CN105578876B - 制备表达hlai类的非人动物的方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种可以在短期间内有效且简便地制作的表达HLA I类的非人动物及其制作方法，其中导入基因的导入拷贝数及导入位置被控制且该基因的表达量或表达位点被控制。HLA I类基因敲入非人动物及其制作方法，其中编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。

Description

制备表达HLAI类的非人动物的方法
技术领域
本发明涉及一种表达HLA I类的非人动物、其制造方法及其使用等。更详细而言，本发明涉及一种HLAI类基因敲入非人动物或非人细胞、它们的衍生物、及它们的使用方法，其中编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHCI类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
背景技术
主要组织相容性抗原复合物(MHC)通过呈递源自癌或病毒的抗原肽，在T细胞的免疫应答诱导引起的生物体防御反应中发挥重要的作用。MHC被分类为I类和II类两种，其中I类在除生殖细胞和红细胞等之外的所有体细胞中表达。MHC I类由α链和β链构成，其中，α链由参与接纳抗原肽的凹槽的形成的α1·α2区域及参与与在细胞毒性T细胞(CTL)表面表达的辅助受体CD8分子的结合的α3区域构成。另一方面，MHC I类的β链由β2微球蛋白基因编码(非专利文献1)。
已知细胞毒性T细胞(CTL)通过经由T细胞受体识别存在于抗原呈递细胞(APC)表面的MHC I类分子和抗原肽的复合体而被活化，特异性地杀伤表达相同复合体的癌细胞或病毒感染细胞。利用这种细胞性免疫机制，进行用于癌症免疫治疗或传染病治疗的疫苗开发。
由于作为实验动物所通用的小鼠的MHC I类(H-2I类)与人的MHC I类(HLA I类)不同，因此，不能使用小鼠作为人类疫苗开发的体内评价模型。因此，通过将含有启动子区域的人HLA基因、或在小鼠H2启动子区域的下游插入HLA基因的重组基因注射于小鼠受精卵中，制作表达人HLA I类分子的各种各样的转基因小鼠(非专利文献2、3)。但是，在这些转基因小鼠中，由于通过小鼠CD8的人HLA I类的α3区域的识别不充分，因此，HLA限制性的CTL诱导是有限的。因此，制作了将融合有HLA I类的α1/α2和小鼠H-2I类的α3的嵌合基因插入于SV40启动子的下游的转基因小鼠(非专利文献4)，首次能够在体内评价HLA限制性的CTL诱导。
但是，这些转基因小鼠中表达内源性的小鼠H-2I类，在小鼠CTL识别抗原时优选使用H-2I类分子，因此，HLA I类限制性的CTL诱导是不完整的。报道为了解决该问题，将小鼠H-2I类a分子(H-2Kb及H-2Db)的双敲除小鼠和HLA I类嵌合基因转基因小鼠交配而制作复合型突变小鼠，改善了HLA I类限制性的CTL诱导(非专利文献5)。
但是，报道由于构成MHC I类的β链的β2微球蛋白基因在MHC I类分子的功能中是必须的，因此，在破坏了β2微球蛋白基因的小鼠中，小鼠MHC I类的功能丧失(非专利文献6、7)。另外，已知用由15个氨基酸构成的肽接头连接β2微球蛋白的C末端和MHC I类的N末端的单链融合基因在细胞内正常工作(非专利文献8)。
因此，制作了将融合有β2微球蛋白、HLA I类的α1/α2结构域及小鼠H-2I类的α3结构域的人工MHC I类基因插入于HLAI类基因启动子的下游的转基因小鼠，与β2微球蛋白基因敲除小鼠交配，由此制作复合型突变小鼠(非专利文献9)。在这些小鼠中，H-2I类的表达几乎完全消失，观察到HLA I类限制性的CTL诱导反应，因此，认为是目前最优异的MHC I类人源化小鼠。
近年来，报道将作为严重免疫缺陷动物的NOD/SCID/gamma-c-null(NOG)小鼠进一步与上述的MHC I类人源化小鼠交配，并通过将人血干细胞移入至得到的多重突变型小鼠中，可重建具有完全HLA限制性T细胞的人适应性免疫系统(非专利文献10)。因此，认为通过上述的MHC I类人源化小鼠与其它突变系统的交配，进而在制作优异的人免疫系统模型动物时也是有用的。
但是，认为迄今为止所制作的人工MHC I类基因转基因小鼠中的转基因的表达受拷贝数、基因组上的插入位点、或者表观遗传修饰等各种因素的影响。因此，必需从所制作的转基因系统中选择显示最佳表达量的系统。另外，基于相同的理由，在表达不同的MHC I类的转基因小鼠系统间比较CTL诱导能力也是困难的。
进而，为了提高人MHC I类限制性的CTL诱导，所选择的系统和β2微球蛋白基因敲除小鼠的交配为必需的，因此，在选择显示最佳表达量的转基因小鼠系统之后，还需要更多的时间和精力。
根据这样的理由，虽然MHC I类人源化小鼠是非常有用的，但是，到目前为止，仅制作了A1、A2、A24、A11、B44、B7等有限的转基因系统，通过β2微球蛋白基因敲除小鼠的交配得到的复合型突变小鼠的制备例进一步受限定。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Human Vaccines 4:6,400-409；November/December 2008
非专利文献2：Eur J Immunol.1989Sep；19(9):1575-83
非专利文献3：J Immunol.1989Feb 15；142(4):1366-71
非专利文献4：J Exp Med.1991Apr 1；173(4):1007-15
非专利文献5：J Immunol.1999,163:2555-60
非专利文献6：Nature.1990Apr 19；344(6268):742-6
非专利文献7：Science,Vol.248(8June 1990):1227-30
非专利文献8：Proc Natl Acad Sci U S A.1992November 15；89(22):10658-62
非专利文献9：J Exp Med.1997Jun 16；185(12):2043-51
非专利文献10：Proc Natl Acad Sci U S A.2010Jul 20；107(29):13022-7
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于，提供一种解决了如上所述缺点的表达HLA I类的非人动物、及其制作方法。
即，本发明在于提供一种表达HLA I类的非人动物、及其制作方法，所述表达HLA I类的非人动物可以在短期间内有效且简便地制作，且导入基因的导入拷贝数及导入位置被控制，该基因的表达量或表达位点被控制。
用于解决课题的技术方案
本发明人等为了解决上述课题重复进行了潜心研究，结果发现：通过使编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达，可以在短期间内有效且简便地制作HLA I类基因敲入非人动物，进而，在利用该方法得到的HLA I类基因敲入非人动物中，可以控制人工嵌合基因的导入拷贝数及导入位置，可以控制该基因的表达量或表达位点，直至完成本发明。
即，本发明包含以下发明。
[1]一种HLA I类基因敲入非人动物，其中，编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
[2]根据[1]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的一个基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
[3]根据[1]或[2]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA I类的α1及α2区域源自HLA-A。
[4]根据[3]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA-A为HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。
[5]根据[3]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，HLA-A为HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
[6]根据[1]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的第1人工嵌合蛋白的第1人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的第1基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达；
编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的第2人工嵌合蛋白的第2人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的与该第1基因座不同的第2基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
[7]根据[6]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域源自相同基因型的HLA。
[8]根据[6]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域源自不同基因型的HLA。
[9]根据[6]～[8]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域源自HLA-A。
[10]根据[9]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域相同或不同，源自HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。
[11]根据[9]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域相同或不同，源自HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物MHC I类的α3区域源自H-2I类。
[13]根据[12]所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物MHC I类的α3区域源自H-2Db。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。[15]根据[1]～[14]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，其中，非人动物为小鼠。
[16]根据[15]所述的HLA I类基因敲入非人动物，所述HLA I类基因敲入非人动物具有B2m+/(HLA/H-2/B2M)或B2m(HLA/H-2/B2M)/(HLA/H-2/B2M)表示的基因型。
[17]一种HLA I类基因敲入非人动物的制作方法，所述方法包括：将编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因导入在该非人动物的β2微球蛋白基因座的转录调控区的控制下的工序。
[18]根据[17]所述的方法，所述方法包括以下工序：
(1)制作包含人工嵌合基因的靶向载体，该人工嵌合基因编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白；
(2)使该靶向载体作用于该非人动物的多能性干细胞，导入在该多能性干细胞的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下。
[19]根据[18]所述的方法，其中，多能性干细胞为ES细胞、GS细胞或iPS细胞。
[20]根据[18]或[19]所述的方法，其中，通过同源重组将人工嵌合基因导入在多能性干细胞的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下。
[21]根据[17]～[20]中任一项所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
[22]一种细胞，所述细胞在非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及该非人动物MHCI类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因。
[23]根据[22]所述的细胞，所述细胞为ES细胞、GS细胞或iPS细胞。
[24]一种由[1]～[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物得到的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系。
[25]一种受试物质特异性CTL诱导剂的筛选方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于[1]～[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、[22]或[23]所述的细胞、或[24]所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系的工序；
(2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
[26]一种评价HLA I类限制性抗原是否存在的方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于[1]～[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、[22]或[23]所述的细胞、或[24]所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系的工序；
(2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
[27]一种疾病的治疗剂或预防剂的筛选方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于[1]～[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物、[22]或[23]所述的细胞、或[24]所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系的工序；
