KR20200066334A

KR20200066334A - 흥분성 신경 독성 관련 손상 치료를 위한 펩타이드 조성물

Info

Publication number: KR20200066334A
Application number: KR1020207012730A
Authority: KR
Inventors: 화민 한; 유지아 티엔; 홍준 지아
Original assignee: 바이오셀즈(베이징) 바이오테크 코., 엘티디.
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2020-06-09
Also published as: CN111132687A; JP2020536065A; EP3693001A4; EA202090802A1; AU2017433643A1; EP3693001A1; JP7073486B2; KR102545825B1; ZA202002329B; CN111132687B; US11541098B2; WO2019061395A1; US20210000909A1; BR112020006321A2; AU2017433643B2

Abstract

본 출원은 펩타이드, pH 조절제 및 충진제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 YEKLLDTEI (서열번호 1) 또는 그의 기능성 변이체를 포함하고, 상기 펩타이드는 중추신경계의 손상을 치료하는 활성 펩타이드이다. 또한, 본 출원은 상기 활성 펩타이드 및 내재화 펩타이드를 포함하는 키메라 펩타이드, pH 조절제 및 충진제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 출원은 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물의 의학적 용도를 제공한다.

Description

흥분성 신경 독성 관련 손상 치료를 위한 펩타이드 조성물

본 출원은 의학 분야에 관한 것으로, 특히 중추신경계 손상 치료용 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.

뇌졸중은 중년에 흔히 나타나는 급성 뇌혈관 질환으로 젊은층으로 퍼지는 경향을 보이고 있다. 현재 세계적으로 인간에게 가장 유해한 세 가지 질병 (암, 심뇌혈관 질환, 당뇨병) 중의 하나이다. 우리나라에서는 매년 뇌혈관 질환으로 사망하는 인구가 300만명 가까이되고, 이러한 수치는 유럽국가보다 4 ~ 5배 더 높으며, 일본의 3.5배, 심지어 태국, 인도 등 개발도상국보다 더 높다. 또한, 매년 8.7%의 속도로 발병율이 상승하고 있으며, 재발병율이 30%를 초과하여 5년 내 재발병율이 54%에 달하며, 뇌졸중 환자의 생존자들 중 75% 정도가 노동능력을 상실하였으며, 40%가 심한 장애를 겪고 있다.

뇌졸중은 크게 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중으로 나눌수 있는데, 허혈성 뇌졸중은 뇌졸중 환자의 총수의 85%를 차지한다. 현재 허혈성 뇌졸중 치료제는 크게 혈관 확장제 (판토텐산 등), 미세사이클 개선, 혈용량 확장제 (저분자 덱스트로스 무수물 등), 혈전을 용해시키는 약물 (요일키나아제 등), 항응고치료, 혈소판 응집 방지를 위한 약물 (아스피린 등), 중의약, 신경세포 보호제 등으로 나뉜다. 그러나 이들 약물은 부작용이 크고 잠재적인 위험성이 수반되거나 치료 효과가 크지 않다는 등의 많은 문제점이 있어 뇌졸중의 발병기전을 조사하고 그 기전에 대해 약제를 개발하는 것은 뇌혈관질환의 예방 및 치료에 중요한 사회적 의미를 가지고 있다.

뇌졸중의 특징은 허혈부위, 뇌출혈 부위 및/또는 상처 부위의 신경세포 사멸에 있다. 한편, 뇌허혈로 인한 신경세포의 사멸 또는 손상은 상처 연쇄반응 과정으로서 뇌허혈 후 조직의 혈액 주입이 떨어지고 흥분성 신경전달물질이 증가하여 NMDA와 AMPA 수용체를 활성화시켜 이온 채널을 개방시키고 칼슘이온 내부흐름을 일으키며, 다량의 효소를 활성화시켜 신호 캐스케이드를 트리커함으로써 다중 경로의 신경세포 손상을 유발한다. 해당 다운 스트림 포스트 시냅틱 밀도 95 단백질 (PSD-95) 은 여러 단백질과의 상호작용에 의해 일련의 허혈성 손상을 유발하며, 이는 뇌허혈성 손상의 중요한 부위이자, 약물 치료의 잠재적인 표적이기도 하다. 따라서, PSD-95 억제제의 개발은 뇌졸중을 비롯한 다양한 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상에 큰 의미를 가진다.

또한, 흥분성 신경전달물질 NMDA는 불안성, 간질 및 알츠하이머병, 근위축성 측색경화증 (ALS), 파킨슨병, 헌팅톤병 등 다양한 신경퇴행성 질환에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 중추신경계의 글루타메이트는 과흥분되어 불안을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있으며, NMDA 수용체 (NMDAR) 는 글루타메이트의 흥분성 신경 독성의 주요 부분을 담당하고 있다. 간질의 발작에는 개시, 발작방전의 유지와 확장 및 발작방전의 억제 등 3가지 서로 다르며 연속적인 병리적 생리과정이 포함되며, 이 과정에서 글루타메이트, 아스파라긴과 같은 흥분성 신경전달물질이 중요한 역할을 한다. 알츠하이머증에서 PSD-95는 GluR6-PSD-95-MLK3 경로를 통해 신경 독성 기전에 관여한다. 또한, 헌팅톤병에서 PSD-95는 NMDA 수용체 및 huntingtin 돌연 변이체 신경 독성의 매개체이다. 따라서 PSD-95 억제제의 개발은 상기와 같은 질환의 치료, 개선 및 예방에 중요한 의미를 갖는다.

펩타이드류 약물의 경우, 약물의 저장 조건이 제한되고, 환경 스트레스에 대한 내성이 제한된다. 펩타이드는 고온 및 장기 보존 과정에서 pH 변화가 발생하여 어느 정도 분해되어 순도가 떨어지고 외관 변화가 심하여 저장기간이 짧아서 약효에 영향을 미치며, 수송에도 높은 요구가 있어 펩타이드 약물의 대량 상용화에 한계가 있어 기술적 개선이 요구되고 있다.

제1 양태로서, 본 출원은 펩타이드, pH 조절제 및 충진제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 YEKLLDTEI (서열번호 1) 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다.

일부 실시예에 있어서, 상기 기능성 변이체는 서열번호 1의 LDTEI 세그먼트에서 하나 이상의 보존적 치환을 통해 형성된 변이체으로서, 상기 보존적 치환은 바람직하게 D와 E사이의 치환, L, V와 I사이의 치환 및 T와 S사이의 치환으로부터 선택된다.

일부 실시예에 있어서, 상기 기능성 변이체는 서열번호 1의 LDTEI 세그먼트를 LDTEL, LDTEV, LDTDI, LDTDL, LDTDV, LDSEI, LDSEL, LDSEV, LDSDI, LDSDL, LDSDV, LETEI, LETEL, LETEV, LETDI, LETDL, LETDV, VDTEI, VDTEL, VDTEV, VDTDI, VDTDL, VDTDV, IDTEI, IDTEL, IDTEV, IDTDI, IDTDL, IDTDV, IETEI, IETEL, IETEV, IETDI, IETDL 및 IETDV로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열로 치환하여 생성된 변이체이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 YEKLLDTEI (서열번호 1) 또는 그의 기능성 변이체 및 내재화 펩타이드를 포함하는 키메라 펩타이드이며, 상기내재화 펩타이드는 상기 키메라 펩타이드의 세포내 섭취를 촉진할 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 상기 내재화 펩타이드는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열번호 2) 을 포함한다.

일부 실시예에 있어서, 상기 키메라 펩타이드는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR YEKLLDTEI (서열번호 3) 를 포함한다.

일부 실시예에 있어서, 상기 pH 조절제는 히스티딘 완충액, 아르기닌 완충액, 소듐 호박산 완충액, 포타슘 호박산 완충액, 소듐 시트레이트 완충액, 글루콘산염 완충액, 아세테이트 완충액, 인산염 완충액 및 트리스 완충액 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는, 구연산/디소듐 포스페이트 완충액 또는 히스티딘/아르기닌 완충액으로부터 선택되며, 더 바람직하게는, 히스티딘/아르기닌 완충액이다.

상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 8, 바람직하게는 약 6 내지 7.5, 보다 바람직하게는 약 6 내지 7, 더욱 바람직하게는 약 6.5 내지 7, 가장 바람직하게는 약 6.5 이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 히스티딘/아르기닌 완충액 내 히스티딘의 함량은 중량을 기준으로, 1% 내지 10%, 바람직하게는 3% 내지 10% 이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 충진제는 , 만니톨, 포도당, 락토오스, 시클로덱스트린, 덱스트로스 무수물-40, 솔비톨, 수크로오스, 글리신 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는 트레할로스, 만니톨, 포도당, 락토오스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 트레할로스이다.

일부 실시예에 있어서, 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 0.05 내지 1: 10, 바람직하게는 약 1: 0.5 내지 1: 5, 보다 바람직하게는 약 1: 0.8 내지 1: 3, 가장 바람직하게는 약 1: 1 이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 충진제는 트레할로스이고, 상기 pH 조절제는 히스티딘/아르기닌 완충액이다.

일부 실시예에 있어서, 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 1이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 ± 0.5이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 조성물은 동결 보호제 및/또는 계면활성제를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게, 상기 동결 보호제는 폴리에틸렌글리콜이고/이거나 상기 계면활성제는 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 조성물은 탈 아미드화 억제제를 더 포함한다.

일부 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 사전 동결건조제제 형태, 동결건조제제 형태 또는 동결건조제제와 수용액을 혼합하여 얻은 복원제 형태이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 포유동물의 신경계 손상 및 이로 인한 관련 질환 또는 통증, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질의 치료, 개선 또는 예방에 사용되거나, 신경세포 보호제로 사용된다.

제2 양태로서, 본 출원은 포유동물의 신경계 손상 및 이와 관련된 질환 또는 통증, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질의 치료, 개선 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은, 제1 양태에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.

제3 양태로서, 본 출원은 포유동물의 신경질환 및 이와 관련된 질환 또는 통증, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질의 치료, 개선 또는 예방용 약물 또는 신경세포 보호제의 제조에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

상기 어느 한 양태에 따른 일부 실시예에 있어서, 상기 질환은 뇌졸중 또는 뇌졸중에 의한 신경계 손상이다.

상기 어느 한 양태에 따른 일부 실시예에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중 및 허혈성 뇌졸중으로부터 변환된 출혈성 뇌졸중을 포함하며, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중이다.

상기 어느 한 양태에 따른 일부 실시예에 있어서, 상기 신경계 손상은 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상이다.

상기 어느 한 양태에 따른 일부 실시예에 있어서, 상기 손상 또는 통증은 말초 신경이나 중추 신경에 위치한다.

