JPWO2015056774A1 - Ｈｌａクラスｉ発現非ヒト動物 - Google Patents

Abstract

短期間で効率的かつ簡便に作製することができ、かつ導入遺伝子の導入コピー数及び導入位置が制御され、当該遺伝子の発現量や発現部位が制御されているＨＬＡクラスＩ発現非ヒト動物、及び、その作製方法の提供。β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、及び、その作製方法。

Description

本発明はＨＬＡクラスＩ発現非ヒト動物、その製造方法、及びその利用等に関する。さらに詳しくは、本発明は、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物や非ヒト細胞、それらの派生物、及びそれらの使用方法に関する。

主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）は、癌やウイルス由来の抗原ペプチドを提示することによって、Ｔ細胞の免疫応答誘導による生体防御反応に重要な役割を果たしている。ＭＨＣはクラスＩとクラスＩＩの二種類に分類され、このうちクラスＩは、生殖細胞や赤血球などを除いた全ての体細胞に発現している。ＭＨＣクラスＩはα鎖とβ鎖で構成され、このうちα鎖は、抗原ペプチドの収容溝の形成に関与するα１・α２領域、および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）表面に発現する補助レセプターＣＤ８分子との結合に関与するα３領域からなる。一方、ＭＨＣクラスＩのβ鎖はβ２ミクログロブリン遺伝子によってコードされる（非特許文献１）。

細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、Ｔ細胞受容体を介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と抗原ペプチドの複合体を認識することによって活性化され、同じ複合体を発現する癌細胞やウイルス感染細胞を特異的に傷害することが知られている。このような細胞性免疫機構を利用して、がん免疫療法や感染症治療のためのワクチン開発が行われている。

実験動物として汎用されているマウスのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２クラスＩ）は、ヒトのＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡクラスＩ）とは異なるため、ヒトワクチン開発におけるイン・ビボ評価モデルとしてマウスを使用することはできない。そのため、プロモーター領域を含むヒトＨＬＡ遺伝子や、マウスＨ２プロモーター領域の下流にＨＬＡ遺伝子を挿入した組換え遺伝子を、マウス受精卵にインジェクションすることによって、ヒトＨＬＡクラスＩ分子を発現する様々なトランスジェニックマウスが作製された（非特許文献２，３）。しかしながら、これらのトランスジェニックマウスでは、マウスＣＤ８によるヒトＨＬＡクラスＩのα３領域の認識が不十分であるために、ＨＬＡ拘束性のＣＴＬ誘導は限定的であった。そこで、ＨＬＡクラスＩのα１／α２とマウスＨ−２クラスＩのα３を融合したキメラ遺伝子をＳＶ４０プロモーターの下流に挿入したトランスジェニックマウスが作製され（非特許文献４）、初めてイン・ビボでＨＬＡ拘束性のＣＴＬ誘導を評価することが可能となった。

ところが、これらのトランスジェニックマウスでは内在性のマウスＨ−２クラスＩが発現しており、マウスＣＴＬが抗原を認識する際にＨ−２クラスＩ分子を好んで使用するために、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導は不完全であった。この問題を解決するために、マウスＨ−２クラスＩａ分子（Ｈ−２Ｋ^ｂおよびＨ−２Ｄ^ｂ）のダブルノックアウトマウスとＨＬＡクラスＩキメラ遺伝子トランスジェニックマウスを交配して複合変異マウスが作製され、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導が改善されることが報告されている（非特許文献５）。

ところで、ＭＨＣクラスＩのβ鎖を構成するβ２ミクログロブリン遺伝子はＭＨＣクラスＩ分子の機能に必須であるため、β２ミクログロブリン遺伝子が破壊されたマウスでは、マウスＭＨＣクラスＩの機能が失われることが報告されている（非特許文献６，７）。また、β２ミクログロブリンのＣ末端とＭＨＣクラスＩのＮ末端を１５アミノ酸からなるペプチドリンカーで結合した１本鎖融合遺伝子は、細胞内で正常に機能することが知られている（非特許文献８）。

そこで、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１／α２ドメイン、およびマウスＨ−２クラスＩのα３ドメインを融合させた人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子を、ＨＬＡクラスＩ遺伝子プロモーターの下流に挿入したトランスジェニックマウスを作製し、β２ミクログロブリン遺伝子ノックアウトマウスと交配することにより複合変異マウスが作製された（非特許文献９）。これらのマウスでは、Ｈ−２クラスＩの発現がほぼ完全に消失し、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導反応が認められることから、現時点で最も優れたＭＨＣクラスＩヒト化マウスであると考えられている。

近年、上記のＭＨＣクラスＩヒト化マウスに、さらに重度免疫不全動物であるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇａｍｍａ−ｃ−ｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスを交配し、得られた多重変異マウスにヒト血液幹細胞を移入することによって、完全なＨＬＡ拘束性Ｔ細胞を有するヒト適応免疫系の再構築が可能であることが報告されている（非特許文献１０）。従って、前述のＭＨＣクラスＩヒト化マウスは、他の変異系統との交配により、さらに優れたヒト免疫系モデル動物を作出する際にも有用であると考えられている。

しかしながら、これまでに作製された人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子トランスジェニックマウスにおけるトランスジーンの発現は、コピー数、ゲノム上の挿入位置、あるいはエピジェネティックな修飾など、様々な因子によって影響を受けると考えられる。したがって、作製されたトランスジェニック系統の中から最適な発現量を示す系統を選択する必要があった。また、同じ理由から異なるＭＨＣクラスＩを発現するトランスジェニックマウス系統間でＣＴＬ誘導能を比較することも困難であった。

さらに、ヒトＭＨＣクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導を高めるためには、選択された系統とβ２ミクログロブリン遺伝子破壊マウスとの交配が必要であるため、最適な発現量を示すトランスジェニックマウス系統を選択した後にも、さらなる時間と労力を要した。

このような理由から、ＭＨＣクラスＩヒト化マウスは非常に有用であるにもかかわらず、これまでＡ１，Ａ２，Ａ２４，Ａ１１，Ｂ４４，Ｂ７などの限られたトランスジェニック系統しか作出されておらず、β２ミクログロブリン遺伝子ノックアウトマウスとの交配による複合変異マウスの作製例はさらに限られていた。

Human Vaccines 4:6, 400‐409; November/December 2008 Eur J Immunol. 1989 Sep; 19 (9): 1575‐83 J Immunol. 1989 Feb 15; 142 (4): 1366‐71 J Exp Med. 1991 Apr 1; 173 (4): 1007‐15 J Immunol. 1999, 163: 2555‐60 Nature. 1990 Apr 19; 344 (6268): 742‐6 Science, Vol. 248 (8 June 1990): 1227‐30 Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 November 15; 89 (22): 10658‐62 J Exp Med. 1997 Jun 16; 185 (12): 2043‐51 Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jul 20; 107 (29): 13022‐7

本発明の課題は、前記のような欠点を解決したＨＬＡクラスＩ発現非ヒト動物、及び、その作製方法を提供することにある。

すなわち、本発明は、短期間で効率的かつ簡便に作製することができ、かつ導入遺伝子の導入コピー数及び導入位置が制御され、当該遺伝子の発現量や発現部位が制御されているＨＬＡクラスＩ発現非ヒト動物、及び、その作製方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現させることによって、短期間で効率的かつ簡便にＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物を作製することができ、さらに、当該手法により得られたＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物においては人工キメラ遺伝子の導入コピー数及び導入位置を制御することができ、当該遺伝子の発現量や発現部位を制御できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。

［１］β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［２］人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座のうちの一方の遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、［１］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［３］ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域がＨＬＡ−Ａに由来する、［１］又は［２］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［４］ＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３１である、［３］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［５］ＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ３１０１である、［３］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［６］β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む第１の人工キメラタンパク質をコードする第１の人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座のうちの第１の遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現しており；
β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む第２の人工キメラタンパク質をコードする第２の人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座のうち該第１の遺伝子座とは異なる方の第２の遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、
［１］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［７］第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、同一遺伝子型のＨＬＡに由来する、［６］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［８］第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、相異なる遺伝子型のＨＬＡに由来する、［６］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［９］第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域及び第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域がＨＬＡ−Ａに由来する、［６］〜［８］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１０］第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、同一又は異なって、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３１に由来する、［９］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１１］第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、同一又は異なって、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ３１０１に由来する、［９］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１２］非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＨ−２クラスＩに由来する、［１］〜［１１］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１３］非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＨ−２Ｄ^ｂに由来する、［１２］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１４］β２ミクログロブリンがヒトβ２ミクログロブリンである、［１］〜［１３］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１５］非ヒト動物がマウスである、［１］〜［１４］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１６］Ｂ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}で表される遺伝子型を有する、［１５］のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。

［１７］β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子座の転写調節領域の制御下に導入する工程を含む、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物の作製方法。

［１８］（１）β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を含むターゲティングベクターを作製し、
（２）該非ヒト動物の多能性幹細胞に該ターゲティングベクターを作用させ、該多能性幹細胞のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下に導入する工程を含む、［１７］の方法。

［１９］多能性幹細胞がＥＳ細胞、ＧＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、［１８］の方法。

［２０］ 相同組換えによって人工キメラ遺伝子を多能性幹細胞のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下に導入する、［１８］又は［１９］の方法。

［２１］β２ミクログロブリンがヒトβ２ミクログロブリンである、［１７］〜［２０］のいずれかの方法。

［２２］β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現する、細胞。

［２３］ＥＳ細胞、ＧＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、［２２］の細胞。

［２４］［１］〜［１６］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物から得られる単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、又は確立された細胞株。

［２５］次の（１）及び（２）の工程を含む、被験物質特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法。
（１）［１］〜［１６］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、［２２］もしくは［２３］の細胞、または、［２４］の単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、もしくは確立された細胞株に被験物質を作用させる工程、
（２）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを評価する工程。

［２６］次の（１）及び（２）の工程を含む、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原の存否を評価する方法。
（１）［１］〜［１６］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、［２２］もしくは［２３］の細胞、または、［２４］の単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、もしくは確立された細胞株に被験物質を作用させる工程、
（２）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを評価する工程。

［２７］次の（１）及び（２）の工程を含む、疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
（１）［１］〜［１６］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、［２２］もしくは［２３］の細胞、または、［２４］の単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、もしくは確立された細胞株に被験物質を作用させる工程、
（２）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを評価する工程。

［２８］疾患が、癌又は感染症である、［２７］の方法。

［２９］次の（１）〜（２）の工程を含む、被験物質によって誘発されるＣＴＬ反応のＨＬＡ拘束特異性を比較する方法。
（１）被験物質を、［１］〜［１６］のいずれかの、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物であって、それぞれ異なるＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現している複数の異なる系統の該非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物において誘発されたＣＴＬ反応をそれぞれ測定する工程、
（２）該非ヒト動物よりそれぞれ測定されたＣＴＬ反応を比較し、ＣＴＬ反応を誘発する被験物質のＨＬＡ拘束性を判定する工程。

［３０］次の（１）〜（２）の工程を含む、被験物質によって誘発されたＣＴＬ反応の有効性を評価する方法。
（１）被験物質を、［１］〜［１６］のいずれかの、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物であって、それぞれ異なるＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現している複数の異なる系統の該非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物において誘発されたＣＴＬ反応をそれぞれ測定する工程、
（２）該非ヒト動物よりそれぞれ測定されたＣＴＬ反応を比較し、ＣＴＬ反応を誘発する被験物質のＨＬＡ拘束性を判定する工程。

［３１］次の（１）及び（２）の工程を含む、被験物質の安全性評価方法。
（１）［１］〜［１６］のいずれかのＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物に被験物質を作用させる工程、
（２）該非ヒト動物に起こる好ましくない応答を分析する工程。

［３２］好ましくない応答が自己免疫反応である、［３１］の方法。

［３３］被験物質が、一もしくは複数のペプチド、一もしくは複数のポリペプチド、一もしくは複数のオリゴヌクレオチド、一もしくは複数のポリヌクレオチド、又は一もしくは複数のタンパク質である、［２５］〜［３２］のいずれかの方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-217684号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