(2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
[28]根据[27]所述的方法，其中，疾病为癌症或传染病。
[29]一种比较由受试物质所诱发的CTL反应的HLA限制特异性的方法，所述方法包括以下的(1)～(2)的工序：
(1)将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、[1]～[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反应的工序；
(2)比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限制性的工序。
[30]一种评价由受试物质诱发的CTL反应的有效性的方法，所述方法包括以下的(1)～(2)的工序：
(1)将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、[1]～[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反应的工序；
(2)比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限制性的工序。
[31]一种受试物质的安全性评价方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于[1]～[16]中任一项所述的HLA I类基因敲入非人动物的工序；
(2)分析发生在该非人动物中的不良应答的工序。
[32]根据[31]所述的方法，其中，不良应答为自身免疫反应。
[33]根据[25]～[32]中任一项所述的方法，其中，受试物质为一种或多种肽、一种或多种多肽、一种或多种寡核苷酸、一种或多种多核苷酸、或者一种或多种蛋白质。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2013-217684号的说明书和/或附图中所记载的内容。
发明效果
根据本发明，可以提供以下发明。
本发明提供一种β2微球蛋白基因座中的基因改变的非人动物。
更具体而言，为一种HLA I类基因敲入非人动物或非人细胞、它们的衍生物及它们的使用方法，所述HLA I类基因敲入非人动物的编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因(以下，记为“人工嵌合基因”或”该人工嵌合基因”。)在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
本发明的通过使该人工嵌合基因在非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达的特征，可以避免目前已知的HLA基因导入转基因小鼠、或目前已知的复合型突变小鼠(即，制作将编码融合有β2微球蛋白、HLA I类的α1/α2结构域及小鼠H-2I类的α3结构域的蛋白质的人工MHC I类基因插入于HLA I类基因启动子的下游的转基因小鼠，通过与β2微球蛋白基因敲除小鼠交配而制作的复合型突变小鼠(上述非专利文献9)。以下记为“目前已知的复合型突变小鼠”。)具有的缺点。
具体而言，在本发明中，具有如下所示的非常优异的优点。
(1)缩短制作时间、效率化、简便化
在制作目前已知的复合型突变小鼠的情况下，制作将上述人工MHC I类基因插入于HLA I类基因启动子的下游的转基因小鼠，在选择出导入基因的表达的最佳系统之后，必须与β2微球蛋白基因敲除小鼠交配，因此，为了得到复合型突变小鼠，至少需要1年半～2年的时间。
与此相对，由于本发明的非人动物不需要系统选择及交配的步骤，因此，例如在非人动物为小鼠的情况下，能够在约7个月～8个月的短期间内制作。
即，根据本发明，与目前已知的复合型突变小鼠相比，能够在短期间内有效且简便地制作目的HLA I类基因敲入非人动物。
(2)实现生理性表达水平(表达量)
在目前已知的复合型突变小鼠中，该人工嵌合基因的表达量或表达位点受所导入的人工MHC I类基因的拷贝数、基因组上的插入位点、表观遗传修饰等各种因素的影响，因此，表达量或表达位点的控制困难。另外，功能性的该人工MHC I类基因是否表达也取决于这些因素，所以，功能性的该人工MHC I类基因是否表达多是偶然引起的情况。
与此相对，在本发明的非人动物中，使该人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座的一个或两个中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。因此，与目前已知的复合型突变小鼠不同，在本发明的非人动物中，能够控制该人工嵌合基因的插入拷贝数、插入位点等。
即，在本发明的非人动物中，插入于β2微球蛋白基因座的该人工嵌合基因的拷贝数为1个拷贝或2个拷贝。由此，与目前已知的复合型突变小鼠不同，能够进一步实现生理性表达水平。
(3)使系统间比较成为可能
在本发明的非人动物中，通过具有上述的特征，在不同的系统间该人工嵌合基因的表达量是一定的，因此，例如在筛选受试物质特异性CTL诱导剂时、评价HLA I类限制性抗原是否存在时、筛选疾病的治疗剂或预防剂时、比较由受试物质所诱发的CTL反应的HLA限制特异性时、判断由受试物质诱发的CTL反应的有效性时、或评价受试物质的安全性时，能够进行系统间的比较。
(4)使杂合子制作容易化
本发明的非人动物的1个实施方案可以为在β2微球蛋白基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下分别插入各1个拷贝的含有不同基因型的HLA I类基因的该人工嵌合基因的非人动物。本发明的该方案可以通过将本发明的非人动物进行交配而简便地制作。在本发明的该方案中，可以得到表达类似量的不同基因型的HLA I类基因的非人动物。如果要用目前已知的复合型突变小鼠的制作方法制作这种非人动物，首先，需要制作表达不同基因型的HLA I类基因的转基因动物，选择表达类似量的各自的基因型的系统，将它们进行交配，但选择表达类似量的各自的基因型的系统的工序未必容易。与此相对，在本发明的非人动物中，由于可以知晓该人工嵌合基因的拷贝数为1个拷贝或2个拷贝、及在该人工嵌合基因配置于β2微球蛋白基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下，因此，可以通过交配而得到在β2微球蛋白基因座上分别具有各1个拷贝的由不同基因型的HLA I类基因构成的该人工嵌合基因的非人动物，认为这些非人动物分别以生理性水平表达该不同基因型的HLA I类基因。对于人而言，已知表达不同型的HLA I类基因的情况较多(即，与为纯合子相比，HLA I类基因为杂合子的情况较多)。因此，在本发明的非人动物的1个实施方案中，通过分别以生理性水平表达不同型的HLA I类基因，例如在研究由受试物质所诱发的HLA限制性的CTL反应时，认为是对人的外推性更高的评价模型。
(5)实现生理性表达水平(表达位点)
在本发明的非人动物中，该人工嵌合基因的表达在β2微球蛋白基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下。因此，与目前已知的复合型突变小鼠不同，该人工嵌合基因的表达受该非人动物的β2微球蛋白启动子等转录调控区的控制。因此，据推测，该人工嵌合基因以与该非人动物内源性的β2微球蛋白表达水平类似的方式进行表达，表达位点(例如、细胞或组织)也与原始MHC I类基因的表达位点一致，具有可以进一步实现生理性表达水平的优点。
(6)使复合型突变动物制作容易化
本发明的非人动物由于在该非人动物的β2微球蛋白基因座上敲入该人工嵌合基因，因此，为单一系统的转基因动物。目前已知的复合型突变小鼠(即，通过将上述人工MHCI类基因插入于HLA I类基因启动子的下游的转基因小鼠和β2微球蛋白基因敲除小鼠的交配而制作的复合型突变小鼠)为通过2个系统的转基因动物的交配而制作的人HLA表达动物。因此，本发明的非人动物在减数分裂时，β2微球蛋白基因座和人工嵌合基因座不会分配于不同的配子，因此，具有与其它系统交配形成的复合型突变动物的制作较容易的优点。作为其它系统的动物，可以例示免疫缺陷动物或癌变模型动物等。
(7)表位识别能力的提高、多样化
即使为在目前已知的HLA基因导入转基因小鼠中没有观察到CTL诱导的受试物质，也可以在本发明的非人动物中产生CTL诱导。
(8)避免H-2I类引起的HLA I类表达降低及HLA I类限制性CTL应答降低
已知β2微球蛋白为MHC I类的构成分子，在β2微球蛋白纯合敲除小鼠中，H-2I类的表达消失，且CD4-CD8+T细胞团显著地减少(Nature 1990 344：742-746)。
在目前已知的复合型突变小鼠中，一般需要纯合敲除β2微球蛋白基因，由此，在各种实验中使用在H-2I类的表达消失的状况下，使人工MHC I类基因表达。这是因为，在杂合敲除β2微球蛋白基因的情况下，内源性的H-2I类和导入的人工MHC I类基因将被共表达，但人工MHC I类基因的表达量降低至与野生型的非转基因小鼠的类似，不能得到充分的人工MHC I类基因的表达量(J Immunol.2013June 17；191：583-593)。因此，杂合敲除了β2微球蛋白基因的目前已知的复合型突变小鼠虽然具有CD4-CD8+T细胞的比例与野生型的非转基因小鼠的比例类似的有利性质，但是，不能使用该小鼠研究HLA I类限制性的CTL诱导反应。
另一方面，在本发明的非人动物中，将该人工嵌合基因敲入于该非人动物的一对β2微球蛋白基因座的一个(即杂合)及两个(即纯合)的情况下导入的人工嵌合基因的表达量分别为在根据被导入的基因拷贝数所设想的变化的范围内，在杂合的情况下导入的人工嵌合基因的表达量不会产生降低至与野生型的非转基因小鼠类似的程度(后述的图9-1、9-2)。另外，CD4-CD8+T细胞的比例也可以保持与野生型的非转基因小鼠类似(后述的图16)。因此，在本发明的非人动物中，在将该人工嵌合基因敲入于该非人动物的一对β2微球蛋白基因座的一个(即杂合)的情况下，也可以用于研究HLA I类限制性的CTL诱导反应。
另外，已知在目前已知的HLA基因导入转基因小鼠中，与纯合敲除了β2微球蛋白基因的情况相比，在β2微球蛋白基因为野生型的情况下，HLA I类限制性的CTL诱导显著地降低(Vaccine 2004 22：1728-1731、International Immunol.2002 14：925-934)。这意味着例如在β2微球蛋白基因为野生型的情况下，内源性的H-2I类和导入的HLA I类基因将被共表达，但在HLA I类限制性的CD8+细胞的培养和维持的过程中，通过H-2I类和HLA I类竞争，HLA I类限制性的培养的CD8+细胞团减少。
另一方面，在本发明的非人动物中，将该人工嵌合基因敲入于该非人动物的一对β2微球蛋白基因座的一个(即杂合)及两个(即纯合)的情况下的HLA I类限制性表位引起的CTL诱导是类似的(后述的图11、12、14、15)。因此，在本发明的非人动物中，在将该人工嵌合基因敲入于该非人动物的一对β2微球蛋白基因座的一个(即杂合)的情况下，也可以研究HLA I类限制性的CTL诱导反应。
附图说明
图1是表示编码含有人β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因的制作方法的示意图。
图2是表示通过同源重组而在β2微球蛋白基因座上敲入人工嵌合基因的方法的示意图。
图3是表示用于制作HLA I类基因敲入小鼠(HLA-A24的情况)的靶向载体的结构的示意图。
图4是表示利用DNA印迹技术(Southern blotting)分析了同源重组体ES细胞的基因型的结果的照片图。
图5是表示利用DNA印迹技术分析了野生型、人工嵌合基因杂合敲入及人工嵌合基因纯合敲入小鼠的基因型的结果的照片图。
图6是表示使用定量RT-PCR法分析了野生型、人工嵌合基因杂合敲入及人工嵌合基因纯合敲入小鼠的各肝脏中的小鼠β2微球蛋白mRNA表达量的结果的图。
图7-1是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞及脾细胞中的HLA-A24的表达量的结果的图。
图7-2是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞及脾细胞中的HLA-A3的表达量的结果的图。
图8-1是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞中的H-2Kb的表达量的结果的图。
图8-2是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞中的H-2Kb的表达量的结果的图。
图9-1是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞中的人工嵌合蛋白(包含HLA-A2及人β2微球蛋白)的表达量的结果的图。
图9-2是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞中的人工嵌合蛋白(包含人β2微球蛋白)的表达量的结果的图。
图10-1是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞中的H-2Kb/H-2Db的表达量的结果的图。
图10-2是表示使用流式细胞仪分析了敲入小鼠的血细胞中的H-2Kb/H-2Db的表达量的结果的图。
图11是表示使用野生型小鼠、以及人工嵌合基因(包含HLA-A24)的杂合敲入及纯合敲入小鼠评价了病毒衍生的抗原肽的CTL诱导能力的结果的图。***表示p＜0.001。
图12是表示使用野生型小鼠、以及人工嵌合基因(包含HLA-A3)的杂合敲入及纯合敲入小鼠评价了病毒衍生的抗原肽的CTL诱导能力的结果的图。***表示p＜0.001，**表示p＜0.01。
图13是表示使用野生型小鼠、以及第一人工嵌合基因(包含HLA-A24)及第二人工嵌合基因(包含HLA-A3)的双重敲入小鼠评价了病毒衍生的抗原肽的CTL诱导能力的结果的图。***表示p＜0.001。
图14是表示使用野生型小鼠、以及人工嵌合基因(包含HLA-A2)的杂合敲入及纯合敲入小鼠评价了病毒衍生的抗原肽的CTL诱导能力的结果的图。***表示p＜0.001。
图15是表示使用野生型小鼠、以及人工嵌合基因(包含HLA-A31)的杂合敲入及纯合敲入小鼠评价了病毒衍生的抗原肽的CTL诱导能力的结果的图。***表示p＜0.001，**表示p＜0.01。
