DNR seka.

Fig. 8 pavaizduota konstrukcija DNR, koduojančios kAH, gauta naudojant kryptingą oligonukleotidų mutagenezę specialioje srityje.

Fig. 9 pavaizduota konstrukcija pBGHg.^* su pBGH_ex_j kurioje EcoRI skėlimo sritis, esanti i viršų, nuo 5' galo, koduojančio ptro, buvo iš anksto pašalinta.

Fig. 10 pavaizduota ekspresijos vektoriaus pMON3213, kuriame yra pBGH_ex__H, konstrukcija, kurioje yra DNR seka, koduojanti kAH(A), vietoje DNR sekos, koduojančios jAH (L) .

Pagal šį išradimą pateikiamas heterologinio polipeptido, tokio kaip eukariotinis (pavyzdžiui, žinduolio arba paukščio) baltymas, kurio N gale yra alaninas, gavimo prokariotuose būdas. Tokiu būdu, gaunamas polipeptidas be papildomo metionino jo N gale. Pastovus tokio polipeptido, kurio N gale nėra metionino, kuris yra gene, koduojančiame polipeptidą, gavimas yra naujas ir nelauktas rezultatas.

Pagal šį išradimą pateikiamas efektyvus pagrindinai švarių baltymų, kurių N gale yra alaninas, gavimo būdas. Tokie baltymai gali būti, be kokių nors apribojimų, minėti jaučio ir kiaulės somatotropinai ir jų variantai, augalų baltymai, konkrečiai, nedidelis subvienetas riboz-1,5-bisfosfatkarboksilazė, gliutationo S-transferazė ir termo šoko baltymas 70. Be to, šis išradimas gali būti efektyviai panaudotas, norint gauti kitus polipeptidus, kai pageidaujama, kad N gale būtų alaninas, o ne metioninas. Gali būti naudinga, kad N gale būtų alaninas, o ne metioninas, pavyzdžiui, nes alanino forma gali būti mažiau imunogeniška, arba pasižymėti kitomis fizikinėmis savybėmis arba modifikuotu biologiniu aktyvumu.

Šio išradimo realizavimo pavyzdžiai, kai gaunamos atskiros jAH arba kAH formos, kultivuojant bakterijų ląsteles, kai šių baltymų N gale nėra metionino todėl nereikalingas jo pašalinimas. Visuose jAH, homologiško gamtiniam, ekspresijos bakterijose darbuose gaunami baltymai su metioninu baltymo N gale. Straipsnyje Siburgo ir kt., DNR, (1983), t. 2, p. 37-45, 44 puslapyje nurodyta, kad jAH, kurių N gale yra fenilalaninas, pavyzdžiui, jAH(L), sąmoningai pasirenkama jo ekspresija E. coli ląstelėse, kad išvengti antros hidrofobinės aminorūgšties liekanos (metionino) prisijungimo prie hidrofobinio alanino, esančio baltymo N gale, pavyzdžiui jAH(A, L). Tokiu būdu, prieinami iki šiol atlikti tyrimai rodo, kad išlieka baltymo, sintetinamo bakterijose, N gale metioninas. Nežiūrint į tai, pareiškėjai nustatė, kad dėl priežasčių, nurodytų aukščiau, būtina gauti kiekvieną iš dviejų formų jAH, jAH(A, L) ir jAH(A, V) ir kiaulės augimo hormono formą kAH(A). Šių somatotropinų gavimo bandymai bakterijose buvo atlikti, laukiant, kad bus sintetinami baltymai, kurių N gale bus metioninas.

Šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose detaliai aprašytas pareiškėjų metodas, kurio pagalba bakterijose gaunami jAH (A, L), jAH (A, V) ir kAH. Trumpiau, šis metodas gali būti aprašomas sekančiai. DNR sekos, koduojančios minėtus baltymus, sudaromos kryptingos mutagenezės tam tikroje DNR sekoje, kuri koduoja jaučio ir kiaulės somatotropinus, kurių N baltymų gale yra fenilalaninas, nukleotidų srityje, tai parodyta Fig. 3, 4 ir 8. Po to sekos, koduojančios jAH(A, L), jAH(A, V) ir kAH, įterpiamos į ekspresijos vektorius, tokiu būdu, kad galutinė geno seka yra: promotorius, ribosomomis sritis, ATG pradžios kodonas esantis prie DNR sekos, koduojančios arba jAH(A, L), arba jAH(A, V), arba kAH (A), ir transliacijos pabaigos kodonas. E. coli kultūra transfekuojama gautu ekspresijos vektoriumi, kuriame yra norimas genas, kultivuojama tokiose sąlygose, kad būtų ekspresuojamas tikslinis heterologinis baltymas. Gauti baltymai analizuojami, nustatant jų seką ir biologinį aktyvumą.

surisimo su (metioninas,

Tokiu būdu, pagal ši išradimą, gaunama, kai DNR seka, kurioje yra transliacijos kodonas (metioninas) po to iš kart heterologinio polipeptido, kurio N gale yra alaninas, kodonai, tai išskirtame iš prokariotinio mikroorganizmo baltyme, iš tikrųjų, N gale yra alaninas, o ne metioninas. Panašu, kad analogiškas rezultatas gali būti gaunamas, jei alanino kodonas yra po apytikriai trijų vienas po kito einančių metionino kodonų, kurie apima iRNR transliavimo pradžią i, tikslinį polipeptidą. Pavyzdžiui, DNR, kurios sudėtyje yra transliacijos pradžios signalas ir tikslinio polipeptido kodonai, gali būti bet kokia seka, kuri atitinkamai koduoja Met-Ala, Met-Met-Ala, Met-Met-Met-Ala arba bet kokį jo funkcinį ekvivalentą.

N-alanininis polipeptidas apibrėžiamas, kaip polipeptidas, kurio N gale yra alaninas. Pareiškėjas nenorėtų apsiriboti žemiau pateikiama mechanizmo teorija, bet jis įsitikinęs, kad po transliacijos N baltymo gale esantis metioninas fermentų pagalba pašalinamas prokariotuose, jei sekanti po metionino aminorūgšties liekana yra alaninas arba kita aminorūgšties liekana, pasižyminti tokiomis pat charakteristikomis (pavyzdžiui, poliaringumas arba hidrofobiškumas) , kurios įgalina pašalinti N gale esantį metioniną. Be to, taip pat įtikėtina, kad dauguma prokariotų sugeba pašalinti N gale esantį heterologinių ir/arba endogeninių polipeptidų metioniną, jei po metionino, esančio N gale, iš kart seka alaninas.

Šie prokariotai (pavyzdžiui, įvairios bakterijos, žinomos ir prieinamos dėka mikroorganizmų deponavimo institutų, tokių, kaip ATCC ir kitų) tai E. coli ir įvairūs jų kamienai (matyt sąrašas neapsiriboja jais). Iš tikrųjų, tikėtina, kad bet koks prokariotas, sugebantis sintetinti polipeptidą, kurio N gale yra alaninas, koduojančioje DNR, kuri prasideda nuo vieno iki trijų gretimų metionino kodonų, po kurių iš kart seka alanino kodonas, potencialiai gali būti efektyvus šio išradimo realizacijai. Naudojami pramonėje ir kiti prieinami prokariotai gali būti patikrinti, ar sugeba jie produkuoti tokius N-alanininius polipeptidus, įterpiant į šių mikroorganizmų genomą geną, kuriame yra promotorius, funkcionuojantis pasirinktame mikroorganizme, DNR, koduojančią surišimo su ribosomomis sritį, nuo vieno iki trijų, sekančių vienas po kito metionino kodonų, kurie yra ir transliacijos pradžios kodonas ir po to iš kart sekančius N-alanino polipeptido kodonus ir transliacijos pabaigos kodoną, po atliekama minėto geno ekspresija ir nustatoma tokiu būdu gauto heterologinio polipeptido N galinė aminorūgšties liekana. Jei nustatoma, kad prokariotinis organizmas produkuoja tokį heterologinį N-alanininį polipeptidą, tai toks mikroorganizmas yra klasės, vadinamos išrinkta patento ir Apibrėžties punktų aprašymui.

Šio išradimo palankiausiame variante buvo naudojami trys E. coli K12 kamienai, kurie deponuoti Amerikos Kultūrų Kolekcijoje, Rocvilles, Meryland, jų kolekcinis numeris ATCC 39986, 53010 ir 53009, šie kamienai pasižymėjo sugebėjimu pašalinti metioniną N baltymų gale, kai po šio metionino sekė iškart alaninas.

Šis išradimas yra reikšmingas, nes įgalina gauti heterologinius polipeptidus, kurių N gale yra alanino liekana .

Viename pageidaujamame išradimo būdo realizavime, kuris yra šio išradimo objektas, jis buvo naudojamas gaunant dvi jAH formas: jAH(A, L) ir jAH (A, V) ir vieną kAH formą - kAH(A), šių preparatų sudėtyje nėra kitų jaučio arba kiaulės baltymų ir/arba kitų jAH arba kAH formų. Šis būdas įgalina gauti jAH(A, L), jAH(A, V) arba kAH(A), kaip vieną formą. Sugebėjimas produkuoti vieLT 3916 B nintelę jAH arba kAH formą, kurių aminorugščių liekanų sekos, homologinės gamtoje sutinkamiems sojnatotropinams, labai svarbus, norint įvertinti tikslų jAH arba kAH formų biologinį aktyvumą, nustatant daugumą sustiprinančių jAH ir kAH efektų, bendru atveju, kaip buvo aprašyta aukščiau. Iš tikrųjų, buvo nustatyta, kad naudojant vieną iš dviejų N-aianininių jAH formų, pasireiškia jAH funkcijos sustiprėjimas - pieno išsiskyrimas. Be to, buvo nustatyta, kad naudojant pieno išsiskyrimo sustiprinančią jAH formą, jAH(A, V), gautą pagal šį išradimą, pieno primilžis žymiai padidėja (statistiniu požiūriu, pavyzdžiui, p<0.05) palyginus, kai naudojamas jAH(A, L). Iki šiol nebuvo tirta įvairių jAH formų santykinis efektyvumas, norint pakelti pieno primilžius. Be to, nebuvo atlikti tyrimai in vivo arba laboratorinėmis sąlygomis įvertinant įvairių jAH formų biologinio aktyvumo skirtumus. Galima padaryti išvadą, kad jAH valininės alelinės formos įtakoja didesnį pieno išsiskyrimą, nei jAH leucino alelinės formos. Ši išvada yra labai svarbi ir nelaukta. Šios išvados dėka galima padaryti prielaidą, kad galima tokiu pat būdu įvertinti skirtumus tarp jAH formų, tokius kaip pašarų efektyvesnis sunaudojimas ir augimo stimuliavimas. Tokiu būdu, panaudojant šį išradimą, kurio pagalba galima gauti bakterijose bent dvi atskiras molekulines hipofizinio jAH formas ir/arba panaudojant kitus žinomus metodus, galima gauti jAH formas, kurios efektyvesnės specialioms reakcijoms, iššauktoms augimo hormono. Kiti žinomi būdai yra (bet jais apsiriboja visas jų sąrašas) pilno jAH baltymo arba jo fragmentų cheminė sintezė, ir/arba jų ekspresiją kituose mikroorganizmuose tokiuose, kaip mielės arba žinduolių ląstelės, panaudojant žinomus rekombinantinės DNR metodus.

