JPH02312597A - 魚類の成長ホルモンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、魚類の成長ホルモンボリペフ、°チドをコー
ドする遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組換え体ＤＮＡ、
該組換え体ＤＮＡを含む組換え体酵母、該酵母による魚
類の成長ホルモンポリペプチドによる広範囲の魚類の成
育促進方法に関するものである。

〔従来の技術〕

魚類の成長ホルモンは脳下垂体において生合成され、こ
れまでにティラピア［Ｓ、Ｎ、Ｆａｒｍｅｒ等、Ｇｅｎ
、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄｃｒｒｎ、　、　３０．９１　（１
９７６）　］他、種々の魚類より成長ホルモンが単離さ
れ、その性質が明らかにされている。さらに、マグロ（
特開平１０４１．８０号）、シロザケ（特開昭−６１−
１５６９９号、特願昭５９−２１３３６１号、同６０−
５００９６号）より成長ホルモンポリペプチドをコード
する遺伝子が単離され、これら遺伝子を組み込んだ組換
え体ＤＮＡを含む大腸菌を培養することにより、成長ホ
ルモンポリペプチドを得る方法が報告されている。

しかし、組換え体ＤＮＡを含む酵母を培養することによ
り、成長ホルモンポリペプチドを得ることは、僅かにシ
ロザケの成長ホルモンに関する場合のみが特開昭６２−
２２４２９７号に報告されているだけである。

〔発明が解決しようとする課題〕

魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有し栽培漁
業において極めて有用な将来的飼料である。しかし現在
該ホルモンを安価に且つ大量に供給することは魚類の脳
下垂体を大量に必要とし、不可能である。

本発明者等は先に、マグロ成長ホルモンポリペプチドが
マグロ成長ホルモン遺伝子を組み込んだ紐換え体ＤＮＡ
を含む大腸菌を培養する二きによって、該培養物中にマ
グロ成長ホルモンポリペプチドが著量生産されることを
見出した。しかし、大腸菌からの蛋白質標品中には内性
毒素がしばしば混在しており、これを除去するための精
製段階は極めて経済的ではない。また大腸菌で大量に生
産された高等生物由来の蛋白質のおおくは、大腸菌内の
生化学的環境が高等生物のそれとかけはなれているため
、不活性な蛋白質として蓄積するなど多くの問題点が残
されている。本発明者等は更に研究を進め、内性毒素を
含まず且つ活性を有する魚類の成長ホルモンを安価に大
量に供給する方法を開発すべく鋭意研究を行い本発明を
完成するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、第１図で示されるアミノ酸配列を含むマグロ
成長ホルモンをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体
ＤＮＡを含む酵母を培養することによって、培養物中に
マグロ成長ホルモンを大量に生産せしめ、これを培地か
ら採取することにより、魚類の成長ホルモンを製造する
方法及びこれを含む魚介用飼料に関する。本発明によれ
ば、内性毒素を含まず且つ活性を有する魚類の成長ホル
モンが製造できる。

以下本発明の詳細な説明する。

マグロの新鮮な脳下垂体より全ＲＮＡを抽出し、これを
オリゴｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕ
ｌｏｓｅ）カラムに通してポリアデニル酸（ポリＡ）を
有するＲＮＡ　（ポリＡ−ＲＮＡ）を調製する。次にこ
の全ポリＡ　−ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素によって
二重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体ＤＮＡは組換えＤＮ
Ａ技法により調製される。

ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡのベクターへの組み込みは
例えばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法［Ｏｋａｙａｍ
ａ　＆ＢｅｒｇＨＭｏ１．Ｃｅｌ　Ｉ　、　Ｂｉｏｌ、
２．１６Ｌ　（１９８２）コに従って行う。

以下、本発明のＤＮＡ及び組換え体ＤＮＡの製法につい
て具体的に説明する。

まずｍＲＮＡとオリゴｄＴ付へククーブライマ−ｐｓＶ
７１８６（ファルマシア社製）を適当な溶液、例えば５
０ｍＭ　）リスー〇ＣＩ緩衝液（ｐ　Ｈ８，３）　、　
ＭｇＣＩｚ　（例えば８ｍＭ）、　ＫＣＩ　（例えば、
３０ｍＭ）、　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ。

ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ　　例えば、各２　ｍＭ）　、　
　ジチオスレイトール（例えば１　ｍＭ）に溶解する。

これに逆転写酵素（例えば１０００υ／瀬）〔宝酒造社
製〕を加え、一定温度（例えば、３７’Ｃ）、　　一定
時間（例えば、６０分間）反応させる。こうして得たＲ
ＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３゛末端にオリゴｄＣ鎖を付加す
る。

まずＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を含む溶液をフェノール／ク
ロロホルム処理を行い、例えば４ＭＣ８３ＣＯＯＮａを
等量加え、２倍量のエタノールによりエタノール沈澱を
行う。