本発明によって、以下が可能となる。

本発明は、β２ミクログロブリン遺伝子座における遺伝子改変非ヒト動物を提供する。

より具体的には、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子（以下、「人工キメラ遺伝子」又は「該人工キメラ遺伝子」と記す。）が、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物や非ヒト細胞、それらの派生物、及びそれらの使用方法である。

該人工キメラ遺伝子を非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現させるという本発明の特徴によって、従来から知られるＨＬＡ遺伝子導入トランスジェニックマウスや、従来から知られる複合変異マウス（すなわち、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１／α２ドメイン、およびマウスＨ−２クラスＩのα３ドメインを融合させたタンパク質をコードする人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子を、ＨＬＡクラスＩ遺伝子プロモーターの下流に挿入したトランスジェニックマウスを作製し、β２ミクログロブリン遺伝子ノックアウトマウスと交配することにより作製した複合変異マウス（上記非特許文献９）。以下「従来から知られる複合変異マウス」と記す。）がもつ欠点を回避することが可能となる。

具体的には、本発明には、以下に示すような極めて優れた利点がある。

（１）作製時間の短縮、効率化、簡便化
従来から知られる複合変異マウスを作製する場合は、上記人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子を、ＨＬＡクラスＩ遺伝子プロモーターの下流に挿入したトランスジェニックマウスを作製し、導入遺伝子の発現が最適な系統を選択した後に、β２ミクログロブリン遺伝子ノックアウトマウスと交配しなければならないため、複合変異マウスを得るためには少なくとも１年半から２年の時間を要した。

これに対して、本発明にかかる非ヒト動物は、系統選択及び交配のステップが必要ないため、例えば非ヒト動物がマウスの場合、7ヶ月から8ヶ月程度の短期間で作製することができる。

すなわち、本発明によれば、従来から知られる複合変異マウスに比較して、短期間で効率的かつ簡便に、目的とするＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物を作製することができる。

（２）生理的な発現レベルの実現（発現量）
従来から知られる複合変異マウスでは、導入される人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子のコピー数、ゲノム上の挿入位置、エピジェネティックな修飾など様々な因子によって、該人工キメラ遺伝子の発現量や発現部位が影響を受けるため、発現量や発現部位のコントロールが困難であった。また、機能的な該人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子が発現するかどうかもこれらの因子に左右されるため、機能的な該人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子が発現するかどうかは偶然によるところが多かった。

それに対して、本発明にかかる非ヒト動物では、該人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座の一方または両方におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現させる。したがって、従来から知られる複合変異マウスと異なり、本発明にかかる非ヒト動物では該人工キメラ遺伝子の挿入コピー数、挿入位置等をコントロールできる。

すなわち、本発明にかかる非ヒト動物では、β２ミクログロブリン遺伝子座に挿入された該人工キメラ遺伝子のコピー数が１コピー又は２コピーである。これによって、従来から知られる複合変異マウスと異なり、より生理的な発現レベルの実現が可能となる。

（３）系統間比較の可能化
本発明にかかる非ヒト動物では、上記の特徴を有することにより、異なる系統間で該人工キメラ遺伝子の発現量が一定となるため、例えば被験物質特異的なＣＴＬ誘導剤をスクリーニングする際、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原の存否を評価する際、疾患の治療又は予防剤をスクリーニングする際、被験物質によって誘発されるＣＴＬ反応のＨＬＡ拘束特異性を比較する際、被験物質によって誘発されたＣＴＬ反応の有効性を判断する際、または、被験物質の安全性を評価する際に、系統間での比較が可能となる。

（４）ヘテロ接合体作製の容易化
本発明にかかる非ヒト動物の１つの実施態様は、異なる遺伝子型のＨＬＡクラスＩ遺伝子を含む該人工キメラ遺伝子を、β２ミクログロブリン遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にそれぞれ１コピーずつ挿入した非ヒト動物であることができる。本発明のこの態様は、本発明にかかる非ヒト動物を交配することで簡便に作製することができる。本発明のこの態様では、異なる遺伝子型のＨＬＡクラスＩ遺伝子を同程度の量発現する非ヒト動物を得ることができる。従来から知られる複合変異マウスの作製方法でこのような非ヒト動物を作製しようとすれば、まず、異なる遺伝子型のＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製し、それぞれの遺伝子型を同程度の量発現する系統を選択し、それらを交配する必要があるが、それぞれの遺伝子型を同程度の量発現する系統を選択する工程は必ずしも容易ではない。これに対して、本発明にかかる非ヒト動物では、該人工キメラ遺伝子のコピー数が１コピー又は２コピーであることが明らかであること、及び、該人工キメラ遺伝子がβ２ミクログロブリン遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下に配置されていることから、交配によって異なる遺伝子型のＨＬＡクラスＩ遺伝子からなる該人工キメラ遺伝子を、β２ミクログロブリン遺伝子座にそれぞれ１コピーずつ有する非ヒト動物を得ることができ、これらは該異なる遺伝子型のＨＬＡクラスＩ遺伝子をそれぞれ生理的なレベルで発現していると考えられる。ヒトでは異なる型のＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現している場合が多い（すなわち、ＨＬＡクラスＩ遺伝子がヘテロ接合体である方が、ホモ接合体であるよりも多い）ことが知られている。したがって本発明にかかる非ヒト動物の１つの実施態様では、異なる型のＨＬＡクラスＩ遺伝子がそれぞれ生理的なレベルで発現していることによって、例えば、被験物質によって誘発されるＨＬＡ拘束性のＣＴＬ反応を調べる際に、よりヒトへの外挿性が高い評価モデルであると考えられる。

（５）生理的な発現レベルの実現（発現部位）
本発明にかかる非ヒト動物では、該人工キメラ遺伝子の発現はβ２ミクログロブリン遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にある。そのため、従来から知られる複合変異マウスと異なり、該人工キメラ遺伝子は該非ヒト動物のβ２ミクログロブリンプロモーター等の転写調節領域によって発現の制御をうける。したがって、該人工キメラ遺伝子は、該非ヒト動物内在性のβ２ミクログロブリン発現レベルと同程度に発現し、発現部位（例えば、細胞や組織）も本来ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現部位と一致していることが予想され、より生理的な発現レベルの実現が可能となるという利点がある。

（６）複合変異動物作製の容易化
本発明にかかる非ヒト動物は該人工キメラ遺伝子が該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインされているため、単一系統の遺伝子改変動物である。従来から知られる複合変異マウス（すなわち上記人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子を、ＨＬＡクラスＩ遺伝子プロモーターの下流に挿入したトランスジェニックマウスとβ２ミクログロブリン遺伝子ノックアウトマウスとの交配により作製した複合変異マウス）は、２系統の遺伝子改変動物の交配により作製されたヒトＨＬＡ発現動物である。したがって、本発明にかかる非ヒト動物は、減数分裂の際に、β２ミクログロブリン遺伝子座と人工キメラ遺伝子座が異なる配偶子に分配されることがないため、他系統との交配による複合変異動物の作製が容易であるという利点を有する。他系統の動物としては、免疫不全動物や発癌モデル動物などが例示できる。

（７）エピトープ認識能の向上、多様化
従来から知られるＨＬＡ遺伝子導入トランスジェニックマウスではＣＴＬ誘導が見られなかった被験物質であっても、本発明にかかる非ヒト動物ではＣＴＬ誘導を生じ得る。

（８）Ｈ−２クラスＩによる、ＨＬＡクラスＩ発現低下及びＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答低下の回避
β２ミクログロブリンはＭＨＣクラスＩの構成分子であり、β２ミクログロブリン・ホモノックアウトマウスではＨ−２クラスＩの発現が消失すること、およびＣＤ４⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団が顕著に減少することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ １９９０ ３４４：７４２−７４６）。

従来から知られる複合変異マウスでは、一般的にβ２ミクログロブリン遺伝子をホモノックアウトすることを要し、これによりＨ−２クラスＩの発現が消失した状況下で、人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子を発現させ、各種実験に使用される。これはβ２ミクログロブリン遺伝子をヘテロノックアウトさせた場合には、内在性のＨ−２クラスＩと導入した人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現が共発現することになるが、人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現量が野生型の非トランスジェニック・マウスと同程度にまで低下し、十分な人工ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現量を得られないことによる（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｊｕｎｅ １７；１９１：５８３−５９３）。したがって、β２ミクログロブリン遺伝子をヘテロノックアウトさせた従来から知られる複合変異マウスは、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合が野生型の非トランスジェニック・マウスのそれと同程度という好ましい性質を有するにもかかわらず、このマウスを用いてＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導反応を調べることができなかった。

一方、本発明にかかる非ヒト動物では、該人工キメラ遺伝子を該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座の一方（すなわち、ヘテロ）及び両方（すなわち、ホモ）にノックインした場合における導入した人工キメラ遺伝子の発現量は、それぞれ、導入された遺伝子コピー数から想定される変化の範囲内であり、ヘテロの場合において導入した人工キメラ遺伝子の発現量が野生型の非トランスジェニック・マウスと同程度にまで低下を生じることはなかった（後述の図９−１，９−２）。また、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合も、野生型の非トランスジェニック・マウスと同程度に保つことができた（後述の図１６）。したがって、本発明にかかる非ヒト動物では、該人工キメラ遺伝子を該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座の一方（すなわち、ヘテロ）にノックインした場合においても、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導反応を調べるのに利用することができる。

また、従来から知られるＨＬＡ遺伝子導入トランスジェニックマウスでは、β２ミクログロブリン遺伝子が野生型である場合には、β２ミクログロブリン遺伝子をホモノックアウトさせた場合と比べて、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導が顕著に低下することが知られている（Ｖａｃｃｉｎｅ ２００４ ２２：１７２８−１７３１、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２ １４：９２５−９３４）。これは例えば、β２ミクログロブリン遺伝子が野生型である場合には、内在性のＨ−２クラスＩと導入したＨＬＡクラスＩ遺伝子の発現が共発現することになるが、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＤ８^＋細胞の教育と維持の過程で、Ｈ−２クラスＩとＨＬＡクラスＩが競合することによってＨＬＡクラスＩ拘束性に教育されたＣＤ８^＋細胞集団が減少することが一因と考えられる。

一方、本発明にかかる非ヒト動物では、該人工キメラ遺伝子を該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座の一方（すなわち、ヘテロ）及び両方（すなわち、ホモ）にノックインした場合におけるＨＬＡクラスＩ拘束性エピトープによるＣＴＬ誘導は同程度であった（後述の図１１，１２，１４，１５）。したがって、本発明にかかる非ヒト動物では、該人工キメラ遺伝子を該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座の一方（すなわち、ヘテロ）にノックインした場合においても、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＴＬ誘導反応を調べることができる。

