JP4219789B2 - 骨髄由来の不死化樹状細胞株 - Google Patents

Description

本発明は、骨髄に由来する不死化樹状細胞株に関し、詳しくはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス）の骨髄に由来する樹状細胞（Dendritic cell；ＤＣ）を継代培養することにより樹立することができる不死化樹状細胞株及びその製法や、その利用に関する。本発明の不死化樹状細胞株は、樹状細胞のインビトロにおける解析や樹状細胞を用いたワクチン療法の開発並びに免疫応答の修飾、増強の研究に応用できる。

従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の観点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に動物試験が行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止し、やがては死滅する（この現象を細胞老化という）。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという危惧に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされている。

一方、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失する。そのため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。そこで、初代細胞にｒａｓ遺伝子やｃ−ｍｙｃ遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、さらに継代することによってその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であった。

これに対し、近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出し、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、これを継代することによって不死化細胞を樹立する方法が報告されている。特にｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウスの臓器から得られる不死化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えることによって操作することができるため、非常に有効であるとされている（例えば、非特許文献１〜８参照。）。

他方、樹状細胞（ＤＣ）は造血幹細胞由来の樹枝状形態をとる細胞集団で、生体内に広く分布している。未成熟樹状細胞は、それぞれの組織に侵入したウイルスや細菌をはじめとする異物を認識して取り込み、リンパ系器官Ｔ細胞領域への移動の過程でペプチドを消化分解によって生成し、ＭＨＣ分子に結合させて細胞表面に提示することにより、抗原特異的なＴ細胞を活性化して免疫応答を誘導する抗原提示細胞としての役割を担っている（例えば、非特許文献９、１０参照。）。このように、ＤＣはＴ細胞依存性の初期免疫応答を惹起できるというＴ細胞応答の始動にとって非常に重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献１１、１２参照。）。骨髄で生まれたＤＣは未熟な状態で、生体内の様々な組織に飲食作用をもって分布する。その未熟ＤＣは抗原を取り込み成熟し、２次リンパ性器官へと移動する。そしてそのＴ細胞領域に蓄積して、体内を循環しているＴ細胞のうち抗原特異的なものを選択的に活性化して免疫応答を駆動する。しかし、ＤＣのインビボにおけるこれらの詳しいメカニズムは未だ分かっておらず、インビトロにて解析する必要がある。マウスのインビトロのシステムにおいて顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いることにより、機能的なＤＣの誘導が初期培養で可能であるが、その寿命は長くても２ヶ月である（例えば、非特許文献１３参照。）。近年、マウスの２次リンパ性器官である脾臓から、ＤＣがＧＭ−ＣＳＦ依存的に長期培養（１２ヶ月以上）できることが報告されたが（Ｄ１細胞：例えば、非特許文献１４参照。）、未熟で抗原を取り込んでいない、骨髄などの１次リンパ組織からはＤＣ細胞株が樹立されていない。
Transgenic Research 4, 215-225, 1995 Genes to Cells, 2, 235-244, 1997 Exp. Cell Res., 197, 50-56, 1991 Exp. Cell Res., 209, 382-387, 1993 Exp. Cell Res., 218, 424-429, 1995 Blood, 86, 2590-2597, 1995 J. Cell. Physiol., 164, 55-64, 1995 Exp. Hematol., 27, 1087-1096, 1999 Ann. Rev. Immunol. 9, 271-296, 1991 J. Exp. Med., 185, 2133-2141, 1997 Nature, 392, 245-252, 1998 Annu. Rev. Immunol., 18, 767-811, 2000 J. Exp. Med., 175, 1157-1167, 1992 J. Exp. Med., 185, 317-328, 1997

