CN111088257B

CN111088257B - 一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用

Info

Publication number: CN111088257B
Application number: CN201911421599.5A
Authority: CN
Inventors: 张继泉; 邢珂凡; 刘玉洁; 孙玉英
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111088257A

Abstract

本发明提供了一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用，所述基因的序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白包含三个结构域，分别为EcVBP‑PC1、EcVBP‑PC2、EcVBP‑PC3。上述基因EcVBP在卵黄蛋白结合蛋白介导外源蛋白进入甲壳动物受精卵中的应用。利用本发明提供的基因成功地将外源蛋白导入中华锯齿米虾的受精卵中，从而证实了VBP作为“分子货车”携带外源蛋白进入甲壳动物受精卵的可行性，为今后开展甲壳动物的基因编辑与分子设计育种提供了基础。

Description

一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用。

背景技术

在我国，虾蟹类等十足目甲壳动物是重要的水产养殖经济物种，随着市场对优质水产品需求量的不断增长，虾蟹类养殖在水产养殖中占据越来越重要的地位。良种的生产和培育作为水产养殖的关键一步，是从根本上提升虾蟹等水产品品质的重要手段。随着分子生物学和细胞生物学等学科的发展，新的育种方法如转基因育种等优势逐渐显现。

基因敲除与基因敲入技术是研究基因的重要手段，2013年初兴起的CRISPR/Cas系统便是实现基因敲除与敲入的有效工具。但目前在模式动物中开展CRISPR/Cas9技术主要是通过显微注射受精卵的方式进行的，该方式较为困难且效率低下，极易损坏受精卵并对操作人员技能要求较高，因而限制了CRISPR/Cas9技术更广泛的应用。

在昆虫和其它节肢动物中，卵黄蛋白是胚胎及幼体早期发育的重要营养成分。其前体在脂肪体中合成，然后分泌到血淋巴中。在卵黄发生过程中，在卵母细胞膜上的受体参与结合卵黄蛋白前体配体，使这些配体内化，积聚在内囊泡中，变成了胚胎发育所需要的卵黄营养颗粒。从1980年开始，研究人员便开始针对这种受体介导性胞吞作用，将这种特异性配体开发成传递药物到哺乳动物细胞的载体。2018年8月，宾夕法尼亚州大学Rasgon的研究团队开发了一种受体介导的卵巢转导技术(也称ReMOT Control)。在卵巢和卵子成熟期间，合成的卵黄蛋白分泌到体液中并被带入卵巢；并且以埃及伊蚊为动物模型，验证了该方法的可行性(CHAVERRA-RODRIGUEZ D,MACIAS V M,HUGHES G L,et al.Targeted deliveryof CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritablegermline gene editing[J].Nature Communications,2018,9)。与胚胎显微注射相比，通过ReMOT Control导入方式开展的基因编辑效率高，技术上更容易实现，成本大大降低，甚至非专业实验人员也可以操作。

在十足目甲壳动物中，尚未见通过类似上述机理实现外源蛋白导入受精卵的报道。因此，对脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白及其编码基因的研究不仅具有重要的理论意义，在实践上也具有巨大的应用潜力，其必将为今后开展重要经济甲壳动物的基因编辑与分子设计育种开辟广阔前景。

发明内容

本发明的目的就是提供一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用，以为外源蛋白进入甲壳动物受精卵提供了一种新途径。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP，所述基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP，所述基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

所述脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白包含三个结构域，分别为EcVBP-PC1、EcVBP-PC2、EcVBP-PC3，EcVBP-PC1对应的基因序列如SEQ ID NO.3所示，EcVBP-PC2对应的基因序列如SEQ ID NO.4所示，EcVBP-PC3对应的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

上述的脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP在卵黄蛋白结合蛋白介导外源蛋白进入甲壳动物受精卵中的应用。

所述应用是将EcVBP-PC1、EcVBP-PC2或EcVBP-PC3对应的基因与外源蛋白基因构建为重组质粒，并经大肠杆菌工程菌高效表达重组蛋白，将重组蛋白纯化后注射进性腺成熟的甲壳动物体液中。