ヒトβ２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子の作製方法を示す概略図である。 相同組換えにより、β２ミクログロブリン遺伝子座に人工キメラ遺伝子をノックインする方法を示す概略図である。 ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックインマウス（ＨＬＡ−Ａ２４の場合）を作製するためのターゲッティングベクターの構造を示す概略図である。 相同組換え体ＥＳ細胞の遺伝子型を、サザンブロッティングにより解析した結果を示す写真図である。 野生型、人工キメラ遺伝子ヘテロノックインおよび人工キメラ遺伝子ホモノックインマウスの遺伝子型を、サザンブロッティングにより解析した結果を示す写真図である。 野生型、人工キメラ遺伝子ヘテロノックインおよび人工キメラ遺伝子ホモノックインマウスの各肝臓におけるマウスβ２ミクログロブリンｍＲＮＡ発現量を、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞および脾臓細胞におけるＨＬＡ−Ａ２４の発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞および脾臓細胞におけるＨＬＡ−Ａ３の発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞におけるＨ−２Ｋ^ｂの発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞におけるＨ−２Ｋ^ｂの発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞における人工キメラタンパク質（ＨＬＡ−Ａ２及びヒトβ２ミクログロブリンを含む）の発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞における人工キメラタンパク質（ヒトβ２ミクログロブリンを含む）の発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞におけるＨ−２Ｋ^ｂ／Ｈ−２Ｄ^ｂの発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 ノックインマウスの血球細胞におけるＨ−２Ｋ^ｂ／Ｈ−２Ｄ^ｂの発現量を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 野生型マウス、ならびに、人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４を含む）のヘテロノックインおよびホモノックインマウスを用いて、ウイルス由来抗原ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価した結果を示す図である。***はp＜0.001を示す。 野生型マウス、ならびに、人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３を含む）のヘテロノックインおよびホモノックインマウスを用いて、ウイルス由来抗原ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価した結果を示す図である。***はp＜0.001、**はp＜0.01をそれぞれ示す。 野生型マウス、ならびに、第一の人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４を含む）及び第二の人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３を含む）のダブルノックインマウスを用いて、ウイルス由来抗原ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価した結果を示す図である。***はp＜0.001を示す。 野生型マウス、ならびに、人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２を含む）のヘテロノックインおよびホモノックインマウスを用いて、ウイルス由来抗原ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価した結果を示す図である。***はp＜0.001を示す。 野生型マウス、ならびに、人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３１を含む）のヘテロノックインおよびホモノックインマウスを用いて、ウイルス由来抗原ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価した結果を示す図である。***はp＜0.001、**はp＜0.01をそれぞれ示す。 野生型マウス、ならびに、人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３１を含む）のヘテロノックインマウス、人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３１を含む）のホモノックインマウス、および第一の人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４を含む）と第二の人工キメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３を含む）のダブルノックインマウスの血球細胞における、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す図である。 （図１６−１の続き）

以下、本発明について詳細に説明する。

本明細書において「人工キメラタンパク質」とは、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をＮ末側よりこの順で連結して含む融合タンパク質をいう。

本明細書において「連結」とは、隣接するタンパク質ドメイン同士が直接的に結合されていてもよいし、隣接するタンパク質ドメインの間に適宜スペーサーとなるアミノ酸配列を介在させ隣接するタンパク質ドメイン同士が間接的に結合されていてもよい。スペーサーとしては従来公知のペプチドリンカーを利用することができるが、ペプチドリンカーのアミノ酸数と種類は限定されない。

本明細書において「人工キメラ遺伝子」とは、上記人工キメラタンパク質をコードする遺伝子であり、より詳細には、β２ミクログロブリンをコードする遺伝子、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域をコードする遺伝子、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする遺伝子をＮ末側よりこの順で連結して含む人工の融合遺伝子をいう。各遺伝子は直接的に結合させてもよいし、上記スペーサーとなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を介在させ隣接する遺伝子同士を間接的に結合させてもよい。上記スペーサーとなるアミノ酸配列をコードする塩基配列は従来公知のペプチドリンカーをコードする塩基配列等を利用することができ、また、該スペーサーとなるアミノ酸配列をコードする塩基配列には必要に応じて制限酵素認識配列を含むことができる。

該人工キメラ遺伝子として、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、並びに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域から細胞内ドメインまでが、そのＮ末端において、ペプチドリンカー（アミノ酸数と種類は限定されないが、好ましくはアミノ酸数１〜１００程度であり、さらに好ましくはアミノ酸数５〜５０程度であり、特に好ましくはアミノ酸数１０〜３０程度である。）によって、β２ミクログロブリンのＣ末端と結合したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子が好ましいが、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域から細胞内ドメインまでの組み合わせは制限されない。

本明細書において「β２ミクログロブリン」とは、ＭＨＣクラスＩのβ鎖を構成するタンパク質をいう。本明細書において「β２ミクログロブリン遺伝子」とは、ＭＨＣクラスＩのβ鎖を構成するβ２ミクログロブリンの遺伝子をいう。

本発明において「β２ミクログロブリン遺伝子」は、宿主となる非ヒト動物に由来しない外来性のβ２ミクログロブリン遺伝子であってもよいし、宿主となる非ヒト動物に由来する内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子であってもよい。したがって、本発明の「人工キメラ遺伝子」において、β２ミクログロブリン遺伝子は宿主となる非ヒト動物に由来しない外来性のβ２ミクログロブリン遺伝子であってもよいし、非ヒト動物に由来する内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子を利用してもよい。

本明細書において「非ヒト動物」とは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ等の哺乳動物、鳥類、爬虫類、両性類、魚類をいう。本発明における「非ヒト動物」は、β２ミクログロブリン遺伝子座を有し、外来遺伝子を導入できる動物であれば特に限定されるものではないが、好ましくは齧歯類であり、さらに好ましくはマウス又はラットであり、飼育及び操作上の点から特に好ましいのはマウスである。

好ましくは、本発明において「β２ミクログロブリン遺伝子」はヒトβ２ミクログロブリン遺伝子である。

ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるヒトβ２ミクログロブリンをコードする遺伝子が挙げられ、例えばＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００４０４８．２として登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。

また、本発明のヒトβ２ミクログロブリンには、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成することにより該ＭＨＣクラスＩ特異的な抗原提示能を有するポリペプチドや、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有しかつＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成することにより該ＭＨＣクラスＩ特異的な抗原提示能を有するポリペプチドも含まれる。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

なお、本発明において「遺伝子」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを意味し、所定のタンパク質又はポリペプチドをコードする限り特に形態は限定されない。

本明細書において「ＨＬＡクラスＩ」とは、ヒトのＭＨＣクラスＩをいい、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを含む。本明細書において「ＨＬＡクラスＩ遺伝子」とはヒトのＭＨＣクラスＩ遺伝子をいい、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃをコードする遺伝子を含む。ＨＬＡクラスＩは、好ましくはＨＬＡ−Ａであり、さらに好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２、又はＨＬＡ−Ａ３１である。

ＨＬＡ−Ａ２４としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ２４０２や配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ２４０３が挙げられ、これらをコードする遺伝子として、例えばＧｅｎＢａｎｋに、Ｍ６４７４０、及び、Ｍ６４７４１としてそれぞれ登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。ＨＬＡ−Ａ２４として好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４０２である。

ＨＬＡ−Ａ３としては、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ０３０１や配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ０３０２が挙げられ、これらをコードする遺伝子として、例えばＧｅｎＢａｎｋに、Ｌ７７７０２．１、及び、ＡＦ２１７５６１．１としてそれぞれ登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。ＨＬＡ−Ａ３として好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０３０１である。

ＨＬＡ−Ａ２としては、例えば、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ０２０１や配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ０２０３が挙げられ、これらをコードする遺伝子として、例えばＧｅｎＢａｎｋに、ＡＹ３６５４２６．１、及び、Ｕ０３８６３．１としてそれぞれ登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。ＨＬＡ−Ａ２として好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２０１である。

ＨＬＡ−Ａ３１としては、例えば、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ３１０１や配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＨＬＡ−Ａ３１０４が挙げられ、これらをコードする遺伝子として、例えばＧｅｎＢａｎｋに、Ｍ８４３７５．１、及び、ＡＦ１４８８６３．１としてそれぞれ登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。ＨＬＡ−Ａ３１として好ましくは、ＨＬＡ−Ａ３１０１である。

また、本発明において、「ＨＬＡクラスＩ」には配列番号２〜９で表されるアミノ酸配列において１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ抗原ペプチドに対して元のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同じか又は同程度の結合性を有するポリペプチドや、配列番号２〜９で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有しかつ抗原ペプチドに対して元のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同じか又は同程度の結合性を有するポリペプチドも含まれる。

本明細書において「ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域」とは、ＨＬＡクラスＩ分子のα１、α２、α３領域のうち、抗原ペプチドの収容溝の形成に関与するα１及びα２領域をいう。ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、上記ＧｅｎＢａｎｋ等の公知データベースに登録されているＨＬＡクラスＩの配列情報に基づいて決定することができる。

本明細書において「非ヒト動物ＭＨＣクラスＩ」とは、ヒト以外の動物のＭＨＣクラスＩをいう。本明細書において「非ヒト動物ＭＨＣクラスＩ遺伝子」とは、ヒト以外の動物のＭＨＣクラスＩをコードする遺伝子をいう。

「非ヒト動物ＭＨＣクラスＩ」としては、マウスのＨ−２、ラットのＲＴ１、ウサギのＲＬＡ、ニワトリのＢ遺伝子座 Ｂ ｌｏｃｕｓが挙げられる。

マウスのＨ−２クラスＩには、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌが含まれる。Ｈ−２Ｋとしては、例えば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるＨ−２Ｋ^ｂ、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＨ−２Ｋ^ｄ、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるＨ−２Ｋ^ｋが挙げられ、これらをコードする遺伝子として、例えばＧｅｎＢａｎｋに、Ｕ４７３２８．１、Ｕ４７３２９．１及び、Ｕ４７３３０．１としてそれぞれ登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。Ｈ−２Ｄとしては、例えば、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるＨ−２Ｄ^ｄや、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるＨ−２Ｄ^ｂが挙げられ、これらをコードする遺伝子として、例えばＧｅｎＢａｎｋに、Ｕ４７３２６．１、及び、Ｕ４７３２５．１としてそれぞれ登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。Ｈ−２Ｌとしては、例えば、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるＨ−２Ｌ^ｄが挙げられ、これをコードする遺伝子として、例えばＧｅｎＢａｎｋに、ＮＭ＿００１２６７８０８．１としてそれぞれ登録されている塩基配列からなるものを利用することができる。

非ヒト動物ＭＨＣクラスＩは好ましくはマウスのＨ−２クラスＩであり、その中でも特に、Ｈ−２Ｄ^ｂ又はＨ−２Ｋ^ｄが好ましい。

また、本発明において、「非ヒト動物ＭＨＣクラスＩ」には、配列番号１０〜１５で表されるアミノ酸配列において１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＣＤ８分子に対して元のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同じか又は同程度の結合性を有するポリペプチドや、配列番号１０〜１５で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有しかつＣＤ８分子に対して元のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同じか又は同程度の結合性を有するポリペプチドも含まれる。

本明細書において「非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域」とは、非ヒト動物のＭＨＣクラスＩ分子のα１、α２、α３領域のうち、ＣＴＬ表面に発現する補助レセプターＣＤ８分子との結合に関与するα３領域とそのＣ末側に存在する当該ＭＨＣクラスＩの細胞内ドメインをいう。なお、本明細書において、特に限定されることなく「非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域」と記載される場合には、当該α３領域から細胞内ドメインまでの領域を意味する。非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、上記ＧｅｎＢａｎｋ等の公知データベースに登録されている非ヒト動物ＭＨＣクラスＩの配列情報に基づいて決定することができる。

本発明にかかる非ヒト動物のＣＴＬが、ＨＬＡと抗原との複合体を有効に認識するために、「非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域」は、該人工キメラ遺伝子を導入する非ヒト動物のＭＨＣの同領域で置き換えられることが好ましい。（Eur. J. Immunol., 26 : 97, 1996；J. Immunol., 159 : 4753, 1997）。

本発明における「人工キメラタンパク質」において、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、及び、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域の遺伝子型の組合せは、「人工キメラタンパク質」が発現し機能すれば特に限定されないが、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域がＨＬＡ−Ａ２に由来する場合は、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域はマウスのＨ−２Ｄ^ｂに由来することが好ましく、α１及びα２領域がＨＬＡ−Ａ２４に由来する場合は、マウスのα３領域はＨ−２Ｄ^ｂに由来することが好ましく、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域がＨＬＡ−Ａ３に由来する場合は、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域はマウスのＨ−２Ｄ^ｂに由来することが好ましく、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域がＨＬＡ−Ａ３１に由来する場合は、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域はマウスのＨ−２Ｄ^ｂに由来することが好ましい。