樹状細胞（ＤＣ）は免疫応答の駆動を行う重要な細胞である。しかし、ＤＣの生体内での動態の解析や、癌免疫賦活への応用は始まったばかりであり、未解明な点が多く残されている。ＤＣは生体から調製することで培養可能であるが、その寿命は限られており、ＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカイン存在下で培養しても、長くて１ヶ月程度しか存続できず、その後死滅する。これまでは、安定的に増殖し続ける樹状細胞の作製は非常に困難であって、樹状細胞の簡便な株化方法もなく、免疫の誘導や修飾、樹状細胞を用いた治療などに目処が立っていなかった。すなわち本発明の課題は、樹状細胞が本来有する機能・特性を保持する不死化樹状細胞株やその樹立方法、かかる不死化樹状細胞株を用いた有用物質のスクリーニング方法及びかかる不死化樹状細胞株を主成分とする細胞ワクチンを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及びＩａ陽性細胞を除去し、得られた細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下培養することにより樹状細胞を誘導し、継代培養を１０回以上繰り返し、樹立した不死化樹状細胞株が、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びＣＴＬ活性の誘導能を有するなど、ＤＣが本来有している性質を備えていることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及びＩａ陽性細胞を除去し、得られた細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下培養することにより樹状細胞を誘導し、継代培養を１０回以上繰り返して樹立される細胞であって、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びＣＴＬ活性の誘導能を有し、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制され、ＬＰＳ刺激に応答能を有することを特徴とする不死化樹状細胞株ＴＤＣ（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５２７）に関する。

また本発明は、（２）被検物質の存在下、上記（１）記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞株における成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定・評価することを特徴とする樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（３）マーカータンパク質が、ミエロイド分子、ロイコサイト分子、Ｉ−Ａ ^b 、ＣＤ８６及び／又はＣＤ４０であることを特徴とする上記（２）記載の樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（４）被検物質の存在下、上記（１）記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することを特徴とする樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（５）被検物質の存在下、上記（１）記載の不死化樹状細胞株をＬＰＳ刺激し、該細胞のＩＬ−１２産生量を測定、評価することを特徴とする樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。

さらに本発明は、（６）上記（１）記載の不死化樹状細胞株を主成分とすることを特徴とする細胞ワクチンや、（７）不死化樹状細胞株が、抗原又は抗原−ＩｇＧ免疫複合体を取り込ませた不死化樹状細胞株であることを特徴とする上記（６）記載の細胞ワクチンや、（８）抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする上記（７）記載の細胞ワクチンに関する。

本発明によれば、安定的に増殖し続ける不死化樹状細胞株を得ることができ、該樹状細胞株を用いて免疫の誘導や修飾、樹状細胞株を用いた治療法の開発など利用することができる。また、本発明によれば、当該細胞株の由来する組織における本来の機能・特性を保持しているので、これを用いた樹状細胞に対する有用物質のスクリーニング方法及び免疫応答を増強する物質を提供することができる。

本発明の不死化樹状細胞株としては、骨髄に由来する不死化樹状細胞株であればどのようなものでもよく、３３℃で増殖することができ、３７℃では増殖が抑制される細胞株が好ましく、この温度感受性の点を除いては、ＤＣが本来備えている性質を有するものがより好ましい。例えば、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びＣＴＬ活性の誘導能を有する細胞株や、ＬＰＳによる刺激により樹状細胞が成熟化、活性化され、ＩＬ−１２を産生するなどＬＰＳ刺激に応答能を有する細胞株や、これらの性質を合わせ有する細胞株を好適に例示することができる。また、かかる不死化樹状細胞株の具体例として、不死化樹状細胞株ＴＤＣを挙げることができ、このＴＤＣ株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５２７（平成１４年９月２６日に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−１９０４４号より移管）として、ブダペスト条約に基づく寄託がなされている。また、本発明の不死化樹状細胞株の由来は特に限定されないが、マウス等の齧歯類などの動物から得られた不死化樹状細胞株は、マウスが豊富な病態モデルを有し、薬理作用の評価に広く用いられていることから好ましい。以下、本発明の不死化樹状細胞株の製造方法を、マウスを用いた方法を例にとって説明する。

マウス由来の本発明の不死化樹状細胞株は、例えば、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウスの骨髄細胞を塩化アンモニウムを用いて溶血処理した後、例えば抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗Ｉ−Ａ^b抗体、抗ラットＩｇ抗体とウサギ補体を用いて、リンパ球とＩａ陽性細胞を除去した細胞を２０ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＧＭ−ＣＳＦを含む完全ＲＰＭＩ培地（５％ＦＣＳ）を用いて培養し、樹状細胞（ＤＣ）を誘導し、継代培養を１０回以上繰り返し、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びＣＴＬ活性の誘導能を有する細胞株を樹立することにより得ることができる。