得られたベレットを適当な溶液、例えば３０＋ｎＭ　ト
リス−１１ｃＩ緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）　、　ＣｏＣｌ
　（例えば、１　ｍＭ）　。

ｄＣＴＰ　（例えば、７０μ旧、カコジル酸（ｐ１４６
．８）　（例えば、１４０ｍＭ）　、ジチオスレイトー
ル（例えば、０．１ｍＭ）に溶解する。

この溶液に例えば、１５００１／ｍｕになるようにター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを加
え、一定温度（例えば、３７°Ｃ）でオリゴｄＣ鎖が８
−１２個付加するのに要する時間（例えば、５−１０分
間）反応させる。次にオリゴｄＣ鎖の付加したＲＮＡ−
ＤＮＡ二重鎮ベクターブライマーをトリス−１１ｃＩ緩
衝液（ｐＨ７，５）（例えば、１０ｍＭ）　、　ＭｇＣ
ｌ　２（例えば、６　ｍＭ）　、　　ＮａＣ］　（例え
ば、６０ｍＭ）から成る溶液に溶解し、これを旧ｎｄＴ
ＴＩ（例えば、２０Ｕ）を加え、一定温度（例えば、３
７“Ｃ）一定時間（例えば、１２０分間）反応させる。

ｈ　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡベクターフライマーニリンカーＤ　
Ｎ　Ａ　（ｐｓＶ１９３２）　（７ｙシフ２フ社製）を
混合し、トリス−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）（例え
ば、２０ｍＭ）、　ＭｇＣ１ｚ　（例えば、４　ｍＭ）
　、（ＮＨ４）　２Ｓ０４（例えば、１０ｍＭ）、　　
ＭＣＩ（例えば、０．１ｍＭ）、　　β−ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）　（例えば、
０．１ｍＭ）を含む溶液中で、大腸菌ＤＮＡリガーゼ（
例えば、６．７０／ｍＲ）　とともに一定時間（例えば
、１５時間）、一定時間（例えば、１２“Ｃ）で反応さ
せる。

この反応によりｃ　ＤＮＡとリンカ−ＤＮＡとの環状化
が行われる。この反応液に、各々終濃度４０ｍＭとなる
ように、ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴ
Ｐを力■え、β−ＮＡＤ　（例えば、終濃度０．１５ｍ
Ｍ）大腸菌リボヌクレアーゼＨ（例えば、１７．７０＃
＋ρ）を添加し、ＲＮＡ部分をＤＮＡに置換することに
より、完全な二重鎖ｃＤＮＡを含む組換え体プラスミド
をえる。

こうして得た組換え体プラスミドを、大腸菌、例えば大
腸菌Ｄ１１１株を、例えば、Ｈａｎａｈａｎ等の方法（
Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ等、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１
６６．５５７．（１９８３）］により形質転換する。形
質転換株の選択にはマーカーであるアンピシリン耐性に
より選択することができる。

上記、形質転換大腸菌を、ナイロンメンプランに固定し
、既知のクロマグロ成長ホルモンのアミノ酸配列より予
想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡプローブと会合
させ、強く会合するものを選択する。（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ　、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　７２．３９６１
（１９７５）Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−１１ｏｇｒｅｓｓの
方法〕。プローブＤＮＡはトリエステル法（Ｊ、Ａｍ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　、　９７．７３２７（１９７５）
　）で合成される。合成りＮＡプローブによる選択は、
ドットブロッテング、５ｏｕｔｈｅｒｎ等の方法（Ｊ、
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、９８，５０３（１９７５）　）に
よって、更に確実にでき、この方法でクロマグロ成長ホ
ルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有する組換え体
プラスミドＤＮＡを同定できる。

このようにして得られる組換え体プラスミドの一例がｐ
ＴＴＳ３３９　（特開平１−１０４１８０号）である。

ｐＴＴＳ３３９のＤＮＡ配列を第１図に示す。このプラ
スミドをマグロ成長ホルモンをコードする遺伝子の供給
源として利用することができる。

酵母中でのマグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発
現によるマグロ成長ホルモンポリペプチドの生産： マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを組み込んだプ
ラスミドより該ＤＮＡを切り出し、これをヘクターＤＮ
Ａに接続し、得られる組換え体ＤＮ、Ａを酵母に形質転
換し、得られる形質転換酵母を培養することによってマ
グロ成長ホルモンポリペプチドを培地中に生成蓄積させ
、これを採取することにより、マグロ成長ホルモンポリ
ペプチドを製造することができる。マグロ成長ホルモン
をコードするＤＮＡを含むプラスミドとして上記ｐＴＴ
Ｓ３３９の他、ｐＵｌｌ；５１３、ｐＵＥｓ１３ｓ−２
（いずれも特開平１−１０４１８０号公報に記載してい
る）が好適な例として挙げられる。