本発明において、「人工キメラ遺伝子」には、上記β２ミクログロブリンをコードする遺伝子、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域をコードする遺伝子、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする遺伝子に加えて、当該人工キメラ遺伝子の発現及び翻訳を調整しうる任意の塩基配列を含むことができる。このような塩基配列として例えば、ＨＬＡクラスＩ遺伝子、特にＨＬＡ−Ａ２４遺伝子のリーダー配列［ATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGACCCAGACCTGGGCG］（配列番号４０）を含めることができる。当該リーダー配列はＨＬＡクラスＩ遺伝子のα１領域の上流にあり、ＨＬＡクラスＩ遺伝子より発現されたタンパク質が細胞膜上に局在するのに関与する（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３４：２７２７，１９８５）。当該リーダー配列はβ２ミクログロブリンをコードする塩基配列のＮ末端に付加することができる。

本発明においては、該「人工キメラ遺伝子」としては、例えば、(i)ヒトβ２ミクログロブリン、ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２のα１及びα２領域、ならびに、マウスのＨ−２Ｄ^ｂのα３領域をＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子（配列番号１６で表わされる塩基配列からなる）、(ii)ヒトβ２ミクログロブリン、ヒトＨＬＡ−Ａ０３０１のα１及びα２領域、ならびに、マウスのＨ−２Ｄ^ｂのα３領域をＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子（配列番号１７で表わされる塩基配列からなる）、(iii)ヒトβ２ミクログロブリン、ヒトＨＬＡ−Ａ０２０１のα１及びα２領域、ならびに、マウスのＨ−２Ｄ^ｂのα３領域をＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子（配列番号４１で表わされる塩基配列からなる）、ならびに／あるいは、(iv)ヒトβ２ミクログロブリン、ヒトＨＬＡ−Ａ３１０１のα１及びα２領域、ならびに、マウスのＨ−２Ｄ^ｂのα３領域をＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子（配列番号４２で表わされる塩基配列からなる）を利用することができる。

本明細書において「人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している」とは、該非ヒト動物において、内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子の発現（転写）を調節する領域に対して、人工キメラ遺伝子が作動可能な様式で連結され、これにより人工キメラ遺伝子の発現が該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域により調節されていることを示す。転写調節領域には、非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子のプロモーター領域やエンハンサー領域が含まれる。

「人工キメラ遺伝子が作動可能な様式で連結される」とは、人工キメラ遺伝子が非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現が駆動され得る限り、任意の形式で連結・配置されることを示す。例えば、人工キメラ遺伝子が「β２ミクログロブリン遺伝子」として、宿主である非ヒト動物に由来する内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子を利用する場合には、当該内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子（終止コドンを除く）の３’末端に、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする遺伝子をこの順で連結して挿入（ノックイン）・配置することにより行うことができる。

あるいは、人工キメラ遺伝子が「β２ミクログロブリン遺伝子」として、宿主となる非ヒト動物に由来しない外来性のβ２ミクログロブリン遺伝子（好ましくはヒトβ２ミクログロブリン遺伝子）を利用する場合には、ヒトβ２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、非ヒト動物の内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子の第一メチオニン以降に挿入することにより、すなわち、当該人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックイン・配置することにより行うことができる。

なお、本明細書において「ノックイン」又は「β２ミクログロブリン遺伝子座にノックイン」とは、非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下に人工キメラ遺伝子が配置されるように、相同組換えにより所望の遺伝子を導入し、人工キメラタンパク質を発現させることを意味する。すなわち、人工キメラ遺伝子が「β２ミクログロブリン遺伝子」として、宿主である非ヒト動物に由来する内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子を利用する場合には、当該内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子（終止コドンを除く）の３’末端に、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする遺伝子をこの順で連結して挿入し、人工キメラ遺伝子を形成し配置することを意味し、人工キメラ遺伝子が「β２ミクログロブリン遺伝子」として、宿主となる非ヒト動物に由来しない外来性のβ２ミクログロブリン遺伝子（好ましくはヒトβ２ミクログロブリン遺伝子）を利用する場合には、ヒトβ２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、非ヒト動物の内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子の第一メチオニン以降に挿入・配置することを意味する。

本発明において、人工キメラ遺伝子は、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座のうちの一方にノックインされていてもよいし、両方のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインされていてもよい。

一方のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインされている場合は、該非ヒト動物はβ２ミクログロブリン遺伝子座に該人工キメラ遺伝子を１コピー有していることとなる。

両方のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインされている場合は、該非ヒト動物はβ２ミクログロブリン遺伝子座に、該人工キメラ遺伝子を、同じ遺伝子型のものとして２コピー有する場合と、相異なる遺伝子型のものとして１コピーずつ有する場合がある。

人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の一方のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインされている場合は、人工キメラ遺伝子がコードする人工キメラタンパク質に含まれるＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域について、ＨＬＡクラスＩは、好ましくはＨＬＡ−Ａであり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３１である。より好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ３１０１である。

人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の両方のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインされている場合であって、両方の人工キメラ遺伝子にコードされている人工キメラタンパク質に含まれるＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域について、ＨＬＡクラスＩが同一遺伝子型のＨＬＡである場合は、これらは好ましくはＨＬＡ−Ａであり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３１である。より好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ３１０１である。

人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の両方のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインされている場合であって、両方の人工キメラ遺伝子にコードされる人工キメラタンパク質に含まれるＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域について、ＨＬＡクラスＩが相異なる遺伝子型のＨＬＡである場合は、これらは好ましくは相異なるＨＬＡ−Ａであり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２、及びＨＬＡ−Ａ３１からなる群から選ばれる２つのＨＬＡ−Ａである。より好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、及びＨＬＡ−Ａ３１０１からなる群から選ばれる２つのＨＬＡ−Ａであり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ２４０２とＨＬＡ−Ａ０３０１である。

本発明におけるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物は、人工キメラ遺伝子に加えて、他の遺伝子変異を含んでいてもよい。他の遺伝子変異としては、例えばＩｌ２ｒｇ、Ｐｒｋｄｃ、Ｆｏｘｎ１、Ｒａｇ１などの免疫関連遺伝子や、Ｒａｓ、Ｓｒｃ、Ｍｙｃなどの癌遺伝子や、ｐ５３、Ａｐｃなどの癌抑制遺伝子の変異が例示できる。

非ヒト動物がマウスの場合、本発明におけるＨＬＡクラスＩ発現非ヒト動物はＨＬＡクラスＩ発現マウスである。該マウスの好ましい遺伝子型は、Ｂ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}である。より好ましくは、Ｂ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}である。よりさらに好ましくは、Ｂ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}である。

よりさらに好ましくは、Ｂ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}である。より好ましくは、Ｂ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}である。よりさらに好ましくは、Ｂ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄ／Ｂ２Ｍ）}である。

特に好ましくは、Ｂ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}である。より好ましくは、Ｂ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}である。よりさらに好ましくは、Ｂ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０３０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}、またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ−Ａ３１０１／Ｈ−２Ｄｂ／Ｂ２Ｍ）}である。

本発明に係るＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物は、例えば、以下のようにして作製することができるが、ここにあげた方法に限定されない。当業者は、遺伝子組換え等の遺伝子工学的手法を、本分野において通常用いられる技術を適宜改変して用いることができる。

本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物は、「β２ミクログロブリン遺伝子」として、宿主となる非ヒト動物に由来しない外来性のβ２ミクログロブリン遺伝子を利用する場合（以下、「方法Ｉ」と記載する）には、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子座にノックインすることによって作製できる。

より具体的には、
（１）β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を含むターゲティングベクターを作製し、
（２）該非ヒト動物の多能性幹細胞に該ターゲティングベクターを作用させ、該多能性幹細胞のβ２ミクログロブリン遺伝子座に該人工キメラ遺伝子を導入する
工程を含む方法で作製することができる。

本明細書において「多能性幹細胞」とは複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞をいい、例えばＥＳ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ）細胞、ＧＳ（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ）細胞、ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ）細胞等が例示できる。

また、本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物は、「β２ミクログロブリン遺伝子」として、宿主である非ヒト動物に由来する内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子を利用する場合（以下、「方法ＩＩ」と記載する）には、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質をコードする導入遺伝子を、該非ヒト動物の当該内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子（終止コドンを除く）の３’末端にノックインすることによって作製できる。

より具体的には、
（１’）ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質をコードする導入遺伝子を含むターゲティングベクターを作製し、
（２’）該非ヒト動物の多能性幹細胞に該ターゲティングベクターを作用させ、該多能性幹細胞のβ２ミクログロブリン遺伝子（終止コドンを除く）の３’末端に該導入遺伝子を導入し、内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子と共に上記人工キメラ遺伝子を形成する、
工程を含む方法で作製することができる。

多能性幹細胞に人工キメラ遺伝子または導入遺伝子を導入する方法としては、例えば当業者に公知の方法を用いることができ、例えば相同組換えを利用した導入方法を用いることができる。具体的には、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ （１９９２，Ｓｅｄｉｖｙ Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．）に記載の方法や、ＺＦＮ（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム等を利用した人工ヌクレアーゼを利用する方法等を用いることができる。

Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ （１９９２，Ｓｅｄｉｖｙ Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．）に記載の方法を用いる場合は、例えば以下のようにして本発明にかかる非ヒト動物を作製することができる。なお本発明にかかる非ヒト動物作製方法は以下に限定されるものではない。

方法Ｉにおいて、人工キメラ遺伝子を作製するために、ヒトβ２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域のそれぞれをコードする遺伝子断片をクローニングする。遺伝子断片としてはＤＮＡ断片であることができる。クローニングの方法としては、目的の遺伝子断片を得られれば特に限定されないが、例えばＰＣＲ法を用いることができる。鋳型としては、例えば、目的遺伝子を保有するいかなる細胞およびＤＮＡライブラリーを用いても良いが、例えば、ヒト細胞から調製したトータルＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いることができる。ヒト細胞株としては例えば、ヒト腫瘍細胞株（例えば、ＳＷ６２０やＨｅｐＧ２）を用いることができる。また、実施例で述べるように、これらの遺伝子配列を人工的に全合成することも可能である。

以上のようにして得られた３種類のＤＮＡ断片を用いて、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を作製する。

該人工キメラ遺伝子を作製する方法は、最終的にβ２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子が構築されれば特に限定されないが、該β２ミクログロブリンをコードする遺伝子断片、該ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域をコードする遺伝子断片、又は該非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする遺伝子断片のそれぞれの５’末端又は３’末端に、必要に応じて制限酵素認識配列を設けることができる。

例えば、５’末端に制限酵素（例えばＮｃｏＩ）認識配列および３’末端に制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）認識配列を付加したヒトβ２ミクログロブリンをコードする配列を含む遺伝子断片と、５’末端に制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）認識配列および３’末端に制限酵素（例えばＳｗａＩ）認識配列を付加した非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする配列を含む遺伝子断片を、それぞれの制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）認識配列で連結させ、制限酵素認識（例えばＮｃｏＩ）部位および制限酵素（例えばＳｗａＩ）認識配列を保有するように改変したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等の適当なベクターにクローニングする。得られたベクターを制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）で消化し、５’末端に制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）認識配列および３’末端に制限酵素（例えばＢｇｌＩＩ）認識配列を付加したＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域をコードする配列を含む遺伝子断片を挿入する。その際、ヒトβ２ミクログロブリンをコードする配列を含む遺伝子断片の制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）認識配列とＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域をコードする配列を含む遺伝子断片の制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）認識配列が連結し、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする配列を含む遺伝子断片の制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）認識配列とＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域をコードする配列を含む遺伝子断片の制限酵素（例えばＢｇｌＩＩ）認識配列が連結されたクローンを選択することによって、目的物を得ることができる。

つぎに、非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の第一メチオニンの上流および下流を含むゲノム断片をクローニングする。該ゲノム断片は、人工キメラ遺伝子を導入する非ヒト動物のゲノム断片であることができる。該非ヒト動物はマウスであることができる。クローニングの方法としては、目的のゲノム断片を得られれば特に限定されないが、例えばＰＣＲ法を用いることができる。鋳型としては、目的配列を保有するいかなる細胞およびＤＮＡライブラリーを用いても良いが、例えば、目的配列を含むＢＡＣクローンや、細胞から調製したゲノムＤＮＡやゲノムＤＮＡライブラリーを用いることができる。ＢＡＣクローンや、細胞から調製したゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーは、マウスのそれらであることができる。

