ES2874501T3

ES2874501T3 - Animal no humano que expresa HLA de clase I

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Publication number: ES2874501T3
Application number: ES14853234T
Authority: ES
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2034-10-17
Also published as: CN105578876A; EP3058819A4; HK1223507A1; EP3058819A1; US20160227750A1; US10278373B2; JP6236461B2; WO2015056774A1; EP3058819B1; CN105578876B; JPWO2015056774A1

Abstract

Un roedor con un gen del HLA de clase I insertado (knock-in), en el cual un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina β2 exógena o endógena, las regiones α1 y α2 del HLA de clase I y una región α3 del MHC de clase I del roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal, se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina β2 del roedor.

Description

DESCRIPCIÓN

Animal no humano que expresa HLA de clase I

Campo técnico

La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 29.

Antecedentes de la técnica

El complejo principal de histocompatibilidad (MHC) juega un papel clave en el mecanismo de defensa de un organismo inducido por respuestas inmunitarias de linfocitos T al presentar un péptido antigénico derivado de cáncer o de virus. El MHC se clasifica como clase I o clase II, y la clase I se expresa en todas las células somáticas excepto en las células germinales y los eritrocitos. El MHC de clase I está compuesto por una cadena a y una cadena p, y la cadena a está compuesta por regiones a l y a2 asociadas con la formación de un surco de retención de péptidos antigénicos y una región a3 asociada con la unión a una molécula correceptor CD8 expresada en la superficie de los linfocitos T citotóxicos (CTL). En cambio, la cadena p del MHC de clase I está codificada por el gen de la microglobulina p2 (Documento no de patente 1).

Se sabe que los linfocitos T citotóxicos (CTL) se activan al reconocer un complejo de una molécula de MHC de clase I y un péptido antigénico existente en la superficie de la célula presentadora de antígeno (APC) con la ayuda de un receptor de linfocitos T y se sabe que específicamente daña las células cancerosas o las células infectadas por virus que expresan los mismos complejos. Con el uso de dicho mecanismo inmunitario mediado por células, se ha intentado el desarrollo de vacunas utilizadas para la inmunoterapia del cáncer o el tratamiento de infecciones.

El MHC de clase I (H-2 de clase I) de los ratones que se utilizan comúnmente como animales de experimentación es diferente del MHC de clase I (HLA de clase I) de los seres humanos. Por lo tanto, los ratones no se pueden utilizar como modelos de evaluación in vivo para el desarrollo de vacunas humanas. Por lo tanto, se han inyectado en óvulos de ratón fertilizados genes HLA humanos que contienen una región promotora o genes recombinantes que comprenden los genes HLA insertados en sitios en dirección 3' de una región promotora H2 de ratón, para preparar así varios ratones transgénicos que expresan moléculas HLA de clase I humanas (Documentos no de patente 2 y 3). Sin embargo, tales ratones transgénicos no fueron capaces de reconocer suficientemente la región a3 de1HLA de clase I humano usando CD8 de ratón. Por lo tanto, la inducción de CTL restringida a1HLA fue limitada. Con el fin de superar dichos problemas, se insertó un gen quimérico que comprende a1/a2 de1HLA de clase I fusionadas con a3 del H-2 de clase I de ratón en un sitio en dirección 3' del promotor SV 40 para construir ratones transgénicos (Documento no de patente 4), y por primera vez se hizo factible la evaluación in vivo de la inducción de CTL restringida al HLA.

En dichos ratones transgénicos, sin embargo, se expresa el H-2 de clase I de ratón endógeno. Cuando los CTL de ratón reconocen un antígeno, usan preferentemente la molécula H-2 de clase I. Por lo tanto, la inducción de CTL restringida al HLA de clase I fue limitada. Para superar este problema, los ratones con dos genes inactivados (knockout) para las moléculas a del H-2 de clase I (H-2Kb y H-2Db) de ratón se sometieron a cruzamiento con ratones transgénicos que comprenden genes quiméricos del HLA de clase I, para construir así ratones mutantes combinados y mejorar la inducción de CTL restringida al HLA de clase I (Documento no de patente 5).

El gen de la microglobulina p2 que constituye la cadena p del MHC de clase I es esencial para que funcione la molécula del MHC de clase I. Por lo tanto, las funciones del MCH de clase I de ratón se pierden en ratones deficientes en el gen de la microglobulina p2 (Documentos no de patente 6 y 7). Adicionalmente, se sabe que un gen de fusión monocatenario resultante de la unión entre el extremo C terminal de la microglobulina p2 y el extremo N terminal del MHC de clase I con la ayuda de un enlazador peptídico que consiste en 15 aminoácidos, funciona normalmente en las células (Documento no de patente 8).

Se insertó un gen artificial del MHC de clase I que comprende microglobulina p2, los dominios a l y a2 de1HLA de clase I y el dominio a3 del H-2 de clase I de ratón fusionados entre sí en un sitio en dirección 3' del promotor del gen del HLA de clase I, para construir así transgénicos ratones. Los ratones transgénicos resultantes se sometieron a cruzamiento con los ratones con el gen de la microglobulina p2 inactivado, para construir así ratones mutantes combinados (Documento no de patente 9). En tales ratones, se perdió sustancialmente la expresión de1H-2 de clase I y se observó una reacción de inducción de CTL restringida al HLA de clase I. Por consiguiente, se considera que tales ratones son los ratones humanizados con MHC de clase I más preferidos en la actualidad.

En los últimos años, el ratón humanizado con MHC de clase I ha sido sometido a cruzamiento con animales más inmunodeficientes (es decir, ratones NOD/SCID/gamma-c-null (NOG)), y se han implantado células madre de sangre humana en los ratones múltiple mutantes resultantes. Por lo tanto, pueden reconstruirse sistemas inmunitarios adaptativos a humanos que tienen linfocitos T restringidos al HLA completo (Documento no de patente 10).

Al someter al ratón humanizado con MHC de clase I al cruce con otras líneas mutantes, los ratones resultantes pueden resultar útiles para la producción de modelos animales superiores del sistema inmunitario humano.

Sin embargo, se considera que la expresión de transgenes en los ratones transgénicos del gen artificial del MHC de clase I que se han construido en el pasado está influenciada por varios factores tales como el número de copias, el sitio de inserción en el genoma o la modificación epigenética. Esto requirió la selección de líneas de ratón que mostraran niveles de expresión óptimos entre las líneas de ratón transgénicas construidas. Por las mismas razones, ha sido difícil comparar la capacidad de inducción de CTL entre líneas de ratones transgénicos que expresan diferentes genes del MHC de clase I.

Para potenciar la inducción de CTL restringida al MHC de clase I humano, ha sido necesario someter las líneas de ratón seleccionadas a cruzamiento con ratones deficientes en el gen de la microglobulina p2. Por consiguiente, se ha requerido tiempo y trabajo adicionales, después de la selección de líneas de ratones transgénicos que muestran los niveles de expresión óptimos.

Si bien el ratón humanizado con MHC de clase I ha sido muy útil, las líneas de ratón transgénico del mismo que se han construido hasta ahora se han limitado a A1, A2, A24, A11, B44, y B7 por las razones descritas anteriormente. La producción de ratones mutantes combinados mediante el cruce del ratón humanizado con MHC de clase I y los ratones con el gen de la microglobulina p2 inactivado se ha limitado aún más.

Documentos de la técnica anterior

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Human Vaccines 4: 6, 400-409; November/December 2008

Documento no de patente 2: Eur. J. Immunol., Sep., 1989; 19 (9): 1575-83

Documento no de patente 3: J. Immunol., Feb. 15, 1989; 142 (4): 1366-71

Documento no de patente 4: J. Exp. Med., Apr. 1, 1991; 173 (4): 1007-15

Documento no de patente 5: J. Immunol., 1999, 163: 2555-60

Documento no de patente 6: Nature, Apr. 19, 1990; 344 (6268): 742-6

Documento no de patente 7: Science, Vol. 248, June 8, 1990: 1227-30

Documento no de patente 8: Proc. Natl., Acad. Sci., U.S.A., November 15, 1992; 89 (22): 10658-62

Documento no de patente 9: J. Exp. Med., Jun. 16, 1997; 185 (12): 2043-51

Documento no de patente 10: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., Jul. 20, 2010; 107 (29): 13022-7

Sumario de la invención

Problemas a resolver mediante la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un roedor que exprese HLA de clase I que resuelva los problemas descritos anteriormente y un método para preparar el mismo.

Específicamente, la presente invención proporciona un roedor que expresa HLA de clase I, que se puede preparar de manera eficiente y fácil en un corto período de tiempo, y en el que el número de copias de los transgenes, las posiciones de introducción del gen, los niveles de expresión génica y los sitios de expresión génica están regulados y un método para prepararlos.

Medios para resolver el problema

Los presentes inventores han llevado a cabo estudios específicos para resolver el problema anterior, y, como resultado, han descubrió lo siguiente. Esto es, se puede obtener un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal que se exprese bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor, de modo que se pueda preparar un roedor con el gen del HLA de clase I insertado (knock-in) de forma eficaz y fácil en un corto período de tiempo. Adicionalmente, se puede regular el número de copias de genes quiméricos artificiales que se van a introducir y las posiciones en las que se introducen los genes en el roedor con el gen de1HLA de clase I insertado preparado mediante dicho método, pudiéndose regular los niveles de expresión génica y los sitios de expresión génica. Esto ha llevado a la materialización de la presente invención.

Específicamente, la presente invención incluye los siguientes.

[1] Un roedor con el gen del HLA de clase I insertado, en el cual un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a1 y a2 del HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I del roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal, se expresa bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor.

[2] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [1], en donde el gen quimérico artificial se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en un locus de un par de loci de la microglobulina p2 del roedor.

[3] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [1] o [2], en donde las regiones a l y a2 del HLA de clase I son regiones a l y a2 del HLA-A de clase I.

[4] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [3], en donde e1HLA-A es HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2, o HLA-A31 o en donde el HLA-A es HLA-A2402, HLA-A0301, HLA-A0201 o HLA-A3101.

[5] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [1], en donde un primer gen quimérico artificial que codifica la primera proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a l y a2 del HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I del roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal, se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en el primer locus del gen del par de loci de la microglobulina p2 del roedor; y un segundo gen quimérico artificial que codifica la segunda proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a l y a2 del h La de clase I y una región a3 del MHC de clase I del roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal, se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor en el otro locus del gen, el cual es el segundo locus del gen del par de loci de la microglobulina p2 del roedor.

[6] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [5], en donde las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son del mismo genotipo.

[7] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [5], en donde las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son de diferente genotipo.

[8] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con uno cualquiera de [5] a [7], en donde las regiones a l y a2 del HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son de HLA-A.

[9] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [8], en donde las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son de HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2 o HLA-A31, o en donde las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son de HLA-A2402, HLA-A030l, HLA-A0201 o HLA-A3101, en donde las regiones a l y a2 del HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a l y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son las mismas o diferentes.

[10] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [9], en donde la región a3 del MHC de clase I del roedor es la región a3 del H-2 de clase I.

[11] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [10], en donde la región a3 del MHC de clase I del roedor es la región a3 de H-2Db.

[12] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [11], en donde la microglobulina p2 es la microglobulina p2 humana.

[13] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [12], en donde el roedor es un ratón.

[14] El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con [13], el cual tiene un genotipo representado como B2m+/(HLA/H-2/B2M) o B2 m(HLA/H-2/B2M)/(HLA/H-2/B2M)

[15] Una célula de roedor que expresa un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal bajo el control de una región reguladora de la transcripción de los loci de la microglobulina p2 del roedor, en donde la microglobulina p2 deriva o no deriva del roedor y en donde el gen quimérico artificial está insertado en los loci de la microglobulina p2 de la célula de roedor.

[16] La célula de acuerdo con [15], que es una célula ES, célula GS, o célula iPS.

[17] Un tejido aislado, órgano aislado, célula aislada, cultivo de células primarias o una línea celular establecida que expresa un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor, obtenido del roedor con el gen de1HLA de clase I insertado de acuerdo con [1] a [14].

[18] Un método para el cribado de un inductor de CTL específicos de la sustancia de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) permitir que una sustancia de ensayo reaccione con la célula de acuerdo con [15] o [16], o con el tejido aislado, órgano aislado, célula aislada, cultivo de células primarias o línea celular establecida de acuerdo con [17]; y

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

[19] Un método para determinar la presencia o ausencia de un antígeno restringido a1HLA de clase I, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

[20] Un método para el cribado de un agente terapéutico o preventivo de una enfermedad, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

[21] El método de acuerdo con [20], en donde la enfermedad es un cáncer o infección.

[22] Un método para el cribado de un inductor de CTL específicos de la sustancia de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) permitir que una sustancia de ensayo reaccione con un roedor con el gen de1HLA de clase I insertado de uno cualquiera de [1] a [14]; y

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

[23] Un método para determinar la presencia o ausencia de un antígeno restringido a1HLA de clase I, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

[24] Un método para el cribado de un agente terapéutico o preventivo de una enfermedad, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

[25] Un método para comparar la especificidad de las reacciones de CTL restringidas a1HLA inducidas por las sustancias de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) administrar sustancias de ensayo a una pluralidad de diferentes cepas de roedores con el gen de1HLA de clase I insertado de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [14] que expresa diferentes genes de1HLA de clase I y ensayar las reacciones de CTL inducidas en los roedores; y

(2) comparar las reacciones de CTL ensayadas en los roedores y evaluar la restricción a1HLA de las sustancias de ensayo que inducen reacciones de CTL.

[26] Un método para evaluar la eficacia de las reacciones de CTL inducidas por las sustancias de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

[27] Un método para evaluar la seguridad de una sustancia de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) permitir que una sustancia de ensayo reaccione con el roedor con el gen de1HLA de clase I insertado de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [14]; y

(2) analizar reacciones desfavorables que ocurren en el roedor.