実施例で用いたｐｓｌＩ３３９及びｐＴＴＳ３３９のう
ち、ｐｓＨ３３９はｐＴＴＳ３３９のマグロ成長ホルモ
ンＮ末端領域をコードするＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａｌ断片を
ｐＵＥｓ１３ｓのそれと置換することにより得ることが
できる。

ヘクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを酵母で発現
させることができるものなら、いかなるものでも用いる
ことができる。酵母内でプラスミドを維持し、且つ酵母
及び大腸菌で形質転換体を選択できるように、酵母複製
オリジン２μ台配列及び、Ｉｅｎ２　（ロイシン非要求
性）　、Ａｐ　（アンピシリン耐性）のマーカーを有す
るヘクターを用いる。

好ましくは、酵母の抑制型酸性ホスファターゼ遺伝子の
プロモーター（ｐＰＨＯ５）　　［Ｒｉｃｈａｒｄ、＾
、Ｋｒａｍｅｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、８１，３６７、　（１９８４）　］ホス
ホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモーター（ｐＰＧ
Ｋ）　　［Ｍ、Ｊ、Ｄｏｂｓｏｎ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、＋ＩＯ＋２６２５、　（１
９８２）　］　、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモ
ーター（ｐＡＤＨｌ）　　［Ｇｒａｎｔ　Ａ、Ｂｉｔｔ
ｅｒ等、Ｇｅｎｅ。

３２．２６３．　（１９８４）　］　、］グリセルアル
デヒドー３−リン酸脱水素酵素遺伝のプロモーター（ｐ
Ｇ３ＰＤＩ＋）［１１ｏ１１ａｎｄ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、　、　２５５．２５９６．　（１９８０）　
］　。

ガラクトキナーゼ遺伝子のプロモーター（ｐＧＡＬｌ）
［Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、
、４，１４４０．　（１９８４）　１などをもち、その
下流にＤＮＡを挿入できるベクターＤＮＡが用いられる
。

具体的に好適なベクターＤＮＡとしてｐＡＭ８２を挙げ
ることができる。ｐＡＭ８２は第２図と３図に示すプラ
スミドで、その構造及び製造法は、果汁等の方法［Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．　
Ｌ　（１９８３）　］に示されている。

マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡとベクターＤＮ
Ａとの組換えは、一般的組換えＤＮＡ技法に使用する制
限酵素及びその関連酵素を用いることにより行うことが
できる。

具体例として、ｐＳＬ３３９の場合、第２図に示したご
とく、まずｐＳＬ３３９からマグロ成長ホルモンをコー
ドするＸｈｏ　ｌ　−Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ消化断片を得、ｐ
ＡＭ８２から酵母の抑制型酸性ホスファターゼのプロモ
ーターを含むＸｈｏｌ−ＰｖｕＩＩ断片を得る。

上記ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、第２図
に示した組換えプラスミドｐＴＧＩ＋８２を得る。

本プラスミドは、成熟マグロ成長ホルモンをコードする
ＤＮＡを有している。

同様の処理を行って、マグロ成長ホルモンの分泌シグナ
ルを持つプラスミドの作成が可能になる。

例えば、ｐＳＬ３３９ｓｐからマグロ成長ホルモンをコ
ードするＸｈｏｌ−ＰｖｕｒＩ消化断片を得、ｐＡＭ８
２から（１）Ｐｌ＋０５）を含むＸｈｏｌ−Ｐｖｕｌｌ
消化断片を得る。上記ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で結合することにより、マグロ成長ホルモンの分泌シグ
ナルを持つｐＴＧｌ１８２ｓＩ）が作成できる（第３図
参照）。

上記組換え技法における反応の条件は一般的に下記の通
りである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１−５０
μｇのＤＮＡを１　１５０ｍＭ（好適には１０　５０ｍ
Ｍ）のトリス−１１ｃＩ緩衝液（ｐＨ６，０−９，０、
好適には（ｐＨ７，０−８，５）、０−２００ｍＭのＮ
ａＣ１あるいはＫＣＩ、０−５０ｍＭ　（好適には５　
２０ｍＭ）のｌ’１ｇｃＩ２を含む反応液中で制限酵素
０．１−５００単位（好適には１１１ｇに対し１−５単
位）を用い、１０°Ｃ−７０°Ｃにおいて１０分間−２
０時間行う。反応の停止は、通常水飽和フェノールを等
量刑えたり、６０°Ｃ−７５”Ｃ，１０−３０分間の加
熱処理で制限酵素を失活させることができる。

