JP6219827B2 - 誘導可能なアデノ随伴ウイルスベクターに媒介されるトランスジーンアブレーション系 - Google Patents

誘導可能なアデノ随伴ウイルスベクターに媒介されるトランスジーンアブレーション系 Download PDF

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Description

遺伝子治療は、疾患を処置する若しくは治癒させるという最終目標を伴う宿主細胞中への遺伝物質の導入を必要とする。多くの疾患は不可欠のタンパク質の欠損をもたらす「欠損」遺伝子により引き起こされる。不完全な遺伝子発現を是正するための１アプローチは、正常遺伝子（トランスジーン）をゲノム内の非特異的な場所に挿入して機能しないすなわち「欠陥のある」疾患を引き起こす遺伝子を置換することである。遺伝子治療は、治療的産物が長期間発現されて反復投与の必要性を排除するように多様な疾患を処置するための治療的タンパク質若しくはＲＮＡの送達のための基盤としてもまた使用し得る。ベクターと呼ばれる担体分子を、患者の標的細胞にトランスジーンを送達するために使用しなければならず、最も普遍的なベクターは正常なヒト遺伝子を運搬するように遺伝子的に変えられているウイルスである。ウイルスは病原性の様式でヒト細胞にそれらの遺伝子を被包化かつ送達する方法を進化させ、そして従ってウイルスゲノムは治療的遺伝子を挿入するよう操作し得る。
安定なトランスジーン発現は、アデノウイルス若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターの非分裂細胞へのイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）送達後に、ならびにまた、レトロウイルスおよびレンチウイルスに基づくもののような組み込むおよび組み込まないベクターでエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で形質導入された幹細胞の移植によっても達成し得る。とりわけ、ＡＡＶは非病原性であり、それは有害な免疫応答を導き出さず、およびＡＡＶトランスジーン発現は頻繁に何年も若しくは動物モデルの一生涯にわたり持続するため、ＡＡＶベクターは遺伝子治療に用いられる（非特許文献１を参照されたい）。ＡＡＶは、４．７ｋｂである一本鎖ＤＮＡゲノムの直線的鎖をパッケージングする小型の無エンベロープヒトパルボウイルスである。ＡＡＶによる生産的感染はアデノウイルス若しくはヘルペスウイルスいずれかのヘルパーウイルスの存在下でのみ起こる。ヘルパーウイルスの非存在下で、ＡＡＶは高頻度で宿主ゲノムの特定の一点（１９ｑ １３−ｑｔｅｒ）に組み込み、ＡＡＶを部位特異的組み込みが可能であることが既知の唯一の哺乳動物ＤＮＡウイルスにする。非特許文献２を参照されたい。しかしながら、いかなるウイルス遺伝子も含有せずかつ治療的遺伝子のみ含有する組換えＡＡＶはゲノムに組み込まない。代わりに、該組換えウイルスゲノムは逆方向末端反復配列を介してその端に融合して、長期遺伝子発現の主原因であると予測される環状のエピソームの形態を形成する（非特許文献１を参照されたい）。
遺伝子治療の事実上全部の前臨床および臨床応用は構成的プロモーターからトランスジーンを発現するベクターを使用し、これは、それが該ベクターゲノムが存続する限り固定された水準で活性であることを意味している。しかしながら、遺伝子治療の影響を受けやすい多くの疾患はトランスジーンの発現を調節させることを必要としうる。遺伝子発現を正に誘導するために薬物で誘導可能な操作された転写因子の制御下に目的の遺伝子を置くという一般原則に基づく数種の系が記述されている（非特許文献３；非特許文献４）。多様な系を２分類に分割し得る。第一において、テトラサイクリン、アンチプロゲスチン若しくはエクジステロイドのような誘導物質によりアロステリックに調節されるＤＮＡ結合ドメインがトランス活性化ドメインに結合されている。薬物の添加（若しくはいくつかの場合には除去）がＤＮＡ結合そしてこれゆえに転写活性化につながる。第二において、アロステリック制御は誘導される近接のより一般的な機構で置き換えられる。ＤＮＡ結合および活性化ドメインは、二量体化の化学的誘導物質すなわち「二量体化剤」と称される二価小分子の添加により活性の転写因子に再構成される別個のポリペプチドとして発現される。これらの系はトランスジーン発現を誘導することを必要とする遺伝子治療系で有用で
ある一方、それらは、それがもはや必要とされない場合若しくは長期薬物投与による毒性が後に続いて起こる場合に、トランスジーン発現を止めるすなわち永続的にアブレートする（ａｂｌａｔｅ）ことが可能であることの必要性に対処していない。
Ｓｈｙａｍら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４（４）：５８３−５９３ Ｋｏｔｉｎら、１９９０、ＰＮＡＳ、８７：２２１１−２２１５ Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｒｎ ＢｉｏＩ、１（２）：２１０−８ Ｒｏｓｓｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９８．９（５）：ｐ．４５１−６
本発明は、薬理学的作用剤、好ましくは経口製剤例えば丸剤に応答して永続的に若しくは一時的にのいずれかで治療的遺伝子産物をアブレートするための内蔵式安全機構を伴い操作されている複製欠損ウイルス組成物（１種若しくは複数）を使用する、被験体への治療的産物の送達のため設計された遺伝子治療系に関する。
本発明は、部分的に、トランスジーンをアブレートするすなわちトランスジーン発現を負に調節するために本明細書で「ＰＩＴＡ」（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ａｂｌａｔｉｏｎ（薬理学的に誘導されるトランスジーンアブレーション））と称される統合されたアプローチの発明者の開発に基づく。このアプローチにおいて、複製欠損ウイルスを、それが被験体中で発現されるがしかし薬理学的作用剤を投与することにより可逆的に若しくは不可逆的に止めることができるように治療的産物（ＲＮＡ若しくはタンパク質）をコードするトランスジーンを送達するために使用する。