Be to, nustačius visų gamtoje sutinkamų formų biologinius aktyvumus, galima gauti polipeptidinius kiekvienos formos variantus, kurie turėtų dar daugiau padiLT 3916 B dinti jų somatotropinį aktyvumą. Galima numatyti, kad sudarant somatotropinų variantus, pašalinant nukleotidus arba aminorūgščių liekanas, pakeičiant ir/arba pridedant nukleotidus arba aminorūgščių liekanas, įgalina gauti įvairias naudingas ekvivalentines kompozicijas, pateikiamas šiame išradime. Tokie jAH variantai yra pakeista jAH(V) forma, kurioje N baltymo gale yra metionino liekana. Šis jAH variantas, sintetinamas genetiškai transformuotoje bakterijoje, kaip buvo nustatyta, padidina pieno išsiskyrimą iki labai didelių dydžių, naudojant jį tokiais kiekiais, kad padidėtų laktacija. Be to, laktacijos padidėjimas, naudojant šį jAH(V) variantą, kaip buvo nustatyta, žymiai didesnis, nei naudojant identiškus variantus, kuriuose vietoje 126 aminorūgšties liekanos yra leucinas.

Nežiūrint į tai, kad pareiškėjas nenorėtų apriboti save žemiau aprašyta mechanizmo teorija, pasirodė, kad pakeičiant leuciną 126 pozicijoje valinu, žymiai padidina tokių somatotropinių baltymų bioįsisavinimą ir/arba biologinį aktyvumą. Somatotropinių baltymų rentgeno kristalografinė analizė parodė, kad minėtų baltymų sritis, apytikriai nuo 90 iki 136 aminorūgšties liekanos, sudaro santykinai labilią sritį. Tiriant kitus baltymus, buvo nustatyta, kad šiose labiliose srityse daugeliu atvejų yra biologiškai aktyvi sritis (pavyzdžiui, sritis, kuri sąveikauja su biologiniu receptoriumi ir/arba su kitomis to paties baltymo dalimis, įgaudamas biologiškai aktyvią formą). Tokiu būdu, galima tikėtis, kad papildomi jAH(A, V) variantai, kuriuose yra pakeitimai, pašalinimai, papildymai ir/arba aminorūgščių liekanų inversijos šioje labilioje srityje ir/arba ne šioje srityje, gali būti gaunami, juos naudojant žymiai padidėja pieno išsiskyrimas, nei naudojant identiškus kitais požiūriais jAH arba jAH(A, L) leucino formas. Pavyzdžiui, pakeičiant 126 pozicijoje arba aplink šią aminorūgšties liekaną hidrofiliškesLT 3916 B nėmis ir/arba mažesnėmis aminorūgšties liekanomis (palyginus su leucinu), tokiu būdu, kad pieno išsigkyrimas nesumažėtų iki minimumo.

Be to, galima tikėtis, kad jAH valino tipai, kurių N gale yra Phe(l) arba Ala(-l), gali užtikrinti aprašytą primilžio padidėjimą, naudojant kartu su pašarais. Taip pat galima tikėtis, kad pakeitus N galą (pavyzdžiui Met(-l)), taip kad jis žymiai nesiskirtų nuo gamtoje sutinkamų jAH baltymų N galo, jAH valininės formos nepadidins primilžių taip, kaip identiški visais kitais atžvilgiais jAH leucino formos ir jAH(A, L). Be to, taip pat galima tikėtis, kad jAH kompozicija, kurioje jAH valininių formų koncentracija, perskaičiavus visų jAH formų svoriui, žymiai didesnė, nei jAH valininių formų, išskirtų iš jaučio hipofizio, taip pat įgalintų pasiekti reikalingą rezultatą.

Pagal vieną plačiausią šio išradimo realizaciją šis išradimas yra rekombinantinės DNR technologijos išplėtimas, norint prokariotuose gauti heterologinius polipeptidus. Tokiu būdu, šio išradimo aprašymas susietas su pagrindiniais metodais, kurie naudojami rekombinantinėje DNR technologijoje, norint išskirti ir klonuoti DNR sekas, koduojančias polipeptidus, pergrupuojant arba pakeičiant klonuotas DNR sekas ir ekspresuojant klonuotas arba modifikuotas DNR sekas transformuotuose mikroorganizmuose. Su šiais metodais yra susipažinęs kiekvienas šios srities specialistas, (žiūr., pavyzdžiui Maniatis, Fritsch ir Sambrook, 1982).

Heterologinės DNR izoliavimas ir/arba konstravimas

Pagal vieną šio išradimo realizaciją DNR seka, koduojanti tikslinį heterologinį polipeptidą, kurį norima ekspresuoti prokariote, pasirenkama ir išskiriama, arba

DNR seka, kuri jį koduoja, konstruojama arba sinte18 tinama cheminiu budu.

svarbių realizacijų

Daugumoje toks polipeptidas yra eukariotų baltymas. Jei polipeptidas yra nedidelis ir žinoma jo aminorūgšeių liekanų seka, tai galima sukonstruoti sintetinę DNR molekulę arba seką, kuri koduotų šį polipeptidą. Jei polipeptido aminorūgšeių liekanų seka nėra žinoma arba jis yra labai didelis, kad būtų galima DNR seką susintetinti, tai atvirkštinės transkripcijos pagalba galima gauti atatinkamą kDNR iš iRNR, kuri gaunama iš audinių arba ląstelių, kurie ekspresuoja šį polipeptidą. Pavyzdžiui, viename šio išradimo realizavimame tokia jAH seka žinomais metodais, kurie yra aprašyti Gudmano ir kt., Methods in Enzymology, t. 68, p. 75-90 (1979), buvo gauta iš jaučio hipofizio.

natyva kDNR gali būti gaunama iš iRNR, ląstelių transformuotų genomine DNR, kuri išskiriama iš natyvaus genų banko specialaus zondo pagalba. Genominė DNR gali būti taip pat modifikuojama įvairiuose vektorių sistemose tokiu būdu, kad DNR gali būti ekspresuoj ama prokariotuose. Šie metodai yra žinomi kiekvienam šios srities specialistui.

Kaip alterišskirtos iš

Po to, kai gaunama heterologinė DNR seka, kurioje yra tikslinio polipeptido kodonai, gali būti naudinga atlikti kai kurias modifikacijas šios molekulės nukleotidų sekoje. Pavyzdžiui, jei ši molekulė buvo gauta atvirkštinės transkripcijos iš iRNR matricos, tai joje daugeliu atvejų bus bent dalis DNR, koduojančios lyderinę probaltymo seką. Todėl būtina pašalinti lyderinę seką, esančią prieš pirmą tikslinio baltymo kodoną. Kai kuriais atvejais būtina papildyti arba įterpti valino kodoną vietoje kito kodono sekos, koduojančios tikslinį baltymą, pradžioje, jei šiame baltyme nėra baltymo N gale valino kodono. Po to įterpiamas transliacijos pradžios kodonas (jis taip pat yra ir metionino kodonas), prieš ir prie pat alanino kodono. Nežiūrint į tai, kad yra kompleksas transliacijos pradžios signalų (metioLT 3916 B nino kodonas bendru atveju) palankiausiame variante (nukleotidų seka ATG, seka GTG taip pat kartais gali būti transliacijos pradžios signalu) naudojamas metionino kodonas. Be to, tuo atveju, kai yra keli metionino kodonai, pavyzdžiui, du, trys, gali būti ir daugiau gretimų metionino kodonų, reikia vertinti, kaip nežymią šio išradimo būdo modifikaciją.

Bent vienas transliacijos pabaigos kodonas turi būti įterptas po baltymo C galo aminorūgšties liekanos kodono, jei jo nebuvo iki tol. Transliacijos kodonų pavyzdžiai yra: deoksinukleotidiniai tripletai TAA, TGA ir TAG. Iš esmės, naudojami rekombinantinės DNR metodai tam, kad sukonstruoti rekombinantinės DNR seką, kurioje būtų, eilės tvarka, transliacijos pradžios signalas (metionino kodonas), tikslinio polipeptido kodonai (N gale turi būti alanino kodonas, kuris yra prie pat transliacijos pradžios signalo) ir bent vienas transliacijos pabaigos kodonas, esantis iš kart po polipeptido C galo aminorūgšties kodono.

Buvo nustatyta, kad efektyviai iRNR ekspresijai gali trukdyti antrinės struktūros, susidarančios vandenilinių ryšių, kurie sujungia dvi komplementarias sekas iRNR viduje, pagalba. Šių komplementarių sekų pašalinimas toje molekulės dalyje, kuri koduoja polipeptido N galą, palengvina iRNR susirišimą su ribosoma, ir to pasėkoje, padidėja ekspresijos lygis. Gali būti pageidautina pakeisti kodonus, kurie dalyvauja susidarant tokioms antrinėms struktūroms, tos pačios aminorūgšties liekanos kodonais, bet iš kitų nukleotidinių tripletų. Žiūr. Europos patentą Nr. 75 444 (publikuota 1988 m. kovo 30 d.); Siburg ir kt., (1983) DNR, 2, p. 37-45 ir Šoier ir kt., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 5403-5407 .

Kiti heterologinės DNR sekos konstravimo būdai suprantami kiekvienam šios srities specialistui. Pavyzdžiui, jei turima DNR molekulė, kuri koduoja polipeptidą, kuri, norima ekspresuoti, kurio N gale yra seka NH₂-Met-X-Y-..., kur X yra bet kokia aminorūgšties liekana, išskyrus alaniną, tai alanino kodonas gali būti įterptas tarp metionino kodono (transliacijos pradžios kodono) ir X aminorūgšties liekanos kodono. Kaip alternatyva, X aminorūgšties liekanos kodonas gali būti pašalinamas, o alanino kodonas įterptas vietoje jo. Tokiu būdu, šio išradimo būdo pagalba būtų gaunamas baltymas, kurio N gale būtų seka NH₂-Ala-X-Y-... arba NH₂-Ala-Y-... .