图16-1是表示使用流式细胞仪分析了野生型小鼠、以及人工嵌合基因(包含HLA-A3、HLA-A24、HLA-A2、HLA-A31)的杂合敲入小鼠、人工嵌合基因(包含HLA-A3、HLA-A24、HLA-A2、HLA-A31)的纯合敲入小鼠、及第一人工嵌合基因(包含HLA-A24)和第二人工嵌合基因(包含HLA-A3)的双重敲入小鼠的血细胞中的CD4-CD8+T细胞的比例的结果的图。
图16-2(图16-1的续)
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
本说明书中的“人工嵌合蛋白”是指：从N末端侧依次连接而含有β2微球蛋白、HLAI类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的融合蛋白质。
本说明书中的“连接”，既可以直接地结合邻接的蛋白质结构域，也可以在邻接的蛋白质结构域之间适当插入作为间隔物的氨基酸序列而间接地结合邻接的蛋白质结构域。作为间隔物，可以利用现有公知的肽接头，但肽接头的氨基酸数目和种类没有限定。
本说明书中的“人工嵌合基因”为编码上述人工嵌合蛋白的基因，更详细而言，是指从N末端侧依次连接而含有编码β2微球蛋白的基因、编码HLA I类的α1及α2区域的基因、以及编码非人动物MHC I类的α3区域的基因的人工融合基因。各基因既可以直接地结合，也可以插入编码上述作为间隔物氨基酸序列的碱基序列并使邻接的基因彼此间接地结合。编码上述作为间隔物氨基酸序列的碱基序列可以利用编码现有公知的肽接头的碱基序列等，另外，在编码该作为间隔物氨基酸序列的碱基序列中，可以根据需要含有限制酶识别序列。
作为该人工嵌合基因，优选编码含有从HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域至细胞内结构域在其N末端通过肽接头(氨基酸数目和种类没有限定，优选氨基酸数为约1～100个，进一步优选为氨基酸数约5～50个，特别优选为氨基酸数约10～30个。)与β2微球蛋白的C末端结合的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因，但从HLA I类的α1及α2区域、非人动物MHC I类的α3区域至细胞内结构域的组合没有限制。
本说明书中的“β2微球蛋白”是指构成MHC I类的β链的蛋白质。本说明书中的“β2微球蛋白基因”是指构成MHC I类的β链的β2微球蛋白的基因。
本发明中的“β2微球蛋白基因”既可以为非源自作为宿主的非人动物的外源性β2微球蛋白基因，也可以为源自作为宿主的非人动物的内源性β2微球蛋白基因。因此，在本发明的“人工嵌合基因”中，β2微球蛋白基因既可以为非源自作为宿主的非人动物的外源性β2微球蛋白基因，也可以利用源自非人动物的内源性β2微球蛋白基因。
本说明书中的“非人动物”是指：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猪、牛、绵羊、猫、狗等哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类。本发明中的“非人动物”只要是具有β2微球蛋白基因座、可以导入外源基因的动物，就没有特别限定，但优选为啮齿类，进一步优选为小鼠或大鼠，从饲养及操作的方面考虑，特别优选的是小鼠。
优选地，本发明中的“β2微球蛋白基因”为人β2微球蛋白基因。
作为人β2微球蛋白基因，可列举编码由序列号1表示的氨基酸序列构成的人β2微球蛋白的基因，例如可以利用由在GenBank中作为NM＿004048.2所注册的碱基序列构成的基因。
另外，在本发明的人β2微球蛋白中，还包含：由在序列号1表示的氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入1～10个、优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且通过与MHC I类分子形成复合体而具有该MHC I类特异性的抗原呈递能力的多肽；或与序列号1表示的氨基酸序列具有80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性、并且通过与MHC I类分子形成复合体而具有该MHC I类特异性的抗原呈递能力的多肽。氨基酸序列的比较可以利用公知的方法进行，例如，可以使用例如默认设置而实施BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for BiologicalInformation(美国国家生物技术信息中心的本地序列基本搜索工具))等。
予以说明的是，本发明中的“基因”是指DNA、RNA、或DNA/RNA杂合体，只要编码规定的蛋白质或多肽，对形式没有特别限定。
本说明书中的“HLA I类”是指人的MHC I类，包含HLA-A、HLA-B、HLA-C。本说明书中的“HLA I类基因”是指人的MHC I类基因，包含编码HLA-A、HLA-B、HLA-C的基因。HLA I类优选为HLA-A，进一步优选为HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2、或HLA-A31。
作为HLA-A24，可列举例如由序列号2表示的氨基酸序列构成的HLA-A2402或由序列号3表示的氨基酸序列构成的HLA-A2403，作为编码它们的基因，可以利用例如在GenBank中由作为M64740、及M64741分别所注册的碱基序列构成的基因。作为HLA-A24，优选为HLA-A2402。
作为HLA-A3，可列举例如由序列号4表示的氨基酸序列构成的HLA-A0301或由序列号5表示的氨基酸序列构成的HLA-A0302，作为编码它们的基因，可以利用例如在GenBank中由作为L77702.1、及AF217561.1分别所注册的碱基序列构成的基因。作为HLA-A3，优选为HLA-A0301。
作为HLA-A2，可列举例如由序列号6表示的氨基酸序列构成的HLA-A0201或由序列号7表示的氨基酸序列构成的HLA-A0203，作为编码它们的基因，可以利用例如在GenBank中由作为AY365426.1、及U03863.1分别所注册的碱基序列构成的基因。作为HLA-A2，优选为HLA-A0201。
作为HLA-A31，可列举例如由序列号8表示的氨基酸序列构成的HLA-A3101或由序列号9表示的氨基酸序列构成的HLA-A3104，作为编码它们的基因，可以利用例如在GenBank中由作为M84375.1、及AF148863.1分别所注册的碱基序列构成的基因。作为HLA-A31，优选为HLA-A3101。
另外，在本发明中，在“HLA I类”中还包含：由在序列号2～9表示的氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入1～10个、优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且对抗原肽具有与由原来的氨基酸序列构成的多肽相同或类似的结合能力的多肽；与序列号2～9表示的氨基酸序列具有80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性、并且对抗原肽具有与由原来的氨基酸序列构成的多肽相同或类似的结合能力的多肽。
本说明书中的“HLA I类的α1及α2区域”是指HLA I类分子的α1、α2、α3区域中的参与接纳抗原肽的凹槽的形成的α1及α2区域。HLA I类的α1及α2区域的氨基酸序列及编码其的碱基序列可以基于上述GenBank等公知数据库所注册的HLA I类的序列信息而确定。
本说明书中的“非人动物MHC I类”是指人以外的动物的MHC I类。本说明书中的“非人动物MHC I类基因”是指编码人以外的动物的MHC I类的基因。
作为“非人动物MHC I类”，可列举：小鼠的H-2、大鼠的RT1、兔的RLA、鸡的B基因座Blocus。
小鼠的H-2I类，包含H-2K、H-2D、H-2L。作为H-2K，可列举例如由序列号10表示的氨基酸序列构成的H-2Kb、由序列号11表示的氨基酸序列构成的H-2Kd、由序列号12表示的氨基酸序列构成的H-2Kk，作为编码它们的基因，可以利用例如在GenBank中由作为U47328.1、U47329.1及U47330.1分别所注册的碱基序列构成的基因。作为H-2D，可列举例如由序列号13表示的氨基酸序列构成的H-2Dd、或由序列号14表示的氨基酸序列构成的H-2Db，作为编码它们的基因，可以利用例如在GenBank中由作为U47326.1及U47325.1分别所注册的碱基序列构成的基因。作为H-2L，可列举例如由序列号15表示的氨基酸序列构成的H-2Ld，作为编码它的基因，可以利用例如在GenBank中由作为NM＿001267808.1分别所注册的碱基序列构成的基因。
非人动物MHC I类优选为小鼠的H-2I类，其中，特别优选H-2Db或H-2Kd。
另外，在本发明中，在“非人动物MHC I类”中，还包含：由在序列号10～15表示的氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入1～10个、优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且对CD8分子具有与由原来的氨基酸序列构成的多肽相同或类似的结合能力的多肽；与序列号10～15表示的氨基酸序列具有80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性、并且对CD8分子具有与由原来的氨基酸序列构成的多肽相同或类似的结合能力的多肽。
本说明书中“非人动物MHC I类的α3区域”是指：非人动物的MHC I类分子的α1、α2、α3区域中的涉及与在CTL表面表达的辅助受体CD8分子的结合的α3区域和存在于其C末端侧的该MHC I类的细胞内结构域。予以说明，本说明书，没有特别限定，在记载为“非人动物MHCI类的α3区域”的情况下，是指从该α3区域至细胞内结构域的区域。非人动物MHC I类的α3区域的氨基酸序列及编码其的碱基序列可以基于上述GenBank等公知数据库所注册的非人动物MHC I类的序列信息而确定。
为了使本发明的非人动物的CTL有效地识别HLA和抗原的复合体，“非人动物MHC I类的α3区域”优选为同区域置换导入该人工嵌合基因的非人动物的MHC。(Eur.J.Immunol.,26:97,1996；J.Immunol.,159:4753,1997)。
在本发明中的“人工嵌合蛋白”中，HLA I类的α1及α2区域、及非人动物MHC I类的α3区域的基因型的组合，只要表达“人工嵌合蛋白”并起作用，就没有特别限定，HLA I类的α1及α2区域源自HLA-A2时，优选非人动物MHC I类的α3区域源自小鼠的H-2Db，α1及α2区域源自HLA-A24时，优选小鼠的α3区域源自H-2Db，HLA I类的α1及α2区域源自HLA-A3时，优选非人动物MHC I类的α3区域源自小鼠的H-2Db，HLA I类的α1及α2区域源自HLA-A31时，优选非人动物MHC I类的α3区域源自小鼠的H-2Db。
在本发明中，在“人工嵌合基因”中，除编码上述β2微球蛋白的基因、编码HLA I类的α1及α2区域的基因、以及编码非人动物MHC I类的α3区域的基因之外，可以含有能够调节该人工嵌合基因的表达及翻译的任何碱基序列。作为这种碱基序列，例如可以含有HLAI类基因、特别地HLA-A24基因的前导序列[ATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGACCCAGACCTGGGCG](序列号40)。该前导序列位于HLA I类基因的α1区域的上游，涉及使由HLA I类基因表达的蛋白质定位于细胞膜上(J.Immunol.，134：2727，1985)。该前导序列可以添加于编码β2微球蛋白的碱基序列的N末端。
在本发明中，作为该“人工嵌合基因”，可以利用例如：(i)编码含有从N末端侧依次连接有人β2微球蛋白、人HLA-A2402的α1及α2区域以及小鼠的H-2Db的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因(由序列号16表示的碱基序列构成)、(ii)编码含有从N末端侧依次连接有人β2微球蛋白、人HLA-A0301的α1及α2区域以及小鼠的H-2Db的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因(由序列号17表示的碱基序列构成)、(iii)编码含有从N末端侧依次连接有人β2微球蛋白、人HLA-A0201的α1及α2区域以及小鼠的H-2Db的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因(由序列号41表示的碱基序列构成)、和/或(iv)编码含有从N末端侧依次连接有人β2微球蛋白、人HLA-A3101的α1及α2区域以及小鼠的H-2Db的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因(由序列号42表示的碱基序列构成)。
本说明书中的“人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达”表示：在该非人动物中，人工嵌合基因以可操作的方式连接至调控内源性的β2微球蛋白基因的表达(转录)的区域，由此人工嵌合基因的表达利用该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区进行调控。在转录调控区中，包含非人动物的β2微球蛋白基因的启动子区域或增强子区域。
“人工嵌合基因以可操作的方式连接”表示：只要人工嵌合基因在非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下可驱动表达，就可以以任意的形式连接、配置。例如，在人工嵌合基因利用源自作为宿主的非人动物的内源性β2微球蛋白基因作为“β2微球蛋白基因”的情况下，可以通过在该内源性β2微球蛋白基因(不包括终止密码子)的3’末端依次连接编码HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的基因而插入(敲入)、配置来进行。
或者，在人工嵌合基因利用非源自作为宿主的非人动物的外源性β2微球蛋白基因(优选人β2微球蛋白基因)作为“β2微球蛋白基因”的情况下，可以通过在非人动物的内源性β2微球蛋白基因的第一甲硫氨酸之后插入编码含有从N末端侧依次连接有人β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因，即通过将该人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因座上敲入、配置来进行。