本発明は、トランスジーンの発現が薬理学的作用剤により正に調節される系を上回る多くの利点を提示する。こうした場合に、受領者は、彼／彼女が該トランスジーンが発現されることを必要とする期間、すなわち非常に長くなることがありかつそれ自体の毒性を伴うことがある期間、薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ）を服用しなければならない。
一局面において、本発明は、制御されたトランスジーン発現アブレーション系を有する治療的産物のＡＡＶ媒介性送達のための組成物を提供し、前記組成物は、（ａ）（ｉ）転写を制御するプロモーターに作動可能に連結されている治療的産物をコードする核酸配列；および（ｉｉ）最低１０個（１０×）のＺｎフィンガーにより特異的かつ選択的に認識される最低３０核酸塩基対の配列を含んでなる最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位であって、前記最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位は該治療的産物をコードする配列の少なくとも５’に配置され、を含んでなる核酸分子を含有するＡＡＶベクター；ならびに（ｂ）プロモーターと作動的関連の機能的エンドヌクレアーゼ触媒ドメインに連結されているＺｎフィンガードメインの少なくとも１０コピーを含んでなるキメラエンドヌクレアーゼを含んでなる最低１種のアブレーターであって、ここで転写および／若しくはアブレーション活性は薬理学的作用剤に応答して誘導され、前記最低１０個（１０×）のＺｎフィンガードメインは前記最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位の前記最低約３０塩基対配列を特異的かつ選択的に認識し、ならびに最低１０個の独立に選択された認識へリックスを含んでなる、を含んでなる。一態様において、エンドヌクレアーゼ触媒ドメインはＦｏｋＩ触媒ドメインである。
さらなる一態様において、該核酸分子は二本鎖ＤＮＡ分子よりなり、ここで最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位が該ＤＮＡ分子の第一鎖上にあり、および少なくとも第二のエンドヌクレアーゼアブレーションが該ＤＮＡ分子の第二鎖上にあり、ここで前記第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位は第一鎖上の前記エンドヌクレアーゼアブレーション前記と異なりかつ異なるＺｎフィンガーにより特異的かつ選択的に認識される。
さらなる一局面において、アブレーター（ｂ）は、薬理学的作用剤により二量体化された後に転写因子により活性化されるカセットにより制御され、前記カセットは２個の転写ユニットを含んでなり、ここで：（ｃ）前記２個の転写ユニットの１個は第一のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；および（ｄ）前記２個の転写ユニットの第二は、第二のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子の活性化ドメインをコードする。
一態様において、該第一および第二のプロモーターは双方とも構成的プロモーターであり、ならびに薬理学的作用剤は転写因子のドメインを二量体化する二量体化剤である。
別の態様において、プロモーターの転写はラパマイシンで調節可能な系により制御され、および該薬理学的作用剤はラパマイシン若しくはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）である。
なお別の態様において、（ａ）（ｉｉ）の最低の約１個の３０塩基対の独特な核酸配列は、ヒトゲノム中のいずれかの下位配列と７０％未満同一かつヒトゲノム中のいずれの下位配列とも８を超えない連続する同一位置である連続する核酸よりなる。
本発明の他の局面および利点は以下の発明の詳細な記述から容易に明らかであろう。
本明細書で使用されるところの以下の用語は示される意味するところを有することができる。すなわち、
「ユニット」は転写ユニットを指す。
「トランスジーンユニット」は、（１）トランスジーンをコードするＤＮＡ配列；（２）トランスジーン内に含有される若しくはこれに隣接するアブレーション認識部位（ＡＲＳ）；および（３）該トランスジーンの発現を調節するプロモーター配列、を含んでなるＤＮＡを指す。
「アブレーション認識部位」若しくは「ＡＲＳ」は（１）トランスジーンユニットからトランスジーンをアブレートする若しくは切り出すアブレーターにより認識され得るか；または（２）アブレーション認識ＲＮＡ配列（ＡＲＲＳ）をコードする、ＤＮＡ配列を指す。
「アブレーション認識ＲＮＡ配列」若しくは「ＡＲＲＳ」は、トランスジーンの転写産物若しくはそのｍＲＮＡの翻訳をアブレートするアブレーターにより認識されるＲＮＡ配列を指す。
「アブレーター」は、（ａ）トランスジーンユニットのＡＲＳを特異的に認識／結合しかつ該トランスジーンを切断する若しくは切り出すか；または（ｂ）転写されたトランスジーンユニットのＡＲＲＳを特異的に認識／結合しかつ該ｍＲＮＡ転写物を切断するか若しくはその翻訳を予防するかのいずれかである、いかなる遺伝子産物すなわち翻訳若しくは転写産物も指す。
「アブレーションユニット」は、（１）アブレーターをコードするＤＮＡ配列；および（２）前記アブレーターの発現を制御するプロモーター配列、を含んでなるＤＮＡを指す。
「二量体化可能な転写因子（ＴＦ）ドメインユニット」は、（１）プロモーターにより制御される二量体化剤結合ドメインに融合されているＴＦのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列；および（２）プロモーターにより制御される二量体化剤結合ドメインに融合されているＴＦの活性化ドメイン（活性化ドメイン融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列、を指す。一態様において、二量体化可能なドメインの各ユニットは構成的プロモーターにより制御され、および該ユニットはアブレーターのプロモーターの制御に利用される。あるいは、プロモーターの１種若しくはそれ以上が誘導可能なプロモーターでありうる。