Tokiu pat būdu galima pašalinti, pridėti ir/arba pakeisti bet kurį aminorūgšties liekanos kodoną, esantį gene ir šio išradimo būdo pagalba galima ekspresuoti variantinius polipeptidus. Variantinis polipeptidas pagal šį išradimą yra polipeptidas, kuriame yra pašalintos viena arba kelios amino rūgščių liekanos, pakeičiant ir/arba papildant kitomis, palyginus su gamtoje sutinkamo polipeptido seka. Tokių variantų pavyzdžiai (bet tai ne visi), kuriuose aminorūgščių liekanų seka šių variantinių jAH formų identiška jAH(L) ir jAH(V), išskirtiems iš jaučio hipofizio ląstelių, išskyrus, kad yra papildomas metioninas baltymo N gale. Šie variantiniai polipeptidai konstruojami taip, kad jų aminorūgščių liekanų seka būtų pagrinde tokia pat kaip ir gamtinių polipeptidų ir kad šie polipeptidai turėtų biologinį aktyvumą. Variantinių polipeptidų konstravimas ir ekspresija gali būti naudinga tam, kad pasiekti didesnį ekspresijos lygį, padidinti baltymo stabilumą, tam, kad supaprastinti polipeptido išgryninimą ir/arba optimizuoti jo biologinį aktyvumą.

Aprašytos aukščiau DNR molekulės, koduojančios tikslinį polipeptidą, modifikacijos gali būti atliktos naudojant restriktazes, egzonukleazes, endonukleazes ir kt., naudojant žinomus metodus. Taip pat galima naudoti bendrus kryptingos oligonukleotidų mutagenezės metodus specialioje nukleotidų sekos srityje tam, kad atlikti nurodytas struktūros arba DNR molekulės sekos modifikacijas; šie metodai taip pat yra žinomi šios srities specialistams. Žiūr., pavyzdžiui, Zoller ir Smit (1982) Nuc. Acids Res., t. 10, p. 6487-6500; Zoller ir Smit (1983), Meth. Enzymol., 10, p. 468-500; Norris ir kt. (1983), Nucl. acids res., t. 11, p. 5103-5112.

Pagal žinomus rekombinantinės DNR metodus, po to, kai gaunama tikslinė heterologinė DNR seka, toliau ši seka įterpiama į atitinkamą klonavimo vektorių, kurio pagalba atliekama DNR sekos replikacija. Tam galima panaudoti bet kokį tinkamą klonavimo vektorių, palankiausiame variante - vektorių, kuriame yra selektyvumo markeris, pavyzdžiui, E. coli plazmidės vektoriai, kuriuose yra Col EI, Xerifild ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1974), t. 71, p. 3455; pBR322, Bolivar ir kt., Gene, (1977), t. 2, p. 95; pBR325, Sobersi ir kt., Gene (1978), t. 4, p. 122 ir pKC7, Rao ir kt., Gene (1979), t. 7, p. 79; ir E. coli bakterofago vektoriai, kuriuose yra XL 47.1, Saron, Loenen ir kt., Gene, (1980), t. 10, p. 249; ir M13mp8 ir M13mp9, Šessing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269. Bendri minėtos DNR sekos įterpimo metodai į klonavimo vektorių, konstruojant rekombinantinį vektorių, žinomi kiekvienam šios srities specialistui. Žiūr., pavyzdžiui knygą Molekulinis klonavimas; Laboratorinis vadovas red. Maniatis, Fritsch ir Sambrook, 1982.

Po to, kai gaunamos kelios tikslinės DNR sekos kopijos, šias sekas galima išskirti iš rekombinantinių vektorių ir Įterpti i ekspresijos sistemą tam, kad gauti ir išskirti tikslinį heterologinį baltymą pagal aprašymą, kuris žemiau detaliai pateikiamas. Prieš įterpiant šias

DNR sekas i, ekspresijos vektorių, galima atlikti įvairias heterologinės DNR sekos modifikacijas, naudojant žinomus kiekvienam šios srities specialistui būdus; žinomais metodais modifikaciją galima atlikti ir po minėto įterpimo.

Šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose be M13mp9, kuris aprašytas Mėsingo ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269, taip pat buvo pasirinktas klonavimo vektorius Ml3mp8, aprašytas ten pat, modifikuotas taip, kad jame būtų Xbal skėlimo sritis, tai parodyta Fig. 1. Vektoriai M13mp8 ir M13mp9, kurie kartu vadinami vektoriai M13, įgalina išskirti rekombinantinius vektorius dvigrandžių (ds) arba replikacinėje formoje (RF), taip pat ir viengrandžių (ss) DNR formoje. RF rekombinantinių DNR vektorių išskyrimas supaprastina tikslinių DNR sekų įterpimą po ekspresijos vektorių replikacijos, tai parodyta Fig. 5, 6 ir 10. Kaip alternatyva, išskiriant šių rekombinantinių vektorių viengrandę formą, kurioje yra tikslinė DNR seka su teisinga 5'-3' orientacija, ekspresijai, taip pat ir atliekant bet kokias DNR sekos modifikacijas, tokiais metodais, kaip kryptinga oligonukleotidų mutagenezė specialioje srityje, tai parodyta Fig. 3, 4 ir 8. Be to, šie M13 vektoriai gali suderinti DNR fragmentus arba genus, kurių ilgis yra iki 4 kilobazių (kb), kurių pagalba galima klonuoti tipinę, pilną, eukariotinę geno seką.

Markerinė funkcija, naudojama M13 vektoriuose, kaip aprašyta Mesing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269, pasižymi fermentas β-galaktozidazė. Konkrečiu atveju tikslinė heterologinė DNR seka įterpiama į geno lacZ fragmentą, kuris yra M13 vektoriuje, tai pažeidžia normalią fragmento lacZ komplektaciją, kuri yra vektoriuje M13, daliniu geno fragmentu lacZ, kuri yra recipiento chromosominėje DNR (pavyzdžiui, JM101 E. coli), taip, kad recipientas nesugeba įsisavinti laktozę, kuri yra bakterijų auginimo terpėje. E. coli po transfekcijos vektoriais M13, kuriuose nėra svetimo geno. sekos, įterptos į vektorių, kuriame yra lacZ geno fragmentas, gali įsisavinti laktozę, kuri yra auginimo terpėje, sudarydamos charakteringas mėlynas dėmes, jei šios bakterijos auginamos ant agaro, kuriame yra terpė lxYT, jos sudėtis - 0.8% (m/t) triptono, 0.5% (m/t) mielių ekstrakto, 0.5% (m/t) NaCI, spalvinis β-galaktozidazės indikatorius. Kai bakterijos auginamos nurodytoje terpėje, E. coli dėmės po transfekcijos rekombinantiniais vektoriais, kuriuose yra įterpta heterologinės DNR seka į vektoriaus M13 fragmento genomą, yra skaidrios ir bespalvės. Todėl, kai įterpiama heterologinė DNR seka į šiuos klonavimo vektorius, tai stebimos bespalvės dėmės po recipiento E. coli transfekcijos rekombinantiniais vektoriais. Įterpimas DNR sekos, koduojančios jAH(L) ir kAH(F), į vektorius M13 pateiktas Fig. 2 ir 9.

Palankiausiame šio išradimo realizavimo variante DNR sekos, koduojančios jAH(L) ir kAH(F), yra plazmidėse pBGH_ex__x ir pPGH_ex__x, atitinkamai, tai aprašyta Siburgo ir kt., DNR, (1983) 2 (1), p. 37-45, išskiriamos iš šių plazmidžių endonukleazių pagalba specifinėje srityje. Reikia pažymėti, kad po transfekcijos plazmidėmis pBGH_ex__x arba pPGH_ex__x ir po kultivavimo tokiose sąlygose, kuriose vyksta ekspresija sekų, koduojančių jAH(L) ir kAH (F), bakterijos produkuoja somatotropinus, kurių baltymo N gale yra metioninas (pavyzdžiui, Met-jAH(L) arba Met-kAH(F), atitinkamai). Atitinkamos sekos po to įterpiamos į RF DNR modifikuotą vektorių M13mp8 M13mp8/Xbal) ir vektorių M13mp9, tai parodyta Fig. 2 ir 7, atitinkamai. Tikslinės DNR sekos, koduojančios jAH(L) arba kAH intarpas RF DNR M13mp8/Xbal ir M13mp9 buvo patvirtinamas naudojant endonukleazes, tai parodyta Fig. 2 ir 7, atitinkamai. E. coli JM101 po to transfekuojamos vienu iš rekombinantinių vektoriumi, kaip aprašyta Messingo ir kt., Methods in Enzymology, (1983), t. 101, p. 20 ir rekombinantinių vektorių ss

DNR, išskiriama pagal metodą, pateiktą Messingo ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269. Atitinkami Messingo ir kt. darbai čia pateikiami kaip nuorodos.

Po šių rekombinantinių vektorių ss DNR išskyrimo atliekama modifikacija kryptingos oligonukleotidų mutagenezės pagalba specialioje srityje, norint gauti koduojančias jAH (A, V), jAH (A, L), jAH (V) ir kAH (A) sekas. Konkrečiu atveju, jAH(L) buvo modifikuojamas papildant seką alanino kodonu, pavyzdžiui GCC sekos, koduojančios jAH (L), 5' gale, kaip parodyta Fig. 3. Galima tikėtis, kad tokiu būdu galima papildyti bet kuriuo iš keturių alanino kodonu. Pageidautinas alanino kodonas, norint pasiekti ekspresijos sistemoje, pagal šį išradimo būdą, optimalią somatotropino išeigą, yra GCC. Alanino prisijungimas, konstruojant koduojančią jAH(A, L) seką, patvirtinamas analizuojant pilnos koduojančios jAH (A, L) DNR seką, arba jos 5' galą, naudojant metodą: Zanger ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1977), t. 74, p. 5468.

Seka, koduojanti jAH(A, V), konstruojama kryptingos oligonukleotidų mutagenezės pagalba specialioje srityje, koduojančioje jAH(A, V), tai parodyta Fig. 4, pakeičiant leucino kodoną 127 pozicijoje (jAH(A, L)) i valino kodoną, pavyzdžiui į GTG. Vėl galima tikėtis, kad atliekant tokius pakeitimus, galima naudoti bet kurį valino kodoną. Sekos, koduojančios jAH(A, V), konstrukcijos teisingumas tikrinamas, analizuojant gautos DNR seką.