[28] El método de acuerdo con [27], en donde las reacciones desfavorables son reacciones autoinmunitarias.

[29] El método de acuerdo con uno cualquiera de [18] a [28], en donde las sustancias de ensayo son una o más de péptidos, una o más de polipéptidos, una o más de oligonucleótidos, una o más de polinucleótidos, o una o más de proteínas.

[30] Se divulga un método para preparar un animal no humano con un gen de1HLA de clase I insertado, que comprende una etapa de introducir un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a l y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I del animal no humano ligadas en este orden desde el extremo N terminal en un sitio bajo el control de una región reguladora de la transcripción de los loci de la microglobulina p2 del animal no humano.

[31] El método divulgado de acuerdo con [30] que comprende las siguientes etapas:

(1) preparar un vector de direccionamiento que comprende el gen quimérico artificial que codifica la proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a l y a2 de1HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I del animal no humano ligadas en este orden desde el extremo N terminal; y

(2) permitir que el vector de direccionamiento reaccione con una célula madre pluripotente del animal no humano, para introducir así el vector de direccionamiento en un sitio bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 de la célula madre pluripotente.

[32] El método divulgado de acuerdo con [31], en donde la célula madre pluripotente es una célula ES, célula GS, o célula iPS.

[33] El método divulgado de acuerdo con [31] o [32], en donde el gen quimérico artificial se introduce en el sitio bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 de la célula madre pluripotente mediante recombinación homóloga.

[34] El método divulgado de acuerdo con uno cualquiera de [30] a [33], en donde la microglobulina p2 es la microglobulina p2 humana.

Efectos de la invención

La presente invención permite lo siguiente.

La presente invención proporciona un roedor que tiene una modificación genética en los loci de la microglobulina p2.

Más específicamente, la presente invención proporciona un roedor o célula con el gen de1HLA de clase I insertado, en el cual un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a1 y a2 del HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal (en lo sucesivo, denominado "gen quimérico artificial" o "el gen quimérico artificial") se expresa bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 de dicho roedor, un derivado del mismo y un método para usar el mismo.

La presente invención se caracteriza por que el gen quimérico artificial se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 de un roedor. Por lo tanto, los problemas de los ratones transgénicos que tienen introducido un gen del HLA convencional o ratones mutantes combinados (es decir, ratones mutantes combinados preparados preparando primero ratones transgénicos mediante la introducción de un gen del MHC de clase I artificial que codifica una proteína que comprende microglobulina p2, los dominios a1 y a2 dominios del HLA de clase I y un dominio a3 del H-2 de clase I de ratón fusionados entre sí en un sitio en dirección 3' del promotor del gen HLA de clase I y sometiendo a continuación a los ratones transgénicos resultantes al cruce con ratones con el gen de la microglobulina p2 inactivado (Documento no de patente 9), en lo sucesivo denominados "ratones mutantes combinados convencionales") se pueden solucionar.

Más particularmente, la presente invención tiene excelentes ventajas, como se describe a continuación.

(1) Tiempo reducido de preparación, promoción de la eficacia y simplificación

Al preparar ratones mutantes combinados convencionales, ha sido necesario preparar ratones transgénicos introduciendo el gen del MHC de clase I artificial en un sitio en dirección 3' del promotor del gen HLA de clase I, seleccionar una cepa que presente el nivel de expresión óptimo de los genes introducidos y someter la cepa seleccionada para cruzar con ratones con el gen de la microglobulina p2 inactivado. Se requirió al menos un año y medio a dos años para obtener ratones mutantes combinados.

En cambio, las etapas de selección de cepas y cruzamiento no son necesarias para preparar los roedores de acuerdo con la presente invención. Cuando los roedores son ratones, dichos ratones se pueden preparar en un período de tiempo corto (por ejemplo, aproximadamente de 7 a 8 meses).

En resumen, de acuerdo con la presente invención, el roedor con el gen HLA de clase I insertado diana se puede preparar en un período de tiempo más corto de una manera más eficiente y simple, en comparación con los ratones mutantes combinados convencionales.

(2) Realización de la expresión génica a niveles fisiológicos (nivel de expresión génica)

En el caso de los ratones mutantes combinados convencionales, varios factores, tales como el número de copias de los genes del MHC de clase I artificiales introducidos, las posiciones de introducción del gen en el genoma y la modificación epigenética, influyen en los niveles de expresión del gen quimérico artificial y los sitios de expresión génica. Por tanto, ha sido difícil regular los niveles de expresión y los sitios de expresión génica. Adicionalmente, la expresión o no expresión de los genes del MHC de clase I funcionales artificiales está influenciada por estos factores. Por consiguiente, la expresión de dicho gen del MHC de clase I artificial funcional frecuentemente se produjo por accidente.

A diferencia de lo anterior, en el roedor de acuerdo con la presente invención, el gen quimérico artificial se puede expresar bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en un locus o en ambos loci de un par de loci de la microglobulina p2 del roedor. A diferencia de los ratones mutantes combinados convencionales, por consiguiente, el número de copias de los genes quiméricos artificiales introducidos y los sitios de introducción del gen pueden regularse en el roedor de acuerdo con la presente invención.

En resumen, en el roedor de acuerdo con la presente invención, el número de copias de los genes quiméricos artificiales introducidos en los loci de la microglobulina p2 es 1 o 2. Esto permite que la expresión génica se realice a niveles más fisiológicos, a diferencia del caso de los ratones mutantes combinados convencionales.

(3) Realización de la comparación entre cepas

En los roedores de acuerdo con la presente invención, los niveles de expresión de genes quiméricos artificiales son constantes entre diferentes cepas debido a la característica descrita anteriormente. Se puede hacer una comparación entre cepas, por ejemplo, detectando un inductor de CTL específicos de la sustancia de ensayo, determinando la presencia o ausencia de un antígeno restringido al HLA de clase I, detectando un agente terapéutico o preventivo de una enfermedad, comparando la especificidad de las reacciones de CTL restringidas a1HLA inducidas por las sustancias de ensayo, evaluando la eficacia de las reacciones de CTL inducidas por sustancias de ensayo o evaluando la seguridad de las sustancias de ensayo.

(4) Facilitación de la preparación de heterocigotos

De acuerdo con una realización del roedor de acuerdo con la presente invención, un roedor puede comprender una copia del gen quimérico artificial que contiene el gen HLA de clase I en cada sitio bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en los loci de la microglobulina p2. Los genes HLA de clase I contenidos en los genes quiméricos artificiales difieren entre sí en cada sitio. Esta realización de la presente invención se puede preparar fácilmente mediante cruzamiento de los roedores de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con esta realización de la presente invención, se puede preparar un roedor que exprese los genes HLA de clase I de diferentes genotipos a niveles iguales. Cuando la preparación de dicho roedor se pretende de acuerdo con un método para preparar ratones mutantes combinados convencionales, es necesario preparar animales transgénicos que expresen genes HLA de clase I de diferentes genotipos, seleccionar la cepa que exprese dichos genes de diferentes genotipos en niveles iguales, y someter la cepa seleccionada a cruzamiento. Sin embargo, la cepa que expresa dichos genes de diferentes genotipos en niveles iguales no es fácil de seleccionar. En el caso del roedor de acuerdo con la presente invención, en cambio, es evidente que el número de copias de los genes quiméricos artificiales es 1 o 2, y el gen quimérico artificial se localiza bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en los loci de la microglobulina p2. Por lo tanto, un roedor que comprende una copia de los genes quiméricos artificiales (es decir, genes HLA de clase I de diferentes genotipos) en cada uno de los loci de la microglobulina p2 puede obtenerse mediante cruzamiento, y se considera que tales genes HLA de clase I de diferentes genotipos se expresan a niveles fisiológicos. Se sabe que los genes HLA de clase I de diferentes genotipos a menudo se expresan en seres humanos (es decir, es más probable que los genes HLA de clase I sean heterocigotos que homocigotos). De acuerdo con una realización del roedor de acuerdo con la presente invención, los genes HLA de clase I de diferentes genotipos se expresan a niveles fisiológicos. Al investigar, por ejemplo, las reacciones de CTL restringidas a1HLA inducidas por las sustancias de ensayo, por consiguiente, se considera que dicho modelo de evaluación es más extrapolable a los seres humanos.

(5) Realización de la expresión génica a niveles fisiológicos (sitio de expresión génica)

En el roedor de acuerdo con la presente invención, la expresión del gen quimérico artificial está bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en los loci de la microglobulina p2. Por lo tanto, a diferencia del caso de los ratones mutantes combinados convencionales, la expresión del gen quimérico artificial está regulada por una región reguladora de la transcripción, tal como un promotor de microglobulina p2 del roedor. Por consiguiente, se espera que el nivel de expresión del gen quimérico artificial sea igual al del gen de la microglobulina p2 endógena del roedor, y se espera que el sitio de expresión (por ejemplo, una célula o tejido) sea el mismo que el del gen MHC de clase I original. Por consiguiente, la expresión génica se puede realizar a un nivel más fisiológico.

(6) Facilitación de la preparación de un animal mutante combinado

En el roedor de acuerdo con la presente invención, el gen quimérico artificial se inserta en los loci de la microglobulina p2 de dicho roedor y, por tanto, se convierte en un animal transgénico de una única cepa. Los ratones mutantes combinados convencionales (es decir, ratones mutantes combinados preparados mediante cruzamiento de ratones transgénicos que comprenden el gen MHC de clase I artificial introducido en un sitio en dirección 3' del promotor del gen HLA de clase I con ratones con el gen de la microglobulina p2 inactivado) son animales que expresan HLA humano preparados mediante cruzamiento de animales transgénicos de dos cepas diferentes. Por consiguiente, en el roedor de acuerdo con la presente invención, el locus de la microglobulina p2 y el locus del gen quimérico artificial no se segregan en diferentes gametos, y la preparación de animales mutantes combinados mediante cruzamiento con otra cepa es ventajosamente fácil. Los ejemplos de animales de diferentes cepas incluyen animales inmunodeficientes o animales modelo de cáncer.

(7) Mejora y diversificación de la capacidad de reconocimiento de epítopos

Las sustancias de ensayo que no indujeron CTL en ratones transgénicos en los que se habían introducido genes HLA convencionales pueden ser capaces de inducir CTL en el roedor de acuerdo con la presente invención.

(8) Prevención de la expresión reducida de HLA de clase I y respuesta reducida de CTL restringida a HLA de clase I causada por el H-2 de clase I

Se sabe que las moléculas de microglobulina p2 constituyen el MHC de clase I, la expresión de1H-2 de clase I se pierde en los ratones homocigotos para el gen de la microglobulina p2 inactivado y la población de linfocitos T CD4-CD8+ está significativamente disminuida (Nature 1990, 344: 742-746).

En general, es necesario que los ratones mutantes combinados convencionales sean homocigotos para el gen de la microglobulina p2 inactivado. Por lo tanto, los genes del MHC de clase I artificiales se expresan a la vez que se pierde la expresión del gen H-2 de clase I, y dichos ratones mutantes combinados se someten a varios tipos de experimentos por las siguientes razones. Cuando los genes de la microglobulina p2 se someten a una inactivación heterocigota, los genes H-2 de clase I endógenos y el gen MHC de clase I artificial introducido se coexpresan, el nivel de expresión del gen MHC de clase I artificial se reduce a un nivel igual al de los ratones no transgénicos de tipo silvestre, y el nivel de expresión del gen MHC de clase I artificial no es suficiente (J. Immunol., June 17, 2013; 191: 583-593). Aunque el contenido de linfocitos T CD4'CD8+T en ratones mutantes combinados convencionales en los que se ha inactivado de forma heterocigota los genes de la microglobulina p2 es igual al de ratones no transgénicos de tipo silvestre, la inducción de CTL restringida al HLA de clase I no se pudo investigar usando dichos ratones mutantes combinados a pesar de las propiedades favorables de los mismos.

En el caso del roedor de acuerdo con la presente invención, los niveles de expresión de los genes quiméricos artificiales introducidos (knocked in) en un locus (es decir, heterocigotos) y en ambos loci (es decir, homocigotos) del par de loci de la microglobulina p2 del roedor se encontraban dentro del intervalo que podría predecirse basándose en número de copias de genes introducidas. El nivel de expresión de los genes quiméricos artificiales introducidos de forma heterocigota no se redujo a un nivel igual al de los ratones no transgénicos de tipo silvestre (Fig. 9-1, Fig. 9-2). Adicionalmente, el contenido de linfocitos T CD4'CD8+se mantuvo al mismo nivel que el de los ratones no transgénicos de tipo silvestre (Fig. 16). Por consiguiente, el roedor de acuerdo con la presente invención se puede usar para investigar la reacción de inducción de CTL restringida al HLA de clase I cuando el gen quimérico artificial se inserta en un locus (es decir, heterocigoto) del par de loci de la microglobulina p2 del roedor.

Cuando el gen de la microglobulina p2 es de tipo silvestre, se sabe que la inducción de CTL restringida a1HLA de clase I se reduce significativamente en ratones transgénicos en los que se ha introducido el gen HLA convencional, en comparación con un caso en donde el gen de la microglobulina p2 está inactivado homocigóticamente (Vaccine 2004 22: 1728-1731, International Immunol., 2002, 14: 925-934). Cuando el gen de la microglobulina p2 es de tipo silvestre, por ejemplo, los genes HLA de clase I introducidos se coexpresan con los genes H-2 de clase I endógenos. Durante la instrucción y el mantenimiento de los linfocitos CD8+ restringido a1HLA de clase I, e1H-2 de clase I compite con el HLA de clase I. Se supone que se debe al hecho de que la población de linfocitos CD8+ instruidos de una manera restringida al HLA de clase I está disminuida.