ＤＮＡの結合反応は、１−１００＋＋＋Ｍ（好適には１
０−１０−５Ｏのトリス−１１Ｃ１緩衝液（ｐ　Ｈ６，
０−９，０、好適にはｐＨ７，０−８，０）、　　１−
５１−５Ｏ好適には５−２５−２ＯのＭｇＣｈ　、０．
１−１０ｍＭ　（好適には０．５−３ｍＭ）、　　１　
３０ｍＭ　（好適には５−１０ｍＭ）　ＤＴＴを含む反
応液中で７４ＤＮＡリガーゼ０．１−１０００単位を用
い１−３０°Ｃ（好適には４−１６°Ｃ）、２０分間−
４８時間（好適には４−２４時間）行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要に従い例えば１ｌａｎａｈａｎ等の形質転換法［ｔ
ｌａｎａｈａｎ　：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、　１６
６、５５７．　（１９８３）　）により、大腸菌に導入
する。

組換え体プラスミドＤＮＡを含む大腸菌から該ＤＮＡを
単離するには、例えばノ＼−ンボイム等の方法（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ
、、？＋１５１３゜（１９７９）　）あるいは、ホルメ
ス等の方法（ｌｌｏｌｍｅｓ等、＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ、１１４．（１９８３））
などを用いて行う。

プラスミドＤＮＡの制限酵素による切断部位の確認には
制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動やポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いて行う。さらにＤＮＡの
塩基配列の決定には、Ｍ１３ファージとグイデオキシヌ
クレオチドを用いたサンガー等の方法（Ｓａｎｇｅｒ等
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｃ１．ｓｃｉ。

ＵＳ八、７４，５４６３．　（１９７７）　）またはマ
キサム・ギルバード等の方法［Ｍａｘａｍ　Ｇ１１ｂｅ
ｒｄ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ。

［ＪＳＡ、７４．５６０（１９７７）　］で行う。

本発明のマグロ成長ホルモンポリペプチドは以下のよう
に製造できる。組換え体プラスミドＤＮＡ（例えばｐＴ
ＧＨ８２）を用いてＩｔｏ等の方法〔１ｔＯ等、Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５３，１６３．（１９８３）　
）により、酵母サツカロマイセス・セルビシエ５ＩＩＹ
２を形質転換させ、ロイシン非要求性のコロニーからｐ
ＴＧＩ＋８２を含む酵母を選択する。この形質転換酵母
ｐＴＧＩ＋８２７サツカロマイセス・セルビシエＳ　１
１　Ｙ　２は工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄
第２３８７号（ＰＥ１７Ｍ　Ｂ１’−２３８７）として
寄託されている。これを無機リン酸を含まない培地で、
培養することにより培養物中にマグロ成長ホルモンポリ
ペプチドを生成させることができる。

ここで用いる培地としては酵母の生育、及びマグロ成長
ホルモンポリペプチドの生産に好適なものならいかなる
培地でも使用できる。

炭素源としては、グルコース、グリセロール、マルトー
ス、フラクトース、シュークロース、ラクトース、マン
ニトール、ソルビト−ルなどが、窒素源としては、ＮＩ
ＩａＣＩ、（ＮＨ４）２ＳＯ４，酵母エキス、コーン・
ステイープ・リカー、ポリペプトン、肉エキス、カザミ
ノ酸、トリプトファンなどが、その他の栄養源としては
、ＫｚＨＰＯｎ、　ＫＨｚＰＯ４，ＮａＣ１゜ＫＣＩ、
　ＭｇＣｈ、　ＦｅＳＯ４，ビタミンＢなどが使用でき
る。

培養は、ｐＨ４，０−９，０、温度１５°Ｃ−３５°Ｃ
で、通気攪拌培養により行われる。

培養６−２４時間で培養菌体中にマグロ成長ホルモンポ
リペプチドが蓄積するので培養物より菌体を集菌し、菌
体より通常のポリペプチドの抽出法にしたがってポリペ
プチドを採取する。

菌体中のマグロ成長ホルモンポリペプチドの確認は、レ
ムリのサンプル緩衝液（Ｌａｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ。

２２７．６８０．　（１９７０）　）に直接菌体を混入
し、加熱溶解後、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
（Ｌａｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ、２２７，６８０．　（１９７０）　）を
用いて、クマシーブリリアントブルー染色によって行う
。

培養により得られたマグロ成長ホルモンを蓄積した形質
転換酵母菌体は該菌体をそのまま、又は該菌体を破砕し
て、魚介類飼料に添加して成長促進効果を有する魚介類
飼料が得られる。

また、上記酵母菌体またはその破砕物に代えてそれらか
ら抽出したマグロ成長ホルモンを魚介類飼料に添加して
もよい。これらの酵母菌体、その破砕物或いはマグロ成
長ホルモンの添加量は特に限定されるものでなく魚介類
の成長が促進される量であればいずれの量でもよい。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