Seka, koduojanti jAH(V), kurios pagalba sintetinamas po bakterijų transfekcijos vektoriais, kuriuose yra koduojanti jAH(V) seka, baltymas Met-jAH(V), analogiškai konstruojama kryptingos mutagenezės pagalba, pakeičiant leucino kodoną 126 padėtyje [ jAH(L)] i, valino kodoną, pavyzdžiui, GTG.

Seka, koduojanti kAH (A) , konstruojama kryptingos mutagenezės pagalba specialioje kAH(F) srityje taip pat, kaip parodyta Fig. 8 ir konstravimas detaliai yra aprašomas žemiau, konstrukcijos teisingumas tikrinamas analizuojant DNR seką.

Po tikslinės heterologinės DNR sekos, išskyrimo ir konstravimo, analogiškai kaip ir jAH(A, L), jAH(A, V) ir kAH(A) atvejais, šios sekos gali būti replikuojamos ir gaunama daug jos kopijų, dauginant atitinkamus rekombinantinius vektorius, naudojant metodus, žinomus kiekvienam šios srities specialistui, šie metodai buvo aprašyti aukščiau. Šios heterologinės DNR sekos gali būti įterptos į bet kokius tinkamus ekspresijos vektorius, norint produkuoti prokariotuose heterologinius polipeptidus.

Polipeptidų, kurių N gale yra alaninas, gavimas

Kaip buvo nurodyta aukščiau, tinkamame ekspresijos vektoriuje turi būti reikalingi transkripcijos ir transliacijos signalai tam, kad būtų galima gauti heterologinį baltymą pasirinktame recipiente, taip pat turi būti markeris tam, kad identifikuoti tuos ekspresijos vektorius, kuriuose yra įterpta tikslinė heterologinė DNR seka. Panaudojant prokariotinį ekspresijos vektorių, rekombinantinės DNR sekos gali būti įterpiamos transdukcijos, transformacijos arba transfekcijos pagalba (visi šie metodai toliau vadinami vienu terminu transfekcija) ir po to minėtas mikroorganizmas kultivuojamas tokiose sąlygose (šios sąlygos priklauso nuo pasirinkto promotoriaus ir recipiento), kuriose yra simuliuojama tikslinio polipeptido produkcija. Tokiu būdu, mikroorganizmų, naudojamų pagal šį išradimą, geLT 3916 B nominės DNR yra kaip chromosominė, taip ir episominė DNR.

Žinoma keletas heterologinio geno ekspresijos ir produkavimo prokariotiniame recipiente vektorių, šie vektoriai dabar yra žinomi kiekvienam šios srities specialistui .

Palankiausiame šio išradimo realizavimo variante buvo naudojami ekspresijos vektoriai pBGH_ex__x, žiūr. Siburg ir kt., DNA (1983), 2 (1), p. 37-45 ir pBGH_ex._x*, kuris yra vektoriaus pBGH_ex_₁ modifikacija.

Ekspresijos vektoriai pBGH_ex__: yra bakterinė plazmidė pBR322, kurioje yra jAH(L) genas. Šis genas sudarytas iš triptofano promotoriaus (ptrp), Shine-Dalgarno sekos, transliacijos pradžios signalo ATG (metionino kodonas, kuris yra prie pat koduojančios sekos N gale esančio fenilalanino, pirmos jAH(L) amino rūgšties liekanos) , sekos, koduojančios jAH(L) ir transliacijos pabaigos kodono.

Ekspresijos vektoriaus pBGH_ex__x markeris yra atsparumas antibiotikui. Konkrečiu atveju pBGH_ex__x yra du atsparumo antibiotikams genai: vienas - atsparumo ampicilinui (amp^r) ir kitas - atsparumo tetraciklinui (tet^r) , kurie suteikia stabiliai transformuotiems ekspresijos vektoriais recipientams atsparumą antibiotikams. Tokiu būdu, stabiliai transformuotos ląstelės gali būti atrenkamos pagal sugebėjimą augti terpėje, kurioje yra arba tetraciklinas, arba ampicilinas, arba abu šie antibiotikai .

Šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose ekspresijos vektoriai pMON3209 ir pMON3215, kuriuose yra pBGH_ex__x, kuriuose yra sekos, koduojančios jAH(A, L) ir jAH(A, V), atitinkamai, vietoje sekos, koduojančios jAH(L), buvo gaunami pagal Fig. 5 ir 6 pateiktą schemą. Po to tokios bakterijos buvo stabiliai transformuojamos ekspresijos vektoriais, transformuotos ląstelės atrenkamos auginant terpėje, kurioje yra atitinkami antibiotikai. Ekspresijos plazmidės, esančios transformuotose bakterijose, buvo restriktazių pagalba analizuojamos, norint patikrinti, ar sekos, koduojančios jAH(A, L) ir jAH(A, V), yra teisinga 5'-3' orientacija.

Šio išradimo realizavimo pavyzdyje, konstruojant ekspresijos vektorių pMON3213, kuriame yra seka, koduojanti kAH(A), vietoje sekos, koduojančios jAH(L), buvo panaudotas ρΒΘΗ^.!*, kuriame yra vektorius pBGH^.!, modifikuotas, pašalinant EcoRI skėlimo sritį, kuri yra prieš 5’ galą sekos, kuri koduoja ptrp. Gautame vektoriuje pBGH_ex_₁* yra tik viena EcoRI skėlimo vieta, tai parodyta Fig. 9. Sekos, koduojančios jAH(L) pakeitimas seka, koduojančia kAH (A), vektoriuje pBGH^.j*, konstruojant ekspresijos vektorių pMON3213, pavaizduotas Fig. 10. Toliau E. coli kultūra buvo transformuojama aukščiau minėtu vektoriumi ir transformuotos ląstelės buvo atrenkamos auginant terpėje, kurioje buvo antibiotikas. Ekspresijos plazmidėse, esančiose transformuotose bakterijose, buvo tikrinama, ar yra seka, koduojanti kAH(A), restriktazių pagalba.

jAH(A, L), jAH(A, V) arba kAH(A) produkavimas buvo vykdomas E. coli bakterijose, transformuojant kamienus arba E. coli W311O, arba E. coli LK892, arba E. coli 294, kurie yra deponuoti, jų katalogo numeriai yra ATCC 39936, 53010 ir 53009, vektoriais pMON3209, pMON3215 arba pMON3213, metodais, kurie buvo aukščiau detaliai aprašyti. Transformuotos E. coli W3110 ląstelės buvo auginamos tokiomis sąlygomis, kuriose vyksta somatotropino genų ekspresija, ir produkuojami tiksliniai heterologiniai polipeptidai.

Heterologinio polipeptido išgryninimas priklausys kaip nuo polipeptido prigimties taip ir nuo pasirinkto recipiento. Pavyzdžiui, buvo pastebėta, kad heterologiniai baltymai, gaunami tokiose bakterijose, kaip E. coli, dažnai būna viduj ląstelės netirpioje formoje kaip intarpiniai kūneliai. Čia naudojamas terminas intarpiniai kūneliai, nes šiuos kūnelius galima matyti fazinio kontrasto mikroskopu. Būdas, kuris naudojamas heterologinių baltymų išgryninimui, išsaugant jų biologinį aktyvumą, aprašytas paraiškoje Europos patentui Nr. 114506 (publikuota 1984 m. rugpjūčio 1 d.), šiame išradime šis būdas vartojamas kaip nuoroda. Trumpai aprašant šį būdą, tai producento ląstelių koncentravimas, šių ląstelių ūžavimas, gaunant ekstraktą arba ląstelių homogenizatą ir intarpinių kūnelių išsiskyrimas, naudojant diferencinį centrifugavimą, visos šios stadijos yra gerai žinomos šios srities specialistams. Išskirti intarpiniai kūneliai ištirpinami stipriame denatūruojančiame agente tokiame, kaip guanidino hidrochloridas, ir ištirpintas baltymas toliau dializuojamas tinkamame tirpiklyje (pavyzdžiui, urėjoje), gryninamas chromatografijos pagalba ir pagaliau biologiškai aktyvuojamas, t.y., atstatoma aktyvi baltymo konformacij a, išsaugant disulfidinius ryšius tarp cisteino liekanų pagal paraišką Europos patentui Nr. 114506. Detalesnis heterologinių baltymų išgryninimo aprašymas pateikiamas pateiktose nagrinėjimui paraiškose JAV patentui, viena pateikta S. B. Storros, kurios pavadinimas - Somatotropinų soliubilizacijos būdas, ir antra pateikta L.E. Bentl, S.B. Storros ir J.Y. Mitchell, kurios pavadinimas - Somatotropinų renatūravimo būdas, šios paraiškos naudojamos kaip nuorodos. Dvi paminėtos nagrinėjamos paraiškos JAV patentui ir šis patentas pateiktos Monsanta kompanijos vardu. Tolesnis heterologinio baltymo išgryninimas, atskiriant nuo bakterinių baltymų, gali būti atliekamas žinomais chromatografiniais metodais tokiais, kaip gelfiltracija arba jonų mainų chromatografija. Bendru atveju, gautame preparate yra apytikriai nuo 90% iki 99.5% polipeptido^ kurio N gale yra alaninas ir nuo 0.5% iki 10% bakterijų arba kito prokarioto baltymų, kuriame buvo sintetinamas baltymas .

Buvo nustatyta, kad, bendru atveju, bent 80% heterologinio baltymo, ekspresuoto pagal šio išradimo būdą, N gale yra NH₂-Ala~... tipo struktūra. Likusi polipeptidų dalis, paprastai, turi N gale metioniną, jų N gale yra NH₂-Met-Ala-... tipo struktūra. Visdėlto, keičiant auginimo sąlygas ir/arba indukcijos trukmę, galima padidinti polipeptido išeigą, kurio N gale yra alaninas bent iki 95% ir daugiau.