また、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウスは、次のようにして作製することができる。ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失させたｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２の全ＤＮＡを制限酸素ＢａｍＨＩで開環してｐＢＲ３２２に導入したプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８（−）−２（OhnoT. et al., Cytotechnology 7, 165-172, 1991）を常法に従い大腸菌内で大量に増幅させ、この増幅したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断してベクター部位を除去し、ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を有するＤＮＡ断片を調製する。このラージＴ抗原遺伝子のプロモーターが内在するＤＮＡ断片を常法に従いマウスの全能性細胞に遺伝子導入することにより、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を全ての細胞内に有する遺伝子導入マウス、すなわちトランスジェニックマウスを作出することができる。かかるトランスジェニックマウスは、その全ての体細胞においてｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現することになる。そして、上記全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞などを具体的に挙げることができる。また、全能性細胞へのＤＮＡの導入方法としては、マイクロインジェクション法、電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。

上記マウスの全能性細胞（培養細胞）の核を、除核未受精卵に移植して初期化すること（核移植）で卵子にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入することができる。また、前核期受精卵の雄性前核にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子をマイクロインジェクションして得られる卵子を仮親の卵管に移植して産仔を得た後、注入した遺伝子を持つ産仔を選出し、安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個体を得ることで、個体発生時にすでにｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれた遺伝子導入マウス、すなわちトランスジェニックマウスを効率よく作出することができる。

本発明の不死化樹状細胞株は、３３℃において永久的増殖能を保持し、３７℃においては増殖が抑制され、３９℃においては増殖を停止するため、細胞固有の分化形質の発現を制御することができるという特色を有している。また、この不死化樹状細胞株は、７ヶ月以上継代培養行っても３３℃で良好な増殖性を示し、樹状細胞としての機能を保持している。本発明の不死化樹状細胞株は、安定的に増殖し続けることができ、また、該樹状細胞の有する抗原取り込み能及び抗原提示能により、Ｔ細胞を活性化させることができるので細胞ワクチンとして有用である上に、免疫の誘導や修飾、樹状細胞を用いた治療の研究に用いることができる。また、以下に示すように、樹状細胞に対する有用物質のスクリーニングに用いることができる。

本発明におけるスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、上記本発明の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞株におけるミエロイド分子、ロイコサイト分子、Ｉ−Ａ^b、ＣＤ８６、ＣＤ４０等の成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定・評価する樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、該細胞株の増殖の程度を測定・評価する樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、該細胞株をＬＰＳ刺激し、該細胞のＩＬ−１２産生量を測定、評価する樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を挙げることができる。そして、上記スクリーニング方法により得られる樹状細胞における成熟促進物質や、樹状細胞における細胞増殖促進物質や、樹状細胞の活性化促進物質も本発明に含まれる。

上記樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化樹状細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に発現したマーカータンパク質の量を検出・測定し、被検物質の非存在下で培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。例えば、樹状細胞の表面に発現する成熟度マーカータンパク質であるミエロイド分子やロイコサイト分子は、それぞれ特異抗体を用いて常法により免疫化学的に検出することにより測定することができる。また、これらに相当するｍＲＮＡの発現量を常法により検出することにより測定することもできる。上記樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化樹状細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に細胞数や細胞の形態を測定・解析し、被検物質の非存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。また、上記樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化樹状細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後にＩＬ−１２の産生量を測定し、被検物質の非存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。

