TW202135854A - 術後輔助療法劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種表現出顯著優異之抑制腫瘤轉移、復發之效果，且副作用少之腫瘤之術後輔助療法劑。 本發明所提供之術後輔助療法劑含有CTL表位4連接肽作為有效成分。

Description

術後輔助療法劑
本發明係關於一種使用CTL表位4連接肽之腫瘤之術後輔助療法劑，該CTL表位4連接肽係由在HLA-A(人類白血球抗原A)限制性方面具有CTL(Cytotoxic T lymphocyte，胞毒型T淋巴球)誘導能力之4個肽連接而成。
癌於日本人死亡原因中排名第1位，每年約有35萬人死亡，目前仍是嚴重之疾病。已確立之癌治療法主要有手術療法、抗癌劑治療、輻射療法及癌免疫療法。於發展程度(stage)較低之早期癌之情形時，藉由清除所有癌細胞之根治性手術療法，可期待較高之治療成效。另一方面，報告有對發展程度較高之癌之根治性手術有限，發生局部復發或遠端轉移之頻度絕不低。考慮了各種引起局部復發或遠端轉移之原因，但認為主要原因在於：手術中殘留肉眼不可見之小癌細胞；或癌細胞之一部分已經發生血行轉移或淋巴轉移，微細之腫瘤開始於其他器官中生長。
尤其於由遠端轉移導致之復發之情形時，認為癌細胞分佈於全身，藉由手術清除所有癌細胞非常困難。因此，作為已發生遠端轉移之癌之治療法，確立有各種化學療法、輻射療法以及近年來之癌免疫療法。該等治療法被賦予以分子等級、細胞等級殺傷癌細胞之作用機理，故理論上可治療分佈於全身之所有癌細胞。然而，遺憾的是，雖然有該療法，但最終所有治療法都變得無效而致死之案例占多數，成為癌治療較大之問題。因此，復發、轉移癌之新穎治療法之開發對於壓製癌至關重要。
從另一角度看，認為若預防極有可能造成嚴重結果之遠端轉移，則可提高根治性手術之成功概率，大幅改善癌患者之結果。將此種以根除手術療法中無法目視到之癌細胞或微小之轉移癌細胞，從而預防癌之復發或轉移為目的所實施之治療稱為術後輔助療法。
例如，在日本，替加氟、吉莫斯特、奧替拉西鉀之調配劑被確立為作為接受根除性手術之II期(Stage II)(其中T1除外)、IIIA期或IIIB期之胃癌之術後輔助療法之治療法，已知替加氟、吉莫斯特、奧替拉西鉀之調配劑投予組與手術單獨組相比，死亡風險降低32%(非專利文獻1)。此外，對肺癌、乳腺癌、大腸癌、子宮癌、惡性黑色素瘤等癌亦分別實施術後輔助療法。然而，如上述例所述，進行術後輔助療法亦無法預防復發或遠端轉移之案例較多，故尋求用於改善治療成效之新穎之術後輔助療法藥。
近年來，作為術後輔助療法，除進行化學療法之術後輔助化學療法以外，亦推進進行癌免疫療法作為術後輔助療法之臨床試驗。癌免疫療法具有如下作用機理：藉由誘導、移植或活化可直接殺傷癌細胞之免疫細胞，例如胞毒型T淋巴球(CTL)或自然殺手(NK)細胞等等而將癌細胞根除。因此，癌免疫療法與化學療法相同，可對無法目視到之微細之腫瘤或癌細胞，表現出全身抗腫瘤效果。
作為癌免疫療法之一之癌肽疫苗療法係長時間作為癌之新治療法被期待之治療法。癌肽疫苗療法係藉由表位特異性胞毒型T淋巴球(CTL)之細胞受體(TCR)識別癌細胞表面呈現抗原肽之主要組織相容基因複合體(MHC，Major histocompatibility complex)，且CTL殺傷癌細胞，而發揮效果。
人類之MHC被稱為人類白血球抗原(HLA)，已知HLA之類型表現出非常多型性。因此，可實施以特定之HLA型為對象之癌肽疫苗之開發。然而，存在如下問題：成為癌疫苗之對象之HLA型受限，癌肽疫苗對於具有對象外之HLA型之患者無效。進而，於治療開始前需要進行HLA型檢查成為使治療之開始時間延遲，使患者負擔增大之一個原因。據以上，期望開發並研究出無需進行HLA型檢查，且可適合所有癌患者之癌肽疫苗。
為了解決該問題，報告有由對HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26或HLA-A3超型之任一者或複數個HLA型表現出CTL誘導能力之各種CTL表位肽連接而成之CTL表位4連接肽(專利文獻1)。
然而，關於CTL表位4連接肽是否作為術後輔助療法發揮效果，此前並未揭示。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2015/060235號公報 非專利文獻
非專利文獻1：N Engl J Med., 357:1810-20(2007)
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於提供一種表現出顯著優異之抑制腫瘤轉移、復發之效果，且副作用少之腫瘤之術後輔助療法劑。 [解決問題之技術手段]
因此，本發明者向腫瘤之轉移、復發之動物模型投予CTL表位4連接肽，並對腫瘤之轉移、復發之抑制效果進行研究，結果發現，不會引發嚴重之副作用，且顯著抑制肺轉移結節數。
即，本發明提供以下發明[1]至[11]。 [1]一種腫瘤之術後輔助療法劑，其特徵在於：含有包含經由連接子而連接之4個CTL表位肽之CTL表位4連接肽作為有效成分， 該CTL表位4連接肽係 序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、與 選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽 經由連接子分別連接而成，且可進而具有親水性胺基酸所構成之肽序列，並且具有選自以下(1)～(3)之任一特徵： (1)C末端為PEP2(其中，於N末端自N末端側經由連接子相鄰地依序包含PEP7及PEP8者除外)； (2)C末端為PEP4； (3)C末端為PEP10。 [2]如[1]記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中上述CTL表位4連接肽中包含之表位肽為 PEP5、 PEP6、 PEP9、及 選自由PEP2、PEP4及PEP10所組成之群中之1個表位肽所構成，且 上述CTL表位4連接肽之C末端為PEP2、PEP4或PEP10。 [3]如[1]或[2]記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽包含選自以下之序列： ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4； ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或 ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10； 再者，式中「(L)」表示連接子。 [4]如[1]至[3]中任一項記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽包含以下序列： ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4 再者，式中「(L)」表示連接子。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中連接子為胺基酸連接子。 [6]如[5]記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中胺基酸連接子為連接有2個精胺酸之精胺酸二聚物或連接有3個精胺酸之精胺酸三聚物。 [7] 如[1]至[6]中任一項記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中親水性胺基酸所構成之肽序列係連接於N末端，且為連接有3個精胺酸之精胺酸三聚物或連接有4個精胺酸之精胺酸四聚物所構成。 [8]如[1]至[7]中任一項記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽為序列編號24、序列編號25或序列編號26。 [9]如[1]至[8]中任一項記載之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽為序列編號24。 [10]一種腫瘤之轉移抑制劑，其特徵在於：含有包含經由連接子而連接之4個CTL表位肽之CTL表位4連接肽作為有效成分， 該CTL表位4連接肽係 序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、與 選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽 經由連接子分別連接而成，且可進而具有親水性胺基酸所構成之肽序列，並且具有選自以下(1)～(3)之任一特徵： (1)C末端為PEP2(其中，於N末端自N末端側經由連接子相鄰地依序包含PEP7及PEP8者除外)； (2)C末端為PEP4； (3)C末端為PEP10。 [11]一種腫瘤之復發抑制劑，其特徵在於：含有包含經由連接子而連接之4個CTL表位肽之CTL表位4連接肽作為有效成分， 該CTL表位4連接肽係 序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、與 選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽 經由連接子分別連接而成，且可進而具有親水性胺基酸所構成之肽序列，並且具有選自以下(1)～(3)中之任一特徵： (1)C末端為PEP2(其中，於N末端自N末端側經由連接子相鄰地依序包含PEP7及PEP8者除外)； (2)C末端為PEP4； (3)C末端為PEP10。
本發明亦關於以下態樣。 ・一種如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽，其用於腫瘤之術後輔助療法。 ・一種序列編號24所表示之CTL表位4連接肽，其用於腫瘤之術後輔助療法。 ・一種如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽，其用於腫瘤之轉移抑制。 ・一種序列編號24所表示之CTL表位4連接肽，其用於腫瘤之轉移抑制。 ・一種如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽，其用於腫瘤之復發抑制。 ・一種序列編號24所表示之CTL表位4連接肽，其用於腫瘤之復發抑制。 ・一種用於腫瘤之術後輔助療法之醫藥組合物，其包含如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽。 ・一種用於腫瘤之術後輔助療法之醫藥組合物，其包含序列編號24所表示之CTL表位4連接肽。 ・一種用於腫瘤之轉移抑制之醫藥組合物，其包含如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽。 ・一種用於腫瘤之轉移抑制之醫藥組合物，其包含序列編號24所表示之CTL表位4連接肽。 ・一種用於腫瘤之復發抑制之醫藥組合物，其用包含如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽。 ・一種用於腫瘤之復發抑制之醫藥組合物，其包含序列編號24所表示之CTL表位4連接肽。 ・一種腫瘤之術後輔助療法，其包括將有效治療腫瘤之復發及/或轉移之量的如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽投予至患者之步驟。 ・一種腫瘤之轉移抑制方法，其包括將有效治療腫瘤之轉移之量的如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽投予至患者之步驟。 ・一種腫瘤之復發抑制方法，其包括將有效治療腫瘤之復發之量的如上述[1]至[11]中規定之CTL表位4連接肽投予至患者之步驟。 本說明書包含成為本案之優先權之基礎之日本專利申請號2019-236947號之揭示內容。 [發明之效果]