実施例１ 成熟マグロ成長ホルモンをコードする組換え体プラスミ
ドｐＴＧｌ（８２の作成： マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＳＨ３３９，２０ｕ　ｇを１０ｍＭ　）リスー〇Ｃ
Ｉ緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）、　７　ｍＭ　ＭｇＣｈ、２
ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１を含む溶液（以下、Ｙ−１００緩衝液と呼ぶ。）５
０μｌに溶かし、制限酵素ＥｃｏＲＩ（全酒造■製）１
５単位加え、３７°Ｃ，２時間消化反応を行った。この
反応液を、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール
沈澱後、ＤＮＡ断片を３０ｔｔ１．の６７ｍＭリン酸カ
リウム（ｐＨ７゜４）、　６．７ｍＭＭｇＣ１２，１ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、３３μＭｄＮＴＰを含む
溶液（以下、クレノー緩衝液と呼ぶ、）に溶かし、５単
位のクレノー酵素（全酒造■製）を加え、３７°Ｃで３
０分間反応させ、このＤＮＡの末端を平滑化した。次に
、このＤＮＡ断片とリン酸化Ｘｈｏｌリンカ−（全酒造
■製）を、３０ｔｔ（！、の６６ｍＭトリス−１１ｃＩ
緩衝液（ｐＨ７，６）、　　６６ｍＭ　ＭｇＣｈ　１０
ｍＭＤＴＴ、　０．１ｍＭ　ＡＴＰを含む溶液（以下、
リガーゼ緩衝液と呼ぶ。）に溶解し、１００単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼ（全酒造■製）で１６°Ｃ，２時間反応
させた。

この反応液を用いて大腸菌ＩＩ　８１０１をＨａｎａｈ
ａｎ等の方法にしたがい形質転換し、アンピシリン耐性
株を得、バーンボイム等の方法によりプラスミド゛ＤＮ
Ａを単離し、第２図に示したｐＸＩ＋０３３９を得た。

ＥｃｏＲＩあるいはＸｈｏｌ制限酵素で切断してアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、ｐＸＨＯ３３９の構造を確認
した。

次に、このようにして作成したｐＸＨＯ３３９，］Ｏｕ
　ｇを５０μｆｆｉのｙ−ｉｏｏ緩衝液に溶かし、Ｘ１
ｌ（ｉｆ、及びＮｃｏｒ　（いずれも全酒造■製）各２
０単位加え、３７°Ｃ１４時間消化反応を行った。この
反応液から低融点アガロースゲル電気泳動法により、マ
グロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む大きいプラ
スミド断片を１μｇ得た。

一方、ベクターＤＮＡとマグロ成長ホルモンをコードす
るＤＮＡを接続するために下記のＤＮＡリンカ−を合成
した（全酒造■製）。

５’ＴＣＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡ
ＣＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＣ３’３’　　　　ＣＧＴＴＧ
ＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＡＧＣＴＣＴ
ＧＧＴＡＣ５’このリン酸化合成リンカ−と上記で得た
プラスミドｐＸＨＯ３３９，Ｘｈｏｌ−Ｎｃｏｌ断片を
リガーゼ緩衝液３０μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
１００単位を加え、１６°Ｃで１２時間反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌ＩＩ　Ｂ　１０１をＨａｎａｈ
ａｎ等の方法に従い形質転換し、アンピシリン耐性株を
得、バーンボイム等の方法によりプラスミドＤＮＡを単
離し、第２図に示したｐＳＬ３３９を得た。ＥｃｏＲＩ
。

Ｘｈｏｒ、　Ｎｃｏｌの３種の制限酵素で切断後、アガ
ロース電気泳動にかけ、ｐＳＬ３３９の構造を確認した
。

次に、このようにして作成したプラスミドｐＳＬ３３９
、１０ｕｇをＹ−１００緩衝液５０μｊ２に溶かし、Ｘ
ｈｏＩ及びＰｖｕｌｌ（いずれも宝酒造■製）各２０単
位を加え、３７°Ｃ，４時間消化反応を行った。この反
応液から低融点アガロースゲル電気泳動法により、マグ
ロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む断片（約０．
８Ｋｂ）ｌμｇを得た。

別ニｐ１１Ｍ８２．１０μｇをＹ−１００１衝液５０ｔ
ｌｌ：ニ溶かし、ＸｈｏＴとＰｖｕＴＩ各２０単位を加
え、３７°Ｃ，４時間消化反応を行った。この反応液か
ら、低融点アガロースゲル電気泳動法により、抑制型酸
性ホスファターゼのプロモーター（ｐＰＨＯ５）　とＩ
ｅｕ２のマーカー、２μ台のオリジン、　ａｒｓ遺伝子
を含む断片（約１０．６Ｋｂ）　　５μｇを得た。

上記で得たｐＳＬ３３９起源のＸｈｏＩ−Ｐｖｕ［Ｉ断
片（約０．８Ｋｂ）とｐＡＭ８２起源のＸｈｏＴ−Ｐｖ
ｕｒＩ断片（約１０．６Ｋｂ）をリガーゼ緩衝液３０μ
ρに溶解し、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、
１６°ｃ、１２時間反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、
アンピシリン耐性株を得、上記方法によりプラスミドＤ
ＮＡを単離し、第２図に示したｐＴＧＨ８２を得た。Ｎ
ｃｏｌ、　Ｘｈｏｌ、　ＥｃｏＲＩ、　Ｐｖｕｌｌで切
断後、アガロースゲル電気泳動にかけ、ｐＴＧｌ＋８２
の構造を確認した。