所述的重组质粒的表达载体选用pCT7-CHISP6H，工程菌选用大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。

上述应用具体包括以下步骤：

a、以脊尾白虾cDNA为模板，通过PCR扩增的方式获得EcVBP-PC1、EcVBP-PC2或EcVBP-PC3对应的基因片段；

b、将EcVBP-PC1、EcVBP-PC2或EcVBP-PC3对应的PCR产物与表达载体pCT7-CHISP6H、外源蛋白EGFP基因共同构建pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP、pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP或pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP重组载体；

c、将pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP、pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP或pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，获得表达产物；

d、利用金属螯合柱层析的方法分离纯化重组蛋白，将重组蛋白注射进性腺成熟的雌性中华锯齿米虾体液中，待其交配产卵后，可在其受精卵中检测到外源蛋白EGFP的绿色荧光信号。

步骤a中，EcVBP-PC1扩增的上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，EcVBP-PC1扩增的下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；EcVBP-PC2扩增的上游引物序列如SEQ ID NO.8所示，EcVBP-PC2扩增的下游引物序列如SEQ ID NO.9所示；EcVBP-PC3扩增的上游引物序列如SEQID NO.10所示，EcVBP-PC3扩增的下游引物序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明相对现有技术的有益效果在于：

1、本发明确定了一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因(EcVBP)的编码序列，也明晰了其所编码的氨基酸序列，通过结构域预测发现VBP存在3个典型的结构域(EcVBP-PC1，EcVBP-PC2，EcVBP-PC3)。

2、本发明成功构建了脊尾白虾EcVBP-PC1，EcVBP-PC2，EcVBP-PC3与EGFP的融合蛋白质粒，通过优化诱导条件，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达重组蛋白。

3、本发明将重组蛋白注射进性腺成熟的雌性中华锯齿米虾体液中，待其交配产卵后，可在其受精卵中检测到绿色荧光信号，从而证实了VBP作为“分子货车”携带外源蛋白进入受精卵的可行性，为今后开展甲壳动物的基因编辑与分子设计育种提供了基础。

附图说明

图1为EcVBPC1-EGFP(左)、EcVBPC2-EGFP(中)、EcVBPC3-EGFP(右)融合蛋白发射荧光的照片。

图2为注射EcVBPC2-EGFP的中华米虾受精卵照片(a-d依次为在自然光、绿色荧光、蓝色荧光、紫外光下观察的照片)。

图3为正常中华米虾受精卵照片(a-d依次为在自然光、绿色荧光、蓝色荧光、紫外光下观察的照片)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的技术效果进行详细阐述。本发明中未提及的实验方法和实验条件均为本领域技术人员公知的常规实验操作。

实施例1重组表达载体的构建

a、基因克隆：

从脊尾白虾(购于青岛沙子口市场)头胸甲cDNA文库中筛选到一种卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP(序列如SEQ ID NO.1所示)，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过在线结构域预测工具(SMART:Main page，http://smart.embl-heidelberg.de/)对其氨基酸序列进行结构域预测，发现脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白VBP存在3个典型的结构域：EcVBP-PC1，EcVBP-PC2，EcVBP-PC3，三者对应的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示。

用TAKARA(货号：9108)RNAiso Plus试剂盒，按照常规步骤提取脊尾白虾TotalRNA，将其用天根生化科技有限公司(后简称天根)FastQuant RT Kit(货号：KR106-02)，按照说明书步骤反转录为cDNA，设计3对引物，通过PCR扩增的方式获得VBP三个典型结构域相应的基因片段：