該ゲノム断片は、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞内における相同組換えを起こすのに十分な長さがあれば特に限定されないが、好ましくは、相同組換えの結果、機能的なマウスβ２ミクログロブリン遺伝子が破壊され、かつマウスβ２ミクログロブリン遺伝子プロモーター／エンハンサーによって、人工キメラ遺伝子の発現が制御されるように設計された配列であることが好ましい。

以上のようにして得られたマウスＤＮＡ断片と、上記の人工キメラ遺伝子、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを連結してターゲッティングベクター（以下、「ターゲッティングベクターＩ」と記載する）を構築する。ポジティブ選択マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など、またネガティブ選択マーカーとしては、例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子などを用いることができる。

各断片の連結のために、適宜連結に適したペプチドリンカーをコードする塩基配列、及び／又は、制限酵素認識配列を設けることができる。

方法ＩＩにおいて、導入遺伝子を作製するために、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域のそれぞれをコードする遺伝子断片を上記方法Ｉと同様にクローニングする。

得られたＤＮＡ断片を用いて、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質をコードする導入遺伝子を作製する。導入遺伝子の作製は上記方法Ｉにおける人工キメラ遺伝子の作製方法に準じて行うことができる。

つぎに、非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子のβ２ミクログロブリン遺伝子の３’末端（終止コドンを除く）および下流を含むゲノム断片を、上記方法Ｉに準じてクローニングする。

該ゲノム断片は、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞内における相同組換えを起こすのに十分な長さがあれば特に限定されないが、好ましくは、相同組換えの結果、マウスの内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子（終止コドンを除く）の３’末端に、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域をコードする遺伝子がこの順で連結して人工キメラ遺伝子を形成し、かつマウスβ２ミクログロブリン遺伝子プロモーター／エンハンサーによって、人工キメラ遺伝子の発現が制御されるように設計された配列であることが好ましい。

以上のようにして得られたマウスＤＮＡ断片と、上記の導入遺伝子、上記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを連結してターゲッティングベクター（以下、「ターゲッティングベクターＩＩ」と記載する）を構築する。

次に、構築した人工キメラ遺伝子を含むターゲッティングベクターＩ又は構築した導入遺伝子を含むターゲッティングベクターＩＩを、非ヒト動物の細胞に導入する。非ヒト動物の細胞は、非ヒト動物の多能性幹細胞であることができる。非ヒト動物の多能性幹細胞としては、例えば、マウスのＥＳ細胞であることができる。マウスのＥＳ細胞としては、例えば、１２９系統のマウス、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス等を例示でき、好ましくは１２９系統のマウス由来のＥＳ細胞である。

ターゲッティングベクターＩ又はＩＩを非ヒト動物に導入する方法としては、細胞への遺伝子導入が可能な方法であれば種々の方法を用いることができるが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈法、リポフェクション法などを用いることができる。また、目的遺伝子座にノックインされるようにデザインされたＺＦＮ（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）やＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）等の人工ヌクレアーゼ技術と組み合わせることにより、高効率でノックインを起こさせることも可能である。

上記ターゲッティングベクターを導入したＥＳ細胞などの多能性幹細胞を、所定の抗生物質に耐性を有するフィーダー細胞上に播種し、所定の抗生物質の存在下で培養を行う。選択培養６−８日目に生存する耐性コロニーをピックアップして一部を継代培養し、残りの細胞を用いてＰＣＲ法により相同組換えの有無を確認する。得られたＰＣＲ陽性クローンについて、サザンハイブリダイゼーション法によりランダムインテグレーションの有無を確認し、ランダムインテグレーションが検出されないクローンを以下の工程に用いる。

用いたＥＳ細胞と異なる被毛色を示す系統の妊娠マウスから胚盤胞期の胚を取り出し、マイクロマニピュレーション法を用いて、上記の相同組換え体ＥＳ細胞１０個程度を割腔内にインジェクションする。アグリゲーション（凝集）法を用いて、８細胞期の胚にＥＳ細胞を移植しても良い。上記の胚を偽妊娠させた雌マウス子宮内に移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。

得られた雄キメラマウスを、用いたＥＳ細胞と異なる被毛色を示す系統の雌マウスと交配させ、ＥＳ細胞由来の被毛色の産仔が誕生することにより、ＥＳ細胞が生殖系列に移入したことを確認することができる。さらに、ＰＣＲ法を用いて産仔の遺伝子型を解析することにより、β２ミクログロブリン遺伝子座における人工キメラ遺伝子ノックイン・ヘテロ接合体マウス（すなわち、人工キメラ遺伝子が、マウスの一対のβ２ミクログロブリン遺伝子の一方の遺伝子座の転写調節領域の制御下にノックインされているマウス）を取得することができる。

また、得られたヘテロ接合体マウス同士を交配することにより、人工キメラ遺伝子ノックイン・ホモ接合体マウス（すなわち、人工キメラ遺伝子が、マウスの一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座の両方の遺伝子座の転写調節領域の制御下にノックインされているマウス）を得ることができる。

また、異なるＨＬＡクラスＩ遺伝子を含む人工キメラ遺伝子がそれぞれノックインされた２系統のノックインマウス同士を交配することにより、一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座に、異なるＨＬＡクラスＩ遺伝子を含む人工キメラ遺伝子がそれぞれ１コピーずつ挿入されたような、ヘテロ接合体ヒト化マウスを作製することができる。

作出されたノックインマウスにおいて人工キメラ遺伝子が細胞表面に発現しているか否かは、例えばノックインマウスから血球細胞や脾細胞を回収し、当該血球細胞や脾細胞を、フローサイトメトリー法を用いて解析することにより確認することができる。ヘテロ接合体マウスにおいては、野生型のβ２ミクログロブリン遺伝子座が保持されているため、マウスＨ−２クラスＩも発現しているが、ホモ接合体マウスにおいては、マウスＨ−２クラスＩの発現が消失し、導入した人工キメラ遺伝子のみが発現したＭＨＣクラスＩヒト化マウスであることを確認することができる。

本発明の非ヒト動物がヒトモデルとして利用できるか否かは、例えば、本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物に、導入した人工キメラ遺伝子に含まれるＨＬＡクラスＩ拘束性の抗原を作用させ、抗原特異的なＣＴＬが誘導されることを確認するなど、当業者に公知のあらゆる方法を用いて調べることが可能であるが、以下に、非ヒト動物がマウスの場合の代表的な確認方法の一例を記載する。

例えば、導入したＨＬＡクラスＩ拘束性の既知の抗原ペプチドを、常法により不完全フロイントアジュバンドと混合しエマルジョンを作製する。当該エマルジョンを本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックインマウスの尾根部周辺の皮下に投与する。免疫部位として、背の皮下や腹腔内に投与することも可能である。最終投与から１週間後にマウス鼠径部よりリンパ節を摘出し、常法によりリンパ節細胞を調製する。脾細胞など他の組織から調製した細胞を使用することも可能である。

調製した細胞を、抗原ペプチド、サイトカイン（インターロイキン２，１５，２１等）存在下で１週間程度培養し、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡの原理を応用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、Ｔ細胞からのインターロイキン２やインターフェロンγなどのサイトカイン放出を解析することによって、ＣＴＬ誘導を調べることができる。また、このとき、非免疫ノックインマウスから調製した脾細胞をＸ線照射して、抗原提示細胞としてリンパ節細胞と共培養したものを用いることも可能である。例えば、抗原刺激により誘導されたＣＴＬが産生する種々のサイトカインの量が、ネガティブコントロールを投与した場合と比較して有意に増加していることを確認することによって、本発明の非ヒト動物がヒトモデルとして利用できることを確認することができる。

また、この場合、本発明にかかる非ヒト動物と同じＨＬＡクラスＩを発現する標的細胞をさらに加えて、標的細胞に対する傷害活性を評価することで、本発明の非ヒト動物がヒトモデルとして利用できることを確認することもできる。標的細胞としては、例えば、本発明にかかる非ヒト動物から単離された細胞や、作製に使用した人工キメラ遺伝子を導入した細胞や、天然に該ＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現する細胞を使用することができる。この場合、例えば、^5１Ｃｒリリースアッセイ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：３１７（１９９４））などを用いることができる。すなわち、前記標的細胞を^５１Ｃｒラベルし、対象となる抗原をパルスして、本発明にかかる非ヒト動物由来の試料（例えば脾細胞）を添加し、標的細胞がＣＴＬにより傷害を受けて遊離された^５１Ｃｒの量を測定する。このようなアッセイによって抗原特異的なＣＴＬの誘導が認められれば、本発明にかかる非ヒト動物は、ヒトモデルとして利用できることを確認することができる。

本発明はまた、本発明のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物から得られる単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、または確立された細胞株を提供する。好ましい組織または臓器としては、胸線、脾臓、骨髄、造血組織、又はリンパ組織である。好ましい細胞としては、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は造血幹細胞である。

本発明はまた、β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現する細胞も提供する。当該細胞にて発現される人工キメラ遺伝子において、β２ミクログロブリン遺伝子は宿主となる非ヒト動物細胞に由来しない外来性のβ２ミクログロブリン遺伝子であってもよいし、非ヒト動物細胞に由来する内在性のβ２ミクログロブリン遺伝子を利用してもよい。該細胞は、上記ターゲッティングベクターＩ又はＩＩを、非ヒト動物細胞に、上記手法に準じて導入することにより作製することができる。好ましくは非ヒト動物の細胞は非ヒト動物の多能性幹細胞であり、さらに好ましくは非ヒト動物のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。あるいは、当該細胞はＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物から単離又は誘導された細胞であっても良い。

以下に、本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、その派生物（例えば細胞、臓器等）、本発明にかかる人工キメラ遺伝子を発現する細胞、それからの派生物（例えば人工キメラ遺伝子を発現する細胞がｉＰＳ細胞である場合に該ｉＰＳ細胞から作製した臓器等）の使用方法を例示するが、ここにあげた方法に限定されない。

本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、その派生物（例えば細胞、臓器等）、本発明にかかる人工キメラ遺伝子を発現する細胞、またはそれからの派生物（例えば人工キメラ遺伝子を発現する細胞がｉＰＳ細胞である場合に該ｉＰＳ細胞から作製した臓器等）を使用して、被験物質特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原の存否の評価、疾患（例えば癌）の治療又は予防剤のスクリーニング、被験物質によって誘発されるＣＴＬ反応のＨＬＡ拘束特異性の比較、被験物質によって誘発されたＣＴＬ反応の有効性の評価、被験物質の安全性（例えば被験物質が自己免疫疾患を誘発する危険性の有無）の評価等を行うことができる。

具体的には、例えば、本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物に被験物質を投与して、当該被験物質に対するＣＴＬ誘導能を測定／評価することによって、ＣＴＬ誘導剤のスクリーニング、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原の存否の評価、及び／又は、疾患の治療又は予防剤のスクリーニングを行うことができる。「被験物質」としては例えば、公知の腫瘍抗原タンパク質やその部分ペプチド、ウイルス本体、ウイルス由来の抗原タンパク質やその部分ペプチド、細菌由来の抗原タンパク質及びその抗原ペプチド、または、活性未知のタンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド等が挙げられる。ＣＴＬ誘導能の測定／評価は、上記ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物の評価方法（例えば、^５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：３１７（１９９４））など）を用いて行うことができる。当該被験物質に対するＣＴＬの誘導が確認された場合には、当該被験物質にはＨＬＡクラスＩ拘束性抗原が含まれること、また当該被験物質がＣＴＬ誘導剤として機能し得ることが明らかとなる。このようにして得られたＣＴＬ誘導剤は、腫瘍やウイルス又は細菌による感染症の治療剤及び／又は予防剤として利用することができる。また、本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物に被験物質を投与して、当該被験物質に対するＣＴＬ誘導能を測定／評価することによって、被験物質によって誘発されるＣＴＬ反応の有効性や安全性（例えば自己免疫反応を生じる可能性）を評価することができる。