상기 어느 한 양태에 따른 일부 실시예에 있어서, 상기 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상은 뇌졸중 또는 척수 손상, 뇌 또는 척수의 허혈성 또는 상처 손상, 급성 CNS 손상, 허혈성 뇌졸중 또는 척수 손상을 포함하는 중추신경계 (CNS) 신경세포 손상, 저산소증, 허혈, 기계적 손상 및 신경퇴행성 질환, 불안, 간질, 뇌졸중으로 인한 손상을 포함한다.

상기 어느 한 양태에 따른 일부 실시예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 근위축성 측파경화증 (ALS), 파킨슨병 또는 헌팅톤병을 포함한다.

도 1은 Pull-down 실험에 의한 P5와 PDZ1/2 도메인의 상호작용을 검사한 결과를 나타낸 것이다. 여기서, M: 단백질의 분자량 마커; 레인 1: His + PDZ1/2 + P5; 레인 2: P5; 레인 3: His + P5; 레인 4: His + PDZ1/2. 레인 1에 나타난 용출 밴드는 P5와 PDZ1/2를 모두 포함하여 P5가 PDZ1/2 도메인과 결합할 수 있음을 확인하였다.
도 2는 래트 MCAO 모델에서 폴리펩타이드 P5의 TTC 염색도를 나타낸 것이다. a. 정상군; b. 모의 수술군; c. 모델군; d. 양성 대조군인 인플루엔자 주사액군; e. NA-1, 10 mg/kg 체중; f. YE-NA-1, 10 mg/kg 체중; g. P5-10mg/kg 체중; h. P5-3mg/kg 체중; i. P5-1mg/kg 체중; j. 예방투여군 P5-10mg/kg 체중; k. 예방투여군 P5-3 mg/kg 체중; ℓ. 예방투여군 P5-1 mg/kg 체중.
도 3은 MCAO 모델 래트에 다양한 용량으로 폴리펩타이드 P5 치료 및 예방 투여후 뇌경색 부피의 통계적 데이터를 보여주는 그래프이다. **p<0.01.
도 4는 래트의 뇌에서의 P5 폴리펩타이드 분포를 나타낸 것이다.
도 5는 래트의 뇌 TTC 염색을 나타낸 것이다.
도 6은 래트의 뇌파절편 HE 염색 결과를 나타낸 것이다. A: 정상군, B: 모의 수술군, C: 모델군, D: 양성 대조 투여군, E: NA-1, F: YE-NA-1, G: P5 군, H: P5 예방 투여군.
도 7은 제0일 때 P5 동결건조 제제 (0번, 1번, 2번) 의 성형 및 안정성에 대한 충진제의 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 제0일 때 P5 동결건조 제제 (3번, 4번, 5번) 의 성형 및 안정성에 대한 충진제의 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 1주차 때 P5 동결건조제제 (0번, 1번, 2번) 의 성형 및 안정성에 대한 충진제의 영향을 나타낸 것이다.
도 10은 1주차 때 P5 동결건조제제 (3번, 4번, 5번) 의 성형 및 안정성에 대한 충진제의 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 히스티딘/아르기닌을 이용하여 조성물의 pH 를 조절한 (즉, pH 범위 선별 실험 II) 1주차 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 히스티딘/아르기닌을 이용하여 조성물의 pH를 조절한 (즉, pH 범위 선별 실험 II) 2주차 결과를 나타낸 것이다.

본 출원의 발명자들은 중추신경계의 손상을 치료하기 위한 펩타이드를 개발하였고, 이를 보다 실용화하기 위하여 많은 연구를 통해 펩타이드, 충진제, pH 완충제를 포함하는 조성물을 제공하였으며, 이러한 조성물은 다음과 같은 장점을 가지고 있다.

1. 약제 학적으로 만족스러운 외관을 갖는 하얀색의 성긴 동결 건조 덩어리를 제공하였으며, 충전제는 (하얀색 성긴 동결 건조 덩어리의) 붕괴 온도를 개선하고, 동결 건조 보호를 제공하고, 장기간 저장 동안 단백질의 안정성을 향상시키는 데 유리한 효과를 제공한다.

2. 비정질 유리질 매트릭스를 제공하고 수소 결합을 통해 단백질과 결합함으로써 건조 공정에서 제거된 물분자를 대체하여 펩타이드의 안정성을 향상시킨다. 이는 펩타이드의 형태를 유지하고 동결-건조 주기에서 펩타이드의 분해를 최소화함으로써 제품의 장기 안정성의 향상에 유리하다.

3. 환경 스트레스에 강하고, 장기간 보존시 제품의 분해가 일어나지 않으며, 외관, 순도 및 불순물 함량이 임상적 응용을 만족시킬 수 있다.

정의

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 본원에서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다.

본 출원에서 아미노산에 사용되는 단문자 또는 삼문자의 약자는 국제적인 관례를 따른다.

용어 "키메라 펩타이드" 는 천연적으로 서로 결합하지 않은 2개의 구성 펩타이드를 갖는 펩타이드를 의미하며, 상기 2개의 구성 펩타이드는 융합 단백질 또는 화학적 결합에 의해 결합될 수 있다.

"PDZ 도메인" 이라는 용어는 약 90개의 아미노산을 갖는 모듈 단백질 도메인을 지칭하는 것으로, 뇌 데커신 PSD-95, 파리 (Drosophila) 분리 연결 단백질 Discs-Large (DLG) 및 상피 밀착 연결 단백질 Z01 (Z01) 에 대해 예컨대 60% 이상의 현저한 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 한다. PDZ 도메인은 Discs-Large 상동성 반복 (DHRs) 및 GLGF 반복으로 불리기도 한다. PDZ 도메인은 일반적으로 예약 코어 공통적인 서열 (Doyle, D. A., 1996, Cell 85: 1067-76) 을 나타낸다. 예를 들어, 미국 출원 제10/714,537호에는 PDZ 도메인을 포함하는 단백질 및 PDZ 도메인 서열이 개시되어 있다.

용어 "NMDA 수용체" 또는 "NMDAR" 는 NMDA와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 막 관련 단백질을 의미한다. 이들 수용체는 인간 또는 마우스, 래트, 토끼, 원숭이 등과 같은 비인간이 될 수 있다.

용어 "특이적 결합 (specific binding)" 은 리간드 (ligand) 및 수용체 (receptor) 와 같은 두 분자 사이의 결합을 의미하며, 이는 다량의 서로 다른 분자가 존재하는 경우에서도 하나의 분자 (리간드)가 다른 특정 분자 (수용체)에 결합하는 능력, 즉 분자가 이질적인 분자 혼합물에서 하나의 분자가 다른 분자에 우선적으로 결합하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 수용체에 대한 리간드의 특이적인 결합도 라벨링되지 않은 리간드가 과량 존재하는 경우 수용체에 대한 검출표지 리간드의 결합이 감소하는 것으로 증명된다 (즉, 결합 경쟁 실험).

통계적으로 유의하게 p 값<0.05, 바람직하게는<0.01, 가장 바람직하게는<0.001이다.

용어 "기능성 변이체"는 모체와 동등 또는 유사한 생물학적 기능 및 성질을 갖는 변형을 의미한다. 비제한적인 예시로서, "기능성 변이체"는 모체에서 하나 이상의 보존적 치환을 통해 얻을 수 있다.

용어 "내재화 펩타이드"는 막 침투 펩타이드로 불리기도 하며, 이는 단백질 의약 분야에서 널리 사용되고 있으며, 이와 결합된 활성 펩타이드가 세포에 의해 섭취 및 흡수되는 것을 촉진하는 역할을 한다. 예를 들어, 상기 내재화 펩타이드는 Tat 펩타이드일 수 있고, 상기 Tat 펩타이드중 하나는 YGRKKRRQRRR (서열번호 2) 일 수 있다.

제1 양태로서, 본 출원은 펩타이드, pH 조절제 및 충진제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 YEKLLDTEI (서열번호 1) 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다. 상기 펩타이드는 본 출원에서 "활성 펩타이드" 라고도 지칭되며, 본 출원의 키메라 펩타이드는 중추신경계 손상 치료 또는 신경세포 보호제의 활성 부분으로 사용된다.

종래의 연구에 따르면, NMDAR과 PSD-95의 상호작용을 저해하는 일부 활성 펩타이드는 NMDAR에 기초한 구조이다. 예를 들어, NMDAR2B (GenBank ID 4099612) 는, C-말단 20개의 아미노산 FNGSSNGHVYEKLSSLESDV및 PL계열 ESDV를 갖는다. 기존의 일부 활성 펩타이드는 NMDAR2B의 C-말단 아미노산 서열의 일부를 선별하여 NMDAR2B와 PSD-95에 대한 경쟁적 저해를 유발하였다. 연구에 따르면, 상기 펩타이드 중 ESDV 또는 LESDV 세그먼트는 NMDAR와 PSD-95 단백질의 상호작용을 저해하는 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 출원의 발명자들은 이론에 구애받지 않고, 본 출원의 활성 펩타이드 YEKLLDTEI(서열번호 1)는 상기 NMDAR2B의 C-말단 아미노산에 대하여 KL 이후의 두 개의 SS 잔기를 포함하지 않고, PL 계열에 대하여 N-말단으로 부터 연장된 아미노산 서열 YEKL을 구비함으로써, 이러한 변경은 활성 펩타이드와 PDZ1/2 도메인의 상호작용을 향상시킬 수 있음을 의외로 확인하였다. YEKL에 대한 C-말단의 LDTEI는 변화될 수 있으며, 이는 활성 펩타이드의 활성에 영향을 주지 않거나 활성을 증가시킬 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 본 출원의 기능성 변이체은 서열번호 1로 기재되는 LDTEI 세그먼트에서 하나 이상의 보존적 치환을 통해 형성된 변이체이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 D와 E 사이의 치환, L, V와 I 사이의 치환, T와 S 사이의 치환 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

보다 구체적인 일부 실시예에 있어서, 기능성 변이체는 서열번호 1의 LDTEI 세그먼트를 LDTEL, LDTEV, LDTDI, LDTDL, LDTDV, LDSEI, LDSEL, LDSEV, LDSDI, LDSDL, LDSDV, LETEI, LETEL, LETEV, LETDI, LETDL, LETDV, VDTEI, VDTEL, VDTEV, VDTDI, VDTDL, VDTDV, IDTEI, IDTEL, IDTEV, IDTDI, IDTDL, IDTDV, IETEI, IETEL, IETEV, IETDI, IETDL 및 IETDV로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열로 치환하여 생성된 변이체이다.

일부 실시예에 있어서, 본원에 개시된 기능성 변이체는 상기 펩타이드와 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 당해 분야의 기술자들에 알려진 바와 같이, 두 단백질 간의 "동일성" 은 하나의 단백질의 아미노산 서열과 그의 보존적 아미노산으로 치환된 두번째 단백질의 서열을 비교함으로써 결정된다. 두 단백질 간의 동일성은 당해 분야의 기술자들에게 자명한 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 이용하여 판단된다. 두 아미노산 서열 간의 동일성은 BLASTP 알고리즘을 이용하여 판단하는 것이 바람직하다.