根據本發明之腫瘤之術後輔助療法，可進行抑制副作用之發生，並且發揮腫瘤之轉移、復發抑制效果之癌治療。進而，使癌患者生存較長時間。
本發明係關於一種含有CTL表位4連接肽作為有效成分之腫瘤之術後輔助療法劑。又，本發明係關於一種含有CTL表位4連接肽作為有效成分之腫瘤之轉移抑制劑。又，本發明係關於一種含有CTL表位4連接肽作為有效成分之腫瘤之復發抑制劑。
於本發明中，CTL表位4連接肽意為經由連接子使選自來自相同及/或不同之腫瘤抗原分子之CTL表位肽之4個肽以直鏈狀連接而成為1分子之肽。
作為來自腫瘤抗原分子之CTL表位肽，已知有如以下者。 KLVERLGAA(序列編號1，於本說明書中記載為「PEP1」，例如國際公開第2001/011044號)； ASLDSDPWV(序列編號2，於本說明書中記載為「PEP2」，例如國際公開第2002/010369號)； ALVEFEDVL(序列編號3，於本說明書中記載為「PEP3」，例如國際公開第2002/010369號)； LLQAEAPRL(序列編號4，於本說明書中記載為「PEP4」，例如國際公開第2000/12701號)； DYSARWNEI(序列編號5，於本說明書中記載為「PEP5」，例如日本專利特開平11-318455號)； VYDYNCHVDL(序列編號6，於本說明書中記載為「PEP6」，例如國際公開第2000/12701號)； LYAWEPSFL(序列編號7，於本說明書中記載為「PEP7」，例如日本專利特開2003-000270號)； DYLRSVLEDF(序列編號8，於本說明書中記載為「PEP8」，例如國際公開第2001/011044號)； QIRPIFSNR(序列編號9，於本說明書中記載為「PEP9」，例如國際公開第2008/007711號)； ILEQSGEWWK(序列編號10，於本說明書中記載為「PEP10」，例如國際公開第2009/022652號)； VIQNLERGYR(序列編號11，於本說明書中記載為「PEP11」，例如國際公開第2009/022652號)； KLKHYGPGWV(序列編號12，於本說明書中記載為「PEP12」，例如國際公開第1999/067288號)； RLQEWCSVI(序列編號13，於本說明書中記載為「PEP13」，例如國際公開第2002/010369號)； ILGELREKV(序列編號14，於本說明書中記載為「PEP14」，例如國際公開第2002/010369號； DYVREHKDNI(序列編號15，於本說明書中記載為「PEP15」，例如國際公開第2005/071075號)； HYTNASDGL(序列編號16，於本說明書中記載為「PEP16」，例如國際公開第2001/011044號)； NYSVRYRPGL(序列編號17，於本說明書中記載為「PEP17」，例如日本專利特開2003-000270號)； RYLTQETNKV(序列編號18，於本說明書中記載為「PEP18」，例如國際公開第2005/116056號)
下述表1中記載成為CTL表位肽PEP1～PEP18之來源之蛋白質之資訊。報告有該等蛋白質於腫瘤組織中高度表現。
[表1]
肽 來源 胺基酸序列 序列編號
PEP1 Lck-246 KLVERLGAA 序列編號1
PEP2 WHSC2-103 ASLDSDPWV 序列編號2
PEP3 HNRPL-140 ALVEFEDVL 序列編號3
PEP4 SART3-302 LLQAEAPRL 序列編號4
PEP5 SART2-93 DYSARWNEI 序列編號5
PEP6 SART3-109 VYDYNCHVDL 序列編號6
PEP7 MRP3-503 LYAWEPSFL 序列編號7
PEP8 Lck-488 DYLRSVLEDF 序列編號8
PEP9 SART3-734 QIRPIFSNR 序列編號9
PEP10 Lck-90 ILEQSGEWWK 序列編號10
PEP11 Lck-449 VIQNLERGYR 序列編號11
PEP12 CypB-129 KLKHYGPGWV 序列編號12
PEP13 UBE2V-43 RLQEWCSVI 序列編號13
PEP14 WHSC2-141 ILGELREKV 序列編號14
PEP15 EGFR-800 DYVREHKDNI 序列編號15
PEP16 Lck-208 HYTNASDGL 序列編號16
PEP17 MRP3-1293 NYSVRYRPGL 序列編號17
PEP18 PTHrP-102 RYLTQETNKV 序列編號18
本發明之CTL表位4連接肽係選自上述CTL表位肽中之特定之13種(序列編號1所表示之肽「PEP1」、序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」、序列編號5所表示之肽「PEP5」、序列編號6所表示之肽「PEP6」、序列編號7所表示之肽「PEP7」、序列編號8所表示之肽「PEP8」、序列編號9所表示之肽「PEP9」、序列編號10所表示之肽「PEP10」、序列編號13所表示之肽「PEP13」、序列編號15所表示之肽「PEP15」、序列編號17所表示之肽「PEP17」及序列編號18所表示之肽「PEP18」)之4種CTL表位肽經由連接子而以直鏈狀連接之肽，可誘導及/或活化各CTL表位肽中3個以上特異性之CTL。再者，雖然不直接評價CTL表位肽中特異性之誘導，但可藉由利用免疫蛋白酶體所進行之切斷實驗(國際公開第2015/060235號等)對該表位肽中是否存在特異性之CTL誘導進行判斷。
於本發明中，CTL表位4連接肽係 序列編號5所表示之肽「PEP5」、與 選自由序列編號1所表示之肽「PEP1」、序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」、序列編號6所表示之肽「PEP6」、序列編號7所表示之肽「PEP7」、序列編號8所表示之肽「PEP8」、序列編號9所表示之肽「PEP9」、序列編號10所表示之肽「PEP10」、序列編號13所表示之肽「PEP13」、序列編號15所表示之肽「PEP15」、序列編號17所表示之肽「PEP17」及序列編號18所表示之肽「PEP18」所組成之群中之3個肽 經由連接子分別連接而成之肽。