本発明の細胞ワクチンとしては、上記本発明の不死化樹状細胞株を主成分とするものであれば特に制限されるものではないが、上記不死化樹状細胞株としてはヒト由来の不死化樹状細胞株が好ましく、かかるヒト由来の不死化樹状細胞株は、ヒト末梢血又は骨髄より樹状細胞株を単離し、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し、継代培養を繰り返すことにより、あるいはヒトの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し、これをインビトロで樹状細胞株に分化させ、継代培養を繰り返すことにより樹立することができる。また、不死化樹状細胞株としては、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制されるものや、不死化樹状細胞株が腫瘍抗原等の抗原や抗原−ＩｇＧ免疫複合体を取り込ませたものが好ましい。本発明の細胞ワクチンは、インビボ又はインビトロで抗原を取り込ませ、修飾後細胞表面に抗原性のペプチドを提示する、Ｔ細胞を刺激する抗原提示細胞として用いることができる。例えば、本発明の不死化樹状細胞株の懸濁液からなる本発明の細胞ワクチンは、ヒト体内に治療用のワクチンとして接種されることになるが、３７℃では増殖が抑制されることから安全性が高い。通常、細胞ワクチンとしての安全性を高めるために、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンＣ処理などが必要とされるが、本発明の不死化樹状細胞株は、かかる細胞不活化処理が不要で、かつ、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制されることから極めて安全性が高いワクチンということができる。

本発明の細胞ワクチン、特にヒト由来の不死化樹状細胞株を主成分とする細胞ワクチンは、ヒトに移入可能な細胞ワクチンとして、白血病、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌などの各種腫瘍、及び各種ウイルス、細菌等による感染症等に対して有利に利用することができる。本発明の細胞ワクチンの投与量は、患者の年齢、体重、性別、癌の種類及び癌の進行度、症状等により異なり、一概に決定できないが、現在行われている細胞ワクチン療法で注入されるのと同程度の量が患者に投与することができる。本発明の細胞ワクチンは、患者本人に使用することもできるが、骨髄バンク、臍帯血バンクの発達により、ＭＨＣ適合の同種の多数の患者に投与することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（トランスジェニックマウスの作出）
ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを導入したトランスジェニックマウスは、下記の手順で作出した。

（導入遺伝子の調製）
マイクロインジェクションにはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを遺伝子工学的手法で改変したものを使用した。ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列をＳａｃIIに変換してＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失するｏｒｉ（−）としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnology, 165-172, 1991）から常法に従い導入用ＤＮＡを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅させることにより得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、アガロース電気泳動法（１％ゲル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行いＤＮＡを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴＥバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍｌの精製ＤＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注入用バッファー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、調製したＤＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存した。

（トランスジェニックマウスの作出）
マウス前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液のマイクロインジェクションは下記の要領で行った。性成熟した８週齢のウィスターマウスを明暗サイクル１２時間（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２℃、湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌マウスにより１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳゴナドトロピン（pregnanto mare serum gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、その４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorionic gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰排卵処理を行った後、雄との同居により交配を行った。ｈＣＧ投与３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and Chang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を使用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダーゼ（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫＲＢ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、ＤＮＡ注入操作までＣＯ₂−インキュベーター内（５％のＣＯ₂−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存した。この様にして準備したマウス受精卵の雄性前核に前記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９匹の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入ＤＮＡのマウスへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾より調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プライマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５’−ＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’（１３６５〜１３８４部位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５’−ＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３’（１５７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、性別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックマウス（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃１９−８）を得た。これらのＧ₀世代のトランスジェニックマウスとウィスターマウスを交配し、雄ファウンダーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウンダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。

（マウス骨髄からのＤＣの分離・調整）
マウスはＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６マウス）と温度感受性ＳＶ４０Ｔ抗原トランスジェニックマウス（ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス；Ｂ６バックグラウンド）の２系統を用いた。また、これらマウスは全て６〜８週齢の雌を用いた。マウスの骨髄細胞を０．１４４Ｍ塩化アンモニウムにて赤血球ｌｙｓｉｓ処理し、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗Ｉ−Ａ^b抗体、抗ラットＩｇ抗体（それぞれＴＩＢ２０７、２１１、１５４、２１６：Amerikan Type Culture Collection）とウサギ補体（Cedarlane社製）を用いて、リンパ球とＩａ陽性細胞の除去を行った。この細胞１×１０⁶／wellを２０ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Peprotech社製）を含む完全ＲＰＭＩ培地（５％ＦＣＳ）を用い、２４穴プレートで培養し、６日後に樹状細胞（ＤＣ）を誘導した。ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇマウスからのＤＣは３３℃、５％ＣＯ₂条件下で誘導後、継代を５×１０⁵／ｍＬ／wellで１０回以上繰り返し（４〜５日ごとに培地交換、３週ごとに継代）、７ヶ月以上培養したものを用いた。なお、Ｂ６マウスからのＤＣは上記の方法により骨髄細胞を単離し、ＤＣを誘導した後、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で培養し、その時点で解析に用いた。