일부 실시예에 있어서, 본원에 개시된 기능성 변이체는 상기 펩타이드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5 이상의 아미노산 잔기를 갖는 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입을 가지므로써 상기 특정 펩타이드와 구별되는 펩타이드를 포함한다.

상술한 바와 같이, 본원의 기능성 변이체는 상술한 특정 펩타이드는 하나 이상의 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입에 의해 상기 특정 펩타이드와 구별될 수 있다. 이러한 변이체는 천연적으로 존재하는 것일 수도 있고, 합성에 의해 생성된 것일 수도 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 하나 이상의 펩타이드 서열을 변형하여 당해 분야에 공지된 다양한 기술 중 어느 하나에 따라 생물학적 활성을 평가할 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 YEKLLDTEI (서열번호 1) 또는 그의 기능성 변이체 및 내재화 펩타이드를 포함하는 키메라 펩타이드일 수 있으며, 상기 내재화 펩타이드는 상기 키메라 펩타이드가 세포에 의해 섭취되는 것을 촉진할 수 있다.

활성 펩타이드와 내재화 펩타이드를 결합시키는 목적은 주로 활성 펩타이드가 작용 표적에 잘 도달하도록 하기 위한 것이므로, 본 출원에 적용되는 내재화 펩타이드는 막 침투 및 내재화의 목적을 달성할 수 있는 한, 그 어떤 특정한 종류에 제한되지 않는다. 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 활성 펩타이드의 작용 표적이 주로 신경세포의 내부에 위치하므로, 바람직하게는 신경세포의 내재화 펩타이드에 특이적으로 적용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 내재화 펩타이드는 Tat 펩타이드일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 Tat 펩타이드의 아미노산 서열은 YGRKKRRQRRR (서열번호 2) 일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 키메라 펩타이드는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (서열번호 3) 를 포함한다.

상기 내재화 펩타이드는 아마이드 결합에 의해 활성 펩타이드와 결합하여 융합 펩타이드로 될 수 있으나, 예컨대 화학적 결합과 같은 다른 방법에 의해 결합될 수도 있다. 상기 두 성분의 결합은 커플링제 또는 결합제에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 샘플들은 상업적으로 입수가 가능한 것으로, S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991) 를 참고할 수 있다. 가교제의 예로는 J-숙신이미드-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPOP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드; N,N'-에틸리덴-비스-(아이오도아세트아미드) 또는 6 내지 11개의 카보닐렌브릿지를 갖는 기타 이러한 샘플 (티올 그룹에 상대적으로 특이함) 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 (아미노기 및 티로기와 비가역적 연결을 형성함) 등이 있다. 기타 가교제로는 (P),P'-디플루오로-m,m'-디니트로디페닐술폰 (아미노기 및 페놀기와 비가역적인 가교를 형성함), 디메틸디에틸아민헥사노에이트 (아미노기에 특이적임); 페놀-1,4-디설포닐클로라이드 (주로 아미노기와 반응 함); 1,6- 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 디이소티오시아네이트 또는 페닐아조-p-디이소시아네이트 (아미노 그룹과 주로 반응함), 글루타르알데히드 (여러개의 다른 측쇄와 반응함) 및 비스-디아조화벤지딘 (주로 티로신 및 히스티딘과 반응함) 등이 있다.

또한, 상술한 펩타이드는 선택적으로 아세틸화, 인산화 및/또는 당화와 같은 유도화 (derivativing) 가 가능하여 저해제와의 친화력을 촉진할 수 있으며, 세포막에 대한 저해제의 전달 능력을 촉진하거나 안정성을 촉진할 수 있다.

본 출원의 활성 펩타이드 및 이와 융합된 융합 펩타이드는 고상 합성 또는 재조합 방법에 의해 합성될 수 있다. 펩타이드 모방체 (peptidomimetics) 는, 예를 들어, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al . John Wiley & Sons, Inc ., NY, al-Obeidi (1998) Mol Biotechnol .9: 205-223 ; Hruby (1997) Curr .Opin .Chem .Biol .1: 114-119 ; 0stergaard (1997) MolDivers .3: 17-27 ; 0stresh (1996) Methods Enzymol .267: 220-234 등의 과학문헌이나 특허문헌에 기재된 다양한 방법 및 방법을 이용하여 합성될 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 상기 pH 조절제는 히스티딘 완충액, 아르기닌 완충액, 소듐 호박산 완충액, 포타슘 호박산 완충액, 소듐 시트레이트 완충액, 글루코네이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액 및 트리스 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 pH 조절제는 구연산/디소듐 포스페이트 완충액 또는 히스티딘/아르기닌 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 pH 조절제는 히스티딘/아르기닌 완충액으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 8 (예를 들면, 약 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8) 이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 6 내지 7.5이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 6 내지 7이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7이다. 일부 실시예에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 6.5이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 히스티딘/아르기닌 완충액 내의 히스티딘/아르기닌의 함량은 약 1% 내지 10% (예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10%) 일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 히스티딘/아르기닌 완충액 내 히스티딘/아르기닌의 함량은 약 3 ~ 10%이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 충진제는 트레할로스, 만니톨, 포도당, 락토스, 시클로덱스트린, 덱스트로스-40, 솔비톨, 수크로오스, 글리신 및 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 충진제는 트레할로스, 만니톨, 포도당, 유당 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 충진제는 트레할로스 (trehalose)이다.

일부 실시예에 있어서, 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 0.05 내지 1: 10일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 0.5 내지 1: 5일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 0.8 내지 1: 3 일 수 있다. 일부 실시예에서, 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 1이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 ± 0.5이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 조성물은 동결 보호제 및/또는 계면활성제를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게, 동결 보호제는 폴리에틸렌글리콜 및/또는 계면활성제는 폴리소르베이트이고, 바람직하게, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시예에 있어서, 상기 조성물은 탈 아미드화 억제제를 더 포함할 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 사전 동결건조제제의 형태, 동결건조제제의 형태 또는 동결건조제제와 수용액을 혼합하여 얻은 복원제 형태이다.

일부 실시예에 있어서, 본 출원의 조성물은 비경구, 정맥내, 피하, 동맥내, 두강내, 시스내, 복강내, 국소, 비강내 또는 근육내 형식으로 투여될 수 있다. 정맥내 투여가 바람직하다.

일부 실시예에 있어서, 비경구 투여를 위한 약학적 조성물은 멸균성 및 실질적으로 등투성을 갖는 약학적 조성물인 것이 바람직하다. 주사의 경우, 활성 펩타이드나 키메라 펩타이드를 포함하는 조성물을 수용액으로 제제화할 수 있으며, 바람직하게는 주입 부위의 불쾌감을 완화시키기 위하여 Hank's 용액, Ringer's 용액 또는 생리식염수 또는 아세트산 완충액과 같은 생리학적으로 호환 가능한 완충액으로 제제화할 수 있다. 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 부형제를 포함할 수 있다.

전술한 부형 물질 이외에 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드를 포함하는 조성물을 저장 제제로 제형화할 수 있다. 이러한 지속성성 제제는 피하 또는 근육내와 같은 임플란트에 의해 투여될 수도 있고, 근육내 주사에 의해 투여될 수도 있다. 따라서, 적절한 고분자 물질 또는 소수성 물질 (예를 들어, 수용성유 내의 에멀젼으로 제형화됨) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화될 수 있거나, 또는 난 용성 유도체 (예를 들어, 난 용성 소금)으로 제형화될 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 본 출원의 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드는 전하를 갖는 측쇄 또는 말단을 포함할 수 있으므로, 유리산이나 염기 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로 상기 그 어떠한 제형에도 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 실질적으로 유리염기의 생물학적 활성을 유지하고 무기산과 반응하여 제조되는 염이다. 약물 염은 해당 유리 염기의 형태보다 물 및 다른 프로톤 용매에 더 잘 용해되는 경향이 있다.

활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드는 예상 목적 (예컨대, 손상된 뇌졸중 및 관련 질환의 손상을 경감시키는 효과)을 효과적으로 달성할 수 있는 양으로 사용될 수 있다. 치료 유효량은 본 출원에서 제시한 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드로 치료하지 않은 환자 (또는 동물 모델) 의 대조군에서의 중추신경계 손상에 비해, 본 출원에서 제시한 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드로 치료한 환자 (또는 동물 모델) 에서 뇌졸중에 의한 손상을 현저히 감소시킬 수 있는 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드의 양을 나타낸다. 본 출원의 방법에 의해 치료되지 않은 대조군의 평균 결과 (경색 부피 또는 장애 지수 측정) 에 대비하여 치료를 거친 개체 환자가 더 좋은 결과를 달성한 경우, 이러한 양도 역시 치료효과가 있는 것으로 판단된다. 치료 대상 환자가 Rankin 척도에서 2 이하의 장애를 나타내고 Barthel 척도에서 75 이상을 나타내는 경우에도 치료효과가 있는 것으로 판단된다. 만일, 치료를 받은 환자군이 치료를 받지 않은 환자군에 비하여 장애 척도 상에서 현저히 개선된 분량분포 (즉, 장애가 더 적음) 를 보이는 경우에도 치료효과가 있는 것으로 판단된다 (Lees et al ., NEngl J Med 2006 ; 354: 588-600 참조). 치료적으로 효과적인 방법은 치료적으로 유효한 양과 상기 목적을 달성하기 위하여 필요한 투여 빈도의 조합을 의미한다. 일반적으로 단일 투여로도 충분하다.

일부 실시예에 있어서, 바람직한 투여량 범위는 뇌졸중 6시간 후 환자 체중 1kg 당 0.001 내지 20 μmol의 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드를 포함하며, 선택적으로 환자 체중 1kg 당 0.03 내지 3 μmol의 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 방법에 있어서, 상기 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드는 환자 체중 1 kg 당 0.1 내지 20 μmol의 양으로 6시간 동안 투여할 수 있다. 일부 방법에 있어서, 환자 체중 1kg 당 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드를 환자 체중 1kg 당 0.1 내지 10μmol, 보다 바람직하게는 환자 체중 1kg 당 약 0.3μmol의 양으로 6시간 동안 투여할 수 있다. 그 외의 경우에는 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드를 환자 체중 1kg 당 0.005 내지 0.5 μmol의 양으로 투여할 수 있다. 6.2로 나누어 서로 다른 표면적:질량 비를 보상함으로써 체중 kg 당 용량을 쥐에서 인간으로 환산할 수 있다. 그람인 경우, 사람의 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드의 적절한 양은 0.01 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/kg, 또는 0.01 내지 10 mg/kg, 또는 0.01 내지 1 mg/kg을 포함할 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드의 투여량은 피시술자, 피시술자의 체중, 고통의 정도, 투여 방식 및 처방의 의사의 조절에 의해 결정된다. 치료는 증상이 검출되거나 또는 검출될 수 없는 경우에도 반복될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 다른 약제와 함께 제공될 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 본 출원의 활성 펩타이드 또는 키메라 펩타이드의 치료학적으로 유효한 양은 독성을 유발하지 않으면서 치료적 이점을 제공할 수 있다. 키메라 펩타이드의 독성은 세포배양물 또는 실험동물에서 표준 약물단계를 통하여 측정될 수 있으며, 예를 들어 LD50 (50% 군사량) 또는 LD100 (100% 군사량) 을 측정하여 측정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과의 비율은 치료 지수이다. 바람직하게는 높은 치료지수를 나타내는 키메라 펩타이드 또는 펩타이드 모방체 (예를 들어, Fingl et al ., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, pp. 1 참고) 를 나타낸다.