於本發明中，具有於PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17及PEP18之各胺基酸序列中取代、插入、缺失及/或添加一個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列，且具有與原來之肽同等或高於其之CTL誘導能力及/或免疫球蛋白產生誘導能力之肽亦可用作「CTL表位肽」。此處「複數個」指2～3個，較佳為2個。作為此種肽，例如可列舉被具有與原來之胺基酸類似之特性之胺基酸取代之(即，藉由保留式胺基酸取代而獲得之)肽。
是否為「具有與原來之肽同等或高於其之CTL誘導能力及/或免疫球蛋白產生誘導能力之肽」例如可依據國際公開第2015/060235號說明書中記載之方法進行評價。於使用上述方法進行評價之情形時，CTL誘導能力以來自預先投予了具有取代、插入、缺失及/或添加一個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列之試驗肽的小鼠之細胞、來自同系小鼠之添加了抗原呈現細胞及試驗肽之孔中之IFN-γ產生細胞之個數為指標，若獲得之Δ值之判定結果(陽性(10≦Δ＜100)、中陽性(100≦Δ＜200)、強陽性(200≦Δ))為同等或更高，則可判斷為具有與原來之肽同等或高於其之CTL誘導能力之肽。於該情形時，若原來之肽為「陽性」，且具有取代、插入、缺失及/或添加一個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列之肽亦為「陽性」，則判斷為同等。又，免疫球蛋白產生誘導能力若以投予了試驗肽之小鼠血清中之CTL表位特異性IgG抗體效價為指標，所獲得之IgG抗體效價之增加(fold)之測定結果(2＜fold＜10、10≦fold＜100、100≦fold)為同等或更高，則可判斷為具有同等或更高之免疫球蛋白產生誘導能力之肽。於該情形時，若原來之肽之測定結果為「2＜fold＜10」之範圍內，且具有取代、插入、缺失及/或添加一個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列之肽之測定結果亦為「2＜fold＜10」之範圍內，則可判斷為同等。
於本發明中，連接子只要於CTL表位4連接肽被投予至生物體時被切斷，可使連接之CTL表位肽各自分離即可，例如可列舉：酯鍵、醚鍵、醯胺鍵、糖鏈連接子、聚乙二醇連接子、胺基酸連接子等。作為用作胺基酸連接子之胺基酸序列，可例示：精胺酸二聚物(RR)、精胺酸三聚物(RRR)、精胺酸四聚物(RRRR)、離胺酸二聚物(KK)、離胺酸三聚物(KKK)、離胺酸四聚物(KKKK)、甘胺酸二聚物(GG)、甘胺酸三聚物(GGG)、甘胺酸四聚物(GGGG)、甘胺酸五聚物(GGGGG)、甘胺酸六聚物(GGGGGG)、丙胺酸-丙胺酸-酪胺酸(AAY)、異白胺酸-白胺酸-丙胺酸(ILA)、精胺酸-纈胺酸-離胺酸-精胺酸(RVKR)等，較佳為精胺酸二聚物(RR)或精胺酸三聚物(RRR)，更佳為精胺酸二聚物(RR)。表位連接肽中使用之連接子於該領域中周知，業者可適當選擇使用。
於本發明之CTL表位4連接肽中，選擇之CTL表位肽及其連接順序可以如下方式決定：將以特定之組合及特定之連接順序合成之CTL表位4連接肽投予至人類HLA-A表現基因轉殖小鼠，並對體內(in vivo)是否存在各CTL表位肽特異性之CTL誘導進行評價而決定。對體內是否存在各CTL表位肽特異性之CTL誘導進行評價之方法例如可依據國際公開第2015/060235號說明書中記載之方法進行評價。選擇之CTL表位肽及其連接順序可使用該方法，針對至少3種以上、較佳為4種CTL表位肽，決定各CTL表位肽中發現特異性之CTL之誘導之CTL表位肽及其連接順序。
本發明之CTL表位4連接肽較佳為具有選自以下(1)～(3)之任一特徵： (1)C末端為PEP2(其中，於N末端自N末端側經由連接子相鄰地依序包含PEP7及PEP8者除外)； (2)C末端為PEP4； (3)C末端為PEP10。
因此，較佳為本發明之CTL表位4連接肽係 序列編號5所表示之肽「PEP5」與 選自由序列編號1所表示之肽「PEP1」、序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」、序列編號6所表示之肽「PEP6」、序列編號7所表示之肽「PEP7」、序列編號8所表示之肽「PEP8」、序列編號9所表示之肽「PEP9」、序列編號10所表示之肽「PEP10」、序列編號13所表示之肽「PEP13」、序列編號15所表示之肽「PEP15」、序列編號17所表示之肽「PEP17」及序列編號18所表示之肽「PEP18」所組成之群中之3個肽 經由連接子分別連接而成，並且具有選自以下(1)～(3)之任一特徵之肽： (1)C末端為PEP2(其中，於N末端自N末端側經由連接子相鄰地依序包含PEP7及PEP8者除外)； (2)C末端為PEP4； (3)C末端為PEP10。
更佳為本發明之CTL表位4連接肽係序列編號5所表示之肽「PEP5」、序列編號6所表示之肽「PEP6」及序列編號9所表示之肽「PEP9」與 選自由序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」及序列編號10所表示之肽「PEP10」所組成之群中之1個肽 經由連接子分別連接而成，且C末端為PEP2、PEP4或PEP10。