予以说明的是，本说明书中“敲入”或“在β2微球蛋白基因座上敲入”是指：以在非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下配置人工嵌合基因的方式通过同源重组而导入所期望的基因，使人工嵌合蛋白表达。即，在人工嵌合基因利用源自作为宿主的非人动物的内源性β2微球蛋白基因作为“β2微球蛋白基因”的情况下，是指：在该内源性β2微球蛋白基因(不包括终止密码子)的3’末端依次连接编码HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的基因而插入，形成人工嵌合基因并配置；在人工嵌合基因利用非源自作为宿主的非人动物的外源性β2微球蛋白基因(优选人β2微球蛋白基因)作为“β2微球蛋白基因”的情况下，是指：将编码含有从N末端侧依次连接有人β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在非人动物的内源性β2微球蛋白基因的第一甲硫氨酸之后插入并配置。
在本发明中，人工嵌合基因既可以在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的一个中被敲入，也可以在两个β2微球蛋白基因座中被敲入。
在一个β2微球蛋白基因座上被敲入时，该非人动物在β2微球蛋白基因座上具有1个拷贝的该人工嵌合基因。
在两个β2微球蛋白基因座上被敲入时，该非人动物在β2微球蛋白基因座上存在将该人工嵌合基因作为相同基因型的基因具有2个拷贝的情况和作为不同基因型的基因具有各1个拷贝的情况。
人工嵌合基因在该非人动物的一个β2微球蛋白基因座上被敲入时，关于人工嵌合基因所编码的人工嵌合蛋白中所含的HLA I类的α1及α2区域，HLA I类优选为HLA-A，进一步优选为HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。更优选为HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
人工嵌合基因在该非人动物的两个β2微球蛋白基因座上被敲入的情况下，关于由两个人工嵌合基因所编码的人工嵌合蛋白中所含的HLA I类的α1及α2区域，HLA I类为相同基因型的HLA时，这些区域优选为HLA-A，进一步优选为HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。更优选为HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
人工嵌合基因在该非人动物的两个β2微球蛋白基因座中被敲入的情况下，关于由两个人工嵌合基因所编码的人工嵌合蛋白中所含的HLA I类的α1及α2区域，HLA I类为不同基因型的HLA时，这些优选为不同的HLA-A，进一步优选为选自由HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2、及HLA-A31构成的组中的2个HLA-A。更优选为选自由HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201及HLA-A3101构成的组中的2个HLA-A，进一步优选为HLA-A2402和HLA-A0301。
本发明中的HLA I类基因敲入非人动物除人工嵌合基因之外，可以含有其它基因突变。作为其它基因突变，可以例示例如Il2rg、Prkdc、Foxn1、Rag1等免疫相关基因，或Ras、Src、Myc等癌症基因，或p53、Apc等抑癌基因的突变。
非人动物为小鼠时，本发明中的表达HLA I类的非人动物为表达HLA I类的小鼠。该小鼠的优选的基因型为B2m+/(HLA/H-2/B2M)或B2m(HLA/H-2/B2M)/(HLA/H-2/B2M)。更优选为B2m(HLA -A24/H-2/B2M)/(HLA-A24/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A24/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A3/H-2/B2M)/(HLA-A3/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A3/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A2/H-2/B2M)/(HLA-A2/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A2/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A31/H-2/B2M)/(HLA-A31/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A31/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2/B2M)/(HLA-A3/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A24/H-2/B2M)/(HLA-A2/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2/B2M)/(HLA-A31/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A3/H-2/B2M)/(HLA-A2/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A3/H-2/B2M)/(HLA-A31/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A2/H-2/B2M)/(HLA-A31/H-2/B2M)。更进一步优选为B2m(HLA-A2402/H-2/B2M)/(HLA-A2402/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A2402/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A0301/H-2/B2M)/(HLA-A0301/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A0301/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A0201/H-2/B2M)/(HLA-A0201/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A0201/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A3101/H-2/B2M)/(HLA-A3101/H-2/B2M)、或B2m+/(HLA-A3101/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A2402/H-2/B2M)/(HLA-A0301/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A2402/H-2/B2M)/(HLA-A0201/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A2402/H-2/B2M)/(HLA-A3101/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A0301/H-2/B2M)/(HLA-A0201/H-2/B2M)、或B2m(HLA-A0301/H-2/B2M)/(HLA-A3101/H-2/B2M)、或B2m(HLA -A0201/H-2/B2M)/(HLA-A3101/H-2/B2M)。
更进一步优选为B2m+/(HLA/H-2D/B2M)或B2m(HLA/H-2D/B2M)/(HLA/H-2D/B2M)。更优选为B2m(HLA -A24/H-2D/B2M)/(HLA-A24/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A24/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A3/H-2D/B2M)/(HLA-A3/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A3/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A2/H-2D/B2M)/(HLA-A2/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A2/H-2D/B2M)、或B2m(HLA -A31/H-2D/B2M)/(HLA-A31/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A31/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2D/B2M)/(HLA-A3/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2D/B2M)/(HLA-A2/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2D/B2M)/(HLA-A31/H-2D/B2M)、或B2m(HLA -A3/H-2D/B2M)/(HLA-A2/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A3/H-2D/B2M)/(HLA-A31/H-2D/B2M)、或B2m(HLA -A2/H-2D/B2M)/(HLA-A31/H-2D/B2M)。更进一步优选为B2m(HLA-A2402/H-2D/B2M)/(HLA-A2402/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A2402/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A0301/H-2D/B2M)/(HLA-A0301/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A0301/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A0201/H-2D/B2M)/(HLA-A0201/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A0201/H-2D/B2M)、或B2m(HLA -A3101/H-2D/B2M)/(HLA-A3101/H-2D/B2M)、或B2m+/(HLA-A3101/H-2D/B2M)、或B2m(HLA -A2402/H-2D/B2M)/(HLA-A0301/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A2402/H-2D/B2M)/(HLA-A0201/H-2D/B2M)、或B2m(HLA -A2402/H-2D/B2M)/(HLA-A3101/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A0301/H-2D/B2M)/(HLA-A0201/H-2D/B2M)、或B2m(HLA -A0301/H-2D/B2M)/(HLA-A3101/H-2D/B2M)、或B2m(HLA-A0201/H-2D/B2M)/(HLA-A3101/H-2D/B2M)。
特别优选为B2m+/(HLA/H-2Db/B2M)或B2m(HLA/H-2Db/B2M)/(HLA/H-2Db/B2M)。更优选为B2m(HLA -A24/H-2Db/B2M)/(HLA-A24/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A24/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A3/H-2Db/B2M)/(HLA-A3/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A3/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A2/H-2Db/B2M)/(HLA-A2/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A2/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA -A31/H-2Db/B2M)/(HLA-A31/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A31/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2Db/B2M)/(HLA-A3/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2Db/B2M)/(HLA-A2/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A24/H-2Db/B2M)/(HLA-A31/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA -A3/H-2Db/B2M)/(HLA-A2/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A3/H-2Db/B2M)/(HLA-A31/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA -A2/H-2Db/B2M)/(HLA-A31/H-2Db/B2M)。更进一步优选为B2m(HLA-A2402/H-2Db/B2M)/(HLA-A2402/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A2402/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A0301/H-2Db/B2M)/(HLA-A0301/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A0301/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A0201/H-2Db/B2M)/(HLA-A0201/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A0201/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA -A3101/H-2Db/B2M)/(HLA-A3101/H-2Db/B2M)、或B2m+/(HLA-A3101/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA -A2402/H-2Db/B2M)/(HLA-A0301/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A2402/H-2Db/B2M)/(HLA-A0201/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA -A2402/H-2Db/B2M)/(HLA-A3101/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A0301/H-2Db/B2M)/(HLA-A0201/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA -A0301/H-2Db/B2M)/(HLA-A3101/H-2Db/B2M)、或B2m(HLA-A0201/H-2Db/B2M)/(HLA-A3101/H-2Db/B2M)。