일부 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 신경세포 보호제 또는 신경세포 손상 또는 손상으로 인한 질환 또는 통증의 치료, 개선 또는 예방용 약학적 조성물일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 신경계 손상은 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상으로 말초 신경이나 중추신경계에 위치한다.

일부 실시예에 있어서, 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상은 뇌졸중 또는 척수손상, 뇌졸중 또는 척수의 허혈성 또는 상처성 손상 및 중추신경계 (CNS) 신경세포의 손상 (급성 CNS 손상, 허혈성 뇌졸중 또는 척수의 손상을 포함함), 및 산소, 허혈, 기계적 손상 및 신경퇴행성 질환, 불안, 간질, 뇌졸중에 의한 손상을 포함한다. 일부 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 허혈성 뇌졸중에 의한 신경질환의 치료, 개선 또는 예방에 사용될 수 있다.

뇌졸중은 CNS에서 손상된 혈류에 의한 병증이다. 가능한 원인은 색전증, 출혈, 혈전 형성 등이 있다. 일부 신경세포는 손상된 혈류에 의해 즉시 사망한다. 이러한 세포들은 글루타메이트를 포함하는 구성 분자를 방출하고, 이러한 구성 분자는 NMDA 수용체를 활성화시키며, NMDA 수용체는 세포내 칼슘 및 세포내 효소의 수준을 증가시켜 더 많은 신경세포를 사멸시킨다 (흥분성 신경 독성 연쇄화 증폭). CNS 조직의 사망을 경색이라고 한다. 뇌졸중에 의한 병리적 손상의 정도를 나타내는 지표로 뇌졸중에 의해 치사된 신경세포의 부피를 사용할 수 있다. 증상적 효과는 경색 볼륨 및 뇌에서의 경색 위치에 따라 달라진다. 장애 지수로서는 Rankin (Rankin Stroke Outcome Scale, Rankin, Scott MedJ ; 2: 200-15 (1957) ), Barthel 지수 (Barthel Index) 등이 증상 손상에 대한 지표로 사용될 수 있다. Rankin 척도는 환자의 글로벌 병증을 직접 다음과 같이 평가하였다.

0: 전혀 증상이 없음.

1: 증상에도 불구하고 유의적인 장애가 없으며, 일상 업무와 활동을 모두 수행할 수 있음.

2: 경미한 장애; 이전의 모든 활동을 수행 할 수는 없지만 도움없이 자신의 업무를 처리 할 수 있음.

3: 약간의 도움이 필요하지만 도움없이 보행 가능함.

4: 중등 내지 중증 장애, 도움없이 보행 불가하고, 도움없이 자신의 신체적인 요구를 돌볼 수 없음.

5: 심각한 장애; 침대에 누워 일어날 수 없으며, 요실금 상태에 처하여, 지속적인 치료와 관심이 필요함.

Barthel 지수는 환자가 10명의 기본적인 일상 생활 활동을 할수 있는 능력에 대한 일련의 문제를 바탕으로 0과 100 사이의 점수를 얻었으며, 낮은 점수는 많은 장애를 나타낸다 (Mahoney et al ., Maryland State Medical Journal 14: 56-61 (1965)).

또는 뇌졸중 심각도/출력은 NIH 뇌졸중 척도를 사용하여 측정 할 수 있다. 상기 NIH 뇌졸중은 월드 와이드 웹 (ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf)에서 확인 가능하다. 이러한 척도는 환자의 의식 수준, 운동, 느낌 및 언어 기능 평가를 포함하여 11 가지 기능 세트를 수행 할 수 있는 환자의 능력을 기반으로 한다.

허혈성 뇌졸중은 뇌로의 혈류 흐름이 막혀서 발생하는 뇌졸중을 의미한다. 이와 같이 막힘 잠재성 질환은 일반적으로 혈관 벽을 따라 지방이 침착하는 경우가 많다. 이를 동맥경화라고 한다. 이러한 지방 침착물은 두 가지의 경색을 유도할 수 있다. 뇌혈전은 혈관의 폐색 부분에서 발생하는 혈전 (혈괴) 을 가리킨다. "일반적으로 뇌색전이라 함은 심장 내의 부착혈전, 동맥경화의 반점, 지방, 종양세포, 섬유연골 또는 공기 등과 같은 혈액 내의 각종 전혈이 뇌동맥으로 이동하여 혈관을 막고, 측지순환이 불가할 경우 뇌조직의 허혈성 괴사를 유발하여 국소적인 신경기능이 상실되는 것을 가리킨다. 색전증의 두 번째 중요한 이유는 불규칙적인 심박동으로, 이는 동맥근섬유 떨림이라고 불리기도 한다. 이는 혈소체가 심장에 형성되어 뇌로 이동하여 전달될 수 있는 질환을 유발한다. 허혈성 뇌졸중의 또 다른 잠재적인 원인은 출혈, 혈전증, 동맥 또는 정맥의 절단, 심장 박동, 출혈을 포함한 그 어떠한 원인에 의해 유발된 쇼크, 뇌혈관 또는 안내뇌의 혈관에 대한 직접 수술 손상 또는 심장 수술과 같은 의학적 원인이다. 허혈성 뇌졸중은 모든 뇌졸중의 약 83%를 차지한다.

기타 다른 신경병증들도 NDMAR에 의해 매개되는 흥분성 신경 독성에 의해 신경사멸을 일으킬 수 있다. 이러한 질환은 신경퇴행성 질환, 불안, 간질, 산소 부족, 뇌졸중과 관련없는 상처성 뇌손상, 척수손상 등의 CNS에 대한 상처를 포함한다. 따라서, 본 출원의 조성물은 알츠하이머병, 근위축성 측부성 경화증 (ALS), 파킨슨병 또는 헌팅톤병을 포함하는 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질의 치료, 개선 또는 예방용으로 사용될 수 있다.

일부 실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 동결건조제제의 형태, 또는 동결건조제제의 형태 또는 동결건조제제와 수용액을 혼합하여 얻은 복원제 형태이다.

제2 양태로, 본원에서 는신경계 손상 및 신경계 손상, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질과 관련된 질환 또는 통증을 치료, 개선 또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 이를 필요로하는 대상에게 제1 양태에 따른 약제 학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다

일부 실시예에 있어서, 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상은 뇌졸중 또는 척수손상, 뇌졸중 또는 척수의 허혈성 또는 상처성 손상 및 중추신경계 (CNS) 신경세포의 손상 (급성 CNS 손상, 허혈성 뇌졸중 또는 척수의 손상을 포함함) 및 저산소증, 허혈, 기계적 손상 및 신경퇴행성 질환, 불안, 간질, 뇌졸중에 의한 손상을 포함한다.

일부 실시예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 근위축성 측파경화증 (ALS), 파킨슨병 또는 헌팅톤병을 포함한다.

일부 실시예에 있어서, 상기 개체는 허혈성 뇌졸중을 겪고 있는 개체이다. 일부 실시예에 있어서, 본 출원의 제1 양태에 따른 약학적 조성물은 뇌허혈로 인한 뇌경색부의 부피를 감소시킬 수 있다.

제3 양태로, 본원에서는신경계 손상 및 신경계 손상, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질, 또는 신경 보호제의 제조와 관련된 질환 또는 통증을 치료, 개선 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서, 제1 양태에 따른 약학적 조성물의 용도가 제공된다

일부 실시예에 있어서, 상기 약물은 허혈성 뇌졸중에 의한 신경질환의 치료, 개선 또는 예방에 사용된다.

이상의 상세한 설명은 본 출원의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.

실시예

하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 출원의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 활성 펩타이드 분자의 선별

연구 결과에 따르면, Tat 막 침투 펩타이드 YGRKKRRQRRR (서열번호 2) 을 선별하고 서로 다른 수의 아미노산을 연결시키 펩타이드 라이브러리를 제조하였다. 펩타이드 라이브러리 내의 키메라 펩타이드 분자를 각각 in vitro에서 발현되어 정제된 PDZ1/2 도메인과 상호작용시키고, 상호작용력의 강약에 따라 폴리펩타이드를 1차 선별하였다.

고정된 분자 (리간드) 는 PDZ1/2 단백질, 분자량: ~ 20kD, 농도: 2mg/ml, 이동상의 분자 (분석물): 폴리펩타이드, 분자량: ~ 2kD, 농도: 10mg/ml . CM5 칩은 Biacore 3000 기기를 사용하여 고정하였다. 전기영동 완충액은 PBS + 0.005% Tween 20을 사용하였다. 고정은 아미노 커플링 (amino coupling) 방법을 사용하였다. 리간드의 농도는 10 ㎍/㎖ 이었다. 고정 완충액은 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.0 이다. 고정량: 1400RU이고 유동세포 2에 고정하였다. 이때 사용된 유속은 10 ㎕/ml 이었고, 리간드는 1분 동안 주입하였다. 재생액으로 PH2.0 + 2.5의 10 mM Gly를 사용하여 분당 30 ㎕ 의 유속으로 재생하였다. 유입시간은 30s이다.

동역학 분석은 대조군 채널: 유동세포 1, 전기영동 완충액: PBS, Kinetic Analysis Wizard 모드 사용, 농도 구배 6.25n, 12.5n, 25n, 50n, 100n, 200n, 400nM, 주입시간 1분, 해리시간 2분, 유속 30 ㎕/분의 조건으로 수행하였다.

데이터는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 피팅하였다. 피팅 모델은 1: 1 결합 모델이다. 해리상수 (KD) 값은 작용력에 반비례한다.

PDZ1/2 도메인과 강한 상호작용을 갖는 키메라 펩타이드를 선별하여 P5로 명명하였으며, 서열은 다음과 같다.

P5: YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (서열 번호: 3)

종래에 보고된 유사 키메라 펩타이드와 직접 비교하기 위하여, 대조군 키메라 펩타이드 NA-1을 도입하였으며, 그 서열은 다음과 같다.