更佳為本發明之CTL表位4連接肽為選自以下之序列所構成之肽： ・PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4； ・PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4； ・PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4； ・PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4； ・PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4； ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4； ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或 ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10。 再者，式中「(L)」表示連接子。
更佳為本發明之CTL表位4連接肽為選自以下之序列所構成之肽： ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4； ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或 ・PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10。 再者，式中「(L)」表示連接子。
更佳為本發明之CTL表位4連接肽之連接子為精胺酸二聚物，且為選自以下之序列所表示之肽： ・PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4(序列編號24，於本說明書中記載為TPV06)； ・PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP2(序列編號25，於本說明書中記載為TPV07)；或 ・PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP10(序列編號26，於本說明書中記載為TPV08)， 更佳為本發明之CTL表位4連接肽為序列編號24所表示之肽TPV06。
關於本發明之一種態樣，CTL表位4連接肽較佳為選自以下表2所示之序列編號19～28之序列所表示之肽。
[表2]
肽 胺基酸序列 序列編號
TPV01 PEP5-RR-PEP6-RR-PEP9-RR-PEP4 序列編號19
TPV02 PEP9-RR-PEP5-RR-PEP6-RR-PEP4 序列編號20
TPV03 PEP6-RR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP4 序列編號21
TPV04 PEP6-RR-PEP9-RR-PEP5-RR-PEP4 序列編號22
TPV05 PEP9-RR-PEP6-RR-PEP5-RR-PEP4 序列編號23
TPV06 PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 序列編號24
TPV07 PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-EP2 序列編號25
TPV08 PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP10 序列編號26
TPV09 RRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 序列編號27
TPV10 RRRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 序列編號28
更佳為CTL表位4連接肽為選自上述表2中所列舉者之以下肽： ・TPV01(序列編號19)； ・TPV02(序列編號20)； ・TPV03(序列編號21)； ・TPV04(序列編號22)； ・TPV05(序列編號23)；或 ・TPV06(序列編號24)。
又，於本發明中，CTL表位4連接肽可使用2種以上，例如可分別或混合使用2種、3種、4種或4種以上之CTL表位4連接肽，但較佳為將3種CTL表位4連接肽加以混合而使用。於使用2種以上CTL表位4連接肽之情形時，只要包含至少1種本發明之CTL表位4連接肽，則剩餘之1種以上可為本發明之CTL表位4連接肽，亦可為例如如國際公開第2015/060235號所記載之CTL表位4連接肽。較佳為使用序列編號24所表示之肽及1種以上之國際公開第2015/060235號中記載之CTL表位4連接肽，更佳為使用序列編號24所表示之肽及2種國際公開第2015/060235號中記載之CTL表位4連接肽，進而更佳為將序列編號24所表示之肽、序列編號29所表示之肽(TPV011：PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10)及序列編號30所表示之肽(TPV012：RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2)之3種加以混合而使用。