（ライトギムザ染色による形態観察）
実施例２で得られたＤＣのライトギムザ（Wright-Giemsa）染色を行った。Ｂ６マウスとｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウスの２系統を起源とするそれぞれのＤＣをサイトスピンでスライドグラスに接着させ、ライトギムザ法（ライト染色液・ギムザ染色液、ともにメルク社製）にて染色し、可視化した。結果を図１に示す。この結果、細胞の大きさは、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣ（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）の方がＢ６マウスのＤＣ（初代培養Ｂ６）より大きかった。

（異なる温度での増殖能）
ＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazo-lium bromide)はミトコンドリア内膜の脱水素酵素などにより開裂されて赤紫色のＭＴＴ-formazanを生成する。この呈色反応が細胞の増殖能に比例することに基づいたＭＴＴアッセイにより、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣの異なる温度（３３℃、３７℃、３９℃）での増殖能を測定した。ＭＴＴアッセイは、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（シグマ社製）溶液１０μＬを前記２０ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Peprotech社製）を含む細胞懸濁液１００μＬに添加し、９６穴プレートに７．５×１０³／１００μＬ／wellで細胞をまき、測定時にＭＴＴ溶液を１０μＬ／well添加し、経時的に測定を行った。結果を図２に示す。この結果、ＳＶ４０Ｔ抗原が発現する３３℃で最も増殖能が高かった。

（ＧＭ−ＣＳＦ要求性）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣについて、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）要求性を検討するため、実施例４と同様な条件で、ＭＴＴアッセイを行った。すなわち、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（シグマ社製）溶液１０μＬをそれぞれ２０、１０、２、０ｎｇ／ｍＬ濃度のマウスリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Peprotech社製）を含む細胞懸濁液１００μＬに添加し、９６穴プレートに７．５×１０³／１００μＬ／wellで細胞をまき、測定時にＭＴＴ溶液を１０μＬ／well添加し、経時的に測定を行った。結果を図３に示す。この結果、通常の初代培養のＤＣ誘導に用いる濃度の２０ｎｇ／ｍＬで一番増殖が良かった。この不死化細胞はＧＭ−ＣＳＦ依存的に増殖する細胞であることが分かった。

（細胞表面に発現するタンパク質の検討）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣを用いて、細胞表面上に発現する代表的なタンパク質であるミエロイド分子及びロイコサイト分子の発現をＦＡＣＳにて解析した。結果を図４及び図５に示す。この結果、上記２系統を起源とするＤＣにおけるミエロイド分子及びロイコサイト分子の発現量は共に変わらなかった。

（抗原の取込み能の比較検討）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣを用いて、１０μｇ／ｍＬの抗原（ＯＶＡ−ＦＩＴＣ；Molecule Probes社製）を添加後２日目に取込み能の比較検討をＦＡＣＳにて行った。結果を図６に示す。この結果、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣはＢ６マウスのＤＣよりも強い取込み能を示した。

（ＬＰＳ刺激に対する樹状細胞の成熟化の比較検討）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣについて、それぞれのＤＣの培養ウェルにＬＰＳを２μｇ／ｍＬ添加して、２４時間後の細胞表面上の成熟度マーカーであるＩ−Ａ^b、ＣＤ８６とＣＤ４０の発現量をＦＡＣＳにて解析した。結果を図７に示す。この結果、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣにおける成熟度マーカーのアップレギュレーション、つまり成熟度はＢ６マウス（初代培養Ｂ６）のＤＣと変わらず起こることが分かった。