Palankiausiame šio išradimo realizavimo variante somatotropiniai polipeptidai, produkuojami ir išskiriami pagal šį aprašymą, pateiktą aukščiau, buvo pademonstruota, kad jie pasižymi biologiniu aktyvumu artimu somatotropino aktyvumui; tai buvo nustatyta analizuojant triušio kepenų receptorių reakciją, atliekant pagal Pišim ir Frizen, J. Cin. Endocrinol. Metab. (1973), t. 37, p. 334-337 ir analizuojant žiurkių priaugimą. Pagal paskutinį somatotropinų, gaunamų E. coli ląstelėse, biologinio aktyvumo analizės metodą biologinis aktyvumas buvo nustatomas pagal žinomą somatotropino partiją (pavyzdžiui, jaučio arba kiaulės hipofizarinį somatotropiną), palyginant žiurkių, kurioms buvo pašalintas hipofizis, priaugimą, įvedant skirtingus junginio kiekius. Konkrečiai, dienos dozės (nuo 0 iki 60 mikrogramų) žinomo arba iš standartinio šaltinio somatotropino buvo injekcijomis įvedamos žiurkėms (95-135 g) su pašalintais hipofiziais 7 ir daugiau dienas. Panaudojant regresinę analizę, buvo nustatoma gyvūnų, kuriems buvo įvedamas žinomas ir tiriamas kiekis augimo hormono, svorio priaugimo regresijos lygtis priklausomai nuo įvesto hormono kiekio logaritmo. Tiesės lygLT 3916 B ties tga buvo kontroliuojamas, norint išvengti lygiagretumo ir persidengimo. Biologinis aktyvumas buvo išreiškiamas kaip tga santykis padaugintas iš standarto aktyvumo.

N-alanininių jAH panaudojimas, kuris yra šio išradimo objektas, padidina karvių primilžį ir, matomai, sumažėja pašarų, reikalingų norimam primilžiui pasiekti, sunaudojimas. Duodant karvėms, kurios auginamos pienui, jAH tas formas, kuriose yra valinas 126 arba artimoje pozicijoje, ypatingai tinkamos pieno primilžiui padidinti. Šie preparatai, kurie yra šio išradimo objektas, gali būti naudojami injekcijomis, įvedant į veną arba implantuojant ant polimerų arba kitų nešėjų, kurie užtikrina reikalingo augimo hormono kiekio išsiskyrimą į kraują. Galima naudoti farmaciškai tinkamas formas, kaip tirpalai, emulsijos arba geliai, kurie yra apvalkale arba be jo. Šiose formose gali būti tik atskiros jAH formos arba jų variantai, o taip pat bet kokia kombinacija natyvaus ir/arba variantinio polipeptido [pavyzdžiui, mišinys jAH (A, V) ir jAH (A, L), ir/arba mišinys jAH(A, V) ir Met-jAH(A)] . Dozės gali kisti nuo 0,005 mg iki 200 mg vienam gyvūnui per dieną, palankiausiame variante - apytikriai nuo 5 mg iki 40 mg vienam gyvūnui per dieną. Labiausiai efektyvus kiekis, norint padidinti primilžius ir/arba padidinti pašarų sunaudojimo efektyvumą, gaunant pieną, galima nustatyti eksperimentu. Realiai pageidautinos jAH dozės priklauso nuo tokių parametrų, kaip gyvūno kūno svoris, bendra gyvūno sveikatos būklė ir šėrimo statusas. Nors jAH poveikį karvėms galima naudoti primilžio rodiklį, šiam tikslui galima naudoti ir kitus karvių produktyvumo rodiklius - bendras augimo dydis ir gyvo svorio padidėjimas. Jeigu tai būtina, tai jAH gali būti naudojamas kartu su kitais stimuliuojančiais agentais, tokiais, kaip biologiškai aktyvūs baltymai, antigenai ir kt., tuo atveju pasiekiamas žymesnis efektas.

Kaip buvo minėta aukščiau, šiuo išradimu pateikiamas jAH variantų, kurių N gale yra alaninas, kuriuose yra pašalintos, papildytos, sukeistos ir/arba pakeistos aminorūgščių liekanos polipeptidinėj e grandinėje, gavimo būdas. Įvairios modifikacijos, kurių dėka pasiekiami tokie efektai, kaip laktacijos ir/arba augimo greičio padidėjimas, gali būti identifikuoti bandymuose su karvėmis.

Žemiau pateikiami pavyzdžiai yra šio išradimo palankiausio realizavimo iliustracija ir jie nėra šio išradimo apribojimas. Nežiūrint į tai, kad pateikiamas išradimas buvo aprašomas palankiausiais šio išradimo realizavimo pavyzdžiais, kiekvienam šios srities specialistui suprantama, kad pagal šio išradimo aprašymą galima atlikti įvairias modifikacijas, neperžengiant šio išradimo Apibrėžties.

Mikroorganizmai ir Plazmidės

Išvardinti mikroorganizmai gali būti gauti iš Amerikos Kultūrų Tipų Kolekcijos (ATCC), 12301 Parklawn Drive, rockville, Maryland, 20852 - 1776, JAV.

ATCC	39936-	E.	coli	W3110
ATCC	53010-	E.	coli	LK392
ATCC	53009-	E.	coli	kamienas 294
ATCC	53024-	E.	coli	W3110/pMON3209/
ATCC	53022-	E.	coli	W3110/pMON3215/
ATCC	53023-	E.	coli	W3110/pMON3213/

Šie deponuoti mikroorganizmai gali būti išduoti po šios paraiškos JAV patento išdavimo firmoje Monsanta Company.

Šie deponuoti mikroorganizmai bus prieinami po bet kokio JAV patento, kurio prioritetas bus nustatytas pagal pateikimo datą, išdavimo. Bet reikia turėti omeny, kad galimybė pasinaudoti deponuotais mikroorganizmais nesuteikia licenzijos šio išradimo naudojimui, pažeidžiant teisėtas pareiškėjo teises. Be to, šis išradimas neapsiriboja deponuotais mikroorganizmais, nes deponuoti mikroorganizmai tik iliustruoja šio išradimo objektą.

Pavyzdys 1

Visi oligonukleotidai buvo susintetinti firmoje Monsanta Botanikos skyriuje, sintezė buvo atliekama DNR sintezatoriumi (Applied Biosystems) pagal procedūrą, pateiktą gamintojo - Applied Biosystems Ine., Foster sity, Kalifornija. Restriktazės ir DNR modifikavimo fermentai buvo gauti iš firmos New England Biolabs, Ine. (Beverly, MA) , iš firmos New England Nuclea (Bostonas, MA) ir iš firmos Bethesda Reseach Laboratories (BRL) (Gavtensburg, Meryland), linkeris Xbal buvo gautas iš firmos Colaborative Reseach, Ine., (Leksington, MA). DNR ligazė T4 buvo gauta iš firmos BRL (Gavtensburg, Meryland), DNR kinazė T4 buvo gauta iš firmos New England Biolabs, Ine. (Beverly, MA). Žymėti ³²P nukleotidai buvo gauti iš firmos American (Arlington, IL) . Klenovo fragmentas DNR polimerazė I buvo gauta iš firmos New England Nuclea (Bostonas, MA) . E. coli JM101 buvo gautas iš dr. Joe Mesing, Minesotos Universitetas (Sant Paul, Minesota).

Skaldymas restriktazėmis, ligavimas DNR ligaze T4 ir Klenovo fragmentu DNR polimeraze I E. coli gali būti atliekami pagal gamintojų rekomendacijas. Tinkamiausi buferiniai tirpalai aprašytiems žemiau fermentams gali būti sekantys: XbaI:100 mM NaCl, 50 mM TRIS, pH 7.5, 10 mM MgSO₄; EcoRI, HindlII ir SmaI:50 mM NaCl, 10 mM TRIS, pH 7.5, 10 mM MgSO₄. DNR ligaze T4 reakcija vykdoma buferiniuose tirpaluose, kurių sudėtyje yra: 25 mM TRIS, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 10 mM ditiotrietolio (DTT), 2 mM spermidino ir 0.2 mM ATF, Klenovo fragmentas DNR polimerazė I E. coli buvo naudojama buferiniame tirpale, kuriame yra: 20 mM TRIS, pH 7.2, 10 mM MgCl₂, 10 mM ditiotrietolio (DTT), 1 mM ATF ir po 1 mM kiekvieno dATF, dGTF, dDTF, dCTF. Jei būtina gauti sintetinamą DNR seką pažymėtą, tai vykdant reakcija su Klenovo fragmentu buvo pridedama a-³²P-ATF (400 Ci/mol) .

Žymėti oligonukleotidai buvo gaunami naudojant y-³²P-ATF (specifinis aktyvumas didesnis, nei 5000 Ci/mol) ir DNR kinazę T4 su 100 mM TRIS, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT.

Plazmidės, kuriose yra DNR sekos, koduojančios jAH(L) ir kAH(F) (pBGH^.j ir pPGH^.-Į, atitinkamai), buvo gautos iš firmos Genentex, Ine., SanFrancisko, Kalifornija. Šios plazmidės gali būti gaunamos pagal aprašymą, pateiktą paraiškoje Europos patentui Nr. 75444 (publikuota 1983 m. kovo 30 d.); Siburg ir kt., DNR (1983), 2 (1), p. 37-45; Geddel ir kt., Nature (1979), t. 281, p. 544-548; Debber ir kt., knygoje Promotoriai: Struktūra ir funkcijos (1982); redaktoriai: M.J. Čemberlin ir R. Rodriges, Sk. 293; Mioccari ir Janothski, J. Bacteriol (1978), t. 133, p. 1457-1466; ir Rozenbegr ir Kurt, Annual Review of Genetic t. 13, p. 319-353. Pirmieji transliuojami DNR, koduojančios jAH(L), kodonai pateikti paraiškoje Europos patentui Nr. 75444 (DeBoer ir kt. ) yra ATG TTC CCA GCT ATG TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT arba jų funkciniai ekvivalentai. (Kaip alternatyva, suprantama, galima panaudoti funkcinius šių kodonų ekvivalentus). Kita, susijusi su nagrinėjamais klausimais, medžiaga pateikiamose publikacijose taip pat naudojama čia kaip nuorodos .

M13mp8 ir Ml3mp9 buvo gauti iš daktaro Joe Mesing iš

Minesotos Universiteto (St. Paul, Minesota).

Visos terpės bakterijų auginimui ir antibiotikai buvo gaunami arba iš firmos Sigma (St. Louis, MO) , arba iš firmos Difco Laboratories (Detroitas, Mičiganas).