本發明之CTL表位4連接肽可進而具有親水性胺基酸所構成之肽序列。該肽序列可添加至CTL表位4連接肽之N末端及/或C末端，較佳為添加至N末端。該肽序列可選擇包含選自由精胺酸、組胺酸、離胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、天冬醯胺酸及麩醯胺酸所組成之群中之1～15個、較佳為2～10個、進而較佳為3～5個親水性胺基酸者。例如可使用精胺酸三聚物(RRR)或精胺酸四聚物(RRRR)作為該肽序列，作為添加有此種肽序列之CTL表位4連接肽，可例示：RRR-TPV06、RRRR-TPV06、TPV06-RRR、TPV06-RRRR、RRR-TPV07、RRRR-TPV07、TPV07-RRR、TPV07-RRRR、RRR-TPV08、RRRR-TPV08、TPV08-RRR、TPV08-RRRR、KKK-TPV06、KKKK-TPV06、TPV06-KKK、TPV06-KKKK、KKK-TPV07、KKKK-TPV07、TPV07-KKK、TPV07-KKKK、KKK-TPV08、KKKK-TPV08、TPV08-KKK、TPV08-KKKK、HHH-TPV06、HHHH-TPV06、TPV06-HHH、TPV06-HHHH、HHH-TPV07、HHHH-TPV07、TPV07-HHH、TPV07-HHHH、HHH-TPV08、HHHH-TPV08、TPV08-HHH、TPV08-HHHH、RRKK-TPV06、RKRK-TPV06、RHRH-TPV06、RRHH-TPV06、KKHH-TPV06、KHKH-TPV06等，較佳為RRR-TPV06、RRRR-TPV06、RRR-TPV07、RRRR-TPV07、RRR-TPV08、RRRR-TPV08、KKK-TPV06、KKKK-TPV06、KKK-TPV07、KKKK-TPV07、KKK-TPV08、KKKK-TPV08、HHH-TPV06、HHHH-TPV06、HHH-TPV07、HHHH-TPV07、HHH-TPV08、HHHH-TPV08、RRKK-TPV06、RKRK-TPV06、RHRH-TPV06、RRHH-TPV06、KKHH-TPV06、KHKH-TPV06，進而較佳為RRR-TPV06(TPV09)、RRRR-TPV06(TPV10)、RRR-TPV07、RRRR-TPV07、RRR-TPV08、RRRR-TPV08，最佳為RRR-TPV06(TPV09)、RRRR-TPV06(TPV10)。
已知添加有親水性胺基酸所構成之該肽序列之肽於水性溶劑中之溶解度提昇(Peptides：38，302-311(2012)，日本專利特開2006-188507)。藉由於本發明之CTL表位4連接肽上添加該肽序列，而可提昇CTL表位4連接肽於水性溶劑中之溶解度。
本發明之「可進而具有親水性胺基酸所構成之肽序列之CTL表位4連接肽」較佳為N末端可具有親水性胺基酸所構成之肽序列之CTL表位4連接肽，更佳為N末端可具有選自由精胺酸、組胺酸及離胺酸所組成之群中之3～5個親水性胺基酸所構成之肽序列之CTL表位4連接肽，更佳為N末端可具有精胺酸三聚物(RRR)或精胺酸四聚物(RRRR)之CTL表位4連接肽，更佳為不具有親水性胺基酸所構成之肽序列之CTL表位4連接肽。
再者，本發明之CTL表位4連接肽例如可依據國際公開第2015/060235號說明書中記載之方法進行合成。
於本發明中，「術後輔助療法」係指手術後治療或抑制腫瘤之復發及/或轉移之方法。本發明之術後輔助療法包括將本說明書中記載之CTL表位4連接肽投予至腫瘤摘除後之患者之步驟。 成為本發明之對象之患者並無限制，人類可獲得尤其有效之效果。
本發明中使用之CTL表位4連接肽用於人類時，推薦用量較佳為每1種CTL表位4連接肽3～9 mg/body/day之範圍。
再者，本發明中所謂「推薦用量」係指根據臨床試驗等而決定之於無嚴重之副作用而可安全地使用之範圍內獲得最大之治療效果之投予量。具體而言，可列舉由日本獨立行政法人醫藥品醫療機器綜合機構(PMDA，Pharmaceuticals and Medical Devices Agency)、美國食品藥品管理局(FDA，Food and Drug Administration)、歐州藥品管理局(EMA，European Medicines Agency)等公共組織或團體認可、推薦、勸告，且附件、概要(Interview Form)、治療準則等中記載之投予量，較佳為由PMDA、FDA或EMA之任一公共組織認可之投予量。
本發明之腫瘤之術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑之投予時程可根據腫瘤之種類或病期等適當選擇。 CTL表位4連接肽較佳為以1週投予1次之步驟重複3次(第1天、第8天、第15天，1日1次)共計21天為1週期之投予時程。又，於第3週期以後，較佳為以第1天投予且休藥20天(3週投予1次之方法)共計21天為1週期之投予時程。
本發明之CTL表位4連接肽之1日投予次數可根據癌種或病期等適當選擇。CTL表位4連接肽之1日投予次數較佳為1次。
關於本發明中成為對象之腫瘤，只要為於腫瘤之術後輔助療法中發揮抗腫瘤效果之範圍，則並無特別限制，較佳為CTL表位4連接肽於腫瘤之術後輔助療法中發揮抗腫瘤效果之腫瘤，更佳為Lck、WHSC2、SART2、SART3、MRP3、UBE2V、EGFR或PTHrP陽性之惡性腫瘤，更佳為SART2陽性之惡性腫瘤。
作為成為本發明之對象之癌，具體而言，可列舉：腦腫瘤、頭頸癌、消化系統癌(食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝癌、膽道癌(膽嚢、膽管癌等)、胰腺癌、小腸癌、大腸癌(結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌等)、胃腸道間質腫瘤等)、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌)、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌(子宮頸癌、子宮體癌等)、腎癌、尿路上皮癌(膀胱癌、腎盂癌、尿道癌)、前列腺癌、皮膚癌、未明原發癌等。再者，此處癌不僅包含原發病灶，亦包含轉移至其他器官(肝臟等)之癌。其中，就抗腫瘤效果之觀點而言，較佳為頭頸癌、消化系統癌、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、皮膚癌，更佳為消化系統癌、肺癌、尿路上皮癌、皮膚癌，尤佳為肺癌、尿路上皮癌。
