CN115960193A - 一种半滑舌鳎雌性特异蛋白的表达及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了pitpβ_w蛋白在调控雄性半滑舌鳎中的生长相关基因和性别分化相关基因的表达中的用途；本发明利用pitpβ_w蛋白成功在雄性半滑舌鳎中调控了生长相关基因和性别分化相关基因，对研究相关基因表达模式和表型，以及对雄性半滑舌鳎的生长和分化提供了良好的研究基础，具有广阔的应用前景。

Description

一种半滑舌鳎雌性特异蛋白的表达及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎雌性特异蛋白的表达及应用方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是比目鱼的一种，属于舌鳎科，舌鳎属，是东北亚地区重要的海水养殖鱼类。半滑舌鳎以其肉质鲜美，口感爽滑而深受消费者喜爱，成为海水养殖鱼类中的名贵品种。半滑舌鳎存在明显的雌、雄生长差异，雌鱼生长可比雄鱼大2-4倍，因此养殖中提高雌鱼比例对于产量提升具有重要意义。半滑舌鳎属于ZW性别决定类型，即理论上讲，ZW基因型将发育为雌鱼，ZZ型发育成雄鱼。然而在实际生产中，有相当一部分的ZW个体会性逆转为“伪雄鱼”，伪雄鱼生长和雄鱼相似，这极大限制了舌鳎产业的发展。

我们通过转录组分析分析，筛选了一个与雌鱼分化密切相关的基因模块，其核心网络由50个基因组成，大多位于W染色体上，对其中一个位于W染色体上的基因pitpβ_w进行了进一步的功能研究，发现其在雄鱼中不表达，只在雌鱼中特异表达，在卵巢中主要定位于I-III期卵细胞，在半滑舌鳎卵巢细胞系中进行RNA干扰会导致sox9a下降(Xu et al.,2021；Sun et al.,2022)。以上结果表明pitpβ_w在雌性分化中发挥重要作用，然而其在体内的作用尚不明确。其在雄鱼中表达后对性别分化是否有影响，具有重要的应用意义，通过表达重组蛋白并进行注射，从而研究相关基因表达模式和表型，是研究性别分化和生长关系的有效途径。

发明内容

本发明提供了半滑舌鳎雌性特异蛋白的表达及应用，具体而言，所述半滑舌鳎雌性特异蛋白为pitpβ_w蛋白，将其在雄性半滑舌鳎(雄鱼)中进行表达，可以调控雄性半滑舌鳎(雄鱼)中的基因表达。

本发明中，pitpβ_w蛋白，为phosphatidylinositol transfer protein(磷脂酰肌醇转移蛋白)；在一个实施方式中，本发明的pitpβ_w蛋白的基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。pitpβ_w蛋白为雌性半滑舌鳎所特有的，在雄性半滑舌鳎中未发现。

在一个实施方式中，本发明提供了pitpβ_w蛋白在调控雄性半滑舌鳎中的生长相关基因和/或性别分化相关基因的表达水平中的用途。

在优选的实施方式中，在雄性半滑舌鳎中引入pitpβ_w蛋白从而可以降低生长相关基因和/或性别分化相关基因的表达水平。

所述降低生长相关基因和性别分化相关基因的表达水平，是指，与没有引入pitpβ_w蛋白的对照相比，引入pitpβ_w蛋白可以降低雄性半滑舌鳎的生长相关基因和性别分化相关基因的表达水平；例如，与对照相比，基因表达水平至少降低50％、60％、70％或80％。

在一个实施方式中，所述“引入pitpβ_w蛋白”可以通过蛋白注射的方式，将pitpβ_w蛋白注射至雄性半滑舌鳎。在其他的实施方式中，所述“引入pitpβ_w蛋白”还可以通过在雄性半滑舌鳎中表达或者过表达pitpβ_w蛋白来实现。

在一个实施方式中，所述生长相关基因为igf1，所述性别分化相关基因为cyp19a；优选的，所述igf1的核酸序列如SEQ ID No.3所示，所述cyp19a的核酸序列如SEQ ID No.4所示。

另一方面，本发明还提供了一种调控雄性半滑舌鳎(雄鱼)中的基因表达水平的方法，所述方法包括在雄性半滑舌鳎中引入pitpβ_w蛋白的步骤。

在一个实施方式中，所述“引入pitpβ_w蛋白”可以通过蛋白注射的方式，将pitpβ_w蛋白注射至雄性半滑舌鳎。在其他的实施方式中，所述“引入pitpβ_w蛋白”还可以通过在雄性半滑舌鳎中表达或者过表达pitpβ_w蛋白来实现。