EcVBP-PC1(扩增引物：PC1-F：5’GTCGACCAACTCAAAACATCTATAGAT 3’；PC1-R：5’GAATTCTGATTTTTTGCTTGCAGTCTC 3’)；

EcVBP-PC2(扩增引物：PC2-F：5’GTCGACTCTGAAAAAGAGACTGCAAGC 3’；PC2-R：5’GAATTCGTCGATACGACGTTTAGGAGT 3’)；

EcVBP-PC3(扩增引物：PC3-F：5’GTCGACGAAGCTAAAGCCAATGGTGG 3’；PC3-R：5’GAATTCTTACTTCATAAGCGCATGTAC 3’)。

PCR扩增体系：

反应流程为：PCR仪95℃，3min；95℃，30s；54℃，30s；72℃，1min20s；35个循环。

b、重组表达载体及宿主菌的选择：

重组表达载体确定为本课题组构建的大肠杆菌高效分泌表达载体pCT7-CHISP6H；宿主菌为原核表达常用的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。

c、重组表达载体的构建：

将EcVBP-PC1，EcVBP-PC2，EcVBP-PC3的PCR产物使用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：DP209-02)，按照说明书步骤凝胶回收后直接与商品化T载体(TAKARA，货号：3271)按说明书步骤进行连接(16℃，12h)，构建质粒pT-EcVBP-PC1，pT-EcVBP-PC2，pT-EcVBP-PC2。

c-1、pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP的构建：

(1)使用SalⅠ(TAKARA，货号：1080A)和EcoRⅠ(TAKARA，货号：1040A)对pT-EcVBP-PC2进行双酶切(37℃，2h)，将酶切产物用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：DP209-02)，按照说明书步骤凝胶回收并与分泌表达载体pCT7-CHISP6H使用连接酶(TAKARA，货号：6023)按说明书步骤进行连接，构建pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2；

(2)设计与pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2含有同源序列的引物(EGFP-F：5’GGCCGGGACCGTCGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT3’；EGFP-R：5’CTTTTTCAGAGTCGACGGAGCCGCCTCCTCCTGATC3’)，从实验室保种的EGFP(DH5α)菌液中扩增用于连接的EGFP片段(EGFP-2)；

EGFP-2的PCR体系为：

反应流程为:PCR仪95℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；35个循环。

(3)将EGFP-2的PCR产物通过与步骤(1)相同的操作进行凝胶回收，按照无缝克隆酶(ABclonal Technology，货号：RK21020)说明书步骤，将其与SalⅠ单酶切后的pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2相连，构建与EGFP重组表达载体(pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP)；

pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP无缝克隆体系为：

pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2(SalⅠ切) 2μl

EGFP-2 3μl

2×Seamless Cloning Mix 5μl

反应条件为：PCR仪50℃，45min。

c-2、pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP和pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP的构建：

(1)从pT-EcVBP-PC1中克隆Infu-PC1(扩增引物：Infu-F1：5’GGAGGAGGCGGCTCCCAACTCAAAACATCTATAGAT3’；Infu-R1：5’GGAGGAGGCGGCTCCCAACTCAAAACATCTATAGAT3’)；从pT-EcVBP-PC3中克隆Infu-PC3(扩增引物：Infu-F3：5’GGAGGAGGCGGCTCCGAAGCTAAAGCCAATGGTGG3’；Infu-R3：5’CAAGCTTCGAATTCATTACTTCATAAGCGCATGTAC 3’)，将PCR产物按前述步骤凝胶回收。

Infu-PC1/PC3的PCR体系为：

灭菌水补足体系至50μl

反应流程为：PCR仪98℃，3min；98℃，10s；52℃，10s；72℃，30s；35个循环。

(2)从pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP中克隆Infu-EGFP(扩增引物：Infu-EGFPF：5’TGAATTCGAAGCTTGATCCGGCT 3；’Infu-EGFPR：5’GGAGCCGCCTCCTCCTGATCC 3’)；将PCR产物按照前述步骤凝胶回收。

Infu-EGFP的PCR体系为：

灭菌水补足体系至50μl

反应流程为：PCR仪98℃，3min；98℃，10s；52℃，10s；72℃，1min10s；35个循环。

(3)分别将Infu-PC1、Infu-PC3与Infu-EGFP按照无缝克隆酶(ABclonalTechnology，货号：RK21020)说明书步骤连接，构建EcVBP-PC1、EcVBP-PC3与EGFP的重组载体(pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP和pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP)。

pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP无缝克隆体系为：

Infu-PC1 1.5μl

Infu-EGFP 1μl

2×Seamless Cloning Mix 2.5μl

反应条件为：PCR仪50℃，50min。

pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP无缝克隆体系为：

Infu-PC3 1.8μl

Infu-EGFP 0.7μl

2×Seamless Cloning Mix 2.5μl

反应条件为：PCR仪50℃，50min。

实施例2重组载体诱导表达及产物提纯

a、将重组载体pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP、pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP和pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP分别转化(转化步骤按现有技术常规操作进行)表达宿主菌BL21(DE3)，在终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中培养菌体浓度至OD600为0.6左右(37℃，250r/min)，添加终浓度为1mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达6h。

b、将发酵液上清离心(8000rpm，10min)后加入PBS并用0.45μm滤膜抽滤，利用镍离子螯合柱层析(实验步骤按现有技术常规操作进行)分离纯化重组蛋白，纯化的蛋白使用荧光显微镜检测到绿色荧光信号(如图1所示)。

实施例3外源蛋白导入受精卵

使用酒精消毒后的微量进样器将EcVBP-PC2与EGFP重组蛋白注射进性腺成熟的雌性中华锯齿米虾体液中，让其在实验室条件下交配产卵。次日雌虾抱卵后，在其受精卵中可使用荧光显微镜检测到绿色荧光信号(图2所示)，而在普通的受精卵中没有观察到绿色荧光信号(图3所示)。本实施例证实了VBP作为“分子货车”携带外源蛋白进入受精卵的可行性，为其它外源蛋白导入甲壳动物受精卵提供了借鉴，同时为今后开展甲壳动物的基因编辑与分子设计育种提供了基础。

序列表

<120> 一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2338

<212> DNA

<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)