（ＬＰＳ刺激に対する樹状細胞の活性化の比較検討）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣにおける、ＬＰＳ刺激に対するＤＣの活性化としてＩＬ−１２ｐ７０産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。結果を図８に示す。この結果、それぞれのＤＣの培養ウェルにＬＰＳを２μｇ／ｍＬ添加して、２４時間後の上清中のＩＬ−１２ｐ７０産生量は２系統間で変わらなかった。

（抗原を取り込ませた場合の樹状細胞の成熟化）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣに、抗原として１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ−ＦＩＴＣを取り込ませて、２日後にそれらの成熟度をＦＡＣＳにて解析した。結果を図９に示す。この結果、Ｂ６マウス（初代培養Ｂ６）のＤＣの方が強い成熟度を示した。

（樹状細胞によるＯＶＡ−Ｔ細胞への抗原提示能の比較検討）
本発明者らが以前樹立したＯＶＡ特異的ＣＤ４Ｔ細胞を用いて、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣの抗原提示能を測定した。提示能としてＴ細胞のＩＬ−４産生と増殖を測定した。Ｘ線照射したＤＣ（５×１０³／well）を１×１０⁵のＯＶＡ特異的Ｔ細胞と様々な濃度のＯＶＡ又はＯＶＡ−ＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ）存在下で９６穴プレートにて共培養した。免疫複合体はＦｃγレセプターを介して抗原を取り込ませると、高効率な抗原提示が起きると言われている（J. Immunol., 161, 6059-6067, 1998、J. Exp. Med., 189, 371-380, 1999、Eur. J. Immunol., 30, 848-857, 2000、J. Exp. Med., 195, F1-F3, 2002）ことから、比較検討に用いた。なお、ＯＶＡ−ＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ）は、卵白アルブミン（ＯＶＡ；Sigma社製）をウサギ抗ＯＶＡ ＩｇＧ（BioDesign社製）を重量比１：１０で混合し、３７℃で１時間インキュベートして作製した。２４時間後、その培養上清を回収し、Ｔ細胞のＩＬ−４産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。Ｔ細胞の増殖は、４８時間の共培養後、［³Ｈ］−ＴｄＲの取り込みを測定した。結果を図１０に示す。この結果、２系統を起源とするそれぞれのＤＣは、共に同じくらいのＴ細胞の増殖、ＩＬ−４産生を起こした。ただ、ＩＬ−４産生において添加したＯＶＡが１μｇ／ｍＬの場合、ＯＶＡ−ＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ）を抗原に用いたときに、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣによるＩＬ−４産生量はＢ６マウス（初代培養Ｂ６）のＤＣに比べて少なかった。

（経時的抗ＯＶＡ抗体価）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣに、ＯＶＡ又はＯＶＡ−ＩｇＧ免疫複合体を負荷して、移入した後の経時的抗ＯＶＡ抗体価を調べた。インビボの実験において、ＤＣを培養しているウェルにＯＶＡ又はＯＶＡ−ＩｇＧ免疫複合体を１０μｇ／ｍＬ含む新鮮培地と交換後２日目に、抗原を取り込んだ成熟ＤＣを回収してＰＢＳ（−）で洗浄し、レシピエントとなるＢ６マウス１匹あたりＤＣ１×１０⁶cellsを尾静脈に移入した。免疫後、眼底より採血し、経時的な抗ＯＶＡ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１１に示す。この結果、ＯＶＡ−ＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ）では、２系統ともＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂいずれにおいても効果的な抗体産生が見られた。抗原にＯＶＡを用いたとき、ＩｇＧ２ａにおいてｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣによる抗体産生が有意な差をもって高かった（２週間後）。

（抗ＧＬ−７抗体による脾臓組織の免疫組織化学染色）
マウスにＤＣを移入し、約３週後にそのマウスの脾臓を採取し、活性化した胚中心の指標であるＧＬ−７の発現を免疫組織化学染色法にて検鏡した。結果を図１２に示す。この結果、Ｂ６マウス及びｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス共に免疫複合体（ＩＣ）を抗原に用いたとき、その形成が効果的だった。これら２系統間に差は無かった。