「二量体化可能な融合タンパク質ユニット」は、（１）二量体化剤結合ドメインに融合されているタンパク質若しくは酵素（例えばアブレーター）のユニット、サブユニット若しくはフラグメントをコードする第一のＤＮＡ配列、および（２）発現されかつ必要とされる場合は活性化される場合に結合して融合タンパク質を形成するタンパク質若しくは酵素のユニット、サブユニット若しくはフラグメントをコードする第二のＤＮＡ配列、を指す。この「二量体化可能な融合タンパク質ユニット」は、アブレーターのプロモーターを活性化するため、ＤＮＡ特異性を提供するため、結合ドメインおよび触媒ドメインを一緒にすることによりキメラアブレーターを活性化するため、若しくは所望のトランスジーンを製造するためを包含する多様な目的上利用しうる。これらユニット（１）および（２）は、単独のプロモーターの制御下に適するリンカー（例えばＩＲＥＳ若しくは２Ａ自己切断タンパク質）により分離されている単独オープンリーディングフレーム中にありうるか、または独立のプロモーターの制御下の別個のオープンリーディングフレーム中にありうる。以下の詳細な記述から、構成的若しくは誘導可能なプロモーターの多様な組合せを、この融合タンパク質ユニットが置かれる用途（例えばアブレーターの発現のため）に依存してこのユニットの２成分中で利用しうることが明らかであろう。一態様において、該二量体化可能な融合タンパク質ユニットは、例えばＺｎフィンガーモチーフ、ホメオドメインモチーフ、ＨＭＧボックスドメイン、ＳＴＡＴタンパク質、Ｂ３、へリックス−ループ−へリックス、ウィングドへリックス−ターン−へリックス、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックス、ウィングドへリックス、ＰＯＵドメイン、リプレッサーのＤＮＡ結合ドメイン、癌遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン、および６塩基対超を認識する天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を包含するＤＮＡ結合ドメインを含有する。
「二量体化剤」は、ＴＦドメイン融合タンパク質若しくは二量体化可能な融合タンパク質のヘテロ二量体化可能な結合ドメインを結合し得そして該融合タンパク質の二量体化若しくはオリゴマー化を誘導し得る、化合物若しくは他の部分を指す。典型的に、二量体化剤は製薬学的組成物として被験体に送達される。
「副作用」は、本発明の複製欠損ウイルス組成物の投与を介して患者に送達されたトランスジーン産物の所望の治療効果に加えて患者で発生する望ましくない二次的影響を指す。
「複製欠損ウイルス」若しくは「ウイルスベクター」は、複製欠損ウイルス粒子にパッケージングされている目的の遺伝子を含有する合成すなわち人工ゲノム；すなわち標的細胞を感染させ得るがしかし子孫ビリオンを生成し得ない粒子を指す。ウイルスベクターの人工ゲノムは、複製するのに必要とされる酵素をコードする遺伝子を包含しない（該ゲノムは、「ガッツレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」、すなわち該人工ゲノムの増幅およびパッケー
ジングに必要とされるシグナルにより隣接されている目的のトランスジーンのみを含有する、であるように操作し得る）。従って、複製および子孫ビリオンによる感染は複製に必要とされるウイルス酵素の存在下を除き起こり得ないため、それは遺伝子治療での使用に安全と思われる。
「ウイルスストック」若しくは「複製欠損ウイルスのストック」は、同一の人工／合成ゲノムをパッケージングするウイルスベクター（言い換えれば、均質なすなわちクローン集団）を指す。
「キメラの操作されたアブレーター」若しくは「キメラ酵素」は、結合ドメインに融合されているエンドヌクレアーゼアブレーターの触媒ドメインをコードする配列および結合ドメインに融合されているエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインをコードする配列が共発現される場合に提供される。キメラの操作されている酵素は二量体であり、ＤＮＡ結合ドメインは、例えばＺｎフィンガーおよび他のホメオドメインモチーフ、ＨＭＧボックスドメイン、ＳＴＡＴタンパク質、Ｂ３、へリックス−ループ−へリックス、ウィングドへリックス−ターン−へリックス、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックス、ウィングドへリックス、ＰＯＵドメイン、リプレッサーのＤＮＡ結合ドメイン、癌遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン、ならびに６塩基対超を認識する天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合ドメインのなかから選択しうる。［１９９５年７月２５日に発行された米国特許第５，４３６，１５０号明細書］。ヘテロ二量体が形成される場合、結合ドメインは所望の酵素生物活性、ＤＮＡ結合特異性、および／若しくは該アブレーターの転写を提供するために二量体化を誘導する薬理学的作用剤に特異的である。典型的には、二重ドメインすなわち容易に分離可能である触媒ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを有する酵素を選択する。一態様において、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが選択される。一態様において、ＡＴＰ加水分解に依存しない２個の機能ドメインを有するエンドヌクレアーゼに基づきキメラエンドヌクレアーゼを設計する。有用なヌクレアーゼは、ＦｏｋＩのようなＩＩ型Ｓエンドヌクレアーゼ若しくはＮａｅ Ｉのようなエンドヌクレアーゼを包含する。別の適するエンドヌクレアーゼは例えばＩ−ＴｅｖＩのようなイントロンエンドヌクレアーゼのなかから選択しうる。なお他の適するヌクレアーゼは、例えばインテグラーゼ（組み込みを触媒する）、セリン組換え酵素（組換えを触媒する）、チロシン組換え酵素、インベルターゼ（例えばＧｉｎ）（転化を触媒する）、リゾルバーゼ（例えばＴｎ３）、および転座、切開（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、挿入、欠失、分解若しくは交換を触媒するヌクレアーゼを包含する。しかしながら他の適するヌクレアーゼを選択しうる。