本发明的HLA I类基因敲入非人动物例如可以如下地制作，但并不限定于在此列举的方法。本领域技术人员可以适当改变在本领域中通常所使用的技术而使用基因重组等基因工程的方法。
在本发明的HLA I类基因敲入非人动物利用非源自作为宿主的非人动物的外源性β2微球蛋白基因作为“β2微球蛋白基因”的情况(以下，记载为“方法I”)下，可以通过将编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因座上敲入而制作。
更具体而言，可以通过包括以下工序的方法而制作，即：
(1)制作包含人工嵌合基因的靶向载体，该人工嵌合基因编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白；
(2)使该靶向载体作用于该非人动物的多能性干细胞，向该多能性干细胞的β2微球蛋白基因座上导入该人工嵌合基因。
本说明书中的“多能性干细胞”是指同时具有可以分化为多个系统的细胞的能力(多分化能力)且即使经过细胞分裂、也能够维持多分化能力的能力(自我复制能力)的细胞，可以例示例如ES(embryonic stem)细胞、GS(germline stem)细胞、iPS(inducespluripotent stem)细胞等。
另外，在本发明的HLA I类基因敲入非人动物利用源自作为宿主的非人动物的内源性β2微球蛋白基因作为“β2微球蛋白基因”的情况(以下、记载为“方法II”)下，可以通过将编码从N末端侧依次连接有HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的导入基因在该非人动物的该内源性β2微球蛋白基因(不包括终止密码子)的3’末端敲入而制作。
更具体而言，可以通过包括以下工序的方法而制作，即：
(1’)制作包含导入基因的靶向载体，该导入基因编码从N末端侧依次连接有HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质；
(2’)使该靶向载体作用于该非人动物的多能性干细胞，向该多能性干细胞的β2微球蛋白基因(不包括终止密码子)的3’末端导入该导入基因，与内源性β2微球蛋白基因一起形成上述人工嵌合基因。
作为向多能性干细胞中导入人工嵌合基因或导入基因的方法，可以使用例如本领域技术人员所公知的方法，可以使用例如利用了同源重组的导入方法。具体而言，可以使用Gene Targeting(1992，Sedivy J.M.and Joyner，A.L.)中记载的方法，或使用利用了ZFN(Zinc Finger Nuclease)、TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、CRISPR/Cas系统等的人工核酸酶的方法等。
使用Gene Targeting(1992，Sedivy J.M.and Joyner，A.L.)中记载的方法时，例如可以如下地制作本发明的非人动物。予以说明，本发明的非人动物制作方法并不限定于以下。
在方法I中，为了制作人工嵌合基因，将分别编码人β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的基因片段进行克隆。作为基因片段，可以为DNA片段。作为克隆的方法，只要可得到目的基因片段，就没有特别限定，例如可以使用PCR法。作为模板，例如可以使用持有目的基因的任何细胞及DNA库，例如可以使用由人细胞制备的总RNA或基因组DNA。作为人细胞系，例如可以使用人肿瘤细胞系(例如SW620或HepG2)。另外，如实施例中所述，也可以人工地全合成这些基因序列。
使用如以上那样得到的3种DNA片段，制作编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因。
就制作该人工嵌合基因的方法而言，只要最终构建了编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因，就没有特别限定，可以在编码该β2微球蛋白的基因片段、编码该HLA I类的α1及α2区域的基因片段、或编码该非人动物MHC I类的α3区域的基因片段的各自的5’末端或3’末端根据需要设置限制酶识别序列。
例如，使在5’末端添加有限制酶(例如NcoI)识别序列及在3’末端添加有限制酶(例如BamHI)识别序列的含有编码人β2微球蛋白的序列的基因片段和在5’末端添加有限制酶(例如BamHI)识别序列及在3’末端添加有限制酶(例如SwaI)识别序列的含有编码非人动物MHC I类的α3区域的序列的基因片段用各自的限制酶(例如BamHI)识别序列连接，在以具备限制酶识别(例如NcoI)位点及限制酶(例如SwaI)识别序列的修饰的pBluescript等适当的载体上进行克隆。将得到的载体用限制酶(例如BamHI)消化，插入在5’末端添加有限制酶(例如BamHI)识别序列及在3’末端添加有限制酶(例如BglII)识别序列的含有编码HLA I类的α1及α2区域的序列的基因片段。此时，通过选择连接含有编码人β2微球蛋白的序列的基因片段的限制酶(例如BamHI)识别序列和含有编码HLA I类的α1及α2区域的序列的基因片段的限制酶(例如BamHI)识别序列、连接含有编码非人动物MHC I类的α3区域的序列的基因片段的限制酶(例如BamHI)识别序列和含有编码HLA I类的α1及α2区域的序列的基因片段的限制酶(例如BglII)识别序列的克隆，可以得到目标目的产物。
接着，将含有非人动物的β2微球蛋白基因的第一甲硫氨酸的上游及下游的基因组片段进行克隆。该基因组片段可以为导入人工嵌合基因的非人动物的基因组片段。该非人动物可以为小鼠。作为克隆的方法，只要可得到目的基因组片段，就没有特别限定，例如可以使用PCR法。作为模板，可以使用持有目的序列的任何细胞及DNA库，例如可以使用含有目的序列的BAC克隆、或由细胞制备的基因组DNA或基因组DNA文库。BAC克隆、或由细胞制备的基因组DNA、基因组DNA文库可以为小鼠的BAC克隆、或由细胞制备的基因组DNA、基因组DNA文库。
该基因组片段只要具有足够的长度以引起ES细胞等多能性干细胞内的同源重组，就没有特别限定，优选为由于同源重组，功能性小鼠β2微球蛋白基因被破坏、且以利用小鼠β2微球蛋白基因启动子/增强子控制人工嵌合基因的表达的方式所设计的序列。
将如以上那样得到的小鼠DNA片段和上述的人工嵌合基因、正选择标记及负选择标记连接而构建靶向载体(以下，记载为“靶向载体I”)。作为正选择标记，可以使用例如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等，另外，作为负选择标记，可以使用例如白喉毒素A片段、单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因等。
为了连接各片段，可以设置编码适于适当连接的肽接头的碱基序列、和/或限制酶识别序列。
在方法II中，为了制作导入基因，将分别编码HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的基因片段与上述方法I同样地进行克隆。
使用得到的DNA片段，制作编码从N末端侧依次连接有HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的导入基因。导入基因的制作可以根据上述方法I中的人工嵌合基因的制作方法而进行。
接着，将包含非人动物的β2微球蛋白基因的β2微球蛋白基因的3’末端(不包括终止密码子)及下游的基因组片段根据上述方法I进行克隆。
该基因组片段只要具有足够的长度以ES细胞等多能性干细胞内的同源重组，就没有特别限定，优选为由于同源重组，在小鼠的内源性β2微球蛋白基因(不包括终止密码子)的3’末端依次连接编码HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的基因而形成人工嵌合基因、且以利用小鼠β2微球蛋白基因启动子/增强子控制人工嵌合基因的表达的方式所设计的序列。
将如以上那样得到的小鼠DNA片段和上述的导入基因、上述的正选择标记及负选择标记连接而构建靶向载体(以下，记载为“靶向载体II”)。
接着，将含有构建的人工嵌合基因的靶向载体I或含有构建的导入基因的靶向载体II导入于非人动物的细胞。非人动物的细胞可以为非人动物的多能性干细胞。作为非人动物的多能性干细胞，例如可以为小鼠的ES细胞。作为小鼠的ES细胞，例如可以例示129系统的小鼠、C57BL/6系统的小鼠等，优选为源自129系统的小鼠的ES细胞。
作为将靶向载体I或II导入于非人动物的方法，可以使用各种方法，只要是可以将基因导入细胞的方法即可，例如，可以使用电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法等。另外，通过与以敲入于目的基因座的方式所设计的ZFN(Zinc Finger Nuclease)或TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)等人工核酸酶技术相结合，也可以以高效率引起敲入。
将导入有上述靶向载体的ES细胞等多能性干细胞接种在对特定抗生素具有抗性的饲养细胞上，在特定抗生素存在下进行培养。挑出在选择培养第6-8天存活的抗性集落，将一部分进行传代培养，使用剩余的细胞利用PCR法确认同源重组的有无。对得到的PCR阳性克隆，利用Southern杂交法确认随机整合的有无，将没有检测出随机整合的克隆用于以下的工序。
从与使用的ES细胞显示不同的被毛颜色的系统的妊娠小鼠中取出胚泡期的胚，使用显微操作法，将约10个上述的同源重组体ES细胞注射于分裂腔内。可以使用聚集(凝集)法将ES细胞移植于8细胞期的胚。可以通过将上述的胚移植于假妊娠的雌性小鼠子宫内、使其妊娠、生产而制作嵌合小鼠。
通过使得到的雄性嵌合小鼠和显示与使用的ES细胞不同的被毛颜色品系的雌性小鼠交配，产生源自ES细胞的被毛颜色的子代，由此可以确认ES细胞转移到生殖系。进而，通过使用PCR法分析子代的基因型，可以获得β2微球蛋白基因座中的人工嵌合基因敲入、杂合子小鼠(即在小鼠的一对β2微球蛋白基因的一个基因座的转录调控区的控制下敲入人工嵌合基因的小鼠)。
另外，通过将得到的杂合子小鼠彼此交配，可以得到人工嵌合基因敲入、纯合子小鼠(即在小鼠的一对β2微球蛋白基因座的两个基因座的转录调控区的控制下敲入人工嵌合基因的小鼠)。
另外，通过将分别敲入有含有不同的HLA I类基因的人工嵌合基因的2种品系的敲入小鼠彼此交配，可以制作在一对β2微球蛋白基因座上分别插入有各1个拷贝的含有不同的HLA I类基因的人工嵌合基因的杂合子人源化小鼠。
在所制作的敲入小鼠中人工嵌合基因是否在细胞表面表达，可以通过例如从敲入小鼠中回收血细胞或脾细胞，使用流式细胞仪法对该血细胞或脾细胞进行分析来确认。在杂合子小鼠中，由于保留了野生型的β2微球蛋白基因座，因此，小鼠H-2I类也表达，但在纯合子小鼠中，可以确认小鼠H-2I类的表达消失，为仅表达导入的人工嵌合基因的MHC I类人源化小鼠。
本发明的非人动物是否可以用作人模型，可以使用本领域技术人员所公知的所有方法进行检测，例如使导入的人工嵌合基因中所含的HLA I类限制性的抗原作用于本发明的HLA I类基因敲入非人动物，确认诱导抗原特异性CTL等，以下，记载了非人动物为小鼠时的代表性的确认方法的一例。
例如，利用常规方法将导入的HLA I类限制性的已知抗原肽与不完全弗氏佐剂混合，制作乳液。将该乳液施用于本发明的HLA I类基因敲入小鼠的尾根部周围的皮下。作为免疫部位，也可以在背部皮下或腹腔内进行施用。从最终给药1周后，从小鼠腹股沟摘除淋巴结，利用常规方法制备淋巴结细胞。也可以使用由脾细胞等其它组织制备的细胞。
将制备的细胞在抗原肽、细胞因子(白细胞介素2、15、21等)存在下培养1周左右，例如使用应用了夹心ELISA的原理的ELISPOT检测对来自T细胞的白细胞介素2或干扰素γ等细胞因子分泌进行分析，由此可以研究CTL诱导。另外，此时，也可以使用将由非免疫敲入小鼠制备的脾细胞进行X射线照射，与作为抗原呈递细胞的淋巴结细胞共培养的物质。例如，通过确认利用抗原刺激所诱导的CTL产生的各种细胞因子的量与施用了阴性对照的情况相比显著地增加，可以确认本发明的非人动物能够用作人类模型。
另外，该情况下，进一步加入表达与本发明的非人动物相同的HLA I类的靶细胞，评价相对于靶细胞的细胞毒性，由此也可以确认本发明的非人动物能够用作人类模型。作为靶细胞，例如可以使用从本发明的非人动物中分离出的细胞、或导入有制作中使用的人工嵌合基因的细胞、或天然地表达该HLA I类基因的细胞。该情况下，例如可以使用51Cr释放法检测(Int.J.Cancer，58：317(1994))等。即，将所述靶细胞进行51Cr标记，脉冲作为对象的抗原，添加本发明的源自非人动物的样品(例如脾细胞)，测定靶细胞受CTL的损伤而游离的51Cr的量。如果通过这种检测观察到抗原特异性CTL的诱导，则可以确认本发明的非人动物能够用作人类模型。