<400> 1

atgttggact ttttcgcagt tattaccaaa ggaggcctgg tcctgtggta ttttcaagat 60

gctgcacagc aactcaaaac atctatagat gccataaatg cattaattag aaatgtggtg 120

ttacaggaaa gaggcgggtc tggaatgtac agtcatggaa gcttggctat caaagagcag 180

ttggataatg aatttgactt actgtttgtt gctgtttacc agaagatatt acagctgtca 240

tatgtggaca aatttttatc tgatatccag cgtgaatttc gtgaacgata cagggatgag 300

ttgcgacagg gtttatatta ccagagtttt gatttctctt gtgaatacga gagaattctt 360

cgtgacgcag aggcaacttc aagaatggta aaactagaag ttaagaaacc tagaagtttt 420

gaagagtcag caaaatccaa gaaaactgtc tcttccatga tagaaaaaag gggcggagag 480

caatcgaaaa aaattccaaa gaaaaaggaa ggtaaaggga agaagaaaaa tggtgaatgc 540

aataataata gtaaacaaag cgcagttgag gaagctgagg atttggatga agaggaggaa 600

gacattaatg gagaagtgga agaagcgatt gaagtgacag cagttaagga gaatgaaagc 660

tctcaattgg atgaggaggc gcttgaaaaa aatagagaaa aacttcgcaa caggatgcag 720

cgtacgccaa aagctgtaaa agttgagaaa acaaaaagcc ctaaagctgt taagaagggg 780

aaggaagcaa ctgtatggga tcttgatggg aaagattcaa agagtcttga ttactcatca 840

aaaaattctt cacctaactc tgggatatcc tcttttcgtc cagactttct gccggaccag 900

tcacagattg gtacactatc tggaaatcta agagacatgg atattccatc tgaaaaagag 960

actgcaagca aaaaatcatc aggtggtatg ttttctatgt ttaagagtct ggtggggggt 1020

aaaactctta ctgatggaga catagctcca gtgttggaga agatgaagga ccaccttatt 1080

gggaagaatg ttgctgctga aatttccatc aaattgtgtc agtccgttgg tcaaaaactt 1140

gaaggcaagg tcattggtac atttgatggt gttacggcaa cagtccggaa tactttaaca 1200

gaagctttgg tgcaactctt gactcctaaa cgtcgtatcg acgtcttacg tgatgttgtc 1260

gaagctaaag ccaatggtgg ggtgtatacc atggttttct gtggtgtaaa tggtgttggc 1320

aaaagtacca atttagccaa gattactttt tggcttatcg aaaataacta tcgtgttctt 1380

atagctgcat gtgacacttt ccgagctgga gctgtagagc agctgagaac acatatgcat 1440

cacttgaatg ctcttcatcc tccagaaaaa catggtggaa tatcaatggt tcagttgttt 1500

gaacagggtt atggtaaaga tgctgctgaa attgctcgcc acgctattga atttgctcgg 1560

aaaaataatt ttgatgttgt tcttgttgat actgctggcc ggatgcagga caacgaacca 1620

cttatgcgag cacttgctaa gcttataatg gtgaatgagc cgcacctcac cctgtttgtg 1680

ggtgaggcat tggttgggaa tgaagcagtg gatcaactgg taaagttcaa cagggctctg 1740

gcaaatcatt ctgtgaaaca tccaccccaa ggaatcgatg gaattgttct caccaagttt 1800

gatactattg atgataaggt tggagctgct atttctatga catacattac tggacagccc 1860

attgtattcg ttggcactgg ccagacttac acagatctcc ggaaattgga tgcaaaagct 1920

gtcgtacatg cgcttatgaa gtaaactttc tctgaaattg aaggctgtga tgggttgggt 1980

ctttatagtg gttgttaatt agcttttcct tcataactaa ttattttatc tggtcttcta 2040

tgggagttca cttctgctat tcacataggt taggaactgg tttaaccctc tcatgctggg 2100

ttggttatga ggccgtgcat gtcagccggt agtgttataa cgccccaaga atatttgatg 2160

ataaactttc gtatcaaagg aacgaagcta tgctagaaaa aataataaaa atataagtga 2220

aacagttgaa agtttgagtt aaatatatta ccttaactgt tactattatc gtcaaggtta 2280

atcataatct ccttaaaact atttcttaga ttatcaccaa tatttaaata aaaaaaaa 2338

<210> 2

<211> 647

<212> PRT

<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)

<400> 2

Met Leu Asp Phe Phe Ala Val Ile Thr Lys Gly Gly Leu Val Leu Trp

1 5 10 15

Tyr Phe Gln Asp Ala Ala Gln Gln Leu Lys Thr Ser Ile Asp Ala Ile

20 25 30

Asn Ala Leu Ile Arg Asn Val Val Leu Gln Glu Arg Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Met Tyr Ser His Gly Ser Leu Ala Ile Lys Glu Gln Leu Asp Asn Glu

50 55 60

Phe Asp Leu Leu Phe Val Ala Val Tyr Gln Lys Ile Leu Gln Leu Ser

65 70 75 80

Tyr Val Asp Lys Phe Leu Ser Asp Ile Gln Arg Glu Phe Arg Glu Arg

85 90 95

Tyr Arg Asp Glu Leu Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Gln Ser Phe Asp Phe

100 105 110

Ser Cys Glu Tyr Glu Arg Ile Leu Arg Asp Ala Glu Ala Thr Ser Arg

115 120 125

Met Val Lys Leu Glu Val Lys Lys Pro Arg Ser Phe Glu Glu Ser Ala

130 135 140

Lys Ser Lys Lys Thr Val Ser Ser Met Ile Glu Lys Arg Gly Gly Glu

145 150 155 160

Gln Ser Lys Lys Ile Pro Lys Lys Lys Glu Gly Lys Gly Lys Lys Lys

165 170 175

Asn Gly Glu Cys Asn Asn Asn Ser Lys Gln Ser Ala Val Glu Glu Ala

180 185 190

Glu Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Ile Asn Gly Glu Val Glu Glu