二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図１Ａは、二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含んでなる以下のＤＮＡ構築物すなわちｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−ＩＲＥＳ−１ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅのマップである。図１Ｂはプラスミドバックボーンに挿入された転写ユニットの漫画である。多様なベクタードメインの記述は本明細書の８．１節に見出し得る。 二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図２Ａは、二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含んでなる以下のＤＮＡ構築物すなわちｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅのマップである。図２Ｂはプラスミドバックボーンに挿入された転写ユニットの漫画である。多様なベクタードメインの記述は本明細書の８．１節に見出し得る。 二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図３Ａは、二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含んでなる以下のＤＮＡ構築物すなわちｐＡＡＶ．ＣＭＶ１７３．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−３ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅのマップである。図３Ｂはプラスミドバックボーンに挿入された転写ユニットの漫画である。多様なベクタードメインの記述は本明細書の８．１節に見出し得る。 二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図４Ａは、二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットを含んでなる以下のＤＮＡ構築物すなわちｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．ＩＳｃｅ−Ｉのマップである。図４Ｂはプラスミドバックボーンに挿入された転写ユニットの漫画である。多様なベクタードメインの記述は本明細書の８．１節に見出し得る。 トランスジーンユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図５Ａは、トランスジーンユニットを含んでなる以下のＤＮＡ構築物すなわちｐＥＮＮ．ＣＭＶ．ＰＬｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０のマップである。図５Ｂはプラスミドバックボーンに挿入された転写ユニットの漫画である。多様なベクタードメインの記述は本明細書の８．２節に見出し得る。 トランスジーンユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図６Ａは、トランスジーンユニットを含んでなる以下のＤＮＡ構築物すなわちｐＥＮＮ．ＣＭＶ．ＰＩＳｃｅＩ．ＵＣ．ＳＶ４０のマップである。図６Ｂはプラスミドバックボーンに挿入された転写ユニットの漫画である。多様なベクタードメインの記述は本明細書の８．２節に見出し得る。 二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびトランスジーンユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図７はトランスジーンユニットおよび二量体化可能な転写因子ドメインユニットを含有するベクターのマップである。多様なベクタードメインの記述は本明細書の８．１節および８．２節に見出し得る。 ラパマイシン処理後のルシフェラーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導である。図８Ａは、ラパマイシンで処理された若しくは処理されないのいずれかの４８時間後の示されるＤＮＡ構築物（ＤＮＡ構築物１ないし６）でトランスフェクトされた細胞中の相対ルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。図８Ｂは、ラパマイシンで処理された若しくは処理されないのいずれかの７２時間後の示されるＤＮＡ構築物（ＤＮＡ構築物１ないし６）でトランスフェクトされた細胞中の相対ルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。 二量体化剤で誘導可能な系のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、マウスの４群が以下のＤＮＡ構築物を含有するＡＡＶベクターのＩＶ注入を受領した。図９Ａは、ＡＡＶベクターを介して群１マウスに送達された、遍在性構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にＧＦＰ−ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ構築物の図解である。図９Ｂは、ＡＡＶベクターを介して群２マウスに送達された、（１）ＣＭＶプロモーターにより駆動される二量体化可能な転写因子ドメインユニット（ｐ６５活性化ドメインと融合されているＦＲＢ、および３コピーのＦＫＢＰと融合されているＤＮＡ結合ドメインＺＦＨＤ）；ならびに（２）二量体化されたＴＦにより誘導されるプロモーターにより駆動されるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクター、をコードするＤＮＡ構築物の図解である。図９Ｃは、ＡＡＶベクターを介して群３マウスに送達された、肝構成的プロモーターＴＢＧの制御下にＧＦＰ−ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ構築物の図解である。図９Ｄは、ＡＡＶベクターを介して群４マウスに送達された、（１）ＴＢＧプロモーターにより駆動される二量体化可能な転写因子ドメインユニットを発現するＡＡＶベクター；および（２）二量体化されたＴＦにより誘導されるプロモーターにより駆動されるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクター、をコードするＤＮＡ構築物の図解である。 