Por otra parte, en el caso del roedor de acuerdo con la presente invención, el grado de inducción de CTL por el epítopo restringido al HLA de clase I cuando los genes quiméricos artificiales se insertaron en cualquiera de los locus (es decir, heterocigotos) del par de loci de la microglobulina p2 del roedor, fue igual a cuando dichos genes se insertaron en ambos loci (es decir, homocigotos) de dicho par (Figs. 11, 12, 14 y 15). Por consiguiente, la reacción de inducción de CTL restringida al HLA de clase I puede investigarse en el roedor de acuerdo con la presente invención, cuando el gen quimérico artificial se inserta en un locus (es decir, heterocigoto) del par de loci de la microglobulina p2 del roedor.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra esquemáticamente un método para preparar un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende microglobulina p2 humana, las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un animal no humano.

La Fig. 2 muestra esquemáticamente un método para insertar el gen quimérico artificial en los loci de la microglobulina p2 mediante recombinación homóloga.

La Fig. 3 muestra esquemáticamente una estructura de un vector de direccionamiento utilizado para preparar un ratón con un gen HLA de clase I (HLA-A24) insertado.

La Fig. 4 muestra una fotografía que demuestra los resultados del análisis de genotipos de células ES recombinadas homólogamente mediante transferencia Southern.

La Fig. 5 muestra una fotografía que demuestra los resultados del análisis de los genotipos de ratones de tipo silvestre, siendo portadores los ratones heterocigotos para el gen insertado de un gen quimérico artificial y siendo portadores los ratones homocigotos para el gen insertado de genes quiméricos mediante transferencia Southern. La FIG. 6 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de ARNm de la microglobulina p2 de ratón en los hígados de ratones de tipo silvestre, siendo portadores los ratones heterocigotos para el gen insertado de un gen quimérico artificial y siendo portadores los ratones homocigotos para el gen insertado de genes quiméricos artificiales mediante RT-PCR cuantitativa.

La Fig. 7-1 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de HLA-A24 en células sanguíneas y esplénicas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo.

La Fig. 7-2 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de HLA-A3 en células sanguíneas y esplénicas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo.

La Fig. 8-1 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de H-2Kb en células sanguíneas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo.

La Fig. 8-2 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de H-2Kb en células sanguíneas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo.

La Fig. 9-1 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de proteína quimérica artificial (incluye HLA-A2 y microglobulina p2 humana) en células sanguíneas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo.

La Fig. 9-2 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de proteína quimérica artificial (incluye microglobulina p2 humana) en células sanguíneas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo. La Fig. 10-1 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de H-2Kb/H-2Db en células sanguíneas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo.

La Fig. 10-2 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de H-2Kb/H-2Db en células sanguíneas de ratones con el gen insertado mediante citometría de flujo.

La Fig. 11 muestra los resultados de la evaluación de la capacidad de los péptidos antigénicos derivados de virus para la inducción de CTL utilizando ratones de tipo silvestre, siendo portadores los ratones heterocigotos para el gen insertado de un gen quimérico artificial (incluye HLA-A24) y siendo portadores los ratones homocigotos para el gen insertado de genes quiméricos artificiales (incluye HLA-A24) (*** indica p < 0,001).

La Fig. 12 muestra los resultados de la evaluación de la capacidad de los péptidos antigénicos derivados de virus para la inducción de CTL utilizando ratones de tipo silvestre, siendo portadores los ratones heterocigotos para el gen insertado de un gen quimérico artificial (incluye HLA-A3) y siendo portadores los ratones homocigotos para el gen insertado de genes quiméricos artificiales (incluye HLA-A3) (*** indica p < 0,001; ** indica p < 0,01).

La Fig. 13 muestra los resultados de la evaluación de la capacidad de los péptidos antigénicos derivados de virus para la inducción de CTL utilizando ratones de tipo silvestre y ratones con doble inserción del gen portadores del primer gen quimérico artificial (incluye HLA-A24) y el segundo gen quimérico artificial (incluye HLA-A3) (*** indica p < 0,001).

La Fig. 14 muestra los resultados de la evaluación de la capacidad de los péptidos antigénicos derivados de virus para la inducción de CTL utilizando ratones de tipo silvestre, siendo portadores los ratones heterocigotos para el gen insertado de un gen quimérico artificial (incluye HLA-A2) y siendo portadores los ratones homocigotos para el gen insertado de genes quiméricos artificiales (incluye HLA-A2) (*** indica p < 0,001).

La Fig. 15 muestra los resultados de la evaluación de la capacidad de los péptidos antigénicos derivados de virus para la inducción de CTL utilizando ratones de tipo silvestre, siendo portadores los ratones heterocigotos para el gen insertado de un gen quimérico artificial (incluye HLA-A31) y siendo portadores los ratones homocigotos para el gen insertado de genes quiméricos artificiales (incluye HLA-A31) (*** indica p < 0,001; ** indica p < 0,01). La Fig. 16-1 muestra los resultados del análisis del contenido de linfocitos T CD4'CD8+en células sanguíneas de ratones de tipo silvestre, siendo portadores los ratones heterocigotos para el gen insertado de un gen quimérico artificial (incluye HLA-A3, HLA-A24, HLA-A2 y HLA-A31), siendo portadores los ratones homocigotos para el gen insertado de genes quiméricos artificiales (incluye HLA-A3, HLA-A24, HLA-A2 y HLA-A31), y siendo portadores los ratones con doble inserción del gen del primer gen quimérico artificial (incluye HLA-A24) y el segundo gen quimérico artificial (incluye HLA-A3) mediante citometría de flujo.

Fig. 16-2 (continuación de la Fig. 16-1)

Modo para llevar a cabo la invención

En lo sucesivo, la presente invención se describe con detalle.

La expresión "proteína quimérica artificial" utilizada en el presente documento se refiere a una proteína de fusión que comprende microglobulina p2, las regiones a1 y a2 del HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un animal no humano ligadas en este orden desde el extremo N terminal.

Cuando los dominios de proteínas adyacentes están "ligados" entre sí en la presente invención, dichos dominios de proteínas adyacentes pueden unirse directamente entre sí. Como alternativa, los dominios de proteínas adyacentes pueden unirse indirectamente entre sí con la ayuda de una secuencia de aminoácidos que sirva como un espaciador adecuado entre ellos. Se puede utilizar como espaciador un enlazador peptídico conocido convencionalmente, y el número y el tipo de aminoácidos que constituyen dicho enlace peptídico no están limitados.

La expresión "gen quimérico artificial" utilizada en el presente documento se refiere a un gen que codifica la proteína quimérica artificial descrita anteriormente. Más particularmente, la expresión se refiere a un gen de fusión artificial que comprende un gen que codifica la microglobulina p2, un gen que codifica las regiones a l y a2 de1HLA de clase I, y un gen que codifica una región a3 del MHC de clase I de un animal no humano ligados en este orden desde el extremo N terminal. Los genes pueden unirse directamente entre sí, o los genes adyacentes pueden unirse indirectamente entre sí con la ayuda de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que sirve como espaciador. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador peptídico conocido convencionalmente puede usarse como una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que sirve como tal espaciador. La secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que sirve como el espaciador puede comprender una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción, según la necesidad.

El gen quimérico artificial mencionado anteriormente codifica preferentemente una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y una región desde la región a3 del MHC de clase I de un animal no humano hasta un dominio intracelular unido a través de su extremo N terminal a la microglobulina p2 a través de su extremo C terminal con la ayuda de un péptido enlazador. (Si bien el número y el tipo de aminoácidos no están limitados, el número de aminoácidos es preferentemente de 1 a 100, más preferentemente de aproximadamente 5 a 50 y, particularmente preferentemente de aproximadamente 10 a 30). Dicho gen quimérico artificial puede comprender las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y una región desde la región a3 del MHC de clase I de un animal no humano hasta un dominio intracelular sin limitación particular.

La expresión "microglobulina p2" utilizada en el presente documento se refiere a una proteína que constituye la cadena p del MHC de clase I. La expresión "gen de la microglobulina p2" utilizada en el presente documento se refiere a un gen de la microglobulina p2 que constituye la cadena p del MHC de clase I.

La expresión "gen de la microglobulina p2" utilizada en el presente documento puede referirse a un gen de la microglobulina p2 exógena que no se deriva de un animal hospedador no humano o un gen de la microglobulina p2 endógena que se deriva de un animal hospedador no humano. Por consiguiente, en el "gen quimérico artificial" de la presente divulgación, el gen de la microglobulina p2 puede ser un gen de la microglobulina p2 exógena que no se deriva de un roedor o un gen de la microglobulina p2 endógena que se deriva de un roedor.

La expresión "animal no humano" usada en el presente documento se refiere a un animal mamífero, tal como un ratón, rata, hámster, cobaya, conejo, cerdo, vaca, oveja, gato, o perro o un pájaro, reptil, anfibio o pez.

El "animal no humano" de acuerdo con la presente divulgación no está particularmente limitado, siempre que dicho animal comprenda los loci de la microglobulina p2 y pueda introducirse un gen extraño en los mismos. Se prefieren los roedores, se prefieren mejor los ratones o las ratas, y los ratones son particularmente preferidos desde el punto de vista de la cría y la manipulación.

En la presente invención, el "gen de la microglobulina p2" es preferentemente un gen de la microglobulina p2 humana.

Un ejemplo de un gen de la microglobulina p2 humana es un gen que codifica la microglobulina p2 humana que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, se puede usar un gen que consiste en la secuencia de nucleótidos registrada en GenBank con el número de registro: NM_004048.2.

Adicionalmente, un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una deleción, sustitución, adición o inserción de 1 a 10, y preferentemente de 1 a 5, aminoácidos en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 y capaz de formar un complejo con una molécula del MHC de clase I, para presentar así el antígeno específico del m Hc de clase I y un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, más preferentemente 90 % o más, aún más preferentemente un 95 % o más, y lo más preferentemente un 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y capaz de formar un complejo con una molécula del MHC de clase I, para así presentar el antígeno específico de MHC de clase I, está dentro del alcance de la microglobulina p2 humana de acuerdo con la presente divulgación. La comparación de la secuencia de aminoácidos se puede realizar de acuerdo con una técnica convencional. Por ejemplo, la comparación de la secuencia de aminoácidos se puede realizar con el uso de BLAST (es decir, la herramienta de búsqueda de alineación local básica en el Centro Nacional de Información Biotecnológica, EE. UU.) utilizando la configuración predeterminada.

El término "gen" utilizado en el presente documento, se refiere a ADN, ARN o un híbrido de ADN/ARN. La forma del gen no está particularmente limitada, siempre que codifique una proteína o polipéptido de interés.

La expresión "HLA de clase I" utilizada en el presente documento se refiere al MHC de clase I humano, y ejemplos del mismo incluyen HLA-A, La expresión "gen HLA de clase I" utilizada en el presente documento se refiere a un gen del MHC de clase I humano, y los ejemplos del mismo incluyen genes que codifican HLA-A, HLA-B y HLA-C. E1HLA de clase I es preferentemente HLA-A, y más preferentemente HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2 o HLA-A31.

Los ejemplos de HLA-A24 incluyen HLA-A2402 que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2 y HLA-A2403 que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, los genes que consisten en las secuencias de nucleótidos registradas en GenBank con los números de registro M64740 y M64741 pueden usarse como genes que codifican HLA-A2402 y HLA-A2403, respectivamente. HLA-A24 es preferentemente HLA-A2402.

Los ejemplos de HLA-A3 incluyen HLA-A0301 que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 y HLA-A0302 que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 5. Por ejemplo, los genes que consisten en las secuencias de nucleótidos registradas en GenBank con los números de registro L77702.1 y AF217561.1 pueden usarse como genes que codifican HLA-A0301 y HLA-A0302, respectivamente. HLA-A3 es preferentemente HLA-A0301.

Los ejemplos de HLA-A2 incluyen HLA-A0201 que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 6 y HLA-A0203 que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 7. Por ejemplo, los genes que consisten en las secuencias de nucleótidos registradas en GenBank con los números de registro AY365426.1 y U03863.1 pueden usarse como genes que codifican HLA-A0201 y HLA-A0203, respectivamente. HLA-A2 es preferentemente HLA-A0201.

Los ejemplos de HLA-A31 incluyen HLA-A3101 que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 8 y HLA-A3104 que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 9. Por ejemplo, los genes que consisten en las secuencias de nucleótidos registradas en GenBank con los números de registro M84375.1 y AF148863.1 pueden usarse como genes que codifican HLA-A3101 y HLA-A3104, respectivamente. HLA-A31 es preferentemente HLA-A3101.

Adicionalmente, un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una deleción, sustitución, adición o inserción de 1 a 10, y preferentemente de 1 a 5 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9 y capaz de unirse a un péptido antigénico al mismo nivel o equivalente que un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos original y un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, más preferentemente 90 % o más, aún más preferentemente 95 % 0 más, y lo más preferentemente 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9 y capaz de unirse a un péptido antigénico al mismo nivel o equivalente que un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos original está dentro del alcance del "HLA de clase I" en la presente divulgación.

La expresión "regiones a l y a2 del HLA de clase I" utilizada en el presente documento se refiere a las regiones a l y a2 que están implicadas en la formación de un surco de retención de un péptido antigénico entre las regiones a1, a2 y a3 de una molécula HLA de clase I. La secuencia de aminoácidos de las regiones a l y a2 de1HLA de clase I y las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas se pueden determinar basándose en la información de la secuencia del HLA de clase I registrada en una base de datos conocida, tal como la base de datos GenBank descrita anteriormente.