さらに、本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物は、人工キメラ遺伝子のコピー数及び導入部位が制御されていることから、該人工キメラ遺伝子の発現量を異なるＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現する異なる系統間でも同程度とすることができる。これにより、複数の異なる系統のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物に被験物質を同様に投与して、各非ヒト動物における当該被験物質に対するＣＴＬ誘導能を測定し比較評価することにより、被験物質によって誘発されるＣＴＬ反応の特異性や有効性を評価することができる。

本発明はまた、ペプチドワクチンで免疫した本発明にかかるＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物から調製したＣＴＬ細胞を、ヒト癌細胞株を異種移植した免疫不全非ヒト動物に移植することによって、該ペプチドワクチンの抗腫瘍効果を評価することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明はこれらの実施例によりなんら制限されるものではない。

実施例１： ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子部分配列のクローニング
まず、人工キメラ遺伝子を作製するために、ＨＬＡ−Ａ２４０２の配列情報（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ４７２０６．１）を基に、ヒト腫瘍細胞株ＳＷ６２０のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてα１及びα２領域を含む遺伝子断片をクローニングした。その際、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子およびマウスＨ−２のα３領域との結合を可能とするために、Ｎ末端側にＢａｍＨＩ認識配列を含む１０のアミノ酸ペプチドをコードする配列、Ｃ末端側のイントロン３配列内にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した。具体的には下記に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、当該改変を施した８６７ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

Ｂａｍ−１０ＡＡ−Ａ２４−Ｆ１：５’−GGATCCGGCGGAGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCGGCTCTGGATCTCCCACTCCATGAGGTATTTCTCC−３’（配列番号１８）
Ｂｇｌ−Ａ２４−Ｒ１：５’−AGATCTACAGGCGATCAGGTAGGCGCCCC−３’（配列番号１９）

実施例２： ヒトβ２ミクログロブリンｃＤＮＡのクローニング
次に、ヒトβ２ミクログロブリンのｃＤＮＡ配列情報（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４０４８．２）を基に、ヒト腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２から調製したトータルＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてヒトβ２ミクログロブリンｃＤＮＡをクローニングした。その際、ＨＬＡα１／α２領域との結合を可能とするために、Ｃ末端側にＢａｍＨＩ認識配列を含む５のアミノ酸ペプチドをコードする配列を付加した。また、人工キメラ遺伝子が、マウスβ２ミクログロブリンの第一メチオニンに相当する部位にノックインされるとともに、正常なプロセッシングを受けて細胞膜上に発現することが可能となるように、Ｎ末端側にＮｃｏＩ認識配列を含むＨＬＡ−Ａ２４のリーダー配列を付加した。具体的には下記に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、当該改変を施した３８６ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

Ｎｃｏ−Ａ２４Ｌ−ｈＢ２ｍ−Ｆ１：
５’−CCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGT−３’（配列番号２０）
Ｂａｍ−５ＡＡ−ｈＢ２ｍ−Ｒ１：５’−GGATCCGCCACCTCCACTGTCTCGATCCCACTTAACTATC−３’（配列番号２１）

実施例３： マウスＨ−２Ｄ^ｂ遺伝子部分配列のクローニング
さらに、マウスＨ−２Ｄ^ｂの配列情報（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ３７６８１．１）を基に、Ｃ５７ＢＬ６／ＮマウスのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて、細胞内ドメイン領域も含むα３以降の領域（エクソン４〜８、およびイントロン３〜７）をクローニングした。その際、ＨＬＡα１／α２領域との結合を可能とするとともに、以降のベクター構築が容易となるように、Ｎ末端側のイントロン３にＢａｍＨＩ認識配列を、Ｃ末端側に例えばＳｗａＩ認識配列を付加した。具体的には下記に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、当該改変を施した２４９４ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

Ｂａｍ−Ｈ２Ｄｂ−Ｆ１：５’−GGATCCTGTGTGACATACCTGTACCTTGTC−３’（配列番号２２）
Ｓｗａ−Ｈ２Ｄｂ−Ｒ１：５’−ATTTAAATCTAGTTGAGTCTCTGATCTTTAGCCCTAGG−３’（配列番号２３）

実施例４： 人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ２４０２）の構築
以上のようにして得られたヒトβ２ミクログロブリンｃＤＮＡ断片、ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノム断片及びマウスＨ−２Ｄ^ｂゲノム断片を連結して、全長３７３５ｂｐとなる所望の人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ２４０２）を構築した。（図１）

実施例５： ターゲッティングベクターの作製
次に、前記で作製された人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ２４０２）を、図２に示すようにマウスβ２ミクログロブリン遺伝子にノックインするためのターゲッティングベクターを作製した。

まず、マウスβ２ミクログロブリンのｃＤＮＡ配列情報（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００９７３５．３）を基に、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子を含むゲノム領域（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００００６８．７）から、ＥＳ細胞内での相同組換えに必要なゲノム配列をクローニングした。具体的にはＣ５７ＢＬ６／ＮマウスのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてマウスβ２ミクログロブリン遺伝子の第一メチオニンの上流約１．２Ｋｂをクローニングした。その際、人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ２４０２）との結合を可能とするとともに、以降のベクター構築が容易となるように、５’端側にＳａｌＩ認識配列を、３’末端側にＮｃｏＩ認識配列を付加した。具体的には下記に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、当該改変を施した、１１９８ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

Ｂ２ｍ−ＳＨＡ−Ｆ１：５’−GTCGACCTGGGTAGACACTGTAGGATTGGGTCTCTG−３’（配列番号２４）
Ｂ２ｍ−ＳＨＡ−Ｒ１：５’−CCATGGTGACGACTGAAGCGACCGCGACTG−３’（配列番号２５）
次に、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含むＢＡＣクローン（ＲＰ２３−３４Ｅ２４）より、イントロン２のＮｈｅＩ認識配列からイントロン４のＳａｃＩＩ認識配列までの、全長８４６２ｂｐのゲノム断片をクローニングした。

以上のようにして得られたマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のゲノム断片および人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ２４０２）を、ＰＧＫ−ＤＴ−ＡカセットおよびＰＧＫ−ｎｅｏ−ｂｐＡカセットとともにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋にクローニングすることにより、全長約１９．２Ｋｂからなる所望のターゲッティングベクターを作製した。（図３）

実施例６： ＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入
次に、実施例５で作製されたターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した。

ＥＳ細胞は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入したＣＭＴＩ−１細胞（Ｐａｓｓａｇｅ １１）を使用した。以下の実施例で記載する細胞の培養は、２０％ＦＢＳ（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および１０^３ ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＬＩＦ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ修正イーグル培地）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で行った。

実施例５で作製したターゲッティングベクター５０μｇをＮｏｔＩで切断した後、０．２ｍＬのＥＳ細胞用エレクトロポレーション・バッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に溶解し、０．３ｍＬのエレクトロポレーション・バッファーに懸濁した２ｘ１０^７個のＣＭＴＩ−１細胞とともに、エレクトロポレーション用キュベット（バイオラッド社）中で混合した。その後、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（バイオラッド社）を使用して、２５０Ｖ、５００μＦの条件で電気パルスを与え、予めネオマイシン耐性フィーダー細胞（ＤＳファーマ社）を播種した１０ｃｍディッシュ５枚に０．１ｍＬずつ加えた。１２−１８時間後に力価２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライテスク）を添加して１週間培養した。

実施例７： 相同組換えを起こしたＥＳ細胞の選択と確認
実施例６において、Ｇ４１８添加後１週間培養して生じてきたＥＳ細胞のコロニー３８４個を採取した。各コロニーを二分し、一方は培養を継続し、他方はＰＢＳで洗浄した後にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理を行い、下記に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、相同組換えを起こしたクローン３個を選択した。

ＨＨＤ−ＨＲＥＳ−Ｆ１：５’−AGCATTTCCTAGTACAGTTCAACACAGTGTTTAGT−３’（配列番号２６）
ＨＨＤ−ＨＲＥＳ−Ｒ１：５’−GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT−３’（配列番号２７）
ＰＣＲの実験条件は、９４℃３０秒、６０℃１分、７２℃２分を１サイクルとして３５サイクル行い、ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動により、正しく相同組換えを行った際に予想されるＰＣＲ産物（約１．４Ｋｂ）が検出されたクローンを陽性と判断した。

相同組換えをより正確に確認するために、前項で陽性と認められたＥＳ細胞クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、以下のようにサザンブロッティング法による解析を行った。

ゲノムＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、１０ｘＳＳＣ溶液でキャピラリー法によりナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ファルマシア社）に転写した。実施例５でクローニングした１１９８ｂｐのＤＮＡ断片から、さらに５’−側上流の約０．５ＫｂのＤＮＡ断片を調製した。［α−^３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（パーキンエルマー社）で標識した上記ＤＮＡ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、正しく相同組換えを行った約２．１Ｋｂのバンドと、野生型由来の２．５Ｋｂのバンドが１：１で検出された。（図４）

実施例８： 人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ２４０２）がノックインされた遺伝子改変動物の作製
相同組換えを起こしていることが確認されたＥＳ細胞をトリプシン処理によりバラバラに分散した。マウスＣ５７ＢＬ／６系統の雄を掛け合わせた同系統の雌より胚盤胞を取り出し、マイクロインジェクション装置（ナリシゲ社）を用いて、胚盤胞１個あたり約１０個の上記ＥＳ細胞を割腔内に注入した。これを、偽妊娠処理した雌マウスの子宮に移し、胎児の発生を継続させることによりキメラマウスを得た。

このキメラマウスの雄をＣ５７ＢＬ／６系統の雌と交配し、生まれてきた仔マウスのうち野生型色（ａｇｏｕｔｉ）のものを選び、その尾の一部を切断した試料からゲノムＤＮＡを抽出し、下記に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行った。

ＨＨＤ−Ｆ１：５’−CTAGAAGCAAGGTCAGAAATCCTCT−３’（配列番号２８）
ＨＨＤ−ＷＴ−Ｒ３：５’−CCGTCAGCACACTCGCAAACAGGCG−３’（配列番号２９）
ＨＨＤ−ＨＲＥＳ−Ｒ１：５’−GAGTAGCAGGACGAGGGTTCGGGGCGCCAT−３’（配列番号３０）
ＰＣＲの実験条件は、９４℃３０秒、６０℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクル行い、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により解析した。野生型遺伝子座由来の８０４ｂｐのＰＣＲ産物に加えて、正しく相同組換えを行った際に予想される５１０ｂｐのＰＣＲ産物を検出することにより、ノックイン・ヘテロ接合体マウスを確認した。

ノックイン・ヘテロ接合体マウス同士を交配し、生まれてきた仔マウスの尾の一部を切断した試料からゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法を用いて遺伝子型を解析した。野生型遺伝子座由来の８０４ｂｐのＰＣＲ産物が検出されず、正しく相同組換えを行った際に予想される５１０ｂｐのＰＣＲ産物のみ検出されることで、ノックイン・ホモ接合体マウスを確認した。

ＰＣＲ法により、ホモ接合体、ヘテロ接合体および野生型と判定されたマウス各３匹の尾の一部から調製したゲノムＤＮＡを、実施例７に記載のサザンハイブリダイゼーション法で解析したところ、ホモ接合体では約２．１Ｋｂのバンドのみが、ヘテロ接合体では約２．１ＫＢおよび約２．５Ｋｂの２本のバンドが、野生型マウスでは約２．５Ｋｂのバンドのみが、それぞれ確認された。（図５）
ホモ接合体、ヘテロ接合体および野生型マウス各３匹を安楽死させ、肝臓からＩｓｏｇｅｎ（和光純薬工業）およびＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡ調製し、ＤＮａｓｅＩ処理した後に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。マウスβ２ミクログロブリンおよびｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡを検出するＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と２ｘＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えた後に、ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲ法により解析したところ、ホモ接合体ではマウスβ２ミクログロブリンｍＲＮＡの発現がほぼ完全に消失し、ヘテロ接合体では野生型マウスの発現量の半分程度に減少していることが確認された。（図６）