NA-1: YGRKRRQRRRKLSSIESDV (서열번호: 4)

또한 P5와 NA-1의 구조적인 차이를 비교하여 키메라 펩타이드 NA-1의 활성 펩타이드의 N-말단에 YE 2개의 잔기가 첨가된 키메라 펩타이드 YE-NA-1을 추가로 도입하였으며, 그 서열은 다음과 같다.

YE-NA-1: YGRKKRRQRRRYEKLSSIESDV (서열번호: 5)

키메라 펩타이드 NA-1, 키메라 펩타이드 YE-NA-1 및 P5에 대해, 상기와 같은 PDZ1/2 도메인 상호작용 실험을 동시에 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

세가지 종류의 키메라 펩타이드와 PDZ1/2 도메인 상호작용 검사

키메라 펩타이드	NA-1	YE-NA - 1	P5
KD （ M ）	7.53E-08	5.44 E-08	2.99E-08

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 키메라 펩타이드 YE-NA-1 및 P5는 대조군 키메라 펩타이드 NA-1에 비하여 PDZ1/2 도메인과 상호작용이 강하고, 또한 P5의 작용 특성이 우수함을 알 수 있다. 이에 본 출원자들은 활성 펩타이드의 N-말단에 추가적인 YE 2개의 아미노산 잔기가 폴리펩타이드와 PDZ1/2 도메인 사이의 상호작용을 어느 정도 증가시킴을 추정하였다. 또한 P5는 YE-NA-1의 카르복실 말단에 대하여 소수성이 약한 세린 (SS) 2개를 감소시켰으며, 이는 폴리펩타이드와 PDZ1/2 도메인의 상호작용을 더욱 증가시킬 수 있음을 추측하고 있다.

키메라 펩타이드 P5는 하기 실험에서 추가로 테스트하였으며, 일부 실험에서는 대조군으로 NA-1과 YE-NA-1을 사용하였다.

실시예 2: Pull-down 실험에 의한 P5와 PDZ1/2 도메인의 상호작용 측정

P5가 PDZ1/2 도메인과 상호작용할 수 있음을 증명하기 위하여 Pull-down 실험을 수행하였다.

컬럼은 His 비드 100 ㎕ 와 MCAC-0 완충액 1 ㎖ 로 5분 동안 평형시켰다. 4

에서 진탕하였다. 4 ℃ 에서 1분간 5000g의 원심분리하였고 상청액을 버렸다. 상기 혼합물에 PDZ1/2 단백질 1mg을 첨가하여 완충액 1ml로 보정하였다. 4 ℃ 에서 1시간 동안 회전 결합시켰다. 상기 혼합물을 4 ℃ 에서 1분간 5000g 원심분리하였고 상청액을 버렸다. MCAC-0 완충액 1 ㎖ 로 5분씩 3회 세척하였다 (4 ℃ 진탕세척). 상기 혼합물에 P5 단백질 1 mg을 첨가하여 완충액 1 ㎖ 로 보정하였다. 4 ℃ 에서, 상기 혼합물을 2시간 동안 회전 결합시켰다. 상기 혼합물을 4 ℃ 에서 1분간 5000g 원심분리하였고 상청액을 버렸다. 1 ㎖ 의 해리액으로 5분씩 3회 세척하였다 (4 ℃ 진탕세척). 세척 후 MCAC-300 20 ㎕ 를 첨가하였다. 원심분리 후 용리액을 취하여 SDS-PAGE로 검사하였다. 실험 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 키메라 펩타이드 P5의 용출 밴드에는 P5및 PDZ1/2 도메인이 동시에 포함되어 있으므로, 이로부터 키메라 펩타이드 P5가 PDZ1/2 도메인과 결합할 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 3: 키메라 펩타이드의 래트 MCAO 모델에 대한 치료 효과

MCAO 제조 방법 및 평가 기준:

국소 뇌 허혈-재관류 모델은 래트 뇌의 해부학적 구조를 고려하여 수정된 Longa에 의해 제안된 가역적 중뇌 동맥 폐쇄 (MCAO) 봉합법에 따라 제조되었다. 10% 클로로포름알데하이드 (chloroformaldehyde) 0.3ml/kg으로 복강 마취하고, 경동맥 (CCA), 경외동맥 (ECA) 및 패개동맥을 노출시키고, 모노 필라멘트 나일론 낚싯줄 (0.26mm)의 헤드 부분 (0.5cm)을 파라핀 (paraffin) 으로 피복하여 20mm의 위치에 표식하였다. 모든 래트는 우측 CCA의 절개부위를 통하여 삽입하였으며, 패개동맥은 오삽입을 방지하기 위하여 일시적으로 고정하였다. 폐색선의 길이는 동물의 체중에 따라 CCA의 분기점으로부터 약 18-20mm였으며, 이에 따라 우측의 중간 대뇌 동맥이 폐색되었다. 이어서 피부를 꿰매고 폐색선의 끝부분을 부분적으로 피부에 고정시켰다. 2 시간 동안 허혈 기간 후, 폐색선을 조심스럽게 당겨 재관류를 형성하였다. 모의 수술군은 나일론 낚시줄을 삽입하지 않은 것 외에, 나머지 단계들은 수술군과 동일하다. 허혈기간 및 재관류 후 2h는 체온을 (37 ± 0.5)℃ 로 유지하였다. 모델 성공의 표시는 래트가 수술 마취로 깨어난 후 왼쪽 팔다리가 불안정하고 안정적으로 서있질 못하며, 꼬리를 들어 올렸을 때 한쪽으로 회전하는 것이 모델 성공의 판단 기준이다.

신경학적 기능 결함 징후는 Longa 및 Bederson의 5점법을 기준으로 하여 동물의 마취 후 24h에서 평가하였다.

0점: 신경계 손상이 없는 증상;

1점: 반대편 앞꿈치가 완전히 펼쳐지지 않음;

2점: 반대편으로 회전함;

3점: 반대편으로 쓰러짐;

4점: 자발보행이 불가능하여 의식이 상실됨.

점수가 높을수록 동물의 행동 장애가 심함을 나타낸다.

실험용 동물 및 소재

동물: 성인 SD 래트 (Vittalia), SPF 등급, 체중 220-250g, 수컷

기구 및 약품: 1 개의 가위, 2 개의 눈 수술 가위, 4 개의 곡선 집게, 4 #, 5 # 수술 봉합사, 6 Х 17 삼각 바늘, 폐색선 (직경 0.26 mm) 및 바늘 홀더 1 개. Enbipu 염화나트륨 주사 용액 (Shijiazhuang Group NBP Pharmaceutical Co., Ltd.), 염소 수화물, 푸로 세 미드 (20mg/vial), 겐타 마이신 설페이트 (80mg/vial), 면봉 및 의료용 트레이 등. 폴리펩타이드는 Kingsray Biotech Inc.에 의해 합성되었다.

실험 그룹화

실험 동물을 음성 대조군, 모의 수술군, 모델군, 양성 약물 Enbipu 군, NA-1 군, YE-NA-1 군 및 P5 군으로 나누었다. 허혈후 1h 내에 생리 식염수, 양성 약물 Enbipu , NA-1 (10 mg/kg), YE-NA-1 (10 mg/kg), P5 (10 mg/kg), P5 (3 mg/kg), P5 (1 mg/kg) 을 각각 꼬리 정맥주사로 투여하였다. 정상군과 모의 수술대조군은 어떠한 약물도 투여하지 않았다.

경색 부피 계산

채점 후 래트는 참수로 사망시켰으며, 뇌 조직을 신속하게 제거하고 -20 ℃ 의 냉장고에 두었다. 10분 후 실온에 방치한 후 뇌를 래트의 뇌 절편틀에 넣고 후구를 적출한 후, 소뇌와 하위 뇌를 적출하여 2 ㎜ 간격으로 크라운 모양의 오칼리를 적출하여 도 1에 도시된 바와 같이 6개의 뇌가 연속적으로 크라운 모양이 조밀한 절편을 만들었다. 그 후, 2% TTC가 들어있는 용액 5ml에 신속하게 뇌판을 넣고 37 ℃ 로 온도를 유지하여 30분 동안 빛을 피하여 배양한 후, 5분 간격으로 뇌판을 1회 흔들어 주었다. TTC 염색 후 정상 조직은 장미색을 띠고 경색 조직은 염색되지 않고 하얀색을 띠었다. 각 그룹의 뇌를 정돈하고 사진을 찍어서 보관하며, 영상분석시스템 소프트웨어 처리 및 통계를 진행하였다. 각 뇌경색 면적을 계산하고, 각 뇌경색 면적에 두께 2mm를 곱하였다. 개별 뇌 부분의 경색 면적과 두께의 적을 합산하여 각 동물의 뇌 경색 부피를 획든하였다. 부피는 뇌 부종의 영향을 제거하기 위해 뇌 반구에서 차지하는 백분율로 표현되었다.

실험결과

실험 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2의 뇌경색 부피에 대한 데이터를 통계적으로 분석하여 도 3에 도시된 바와 같은 뇌경색 부피 데이터에 대한 통계적 히스토그램을 작성하였으며, 뇌경색 부피에 대한 구체적인 통계적 데이터는 하기 표 2에 나타내었다. 그 결과, P5의 가장 높은 투여량 (10 mg/kg) 의 치료 및 예방투여는 뇌출혈 래트의 뇌경색 부피의 50% (p<0.01) 를 유의적으로 감소시켰으나, 양성 약물 Enbipu 투여군은 16% (p<0.01), NA-1군은 16% (p<0.01), YE-NA-1군은 26% (p<0.01) 밖에 감소시키지 못하였다. P5의 차고용량 (3mg/kg) 의 치료 및 예방투여도 뇌경색의 부피를 상당히 줄였다. 또한, P5의 투여량이 증가함에 따라 경색 부피가 감소하는 수치가 감소함을 알 수 있으며, 치료효과는 약물의 농도와 긍정적 관련이 있음을 알 수 있다. 여기서, YE-NA-1 폴리펩타이드가 NA-1 폴리펩타이드에 비하여 치료효과가 현저히 우수한 것을 확인할 수 있으며, 본 출원자들은 YE 2개의 아미노산의 첨가가 PDZ1/2 도메인과의 상호작용을 증가시켜 NA-1 폴리펩타이드에 비하여 우수한 치료효과를 나타냄을 추측하고 있다.