ルシフェラーゼの基質ルシフェリンの注入３０分後に多様なＤＮＡ構築物を含有するＡＡＶウイルスの３×１０11粒子を受領した４群のマウスの画像である。図１０Ａは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）の群１のマウスの多様な組織、主に肺、肝および筋でのルシフェラーゼ発現を示す。図１０Ｂは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）の群２のマウスの主に肝および筋でのルシフェラーゼ発現を示す。図１０Ｃは、ラパマイシン投与後（「Ｐｏｓｔ」）の主に肝および筋でのルシフェラーゼ発現を示し、かつ、群３のマウスでラパマイシン投与前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現が存在しないことを示す。図１０Ｄは、ルシフェラーゼ発現が肝ラパマイシン投与後（「Ｐｏｓｔ」）に制限されることを示し、かつ、ラパマイシン投与前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現が存在しないことを示す。 ルシフェラーゼの基質ルシフェリンの注入３０分後に多様なＤＮＡ構築物を含有するＡＡＶウイルスの１×１０11粒子を受領した４群のマウスの画像である。図１Ａは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）の群１のマウスの多様な組織、主に肺、肝および筋でのルシフェラーゼ発現を示す。図１１Ｂは、ラパマイシン投与の前（「Ｐｒｅ」）および後（「Ｐｏｓｔ」）の群２のマウスの主に肝および筋でのルシフェラーゼ発現を示す。図１１Ｃは、ラパマイシン投与後（「Ｐｏｓｔ」）の主に肝および筋でのルシフェラーゼ発現を示し、かつ、群３のマウスでラパマイシン投与前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現が存在しないことを示す。図１１Ｄは、ルシフェラーゼ発現が肝（「Ｐｏｓｔ」）ラパマイシン投与に制限されることを示し、かつ、ラパマイシン投与前（「Ｐｒｅ」）にルシフェラーゼ発現が存在しないことを示す。 ＡＭＤを処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図１２Ａは可溶性ＶＥＧＦ受容体ｓＦｌｔ−１をコードするトランスジーンユニットを含んでなるＤＮＡ構築物を示す。図１２Ｂは、ＩＲＥＳにより調節されるＡｖａｓｔｉｎ ＩｇＧ Ｈ鎖（ＡｖａｓｔｉｎＨ）およびＬ鎖（ＡｖａｓｔｉｎＬ）を含んでなる２シストロン性ＤＮＡ構築物を示す。図１２Ｃは、Ｔ２Ａ配列により分離されているＡｖａｓｔｉｎ ＩｇＧ Ｈ鎖（ＡｖａｓｔｉｎＨ）およびＬ鎖（ＡｖａｓｔｉｎＬ）を含んでなる２シストロン性ＤＮＡ構築物を示す。 肝代謝性疾患を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図１３Ａは第ＩＸ因子を含んでなるトランスジーンを含有する血友病Ａおよび／若しくはＢを処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。図１３ＢはＨＣＶのＩＲＥＳを標的とするｓｈＲＮＡの送達のためのＤＮＡ構築物を示す。 心疾患を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図１４Ａは、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１）を含んでなるトランスジーンユニットを含有するうっ血性心不全を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。図１４Ｂは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含んでなるトランスジーンユニットを含有するうっ血性心不全を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。 ＣＮＳ疾患のためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物である。図１５は、神経成長因子（ＮＧＦ）を含んでなるトランスジーンユニットを含有するアルツハイマー病を処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。 ＨＩＶ処置のためのＰＩＴＡ系である。図１６は、ＨＩＶ抗体のＨおよびＬ鎖を含んでなるトランスジーンユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物、ならびにアブレーションユニットおよび二量体化可能なＴＦドメインユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。図１６はまた、ラパマイシンアナログ（ラパログ）がアブレーターｃｒｅの発現を誘導してトランスジーンユニットを含有するＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物からトランスジーン（ＨＩＶ抗体のＨおよびＬ鎖）をアブレートし得ることも示す。 ＰＩＴＡ系の一態様の具体的説明である。図１７は、構成的プロモーターと作動的関連の各転写因子ドメイン融合配列を伴う、構成的プロモーターと作動的関連にある治療的抗体をコードするトランスジーンユニット、転写因子で誘導可能なプロモーターと作動的関連にあるエンドヌクレアーゼをコードするアブレーションユニット、および二量体化可能なＴＦドメインユニットを示す。ラパマイシン若しくはラパログの投与前に、治療的抗体および２種の転写因子ドメイン融合タンパク質のベースライン発現が存在する。ラパマイシン投与に際して、二量体化された転写因子がエンドヌクレアーゼの発現を誘導し、それがトランスジーンユニット中のエンドヌクレアーゼ認識ドメインを切断し、それによりトランスジーン発現をアブレートする。 野生型ＦｏｋＩが、ＦｏｋＩのアブレーション部位を含有するトランスジーンを含有するＤＮＡプラスミドをＦｏｋＩ酵素をコードするプラスミドとともに標的細胞にコトランスフェクトした場合にトランスジーンの発現を効果的なアブレートしたことを具体的に説明する棒グラフである。