実施例２ 分泌シグナルを含むマグロ成長ホルモンをコードする紐
換え体プラスミド； ｐＴＴＳ３３９．１０μｇをＹ−１００緩衝液５０μ！
に？容かし、１０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７°Ｃ，
２時間消化反応を行った。この反応液をフェノール／ク
ロロホルム抽出、エタノール沈澱後、このＤＮＡの末端
を平滑化するため、３０μｌのクレノー緩衝液に溶かし
、５単位のクレノー酵素を加え、３７°Ｃ１３０分間反
応を行った。

この平滑化したＤＮＡ断片とリン酸化Ｘｈｏｌリンカ−
を３０μｌのリガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位の７
４ＤＮＡリガーゼを加え、１６°Ｃ１１２時間結合反応
を行った。

この反応液を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、ア
ンピシリン耐性株を得、プラスミドＤＮＡを単離し、目
的のプラスミドｐＸＨＯ３３９ｓｐを得た。

このｐＸｔ１０３３９ｓｐ、　ｉｏ　ＩＩ　ｇを５０μ
ｆのＹ４００緩衝液に溶かし、ＸｈｏＩとＮｃｏｌを各
々１０単位加え、３７°Ｃ１４時間消化反応を行った。

この反応液から低融点アガロースゲル電気泳動法により
、マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む大きい
プラスミド断片を１μｇ得た。

実施例１で述べたリン酸化した合成リンカ−と上記で得
たプラスミドｐＸＨＯ３３９ｓｐ、　Ｘｈｏｌ−Ｎｃｏ
Ｔ断片をリガーゼ緩衝液３０μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ１００単位を加え、１６°Ｃ９１２時間環状化
反応を行った。

この反応液を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、ア
ンピシリン耐性株を得、プラスミドＤＮＡを単離し、目
的のプラスミドｐｓＬ３３９ｓ１１を得た。

このｐｓＬ３３０ｓｐ、　１０　ｕ　ｇを５０１７の’
１−１００　Ｍ新液に熔かし、ＸｈｏＴとＰｖｕＴＩを
各々１０単位加え、３７°Ｃ３４時間消化反応を行った
。この反応液から低融点アガロースゲル電気泳動法によ
り、マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む断片
（約０．９Ｋｂ）１μｇを得た。

このｐＳＬ３３９ｓｐ起源のＸｈｏＴ−ＰｖｕＴＴ断片
と実施例１で述べた方法で得たｐＡＭ８２起源のＸｈｏ
Ｔ−Ｐｖｕ１１断片（約１０．６Ｋｂ）を３０μ！のり
ガーゼ緩衝液に溶解し、１００単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを加え、１６°Ｃ１１２時間環状化反応を行った。