래트 MCAO 모델에 대한 P5 폴리펩타이드의 치료 효과

그룹	경색 부피 평균 백분율(%)	표준 편차	모델군 대비 뇌경색 감소 백분율 (%)	모델군 대비 T검사	P5-10 mg/kg 대비T검사
정상군	0	0
모의 수술군	0	0
모델군	45.96	3.35
양성 약물 Enbipu 군	38.61	3.21	15.99	p<0.01
NA-l 10 mg/kg	38.56	2.25	16.10	p<0.01	p<0.01
YE-NA-1 10 mg/kg	33.96	2.40	26.11	p<0.01	p<0.01
P5-10 mg/kg	24.84	2.90	45.95	p<0.01
P5-3 mg/kg	36.54	2.35	20.50	p<0.01
P5-1 mg/kg	43.22	3.12	5.96	0.061
P5 예방 투여10 mg/kg	19.54	2.30	57.48	p<0.01
P5 예방 투여3 mg/kg	35.66	1.50	22.41	p<0.01
P5 예방 투여1mg/kg	44.23	2.20	3.76	0.082

실시예 4: P5의 래트 뇌 내 분포

정상 대조군 래트와 MCAO 모델로 모델을 조제한 후 1hr내, 각각 꼬리정맥을 통해 생리염 형광으로 표지된 폴리펩타이드 FITC-P5/10 mg/kg을 각각 주사하고 투여 후 12시간 후에 래트를 사명시켜 뇌조직을 빠르게 적출하여 소형 동물 생체 영상 시스템 장치에 넣고 형광을 측정하였다. 형광 검출이 완료되면 뇌조직을 TTC 염색액에 넣어 염색하여 허혈부위와 약물분포의 상관관계를 판단하였다. 도 4 및 도 5에서 보이는 바와 같이, 정상 래트의 뇌는 형광 표지된 폴리펩타이드가 분포하는 TTC에 의해 완전히 염색되고, 허혈 래트의 허혈 부위는 TTC에 의해 염색되지 못하고, 중동맥 부위를 중심으로 하는 허혈 부위에 형광 표지된 폴리펩타이드가 분포되어 있다. 이러한 경우, 상기 폴리펩타이드 P5가 허혈 부위에 표적으로 분포하여 치료 효과를 발휘함을 알 수 있으며, 그 분포량은 허혈 정도에 비례함을 알 수 있다.

실시예 5: HE 염색을 통한 조직학적 변화 관찰

각 그룹의 래트는 허혈 24h 후 참수로 사망시켜, 뇌를 취해약 4 mm의 두께로 시신 경계 근처에서 관상으로 절개하여, 10% 포르말린 용액으로 절편들을 고정시켰다. 70% 내지 100% 알콜농도 구배로 탈수시킨 후 자일렌에 2회 투명화하고 파라핀에 포매하였다. 파라핀 덩어리를 조심스럽게 트리밍하고, 파라핀 슬라이싱 기계에 고정시키고, 두께가 4 ㎛ 인 절편으로 슬라이스 하였다. 파라핀 부분을 완전히 펼쳐 깨끗하게 건조된 유리 슬라이드에 부착한 후 4 ℃의 냉장고에 보관하였다. 통상의 HE 염색을 실시하고, 광학 현미경으로 염색한 결과를 관찰하였다.

실험 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 정상 뇌조직 신경세포의 핵이 뚜렷하고 핵이 원형이며 핵막이 완전한 것으로 나타났으며, 허혈 모델 래트의 허혈측 뇌조직에서 심각한 신경세포 괴사, 세포부전, 세포핵 농축, 세포에 엉성하고 옅은 염색 및 진공화가 관찰되었으며, P5, 10 mg/kg 치료 및 예방투여군은 상기와 같은 병리학적 변화가 유의적으로 개선되었으며, 그 결과 양성 약물 Enbipu의 주사액, NA-1 및 YE-NA-1, 10 mg/kg 보다 우수한 결과를 나타내었다.

실시예6: 급성독성시험

래트를 이용하여 급성독성시험을 실시하였다. 그 결과, 체중 200 mg/kg의 투여량에서 P5의 래트에 대해 치명적인 효과 및 기타 현저한 독성적인 부작용이 없음을 관찰하였다.

실시예 7: P5 동결건조제제의 제조방법

이하에서는 충진제로 트레할로스, pH 조절제로 아르기닌 용액을 예로 들어 동결 건조제제의 제조방법을 설명하고, 나머지 동결 건조제제는 유사한 방법으로 제조하였다.

P5 동결건조제제의 제조는 다음과 같이 진행된다.

5% 아르기닌 용액을 준비하였다;

트레할로스, P5 펩타이드 각각을 측정하였다;

주사용수 80%를 넣고 교반하여 완전히 용해시켰다;

아르기닌 용액을 첨가하여 pH를 6.5 ± 0.5로 조절하였다;

물을 전량 보충하여 균일하게 교반한다;

각각 0.45μm, 0.22μm 필터를 이용하여 여과한다;

여액을 세린병에 담아 반-부가한다;

진공동결건조: -30 ℃ 에서 3h 유지; 승화: -20 ℃ 에서 3h 유지, -10 ℃ 에서 5h 유지, 5 ℃ 에서 10h 유지; 재건조: 30 ℃ 에서 5h 유지;

진공 밀봉을 수행한다;

알루미늄-플라스틱 결합 캡 추가한다.

실시예8: P5 동결건조제제의 성형, 안정성에 대한 충진제의 영향

시험방법:

다양한 충진제를 선택하여 P5 동결건조 제제의 성형 및 안정성을 분석하고, 샘플을 60

하에서의 안정성 시험기에 2주 동안 방치하여 1주차 때 및 2주차 때 각각 샘플링하여 검사하였다. 충진제로서 트레할로스, 시클로덱스트린, 만니톨, 유당 및 포도당을 각각 사용한 경우의 성질, 용액 청정도 및 색상, pH, 불순물 물질 및 P5 함량을 관찰하였다.

충진제 및 사용량의 배합비

실험번호	0	1	2	3	4	5
P5 함량	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g
충진제	/	트레할로스 1.0g	사이클로덱스트린 1.0g	만니톨 1.0g	유당 1.0g	포도당 1.0g
물	20ml	20ml	20ml	20ml	20ml	20ml
주입량/병	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml

실시예 8에 사용된 샘플의 사양정보

번호	명칭	규격	제조사	로트 번호
1	P5	주사등급	항우주중타이합성제조	CQ-04-00317
2	트레할로스	약용등급	Pfanstiehl	38540A
3	하이드록시프로필베타 시클로덱스트린	약용등급	산둥 빈저우 지왠	20160309-1
4	만니톨	약용등급	난닝화확제약	F431C
5	유당	약용등급	진쟝캉푸생물	20160510
6	포도당	약용등급	시왕제약산업	201605133
7	아세토니트릴	크로마토그래피	Mereda
8	트리플루오로아세트산	크로마토그래피	Mereda

검사 방법:외관: 검사대상이 하얀색의 성긴 건조덩어리 또는 분말이어야 함.

용액의 청정도 및 색상: 샘플 한 개를 취하여 물 1ml를 가하여 녹이고, 용액은 맑고 무색이여야 함. 용액이 탁한 경우, 1호 탁도 표준액 (통기식 0902 1법) 과 비교하여 이보다 더 짙어서는 안 된다. 용액이 착색될 경우, 황색 1호 표준액 (중국 약전 4구 통기식 0901 1법) 과 비교하여 이보다 더 짙어서는 안 된다.

pH: 용액 청정도 및 색 요건을 충족하는 용액 추출하여, 중국 약전4구 통기식 0631 배액 농도 측정법 기준으로 샘플을 측정하였다.

불순물계 물질:

고성능액체크로마토그래피법에 따라 측정하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다.

컬럼: Agilent C18 (4 . 6 mm x 150 mm, 5 ㎛ )

이동상: A: 0.065% TFA-물, B: 0.05% TFA-아세토니트릴

용출방식: 구배 용출, 0 ~ 30분 5 ~ 65% B ; 유속: 1.0 ㎖/min: 칼럼 온도: 36 ℃ ; 검출파장: 220 ㎚, 주입량: 10 ㎕

P5 펩타이드 적량을 취하여 물을 가하여 용해시키고, P5 펩타이드 1 ㎖ 당 약 2 ㎎ 을 함유하는 용액을 제조하여 대조군으로 하였다.

샘플을 취하여 물을 가하여 용해시키고 희석하여 1 ㎖ 당 약 2 ㎎ 를 함유하는 용액을 제조하여 측정하고자 하는 샘플로 하였다. 상기 용액을 정밀하게 10 ㎕ 씩 취하여 액체 크로마토그래피에 주입하여 크로마토그램을 기록하였다. 외부표준법의 피크 면적에 따른 함량을 계산하고, 면적 정규화법의 불순물 물질을 계산한다.

최종적으로 표준탁도 용액의 청정도 측정 결과와 비교하여 측정하고자 하는 샘플의 청정도를 결정하였다.

실험결과

P5 동결건조 제제의 성형 및 안정성에 대한 충진제의 영향 (0일)

충진제 선별 (0일)
실험번호	충진제	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	불순물
0	/	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.88	109.27%	미검출
1	트레할로스	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.83	105.34%	미검출
2	사이클로덱스트린	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.98	103.97%	미검출
3	만니톨	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.90	111.40%	미검출
4	유당	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.70	107.60%	미검출
5	포도당	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	5.73	100.88%	미검출

P5 동결건조제제의 성형 및 안정성에 대한 충진제의 영향

충진제 선별 (60℃ 1주)
실험번호	충진제	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	/	하얀색의 성긴 덩어리 (약간 위축됨)	맑음, 무색	6.07	107.91	0.53	1.04
1	트레할로스	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.76	105.35	0.21	0.30
2	사이클로덱스트린	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.89	102.42	0.89	1.36
3	만니톨	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	6.09	103.05	1.34	3.91
4	유당	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.57	64.89	10.47	38.82
5	포도당	노란색 덩어리 (현저히 위축됨)	맑음, 색상 > 10번 노란색	4.62	57.58	75.28	75.51

P5 동결건조제제의 성형 및 안정성에 대한 충진제의 영향 (제2주)

충진제 선별 (60℃ 2주)
실험번호	충진제	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	/	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리 (약간 위축됨)	맑음, 무색	5.77	106.97	0.72	1.34
1	트레할로스	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.97	105.63	0.19	0.25
2	사이클로덱스트린	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	6.30	101.04	1.01	1.72
3	만니톨	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	6.29	102.05	1.61	4.66

불순물 물질의 경우 0일째에 각각의 샘플 (0번 내지 5번) 에서는 불순물 물질이 검출되지 않았다. 1주차 때 1번 (트레할로스) 의 최대 단일 불순물이 0.21%, 총 불순물이 0.3%로 대조구 (0번)보다 현저히 낮았으며, 이는 트레할로스가 확실히 보호 작용을 발휘함을 의미한다. 한편, 2번부터 5번까지의 불순물들의 함량을 살펴보면, 최대 단일 불순물과 총 불순물이 1번 (트레할로스)에 비해 차이가 있음을 알 수 있으며, 이는 시클로덱스트린, 만니톨, 유당 및 포도당이 트레할로스에 비해 보호 작용에 있어서 그다지 우수하지 않음을 알 수 있다.