図１８Ａ、棒１は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを表し、棒２は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋２００ｎｇのｐＣＭＶ．ＦｏｋＩを表し、棒３は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋トランスフェクトされたＦｏｋＩタンパク質を表し、棒４はトランスフェクトされたＦｏｋＩタンパク質のみを表し；棒５はトランスフェクトされない対照を表す。図１８Ｂ、棒１は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃ単独を表し、その後の棒は、ｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅとコトランスフェクトされた増大する濃度のＺＦＨＤ−ＦｏｋＩ発現プラスミド（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を表す。この研究は実施例１１Ａに記述する。 ＺｎフィンガーホメオドメインによりＤＮＡ上の非同族（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ）認識部位に繋ぎ止められているキメラの操作されている酵素がトランスジーンの発現を効果的にアブレートすることを具体的に説明する棒グラフである。図１９Ａは、ｐＣＭＶ．ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅとコトランスフェクトされた、増大する濃度の、繋ぎ止められていないＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）を比較する。第一の棒は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃ単独の陽性対照を提供する。図１９Ｂは、ｐＣＭＶ．ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅとコトランスフェクトされた、増大する濃度の、Ｚｎフィンガーホメオドメインとの融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）を比較する。第一の棒は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃ単独の対照を提供する。この研究は実施例１１Ｂに記述する。 キメラＦｏｋＩのＤＮＡ結合特異性が多様な分類の異種ＤＮＡ結合ドメインとの融合により変化され再現可能であり得、また、標的トランスジーンのアブレーションが異種核局在化シグナル（ＮＬＳ）の付加的なもの（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）によりさらに改良され得ることを具体的に説明する棒グラフである。図２０Ａは、増大する濃度の、ＨＴＨ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）とのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのコトランスフェクションの結果を具体的に説明する。第一の棒は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ単独を示す対照である。図２０Ｂは、増大する濃度の、そのＮ末端にＮＬＳをさらに有するＨＴＨ−ＦｏｋＩ融合をコードする発現プラスミド（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）とのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのコトランスフェクションの結果を具体的に説明する。第一の棒は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ単独を示す対照である。この研究は実施例１１Ｃに記述する。 本明細書に記述されるところのアブレーション認識部位での使用のための独特の核酸配列の選択方法のフローチャートである。
発明の詳細な記述
本発明は、薬理学的作用剤、好ましくは経口製剤例えば丸剤に応答して永続的に若しくは一時的にのいずれかで治療的遺伝子産物をアブレートするための内蔵式安全機構を伴い操作されている複製欠損ウイルス組成物（１種若しくは複数）を使用する、被験体への治療的産物の送達のため設計された遺伝子治療系に関する。
ＰＩＴＡ系において、１種若しくはそれ以上の複製欠損ウイルスを、ウイルスゲノム（１種若しくは複数）が、（ａ）転写を制御するプロモーターと作動的関連の治療的産物をコードする第一の転写ユニットであって、前記ユニットは最低１個のアブレーション認識部位を含有し；および（ｂ）薬理学的作用剤に応答して転写を誘導するプロモーターと作動的関連のアブレーション認識部位に特異的なアブレーター（若しくは融合タンパク質ユニットの一部としてのそのフラグメント）をコードする第二の転写ユニット、を含有するよう操作されている複製欠損ウイルス組成物中で使用する。選択された結合ドメインのドメインを特異的に二量体化するいかなる薬理学的作用剤も使用し得る。一態様において、ラパマイシンおよび「ラパログ」と称されるそのアナログを使用し得る。
第一の転写ユニットを含有するウイルスゲノムは、同一のアブレーション認識部位の２個若しくはそれ以上、または２個若しくはそれ以上の異なるアブレーション認識部位（すなわち、他のアブレーション認識部位（１個若しくは複数）を認識するものと異なるアブレーターに特異的な部位である）を含有しうる。同一にしろ異なるにしろ、こうした２個若しくはそれ以上のアブレーション認識部位は相互に縦列に配置されうるか、または他者と連続しない位置に配置されうる。さらに、アブレーション認識部位（１個若しくは複数）は、トランスジーンの相対のコーディング配列をいかなる位置に、すなわちトランスジーンコーディング配列内、コーディング配列に対し５’（直接５’、または例えばプロモーターの上流若しくは下流に１若しくはそれ以上の塩基により分離されるのいずれか）、あるいはコーディング配列に対し３’（例えば直接３’または例えばポリＡ配列の上流に１若しくはそれ以上の塩基により分離されるかのいずれか）に配置されてもよい。