この反応液を用いで、大腸菌）１８１０１株を形質転換
し、アンピシリン耐性株を得、プラスミドＤＮＡを単離
し、目的のプラスミドｐｒＧＩ−１８２ｓｐを得た。

ｐＴＧＩ＋８２ｓｐの構造は、Ｎｃｏｌ、　Ｘｈｏｌ、
　ＥｃｏＲｌ、　Ｐｖｕｌ＋で切断後、アガロースゲル
電気泳動にかけ、確認した（第３図参照）。

実施例３ ｐＴＧＨ８２を含む酵母によるマグロ成長ホルモンポリ
ペプチドの生産： 実施例１で得た組換え体プラスミＦ’ｐＴＧＨ８２を用
いＩｔｏ等の方法に従い、酵母サッカロマイセス・セレ
ビシエ５ｌｌＹ２株を形質転換した。得られたロイシン
非要求性形質転換株を、１００　ｍｌの無機リン酸を含
むＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（０，２％（ＮＨ，）
ＳＯ４，０，１５％Ｋ１１２ＰＯ４，０，０５％　門ｇ
ｓＯ４・７Ｈｚｏ、　０．０３３％　ＣａＣｌ２・２　
Ｈｚｏ、　０．０１ｐｐｍ　　ＫＩ、微量元素、ビタミ
ン類、０゜２％　アスパラギン、２％　グルコース、２
５μｇ／ｍｌｌ、ヒスチジン、２５μｇ／ｍｌ　　トリ
プトファン、２０Ｉｔｇ／ｍｌ　　ウラシル、　　ｐＨ
５，６）に接種し、３０°Ｃで、０、Ｄ、６１０＝　１
．　Ｏになるまで培養した。０．Ｄ、６１．０＝１．０
で、培養液を５．ＯＯＯｒｐｍ、　　５分間、無菌的に
遠心して集菌した。集めた菌体を無機リン酸を含まない
Ｂｕｒｋｈｏ１ｄｅｒ最小培地（０，１５％ＫＩＩ２Ｐ
Ｏ，を０．１５％ＭＣＩ　に変えた培地）’１００ｍＲ
に懸濁　し、３０°Ｃでさらに２４時間培養した。２４
時間後、　５．ＯＯＯｒｐｍ、５分間、遠心して集菌を
行った。集めた菌体を０．１ｍＭフェニルメタンスルホ
ニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む１００ｍＭ　　）リ
ス−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨ７，０）　　３　ｍｌに懸濁
し、約２０ｇのガラスピーズ（Ｂ、Ｂｒａｕｎ　Ｍｅｌ
ｓｕｎｇｅｎ　ＡＧ製）とともに、混合し、４°Ｃで５
分間、菌体を破砕し、その後、レムリのサンプル緩衝液
に懸濁、加熱処理後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリアントブル
ーで染色したところ、分子量２１．０００の部位にポリ
ペプチドバンドが見出された。この電気泳動したゲルを
、ウェスタン・プロッティング（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ等
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　２５７．１３１５０
．　（１９８２）　）に供したところ、抗マグロ成長ポ
ルモン抗体と結合した。この結果より、ｐＴＧＩ＋８２
を含むｐＴＧＨ８２／Ｓａ−ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
５ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　５Ｈｖ２はマグロ成長ホルモン
ポリペプチドを生産していることが判明したｑ実施例４ ＩＩＴＧ＋（８２ｓｐを含む酵母によるマグロ成長ホル
モンポリペプチドの生産： 実施例２で得た組換え体プラスミドｐＴＧｔ１８２ｓｐ
を用いＩｔｏ等の方法に従い、酵母５ＩＩＹ２株を形質
転換した。得られたロイシン非要求性形質転換体株を、
実施例３と同様の条件で培養した。培養後、遠心により
集菌を行い、実施例３と同様の条件で菌体を破砕した。

その後、レムリのサンプル緩衝液に懸濁、加熱処理後、
５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳
動後、クマシーブリリアントブルーにより染色したとこ
ろ、分子量２ＬＯＯＯの部位にポリペプチドバンドが見
出された。このゲルを、ウェスタン・プロッティングに
供したところ、抗マグロ成長ホルモン抗体と結合した。

この結果より、ｐＴＧＩＩ８２ｓｐを含む／　Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ　５ＩＩＹ
２　ｐＴＧｌ＋８２ｓｐはマグロ成長ホルモンポリペプ
チドを生産していることが判明した。ｐＴＧＨ８２ｓｐ
／５ＨＹ２株はｐＴＧｌ１８２ｓｐ／Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　５ｔ−ＩＹ２　（
微工研条寄第第２３８８号）（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３８
８）としては工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し
である。

実施例５ 酵母より生産されたマグロ成長ホルモンの生物活性の測
定： 実施例３と同様の操作で、培養したｐＴＧＨ８２／ザッ
カロマイセス・セレビシェ５ＨＹ２株１００　ｍｌの培
養液より菌体を集菌、ガラスピーズを用いて破砕して得
られた沈澱物を、８Ｍ尿素を含む５０１１１Ｍ　）リス
−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，０）で４°Ｃ１晩透析後、マグ
ロ成長ホルモンをリガンドとしたアフィニティカラｌ、
に３度供し、約１０ｍｇのマグロ成長ホルモンを得た。

この蛋白質は、ＳＯ３−ポリアクリファミドゲル電気泳
動により単一であることを確認した。このマグロ成長ホ
ルモン精製物を用いて、以下の検討を行った。

体長１５ｃｍ、体重１００ｇ前後のクロマグロ稚魚３０
尾を２群に分け、水温２５°Ｃの水槽２セツトに入れた
。

海水は、循環させフィルター濾過により水の汚れを除去
した。餌は１日２回、午前１０時と午後５時に、飽食す
るまで与えた。１セツトには５日おきに４回、上記で得
られたマグロ成長ホルモンを０．５μｇ、　１００μｌ
の生理食塩水に熔解しこれを腹腔内に注射した。残り１
セツトには、５日おきに４回１００μｌの生理食塩水を
腹腔内に注射し、コントロールとした。５日おきに、体
長と体重の増加を測定した。その結果を第４図に示す。

実施例６ マグロ成長ホルモンを菌体内に生産蓄積した酵母菌体の
魚介類用飼料としての有効性：実施例３と同様の操作で
、培養したｐＴＧＨ８２サッカロマイセス・セレビシエ
５ＨＹ２株２０Ｉ！、の培養液より菌体を集菌、ダイノ
シル（Ｗｉｌｌｙ八、Ｂ０社製）を用いて破砕後、凍結
乾燥し、マグロ成長ホルモンを生産蓄積した酵母乾燥菌
体を得た。この酵母乾燥菌体を用いて以下の検討を行っ
た。