La expresión "MHC de clase I de un animal no humano" utilizada en el presente documento se refiere al MHC de clase 1 de un animal distinto de un ser humano. La expresión "gen MHC de clase I de un animal no humano" utilizada en el presente documento se refiere a un gen que codifica un MHC de clase I de un animal distinto de un ser humano.

Los ejemplos de "MHC de clase I de un animal no humano" incluyen H-2 de ratón, RT1 de rata, RLA de conejo y locus B de pollo.

El H-2 de clase I de ratón incluye H-2K, H-2D y H-2L. Los ejemplos de H-2K incluyen H-2Kb que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10, H-2Kd que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 11, y H-2Kk que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12. Por ejemplo, los genes que consisten en las secuencias de nucleótidos registradas en GenBank con los números de registro U47328.1, U47329.1 y U47330.1 se pueden usar como genes que codifican H-2Kb, H-2Kd y H-2Kk, respectivamente. Los ejemplos de H-2D incluyen H-2Dd que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 13 y H-2Db que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14. Por ejemplo, los genes que comprenden las secuencias de nucleótidos registradas en GenBank con los números de registro U47326.1 y U47325.1 pueden usarse como genes que codifican H-2Ddy H-2Db, respectivamente. Un ejemplo de H-2L es H-2Ld que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la s Eq ID NO: 15. Por ejemplo, un gen que consiste en la secuencias de nucleótidos registrada en GenBank con el número de registro NM_001267808.1 puede usarse como un gen que codifica H-2Ld.

El MHC de clase I de un animal no humano es preferentemente el H-2 de clase I de ratón, prefiriéndose particularmente H-2Db o H-2Kd.

Adicionalmente, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una deleción, sustitución, adición o inserción de 1 a 10, y preferentemente de 1 a 5, aminoácidos en la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NOs: 10 a 15 y capaz de unirse a una molécula CD8 al mismo nivel o equivalente que un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos original y un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, más preferentemente 90 % o más, aún más preferentemente 95 % o más, y lo más preferentemente 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 10 a 15 y capaz de unirse a una molécula CD8 al mismo nivel o equivalente que el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos original está dentro del alcance del "MHC de clase I de un animal no humano" en la presente divulgación.

La expresión "una región a3 del MHC de clase I de un animal no humano" utilizada en el presente documento se refiere a una región a3 que está implicada en la unión a una molécula correceptor CD8 expresada en una superficie de CTL entre las regiones a1, a2 y a3 de una molécula MHC de clase I de un animal no humano y un dominio intracelular del MHC de clase I en el extremo C terminal de dicha región a3. Cuando la expresión "región a3 del MHC de clase I de un animal no humano" aparece en esta memoria descriptiva sin ninguna limitación particular, la expresión se refiere a una región desde la región a3 hasta el dominio intracelular. La secuencia de aminoácidos de la región a3 del MHC de clase I de un animal no humano y la secuencia de nucleótidos que codifica la misma se puede determinar basándose en la información de secuencia relativa al MHC de clase I de un animal no humano registrada en una base de datos conocida, tal como la base de datos GenBank descrita anteriormente.

Para que los CTL del roedor de acuerdo con la presente invención reconozcan eficazmente un complejo de antígeno HLA, la "región a3 del MHC de clase I de un roedor" se sustituye preferentemente con la misma región MHC de un roedor en la cual se ha introducido el gen quimérico artificial (Eur. J. Immunol., 26: 97, 1996; J. Immunol., 159: 4753, 1997).

En la "proteína quimérica artificial" de la presente divulgación, las combinaciones de genotipos de las regiones a1 y a2 del HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor no están particularmente limitadas, siempre que la "proteína quimérica artificial" pueda expresarse y funcionar. Cuando las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I se derivan de HLA-A2, la región a3 del MHC de clase I de un roedor se deriva preferentemente de H-2Db de ratón. Cuando las regiones a1 y a2 se derivan de HLA-A24, la región a3 de ratón se deriva preferentemente de H-2Db Cuando las regiones a1 y a2 del HLA de clase I se derivan de HLA-A3, la región a3 del MHC de clase I de un roedor se deriva preferentemente de H-2Db de ratón. Cuando las regiones a1 y a2 del HLA de clase I se derivan de HLA-A31, la región a3 del MHC de clase I de un roedor se deriva preferentemente de H-2Db de ratón.

El "gen quimérico artificial" de la presente divulgación comprende el gen que codifica la microglobulina p2, el gen que codifica las regiones a1 y a2 del HLA de clase I y el gen que codifica la región a3 del MHC de clase I de un roedor. Adicionalmente, dicho "gen quimérico artificial" puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que permita la regulación de la expresión y traducción del gen quimérico artificial. Ejemplos de tales secuencias de nucleótidos incluyen una secuencia líder del gen HLA de clase I (gen HLA-A24, en particular) (SEQ ID NO: 40; ATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGACCCAGACCTGGGCG).

Dicha secuencia líder está localizada en dirección 5' de la región a1 del gen HLA de clase I, y está implicada en la localización de proteínas expresadas por el gen HLA de clase I en una membrana celular (J. Immunol., 134: 2727, 1985). La secuencia líder se puede añadir al extremo N terminal de la secuencia de nucleótidos que codifica la microglobulina p2.

En la presente invención, por ejemplo: (i) un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 humana, las regiones a1 y a2 de HLA-A2402 humano y una región a3 de H-2Db de ratón ligadas en este orden desde el extremo N terminal (que consiste en la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16); (ii) un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 humana, las regiones a1 y a2 de HLA-A0301 humano y una región a3 de H-2Db de ratón ligadas en este orden desde el extremo N terminal (que consiste en la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 17); (iii) un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 humana, las regiones a1 y a2 de HLA-A0201 humano y una región a3 de H-2Db de ratón ligadas en este orden desde el extremo N terminal (que consiste en la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41); y/o (iv) un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 humana, las regiones a1 y a2 de HLA-A3101 humano y una región a3 de H-2Db de ratón ligadas en este orden desde el extremo N terminal (que consiste en la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 42) se pueden usar como tal "gen quimérico artificial".

Cuando el "gen quimérico artificial se expresa bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor" en el presente documento, un gen quimérico artificial se liga a una región que regula la expresión (transcripción) del gen de la microglobulina p2 endógena en el roedor de manera operativa. Por lo tanto, la expresión del gen quimérico artificial está regulada por la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 de dicho roedor. La región reguladora de la transcripción comprende una región promotora y una región potenciadora del gen de la microglobulina p2 del roedor.

Cuando el "gen quimérico artificial se liga de manera operativa", dicho gen quimérico artificial se puede ligar y colocar de cualquier manera, siempre que la expresión génica se induzca bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor. Cuando un gen quimérico artificial usa un gen de la microglobulina p2 endógena derivado de un roedor como el "gen de la microglobulina p2", por ejemplo, un gen que codifica las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y un gen que codifica una región a3 del MHC de clase I de un roedor puede ligarse en este orden al extremo 3' del gen de la microglobulina p2 endógena (excluyendo el codón de terminación). Por lo tanto, dicho gen quimérico artificial se puede insertar (knocked in) y posicionar.

Cuando un gen quimérico artificial usa un gen de la microglobulina p2 exógena que no se deriva de un roedor como el "gen de la microglobulina p2", en cambio, un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 humana, las regiones a l y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal se puede insertar en una posición en dirección 3' de la primera metionina del gen de la microglobulina p2 endógena del roedor. Por lo tanto, el gen quimérico artificial puede insertarse y colocarse en el locus de la microglobulina p2 del roedor.

Cuando un gen "se inserta" o "se inserta en el locus de la microglobulina p2" en la presente invención, se introduce un gen de interés mediante recombinación homóloga, de modo que el gen quimérico artificial se coloca bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 de un roedor, y así se expresa la proteína quimérica artificial. Cuando un gen quimérico artificial usa un gen de la microglobulina p2 endógena derivado de un roedor como el "gen de la microglobulina p2", específicamente, un gen que codifica las regiones a l y a2 de1HLA de clase I, y un gen que codifica una región a3 del MHC de clase I de un roedor están ligados en este orden al extremo 3' del gen de la microglobulina p2 endógena (excluyendo el codón de terminación), para construir así el gen quimérico artificial. Cuando un gen quimérico artificial usa un gen de la microglobulina p2 exógena que no se deriva de un roedor (preferentemente el gen de la microglobulina p2 humana) como el "gen de la microglobulina p2", un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 humana, las regiones a l y a2 del HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal se inserta en una posición en dirección 3' de la primera metionina del gen de la microglobulina p2 endógena de un roedor no humano.

En la presente invención, el gen quimérico artificial puede insertarse en un locus o en ambos loci de un par de loci de la microglobulina p2 del roedor.

Cuando el gen quimérico artificial se inserta en uno de los loci de la microglobulina p2, el roedor comprende una copia del gen quimérico artificial en el locus de la microglobulina p2.

Cuando los genes quiméricos artificiales se insertan en ambos loci de la microglobulina p2, el roedor ocasionalmente comprende 2 copias de los genes quiméricos artificiales del mismo genotipo en los loci de la microglobulina p2, o el roedor ocasionalmente comprende una copia de los genes quiméricos artificiales de diferentes genotipos en cada locus de la microglobulina p2.

El gen quimérico artificial se inserta ocasionalmente en uno de los loci de la microglobulina p2 del roedor, y una proteína quimérica artificial codificada por el gen quimérico artificial comprende las regiones a l y a2 de1HLA de clase I. En tal caso, el HLA de clase I es preferentemente HLA-A, más preferentemente HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2 o HLA-A31, y aún más preferentemente HLA-A2402, HLA-A0301, HLA-A0201 o HLA-A3101.

Los genes quiméricos artificiales se insertan ocasionalmente en ambos loci de los loci de la microglobulina p2 del roedor, y las proteínas quiméricas artificiales codificadas por ambos genes quiméricos artificiales comprenden cada una las regiones a l y a2 del HLA de clase I. En el caso del HLA de clase I del mismo genotipo, e1HLA de clase I es preferentemente HLA-A, más preferentemente HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2 o HLA-A31, y aún más preferentemente HLA-A2402, HLA-A0301, HLA-A0201 o HLA-A3101.

Los genes quiméricos artificiales se insertan ocasionalmente en ambos loci de los loci de la microglobulina p2 del roedor, y las proteínas quiméricas artificiales codificadas por ambos genes quiméricos artificiales comprenden cada una las regiones a l y a2 del HLA de clase I. En el caso del HLA de clase I de diferentes genotipos, e1HLA de clase I es preferentemente un HLA-A diferente, más preferentemente se seleccionan dos tipos de HLA-A del grupo que consiste en HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2 y HLA-A31, aún más preferentemente se seleccionan dos tipos de HLA-A del grupo que consiste en HLA-A2402, HLA-A0301, HLA-A0201, y HLA-A3101, e incluso más preferentemente HLA-A2402 o HLA-A0301.

El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con la presente invención puede comprender otras mutaciones genéticas, además de los genes quiméricos artificiales. Los ejemplos de otras mutaciones genéticas denomina "Método II"). En tal caso, un transgén que codifica una proteína que comprende las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N puede insertarse en el extremo 3' del gen de la microglobulina p2 endógena (excluyendo el codón de terminación) del roedor.

Más específicamente, el roedor con el gen del HLA de clase I insertado de la presente invención puede prepararse mediante un método que comprende las siguientes etapas:

(1') preparar un vector de direccionamiento que comprende un transgén que codifica una proteína que comprende las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal; y

(2') permitir que el vector de direccionamiento actúe sobre una célula madre pluripotente del roedor, e introducir el transgén en el extremo 3' del gen de la microglobulina p2 de la célula madre pluripotente (excluyendo el codón de terminación), para construir así el gen quimérico artificial con el gen de la microglobulina p2 endógena.

El gen quimérico artificial o el transgén se puede introducir en una célula madre pluripotente de acuerdo, por ejemplo, con un método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear un método de introducción de genes mediante recombinación homóloga. Específicamente, se puede emplear el método descrito en Gene Targeting (Sedivy, J. M. and Joyner, A. L., 1992) o un método que implica el uso de nucleasas artificiales, tales como las nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), o sistemas CRISPR/Cas.

Cuando se emplea el método descrito en Gene Targeting (Sedivy J. M. and Joyner, A. L., 1992), por ejemplo, el roedor de acuerdo con la presente invención puede prepararse de la manera que se describe a continuación. Los métodos para preparar el roedor de acuerdo con la presente invención no se limitan a los mismos.

De acuerdo con el Método I, el gen quimérico artificial se prepara mediante la clonación de fragmentos de genes, cada uno de los cuales codifica la microglobulina p2 humana, las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un roedor. Un fragmento de un gen puede ser un fragmento de ADN. Un método de clonación no está particularmente limitado, siempre que se pueda obtener un fragmento de gen diana. Por ejemplo, se puede emplear la PCR. Como molde, se puede utilizar cualquier célula o biblioteca de ADN que lleve un gen diana. Por ejemplo, se puede usar ARN total o ADN genómico preparado a partir de una célula humana. Como línea celular humana, por ejemplo, se puede usar una línea celular tumoral humana (por ejemplo, SW620 o HepG2). Como se describe en los ejemplos, la secuencia génica de longitud completa se puede sintetizar artificialmente.

Se prepara usando los tres tipos de fragmentos de ADN obtenidos como antes, un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal.

Un método de preparación de dicho gen quimérico artificial no está particularmente limitado, siempre que en último término se construya un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y una región a3 del m Hc de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal. Según la necesidad, se puede proporcionar una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción en el extremo 5' o en el extremo 3' de un fragmento de gen que codifica la microglobulina p2, un fragmento de gen que codifica las regiones a l y a2 del HLA de clase I, y un fragmento de gen que codifica una región a3 del MHC de clase I de un roedor.