アブレーターは、（ａ）トランスジーンユニットのアブレーション認識部位（１個若しくは複数）（ＡＲＳ）を特異的に認識／結合しかつ該トランスジーンを切断する若しくは切り出すか；または（ｂ）転写されたトランスジーンユニットのアブレーション認識ＲＮＡ配列（ＡＲＲＳ）を特異的に認識／結合しかつ該ｍＲＮＡ転写物を切断する若しくはその翻訳を阻害するかのいずれかである、いかなる遺伝子産物すなわち翻訳若しくは転写産物でもある。本明細書で使用されるところのアブレーターは、第一の転写ユニット中のアブレーション認識部位に結合しかつＤＮＡを切り出す若しくはアブレートするエンドヌクレアーゼ、組換え酵素、メガヌクレアーゼ、若しくはＺｎフィンガーエンドヌクレアーゼ、および第一の転写ユニットのＲＮＡ転写物をアブレートする若しくは第一の転写ユニットのＲＮＡ転写物の翻訳を抑制する干渉ＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンスよりなる群から選択しうる。特定の一態様において、アブレーターはＣｒｅ（そのアブレーション認識部位としてｌｏｘＰを有する）であるか、若しくはアブレーターはＦＬＰ（そのアブレーション認識部位としてＦＲＴを有する）である。一態様において、ＡＴＰ加水分解と独立に機能するエンドヌクレアーゼが選択される。こうしたアブレーターの例は、ＩＩ型Ｓエンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、ＮａｅＩ、およびイントロンエンドヌクレアーゼ（例えばＩ−ＴｅｃＩのような）、インテグラーゼ（組み込みを触媒する）、セリ
ン組換え酵素（組換えを触媒する）、チロシン組換え酵素、インベルターゼ（例えばＧｉｎ）（転化を触媒する）、リゾルバーゼ（例えばＴｎ３）、ならびに転座、解離、挿入、欠失、切開若しくは交換を触媒するヌクレアーゼを包含しうる。しかしながら他の適するヌクレアーゼを選択しうる。
治療的トランスジーンの永続的活動停止のため、アブレーターは、第一の転写ユニット中のアブレーション認識部位（１個若しくは複数）に結合しかつ該トランスジーンをアブレートする若しくは切り出すエンドヌクレアーゼであり得る。トランスジーンの一時的活動停止が望ましい場合、治療的トランスジーンのＲＮＡ転写物中のアブレーション認識部位（１個若しくは複数）に結合しかつ該転写物をアブレートするすなわちその翻訳を阻害するアブレーターを選ぶべきである。この場合、干渉ＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス系を使用し得る。該系は、治療的トランスジーンが癌、当業者に容易に明らかであろう多様な遺伝病を処置する若しくは宿主免疫応答を媒介するために投与される場合にとりわけ望ましい。
アブレーターの発現は、例えば誘導可能なプロモーターを包含する１個若しくはそれ以上の配列により、および／または本明細書に記述されるようなホモ二量体若しくはヘテロ二量体融合タンパク質系を利用するキメラアブレーターの使用により制御しうる。ホモ二量体系の使用を選択する場合、アブレーターの発現は誘導可能なプロモーターにより制御される。ヘテロ二量体系の使用を選択する場合、アブレーターの発現は、薬理学的作用剤および場合によっては該ヘテロ二量体系を形成する融合タンパク質の一方若しくは双方のさらなる誘導可能なプロモーターの付加的なもの（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）により制御される。一態様において、ホモおよびヘテロ二量体化可能なアブレーターを、転写因子制御因子を含む構築物に安全のための付加的な層を提供するために選択する。これらの系は本明細の後でより詳細に記述される。
限定されるものでないがアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）；アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルス；などを挙げることができる遺伝子治療に適するいかなるウイルスも使用しうる。好ましい態様において、使用される複製欠損ウイルスはアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９若しくはｒｈ１０がヒト被験体での使用にとりわけ魅力的である。パッケージングのためのＡＡＶゲノムの大きさの制約により、転写ユニットを操作しかつ２種若しくはそれ以上のＡＡＶストックにパッケージングし得る。本発明のウイルス組成物として使用される１種のウイルスストックにパッケージングされるにせよ、本発明のウイルス組成物を形成する２種若しくはそれ以上のウイルスストックにパッケージングされるにせよ、処置に使用されるウイルスゲノムは、治療的トランスジーンおよびアブレーターをコードする第一および第二の転写ユニットを集合的に含有しなければならず；そしてさらに付加的な転写ユニットを含みうる。例えば、第一の転写ユニットを１種のウイルスストックにパッケージングし得、ならびに第二、第三および第四の転写ユニットを第二のウイルスストックにパッケージングし得る。あるいは、第二の転写ユニットを１種のウイルスストックにパッケージングし得、ならびに第一、第三および第四の転写ユニットを第二のウイルスストックにパッケージングし得る。大きさによりＡＡＶに有用ながＡＡＶゲノムのパッケージングにおいて含有する一方、他のウイルスを本発明のウイルス組成物を製造するために使用しうる。別の態様において、それらが複数のウイルスを含有する本発明のウイルス組成物は異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有しうる。
一態様において、本発明のウイルス組成物は、上述されるところのような組合せに２種若しくはそれ以上の異なるＡＡＶ（若しくは別のウイルス）ストックを含有する。例えば、ウイルス組成物は、アブレーター認識部位および第一のアブレーターとともに治療的遺
伝子を含んでなる第一のウイルスストックならびに付加的なアブレーター（１種若しくは複数）を含有する第二のウイルスストックを含有しうる。別のウイルス組成物は、治療的遺伝子およびアブレーターのフラグメントを含んでなる第一のウイルスストックならびにアブレーターの別のフラグメントを含んでなる第二のウイルスストックを含有しうる。本発明のウイルス組成物の２種若しくはそれ以上のウイルスストックの多様な他の組合せが本系の成分の記述から明らかであろう。