Pavyzdys 2

Pateikiamuose žemiau pavyzdžiuose iliustruojamas trijų koduojančių DNR sekų, kurias ekspresavus, pasiekiama tiesioginė produkcija bakterijose polipeptidų, kurių N gale yra alaninas, konstravimas. Konkrečiu atveju, koduojančios DNR sekos buvo konstruojamos tokiu būdu, kad transliacijos pradžios signalas (metionino kodonas ATG) buvo prie pat alanino kodono (pavyzdžiui, GCC) . Šios trys koduojančios DNR sekos, koduojančios jAH(A, L), jAH(A, V) ir kAH(A), buvo konstruojamos kryptingos mųtagenezės pagalba, naudojant anksčiau išskirtas somatotropiną koduojančias DNR sekas. Šis pavyzdys iliustruoja taip pat ir DNR sekos, koduojančios jAH(V), kurią ekspresuojant bakterijose, sintetinamas Met-jAH(V).

A. DNR sekos, koduojančios jAH(A, L) konstravimas

DNR seka, koduojanti somatotropiną, jAH(L), buvo išskiriama iš pBGHg^, kaip Xbal fragmentas ir kionuojama į Xbal skėlimo sritį vektoriuje M13mp8 (M13mp8/Xbal). Vektorius Ml3mp8/Xbal, kuriame yra Xbal linkeris pradinėje SmaI skėlimo srityje, konstravimas pateiktas Fig. 1. Kaip parodyta Fig. 2, Xbal skelia viename DNR sekos, koduojančios jAH(L), išpjaudama pilną DNR seką, koduojančią jAH (L). Plazmidė pBGH_ex_₁, perskelta Xbal restriktaze buvo sumaišoma, esant DNR ligazei T4, su RF DNR Ml3mp8/Xbal, linerizuota restriktazės Xbal pagalba, ir paveikiama šarmine fosfataze, išskirta iš jaučio žarnyno. Po to mišinys buvo inkubuojamas per naktį 14°C temperatūroje. Paveikus šarmine fosfataze, išvengiama vektoriaus M13mp8/Xbal recirkuliacijos. DNR sekos, koduojančios jAH(L), įterpimas į vektorių

M13mp8/Xbal, konstruojant rekombinantini vektorių M13mp8/BGH_ex__lz iš pradžių buvo kontroliuojamas pagal bespalvių dėmių susidarymą, auginant E. coli JM101 bakterijas lxYT terpėje, naudojant minkšto agaro paruošimo procedūrą, aprašytą knygoje Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas red. Maniatis, Fritš ir Sembruk (1982), p. 64, šiame agare yra 10 μΐ 100 mM IPTGP (izopropil-p-G-tiogalaktopiranozidas) ir 50 μΐ 2% (m/v) XGAL (5-brom-4-chlor-3-indolil-p-D-galaktopiranozidas) 3 ml viršutinio agaro, ir buvo atliekama transfekcija minėtu rekombinantiniu vektoriumi, aprašytu aukščiau būdu. Sekos, koduojančios jAH(L), įjungimas buvo patvirtintas analizuojant restrikcine analize išskirtą rekombinantinio vektoriaus RF DNR restriktaze Xbal, buvo gaunamas 590 bazių porų fragmentas, kuriame buvo įterpta seka (Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas red. Maniatis, Fritsch ir Sambrook (1982), skyrius 3). 590 bazių porų fragmentas buvo identifikuojamas elektroforėzės 1% (m/t) agarozėje pagal aprašytą knygoje Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas red. Maniatis, Fritsch ir Sambrook (1982) metodiką. Visi kiti restrikciniai fragmentai buvo identifikuojami šios procedūros pagalba. Įterptų sekų, koduojančių jAH(L), orientacija buvo kontroliuojama skaldant rekombinantinį RF vektorių fermentais SmaI ir HindlII. Jei koduojančios sekos yra teisingos 5'-3' orientacijos, tai po skaldymo šiais fermentais turi būti gaunamas 207 bazių porų fragmentas. Fago ssDNR išskyrimas buvo atliekamas pagal metodiką, aprašytą Missing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269. Po to vektorius M13mp8/BGH_ex_₁ buvo naudojamas kaip matrica atliekant kryptingą mutagenezę iš esmės pagal aprašymą, pateiktą Zoller ir Smith, Nuc. Acids Res., (1982), t. 10, p. 6487-6500, Zoller ir Smith, Methods in Enzymology (1983), t. 100, p. 468500, Norriss ir kt., Nuc. Acids Res., (1983), t. 11, p. 5103-5112, šie aprašymai čia pateikiami kaip nuorodos.

Fig. 3 pateikiama mutagenezės diagrama, konstruojant DNR seką, koduojančią jAH(A, L) iš sekos, koduojančios jAH(L). Trumpai, tai oligonukleotidų pradmenį (žiūr. Lentelę 1, žemiau), kuriame yra norimos mutacijos seka, naudojamas ciklizuotos DNR matricos MlSmpS/BGH^.! iš ssDNR, pradmens sintezei. Tokiu būdu gautos uždaros žiedinės dsDNR molekulės buvo atskiriamos nuo nepilnų ir vienspiralių DNR žiedų, naudojant ultracentrifūgavimą pašarmintame sacharozės gradiente, pagal metodiką, aprašytą Zoller ir Smith, Methods in Enzymology (1983), t. 100, p. 468-500. Žiedinės dsDNR molekulės toliau buvo naudojamos E. coli JM101 transformavimui, kuris buvo atliekamas pagal metodiką, aprašytą Messing ir kt., Gene, (1982), t. 19, p. 269-276, gautos bespalvės dėmės buvo pernešamos ant Pall filtrų, gautu iš firmos Pall

Ultrafine Filtration Corp. (Glen Kown, New York), ir 32 buvo tikrinamos hibridizuoj ant su žymėtu P oligonukleotidiniu pradmeniu, kuris buvo naudojamas kryptingai mutagenezei. Minėtų dėmių surinkimas buvo atliekamas pagal filtrų gamintojo Pall pateikiamą metodiką. Išsėjimas hibridizuoj ant buvo atliekamas naudojant nailoninius Biodine filtrus, kurie yra aprašyti Pall Ultrafine Filtration Corp. (Glen Kown, New-York) publikacijoje Vadovas DNR pernešimui ant nailoninių Pall Biodine™ filtrų (1983). Filtrai buvo praplaunami, didinant temperatūrą, iki tol, kol atsiplaudavo radioaktyvi žymė iš kontrolinio filtro, kuris buvo paruošiamas naudojant fagą Μ^πιρδ/ΒΰΗθχ.!. Bendras atplovimo protokolas: praplovimas kambario temperatūroje su 6xSSC (0.9 N NaCl ir 0.09 M natrio citratas) 10 minučių, po to praplovimas 50°C temperatūroje su 6xSSC 5 minutes ir po to sekantys praplovimai, pakeliant temperatūrą kas 5°C. Dėmės, kurios hibridizavosi su žymėtu oligonukleotidiniu pradmeniu aukštesnėse temperatūrose, nei kontroliniai fagai, buvo Įvertinamos, kaip turinčios naujai sudarytą seką, koduojančią jAH(A, L), ir jos buvo toliau vadinamos potencialiai teiLT 3916 B giamomis. Kaip alternatyva, atskiros bespalvės dėmės buvo atrenkamos iš transformuotų E. coli JM101 ląstelių ir buvo auginamos 5 ml terpėje 2xYT (1.6% (m/t) triptono, 1,0% (m/t) mielių ekstrakto, 0.5% (m/t) NaCl) per naktį aeruojant 37°C temperatūroje. Fago DNR, gauta pagal aprašymą, pateiktą Messing ir kt., Gene (1982), t. 19, p. 269, dėmėmis buvo užnešama ant nitroceliuliozės membranos, atliekama hibridizacija su žymėtu pradmeniu ir atplaunama, keliant temperatūrą tokiu pat būdu, kaip buvo aprašyta aukščiau. Fago DNR, kurios hibridizavosi aukštesnėje temperatūroje, nei kontrolinės MlSmpS/BGH^.! dėmės, buvo įvertinamos kaip teigiamos. Potencialiai teigiamos dėmės, atrinktos abiejų metodų metu, buvo auginamos pagal aprašymą, pateiktą anksčiau, ir buvo naudojamos fago ssDNR išskyrimui, šios DNR seka buvo analizuojama pagal metodiką, pateiktą Zanger ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1977), t. 74, p. 5463, tam, kad patvirtinti, kad jos koduoja jAH(A, L). RF DNR iš MlSmpe/BGHejj,! (Ala) taip pat buvo tikrinama, skeliant restriktaze HaelII, norint įsitikinti, kad yra Ala kodonas po transliacijos pradžios signalo (metionino kodono ATG), nes įvedus Ala kodoną, gaunama papildoma HaelII skėlimo sritis. Alanino kodono prisijungimo išeiga prie DNR sekos, koduojančios jAH(L), yra apytikriai 2%.

B. DNR sekos, koduojančios kAH(A), konstravimas

Šiuo atveju taip pat buvo naudojama kryptinga mutagenezė, norint prijungti alanino kodoną prie DNR sekos, koduojančios kAH(F), pagal metodiką, aprašytą Siburg ir kt. DNR, (1983), 2 (1), p. 37-45. Mutagenezė, pagal diagramą, pateiktą Fig. 8, buvo atliekama sekančiai:

DNR seka, koduojanti kAH(F), kurios ilgis 590 bazių porų, esanti plazmidėje pPGH_ex_!, buvo išskiriama restriktazėmis EcoRI ir HindlII, kurios skelia plazmidę 5’-3’ galuose, tai parodyta Fig. 7. Perkirpta plazmide pPGH^.! buvo sumaišoma su RF DNR M13mp9 po skėlimo EcoRI ir HindlII, bet iš anksto paveikta šarmine fosfataze iš jaučio žarnyno tam, kad išvengti pakartotino M13mp9 ligavimosi. Po to į šį mišinį buvo pridedama DNR ligazė T4. Esant lipniems galams fago RF DNR sekoje ir DNR sekoje, koduojančioje kAH(F), kurios gaunamos, panaudojant dvi skirtingas restriktazes, kAH(F) DNR seka gali būti selektyviai įterpta į fago RF DNR ir gali būti įterpiama teisinga 5'-3' orientacija, tai pavaizduota Fig. 7. Po to buvo atliekama E. coli JM101 transformacija tokiu pat būdu, kaip ir aprašytu aukščiau M13mp8/BGH_ex_₁ atveju, gaunamame rekombinantiniame vektoriuje M13mp8/PGH_ex_₁ yra DNR seka, koduojanti jAH (F). Po to transformuotos E. coli JM101 ląstelės buvo auginamos lxYT terpėje, kurioje buvo chomogeninės medžiagos, ir atranka buvo atliekama pagal bespalvių dėmių susidarymą, tai aprašyta aukščiau. DNR sekos, koduojančios kAH(F), įterpimas buvo patikrinamas sekančiai. Buvo atrenkamos bespalvės dėmės, o RF DNR iš MlSmpe/PGHgjj.j, išskirta pagal aprašytą aukščiau būdą, buvo skaldoma restriktazėmis EcoRI ir HindlII ir, analizuojant elektroforezės agarozėje pagalba, buvo gaunamas 590 bazių porų dydžio fragmentas, kuriame buvo įterpta kAH (F) DNR seka. Po to fagas M13mp8/PGH_ex_₁ buvo padauginamas naudojant E. coli JM101, o fago ssDNR buvo išskiriama pagal aprašytą aukščiau būdą.