本发明还提供一种由本发明的HLA I类基因敲入非人动物得到的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系。作为优选的组织或器官，为胸腺、脾脏、骨髓、造血组织、或淋巴组织。作为优选的细胞，为抗原呈递细胞、T细胞、B细胞、或造血干细胞。
本发明还提供一种细胞，所述细胞在非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及该非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因。在由该细胞表达的人工嵌合基因中，β2微球蛋白基因既可以为非源自作为宿主的非人动物细胞的外源性β2微球蛋白基因，也可以利用源自非人动物细胞的内源性β2微球蛋白基因。该细胞可以根据上述方法通过向非人动物细胞导入上述靶向载体I或II来制作。优选非人动物的细胞为非人动物的多能性干细胞，进一步优选为非人动物的ES细胞或iPS细胞。或者，该细胞可以为从HLA I类基因敲入非人动物中分离或诱导的细胞。
以下，例示本发明的HLA I类基因敲入非人动物、其衍生物(例如细胞、器官等)、表达本发明的人工嵌合基因的细胞、来自其的衍生物(例如在表达人工嵌合基因的细胞为iPS细胞的情况下，为由该iPS细胞制作的器官等)的使用方法，但并不限定于在此列举的方法。
可以使用本发明的HLA I类基因敲入非人动物、其衍生物(例如细胞、器官等)、表达本发明的人工嵌合基因的细胞、或来自其的衍生物(例如在表达人工嵌合基因的细胞为iPS细胞的情况下，为由该iPS细胞制作的器官等)，进行受试物质特异性的CTL诱导剂的筛选、HLA I类限制性抗原是否存在的评价、疾病(例如癌症)的治疗剂或预防剂的筛选、由受试物质所诱发的CTL反应的HLA限制特异性的比较、由受试物质诱发的CTL反应的有效性的评价、受试物质的安全性(例如受试物质诱发自身免疫性疾病的危险性的有无)的评价等。
具体而言，例如通过对本发明的HLA I类基因敲入非人动物施用受试物质并测定/评价该受试物质的CTL诱导能力，可以进行CTL诱导剂的筛选、HLA I类限制性抗原是否存在的评价、和/或疾病的治疗剂或预防剂的筛选。作为“受试物质”，可列举例如：已知的肿瘤抗原蛋白或其部分肽、病毒体、源自病毒的抗原蛋白或其部分肽、源自细菌的抗原蛋白及其抗原肽、或活性未知的蛋白质或肽、或者编码它们的多核苷酸或寡核苷酸等。CTL诱导能力的测定/评价可以使用上述HLA I类基因敲入非人动物的评价方法(例如51Cr释放法检测(Int.J.Cancer，58：317(1994))等)而进行。在确认了该受试物质的CTL的诱导的情况下，得知：在该受试物质中含有HLA I类限制性抗原，另外该受试物质可作为CTL诱导剂起作用。这样得到的CTL诱导剂可以作为肿瘤、病毒或细菌引起的传染病的治疗剂和/或预防剂利用。另外，通过对本发明的HLA I类基因敲入非人动物施用受试物质并测定/评价该受试物质的CTL诱导能力，可以评价由受试物质所诱发的CTL反应的有效性或安全性(例如产生自身免疫反应的可能性)。
此外，本发明的HLA I类基因敲入非人动物可控制人工嵌合基因的拷贝数及导入位点，因此，可以将该人工嵌合基因的表达量在表达不同的HLA I类基因的不同的系统间也设为类似。由此，通过同样地对多个不同的系统的HLA I类基因敲入非人动物施用受试物质并测定各非人动物中的该受试物质的CTL诱导能力且进行比较评价，可以评价由受试物质所诱发的CTL反应的特异性或有效性。
本发明另外通过将由用肽疫苗免疫的本发明的HLA I类基因敲入非人动物制备的CTL细胞移植于异种移植了人癌细胞系的免疫缺陷非人动物，可以评价该肽疫苗的抗肿瘤效果。
实施例
以下，通过实施例，具体地说明本发明，但实施例用于例证，本发明并不受这些实施例的任何限制。
实施例1：HLA-A2402基因部分序列的克隆
首先，为了制作人工嵌合基因，基于HLA-A2402的序列信息(GeneBank AccessionNo.L47206.1)，以人肿瘤细胞系SW620的基因组DNA为模板，使用PCR法克隆含有α1及α2区域的基因片段。此时，为了能够进行与人β2微球蛋白基因及小鼠H-2的α3区域的结合，在N末端侧添加编码含有BamHI识别序列的10个氨基酸的肽的序列，在C末端侧的内含子3序列内添加BglII识别序列。具体而言，通过使用下述中记载的引物进行PCR法，得到进行了该改变的867bp的DNA片段。
Bam-10AA-A24-F1：
5’-GGATCCGGCGGAGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCGGCTCTGGATCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTCC-3’(序列号18)
Bgl-A24-R1：
5’-AGATCTACAGGCGATCAGGTAGGCGCCCC-3’(序列号19)
实施例2：人β2微球蛋白cDNA的克隆
接着，基于人β2微球蛋白的cDNA序列信息(GeneBank Accession No.NM＿004048.2)，以由人肿瘤细胞系HepG2制备的总RNA为模板，使用RT-PCR法克隆人β2微球蛋白cDNA。此时，为了能够进行与HLAα1/α2区域的结合，在C末端侧添加编码含有BamHI识别序列的5个氨基酸的肽的序列。另外，人工嵌合基因在相当于小鼠β2微球蛋白的第一甲硫氨酸的部位被敲入，同时，在N末端侧添加含有NcoI识别序列的HLA-A24的前导序列以使受到正常的处理而能够在细胞膜上表达。具体而言，通过使用下述中记载的引物进行PCR法，得到进行了该改变的386bp的DNA片段。
Nco-A24L-hB2m-F1：
5’-CCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGT-3’(序列号20)
Bam-5AA-hB2m-R1：
5’-GGATCCGCCACCTCCACTGTCTCGATCCCACTTAACTATC-3’(序列号21)
实施例3：小鼠H-2Db基因部分序列的克隆
进而，基于小鼠H-2Db的序列信息(GeneBank Accession No.M37681.1)，以C57BL6/N小鼠的基因组DNA为模板，使用PCR法，将还包含细胞内结构域区域的α3以后的区域(外显子4～8及内含子3～7)进行克隆。此时，可进行与HLAα1/α2区域的结合，同时，在N末端侧的内含子3上添加BamHI识别序列，在C末端侧添加例如SwaI识别序列以使以后的载体构建变得容易。具体而言，通过使用下述记载的引物进行PCR法，得到进行了该改变的2494bp的DNA片段。
Bam-H-2Db-F1：
5’-GGATCCTGTGTGACATACCTGTACCTTGTC-3’(序列号22)
Swa-H-2Db-R1：
5’-ATTTAAATCTAGTTGAGTCTCTGATCTTTAGCCCTAGG-3’(序列号23)
实施例4：人工嵌合基因(HHD-A2402)的构建
将如以上那样得到的人β2微球蛋白cDNA片段、人HLA-A2402基因组片段及小鼠H-2Db基因组片段连接，构建全长为3735bp的所期望的人工嵌合基因(HHD-A2402)。(图1)
实施例5：靶向载体的制作
接着，如图2所示制作用于将上述所制作的人工嵌合基因(HHD-A2402)敲入于小鼠β2微球蛋白基因的靶向载体。
首先，基于小鼠β2微球蛋白的cDNA序列信息(GeneBank Accession No.NM＿009735.3)，从含有小鼠β2微球蛋白基因的基因组区域(GeneBank Accession No.NC＿000068.7)克隆在ES细胞内的同源重组中所需要的基因组序列。具体而言，以C57BL6/N小鼠的基因组DNA为模板，使用PCR法克隆小鼠β2微球蛋白基因的第一甲硫氨酸的上游约1.2Kb。此时，可以进行与人工嵌合基因(HHD-A2402)的结合，同时，在5’端侧添加SalI识别序列，在3’末端侧添加NcoI识别序列以使以后的载体构建变得容易。具体而言，通过使用下述中记载的引物进行PCR法，得到进行了该改变的1198bp的DNA片段。
B2m-SHA-F1：
5’-GTCGACCTGGGTAGACACTGTAGGATTGGGTCTCTG-3’(序列号24)
B2m-SHA-R1：
5’-CCATGGTGACGACTGAAGCGACCGCGACTG-3’(序列号25)
接着，从含有小鼠β2微球蛋白基因的基因组DNA序列的BAC克隆(RP23-34E24)，克隆从内含子2的NheI识别序列至内含子4的SacII识别序列的全长8462bp的基因组片段。
通过将如以上那样得到的小鼠β2微球蛋白基因的基因组片段及人工嵌合基因(HHD-A2402)与PGK-DT-A 盒及PGK-neo-bpA 盒同时在质粒pBluescriptⅡKS+上进行克隆，制作由全长约19.2Kb构成的所期望的靶向载体。(图3)
实施例6：向ES细胞导入靶向载体
接着，将实施例5中所制作的靶向载体导入于ES细胞。
ES细胞使用从Millipore社购入的CMTI-1细胞(Passage 11)。以下的实施例中记载的细胞的培养使用添加有20％FBS(ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum)(LifeTechnologies社)及103units/mL的LIF(Leukocyte Inhibitory Factor)(Millipore社)的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)(Life Technologies社)，在37℃的5％CO2细胞培养箱中进行。
将实施例5中制作的靶向载体50μg用NotI切割之后，溶解于0.2mL的ES细胞用电穿孔缓冲液(Millipore社)，与悬浮于0.3mL的电穿孔缓冲液的2×107个CMTI-1细胞同时在电穿孔用样品池(bio-rad社)中进行混合。其后，使用Gene PulserⅡ(bio-rad社)，在250V、500μF的条件下给予电脉冲，在5个预先接种有新霉素抗性饲养细胞(DS Pharma社)的10cm培养皿中各加入0.1mL。12-18小时后，添加效价为250μg/mL的G418(nacalai tesque)，培养1周。
实施例7：已发生同源重组的ES细胞的选择和确认
在实施例6中，收集384个添加G418后培养1周后存活的ES细胞集落。将各集落分成两份，一份继续培养，另一份用PBS洗涤之后进行蛋白酶K处理，使用下述记载的引物进行PCR，选择3个已发生同源重组的克隆。
HHD-HRES-F1：
5’-AGCATTTCCTAGTACAGTTCAACACAGTGTTTAGT-3’(序列号26)
HHD-HRES-R1：
5’-GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT-3’(序列号27)
关于PCR的实验条件，将94℃30秒、60℃1分钟、72℃2分钟作为1循环进行35循环，通过PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳，将检测出在成功地进行同源重组时所预测的PCR产物(约1.4Kb)的克隆判断为阳性。
为了更准确地确认同源重组，从在前项中认为是阳性的ES细胞克隆中提取基因组DNA，利用如下DNA印迹技术法进行分析。
将10μg基因组DNA用限制酶EcoRI切割后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在10×SSC溶液中通过毛细管法转移到尼龙薄膜Hybond-N+(Pharmacia社)上。从实施例5中克隆的1198bp的DNA片段进一步制备5’-侧上游的约0.5Kb的DNA片段。将以[α-32P]-dCTP(Perkinelmer社)标记的上述DNA片段作为探针进行Southern杂交，成功地进行了同源重组的约2.1Kb的条带和源自野生型的2.5Kb的条带以1：1被检测出。(图4)
实施例8：敲入人工嵌合基因(HHD-A2402)的转基因动物的制作
将确认已发生同源重组的ES细胞通过胰蛋白酶处理进行分散。从适于与小鼠C57BL/6系统的雄体交配的同品系的雌体中取出胚泡，使用微注射装置(NARISHIGE社)，向每1个胚泡的分裂腔内注入约10个上述ES细胞。将其移至进行了假妊娠处理的雌性小鼠的子宫中，通过持续产生胎儿以得到嵌合小鼠。
将该嵌合小鼠的雄体与C57BL/6系统的雌体交配，选择刚出生的仔鼠中的野生型色(agouti)，从切割自其尾巴的一部分的试样中提取基因组DNA，使用下述记载的引物进行PCR。
HHD-F1：
5’-CTAGAAGCAAGGTCAGAAATCCTCT-3’(序列号28)
HHD-WT-R3：
5’-CCGTCAGCACACTCGCAAACAGGCG-3’(序列号29)
HHD-HRES-R1：
5’-GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT-3’(序列号30)
关于PCR的实验条件，将94℃30秒、60℃1分钟、72℃1分钟作为1循环进行35循环，将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。除源自野生型基因座的804bp的PCR产物之外，通过检测出在成功地进行同源重组时所预测的510bp的PCR产物，确认敲入杂合子小鼠。
将敲入杂合子小鼠彼此交配，从切割自出生不久的仔鼠的尾巴的一部分的试样中提取基因组DNA，使用上述PCR法分析基因型。源自野生型基因座的804bp的PCR产物没有被检测出，通过仅检测出在成功地进行同源重组时所预测的510bp的PCR产物，确认敲入纯合子小鼠。
将由利用PCR法判定为纯合子、杂合子及野生型的小鼠各3只的尾巴的一部分制备的基因组DNA通过实施例7中记载的Southern杂交法进行分析，结果，在纯合子中，确认仅约2.1Kb的条带，在杂合子中，确认约2.1KB及约2.5Kb的2个条带，在野生型小鼠中，确认仅约2.5Kb的条带。(图5)