성질의 경우, 트레할로스, 시클로덱스트린, 만니톨, 락토오스는 1주차 때 모두 하얀색의 성긴 건조덩어리 상태를 유지하지만, 대조군은 약간의 위축성을 보였으며, 5번 (포도당) 에서는 심한 위축성을 보였고 노란색 덩어리로 나타났다. 트레할로스, 시클로덱스트린, 만니톨은 2주차 때에도 여전히 하얀색의 성긴 건조덩어리 상태를 유지하지만, 대조군은 약간 위축되었다.

pH는 1주차와 2주차에서 0번과 1번의 pH 변화가 별로 없었으며, 1주차 때 4번과 5번 샘플의 pH가 떨어지고, 2주차 때 2번과 3번 샘플의 pH가 증가하였다.

청정도 및 색상의 경우 1주차 때 0번부터 4번까지 모두 무색을 띄고, 5번은 맑고, 색상이 노란색으로 변하였다. 2주차 때에는 0번부터 3번까지 모두 맑고 무색으로 나타났다.

상기 분석을 종합하면, 성질, 용액청정도 및 색상, pH, 불순물계 물질 및 함량을 종합적으로 고려하여 다음 단계 시험의 충진제로서 트레할로스를 선정하였다.

실시예 9: P5 동결건조제제의 성형, 안정성에 미치는 영향

트레할로스의 함량을 달리할 경우 P5 동결건조제제의 성형 여부를 관찰하였으며, 상기 실시예 8의 검사방법을 참조하였다.

트레할로스 사용량 선별 실험 I의 샘플 조성물 (P5: 트레할로스 = 1: 0, 1: 0.25, 1: 0.5, 1: 0.75 및 1: 1).

실험번호	0	1	2	3	4
P5	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g
트레할로스	/	50mg	0.10 g	0.15 g	0.20g
물	2ml	2ml	2ml	2ml	2ml
주입량/병	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl

트레할로스 사용량 선별 실험 II의 샘플 조성물 (P5: 트레할로스 = 1: 1.5, 1: 2, 1: 3, 1: 4 및 1: 5).

실험번호	5	6	7	8	9
P5	0.10 g	0.10 g	0.10 g	0.10 g	0.10 g
트레할로스	0.15 g	0.20g	0.30g	0.40g	0.50g
물	2ml	2ml	2ml	3ml	4ml
주입량/병	100 μl	100 μl	100 μl	150 μl	200 μl

각각의 샘플을 60 ℃ 안정성 시험기에 2주 동안 방치하여 1주차 및 2주차 때 각각 샘플링하였다. 다양한 P5: 트레할로스 비율로 실험할 경우, 각 샘플의 성질, 용액의 청정도 및 색상, pH, 불순물 물질 및 함량을 관찰하였다.

트레할로스 사용량 선별 실험 I의 결과 (0일), 충진 규격이 10 ㎎/병이며, 7 ㎖ 의 시린 병을 사용하였다.

트레할로스 사용량 선별 실험 I (0일)
실험번호	P5: 트레할로스	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	/	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.92	91.19	0.10	0.10
1	1:0.25	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.89	88.15	0.10	0.10
2	1:0.5	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.73	89.68	0.10	0.11
3	1:0.75	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.89	87.18	0.09	0.10
4	1:1	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.93	88.84	0.08	0.10

트레할로스 사용량 선별 실험 I의 결과 (1주차)

트레할로스 사용량 선별 실험 I (60 ℃, 1주차)
실험번호	P5: 트레할로스	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	/	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.10	87.68	0.65	1.78
1	1:0.25	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.53	85.34	0.51	1.27
2	1:0.5	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.40	89.56	0.23	0.48
3	1:0.75	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.22	89.87	0.18	0.21
4	1:1	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.16	87.61	0.17	0.17

트레할로스 사용량 선별 실험 I의 결과 (2주차)

트레할로스 사용량 선별 실험 I (60 ℃, 2주차)
실험번호	P5: 트레할로스	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	/	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.88	87.91	0.88	2.74
1	1:0.25	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.97	87.48	0.51	1.15
2	1:0.5	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.89	92.77	0.37	0.88
3	1:0.75	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.77	90.66	0.29	0.52
4	1:1	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.81	91.10	0.26	0.47

트레할로스 사용량 선별 실험II의 결과 요약. 충진 규격 5mg/병, 세린병 7ml를 사용하였다.

트레할로스 사용량 선별 II (0일)
실험번호	트레할로스: P5	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
5	1: 1.5	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.98	106.63	0.03	0.03
6	1: 2	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.89	97.19	0.05	0.05
7	1: 3	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.92	94.95	0.05	0.05
8	1: 4	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.83	99.88	0.03	0.03
9	1: 5	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.86	101.34	0.04	0.04
트레할로스 사용량 선별 II (60 ℃, 1주)
실험번호	트레할로스: P5	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
5	1: 1.5	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	6.18	98.13	0.23	0.30
6	1: 2	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.95	90.87	0.19	0.35
7	1: 3	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.64	87.27	0.17	0.30
8	1: 4	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.78	93.75	0.22	0.33
9	1: 5	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	6.33	95.45	0.23	0.31
트레할로스 사용량 선별 II (60 ℃, 2주)
실험번호	트레할로스: P5	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
5	1: 1.5	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.83	94.59	0.30	0.59
6	1: 2	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.99	91.89	0.26	0.55
7	1: 3	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	7.20	86.25	0.27	0.52
8	1: 4	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.88	92.82	0.23	0.46
9	1: 5	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.95	94.42	0.23	0.47

각각의 샘플을 40 ℃ 안정성 시험기에 각각 3개월 동안 방치하여 1달 말과 3달 말에 각각 샘플링을 하여 측정하였다. 다양한 P5: 트레할로스 비율을 사용하는 경우, 각 샘플의 성질, 용액의 청정도 및 색상, pH, 불순물 물질 및 함량을 관찰하였다.

트레할로스 사용량 선별 실험 I (40 ℃)의 결과. 충진 규격 0.1 ㎖/병 (10 ㎎), 7 ㎖ 의 세린병 사용.

충진제 사용량 선별 (40 ℃, 1개월)
실험번호	P5: 트레할로스	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	1:0	하얀색 동결건조체	맑음, 무색	7.05	91.52	0.98	1.09
1	1:0.25	하얀색 동결건조체	맑음, 무색	7.08	86.94	1.07	1.16
2	1:0.5	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	7.07	91.43	0.85	0.92
3	1:0.75	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.99	90.36	0.84	0.92
4	1:1	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	맑음, 무색	6.94	90.36	0.80	0.88

실험 결과:불순물들의 경우, 60 ℃ 에서 1주차 또는 2주차 때 샘플 1 내지 샘플 9 (최대 단일 불순물 및 총 불순물) 가 대조군 (0번) 에 비하여 현저히 낮았으며, 이는 트레할로스가 현저한 보호작용을 발휘함을 의미한다. 실험 I (P5: 트레할로스 = 1: 0.25 ~ 1: 1) 의 경우, 트레할로스의 사용?이 증가함에 따라 불순물 물질이 점차 감소하므로, 이로써 트레할로스의 보호 효과가 점차 증가함을 알 수 있다.

실험 II (P5: 트레할로스 = 1: 1.5 내지 1: 5) 의 경우, 1주차 또는 2주차 때 5번 내지 9번의 불순물들이 4번 (P5: 트레할로스 = 1: 1) 에 비해 현저한 차이가 없었으며, 이는 트레할로스 보호 효과가 더 이상 증가하지 않음을 의미한다.

따라서 P5와 트레할로스의 비율은 1: 1로 하는 것이 바람직하다.

pH는 60 ℃ 에서 2주일, 40 ℃ 에서 1개월 때, 각 샘플의 pH는 대조 샘플과 비교시 변화하였으며, 즉 약 6.0에서 약 7.0으로 변화하여, 이는 pH를 안정화시키기 위해 pH 완충제를 첨가하여야 함을 알 수 있다.

실시예 10: 동결건조된 제제의 용액청정도 및 불순물들에 대한 pH의 영향

상기 실시예 8의 검사방법을 참조하여, 동결건조된 제제의 용액청정도, 불순물 물질들에 대해 pH가 미치는 영향을 관찰하였다.

실험예I: 구연산, 인산일수소나트륨을 사용하여 조성물의 pH를 조절하였다.

pH 범위 선별 실험 I의 샘플 조성: 구연산, 인산일수소나트륨을 사용하여 pH를 약 4, 5, 6, 7, 8로 조절하였다.

실험번호	0	1	2	3	4	5
pH	5.43	4.10	5.00	6.04	6.92	7.84
P5	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g
트레할로스	1.0g	1.0g	1.0g	1.0g	1.0g	1.0g
0.1 M 구연산	/	9.71ml	11.3ml	12.63ml	16.47ml	23.45ml
0.2 M 인산일수소나트륨	/	12.29ml	9.7ml	7.37ml	3.53ml	0.55ml
물	20ml	/	/	/	/	/
주입량/병	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml

실험I의 결과 및 분석

pH 범위 선별 실험 I의 결과 (0일)

pH 범위 스크리닝 (0일)
실험번호	PH	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	미조절	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.73	102.46	0.10	0.11
1	4.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<1번, 무색	4.32	102.31	0.13	0.13
2	5.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도 = 2번, 무색	5.36	101.12	0.12	0.12
3	6.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<3번, 무색	6.52	99.22	0.09	0.09
4	7.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<3번, 무색	7.37	100.05	0.03	0.03
5	8.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<2번, 무색	8.20	98.39	0.05	0.05

pH 범위 선별 실험 I의 결과 (1주차)

pH 범위 선별 (60 ℃, 1주차)
실험번호	PH	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	미조절	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.87	101.28	0.18	0.23
1	4.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<1번, 무색	4.31	98.72	0.79	1.72
2	5.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<1번, 무색	5.52	100.62	0.46	0.90
3	6.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도 = 1번, 무색	6.65	97.39	0.28	0.36
4	7.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<1번, 무색	7.48	98.37	0.15	0.23
5	8.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<3번, 무색	8.40	96.66	0.15	0.15

pH 범위 선별 실험 I의 결과 (2주차)

pH 범위 선별 (60 ℃, 2주차)
실험번호	pH	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
0	미조절	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.76	102.81	0.22	0.28
1	4.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<1번, 무색	4.36	97.13	1.16	3.40
2	5.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<1번, 무색	5.46	99.21	0.74	1.69
3	6.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<1번, 무색	6.46	97.87	0.39	0.58
4	7.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<1번, 무색	7.27	98.99	0.17	0.32
5	8.0	하얀색 동결건조 덩어리 (위축됨)	청정도<3, 무색	8.20	95.76	0.24	0.33

선별 실험 I은 구연산, 디소듐 포스페이트 완충액 시스템을 사용하였으며 pH를 4.0 내지 8.0으로 조절하였다. 대조군 샘플 (0번) 과 1번 ~ 5번은 60 ℃ 에서 2주 동안 pH가 안정하였다. 청정도를 관찰한 결과 대조군 샘플 (0번) 은 청정도가 매우 좋았으며, 1번부터 4번까지는 약간 탁함이 있었다. 1주차 또는 2주차 때 대조군 샘플 (0번) 의 성질은 그대로 유지되었고 pH를 조절한 샘플은 상당히 위축되었다. 또한 pH가 증가함에 따라 샘플 내의 불순물성분이 점차 감소하는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 출원자들은 다른 pH 조절제를 사용하여 보다 높은 pH 범위에서 실험 II를 수행하였다.