DNR iš M13mp8/PGH_ex_₁ buvo naudojama matrica kryptingai mutagenezei, tai pavaizduota Fig. 8, mutagenezė buvo atliekama taip pat kaip ir konstruojant seką, koduojančią jAH(A, L), panaudojant specialų pradmenį (žiūr. Lentelę 1, kuri pateikiama žemiau). Alanino kodono, šiuo atveju GCC, prijungimo prie DNR sekos, koduojančios kAH(A), tikimybė yra apie 12%. Gauta seka, koduojanti kAH(A), buvo analizuojama sekvenuoj ant.

Pavyzdys 3

Šis pavyzdys tai ekspresijos vektorių, kurių pagalba pasiekiama tiesioginė heterologinių polipeptidų, kurių N gale yra alaninas, produkcija bakterijose, konstravimo ir ekspresijos iliustracija. Gaunami trys polipeptidai, somatotropinų formos jAH(A, L), jAH(A, V) ir kAH (A) . Šis pavyzdys yra jAH(V) konstravimo ir ekspresijos ir jAH(L) konstravimo ir ekspresijos iliustracija. Gaunami polipeptidai, atitinkamai, yra MetjAH (V) ir Met-jAH(L).

LENTELĖ 1

Sekų, koduojančių somatotropinus, kurių N gale yra alaninas, konstravimas

Baltymas	Pradmens seka1	Matrica	2 Plazmidė
Met-jAH(V)	5'-GGT GCC ATC TTC CAC CTC CCG CAT CĄG	MnmpS/BGH^	pMON3214
jAH(A, L)	5'-CAC ATA GCT GGG AAG GCC ATA GAA TTC	MlSmpe/BGH^.!	pMON3209
jAH(A, V)	5'-GGT GCC ATC TTC CAC CTC CCG CAT CAG	MlSmpe/BGH^.i	pMON3215
kAH (A)	5'-CCA GTG AAT TCT ATG GCC TTC CCA GCT ATG	MlSmpe/PGH^.!	pMON3213

¹ Pabrauktos bazės pradmenų sekoje koduoja norimą prijungimą arba mutaciją.

Taip žymimos galutinės plazmidės, kurios buvo naudojamos polipeptidų, kurių N gale yra alaninas, gavimui kultivuojant E. coli.

A. jAH(A, L), jAH(A, V), jAH(L) ir jAH(V) ekspresija

DNR sekos, koduojančios jAH(A, L), jAH(A, V) ir jAH(V), kurios yra rekombinantiniuose vektoriuose Ml 3mp8/BGH_ex_₁ /Ala/, MlSmpS/BGH^.! /Ala, Vai/ ir M13mp8/BGH_ex_₁ /Vai/, atitinkamai, buvo panaudotos pakeičiant DNR seką, koduojančią jAH(L), kuri yra ekspresijos plazmidėje pBGHg*.! (žiūr. Fig. 5 ir 6) . Tai buvo atliekama skeliant RF DNR iš M13 restriktaze Xbal. Ekspresijos plazmidė pBGH_ex_₁ taip pat buvo skeliama restriktaze Xbal, po to paveikiama šarmine fosfataze iš jaučio žarnyno, norint išvengti pakartotinio ligavimosi. Kiekviena perskelta RF DNR atskirai buvo sumaišoma su perskelta plazmides pBGHe^! DNR ir buvo atliekamas ligavimas pagal aukščiau aprašytą metodiką, per naktį 14°C temperatūroje. Gautuose rekombinantiniuose ekspresijos vektoriuose, žymimuose pMON3209, pMON3215 ir pMON3214, yra DNR sekos, koduojančios jAH(A, L), jAH(A, V) ir jAH(V), atitinkamai. Po to buvo transformuojamos E. coli W3110 ląstelės ligavimo mišiniu, kuriame buvo arba pMON3209, arba pMON3215, arba pMON3214, arba pBGH_ex_₁, po transformacijos bakterijos buvo auginamos Lauria buljone (LB), kuriame buvo 1% (m/t) triptono, 0.5% (m/t) mielių ekstrakto ir 0.5% (m/t) NaCl ir 12.5 ųg/ml tetraciklino ir 200 pg/ml ampicilino. E. coli W3110 kamieno, kuriame yra pMON3209, deponavimo kodas yra ATTC 53024, E. coli W3110 kamieno, kuriame yra pMON3215, deponavimo kodas yra ATTC 53022. Ląstelių transformacija trumpai gali būti aprašoma sekančiai: E. coli W3110 kultūra buvo auginama apie 50 ml LB terpės iki OD_60Ū=0.60. Po to ląstelės surenkamos ir suspenduojamos 10 ml buferinio tirpalo A:25 mM TRIS, pH 7.6 ir 10 mM NaCl. Suspensija centrifūguojama, ląstelės vėl suspenduojamos 1 ml buferinio tirpalo A į kurį buvo pridedama 14 ml buferinio tirpalo B:25 mM TRIS, pH 7.6, 10 mM NaCl, 50 mM CaCl₂ ir ląstelių suspensija buvo išlaikoma lede 30 minučių.

Po to ląstelės buvo nucentrifūguojamos ir suspenduoLT 3916 B jamos 3 ml buferinio tirpalo B. 0.2 ml ląstelių suspensijos buvo sumaišoma su 0.1 ml buferinio tirpalo B ir su 0.1-0.5 ųg tikslinio ekspresijos vektoriumi (pMON3209, pMON3215, pMON3214 arba su pBGH_ex_₁) ir išlaikomos lede 60 minučių. Mišinys per 1 minutę buvo pašildomas iki 37°C temperatūros ir pridedama 3 ml LB terpės; gautas mišinys buvo inkubuojamas 60 minučių 37°C temperatūroje. Po inkubacijos ląstelės buvo nucentrifūguojamos ir vėl suspenduojamos 300 ml LB terpės ir auginamos lėkštelėse su LB, pridėjus antibiotikus, kaip aprašyta aukščiau. Buvo atrenkamos atsparios antibiotikams bakterijų kolonijos ir iš ekspresijos vektorių pMON3209, pMON3215, ρΒΰΗθχ.! ir pMON3214 buvo išskiriama DNR pagal metodą, aprašytą knygoje Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas, Maniatis, Fritsch, Sambrook (red.), (1982). DNR iš pMON3209, pMON3215, pMON3214 ir pBGH^^ buvo patikrinama ar yra 590 bazių porų Xbal fragmentas ir 200 bazių porų HindlI/SmaI fragmentas, jei šie fragmentai yra, tai DNR seka, koduojanti jAH (A, L), jAH(V) ir jAH (A, V), yra teisingai orientuota. Plazmidės pMON3209 ir pMON3215 buvo analizuojamos, skaldant restriktaze HaelII, norint Įsitikinti, kad yra nauja HaelII skėlimo sritis, kuri susidaro prijungus kodoną GCC (alanino). Pagaliau, buvo dalinai analizuojama, pagal pateiktą aukščiau aprašymą, Xbal fragmento, kurio ilgis 590 bazių porų, iš vektorių pMON3209, pMON3214 ir pMON3215, seka tam, kad patvirtinti, kad yra ekspresijos vektoriuose DNR sekos, koduojančios jAH (A, L), jAH (V) ir jAH (A, V).

Kiekviena E. coli W3110 kolonija, kuriose buvo vektoriai pMON3209, pMON3214, ρΒΘΗθχ^ ir pMON3215, buvo persėjamos atskirai į 5 ml LB, kurioje buvo 12.5 pg/ml tetraciklino, ir buvo auginamos aeruojant per naktį

37°C temperatūroje. Po išauginimo kiekvienos kultūros

0.5 ml buvo persėjami atskirai į 250 ml mikrobangines kolbas po 25 ml M9 terpės, jos sudėtis: (litrui terpės)

100 ml 10x druskų mišinio tirpalas [ 70 g Na₂HPO₄, 30 g KH₂PO₄, 5 g NaCI, 10 g NH₄C1 iki bendro 100 ml tūrio] , 1.2 ml 1M MgSCų tirpalo, 0.25 ml 0.1% vitamino B_lz 12.5 ml 20% (m/t) gliukozės tirpalo, 0.025 ml 1M CaCl₂ tirpalo, ši terpė buvo papildoma 0.5% (m/t) casamino rūgštimis ir 6.25 ųg/ml tetraciklinu. Kiekviena kultūra buvo auginama aeruojant 37°C temperatūroje tol, kol OD₆₀₀ (optinis tankis 600 nm ilgio bangoje) pasiekdavo 1.0. Iš kiekvienos kolbos buvo paimama 0.2 ml kultūrinio skysčio ir ląstelės lizuojamos buferiniame tirpale su natrio dodecilsulfatu (SDS) ir lizatas buvo analizuojamas SDS PAGE (elektroforezė denatūruojančiomis sąlygomis) pagal metodiką, aprašytą Lemli, Nature (1970), t. 227, p. 680-685. Elektroforegramoj e visų E. coli W3110 ląstelių lizatuose buvo matomi dominuojantys baltymai, kurių molekulinė masė 22 000 D. Šie dominuojantys 22 000 D baltymai rišosi su antikūnais F 11-A1-86 (žiūr. Krivy ir Royold, Hibridoma, (1984), t. 3, p. 252-262), kurie yra prieš jaučio hipofizio somatotropiną, analizuojant Western Blot (žiūr. Krivy ir Royold, Hibridoma, (1984), t. 3, p. 252-262), tai patvirtina, kad gauti polipeptidai yra tokie pat, kaip ir hipofizinis somatotropinas. Kontrolinės E. coli W3110 kultūros ląstelės, kuriose yra tik tėvinė plazmidė pBR322, neprodukavo 22 000 D baltymų, kurie susirištų su antikūnais prieš somatotropiną.