（生体内ＣＴＬ活性）
マウスへのＤＣ移入による生体内のＣＴＬ活性を比較検討した。移入７日後のマウスの脾臓細胞を採取し、３７℃のＣＯ₂インキュベーターにて３０分間インキュベートすることで付着性細胞を取り除き、Ｔ細胞リッチな状態にした。この非付着性細胞１×１０⁷と、Ｘ線照射し増殖を止めたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ １×１０⁶を２４穴プレートにて共培養した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ（CRL2113;ATCC）はＢ６由来のthymomaであるＥＬ−４にＯＶＡのｃＤＮＡをトランスフェクトしたものであり、そのＭＨＣクラスＩ上には常にＯＶＡのペプチドがロードされている。培養５日目に、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡをＮａ₂ ⁵¹ＣｒＯ₄（Amersham Pharmacia Biotech社製）で１時間かけてラベルした。様々な濃度の生脾細胞とその⁵¹ＣｒラベルしたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ １×１０⁴とを９６穴Ｕボトムプレートにて共培養し、４時間後に上清中の⁵¹Ｃｒの放出をオートウェルガンマシステム（Aloka社製）にて測定した。結果を図１３に示す。この結果、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣにＯＶＡを添加したときに、Ｂ６マウスのＤＣと比較すると、免疫複合体を取り込ませたときと同程度の、かなり強力なＣＴＬ活性を誘導した。

（樹状細胞におけるＭＨＣクラスＩ／ＯＶＡペプチド複合体の発現）
上記実施例１４において、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣにＯＶＡを添加したときに、Ｂ６マウス（初代培養Ｂ６）のＤＣと比較すると、免疫複合体を取り込ませたときと同程度の、かなり強力なＣＴＬ活性を誘導した理由として、ＤＣのＭＨＣクラスＩ分子上により多くの抗原由来ペプチドが提示されているのではないかと考え、ＭＨＣクラスＩ／ＯＶＡペプチド複合体に特異的なモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより解析した。５０μｇ／ｍｌのＯＶＡ存在下で、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣを４８時間培養した。次いで、抗ＦｃγＲII／III抗体でＦｃレセプターをブロックした後、抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ抗体及び抗ＭＨＣ Ｉ−ＦＩＴＣ抗体、又は抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ抗体及び抗ＭＨＣ Ｉ／ＯＶＡペプチド抗体を用いて染色した。なお、抗ＭＨＣ Ｉ／ＯＶＡペプチド抗体染色の場合、２次抗体（抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体）で染色した。染色後、フローサイトメトリー（ＢＤＬＳＲ）で測定し、データはBD CellQuestで解析した。樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性細胞）のＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ Ｉ／ＯＶＡペプチド細胞表面発現量をヒストグラムで示した結果を図１４に示す。この結果、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣのＭＨＣクラスＩの発現レベルは野生型のＢ６マウス（初代培養Ｂ６）とほぼ同等であったが、ＭＨＣクラスＩ／ＯＶＡペプチド複合体の発現はｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣにおいて劇的に高くなっていた。すなわち、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣはＭＨＣクラスＩに効率良くＯＶＡペプチドを提示することでＣＴＬに対する効率良い抗原提示ができる細胞であることがわかった。

（インビボにおける抗腫瘍活性）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣの生体内における増強されたＣＴＬ応答を具体的に評価するために、抗腫瘍実験を行った。ＯＶＡ刺激（１０μｇ／ｍｌ，４８時間）を与えたｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウス（ＳＶ４０Ｔ Ｂ６）とＢ６マウス（初代培養Ｂ６）の２系統を起源とするそれぞれのＤＣ（５×１０⁵／マウス）、又は生理食塩水（２００μｌ）を、未感作マウス（７〜８匹）の尾静脈より投与し、７日後に再度ＤＣ又は生理食塩水を投与し、さらに７日後にＯＶＡを発現する腫瘍細胞（Ｅ．Ｇ７）を左大腿部に１×１０⁵／マウスで植え付け、腫瘍形成を日を追って観察し、腫瘍の直径が５ｍｍ以上のものを腫瘍が形成されたと判定した。結果を図１５に示す。図１５における腫瘍抑制率は、腫瘍が形成されていないマウスの割合を％で表示したものである。ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣを移入したマウスは野生型のＢ６マウスのＤＣを移入したマウスよりも腫瘍形成が遅く、効率良く腫瘍形成を抑制した。すなはち、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣは生体内において野生型ＤＣよりも効率良く抗腫瘍活性を誘導する細胞であることが判った。