Por ejemplo, un fragmento de gen que comprende una secuencia que codifica la microglobulina p2 humana que comprende una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, NcoI) en el extremo 5' y una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BamHI) en el extremo 3' se liga a un fragmento de gen que comprende una secuencia que codifica una región a3 del MHC de clase I de un roedor que comprende una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BamHI) en el extremo 5' y una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, SwaI) en el extremo 3' con la ayuda de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción (por ejemplo, BamHI). El resultante se clona a continuación en un vector adecuado, tal como pBluescript, que ha sido modificado para llevar una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, NcoI) y una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, SwaI). El vector resultante se digiere con una enzima de restricción (por ejemplo, BamHI) y un fragmento de gen que comprende secuencias que codifican las regiones a l y a2 del HLA de clase I al que se añade una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BamHI) y una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BglII) se inserta en el extremo 5' y el extremo 3', respectivamente. En tal caso, se puede obtener un producto diana seleccionando un clon que comprende una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BamHI) de un fragmento de gen que comprende una secuencia que codifica la microglobulina p2 humana ligada a una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BamHI) de un fragmento de gen que comprende una secuencia que codifica las regiones a l y a2 del h La de clase I y una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BamHI) de un fragmento de gen que comprende una secuencia que codifica una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligada a una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción (por ejemplo, BglII) de un fragmento de gen que comprende una secuencia que codifica las regiones a l y a2 del HLA de clase I.

Posteriormente, se clona un fragmento de genoma que comprende regiones en dirección 5' y dirección 3' de la primera metionina del gen de la microglobulina p2 de un roedor. Dicho fragmento de genoma puede derivarse de un roedor en el que se va a introducir un gen quimérico artificial. El roedor puede ser un ratón. El método de clonación no está particularmente limitado, siempre que se pueda obtener un fragmento de genoma diana. Por ejemplo, se puede emplear la PCR. Como molde, se puede usar cualquier célula o biblioteca de ADN que lleve una secuencia diana. Por ejemplo, puede usarse un clon bAc que comprende una secuencia diana, ADN genómico preparado a partir de una célula o una biblioteca de ADN genómico. Un clon de BAC, ADN genómico preparado a partir de una célula o una biblioteca de ADN genómico puede derivarse de un ratón.

El fragmento de genoma no está particularmente limitado, siempre que sea lo suficientemente largo para provocar una recombinación homóloga en una célula madre pluripotente, tal como una célula ES. Es preferible que se diseñe una secuencia para que tenga una alteración de un gen de la microglobulina p2 de ratón funcional como resultado de una recombinación homóloga y que la expresión del gen quimérico artificial se controle mediante un promotor/potenciador del gen de la microglobulina p2 de ratón.

El fragmento de ADN de ratón obtenido anteriormente, el gen quimérico artificial, un marcador de selección positiva y un marcador de selección negativa se ligan entre sí, para construir así un vector de direccionamiento (en lo sucesivo, denominado "Vector de direccionamiento I"). Los ejemplos de marcadores de selección positiva que pueden usarse incluyen un gen resistente a neomicina, un gen resistente a higromicina y un gen resistente a puromicina. Los ejemplos de marcadores de selección negativa que pueden usarse incluyen un fragmento de toxina A de difteria y un gen de timidina quinasa del virus del herpes simple.

Puede prepararse adecuadamente una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador peptídico y/o una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción que sea adecuada para la ligación, para ligar así fragmentos.

De acuerdo con el Método II, los fragmentos de genes que codifican cada una de las regiones a l y a2 de1HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un roedor se clonan de la misma manera que en el Método I para preparar un transgén.

Se prepara un transgén que codifica una proteína que comprende las regiones a l y a2 de1HLA de clase I, y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N utilizando el fragmento de ADN resultante. Se puede preparar un transgén de acuerdo con el método para preparar un gen quimérico artificial del Método I.

Posteriormente, se clona un fragmento de genoma que comprende el extremo 3' del gen de la microglobulina p2 de un roedor (excluyendo un codón de terminación) y una región en dirección 3' del mismo de acuerdo con el Método I.

El fragmento de genoma no está particularmente limitado, siempre que sea lo suficientemente largo para provocar una recombinación homóloga en una célula madre pluripotente, tal como una célula ES. Es preferible que se diseñe una secuencia para constituir un gen quimérico artificial que comprende un gen que codifica las regiones a l y a2 de1HLA de clase I, y un gen que codifica una región a3 del m Hc de clase I de un roedor ligados en este orden desde el extremo 3' de un gen de la microglobulina p2 endógena de ratón (excluyendo un codón de terminación) como resultado de la recombinación homóloga. Adicionalmente, es preferible que la expresión del gen quimérico artificial sea controlada por un promotor/potenciador del gen de la microglobulina p2 de ratón.

El fragmento de ADN de ratón obtenido anteriormente, el transgén, el marcador de selección positiva y el marcador de selección negativa se ligan entre sí, para construir así un vector de direccionamiento (en lo sucesivo, denominado "Vector de direccionamiento II").

Posteriormente, el Vector de direccionamiento I que comprende el gen quimérico artificial o el Vector de direccionamiento II que comprende el transgén se introduce en una célula de roedor. Una célula de roedor puede ser una célula madre pluripotente de un roedor. Una célula madre pluripotente de un roedor puede ser, por ejemplo, una célula ES de ratón. Los ejemplos de células ES de ratón incluyen células ES derivadas de la línea 129 de ratón y las derivadas de la línea C57BL/6 de ratón, siendo preferibles las células ES derivadas de la línea 129 de ratón.

El Vector de direccionamiento I o II puede introducirse en un roedor de acuerdo con diversas técnicas, siempre que se pueda introducir un gen en una célula. Por ejemplo, se puede usar la electroporación, la coprecipitación con fosfato cálcico o la lipofección. Dicha técnica se puede emplear en combinación con un método que implica el uso de nucleasas artificiales tales como nucleasas con dedos de zinc (ZFN) o nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) que están diseñadas para incorporarse en un locus de gen diana. Por lo tanto, un gen de interés puede insertarse con gran eficacia.

Las células madre pluripotentes, tales como las células ES, en las que se ha introducido el vector de direccionamiento, se siembran en células alimentadoras que presentan resistencia a antibióticos específicos, y el cultivo se realiza en presencia de dichos antibióticos específicos. Se seleccionan las colonias resistentes que sobreviven de 6 a 8 días después del inicio del cultivo de selección, algunas de las colonias seleccionadas se someten a subcultivo y las células restantes se analizan mediante PCR para determinar si se ha producido o no recombinación homóloga. Los clones positivos para PCR se someten a hibridación Southern para detectar la integración aleatoria, y los clones en los que no se detecta la integración aleatoria se someten al siguiente proceso.

Los embriones en estadio de blastocisto se extraen de un hembra ratón preñada que presenta un color de pelo diferente al de las células ES utilizadas, y se inyectan aproximadamente 10 células ES recombinadas homólogamente descritas anteriormente en la cavidad de segmentación mediante micromanipulación. Como alternativa, las células ES se pueden implantar en los embriones en estadio de 8 células mediante el método de agregación. Los embriones se implantan en el útero del ratón hembra pseudopreñada y se induce al ratón hembra a quedar preñada y dar a luz. Por lo tanto, se puede preparar un ratón quimérico.

Cuando el ratón macho quimérico resultante se cruza con un ratón hembra que presenta un color de pelo diferente al de las células ES utilizadas y la descendencia resultante muestra un color de pelo derivado de las células ES, se puede confirmar la transferencia de las células ES a las líneas germinales. Adicionalmente, se puede analizar el genotipo de la descendencia mediante PCR, y se pueden identificar los ratones heterocigotos para el gen insertado que portan un gen quimérico artificial en los loci de la microglobulina p2 (es decir, ratones que comprenden un gen quimérico artificial insertado en uno del par de genes de la microglobulina p2 de ratón bajo el control de la región reguladora de la transcripción).

Los ratones heterocigotos resultantes se someten a cruces entre sí, de modo que se pueden identificar los ratones homocigotos para el gen insertado que portan genes quiméricos artificiales (es decir, ratones que comprenden genes quiméricos artificiales insertados en ambos loci del par de genes de la microglobulina p2 de ratón bajo el control del región reguladora de la transcripción).

Dos líneas de ratones con el gen insertado que llevan genes quiméricos artificiales que contienen genes HLA de clase I diferentes se someten a cruzamiento entre sí de manera que se pueden preparar ratones humanizados heterocigotos. Los ratones humanizados heterocigotos comprenderían una copia del gen quimérico artificial que contiene el gen HLA de clase I insertado en cada sitio del par de loci de la microglobulina p2. Los genes HLA de clase I contenidos en los genes quiméricos artificiales difieren entre sí en cada sitio.

La expresión o falta de expresión de los genes quiméricos artificiales en la superficie celular en los ratones con el gen insertado preparados puede investigarse, por ejemplo, recuperando células sanguíneas o esplénicas de ratones con el gen insertado y analizando las células sanguíneas o esplénicas recuperadas mediante citometría de flujo. Dado que los ratones heterocigotos conservan los loci de la microglobulina p2 de tipo silvestre, también expresan los genes del H-2 de clase I de ratón. En cambio, los ratones homocigotos pueden identificarse como ratones humanizados con MHC de clase I en los que se pierde la expresión del gen H-2 de clase I de ratón y se observa selectivamente la expresión de los genes quiméricos artificiales introducidos.

La utilidad o no utilidad de los roedores de la presente invención como modelos humanos puede examinarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, se permite que los antígenos restringidos a1HLA de clase I contenidos en los genes quiméricos artificiales introducidos actúen sobre los roedores con el gen HLA de clase I insertado de la presente invención, y se analiza la inducción de CTL específicos de antígeno. A continuación se describe un ejemplo de un método representativo para el análisis cuando los animales no humanos son ratones.

Por ejemplo, los péptidos antigénicos restringidos al HLA de clase I conocidos que se han introducido se mezclan con el adyuvante incompleto de Freund de acuerdo con una técnica convencional para preparar una emulsión. La emulsión se administra por vía subcutánea a los ratones con el gen del HLA de clase I insertado de la presente invención en un sitio en las proximidades de la cabeza de la cola. Como alternativa, la emulsión se puede administrar por vía subcutánea en el lomo o por vía intraperitoneal. Los ganglios linfáticos se extraen de la ingle del ratón 1 semana después de la administración final y las células de los ganglios linfáticos se preparan de acuerdo con una técnica convencional. También se pueden utilizar células preparadas a partir de otros tejidos, tal como células esplénicas.

Las células preparadas se cultivan durante aproximadamente una semana en presencia de péptidos antigénicos y citocinas (por ejemplo, interleucinas 2, 15 o 21), y la liberación de citocinas tales como interleucina 2 o interferón y de los linfocitos T se analiza mediante ensayos e LiSPOT basados en los principios del ELISA tipo sándwich u otras técnicas. Por lo tanto, se puede investigar la inducción de CTL. En este caso, las células esplénicas obtenidas de ratones con el gen insertado no inmunizados pueden irradiarse con rayos X y pueden usarse como células presentadoras de antígeno y cultivarse en presencia de células de ganglios linfáticos. Por ejemplo, se confirma un aumento significativo en las cantidades de diversas citocinas producidas por CTL inducidos tras la estimulación del antígeno, en comparación con el caso de la administración de control negativo. Por lo tanto, se puede confirmar si los roedores de la presente invención pueden usarse o no como modelos humanos.

En tal caso, se añaden adicionalmente células diana que expresan los mismos genes HLA de clase I que el roedor de acuerdo con la presente invención, y se evalúa la actividad citotóxica de las células diana. Por lo tanto, se puede determinar si los roedores no humanos de la presente invención pueden usarse o no como modelos humanos. Los ejemplos de células diana que pueden usarse incluyen células aisladas del roedor de acuerdo con la presente invención, células en las que se han introducido los genes quiméricos artificiales y células que expresan de forma natural el gen HLA de clase I. En tal caso, se pueden emplear ensayos de liberación de 51Cr (Int. J. Cancer, 58: 317, 1994) u otras técnicas. Específicamente, las células diana se marcan con 51Cr, las células diana marcadas se pulsan con los antígenos diana, se añaden las muestras derivadas del roedor de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, células esplénicas) a las mismas y se ensaya la cantidad de 51Cr liberado cuando las células diana resultan dañadas por los c Tl . Si se observa inducción de c T l específicos de antígeno como resultado de tales ensayos, se puede determinar que el roedor de acuerdo con la presente invención puede usarse como modelo humano.

La presente invención también proporciona un tejido aislado, órgano aislado, célula aislada, célula de cultivo primario o línea celular establecida obtenidos del roedor con el gen HLA de clase I insertado de acuerdo con la presente invención. Los tejidos u órganos son preferentemente la glándula tímica, el bazo, la médula ósea, el tejido hematopoyético o el tejido linfático. Las células preferidas son células presentadoras de antígeno, linfocitos T, linfocitos B, o células madre hematopoyéticas.

La presente invención también proporciona una célula que expresa un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a l y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor. En genes quiméricos artificiales expresados en dicha célula, el gen de la microglobulina p2 puede ser un gen de la microglobulina p2 exógena que no se deriva de una célula de roedor o un gen de la microglobulina p2 endógena que se deriva de un roedor. Dicha célula se puede preparar introduciendo el Vector de selección I o II en una célula de roedor de acuerdo con la técnica descrita anteriormente. Una célula de roedor es preferentemente una célula madre pluripotente derivada de un roedor, y más preferentemente una célula ES o una célula iPS derivada de un roedor. Dicha célula puede aislarse o inducirse a partir de un roedor con el gen HLA de clase I insertado.