실험예II: 히스티딘/아르기닌을 이용한 조성물의 pH 조절

pH 범위 선별 실험 II의 샘플 조성: 히스티딘/아르기닌을 사용하여 조성물의 pH를 약 6, 7, 8, 9, 10으로 조절하였다.

실험번호	H0	H1	H2	H3	H4	H5
pH	5.5	7.1	7.0	7.9	8.9	9.5
P5	0.10 g	0.10 g	0.10 g	0.10 g	0.10 g	0.10 g
트레할로스	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g	0.20g
3% 히스티딘	/	2.7ml	/	/	/	/
10% 아르기닌	/	/	80μl	100 μl	250 μ l	800μl
물	2.7ml	/	2.7ml	2.7ml	2.7ml	2.4ml
주입량/병	150 μl	150 μl	150 μl	150 μl	150 μl	160 μl

실험II의 결과 및 분석

pH 범위 선별 실험 II의 결과 (0일)

pH 범위 스크리닝 (0일)
실험번호	pH 조절제	pH	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
H0	/	/	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	5.90	101.13	0.22	0.26
H1	3% 히스티딘	7.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도 = 2번, 무색	7.14	102.94	0.06	0.06
H2	10% 아르기닌	7.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<1번, 무색	6.84	98.39	0.07	0.07
H3	10% 아르기닌	8.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<1번, 무색	7.26	100.94	0.05	0.05
H4	10% 아르기닌	9.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<2번, 무색	8.42	92.63	0.05	0.05
H5	10% 아르기닌	10.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<2번, 무색	9.08	95.46	0.07	0.07

pH 범위 선별 실험 II의 결과 (1주차)

pH 범위 선별 (60 ℃, 1주차)
실험번호	pH 조절제	pH	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
H0	/	/	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	6.06	100.37	0.32	0.37
H1	3% 히스티딘	7.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도 = 2번, 무색	7.19	96.95	0.07	0.07
H2	10% 아르기닌	7.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<1번, 무색	6.91	98.20	0.09	0.09
H3	10% 아르기닌	8.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<1번, 무색	7.42	99.06	0.09	0.09
H4	10% 아르기닌	9.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<3번, 무색	8.63	93.39	0.07	0.07
H5	10% 아르기닌	10.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도 = 3번, 무색	9.15	94.33	0.24	0.30

pH 범위 선별 실험 II의 결과 (2주차)

pH 범위 선별 (60 ℃, 2주차)
실험번호	pH 조절제	pH	외관	용액의 청정도 및 색상	pH	P5 함량%	최대 단일 불순물%	총 불순물%
H0	/	/	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	맑음, 무색	6.47	100.89	0.31	0.38
H1	3% 히스티딘	7.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<3번, 무색	7.22	103.64	0.09	0.09
H2	10% 아르기닌	7.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<1번, 무색	7.10	101.57	0.11	0.11
H3	10% 아르기닌	8.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<2번, 무색	7.61	100.86	0.10	0.10
H4	10% 아르기닌	9.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<3번, 무색	8.64	91.40	0.21	0.29
H5	10% 아르기닌	10.0	하얀색의 성긴 동결건조 덩어리	청정도<4번, 무색	9.18	90.51	0.36	0.44

선별 실험 II는 히스티딘/아르기닌 완충액을 사용하여 pH를 7 내지 10으로 조절하였다. 2주차 때 대조군 샘플 (H0) 의 pH가 5.9에서 6.5로 변화하고, 이때 H1 내지 H5 샘플의 pH는 안정하였다. 대조군 샘플 (H0) 의 불순물들은 0일때에 비하여 크게 증가하였으나, H1, H2 및 H3 샘플은 증가하지 않았다. 대조군 샘플 (H0) 의 청정도는 매우 좋았으며, H1 내지 H5 샘플은 모두 탁도가 있었고, H2 샘플의 탁도가 가장 낮았다. 따라서 pH를 6.5 ± 0.5로 하는 것이 바람직하다.

또한, pH 조절제를 첨가하지 않은 경우에도 pH 변화가 서로 다르다. 예를 들어, 충진제 선별 실험에서 2번은 60 ℃ 2주차 때 pH가 크게 변화하지 않고; ph 범위 선별 실험 I에서 0번은 60 ℃ 2주차 때 pH가 크게 변화하지 않고; ph 범위 선별 실험 II에서 H0번은 60 ℃ 2주차 때 pH가 현저한 변화가 있었고 변화 폭이 0.5였으며; 트레할로스 사용량 선별 실험 II에서 1번부터 5번까지는 60 ℃ 2주차 때 pH가 현저한 변화가 있었고, 변화 폭이 1.0이 였다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌들은 각각의 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조용으로 인용된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 출원의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 출원의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 출원의 실시예에 따른 특징, 단계, 또는 실시예는 다른 특징, 단계, 또는 실시예와 조합되어 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Biocells (Beijing) Biotech Co., Ltd. <120> PEPTIDE COMPOSITION FOR TREATING EXCITATORY NEUROTOXICITY RELATED INJURIES <130> 17C52731 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Tyr Glu Lys Leu Leu Asp Thr Glu Ile 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Tyr Glu Lys Leu Leu 1 5 10 15 Asp Thr Glu Ile 20

Claims

펩타이드, pH 조절제 및 충진제를 포함하는 약학적 조성물에 있어서,
상기 펩타이드는 아미노산 서열 YEKLLDTEI (서열번호 1) 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 기능성 변이체는 서열번호 1의 LDTEI 세그먼트에서 하나 또는 다수의 보존적 치환에 의해 생성된 변이체이고, 바람직하게 상기 보존적 치환은 D와 E사이의 치환, L, V와 I사이의 치환 및 T와 S사이의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 기능성 변이체는 서열번호 1의 LDTEI 세그먼트를 LDTEL, LDTEV, LDTDI, LDTDL, LDTDV, LDSEI, LDSEL, LDSEV, LDSDI, LDSDL, LDSDV, LETEI, LETEL, LETEV, LETDI, LETDL, LETDV, VDTEI, VDTEL, VDTEV, VDTDI, VDTDL, VDTDV, IDTEI, IDTEL, IDTEV, IDTDI, IDTDL, IDTDV, IETEI, IETEL, IETEV, IETDI, IETDL 및 IETDV로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열로 치환하여 생성된 변이체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노선 서열 YEKLLDTEI (서열번호 1) 또는 그 기능성 변이체 및 내재화 펩타이드를 포함하는 키메라 펩타이드이고, 상기 내재화 펩타이드는 상기 키메라 펩타이드의 세포내 섭취를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 내재화 펩타이드는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열번호 2)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 키메라 펩타이드는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI (서열번호 3) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH 조절제는 히스티딘 완충액, 아르기닌 완충액, 소듐 호박산 완충액, 소듐 호박산 완충액, 소듐 시트레이트 완충액, 글루콘산염 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 트리스 완충액 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는 시트르산/이나트륨인산수소 완충액 또는 히스티딘/아르기닌 완충액, 더욱 바람직하게는 히스티딘/아르기닌 완충액으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 5.5 내지 8, 바람직하게는 약 6 내지 7.5, 보다 바람직하게는 약 6 내지 7, 더욱 바람직하게는 약 6.5 내지 7, 가장 바람직하게는 약 6.5 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 히스티딘/아르기닌 완충액 내 히스티딘/아르기닌의 함량은 중량 기준으로, 약 1% 내지 10%, 바람직하게는 약 3% 내지 10% 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 충진제는 트레할로스, 만니톨, 포도당, 락토오스, 시클로덱스트린, 덱스트로스 무수물-40, 솔비톨, 수크로오스, 글리신 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는 트레할로스, 만니톨, 포도당, 락토오스 또는 이들의 임의의 조합으로 부터 선택되고, 보다 바람직하게는 트레할로스인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 0.05 내지 1: 10, 바람직하게는 약 1: 0.5 내지 1: 5, 보다 바람직하게는 약 1: 0.8 내지 1: 3, 가장 바람직하게는 약 1: 1인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 충진제는 트레할로스이고, pH 조절제는 히스티딘/아르기닌 완충액인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 펩타이드와 트레할로스의 질량비는 약 1: 1인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물의 pH가 6.5 ± 0.5인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 보호제 및/또는 계면활성제를 더 포함하고, 바람직하게는, 상기 동결 보호제는 폴리에틸렌 글리콜이고/이거나 상기 계면활성제는 폴리 소르 베이트, 바람직하게 폴리 소르 베이트 20 또는 폴리 소르 베이트 80인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 탈 아미드화 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 사전 동결건조제제 형태, 또는 동결건조제제 형태, 또는 동결건조제제와 수용액을 혼합하여 얻은 복원제 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 포유동물의 신경계 손상 및 이로 인한 질환 또는 통증, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질의 치료, 개선 또는 예방에 사용되거나 신경세포 보호제로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
포유동물의 신경계 손상 및 이와 관련된 질환 또는 통증, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질의 치료, 개선 또는 예방 방법에 있어서,
상기 방법은, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
포유동물의 신경질환 및 이와 관련된 질환 또는 통증, 신경퇴행성 질환, 불안 또는 간질의 치료, 개선 또는 예방용 약물 또는 신경세포 보호제의 제조에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 용도.
제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 질환은 뇌졸중 또는 뇌졸중에 의한 신경계 손상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 방법 및 용도.
제21항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중 및 허혈성 뇌졸중으로부터 변환된 출혈성 뇌졸중을 포함하고, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 방법 및 용도.
제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 신경계 손상은 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 방법 및 용도.
제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 손상 또는 통증은 말초 신경이나 중추 신경에 위치하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 방법 및 용도.
제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 흥분성 신경 독성에 의한 신경계 손상은 뇌졸중 또는 척수 손상, 뇌 또는 척수의 허혈성 또는 상처 손상, 급성 CNS 손상, 허혈성 뇌졸중 또는 척수 손상을 포함하는 중추신경계 (CNS) 신경세포 손상, 저산소증, 허혈, 기계적 손상 및 신경퇴행성 질환, 불안, 간질, 뇌졸중으로 인한 손상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 방법 및 용도.
제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 근위축성 측파경화증 (ALS), 파킨슨병 또는 헌팅톤병을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 방법 및 용도.