对纯合子、杂合子及野生型小鼠各3只实施安乐死，使用Isogen(和光纯药工业)及RNeasy Kit(QIAGEN社)由肝脏制备总RNA，在进行DNA酶I处理之后，使用SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesized System(Life Technologies社)合成cDNA。在加入检测小鼠β2微球蛋白及核糖体RNA的TaqMan Assay Mix(Applied Biosystems社)和2×TaqManUniversal Master Mix(Applied Biosystems社)之后，使用PRISM7900HT SequenceDetection System(AppliedBiosystems社)利用定量RT-PCR法进行分析，结果确认：在纯合子中，小鼠β2微球蛋白mRNA的表达几乎完全消失，在杂合子中，减少至野生型小鼠的表达量的约一半。(图6)
实施例9：敲入人工嵌合基因(HHD-A0301)的转基因动物的制作
基于人HLA-A0301的序列信息(GeneBank Accession No.AJ748743.1)，进行包含α1及α2区域的基因片段的全合成。具体而言，在N末端侧添加编码含有BamHI识别序列的10个氨基酸肽的序列、及在C末端侧的内含子3序列内添加BglII识别序列，合成下述记载的867bp的DNA片段。
5’-
ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttcattttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCATCCAGATAATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATGAGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGATGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct-3’(序列号31)(大写字母表示外显子区域，小写字母表示内含子区域)
以后，利用实施例2～8中记载的方法制作HHD-A0301的敲入杂合子小鼠及敲入纯合子小鼠。
实施例10：敲入人工嵌合基因(HHD-A0201)的转基因动物的制作
基于人HLA-A0201的序列信息(GeneBank Accession No.AY365426.1)，进行包含α1及α2区域的基因片段的全合成。具体而言，在N末端侧添加编码含有BamHI识别序列的10个氨基酸肽的序列、及在C末端侧的内含子3序列内添加BglII识别序列，合成下述中记载的867bp的DNA片段。
5’-
ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttcattttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct-3’(序列号43)(大写字母表示外显子区域，小写字母表示内含子区域)
以后，利用实施例2～8中记载的方法，制作HHD-A0201的敲入杂合子小鼠及敲入纯合子小鼠。
实施例11：敲入人工嵌合基因(HHD-A3101)的转基因动物的制作
基于HLA-A3101的序列信息(GeneBank Accession No.M84375.1)，进行包含α1及α2区域的基因片段的全合成。具体而言，在N末端侧添加编码含有BamHI识别序列的10个氨基酸肽的序列、及在C末端侧的内含子3序列内添加BglII识别序列，合成下述中记载的867bp的DNA片段。
5’-
ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCACCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGAGGCCTGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCACTCACAGATTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttcattttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCATCCAGATGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCAGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCTTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct-3’(序列号44)(大写字母表示外显子区域，小写字母表示内含子区域)
以后，利用实施例2～8中记载的方法制作HHD-A3101的敲入杂合子小鼠及敲入纯合子小鼠。
实施例12：敲入HHD-A2402及HHD-A0301的转基因动物的制作
将HHD-A2402敲入纯合子小鼠和HHD-A0301敲入纯合子小鼠交配，制作持有各1个拷贝的HHD-A2402及HHD-A0301基因的双重敲入小鼠。
实施例13：敲入小鼠中的人及小鼠MHC I类的表达确认
对HHD-A2402、HHD-A0301各自的敲入纯合子小鼠、敲入杂合子小鼠、同窝对照(同腹対照)的野生型小鼠及HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠实施安乐死，利用流式细胞仪法分析从摘除的脾脏中回收的脾细胞或血细胞表面上的人MHC I类的表达。具体而言，将1×106个脾细胞或血细胞用单克隆的PE标记的抗HLA抗体17A10(MBL社)、或作为一抗的生物素化抗体4i153(Abcam社)及作为二抗的PE标记的抗生物素抗体Bio3-18E7(MiltenyiBiotec)进行染色。
其结果，在HHD-A2402敲入纯合子小鼠及HHD-A2402敲入杂合子小鼠中，确认HLA-A24的表达，而在HHD-A0301敲入纯合子小鼠及HHD-A0301敲入杂合子小鼠中，确认HLA-A3的表达。另外，在HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠中，可观察到HLA-A24及HLA-A3两者的表达。(图7-1、图7-2)
进而，使用PE标记的抗H-2Kb抗体AF6-88.5(BD Bioscience社)分析脾细胞表面上的内源性小鼠MHC I类的表达，结果，在野生型及HHD-A2402敲入杂合子小鼠及HHD-A0301敲入杂合子小鼠中可观察到H-2Kb的表达，但在HHD-A2402敲入纯合子小鼠、HHD-A0301敲入纯合子小鼠、及HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠中确认H-2Kb的表达几乎完全消失。(图8-1、图8-2)
同样地，使用单克隆的PE标记的抗HLA-A2抗体BB7.2(MBL社)及单克隆的FITC标记的抗人β2微球蛋白抗体TU99(BD Bioscience社)确认HHD-A0201敲入纯合子小鼠、杂合子小鼠及同窝(同腹)对照的野生型小鼠的血细胞表面上的HLA-A2及人β2微球蛋白的表达，并使用单克隆的FITC标记的抗人β2微球蛋白抗体TU99确认HHD-A3101敲入纯合子小鼠、杂合子小鼠及同窝对照的野生型小鼠的血细胞表面上的人β2微球蛋白的表达。
其结果，在HHD-A0201敲入纯合子小鼠及HHD-A0201敲入杂合子小鼠中，可观察到HLA-A2及人β2微球蛋白的表达(图9-1)，另外，在HHD-A3101敲入纯合子小鼠及HHD-A3101敲入杂合子小鼠中，可观察到人β2微球蛋白的表达(图9-2)。
进而，使用PE标记的抗H-2Kb/H-2Db抗体28-8-6(Biolegend社)分析血细胞表面上的内源性的小鼠MHC I类的表达，结果，在野生型及HHD-A0201敲入杂合子小鼠及HHD-A3101敲入杂合子小鼠中，可观察到H-2Kb和/或H-2Db的表达，但在HHD-A0201敲入纯合子小鼠及HHD-A3101敲入纯合子小鼠中，确认H-2Kb及H-2Db的表达几乎完全消失。(图10-1、图10-2)
实施例14：A24敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
将下述记载的病毒衍生的抗原肽或阴性对照肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场)制备为2mg/mL，填充于B Braun Injekt注射器。
A24V6：EYLVSFGVW(A24限制性HBV衍生的抗原)(序列号32)
A24V8：SFHSLHLLF(A24限制性HTLV衍生的抗原)(序列号33)
A24V9：DYCNVLNKEF(A24限制性EBV衍生的抗原)(序列号34)
A24V10：RYLRDQQLL(A24限制性HIV衍生的抗原)(序列号35)
在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂(IFA)之后，将两注射器用GP注射器连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A24纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各100μL/小鼠施用上述乳液，总计2次。最终施用1周后，从小鼠中回收腹股沟淋巴结。将淋巴结细胞悬浮液用完全培养基(RPMI-1640，10％热灭活的FBS，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，50μM 2-巯基乙醇)制备为5×106细胞/mL，分别加入靶CTL表位肽(最终浓度10μg/mL)、重组小鼠IL-15(最终浓度100ng/mL)、重组小鼠IL-21(最终浓度100ng/mL)，以1mL/孔向24孔板接种后，在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养8天。8天后，回收细胞，在Murine IFN-γELISpot Kit(GEN-PROBE)添加的抗IFN-γ抗体固相化板上以1×105细胞/孔接种。接着，将由同系小鼠脾脏制备且照射有30Gy的X射线的脾细胞向同一孔作为抗原呈递细胞以1×105细胞/孔接种后，加入靶CTL表位肽、或阴性对照肽(最终浓度10μg/mL)，在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养一夜。第二天，按照试剂盒的说明书文件，使产生IFN-γ的细胞点显色。产生IFN-γ的细胞点数用ELISPOT分析器(Immunospot S6，Cellular Technology Ltd.)进行定量。其结果，如图11所示，在A24纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生的抗原肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数(Student’s t-test，p＜0.001)、确认表位特异性CTL的诱导。
实施例15：A3敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
将下述记载的病毒衍生的抗原肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场)制备为2mg/mL，填充于B Braun Injekt注射器。
A3V3：RLRPGGKKK (A3限制性HIV衍生的抗原)(序列号36)
A3V4：QVPLRPMTYK (A3限制性HIV衍生的抗原)(序列号37)
A3V7：RLRAEAQVK (A3限制性EBV衍生的抗原)(序列号38)
A3V10：SIIPGPLK (A3限制性流感病毒衍生的抗原)(序列号39)
在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂(IFA)之后，将两注射器用GP注射器连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A3纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各100μL/小鼠施用上述乳液，总计2次，以后，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱导。其结果，如图12所示，在A3纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生的抗原肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数(Student’s t-test，p＜0.01或p＜0.001)，确认表位特异性CTL的诱导。
实施例16：A24/A3双重敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
同样地，将病毒衍生的抗原肽(A3V7及A24V8)施用于A24/A3双重敲入小鼠及野生型小鼠，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱导。其结果，如图13所示，在A24/A3双重敲入小鼠中，添加上述病毒衍生的抗原肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数(Student’s t-test，p＜0.001)，确认表位特异性的CTL的诱导。
实施例17：A2敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
将下述记载的病毒衍生的抗原肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场)制备为1mg/mL，填充于B Braun Injekt注射器。
A2V1：CLGGLLTMV(序列号45)
A2V2：GLCTLVAML(序列号46)
A2V3：NLVPMVATV(序列号47)
A2V4：VLAELVKQI(序列号48)
A2V7：VLSDFKTWL(序列号49)
A2V8：FLPSDFFPSV(序列号50)
A2V9：FLLTRILTI(序列号51)
A2V10：GLSPTVWLS(序列号52)
在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂(IFA)之后，将两注射器用GP注射器连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A2纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各100μL/小鼠施用上述乳液，总计2次，以后，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱导。其结果，如图14所示，在A2纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生的抗原肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数(Student’s t-test，p＜0.001)，确认表位特异性的CTL的诱导。