En lo sucesivo, se describen los métodos de uso del roedor con el gen HLA de clase I insertado de la presente invención, derivados del mismo (por ejemplo, células y órganos), células de roedor de la presente invención que expresan el gen quimérico artificial de la presente divulgación y derivadas de las mismas (por ejemplo, órganos preparados a partir de células iPS cuando las células que expresan genes quiméricos artificiales son células iPS), aunque los métodos no se limitan a los mismos.

El roedor con el gen del HLA de clase I insertado de la presente invención, derivados del mismo (por ejemplo, células y órganos), células que expresan el gen quimérico artificial de la presente invención y derivadas de las mismas (por ejemplo, órganos preparados a partir de células iPS cuando las células que expresan genes quiméricos artificiales son células iPS) se pueden utilizar para el cribado de un inductor de CTL específicos de la sustancia de ensayo, determinación de la presencia o ausencia del antígeno restringido al HLA de clase I, cribado de un agente terapéutico 0 preventivo de una enfermedad (por ejemplo, cáncer), comparación de la especificidad de las reacciones de CTL restringidas al HLA inducidas por una sustancia de ensayo, evaluación de la eficacia de las reacciones de CTL inducidas por una sustancia de ensayo, evaluación de la seguridad de una sustancia de ensayo (por ejemplo, el riesgo que la sustancia de ensayo representa para la inducción de una reacción autoinmunitaria), u otros propósitos.

Más específicamente, por ejemplo, se administra una sustancia de ensayo al roedor con el gen HLA de clase I insertado de la presente invención, y se analiza y evalúa la capacidad de la sustancia de ensayo para la inducción de CTL. Por lo tanto, se puede seleccionar un inductor de CTL para determinar la presencia o ausencia del antígeno restringido al HLA de clase I y/o un agente terapéutico o preventivo para una enfermedad. Ejemplos de "sustancias de ensayo" incluyen proteínas antigénicas tumorales conocidas, péptidos parciales de las mismas, virus, proteínas antigénicas derivadas de virus, péptidos parciales de las mismas, proteínas antigénicas derivadas de bacterias, péptidos antigénicos de las mismas, proteínas y péptidos con actividad desconocida, y polinucleótidos u oligonucleótidos que codifican tales sustancias. La capacidad para la inducción de CTL puede ensayarse y evaluarse de acuerdo con el método de evaluación mencionado anteriormente utilizado para el roedor con el gen h La de clase 1 insertado (por ejemplo., ensayos de liberación de 51Cr (Int. J. Cancer, 58: 317, 1994)). Cuando se determina que la sustancia de ensayo es capaz de inducir CTL, resulta evidente que dicha sustancia de ensayo contiene un antígeno restringido al HLA de clase I y que la sustancia de ensayo es capaz de actuar como inductor de CTL. El inductor de CTL así obtenido puede usarse como un agente terapéutico y/o preventivo para un tumor o una infección por virus o bacterias. Mediante la administración de una sustancia de ensayo al roedor con el gen HLA de clase I insertado de la presente invención y los ensayos y la evaluación de la capacidad de la sustancia de prueba para la inducción de CTL, se pueden evaluar los efectos de las reacciones de CTL inducidas por una sustancia de ensayo y la seguridad de la misma (por ejemplo, se puede evaluar el riesgo que representa la sustancia de ensayo para la inducción de una enfermedad autoinmunitaria).

Adicionalmente, el número de copias de genes quiméricos artificiales y los sitios de introducción de genes están regulados en el roedor con el gen HLA de clase I insertado de la presente invención. Por lo tanto, los niveles de expresión de tales genes quiméricos artificiales se pueden mantener a niveles equivalentes entre diferentes líneas de ratón que expresan diferentes genes HLA de clase I. Las sustancias de ensayo se administran a una pluralidad de roedores con el gen HLA de clase I insertado diferentes de la misma manera, y la capacidad de los roedores para la inducción de CTL en respuesta a las sustancias de ensayo se valora, compara y a continuación se evalúa. Por lo tanto, se puede evaluar la especificidad y la eficacia de las reacciones de CTL inducidas por las sustancias de ensayo.

De acuerdo con la presente invención, los linfocitos CTL preparados a partir de los roedores con el gen HLA de clase I insertado de la presente invención que han sido inmunizados con vacunas peptídicas pueden implantarse en los roedores inmunodeficientes resultantes del xenoinjerto de líneas celulares derivadas de cáncer humano. Por lo tanto, se pueden evaluar los efectos antitumorales de tales vacunas peptídicas.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describe con mayor detalle con referencia a los ejemplos.

Ejemplo 1: Clonación de la secuencia parcial del gen HLA-A2402

Con el fin de preparar genes quiméricos artificiales, al principio, se clonó un fragmento de gen que contenía las regiones a l y a2 mediante PCR utilizando ADN genómico de la línea celular tumoral humana SW620 como molde basándose en la información de secuencia para HLA-A2402 (Número de registro en GenBank N.° L47206.1). En tal caso, se añadió una secuencia que codifica un péptido de 10 aminoácidos que incluye una secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo N terminal, y se añadió la secuencia de reconocimiento de BglII a la secuencia del intrón 3 en el extremo C terminal, para unir así el fragmento del gen a la microglobulina p2 humana y la región a3 del H-2 de ratón. Específicamente, se llevó a cabo la PCR usando los cebadores que se muestran a continuación, y se obtuvo un fragmento de ADN de 867 pb modificado como se ha descrito anteriormente.

Bam-10AA-A24-F1:

5'-GGATCCGGCGGAGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCGGCTCTGGATCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 18)

Bgl-A24-R1: 5'-AGATCTACAGGCGATCAGGTAGGCGCCCC-3' (SEQ ID NO: 19)

Ejemplo 2: Clonación del ADNc de la microglobulina p2 humana

Posteriormente, se clonó el ADNc de la microglobulina p2 humana mediante RT-PCR usando ARN total preparado a partir de la línea de células tumorales humanas HepG2 como molde basándose en la información de secuencia del ADNc de la microglobulina p2 humana (N.° de registro en GenBank NM_004048.2). En tal caso, se añadió al extremo C terminal una secuencia que codifica un péptido de 5 aminoácidos que incluye una secuencia de reconocimiento de BamHI, para unir el fragmento de ADNc a las regiones a1 y a2 del h La . Para insertar el gen quimérico artificial en un sitio correspondiente a la primera metionina de la microglobulina p2 de ratón y expresar el gen quimérico artificial en una membrana celular tras el procesamiento normal, se añadió una secuencia líder de HLA-A24 que comprende una secuencia de reconocimiento de NcoI al extremo N terminal. Específicamente, se llevó a cabo la PCR usando los cebadores que se muestran a continuación, y se obtuvo un fragmento de ADN de 386 pb modificado como se ha descrito anteriormente.

Nco-A24L-hB2m-F1:

5'-

CCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGAT

CCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGT-3' (SEQ ID NO: 20)

Bam-5AA-hB2m-R1: 5'-GGATCCGCCACCTCCACTGTCTCGATCCCACTTAACTATC-3' (SEQ ID NO: 21)

Ejemplo 3: Clonación de la secuencia parcial del gen H-2Db de ratón

Basándose en la información de secuencia del H-2Db de ratón (N.° de registro en GenBank M37681.1), se clonaron las regiones en dirección 3' de la región a3 que incluye el dominio intracelular (es decir, los exones 4 a 8 y los intrones 3 a 7) mediante PCR usando ADN genómico del ratón C57BL6/N como molde. Para unir la secuencia a las regiones a1 y a2 del HLA y para facilitar la construcción del vector, se añadió la secuencia de reconocimiento de BamHI al intrón 3 en el extremo N terminal y, por ejemplo, se añadió la secuencia de reconocimiento de SwaI al extremo C terminal. Específicamente, se llevó a cabo la PCR usando los cebadores que se muestran a continuación, y se obtuvo un fragmento de ADN de 2494 pb modificado como se ha descrito anteriormente. Bam-H2Db-F1: 5'-GGATCCTGTGTGACATACCTGTACCTTGTC-3' (SEQ ID NO: 22) Swa-H2Db-R1: 5'-ATTTAAATCTAGTTGAGTCTCTGATCTTTAGCCCTAGG-3' (SEQ ID NO: 23)

Ejemplo 4: Construcción de un gen quimérico artificial (HHD-A2402)

El fragmento de ADNc de la microglobulina p2 humana, el fragmento de genoma de HLA-A2402 humano y el fragmento de genoma de H-2Db de ratón obtenidos de la manera descrita anteriormente se ligaron entre sí, para construir así un gen quimérico artificial de interés (longitud completa: 3735 pb, HHD-A2402) (Fig. 1).

Ejemplo 5: Preparación del vector de direccionamiento

Posteriormente, se preparó un vector de direccionamiento utilizado para insertar el gen quimérico artificial (HHD-A2402) preparado anteriormente en el gen de la microglobulina p2 de ratón como se muestra en la Fig. 2.

Inicialmente, basándose en la información de la secuencia para el ADNc de la microglobulina p2 de ratón (N.° de registro en GenBank NM_009735.3), se clonó una secuencia del genoma necesaria para la recombinación homóloga en células ES de la región del genoma que incluye el gen de la microglobulina p2 de ratón (N.° de registro en GenBank NC_000068.7). Específicamente, la PCR se llevó a cabo usando ADN genómico del ratón C57BL6/N como molde, para clonar así una región de aproximadamente 1,2 kb en dirección 5' de la primera metionina del gen de la microglobulina p2 de ratón. Para unir el fragmento al gen quimérico artificial (HHD-A2402) y facilitar la construcción del vector, se añadieron la secuencia de reconocimiento de Salí y la secuencia de reconocimiento de Ncol al extremo 5' y al extremo 3', respectivamente. Específicamente, se llevó a cabo la PCR usando los cebadores que se muestran a continuación, y se obtuvo un fragmento de ADN de 1.198 pb modificado como se ha descrito anteriormente.

B2m-SHA-F1: 5'-GTCGACCTGGGTAGACACTGTAGGATTGGGTCTCTG-3' (SEQ ID NO: 24)

B2m-SHA-R1: 5'-CCATGGTGACGACTGAAGCGACCGCGACTG-3' (SEQ ID NO: 25)

Posteriormente, se clonó un fragmento de genoma de longitud completa de 8.462 pb desde la secuencia de reconocimiento de Nheí del intrón 2 hasta la secuencia de reconocimiento de Sacíí del intrón 4 a partir del clon BAC (RP23-34E24) que comprende la secuencia de ADN genómico del gen de la microglobulina p2 de ratón.

El fragmento de genoma del gen de la microglobulina p2 de ratón obtenido de la manera descrita anteriormente y el gen quimérico artificial (HHD-A2402) se clonaron en el plásmido "pBluescript II KS+" junto con el casete PGK-DT-A y el casete PGK-neo-bpA. Por lo tanto, se preparó un vector de direccionamiento de interés (longitud completa: aproximadamente 19,2 kb) (Fig. 3).

Ejemplo 6: Introducción de un vector de direccionamiento en células ES

Posteriormente, el vector de direccionamiento preparado en el Ejemplo 5 se introdujo en células ES.

Las células CMTI-1 adquiridas en Millipore (Pase 11) se utilizaron como células ES. Las células descritas en los ejemplos siguientes se cultivaron utilizando el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado con FBS al 20 % (suero bovino fetal calificado para células ES) (Life Technologies) y 103 unidades/ml de factores inhibidores de leucocitos (LIF) (Millipore) en una incubadora a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %.

El vector de direccionamiento preparado en el Ejemplo 5 (50 |jg) se escindió con NotI, se disolvió en 0,2 ml de un tampón de electroporación para células ES (Millipore) y se mezcló con 2 x 107 células CMTI-1 suspendidas en 0,3 ml de un tampón de electroporación en una cubeta de electroporación (Bio-Rad). A continuación, se aplicaron pulsos eléctricos utilizando el Gene Pulser II (Bio-Rad) a 250 V y 500 jF , y el resultante se añadió en cantidades de 0,1 ml/placa a cinco placas de 10 cm en las que previamente se habían sembrado células alimentadoras resistentes a neomicina (DS Pharma). A estas se añadieron G418 (título: 250 jg/ml, Nacalai Tesque) de 12 a 18 horas después, y se cultivó durante 1 semana.

Ejemplo 7: Selección y confirmación de células ES recombinadas homólogamente

Se tomaron muestras de las colonias de células ES (384 colonias) desarrolladas como resultado del cultivo durante 1 semana después de la adición de G418 en el Ejemplo 6. Las colonias se dividieron en dos y una de ellas se siguió cultivando. La otra se trató con proteinasa K y se sometió a PCR utilizando los cebadores que se muestran a continuación. Se seleccionaron tres clones recombinados homólogamente.

HHD-HRES-F1: 5-AGCATTTCCTAGTACAGTTCAACACAGTGTTTAGT-3' (SEQ ID NO: 26)

HHD-HRES-R1: 5'-GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT-3' (SEQ ID NO: 27)

Se repitió un ciclo de PCR de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos 35 veces. El producto de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 %, para detectar así un producto de la PCR (aproximadamente 1,4 kb) que se dedujo que se desarrolló tras la recombinación homóloga correcta. Se determinó que los clones en los que se detectó tal producto de la PCR eran clones positivos.

Con el fin de confirmar la recombinación homóloga con mayor precisión, se extrajo el ADN genómico de los clones de células ES que se determinó que eran los clones positivos anteriores y se analizó mediante transferencia Southern de la manera que se describe a continuación.