体長７〜８ｃｍ、体重１０ｇ前後のニジマス稚魚２０尾
を２群に分け、水温２０°Ｃの水槽２セントに入れ、２
８日間飼育した。餌は１日２回、午前９時と午後４時に
、初期飼料Ｐ２　０．５＋　酵母乾燥菌体０．５　ｇ／
１尾を通常の餌の代わりに与えた。

残り１セツトは通常の餌で飼育しコントロールとした。

７日おきに体長と体重の増加を測定した。

その結果を第５図に示す。

マグロ成長ホルモンを菌体内に生産蓄積した酵母乾燥菌
体を与えたセットの方が、コントロールのセットよりも
体長、体重ともに顕著に増加していることより、該酵母
乾燥菌体の魚介類用飼料としての有効性が確かめられた
。

以上の結果より、酵母で生産されたマグロ成長ホルモン
ポリペプチドに成長促進効果があることを確認した。

参考例１ 熟成マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む組換
え体プラスミドｐｓＩ＋３３９の作成：マグロ成長ホル
モンをコードするｐＴＴＳ３３９．１０μｇを、１００
ｍＭＩ・リス−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）、７ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ　、５０ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ２−メルカ
プトエタノールを含む溶液（以下、Ｙ−１００緩衝液と
呼ぶ）に溶かし、ＥｃｏＲＩとＣ１ａＩ各々１０単位を
加え、３７°Ｃ，４時間消化反応を行った。この反応液
から、低融点アガロースゲル電気泳動法により、マグロ
成長ホルモンＣ末端側をコードするＤＮＡを含む断片（
約３．３Ｋｂ）１μｇを得た。

別にｐＵＥｓ１３ｓ、１０μｇを、５０μ！のＹ−５０
緩衝液に熔かし、ＥｃｏＲＩとＣ１ａｒ各々単位を加え
、３７°Ｃ１４時間消化反応を行った。この反応液から
、低融点アガロースゲル電気泳動法により、マグロ成長
ホルモンＮ末端側をコードするＤＮＡを含む断片（約０
．２Ｋｈ）１μｇを得た。

このｐＴＴＳ３３９起源のＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａｌ断片（
約３．３Ｋｂ）とｐＵＥｓＩ３ｓ起源のＥｃｏＲＩ−Ｃ
１ａｌ断片（約０．２　Ｋｂ）を３０μｌのリガーゼ緩
衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
、１６°Ｃ１１２時間、環状化反応を行った。

この反応液を用いて、大腸菌１１ＢＩＯＩ株を形質転換
し、アンピシリン耐性株を選択し、プラスミドＤＮＡを
単離し、目的のプラスミドｐＳＨ３３９を得た。

ｐＳＨ３３９の構造は、Ｎｃｏｌ、　ＥｃｏＲＴ、　Ｃ
１ａｌで切断後、アガロースゲル電気泳動にかけ、確認
した（第５図参照）。

〔発明の効果〕

本発明によれば、内性毒素を含有しない魚類の成長ホル
モンポリペプチドを、組換え体ＤＮＡを持つ酵母を培養
することにより大量に生産することができる。この生産
した成長ホルモンは魚類の成長促進効果を示すことが認
められたことから、増養殖業への応用が期待される。

【図面の簡単な説明】 第１図はプラスミドｐＴＴＳ３３９中のマグロ成長ホル
モン遺伝子の全塩基配列、第２図はプラスミドｐＴＧＨ
８２の構築図、第３図はプラスミドＩＩＴＧ）＋８２３
１）の構築図、第４図はクロマグロ稚魚に本発明で得ら
れた成長ホルモンを投与したときの体長、体重の増加を
示す図、第５図は本発明で得られたマグロ成長ホルモン
生産酵母乾燥菌体を餌にまぜてマダイ稚魚に投与したと
きの体長、体重の増加を示す図であり、第６図はプラス
ミドｐｓＨ３３９の構築図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図で示されるアミノ酸配列を含むマグロの成長
   ホルモンをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
   Ａを有する酵母を、培地中で培養し、該培地中に、マグ
   ロ成長ホルモンポリペプチドを、蓄積せしめ、これを該
   培養物から採集することを特徴とする魚類の成長ホルモ
   ンの製造法。 ２、酵母が、サッカロマイセス属に属する酵母であるこ
   とを特徴とする請求項１記載の魚類の成長ホルモンの製
   造法。 ３、サッカロマイセス属に属するの酵母が、サッカロマ
   イセス・セレビシエであることを特徴とする請求項２記
   載の魚類の成長ホルモンの製造法。 ４、第１図で示されるアミノ酸配列を含むマグロの成長
   ホルモンポリペプチドを蓄積した酵母菌体又はその破砕
   物を含む魚介類用飼料。 ５、第１図で示されるアミノ酸配列からなるマグロ成長
   ホルモンを含む魚介類用飼料。