実施例９：人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ０３０１）がノックインされた遺伝子改変動物の作製
ヒトＨＬＡ−Ａ０３０１の配列情報（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＪ７４８７４３．１）を基に、α１及びα２領域を含む遺伝子断片の全合成を行った。具体的には、Ｎ末端側にＢａｍＨＩ認識配列を含む１０のアミノ酸ペプチドをコードする配列、およびＣ末端側のイントロン３配列内にＢｇｌＩＩ認識配列を付加し、下記に記載の８６７ｂｐのＤＮＡ断片を合成した。

５’−
ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCAGTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttcattttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCATCCAGATAATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATGAGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGATGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct−３’（配列番号３１）（大文字はエクソン領域を、小文字はイントロン領域をそれぞれ示す）
以降、実施例２〜８に記載の方法によって、ＨＨＤ−Ａ０３０１のノックイン・ヘテロ接合体マウスおよびノックイン・ホモ接合体マウスを作製した。

実施例１０：人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ０２０１）がノックインされた遺伝子改変動物の作製
ヒトＨＬＡ−Ａ０２０１の配列情報（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＹ３６５４２６．１）を基に、α１及びα２領域を含む遺伝子断片の全合成を行った。具体的には、Ｎ末端側にＢａｍＨＩ認識配列を含む１０のアミノ酸ペプチドをコードする配列、およびＣ末端側のイントロン３配列内にＢｇｌＩＩ認識配列を付加し、下記に記載の８６７ｂｐのＤＮＡ断片を合成した。

５’−
ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttcattttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct−３’（配列番号４３）（大文字はエクソン領域を、小文字はイントロン領域をそれぞれ示す）
以降、実施例２〜８に記載の方法によって、ＨＨＤ−Ａ０２０１のノックイン・ヘテロ接合体マウスおよびノックイン・ホモ接合体マウスを作製した。

実施例１１：人工キメラ遺伝子（ＨＨＤ−Ａ３１０１）がノックインされた遺伝子改変動物の作製
ヒトＨＬＡ−Ａ３１０１の配列情報（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｍ８４３７５．１）を基に、α１及びα２領域を含む遺伝子断片の全合成を行った。具体的には、Ｎ末端側にＢａｍＨＩ認識配列を含む１０のアミノ酸ペプチドをコードする配列、およびＣ末端側のイントロン３配列内にＢｇｌＩＩ認識配列を付加し、下記に記載の８６７ｂｐのＤＮＡ断片を合成した。

５’−
ggatccggcggaggcggctcgggtggcggcggctctgGATCTCACTCCATGAGGTATTTCACCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGAGGCCTGAGTATTGGGACCAGGAGACACGGAATGTGAAGGCCCACTCACAGATTGACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGgtgagtgaccccggccggtggcgcaggtcaggacccctcatcccccacggacgggccaggtcgcccacagtctccgggtccgagatccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgcctttacccggtttcattttcagtttaggccaaaaatccccccgggttggtcggggctgggcggggctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccagGTTCTCACACCATCCAGATGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCAGCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCTTGAACGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGgtaccaggggccacggggcgcctccctgatcgcctgtagatct−３’（配列番号４４）（大文字はエクソン領域を、小文字はイントロン領域をそれぞれ示す）
以降、実施例２〜８に記載の方法によって、ＨＨＤ−Ａ３１０１のノックイン・ヘテロ接合体マウスおよびノックイン・ホモ接合体マウスを作製した。

実施例１２： ＨＨＤ−Ａ２４０２およびＨＨＤ−Ａ０３０１がノックインされた遺伝子改変動物の作製
ＨＨＤ−Ａ２４０２ノックイン・ホモ接合体マウスとＨＨＤ−Ａ０３０１ノックイン・ホモ接合体マウスを交配し、ＨＨＤ−Ａ２４０２およびＨＨＤ−Ａ０３０１遺伝子を１コピーずつ保有するダブルノックインマウスを作製した。

実施例１３： ノックインマウスにおけるヒトおよびマウスＭＨＣクラスＩの発現確認
ＨＨＤ−Ａ２４０２、ＨＨＤ−Ａ０３０１それぞれのノックイン・ホモ接合体マウス、ノックイン・ヘテロ接合体マウス、同腹対照の野生型マウス、およびＨＨＤ−Ａ２４０２／ＨＨＤ−Ａ０３０１ダブルノックインマウスを安楽死させ、摘出した脾臓から回収した脾細胞または血球細胞表面におけるヒトＭＨＣクラスＩの発現をフローサイトメトリー法により解析した。具体的には、１ｘ１０^６個の脾細胞または血球細胞をモノクローナルなＰＥ標識抗ＨＬＡ抗体１７Ａ１０（ＭＢＬ社）、または一次抗体としてビオチン化抗体４ｉ１５３（Ａｂｃａｍ社）および二次抗体としてＰＥ標識抗ビオチン抗体Ｂｉｏ３−１８Ｅ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で染色した。

その結果、ＨＨＤ−Ａ２４０２ノックイン・ホモ接合体マウスおよびＨＨＤ−Ａ２４０２ノックイン・ヘテロ接合体マウスにおいてＨＬＡ−Ａ２４の発現が、ＨＨＤ−Ａ０３０１ノックイン・ホモ接合体マウスおよびＨＨＤ−Ａ０３０１ノックイン・ヘテロ接合体マウスにおいてＨＬＡ−Ａ３の発現が、それぞれ確認された。また、ＨＨＤ−Ａ２４０２／ＨＨＤ−Ａ０３０１ダブルノックインマウスにおいては、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ３両方の発現が認められた。（図７−１、図７−２）
さらに、ＰＥ標識抗Ｈ−２Ｋ^ｂ抗体ＡＦ６−８８．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて脾細胞表面における内在性のマウスＭＨＣクラスＩの発現を解析したところ、野生型および、ＨＨＤ−Ａ２４０２ノックイン・ヘテロ接合体マウスおよびＨＨＤ−Ａ０３０１ノックイン・ヘテロ接合体マウスにおいてはＨ−２Ｋ^ｂの発現が認められたが、ＨＨＤ−Ａ２４０２ノックイン・ホモ接合体マウス、ＨＨＤ−Ａ０３０１ノックイン・ホモ接合体マウス、およびＨＨＤ−Ａ２４０２／ＨＨＤ−Ａ０３０１ダブルノックインマウスにおいては、Ｈ−２Ｋ^ｂの発現がほぼ完全に消失していることが確認された。（図８−１、図８−２）
同様に、モノクローナルなＰＥ標識抗ＨＬＡ-Ａ２抗体ＢＢ７．２（ＭＢＬ社）、及びモノクローナルなＦＩＴＣ標識抗ヒトβ２ミクログロブリン抗体ＴＵ９９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、ＨＨＤ−Ａ０２０１ノックイン・ホモ接合体マウス、ヘテロ接合体マウス、および同腹対照の野生型マウスの血球細胞表面におけるＨＬＡ−Ａ２及びヒトβ２ミクログロブリンの発現、ならびにモノクローナルなＦＩＴＣ標識抗ヒトβ２ミクログロブリン抗体ＴＵ９９を用いて、ＨＨＤ−Ａ３１０１ノックイン・ホモ接合体マウス、ヘテロ接合体マウス、および同腹対照の野生型マウスの血球細胞表面におけるヒトβ２ミクログロブリンの発現を、それぞれ確認した。

その結果、ＨＨＤ−Ａ０２０１ノックイン・ホモ接合体マウス、およびＨＨＤ−Ａ０２０１ノックイン・ヘテロ接合体マウスにおいてＨＬＡ−Ａ２及びヒトβ２ミクログロブリンの発現が認められ（図９−１）、またＨＨＤ−Ａ３１０１ノックイン・ホモ接合体マウス、およびＨＨＤ−Ａ３１０１ノックイン・ヘテロ接合体マウスにおいてヒトβ２ミクログロブリンの発現が認められた（図９−２）。

さらに、ＰＥ標識抗Ｈ−２Ｋ^ｂ／Ｈ−２Ｄ^ｂ抗体２８−８−６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いて血球細胞表面における内在性のマウスＭＨＣクラスＩの発現を解析したところ、野生型および、ＨＨＤ−Ａ０２０１ノックイン・ヘテロ接合体マウス及びＨＨＤ−Ａ３１０１ノックイン・ヘテロ接合体マウスにおいてＨ−２Ｋ^ｂおよび／またはＨ−２Ｄ^ｂの発現が認められたが、ＨＨＤ−Ａ０２０１ノックイン・ホモ接合体マウスおよびＨＨＤ−Ａ３１０１ノックイン・ホモ接合体マウスにおいては、Ｈ−２Ｋ^ｂおよびＨ−２Ｄ^ｂの発現がほぼ完全に消失していることが確認された。（図１０−１、図１０−２）

実施例１４： Ａ２４ノックインマウスにおけるＣＴＬ誘導能の確認
下記記載のウイルス由来抗原ペプチド又はネガティブコントロールペプチドを大塚蒸留水（大塚製薬工場）にて２ｍｇ／ｍＬに調製し、Ｂ Ｂｒａｕｎ Ｉｎｊｅｋｔシリンジに充填した。

Ａ２４Ｖ６： EYLVSFGVW （Ａ２４拘束性ＨＢＶ由来抗原）（配列番号３２）
Ａ２４Ｖ８： SFHSLHLLF （Ａ２４拘束性ＨＴＬＶ由来抗原）（配列番号３３）
Ａ２４Ｖ９： DYCNVLNKEF （Ａ２４拘束性ＥＢＶ由来抗原）（配列番号３４）
Ａ２４Ｖ１０： RYLRDQQLL （Ａ２４拘束性ＨＩＶ由来抗原）（配列番号３５）
別のシリンジに等量のＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）を充填後、両シリンジをＧＰシリンジコネクタで接続し、ウイルス由来抗原ペプチド溶液とＩＦＡをよく混合させることでエマルジョンを調製した。Ａ２４ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスおよび同腹野生型マウスの尾根部の皮下に、上記エマルジョンを１００μＬ／ｍｏｕｓｅずつ週１回、計２回投与した。最終投与１週間後、マウスより鼠径部リンパ節を回収した。リンパ節細胞懸濁液をＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ−１６４０，１０％ ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，５０μＭ ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）にて５×１０^６細胞／ｍＬに調製し、標的ＣＴＬエピトープペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１５（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ＩＬ−２１（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ加え１ｍＬ／ｗｅｌｌで２４ウェルプレートへ播種後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で８日間培養した。８日後、細胞を回収しＭｕｒｉｎｅ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｋｉｔ（ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ）添付のａｎｔｉ ＩＦＮ−γ抗体固相化プレートに１×１０^５細胞／ｗｅｌｌで播種した。続けて、同系マウス脾臓より調製し３０ＧｙのＸ線を照射した脾臓細胞を同一ウェルへ抗原提示細胞として１×１０^５細胞／ｗｅｌｌ播種後、標的ＣＴＬエピトープペプチド、またはネガティブコントロールペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩インキュベートした。翌日、キットの添付文書に従いＩＦＮ−γ産生細胞スポットを発色させた。ＩＦＮ−γ産生細胞スポット数はＥＬＩＳＰＯＴアナライザー（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓ６，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）にて定量した。その結果、図１１に示すように、Ａ２４ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスいずれにおいても、上記ウイルス由来抗原ペプチド添加ウェルのＩＦＮ−γ産生細胞スポット数が、ネガティブコントロールペプチド添加ウェルのそれに比し有意に高く（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．００１）、エピトープ特異的ＣＴＬの誘導が確認された。

実施例１５： Ａ３ノックインマウスにおけるＣＴＬ誘導能の確認
下記記載のウイルス由来抗原ペプチドを大塚蒸留水（大塚製薬工場）にて２ｍｇ／ｍＬに調製し、Ｂ Ｂｒａｕｎ Ｉｎｊｅｋｔシリンジに充填した。