El ADN genómico (10 |jg) se escindió con la enzima de restricción EcoRI, se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 % y a continuación se transfirió a una membrana de nailon (Hybond-N+, Pharmacia) usando una solución 10x SSC por el método capilar. Además, se preparó un fragmento de a Dn de aproximadamente 0,5 kb en una región en dirección 5' del fragmento de ADN de 1.198 pb clonado en el Ejemplo 5. La hibridación Southern se llevó a cabo utilizando el fragmento de ADN marcado con [a-32P]-dCTP (Perkin Elmer) como sonda. Como resultado, se detectó una banda de aproximadamente 2,1 kb resultante de la recombinación homóloga correcta y una banda de 2,5 kb derivada de un tipo silvestre en una proporción 1:1 (Fig. 4).

Ejemplo 8: Preparación de un animal transgénico con el gen quimérico artificial (HHD-A2402) insertado

Las células ES recombinadas homólogamente se dispersaron por separado mediante tratamiento con tripsina. Un ratón macho de la cepa C57BL/6 se sometió a cruzamiento con un ratón hembra de la misma cepa, se extrajeron los blastocistos de la rata hembra y se inyectaron aproximadamente 10 células ES descritas anteriormente en la cavidad de segmentación por blastocisto utilizando un aparato de microinyección (Narishige). Los resultantes se trasplantaron al útero de la ratón hembra pseudopreñada y se continuó con el desarrollo fetal. Por lo tanto, se obtuvo un ratón quimérico.

El ratón quimérico macho se sometió a cruzamiento con un ratón hembra de la cepa C57BL/6, los que presentaban el color del tipo silvestre (agouti) se seleccionaron de entre los ratones descendientes resultantes y se cortaron partes de las colas para preparar muestras. Se extrajo ADN genómico de las muestras y se sometió a PCR utilizando los cebadores que se muestran a continuación.

HHD-F1: 5'-CTAGAAGCAAGGTCAGAAATCCTCT-3' (SEQ ID NO: 28)

HHD-WT-R3: 5'-CCGTCAGCACACTCGCAAACAGGCG-3' (SEQ ID NO: 29)

HHD-HRES-R1: 5'-GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT-3' (SEQ ID NO: 30)

Se repitió un ciclo de PCR de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto 35 veces y el producto de la PCR se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Cuando se detectó un producto de la PCR de 510 pb que se dedujo que se había desarrollado tras la recombinación homóloga correcta además del producto de la PCR de 804 pb derivado del locus del gen de tipo silvestre, se determinó que los ratones examinados eran ratones heterocigotos para el gen insertado.

Los ratones heterocigotos para el gen insertado se sometieron a cruces entre sí, se extrajo ADN genómico de las muestras obtenidas cortando partes de las colas de los ratones descendientes, y se analizaron los genotipos de los mismos mediante la PCR descrita anteriormente. Cuando no se detectó un producto de la PCR de 804 pb derivado del locus del gen de tipo silvestre y solo se detectó un producto de la PCR de 510 pb que se dedujo que se había desarrollado tras la recombinación homóloga correcta, se determinó que los ratones examinados eran ratones homocigotos para el gen insertado.

Los ADN genómicos preparados a partir de partes de las colas de ratones homocigotos, ratones heterocigotos y ratones de tipo silvestre (3 individuos de cada uno) identificados mediante PCR se analizaron mediante la hibridación Southern descrita en el Ejemplo 7. Como resultado, se detectaron una sola banda de aproximadamente 2,1 kb, bandas de aproximadamente 2,1 kb y aproximadamente 2,5 kb, y una sola banda de aproximadamente 2,5 pb para ratones homocigotos, ratones heterocigotos y ratones de tipo silvestre, respectivamente (Fig. 5).

Se sacrificaron ratones homocigotos, heterocigotos y de tipo silvestre (3 individuos de cada uno), se prepararon los ARN totales a partir de los hígados utilizando Isogen (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y el kit RNeasy (QIAGEN), seguido de tratamiento con ADNasaI, y los ADNc se sintetizaron a continuación usando el SuperScript III First-Strand Synthesized System (Life Technologies). Después de la adición de TaqMan Assay Mix (Applied Biosystems) y 2x TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) para el cribado de la microglobulina p2 de ratón y el ARN ribosómico, se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa utilizando el PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Los resultados del análisis demuestran que la expresión del ARNm de la microglobulina p2 de ratón se perdió sustancialmente por completo en ratones homocigotos y dicha expresión en los ratones heterocigotos se redujo a un nivel que era aproximadamente la mitad del nivel de expresión observado en ratones de tipo silvestre (Fig. 6). Ejemplo 9: Preparación de un animal transgénico con el gen quimérico artificial (HHD-A0301) insertado

Basándose en la información de la secuencia para HLA-A0301 humano (N.° de registro en GenBank AJ748743.1), se sintetizó completamente un fragmento de gen que comprende las regiones a1 y a2. Específicamente, se añadió una secuencia que codifica un péptido de 10 aminoácidos que incluye la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo N terminal, y se añadió la secuencia de reconocimiento de BglII en la secuencia del intrón 3 en el lado C terminal, para sintetizar así el fragmento de ADN de 867 pb descrito a continuación. 5'-ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTG TCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCA GTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGA TAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCAGTCA CAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgt gagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccg aagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggttteatttteagtttaggccaaaaatecccccgggttggt cggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCATCCAGATAATGTAT GGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGGCAGGACGCCTACGA CGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGG CGGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATGAGGCGGAGCAGTTGAGAGCC TACCTGGATGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGAC GCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct-3' (SEQ ID NO: 31) (las letras mayúsculas indican regiones exón y las letras minúsculas indican regiones intrón)

De acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 2 a 8, se prepararon heterocigotos para el gen HHD-A0301 insertado y ratones homocigotos para el gen HHD-A0301 insertado.

Ejemplo 10: Preparación de un animal transgénico con el gen quimérico artificial (HHD-A0201) insertado

Basándose en la información de la secuencia para HLA-A0201 humano (N.° de registro en GenBank AY365426.1), se sintetizó completamente un fragmento de gen que comprende las regiones a l y a2. Específicamente, se añadió una secuencia que codifica un péptido de 10 aminoácidos que incluye la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo N terminal, y se añadió la secuencia de reconocimiento de BgllI en la secuencia del intrón 3 en el lado C terminal, para sintetizar así el fragmento de ADN de 867 pb descrito a continuación. 5'-ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCAT GAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGAC GACACGCA GTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGA TAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCA CAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgtagtgaccccggccggtgg cgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccg agccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttcattttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggt cggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTAT GGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGAC GGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGC AGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCT ACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACG CTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct-3' (SEQ ID NO: 43) (las letras mayúsculas indican regiones exón y las letras minúsculas indican regiones intrón)

De acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 2 a 8, se prepararon heterocigotos para el gen HHD-A0201 insertado y ratones homocigotos para el gen HHD-A0201 insertado.

Ejemplo 11: Preparación de un animal transgénico con el gen quimérico artificial (HHD-A3101) insertado

Basándose en la información de la secuencia para HLA-A3101 humano (N.° de registro en GenBank M84375.1), se sintetizó completamente un fragmento de gen que comprende las regiones a1 y a2. Específicamente, se añadió una secuencia que codifica un péptido de 10 aminoácidos que incluye la secuencia de reconocimiento de BamHI al extremo N terminal, y se añadió la secuencia de reconocimiento de BgllI en la secuencia del intrón 3 en el lado C terminal, para sintetizar así el fragmento de ADN de 867 pb descrito a continuación.

¿'-ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgG ATC TC AC TC C ATG A G G TATTT C’ ACCAC ATCCG T GTCXX:<MXCCGCKX5GCGGGGAGCCCOGCTTC ATCGCOGTGGGCTACGTGGACGACACGC AGTTCGTGCGGTTCGAC AGCGACGCCGCGAGCGAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGG ATAG AG CAG G AG AG G C CTGAGTATTGGGAC CA GGAGAC A CG G AATG TG AAG G C CCA CTC A C A G A TTGAOCGAGTGGA CCTGGGG ACCCTGCG CGGCT'ACTAGA ACCAGAGCGAGGCCG gtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagalccacccc gaagccgcgggaccccgagaccc ttgccccgggagaggcccaggcgc ctttacccggtttc attttcagtttaggcc aaaaatccccccgggttgg tccgggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTC A C A CC ATC C AG ATG ATG TA TGGCTG CG A CGTGGGG TCGG ACG GG C C f T rCC TCCG C GG GT ACC AG C AG G A C G CCT A CG AC G G CAAG G ATTACATCG C CTTGA A CG A GG A CCTGCGCTCTTG GACCGCGGCGGACATG GCGGCTC AGATCACCCAGCGC AAGTGGGAGGCGGCCCGTG7GGCGGAGC AGTTO AG AG C C T A CCTGG AGGG CACGTGCGTGG AG TGG CTCCGC AG ATA C CTGG AG A ACGGG A AGG A G A ÜGCTGC AGCGC A CGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct-S'

(SEQ ID NO: 44)

(las letras mayúsculas indican regiones exón y las letras minúsculas indican regiones intrón)

De acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 2 a 8, se prepararon heterocigotos para el gen HHD-A3101 insertado y ratones homocigotos para el gen HHD-A3101 insertado.

Ejemplo 12: Preparación de un animal transgénico con los genes HHD-A2402 y HHD-A0301 insertados

Los ratones homocigotos para el gen HHD-A2402 insertado se sometieron a cruzamiento con los ratones homocigotos para el gen HHD-A0301 insertado para preparar ratones con doble inserción de gen que llevan una copia de cada uno de los genes HHD-A2402 y HHD-A0301.

Ejemplo 13: Confirmación de la expresión del gen MHC de clase I humano y de ratón en ratones con el gen insertado ratones homocigotos para el gen HHD-A2402 insertado, ratones homocigotos para el gen HHD-A0301 insertado, ratones heterocigotos para el gen HHD-A2402 insertado, ratones heterocigotos para el gen HHD-A0301 insertado, ratones de tipo silvestre como miembros de camada de control y ratones con dos genes HHD-A2402/HHD-A0301 insertados se sacrificaron, y se analizó mediante citometría de flujo la expresión del gen del MHC de clase I humano en la superficie de las células sanguíneas o células esplénicas recogidas de los bazos extraídos. Específicamente, se tiñeron 1 x 106 células esplénicas o células sanguíneas con anticuerpo monoclonal anti-HLA marcado con PE 17A10 (MBL) o el anticuerpo biotinilado 4i153 (Abcam) como anticuerpo primario y el anticuerpo anti-biotina marcado con PE Bio3-18E7 (Miltenyi Biotec) como el anticuerpo secundario.

Como resultado, se detectó expresión de HLA-A24 en ratones homocigotos para el gen HHD-A2402 insertado y ratones heterocigotos para el gen HHD-A2402 insertado, y se detectó la expresión de HLA-A3 en ratones homocigotos para el gen HHD-A0301 insertado y en ratones heterocigotos para el gen HHD-A0301 insertado. Adicionalmente, se detectó la expresión tanto de HLA-A24 como de HLA-A3 en ratones con dos genes HHD-A2402/HHD-A0301 insertados (Fig. 7-1 y Fig. 7-2).

Además, se analizó la expresión del gen MHC de clase I endógeno de ratón en la superficie de las células esplénicas usando el anticuerpo anti-H-2Kb marcado con PE AF6-88.5 (BD Bioscience). Como resultado, se detectó la expresión de H-2Kb en ratones de tipo silvestre, ratones heterocigotos para el gen HHD-A2402 insertado y ratones heterocigotos para el gen HHD-A0301 insertado. En cambio, la expresión de H-2Kb se perdió casi por completo en ratones homocigotos para el gen HHD-A2402 insertado, ratones homocigotos para el gen HHD-A0301 insertado y ratones con dos genes h Hd -A2402/HHD-A0301 insertados Fig. 8-1 y Fig. 8-2).

Mediante el uso del anticuerpo monoclonal anti-HLA-A2 marcado con PE BB7.2 (MBL) y el anticuerpo monoclonal anti-microglobulina p2 humana marcado con FITC TU99 (BD Bioscience), se analizó de la misma manera la expresión de HLA-A2 y la microglobulina p2 humana en la superficie de las células sanguíneas de los ratones homocigotos para el gen HHD-A0201 insertado, ratones heterocigotos para el gen HHD-A0201 insertado y en ratones de tipo silvestre como miembros de camada de control. Además, se analizó de la misma manera la expresión de la microglobulina p2 humana en la superficie de las células sanguíneas de los ratones homocigotos para el gen HHD-A3101 insertado, ratones heterocigotos para el gen HHD-A3101 insertado y ratones de tipo silvestre compañeros de camada de control usando el anticuerpo anti-microglobulina p2 humana marcado con FITC TU99.

Como resultado, se detectó la expresión de HLA-A2 y microglobulina p2 humana en ratones homocigotos para el gen HHD-A0201 insertado y ratones heterocigotos para el gen HHD-A0201 insertado (Fig. 9-1), y se detectó la expresión de la microglobulina p2 humana en ratones homocigotos para el gen HHD-A3101 insertado y en ratones heterocigotos para el gen HHD-A3101 insertado (Fig. 9-2).

Adicionalmente, se analizó la expresión del gen MHC de clase I endógeno de ratón en la superficie de las células sanguíneas usando el anticuerpo anti-H-2Kb/H-2Db marcado con PE 28-8-6 (Biolegend). Como resultado, se detectó la expresión de H-2Kb y/o H-2Db en ratones de tipo silvestre, ratones heterocigotos para el gen HHD-A0201 insertado y ratones heterocigotos para el gen HHD-A3101 insertado; sin embargo, la expresión de H-2Kb y H-2Db se perdió casi por completo en ratones homocigotos para el gen HHD-A0201 insertado y en ratones homocigotos para el gen HHD-A3101 insertado (Fig. 10-1 and Fig. 10-2).