Bakterijos, kuriose buvo ekspresijos plazmidės pMON3209, pMON3214, pBGH^-! ir pMON3215, buvo saugomos sekančiai. Kiekviena E. coli W3110 kultūros kolonija, transformuota viena plazmidė arba pMON3209, arba pMON3215, arba pMON3214, arba pBGH_ex_₁ buvo auginamos aeruojant per naktį 37°C temperatūroje 5 ml LB, pridėjus 12.5 ųg/ml tetraciklino. Kiekvienos išaugintos kultūros 1 ml buvo įpilamas į atskiras kolbas, kuriose buvo 25 ml LB ir 12.5 ųg/ml tetraciklino, ląstelės buvo auginamos kol OD₆₀₀ pasiekdavo 1.0. Ląstelės buvo surenkamos 5 miLT 3916 B nutes centrifūguojant 6 000 xg, esant 4°C temperatūrai. Ląstelės buvo atskirai suspenduojamos 12 ml LB, pridėjus 7.5% (m/t) DMSO ir greitai užšaldomos sausame lede porcijomis po 1 ml. Ląstelės buvo saugomos skystame azote. Be to apie 10 mikrogramų išgrynintos plazmidės DNR buvo saugoma minus 80°C temperatūroje.

E. coli W3110 kultūra, kurioje yra pMON3?13, buvo deponuota Amerikos mikroorganizmų muziejuje (ATCC), jos kodas - ATCC 53023. Sekos, koduojančios kAH(L), pakeitimas seka, koduojančia kAH(A), ekspresijos vektoriuje pBGH_ex__x* buvo patvirtintas išskiriant DNR pMON3213 ir skaldant šį ekspresijos vektorių fermentais EcoRI ir HindlII, norint patikrinti, ar susidaro 590 bazių porų fragmentas, o skeliant restriktaze HaelII, turi būti gaunamas papildomas fragmentas, kuris susidaro DNR sekoje, koduojančioje kAH(A), papildomai įvedus alanino kodoną. Galutinis įrodymas, kad tikrai ekspresijos vektoriuje pMON3213 yra DNR seka, koduojanti kAH(A), buvo gaunamas dalinai nustatant 590 bazių porų EcoRI/HindlII fragmento nukleotidų seką, naudojant būdą, aprašytą aukščiau.

DNR sekos, koduojančios kAH(A), ekspresija ir kAH(A) produkcija E. coli W3110 kultūroje buvo atliekama taip pat kaip jAH (A, L) ir jAH (A, V) atveju, kuris yra aprašytas aukščiau. Taip pat buvo stebima dominuojančio 22000 D baltymo produkcija, analizuojant SDS PAGE, šis analizės metodas buvo aprašytas aukščiau.

E. coli W3110 ląstelės, transformuotos ekspresijos vektoriumi pMON3212, buvo saugomos taip pat, kaip buvo aprašyta aukščiau, jos buvo naudojamos gaunant didelius kAH(A) kiekius (fermentacijos buvo vykdomos nuo 10 iki 100 1) auginimas buvo atliekamas taip pat, kaip buvo aprašyta aukščiau. kAH(A) išeiga auginant 100 1 fermentatoriuje apytikriai buvo 1 g tikslinio baltymo 1 litre kultūrinio skysčio; tai buvo nustatyta, analizuojant radioimuninės analizės pagalba (Rozner ir kt., J. Immunol. Methods, (1982), t. 52, p. 175-181.

Pavyzdys 4

Šis pavyzdys buvo atliktas, norint nustatyti heterologinių baltymų jAH(A, L), jAH(A, V), Met-jAH(V), MetjAH(L) ir kAH(A), produkuotų bakterijose, būdu, aprašytu šio išradimo realizavimo pavyzdžiuose, kuris yra šio išradimo objektas, N baltymų galų aminorugščių liekanų sekas.

Somatotropiniai polipeptidai, produkuojami E. coli ląstelėse, buvo gryninami iš ištirpintų intarpinių kūnelių, kuriuose buvo vienas iš baltymų arba jAH(A, L), arba jAH(A, V), arba Met-jAH(V), arba Met-jAH(L), arba kAH(A), panaudojant imunoafininę chromatografiją, šis gryninimo metodas aprašytas Krivy ir Rouid, Hibridoma, (1984), t. 3, p. 151-161. Visi trijų formų somatotropinai buvo išgryninami imunoafininės chromatografijos pagalba iki 95%; tai buvo nustatoma SDS PAGE, naudojant gradientinį poliakrilamido gelį nuo 7.5 iki 15%, užnešant 1 ųg išgryninto baltymo, tai buvo atliekama pagal Lemli, Nature (1970), t. 227, p. 680-685. Išgrynintų jAH formų baltymų koncentracija buvo nustatoma, naudojant aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją. Baltymai, prieš nustatant aminorugščių liekanų sekas N gale, išgryninti imunoafininės chromatografijos pagalba, buvo dializuojami prieš vandenį ir po to buvo liofilizuoti. Prieš analizuojant N galų sekas, išgryninti baltymai buvo ištirpinami 50 mM amonio bikarbonato buferiniame tirpale su 0.1% (m/t) SDS (natrio dodecilsulfato) ir dializuojami šiame buferiniame tirpale tam, kad pašalinti TRIS (tris-oksimetilaminometaną) ir gliciną. Po to N galo sekos buvo nustatomos, panaudojant Baltymų aminorugščių liekanų sekų Analizatorių, modelis 470A, firma Applied Biosystems (firma Applied Biosystems, Ine., Foster Sity, Kalifornija), pągal metodiką, aprašytą Chankapiller ir kt., (1983), Methods in Enzymology, t. 91, p. 399-413 ir Chankapiller ir kt., (1983), Methods in Enzymology, t. 91, p. 486-493.

Lentelėje 2 pateikiami jAH(A, L), jAH(A, V), Met-jAH(V), Met-jAH(L) ir kAH (A) kelių preparatų sekų analizės duomenys. Baltymo, kurio N gale yra metioninas, kiekis lentelėje 2 pateikiamas procentais nuo bendro somatotropino kiekio bandinyje. Metionino nustatymui buvo naudojami du metodai. Naudojant netiesioginį metodą, NH₂-Met-Ala-Phe-... kiekis dominuojančioje populiacijoje NH₂-Ala-Phe-... buvo skaičiuojamas pagal lag-signalų skirtumą. Kadangi ši procedūra priklauso nuo normalios sekos lag įvertinimo, kuris kinta ciklas nuo ciklo, tai šis metodas tinka tik grubiam NH₂-Ala-Phe-... sekos įvertinimui. Tiesioginis metodas, kurio metu baltymas skaldomas Edmano reakcijos pagalba, paremtas PTHMet signalų dydžių sulyginimu su PTH-Ala, atskyrus PTHMet signalą nuo triukšmų, naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (HPLC). PTH - pažymėta feniltiochidantoinas. Konkrečiai, Edmano degradacijos principas yra reaktyvo, kuris nuskelia N gale esančią aminorūgšties liekaną, sąveika su šia aminorūgšties liekana, susidarant laisvam PTH ir aminorūgšties liekanos junginiui. Šio metodo pagalba galima gana tiksliai nustatyti seką Met-Ala-Phe-. . . tuo atveju, kai yra nežymus užterštumas laisva aminorūgštimi.

Iš duomenų, pateiktų lentelėje 2, kuri yra pateikiama žemiau, matome, kad metioninas nėra nuskeliamas, jei po jo seka fenilalaninas. Bet, virš 80% molekulių, kurios produkuojamos, naudojant genetines konstrukcijas MBS (A, L) ir MBS(A, V), N gale yra alaninas. Metionino, esančio baltymo gale, nuskėlimo laipsnis kinta įvairiose fermentacijose, bet visada yra didesnis, nei 80% nuo visų somatotropino molekulių. Somatotropinų, produkuojamų transformuotuose mikroorganizmuose, ekspresijos lygis buvo pasiektas 10-15% nuo bendro bakterijų baltymo kiekio .

Lentelė 2

Met-jAH(L), jAH(A, L), jAH(A, V) ir kAH (A) baltymų N galo aminorūgščių liekanų analizė

Metioninas N gale, %¹

Baltymas	Netiesioginis	Tiesioginis
Met-jAH(L)	92.0	100.0
jAH(A, L)	20.32	18.42
	10.8	6.0
jAH(A, V)	7.52	3. O2
	16.7	9.0
kAH (A)	16.7	17.0
Met-jAH(V)	neanalizuota	100.0

¹ Baltymo, kurio N gale yra metioninas, kiekis procentais, nuo bendro somatotropino kiekio mėginyje.

² Duomenys gauti analizuojant baltymus iš skirtingų fermentacijų .

Claims (4)

1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

   1. Kiaulės augimo hormono gavimo būdas, apimantis kDNR, koduojančios kiaulės augimo hormoną, gavimą, kDNR įterpimą į bakterinę plazmidę, Escherichia coli kamienų transformaciją gauta rekombinantine plazmidę, klonų, kuriuose yra rekombinantinės plazmidės, atranką ir kDNR iš šių plazmidžių įterpimą į ekspresijos vektorių, po to sekančą Escherichia coli kamienų transformaciją gauta rekombinantine plazmidę, transformuotų kamienų atranką, kultivuojant terpėje, galutinio produkto išskyrimą ir gryninimą, besiskiriantis tuo, kad siekiant gauti kiaulės augimo hormoną, kurio N-gale yra alaninas, į kDNR fragmentą, išskirtą iš rekombinantinės plazmidės pPGH_ex_x, vietoje DNR sekos, koduojančios kAH(F), įterpia alanino kodoną prie pat vieno arba kelių, esančių greta, ATG kodonų.
2. 2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad kiaulės augimo hormonas yra kAH(A).
3. 3. Heterologinio polipeptido, kurio N gale yra alaninas, gavimo bakterijose būdas, besiskiriantis tuo, kad vykdo genominės DNR ekspresiją pasirinktose bakterijose, paminėtoje DNR aukščiau minėto polipeptido kodonai yra iškart po vieno - trijų, greta esančių, metionino kodonų, ir išskiria sintetinamą minėtų bakterijų viduje polipeptidą, kurio N gale yra alaninas.
4. 4. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad ne mažiau 80 % (pagal svorį) susintetinto aukščiau minėtoje bakterijoje po aukščiau minėtos DNR ekspresijos polipeptido sudaro polipeptidas, kurio N gale yra alaninas.

   48 5. Būdas pagal 3 punktą, besisk i r i a n t i s tuo, kad naudoj a E. coli bakterijas. 6. Būdas pagal 3 punktą, besisk i r i a n t i s tuo,kad aukščiau minėto, gauto polipeptido amino rūgš-