Ａ３Ｖ３： RLRPGGKKK （Ａ３拘束性ＨＩＶ由来抗原）（配列番号３６）
Ａ３Ｖ４： QVPLRPMTYK （Ａ３拘束性ＨＩＶ由来抗原）（配列番号３７）
Ａ３Ｖ７： RLRAEAQVK （Ａ３拘束性ＥＢＶ由来抗原）（配列番号３８）
Ａ３Ｖ１０： SIIPGPLK （Ａ３拘束性インフルエンザウイルス由来抗原）（配列番号３９）
別のシリンジに等量のＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）を充填後、両シリンジをＧＰシリンジコネクタで接続し、ウイルス由来抗原ペプチド溶液とＩＦＡをよく混合させることでエマルジョンを調製した。Ａ３ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスおよび同腹野生型マウスの尾根部の皮下に、上記エマルジョンを１００μＬ／ｍｏｕｓｅずつ週１回、計２回投与し、以降、実施例１４に記載の方法によって、ウイルス由来抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を評価した。その結果、図１２に示すように、Ａ３ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスいずれにおいても、上記ウイルス由来抗原ペプチド添加ウェルのＩＦＮ−γ産生細胞スポット数が、ネガティブコントロールペプチド添加ウェルのそれに比し有意に高く（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０１またはｐ＜０．００１）、エピトープ特異的ＣＴＬの誘導が確認された。

実施例１６： Ａ２４／Ａ３ダブルノックインマウスにおけるＣＴＬ誘導能の確認
同様に、ウイルス由来抗原ペプチド（Ａ３Ｖ７およびＡ２４Ｖ８）をＡ２４／Ａ３ダブルノックインマウスおよび野生型マウスに投与し、実施例１４に記載の方法によって、ウイルス由来抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を評価した。その結果、図１３に示すように、Ａ２４／Ａ３ダブルノックインマウスにおいて、上記ウイルス由来抗原ペプチド添加ウェルのＩＦＮ−γ産生細胞スポット数が、ネガティブコントロールペプチド添加ウェルのそれに比し有意に高く（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．００１）、エピトープ特異的ＣＴＬの誘導が確認された。

実施例１７： Ａ２ノックインマウスにおけるＣＴＬ誘導能の確認
下記記載のウイルス由来抗原ペプチドを大塚蒸留水（大塚製薬工場）にて１ｍｇ／ｍＬに調製し、Ｂ Ｂｒａｕｎ Ｉｎｊｅｋｔシリンジに充填した。

A2V1：CLGGLLTMV（配列番号４５）
A2V2：GLCTLVAML（配列番号４６）
A2V3：NLVPMVATV（配列番号４７）
A2V4：VLAELVKQI（配列番号４８）
A2V7：VLSDFKTWL（配列番号４９）
A2V8：FLPSDFFPSV（配列番号５０）
A2V9：FLLTRILTI（配列番号５１）
A2V10：GLSPTVWLS（配列番号５２）
別のシリンジに等量のＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）を充填後、両シリンジをＧＰシリンジコネクタで接続し、ウイルス由来抗原ペプチド溶液とＩＦＡをよく混合させることでエマルジョンを調製した。Ａ２ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスおよび同腹野生型マウスの尾根部の皮下に、上記エマルジョンを１００μＬ／ｍｏｕｓｅずつ週１回、計２回投与し、以降、実施例１４に記載の方法によって、ウイルス由来抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を評価した。その結果、図１４に示すように、Ａ２ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスいずれにおいても、上記ウイルス由来抗原ペプチド添加ウェルのＩＦＮ−γ産生細胞スポット数が、ネガティブコントロールペプチド添加ウェルのそれに比し有意に高く（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．００１）、エピトープ特異的ＣＴＬの誘導が確認された。

実施例１８： Ａ３１ノックインマウスにおけるＣＴＬ誘導能の確認
下記記載のウイルス由来抗原ペプチドを大塚蒸留水（大塚製薬工場）にて１ｍｇ／ｍＬに調製し、Ｂ Ｂｒａｕｎ Ｉｎｊｅｋｔシリンジに充填した。

A31V3：ASCMGLIYNR（配列番号５３）
A31V5：SVQPTFSVQR（配列番号５４）
A31V6：KFLPDLYDYK（配列番号５５）
A31V8：SFSFGGFTFK（配列番号５６）
A31V10：RVIDPRRCMK（配列番号５７）
別のシリンジに等量のＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）を充填後、両シリンジをＧＰシリンジコネクタで接続し、ウイルス由来抗原ペプチド溶液とＩＦＡをよく混合させることでエマルジョンを調製した。Ａ３１ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスおよび同腹野生型マウスの尾根部の皮下に、上記エマルジョンを１００μＬ／ｍｏｕｓｅずつ週１回、計２回投与し、以降、実施例１４に記載の方法によって、ウイルス由来抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を評価した。その結果、図１５に示すように、Ａ３１ホモノックインマウス、ヘテロノックインマウスいずれにおいても、上記ウイルス由来抗原ペプチド添加ウェルのＩＦＮ−γ産生細胞スポット数が、ネガティブコントロールペプチド添加ウェルのそれに比し有意に高く（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０１またはｐ＜０．００１）、エピトープ特異的ＣＴＬの誘導が確認された。

実施例１９： ノックインマウスにおけるＣＤ４⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団の解析
ＨＨＤ−Ａ２４０２、ＨＨＤ−Ａ０３０１、ＨＨＤ−Ａ０２０１、ＨＨＤ−Ａ３１０１それぞれのノックイン・ホモ接合体マウス、ノックイン・ヘテロ接合体マウス、同腹対照の野生型マウス、およびＨＨＤ−Ａ２４０２／ＨＨＤ−Ａ０３０１ダブルノックインマウスを安楽死させ、血球細胞表面におけるＣＤ４およびＣＤ８の発現をフローサイトメトリー法により解析した。具体的には、１ｘ１０^６個の血球細胞をモノクローナルなＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ４抗体ＧＫ１．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、およびＦＩＴＣまたはＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体５３−６．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色した。

その結果、ＨＨＤ−Ａ２４０２、ＨＨＤ−Ａ０３０１、ＨＨＤ−Ａ０２０１、ＨＨＤ−Ａ３１０１それぞれのノックイン・ヘテロ接合体マウスでは、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合は野生型マウスと同程度であったが、ＨＨＤ−Ａ２４０２、ＨＨＤ−Ａ０３０１、ＨＨＤ−Ａ０２０１、ＨＨＤ−Ａ３１０１それぞれのノックイン・ホモ接合体マウスおよびＨＨＤ−Ａ２４０２／ＨＨＤ−Ａ０３０１ダブルノックインマウスでは、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合は、野生型マウスと比較して顕著に減少していることが確認された。（図１６−１、図１６−２）
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (33)

1. β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
2. 人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座のうちの一方の遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、請求項１に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
3. ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域がＨＬＡ−Ａに由来する、請求項１又は２に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
4. ＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３１である、請求項３に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
5. ＨＬＡ−Ａが、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ３１０１である、請求項３に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
6. β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む第１の人工キメラタンパク質をコードする第１の人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座のうちの第１の遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現しており；
   β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む第２の人工キメラタンパク質をコードする第２の人工キメラ遺伝子が、該非ヒト動物の一対のβ２ミクログロブリン遺伝子座のうち該第１の遺伝子座とは異なる方の第２の遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現している、
   請求項１に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
7. 第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、同一遺伝子型のＨＬＡに由来する、請求項６に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
8. 第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、相異なる遺伝子型のＨＬＡに由来する、請求項６に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
9. 第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域及び第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域がＨＬＡ−Ａに由来する、請求項６〜８のいずれか１項に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
10. 第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、同一又は異なって、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３１に由来する、請求項９に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
11. 第１の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域と、第２の人工キメラタンパク質のＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域とが、同一又は異なって、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ３１０１に由来する、請求項９に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
12. 非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＨ−２クラスＩに由来する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
13. 非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＨ−２Ｄ^ｂに由来する、請求項１２に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
14. β２ミクログロブリンがヒトβ２ミクログロブリンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
15. 非ヒト動物がマウスである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
16. Ｂ２ｍ^{＋／（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}またはＢ２ｍ^{（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）／（ＨＬＡ／Ｈ−２／Ｂ２Ｍ）}で表される遺伝子型を有する、請求項１５に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物。
17. β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子座の転写調節領域の制御下に導入する工程を含む、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物の作製方法。
18. （１）β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を含むターゲティングベクターを作製し、
    （２）該非ヒト動物の多能性幹細胞に該ターゲティングベクターを作用させ、該多能性幹細胞のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下に導入する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 多能性幹細胞がＥＳ細胞、ＧＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、請求項１８に記載の方法。
20. 相同組換えによって人工キメラ遺伝子を多能性幹細胞のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下に導入する、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. β２ミクログロブリンがヒトβ２ミクログロブリンである、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. β２ミクログロブリン、ＨＬＡクラスＩのα１及びα２領域、ならびに、非ヒト動物ＭＨＣクラスＩのα３領域がＮ末側よりこの順で連結したタンパク質を含む人工キメラタンパク質をコードする人工キメラ遺伝子を、該非ヒト動物のβ２ミクログロブリン遺伝子の転写調節領域の制御下にて発現する、細胞。
23. ＥＳ細胞、ＧＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、請求項２２に記載の細胞。
24. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物から得られる単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、又は確立された細胞株。
25. 次の（１）及び（２）の工程を含む、被験物質特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法。
    （１）請求項１〜１６のいずれか１項に記載されたＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、請求項２２もしくは２３に記載の細胞、または、請求項２４に記載の単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、もしくは確立された細胞株に被験物質を作用させる工程、
    （２）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを評価する工程。
26. 次の（１）及び（２）の工程を含む、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原の存否を評価する方法。
    （１）請求項１〜１６のいずれか１項に記載されたＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、請求項２２もしくは２３に記載の細胞、または、請求項２４に記載の単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、もしくは確立された細胞株に被験物質を作用させる工程、
    （２）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを評価する工程。
27. 次の（１）及び（２）の工程を含む、疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
    （１）請求項１〜１６のいずれか１項に記載されたＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物、請求項２２もしくは２３に記載の細胞、または、請求項２４に記載の単離された組織、単離された臓器、単離された細胞、初代細胞培養物、もしくは確立された細胞株に被験物質を作用させる工程、
    （２）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを評価する工程。
28. 疾患が、癌又は感染症である、請求項２７に記載の方法。
29. 次の（１）〜（２）の工程を含む、被験物質によって誘発されるＣＴＬ反応のＨＬＡ拘束特異性を比較する方法。
    （１）被験物質を、請求項１〜１６のいずれか１項に記載される、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物であって、それぞれ異なるＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現している複数の異なる系統の該非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物において誘発されたＣＴＬ反応をそれぞれ測定する工程、
    （２）該非ヒト動物よりそれぞれ測定されたＣＴＬ反応を比較し、ＣＴＬ反応を誘発する被験物質のＨＬＡ拘束性を判定する工程。
30. 次の（１）〜（２）の工程を含む、被験物質によって誘発されたＣＴＬ反応の有効性を評価する方法。
    （１）被験物質を、請求項１〜１６のいずれか１項に記載される、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物であって、それぞれ異なるＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現している複数の異なる系統の該非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物において誘発されたＣＴＬ反応をそれぞれ測定する工程、
    （２）該非ヒト動物よりそれぞれ測定されたＣＴＬ反応を比較し、ＣＴＬ反応を誘発する被験物質のＨＬＡ拘束性を判定する工程。
31. 次の（１）及び（２）の工程を含む、被験物質の安全性評価方法。
    （１）請求項１〜１６のいずれか１項に記載されたＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックイン非ヒト動物に被験物質を作用させる工程、
    （２）該非ヒト動物に起こる好ましくない応答を分析する工程。
32. 好ましくない応答が自己免疫反応である、請求項３１に記載の方法。
33. 被験物質が、一もしくは複数のペプチド、一もしくは複数のポリペプチド、一もしくは複数のオリゴヌクレオチド、一もしくは複数のポリヌクレオチド、又は一もしくは複数のタンパク質である、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の方法。

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