作為本發明之腫瘤之術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑之投予形態，並無特別限制，可根據治療目的而適當選擇，具體而言，可例示：經口劑(錠劑、被覆錠劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑等)、注射劑、栓劑、貼附劑、軟膏劑等，較佳為注射劑。
本發明中之腫瘤之術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑可使用藥學上容許之載體，並藉由通常公知之方法而製備。作為此種載體，可例示通常之藥劑中通用之各種載體，例如：賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、溶解輔助劑、懸浮劑、等張劑、pH值調節劑、緩衝劑、穩定劑、著色劑、矯味劑、矯臭劑等。
作為本發明之術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑之有效成分的CTL表位4連接肽可僅特異性地將表現包含之表位之細胞作為目標。因此，與先前用作術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑之抗癌劑相比，可不產生嚴重之副作用，而減輕患者之負擔，並且有效地使用。
抗癌效果之確認大多使用動物模型進行，但一般以移植之腫瘤之生長或已移植腫瘤之動物之生存率為指標。對此，認為關於術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑之效果，與切除動物模型中暫時移植之腫瘤相比，確認對於轉移後之腫瘤之效果更佳。因此，本發明之腫瘤之術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑之效果可使用例如在與腫瘤之移植部位不同之部位產生腫瘤、即產生轉移之動物模型進行確認。
又，作為本發明之術後輔助療法劑、轉移抑制劑及復發抑制劑之有效成分的CTL表位4連接肽係於HLA-A限制性方面具有CTL誘導能力等，故用以確認效果之動物模型必須為表現HLA-A分子者。
作為此種模型，並無特別限制，例如可列舉HLA-A基因敲入之非免疫缺陷非人類動物。HLA-A基因敲入之非免疫缺陷非人類動物只要為具有人類HLA-A之α1及α2區域之非免疫缺陷非人類動物即可，例如可較佳地使用國際公開第2015/056774號及J. Immunol：198，516-527(2017)中揭示之人類HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai 小鼠)。 實施例
以下列舉實施例進一步詳細地說明本發明，但本發明並不受該等實施例任何限制，具有本領域內之通常知識者可於本發明之技術思想內進行多種變化。
[實施例1  肽之合成、精製] 使用自動肽合成機Prelude(Protein Technologies, Inc.)並藉由利用9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)法之固相肽合成法合成表位4連接肽TPV07及TPV08。即，於1-(1,3,5-三甲苯-2-磺醯基)-3-硝基-1,2,4-三唑/N-甲基咪唑/二氯甲烷之條件下，使Wang-ChemMatrix樹脂與α-胺基被Fmoc基保護且側鏈官能基被一般保護基保護之胺基酸進行縮合，完成C末端胺基酸向樹脂之擔載。向其中注入去保護劑(20% 哌啶/N,N-二甲基甲醯胺(DMF))而將Fmoc基去除之後，於1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HCTU)/N-甲基𠰌啉(NMM)/DMF條件下，使α-胺基被Fmoc基保護且側鏈官能基被一般保護基保護之胺基酸縮合，合成二肽。藉由反覆執行利用去保護劑所進行之Fmoc基之去保護及HCTU/NMM/DMF條件下之胺基酸之縮合操作，而合成具有目標序列之肽。保護肽樹脂之合成結束後，將去保護溶液(2.5%三異丙基矽烷、2.5%水、2.5%1,2-乙二硫醇、92.5%三氟乙酸)添加至保護肽樹脂中，進行4小時反應，藉此將肽側鏈保護基去除，並且自樹脂切下游離肽。藉由將樹脂過濾去除，並將獲得之過濾液添加至冷醚中，而以沈澱之形式回收肽。獲得之各種合成肽於Proteonavi管柱(SHISEIDO)中使用0.1%TFA(Trifluoroacetic acid，三氟乙酸)水溶液及乙腈作為溶劑系進行精製。最終精製肽藉由CAPCELL PAK UG120管柱(SHISEIDO)及HPLC系統(HITACHI)確認純度。又，藉由ESI-MS系統(Synapt HDMS、WATERS)確認分子量，於冷凍乾燥後冷溫暗處保存，並供於以下所示之實施例。
將藉由TPV07及TPV08之質譜(MS)分析所測得之分子量示於表3。進而，將TPV07及TPV08之HPLC之層析圖及MS示於圖1～圖4。
[表3]
肽 分子量 (Calculated) 分子量 (Deconvoluted)
TPV07 5396.03 5395.20
TPV08 5682.41 5682.00
TPV01～TPV06、TPV09～TPV12例如亦可依據國際公開第2015/060235號說明書中記載之方法進行合成，亦可依據與上述所示之TPV07及TPV08相同之方法進行合成。任一肽均獲得純度90%以上者。
[實施例2  B16F10.A24/SART293-101 細胞株肺轉移模型中之TPV06之效果] 將11週齡之B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai 小鼠(J. Immunol：198，516-527(2017))隨機分配，每組10隻。將實施分組之日設為Day0。
B16F10.A24/SART293-101 細胞株(PLoS One：13，e0199249(2018))使用包含10%FBS之Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Sigma-Aldrich公司)培養基進行培養。B16F10.A24/SART293-101 於37℃、5%CO2 保溫箱中，一週2次以1：25～1：40比率繼代。