在一个实施方式中，所述调控雄性半滑舌鳎(雄鱼)中的基因表达的方法为降低雄性半滑舌鳎中的生长相关基因和/或性别分化相关基因的表达水平。

在一个实施方式中，所述生长相关基因为igf1，所述性别分化相关基因为cyp19a；优选的，所述igf1的核酸序列如SEQ ID No.3所示，所述cyp19a的核酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明利用pitpβ_w蛋白，成功在雄性半滑舌鳎中调控了生长相关基因和性别分化相关基因，对研究相关基因表达模式和表型，以及对雄性半滑舌鳎的生长和分化提供了良好的研究基础，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.Pitpβ_w重组蛋白表达及纯化电泳图。

图2.Pitpβ_w重组蛋白后对雄性半滑舌鳎的生长相关基因igf1和性别分化相关基因cyp19a的表达影响(*表示显著性差异p<0.05)。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本实施方式中的，pitpβ_w(phosphatidylinositol transfer protein，磷脂酰肌醇转移蛋白)的基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

根据pitpβ_w的基因序列，设计了pitpβ_w的表达引物，使用pET28a和大肠杆菌表达系统进行重组蛋白表达，引物见表1所示。

表1用于蛋白表达的引物

载体构建以及蛋白表达和纯化步骤如下：提取卵巢RNA反转录制备cDNA，以cDNA为模板扩增pitp_w基因，运用NcoI、HindIII双酶切后连接pET-28a载体。连接转化大肠杆菌Dh5a后，筛选阳性质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落接种5ml液体LB培养基，37℃培养过夜。吸取0.5ml菌液转接到50ml液体LB培养基中，37℃培养2-3h，待OD₆₀₀为0.6～0.8范围，加入0.5mM的IPTG于25℃摇床中诱导表达过夜。离心收集菌体，加入10ml pH7.2的Tris-HCL缓冲液重悬，超声波破碎后离心，取上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳检测。将上清通过BeyoGold^TMHig-tag Purification Resin进行亲和纯化，获得较纯的蛋白(如图1所示)，测定浓度后进行注射。(注：平板和液体培养基中均添加卡那霉素，终浓度50μg/ml)。

将纯化得到的重组目的蛋白-磷脂酰肌醇转移蛋白，在雄性半滑舌鳎(雄鱼)中进行体内蛋白注射，具体步骤如下：选取孵化后120天的半滑舌鳎，通过手电筒腹侧照射可清楚分辨性腺位置，用微量注射器将蛋白注射至精巢位置。注射分对照组(BSA)和实验组(Pitpβ_w重组蛋白)，蛋白的剂量(浓度29.79μg/ml，注射100μl)，共进行2次注射(间隔24h)，48h后取性腺进行RNA提取，反转录后通过定量PCR检测生长相关基因insulin-likegrowth factor(igf1,NM_001294198.1)和性别分化相关基因cyp19a(NM_001294242.1)，igf1的核酸序列如SEQ ID No.3所示，cyp19a的核酸序列如SEQ ID No.4所示；用于定量PCR的检测引物见表2。

表2用于定量PCR的检测引物

在实际操作中，经过性别鉴定后，在对照组、实验组各选取3-5条雄鱼进行qPCR验证，检测生长相关基因igf1和性别分化相关基因cyp19a，发现igf1和cyp19a表达水平均显著下降(如图2所示)。

参考文献：

Sun et al.,pitpβ_w Encoding Phosphatidylinositol Transfer Protein IsInvolved in Female Differentiation of Chinese Tongue Sole,Cynoglossussemilaevis.Frontiers in Genetics,2022,doi:10.3389/fgene.2022.861763.

Xu et al.,Transcriptomic analysis revealed gene expression profilesduring the sex differentiation of Chinese tongue sole(Cynoglossussemilaevis).Comparative Biochemistry and Physiology-Part D:Genomics andProteomics,2021,40:100919.

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.pitpβ_w蛋白在调控雄性半滑舌鳎中的生长相关基因和/或性别分化相关基因的表达水平中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生长相关基因为igf1，所述性别分化相关基因为cyp19a。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述用途为在雄性半滑舌鳎中引入pitpβ_w蛋白从而降低生长相关基因和/或性别分化相关基因的表达水平。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述pitpβ_w蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

5.一种调控雄性半滑舌鳎中的生长相关基因和/或性别分化相关基因的表达水平的方法，所述方法包括在雄性半滑舌鳎中引入pitpβ_w蛋白的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pitpβ_w蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生长相关基因为igf1，所述性别分化相关基因为cyp19a。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括在雄性半滑舌鳎中表达pitpβ_w蛋白的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述表达为过表达。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为降低控雄性半滑舌鳎中的生长相关基因和/或性别分化相关基因的表达水平的方法。

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