实施例18：A31敲入小鼠中的CTL诱导能力的确认
将下述记载的病毒衍生的抗原肽用大塚蒸馏水(大塚制药工场)制备为1mg/mL，填充于B Braun Injekt注射器。
A31V3：ASCMGLIYNR (序列号53)
A31V5：SVQPTFSVQR(序列号54)
A31V6：KFLPDLYDYK(序列号55)
A31V8：SFSFGGFTFK(序列号56)
A31V10：RVIDPRRCMK(序列号57)
在其它注射器中填充等量的弗氏不完全佐剂(IFA)之后，将两注射器用GP注射器连接器连接，通过使病毒衍生的抗原肽溶液和IFA充分地混合而制备乳液。在A31纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠及同窝野生型小鼠的尾根部的皮下按每周1次各100μL/小鼠施用上述乳液，总计2次，以后，利用实施例14中记载的方法评价病毒衍生的抗原肽特异性的CTL的诱导。其结果，如图15所示，在A31纯合敲入小鼠、杂合敲入小鼠任一个中，添加上述病毒衍生的抗原肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数显著地高于添加阴性对照肽的孔的产生IFN-γ的细胞点数(Student’s t-test，p＜0.01或p＜0.001)，确认表位特异性的CTL的诱导。
实施例19：敲入小鼠中的CD4-CD8+T细胞团的分析
对HHD-A2402、HHD-A0301、HHD-A0201、HHD-A3101各自的敲入纯合子小鼠、敲入杂合子小鼠、同窝对照的野生型小鼠、及HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠实施安乐死，利用流式细胞仪法分析血细胞表面上的CD4及CD8的表达。具体而言，将1×106个血细胞用单克隆的PE-Cy7标记的抗CD4抗体GK1.5(eBioscience社)及FITC或APC标记的抗CD8抗体53-6.7(eBioscience社)进行染色。
其结果，在HHD-A2402、HHD-A0301、HHD-A0201、HHD-A3101各自的敲入杂合子小鼠中，CD4-CD8+T细胞的比例与野生型小鼠类似，但在HHD-A2402、HHD-A0301、HHD-A0201、HHD-A3101各自的敲入纯合子小鼠及HHD-A2402/HHD-A0301双重敲入小鼠中，确认CD4-CD8+T细胞的比例与野生型小鼠相比显著地减少。(图16-1、图16-2)
将本说明书中引用的全部的刊行物、专利及专利申请直接作为参考引入于本说明书中。

Claims (45)

1.一种用于制备HLA I类基因敲入非人动物的方法，所述方法包括将编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及所述非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因引入到所述非人动物的位点，其中所述人工嵌合基因在该非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达，并且其中所述非人动物是啮齿类动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，人工嵌合基因被引入为在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的一个基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，HLAI类的α1及α2区域源自HLA-A。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，HLA-A为HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，HLA-A为HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLAI类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的第1人工嵌合蛋白的第1人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的第1基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达；
编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHCI类的α3区域的蛋白质的第2人工嵌合蛋白的第2人工嵌合基因在该非人动物的一对β2微球蛋白基因座中的与该第1基因座不同的第2基因座中的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域源自相同基因型的HLA。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域源自不同基因型的HLA。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域源自HLA-A。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域相同或不同，源自HLA-A24、HLA-A3、HLA-A2或HLA-A31。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，第1人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域和第2人工嵌合蛋白的HLA I类的α1及α2区域相同或不同，源自HLA-A2402、HLA-A0301、HLA-A0201或HLA-A3101。
12.根据权利要求1～2、4-8和10-11中任一项所述的方法，其中，非人动物MHC I类的α3区域源自H-2I类。
13.根据权利要求3所述的方法，其中，非人动物MHC I类的α3区域源自H-2I类。
14.根据权利要求9所述的方法，其中，非人动物MHC I类的α3区域源自H-2I类。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，非人动物MHC I类的α3区域源自H-2Db。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中，非人动物MHC I类的α3区域源自H-2Db。
17.根据权利要求1～2、4-8、10-11和13-15中任一项所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
18.根据权利要求3所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
19.根据权利要求9所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
20.根据权利要求12所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
21.根据权利要求16所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
22.根据权利要求1～2、4-8、10-11、13-15和18-21中任一项所述的方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
23.根据权利要求3所述的方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
24.根据权利要求9所述的方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
25.根据权利要求12所述的方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
26.根据权利要求16所述的方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
27.根据权利要求17所述的方法，其中，啮齿类动物为小鼠。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述小鼠具有B2m+/(HLA/H-2/B2M)或B2m(HLA /H-2/B2M)/(HLA/H-2/B2M)表示的基因型。
29.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述小鼠具有B2m+/(HLA/H-2/B2M)或B2m(HLA/H-2/B2M)/(HLA/H-2/B2M)表示的基因型。
30.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下工序：
(1)制作包含人工嵌合基因的靶向载体，该人工嵌合基因编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白；
(2)使该靶向载体作用于该非人动物的多能性干细胞，导入在该多能性干细胞的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，多能性干细胞为ES细胞、GS细胞或iPS细胞。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中，通过同源重组将人工嵌合基因导入在多能性干细胞的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下。
33.根据权利要求30或31所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，β2微球蛋白为人β2微球蛋白。
35.一种分离自由根据权利要求1-34中任一项所述的方法制备的非人动物的细胞，所述细胞在非人动物的β2微球蛋白基因的转录调控区的控制下表达编码含有从N末端侧依次连接有β2微球蛋白、HLA I类的α1及α2区域以及该非人动物MHC I类的α3区域的蛋白质的人工嵌合蛋白的人工嵌合基因，其中所述细胞不是生殖细胞。
36.一种由根据权利要求1～34中任一项所述的方法制备的HLA I类基因敲入非人动物得到的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系，其中所述分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系不是生殖细胞。
37.一种受试物质特异性CTL诱导剂的筛选方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于由权利要求1～34中任一项所述的方法制备的HLA I类基因敲入非人动物、权利要求35所述的细胞、或权利要求36所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系的工序；
(2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
38.一种评价HLA I类限制性抗原是否存在的方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于由根据权利要求1～34中任一项所述的方法制备的HLA I类基因敲入非人动物、权利要求35所述的细胞、或权利要求36所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系的工序；
(2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
39.一种疾病的治疗剂或预防剂的筛选方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于由根据权利要求1～34中任一项所述的方法制备的HLA I类基因敲入非人动物、权利要求35所述的细胞、或权利要求36所述的离体组织、离体器官、分离出的细胞、原代细胞培养物、或已建立的细胞系的工序；
(2)评价受试物质是否诱导特异性CTL的工序。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，疾病为癌症或传染病。
41.一种比较由受试物质所诱发的CTL反应的HLA限制特异性的方法，所述方法包括以下的(1)～(2)的工序：
(1)将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、由根据权利要求1～34中任一项所述的方法制备的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反应的工序；
(2)比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限制性的工序。
42.一种评价由受试物质诱发的CTL反应的有效性的方法，所述方法包括以下的(1)～(2)的工序：
(1)将受试物质施用于分别表达不同的HLA I类基因的多个不同的系统的、由根据权利要求1～34中任一项所述的方法制备的HLA I类基因敲入非人动物，分别测定在该非人动物中被诱发的CTL反应的工序；
(2)比较分别测定的该非人动物的CTL反应，判定诱发CTL反应的受试物质的HLA限制性的工序。
43.一种受试物质的安全性评价方法，所述方法包括以下的(1)及(2)的工序：
(1)使受试物质作用于由根据权利要求1～34中任一项所述的方法制备的HLA I类基因敲入非人动物的工序；
(2)分析发生在该非人动物中的不良应答的工序。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，不良应答为自身免疫反应。
45.根据权利要求37～44中任一项所述的方法，其中，受试物质为一种或多种肽、一种或多种多肽、一种或多种寡核苷酸、一种或多种多核苷酸、或者一种或多种蛋白质。
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