（考察）
ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ Ｔｇマウスの骨髄細胞から誘導して、１０回以上継代し、７ヶ月以上３３℃で長期培養を繰り返したＤＣは初期培養のそれに比べ、大きさが少々大きく、取り込み能が高いが、インビトロにおいての抗原提示能ではＭＨＣクラスIIを介した場合で変わらない機能を持つことが分かった。このことから、インビトロにおけるＤＣの解析に用いるのに有用な細胞株であると考えられる。また、インビボにおいてワクチンとして用いると、特にＭＨＣクラスIを介して強力にＣＴＬを誘導した。これは高効率のＭＨＣクラスIを介した提示能は高い抗原の取り込み量に依存するという報告（Annu. Rev. Immunol., 19, 47-64, 2001）と一致する。このことから、ｔｓ ＳＶ４０ ＬＴ ＴｇのＤＣは癌やウイルスなどに対するワクチン効果を生体内で効率よく起こすことができる。

本発明の不死化した樹状細胞株の樹状細胞とＢ６マウスの樹状細胞をライトギムザ染色した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株について、ＭＴＴアッセイにより温度条件を変えて増殖能を測定した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株の増殖において、ＧＭ−ＣＳＦの要求性をＭＴＴアッセイにより測定した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞上の代表的なミエロイド分子の発現量をＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞表面上の代表的なロイコサイト分子の発現量をＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞の抗原取り込み能をＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞のＬＰＳ刺激に対する、樹状細胞の成熟度をＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞のＬＰＳ刺激に対する、樹状細胞のＩＬ−１２ｐ７０産生量をＥＬＩＳＡ法にて測定した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞にＯＶＡを取り込ませ、２日後の成熟度をＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞のＯＶＡ−Ｔ細胞への抗原提示能の結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞にＯＶＡを移入し、経時的抗ＯＶＡ抗体価を示す図である。 本発明の樹状細胞株の樹状細胞を移入した後、約３週間後の、脾臓胚中心の免疫組織化学染色（抗ＧＬ−７抗体）した結果を示す図である。 本発明の樹状細胞株の樹状細胞を移入したことによる、生体内のＣＴＬ活性を比較検討した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株とＢ６マウスの樹状細胞におけるＭＨＣクラスI／ＯＶＡペプチド複合体の発現量を比較した結果を示す図である。 本発明の不死化した樹状細胞株を移入したことによる、生体内での増強された抗腫瘍活性の結果を示す図である。

Claims (8)

1. ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及びＩａ陽性細胞を除去し、得られた細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下培養することにより樹状細胞を誘導し、継代培養を１０回以上繰り返して樹立される細胞であって、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びＣＴＬ活性の誘導能を有し、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制され、ＬＰＳ刺激に応答能を有することを特徴とする不死化樹状細胞株ＴＤＣ（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５２７）。
2. 被検物質の存在下、請求項１記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞株における成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定・評価することを特徴とする樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
3. マーカータンパク質が、ミエロイド分子、ロイコサイト分子、Ｉ−Ａ^b、ＣＤ８６及び／又はＣＤ４０であることを特徴とする請求項２記載の樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
4. 被検物質の存在下、請求項１記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することを特徴とする樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
5. 被検物質の存在下、請求項１記載の不死化樹状細胞株をＬＰＳ刺激し、該細胞のＩＬ−１２産生量を測定、評価することを特徴とする樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
6. 請求項１記載の不死化樹状細胞株を主成分とすることを特徴とする細胞ワクチン。
7. 不死化樹状細胞株が、抗原又は抗原−ＩｇＧ免疫複合体を取り込ませた不死化樹状細胞株であることを特徴とする請求項６記載の細胞ワクチン。
8. 抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする請求項７記載の細胞ワクチン。

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