於小鼠分組後之同一天(Day0)，將使用D-PBS(富士膠片和光純藥公司)製備之B16F10.A24/SART293-101 細胞懸濁液以每次1×106 細胞/0.1 mL移植至小鼠尾靜脈內。
確認本小鼠模型之移植至血液中之腫瘤細胞於肺中復發之情況。因此，藉由確認稱得上模仿人類之由癌轉移導致之復發機制之該模型中之效果，而可確認轉移、復發之抑制效果。
使表位4連接肽TPV06(序列編號24)溶解於蒸餾水(大塚製藥工廠)中而製備6 mg/ mL之肽溶液，並填充至B Braun Injekt注射器(B. Braun Aesculap公司)中。向另一注射器中填充等量之Montanide ISA 51 VG(SEPPIC公司)之後，利用連接器將兩注射器連接，並將肽溶液及Montanide ISA 51 VG充分混合，藉此，製備乳液。又，作為對照組，製備將蒸餾水及等量之Montanide ISA 51 VG加以混合而成之乳液。將該等投予至B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai 小鼠之尾根部周邊之皮下，每週1次每次100 μL，共計3次(Day1、8、15)。
B16F10.A24/SART293-101 細胞株移植後28天後(Day28)，摘除肺，以目視測定肺轉移結節數。
如圖5所示，TPV06投予組與對照組相比，(p＝0.0014，Student's t-test)中肺轉移結節數得以顯著抑制。
以上結果顯示，藉由投予TPV06，而可顯著抑制表現SART293-101 之腫瘤細胞之轉移、復發。因此，CTL表位4連接肽對治療腫瘤之轉移、復發有用。
一般而言，關於抗原特異性CTL，已知來自癌抗原之CTL表位肽經由細胞表面上之HLA分子而特異性地識別、活化經抗原呈現之細胞，並殺傷該細胞(Janeway's Immunobiology，7th edition)。因此，只要目標細胞表現出CTL表位4連接肽之目標癌抗原，則可表現出抗腫瘤效果。即，關於該CTL表位4連接肽之腫瘤之轉移、復發之抑制效果(治療效果)，只要該CTL表位4連接肽表現出成目標癌抗原，則發揮效果，故成為治療目標之腫瘤之種類無限制。 本說明書中引用之所有刊物、日本專利及日本專利申請藉由直接引用而併入至本說明書中。
圖1表示CTL表位4連接肽TPV07之HPLC之層析圖。 圖2表示CTL表位4連接肽TPV08之HPLC之層析圖。 圖3表示CTL表位4連接肽TPV07之質譜。 圖4表示CTL表位4連接肽TPV08之質譜。 圖5表示靜脈內移植B16F10.A24/SART293-101 細胞株之小鼠模型中之TPV06之肺轉移結節數之抑制效果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (9)

  1. 一種腫瘤之術後輔助療法劑，其特徵在於：含有包含經由連接子而連接之4個CTL表位肽之CTL表位4連接肽作為有效成分， 該CTL表位4連接肽係 序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、與 選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽 經由連接子分別連接而成，且可進而具有親水性胺基酸所構成之肽序列，並且具有選自以下(1)～(3)之任一特徵： (1)C末端為PEP2(其中，於N末端自N末端側經由連接子相鄰地依序包含PEP7及PEP8者除外)； (2)C末端為PEP4； (3)C末端為PEP10。
  2. 如請求項1之腫瘤之術後輔助療法劑，其中上述CTL表位4連接肽中包含之表位肽為 PEP5、 PEP6、 PEP9及 選自由PEP2、PEP4及PEP10所組成之群中之1個表位肽所構成， 且上述CTL表位4連接肽之C末端為PEP2、PEP4或PEP10。
  3. 如請求項1或2之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽包含選自以下之序列： PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4； PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或 PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10； 再者，式中「(L)」表示連接子。
  4. 如請求項1至3中任一項之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽包含以下序列： PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4 再者，式中「(L)」表示連接子。
  5. 如請求項1至4中任一項之腫瘤之術後輔助療法劑，其中連接子為胺基酸連接子。
  6. 如請求項5之腫瘤之術後輔助療法劑，其中胺基酸連接子為連接有2個精胺酸之精胺酸二聚物或連接有3個精胺酸之精胺酸三聚物。
  7. 如請求項1至6中任一項之腫瘤之術後輔助療法劑，其中親水性胺基酸所構成之肽序列係連接於N末端，且為連接有3個精胺酸之精胺酸三聚物或連接有4個精胺酸之精胺酸四聚物所構成。
  8. 如請求項1至7中任一項之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽為序列編號24、序列編號25或序列編號26。
  9. 如請求項1至8中任一項之腫瘤之術後輔助療法劑，其中CTL表位4連接肽為序列編號24。
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