Ejemplo 14: Confirmación de la capacidad de inducción de CTL en ratones con el gen A24 insertado

Los péptidos antigénicos derivados de virus o los péptidos de control negativo descritos a continuación se disolvieron a 2 mg/ml en agua destilada Otsuka (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) y se introdujeron en una jeringa B Braun Injekt.

A24V6: EYLVSFGVW (antígeno derivado del HBV restringido a A24) (SEQ ID NO: 32)

A24V8: SFHSLHLLF (antígeno derivado del HTLV restringido a A24) (SEQ ID NO: 33)

A24V9: DYCNVLNKEF (antígeno derivado del EBV restringido a A24) (SEQ ID NO: 34)

A24V10: RYLRDQQLL (antígeno derivado del HIV restringido a A24) (SEQ ID NO: 35)

Después de llenar otra jeringa con una cantidad equivalente de adyuvante incompleto de Freund (IFA), estas jeringas se conectaron con la ayuda de un conector de jeringa GP y la solución de péptidos antigénicos derivados de virus se mezcló a fondo con IFA para preparar una emulsión. La emulsión se administró por vía subcutánea a ratones homocigotos para el gen A24 insertado, ratones heterocigotos para el gen A24 insertado, y ratones compañeros de camada de tipo silvestre en las cabezas de la cola en cantidades de 100jl/ratón una vez por semana, y la administración se realizó dos veces en total. Los ganglios linfáticos de las ingles se extrajeron de los ratones 1 semana después de la administración final. Se preparó una suspensión de células de los ganglios linfáticos ajustando la concentración celular a 5 * 106 células/ml con la ayuda de un medio completo (RPMI-1640, FBS inactivado con calor al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/ml, 2-Mercaptoetanol 50 j M), a esta se añadieron el péptido del epítopo de CTL diana (concentración final: 10 jg/ml), la IL-15 de ratón recombinante (concentración final: 100 ng/ml) y la iL-21 de ratón recombinante (concentración final: 100 ng/ml), la suspensión resultante se sembró en una placa de 24 pocillos a 1 ml/pocillo y el cultivo se realizó en una incubadora a 37 °C en presencia de CO2 al 5 % durante 8 días. A continuación, las células se recuperaron y se sembraron en una placa inmovilizada con anticuerpos anti-IFN-y incluida en el Murine IFN-y ELISpot Kit (GEN-PROBE) a 1 x 105 células/pocillo. Posteriormente, las células esplénicas obtenidas del bazo del ratón de la misma cepa e irradiadas con rayos X a 30 Gy se sembraron en el mismo pocillo que las células presentadoras de antígeno a 1 x 105 células/pocillo, se añadieron los péptidos del epítopo CTL diana o los péptidos de control negativo (concentración final: 10 jg/m l) y el cultivo se realizó por la noche en una incubadora a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %. Se dejó que las manchas de células productoras de IFN-y desarrollaran color de acuerdo con las instrucciones del kit al día siguiente. El número de manchas de células productoras de IFN-y se determinó utilizando el analizador ELISPOT (Immunospot S6, Cellular Technology Ltd.). Como resultado, se encontró que el número de manchas de células productoras de IFN-y en los pocillos a los que se habían añadido los péptidos antigénicos derivados de virus era significativamente mayor que en los pocillos a los que se habían añadido los péptidos de control negativo tanto en los ratones homocigotos para el gen A24 insertado como en los ratones heterocigotos para el gen A24 insertado (prueba t de Student), p <0,001), y se observó la inducción de CTL específicos de epítopo, como se muestra en la Fig. 11.

Ejemplo 15: Confirmación de la capacidad de inducción de CTL en ratones con el gen A3 insertado

Los péptidos antigénicos derivados de virus descritos a continuación se disolvieron a 2 mg/ml en agua destilada Otsuka (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) y se introdujeron en una jeringa B Braun Injekt.

A3V3: RLRPGGKKK (antígeno derivado del HIV restringido a A3) (SEQ ID NO: 36)

A3V4: QVPLRPMTYK (antígeno derivado del HIV restringido a A3) (SEQ ID NO: 37)

A3V7: RLRAEAQVK (antígeno derivado del EBV restringido a A3) (SEQ ID NO: 38)

A3V10: SIIPGPLK (antígeno derivado del virus de la gripe restringido a A3) (SEQ ID NO: 39)

Después de llenar otra jeringa con una cantidad equivalente de adyuvante incompleto de Freund (IFA), estas jeringas se conectaron con la ayuda de un conector de jeringa GP y la solución de péptidos antigénicos derivados de virus se mezcló a fondo con IFA para preparar una emulsión. La emulsión se administró por vía subcutánea a ratones homocigotos para el gen A3 insertado, ratones heterocigotos para el gen A3 insertado, y ratones compañeros de camada de tipo silvestre en las cabezas de la cola en cantidades de 100|jl/ratón una vez por semana, y la administración se realizó dos veces en total. La inducción de CTL específicos del péptido antigénico derivado de virus se evaluó a continuación con el método descrito en el Ejemplo 14.

Como resultado, se encontró que el número de manchas de células productoras de IFN-y en los pocillos a los que se habían añadido los péptidos antigénicos derivados de virus era significativamente mayor que en los pocillos a los que se habían añadido los péptidos de control negativo tanto en los ratones homocigotos para el gen A3 insertado como en los ratones heterocigotos para el gen A3 insertado (prueba t de Student), p < 0,01 o p <0,001), y se observó la inducción de CTL específicos de epítopo, como se muestra en la Fig. 12.

Ejemplo 16: Confirmación de la capacidad de inducción de CTL en ratones con dos genes A24/A3 insertados

Los péptidos antigénicos derivados de virus (A3V7 y A24V8) se administraron a ratones con dos genes A24/A3 insertados y a ratones de tipo silvestre de la manera descrita anteriormente, y se evaluó la inducción de CTL específicos del péptido antigénico derivado de virus de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 14. Como resultado, se encontró que el número de manchas de células productoras de IFN-y en los pocillos a los que se habían añadido péptidos antigénicos derivados de virus era significativamente mayor que en los pocillos donde los péptidos de control negativo se habían añadido a ratones con dos genes A24/A3 insertados (prueba t de Student, p <0,001), y se observó la inducción de CTL específicos de epítopo, como se muestra en la Fig. 13.

Ejemplo 17: Confirmación de la capacidad de inducción de CTL en ratones con el gen A2 insertado

Los péptidos antigénicos derivados de virus descritos a continuación se disolvieron a 1 mg/ml en agua destilada Otsuka (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) y se introdujeron en una jeringa B Braun Injekt.

A2V1: CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 45)

A2V2: GLCTLVAML (SEQ ID NO: 46)

A2V3: NLVPMVATV (SEQ ID NO: 47)

A2V4: VLAELVKQI (SEQ ID NO: 48)

A2V7: VLSDFKTWL (SEQ ID NO: 49)

A2V8: FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 50)

A2V9: FLLTRILTI (SEQ ID NO: 51)

A2V10: GLSPTVWLS (SEQ ID NO: 52)

Después de llenar otra jeringa con una cantidad equivalente de adyuvante incompleto de Freund (IFA), estas jeringas se conectaron con la ayuda de un conector de jeringa GP y la solución de péptidos antigénicos derivados de virus se mezcló a fondo con IFA para preparar una emulsión. La emulsión se administró por vía subcutánea a ratones homocigotos para el gen A2 insertado, ratones heterocigotos para el gen A2 insertado, y ratones compañeros de camada de tipo silvestre en las cabezas de la cola en cantidades de 100pl/ratón una vez por semana, y la administración se realizó dos veces en total. La inducción de CTL específicos del péptido antigénico derivado de virus se evaluó a continuación con el método descrito en el Ejemplo 14. Como resultado, se encontró que el número de manchas de células productoras de IFN-y en los pocillos a los que se habían añadido los péptidos antigénicos derivados de virus era significativamente mayor que en los pocillos a los que se habían añadido los péptidos de control negativo tanto en los ratones homocigotos para el gen A2 insertado como en los ratones heterocigotos para el gen A2 insertado (prueba t de Student), p <0,001), y se observó la inducción de CTL específicos de epítopo, como se muestra en la Fig. 14.

Ejemplo 18: Confirmación de la capacidad de inducción de CTL en ratones con el gen A31 insertado

A31V3: ASCMGLIYNR (SEQ ID NO: 53)

A31V5: SVQPTFSVQR (SEQ ID NO: 54)

A31V6: KFLPDLYDYK (SEQ ID NO: 55)

A31V8: SFSFGGFTFK (SEQ ID NO: 56)

A31V10: RVIDPRRCMK (SEQ ID NO: 57)

Después de llenar otra jeringa con una cantidad equivalente de adyuvante incompleto de Freund (IFA), estas jeringas se conectaron con la ayuda de un conector de jeringa GP y la solución de péptidos antigénicos derivados de virus se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor con un gen del HLA de clase I insertado (knock-in), en el cual un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a l y a2 del HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I del roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal, se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor.

2. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen quimérico artificial se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en un locus de un par de loci de la microglobulina p2 del roedor.

3. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde las regiones a l y a2 del HLA de clase I son regiones a l y a2 del HLA-A de clase I.

4. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con la reivindicación 3, en donde e1HLA-A es HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2, o HLA-A31 o en donde el HLA-A es HLA-A2402, HLA-A0301, HLA-A0201 o HLA-A3101.

5. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un primer gen quimérico artificial que codifica la primera proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a1 y a2 del HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I del roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal, se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en el primer locus del gen del par de loci de la microglobulina p2 del roedor;

y un segundo gen quimérico artificial que codifica la segunda proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I del roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal, se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 en el otro locus del gen, que es el segundo locus del gen del par de loci de la microglobulina p2 del roedor.

6. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las regiones a1 y a2 del HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son del mismo genotipo.

7. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con la reivindicación 5, en donde las regiones a1 y a2 del HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son de diferentes genotipos.

8. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde las regiones a1 y a2 del HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son del HLA-A.

9. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde las regiones a1 y a2 del HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son de HLA-A24, HLA-A3, HLA-A2 o HLA-A31, o en donde las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son de HLA-A2402, HLA-A0301, HLA-A0201 o HLA-A3101, en donde las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la primera proteína quimérica artificial y las regiones a1 y a2 de1HLA de clase I de la segunda proteína quimérica artificial son las mismas o diferentes.

10. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la región a3 del MHC de clase I del roedor es la región a3 del H-2 de clase I.

11. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con reivindicación 10, en donde la región a3 del MHC de clase I del roedor es la región a3 de H-2Db.

12. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la microglobulina p2 es la microglobulina p2 humana.

13. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el roedor es un ratón.

14. El roedor con un gen del HLA de clase I insertado de acuerdo con reivindicación 13, que tiene un genotipo representado como B2m+/(HLA/H-2/B2M) o B2m(HLA/H-2/B2M)/(HLA/H-2/B2M).

15. Una célula de roedor que expresa un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2, las regiones a l y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor ligadas en este orden desde el extremo N terminal bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor, en donde la microglobulina p2 deriva o no deriva del roedor y en donde el gen quimérico artificial está insertado en los loci de la microglobulina p2 de la célula de roedor.

16. La célula de acuerdo con la reivindicación 15, que es una célula madre embrionaria (ES), una célula de glutamina sintetasa (GS) o una célula madre pluripotente (iPS) inducida.

17. Un tejido aislado, un órgano aislado, una célula aislada, un cultivo de células primarias o una línea celular establecida que expresa un gen quimérico artificial que codifica una proteína quimérica artificial que comprende una proteína compuesta de microglobulina p2 exógena o endógena, las regiones a l y a2 de1HLA de clase I y una región a3 del MHC de clase I de un roedor, ligadas en este orden desde el extremo N terminal bajo el control de una región reguladora de la transcripción del gen de la microglobulina p2 del roedor, obtenida del roedor con un gen de1HLA de clase I insertado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14.

18. Un método para el cribado de un inductor de CTL específicos de la sustancia de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) permitir que una sustancia de ensayo reaccione con la célula de acuerdo con las reivindicaciones 15 o 16, o con el tejido aislado, el órgano aislado, la célula aislada, el cultivo de células primarias o la línea celular establecida de acuerdo con la reivindicación 17; y

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

19. Un método para determinar la presencia o ausencia de un antígeno restringido a1HLA de clase I, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

20. Un método para el cribado de un agente terapéutico o preventivo de una enfermedad, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la enfermedad es un cáncer o una infección.

22. Un método para el cribado de un inductor de CTL específicos de la sustancia de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) permitir que una sustancia de ensayo reaccione con el roedor con el gen de1HLA de clase I insertado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14; y

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

23. Un método para determinar la presencia o ausencia de un antígeno restringido a1HLA de clase I, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

24. Un método para el cribado de un agente terapéutico o preventivo de una enfermedad, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(2) determinar si se inducen o no CTL específicos de la sustancia de ensayo.

25. Un método para comparar la especificidad de las reacciones de CTL restringidas a1HLA inducidas por las sustancias de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) administrar sustancias de ensayo a una pluralidad de diferentes cepas de roedores con el gen de1HLA de clase I insertado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que expresa diferentes genes de1HLA de clase I y ensayar las reacciones de CTL inducidas en los roedores; y

26. Un método para evaluar la eficacia de las reacciones de CTL inducidas por las sustancias de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

27. Un método para evaluar la seguridad de una sustancia de ensayo, que comprende las siguientes etapas (1) y (2):

(1) permitir que una sustancia de ensayo reaccione con el roedor con el gen de1HLA de clase I insertado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14; y

(2) analizar reacciones desfavorables que ocurren en el roedor.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde las reacciones desfavorables son reacciones autoinmunitarias.

29. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en donde las sustancias de ensayo son una o más de péptidos, una o más de polipéptidos, una o más de oligonucleótidos, una o más de polinucleótidos, o una o más de proteínas.