195 200 205

Ala Ile Glu Val Thr Ala Val Lys Glu Asn Glu Ser Ser Gln Leu Asp

210 215 220

Glu Glu Ala Leu Glu Lys Asn Arg Glu Lys Leu Arg Asn Arg Met Gln

225 230 235 240

Arg Thr Pro Lys Ala Val Lys Val Glu Lys Thr Lys Ser Pro Lys Ala

245 250 255

Val Lys Lys Gly Lys Glu Ala Thr Val Trp Asp Leu Asp Gly Lys Asp

260 265 270

Ser Lys Ser Leu Asp Tyr Ser Ser Lys Asn Ser Ser Pro Asn Ser Gly

275 280 285

Ile Ser Ser Phe Arg Pro Asp Phe Leu Pro Asp Gln Ser Gln Ile Gly

290 295 300

Thr Leu Ser Gly Asn Leu Arg Asp Met Asp Ile Pro Ser Glu Lys Glu

305 310 315 320

Thr Ala Ser Lys Lys Ser Ser Gly Gly Met Phe Ser Met Phe Lys Ser

325 330 335

Leu Val Gly Gly Lys Thr Leu Thr Asp Gly Asp Ile Ala Pro Val Leu

340 345 350

Glu Lys Met Lys Asp His Leu Ile Gly Lys Asn Val Ala Ala Glu Ile

355 360 365

Ser Ile Lys Leu Cys Gln Ser Val Gly Gln Lys Leu Glu Gly Lys Val

370 375 380

Ile Gly Thr Phe Asp Gly Val Thr Ala Thr Val Arg Asn Thr Leu Thr

385 390 395 400

Glu Ala Leu Val Gln Leu Leu Thr Pro Lys Arg Arg Ile Asp Val Leu

405 410 415

Arg Asp Val Val Glu Ala Lys Ala Asn Gly Gly Val Tyr Thr Met Val

420 425 430

Phe Cys Gly Val Asn Gly Val Gly Lys Ser Thr Asn Leu Ala Lys Ile

435 440 445

Thr Phe Trp Leu Ile Glu Asn Asn Tyr Arg Val Leu Ile Ala Ala Cys

450 455 460

Asp Thr Phe Arg Ala Gly Ala Val Glu Gln Leu Arg Thr His Met His

465 470 475 480

His Leu Asn Ala Leu His Pro Pro Glu Lys His Gly Gly Ile Ser Met

485 490 495

Val Gln Leu Phe Glu Gln Gly Tyr Gly Lys Asp Ala Ala Glu Ile Ala

500 505 510

Arg His Ala Ile Glu Phe Ala Arg Lys Asn Asn Phe Asp Val Val Leu

515 520 525

Val Asp Thr Ala Gly Arg Met Gln Asp Asn Glu Pro Leu Met Arg Ala

530 535 540

Leu Ala Lys Leu Ile Met Val Asn Glu Pro His Leu Thr Leu Phe Val

545 550 555 560

Gly Glu Ala Leu Val Gly Asn Glu Ala Val Asp Gln Leu Val Lys Phe

565 570 575

Asn Arg Ala Leu Ala Asn His Ser Val Lys His Pro Pro Gln Gly Ile

580 585 590

Asp Gly Ile Val Leu Thr Lys Phe Asp Thr Ile Asp Asp Lys Val Gly

595 600 605

Ala Ala Ile Ser Met Thr Tyr Ile Thr Gly Gln Pro Ile Val Phe Val

610 615 620

Gly Thr Gly Gln Thr Tyr Thr Asp Leu Arg Lys Leu Asp Ala Lys Ala

625 630 635 640

Val Val His Ala Leu Met Lys

645

<210> 3

<211> 870

<212> DNA

<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)

<400> 3

caactcaaaa catctataga tgccataaat gcattaatta gaaatgtggt gttacaggaa 60

agaggcgggt ctggaatgta cagtcatgga agcttggcta tcaaagagca gttggataat 120

gaatttgact tactgtttgt tgctgtttac cagaagatat tacagctgtc atatgtggac 180

aaatttttat ctgatatcca gcgtgaattt cgtgaacgat acagggatga gttgcgacag 240

ggtttatatt accagagttt tgattcctct tgtgaatacg agagaattct tcgtgacgca 300

gaggcaactt caagaatggt aaaactagaa gttaagaaac ctagaagttt tgaagagtca 360

gcaaaatcca agaaaactgt ctcttccatg atagaaaaaa ggggcggaga gcaatcgaaa 420

aaaattccaa agaaaaagga aggtaaacaa agtgcagttg aggaagctga ggatttggat 480

gaagaggagg aagacattaa tggagaagtg gaagaagcta ttgaagtgat tacagttaag 540

gtgaatgaaa gctctcaatt ggacgaggag gcgcttgaaa aaaatagaga aaaacttcgc 600

aacaggatgc agcgtacgcc aaaagctgta aaagttgaga aaacaaaaag ccctaaagct 660

gttaagaagg ggaaggaagc aactgtatgg gatcttgatg ggaaagattc aaagagtctt 720

gattactcat caaaaaattc ttcacctaac tctgggatat cctcttttcg tccagacttt 780

ctgccggacc agtcacagat tggtacacta tctggaaatc taagagacat ggatattcca 840

tctgaaaaag agactgcaag caaaaaatca 870

<210> 4

<211> 294

<212> DNA

<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)

<400> 4

tctgaaaaag agactgcaag caaaaaatca tcaggtggta tgttttctat gtttaagagt 60

ctggtggggg gtaaaactct tactgatgga gacatagctc cagtgttgga gaagatgaag 120

gaccacctta ttgggaagaa tgttgctgct gaaatttcca tcaaattgtg tcagtccgtt 180

ggtcaaaaac ttgaaggcaa ggtcattggt acatttgatg gtgttacggc aacagtccgg 240

aatactttaa cagaagcttt ggtgcaactc ttgactccta aacgtcgtat cgac 294

<210> 5

<211> 684

<212> DNA

<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)

<400> 5

gaagctaaag ccaatggtgg ggtgtatacc atggttttct gtggtgtaaa tggtgttggc 60

aaaagtacca atttagccaa gattactttt tggcttatcg aaaataacta tcgtgttctt 120

atagctgcat gtgacacttt ccgagctgga gctgtagagc agctgagaac acatatgcat 180

cacttgaatg ctcttcatcc tccagaaaaa catggtggaa tatcaatggt tcagttgttt 240

gaacagggtt atggtaaaga tgctgctgaa attgctcgcc acgctattga atttgctcgg 300

aaaaataatt ttgatgttgt tcttgttgat actgctggcc ggatgcagga caacgaacca 360

cttatgcgag cacttgctaa gcttataatg gtgaatgagc cgcacctcac cctgtttgtg 420

ggtgaggcat tggttgggaa tgaagcagtg gatcaactgg taaagttcaa cagggctctg 480

gcaaatcatt ctgtgaaaca tccaccccaa ggaatcgatg gaattgttct caccaagttt 540

gatactattg atgataaggt tggagctgct atttctatga catacattac tggacagccc 600

attgtattcg ttggcactgg ccagacttac acagatctcc ggaaattgga tgcaaaagct 660

gtcgtacatg cgcttatgaa gtaa 684

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgaccaac tcaaaacatc tatagat 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaattctgat tttttgcttg cagtctc 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgactctg aaaaagagac tgcaagc 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattcgtcg atacgacgtt taggagt 27

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgacgaag ctaaagccaa tggtgg 26

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaattcttac ttcataagcg catgtac 27

Claims

1.一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP-PC2结构域，其特征是，EcVBP-PC2结构域对应的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种权利要求1所述的脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP-PC2结构域在卵黄蛋白结合蛋白介导外源蛋白进入甲壳动物受精卵中的应用，其特征是，将EcVBP-PC2对应的基因与外源蛋白基因构建为重组质粒，并经大肠杆菌工程菌高效表达重组蛋白，将重组蛋白纯化后注射进性腺成熟的甲壳动物体液中。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，重组质粒的表达载体选用pCT7-CHISP6H，工程菌选用大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征是，包括以下步骤：

a、以脊尾白虾cDNA为模板，通过PCR扩增的方式获得EcVBP-PC2对应的基因片段；

b、将EcVBP-PC2对应的PCR产物与表达载体pCT7-CHISP6H、外源蛋白EGFP基因共同构建pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP重组载体；

c、将pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，获得表达产物；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，步骤a中，EcVBP-PC2扩增的上游引物序列如SEQ ID NO.8所示，EcVBP-PC2扩增的下游引物序列如SEQ ID NO.9所示。