一態様において、組成物は制御されるトランスジーン発現アブレーション系を有する治療的産物の送達のための系に１種若しくはそれ以上のＡＡＶベクターを含有する。該組成物中の最低１種のＡＡＶベクターは、（ｉ）転写を制御するプロモーターに作動可能に連結されている治療的産物をコードする核酸配列；および（ｉｉ）最低１０個（１０×）のＺｎフィンガーにより特異的かつ選択的に認識される最低３０核酸塩基対の配列を含んでなる最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位であって、前記最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位は該治療的産物をコードする配列に対し少なくとも５’に配置され；ならびに（ｂ）プロモーターと作動的関連の機能的エンドヌクレアーゼ触媒ドメインに連結されているＺｎフィンガードメインの最低１０コピーを含んでなるキメラエンドヌクレアーゼを含んでなる最低１種のアブレーターであって、ここで転写および／若しくはアブレーション活性は薬理学的作用剤に応答して誘導され、前記最低１０個（１０×）のＺｎフィンガードメインは前記最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位中の前記最低約３０塩基対配列を特異的かつ選択的に認識しならびに最低１０個の独立に選択された認識へリックスを含んでなる、を含んでなる核酸分子を含有する。一態様において、エンドヌクレアーゼ触媒ドメインはＦｏｋＩ触媒ドメインである。さらなる一態様において、アブレーター（ｂ）は薬理学的作用剤により二量体化された後に転写因子により活性化されるカセットにより制御され、前記カセットは２個の転写ユニットを含んでなり、ここで前記２個の転写ユニットの一方は第一のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；ならびに、前記２個の転写ユニットの第二は第二のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子の活性化ドメインをコードする。選択される結合ドメインのドメインを特異的に二量体化するいかなる薬理学的作用剤も使用し得る。一態様において、ラパマイシンおよび「ラパログ」と称されるそのアナログを使用し得る。
ウイルスゲノム（１種若しくは複数）内にスペースを保存するため、２シストロン性転写ユニットを操作し得る。例えば、同一プロモーターにより調節され得る転写ユニット、例えば第三および第四の転写ユニット（ならびに該当する場合は治療的トランスジーンをコードする第一の転写ユニット）を、ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）若しくは２Ａペプチドを含有する２シストロン性ユニットとして操作し得、それは翻訳後事象で自己切断し（例えばフリン−２Ａ）、かつ、トランスジーン（若しくはアブレーターコーディング配列）が大型であるか、多サブユニットよりなるか、または２種のトランスジーンが所望のトランスジーン（１種若しくは複数）を運搬する共送達される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であるか、あるいはサブユニットがそれらがｉｎ ｖｉｖｏでコンカタメライズ（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚｅ）して単独ベクターゲノムを形成することを可能にするよう共投与される場合に、単独プロモーターからのメッセージにより異種遺伝子産物の共発現を可能にする。こうした一態様において、第一のＡＡＶは単独トランスジーンを発現する発現カセットを運搬することができ、および第二のＡＡＶは宿主細胞中での共発現のため異なるトランスジーンを発現する発現カセットを運搬しうる。しかしながら、選択されたトランスジーンはいかなる生物学的に活性の産物若しくは他の産物例えば研究に望ましい産物もコードしうる。単独プロモーターが、自己切断ペプチド（例えば２Ａペプチド、Ｔ２Ａ）若しくはプロテアーゼ認識部位（例えばフリン）をコードする配列により相互から分離されている２若しくは３種の異種遺伝子（例えば第三および第四の転写ユニット、な
らびに該当する場合は治療的トランスジーンをコードする第一の転写ユニット）を単独オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に含有するＲＮＡの発現を指図しうる。該ＯＲＦは従って、翻訳の間（Ｔ２Ａの場合に）若しくは後のいずれかに個々のタンパク質に切断される単独ポリタンパク質をコードする。これらＩＲＥＳおよびポリタンパク質系を使用してＡＡＶのパッケージングのスペースを確保し、それらは同一プロモーターにより駆動され得る成分の発現にのみ使用し得る。
本発明は、複製欠損ウイルス組成物の製造のため細胞株を操作するのに使用されるＤＮＡ構築物；複製欠損ウイルス組成物の生産（ｐｒｏｄｕｃｅ）および製造（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）方法；植物、細菌、哺乳動物細胞などを包含する多様な細胞型および系での発現、ならびに獣医学処置（例えば家畜および他の哺乳動物における）を包含する遺伝子移入ならびにヒト被験体における遺伝子治療を包含するｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏ治療のための複製欠損ウイルス組成物を使用する処置方法にもまた関する。
５．１．トランスジーンアブレーション系
本発明は、トランスジーン若しくはその転写産物に特異的なアブレーターの発現を誘導する小分子を含有する薬理学的作用剤好ましくは経口製剤例えば丸剤に応答して永続的に若しくは一時的にのいずれかで治療的遺伝子産物をアブレートするための内蔵式安全機構を伴い操作されている複製欠損ウイルス組成物を使用するトランスジーン（治療的産物すなわちタンパク質若しくはＲＮＡをコードする）の送達のため設計される薬理学的に誘導されるトランスジーンアブレーション（ＰＩＴＡ）系を提供する。しかしながら薬理学的作用剤の他の送達経路を選択しうる。
該ＰＩＴＡ系において、ウイルスゲノム（１種若しくは複数）がトランスジーンユニット（本明細書の５．１．１節に記述される）およびアブレーションユニット（本明細書の５．１．２節に記述される）を含有するよう操作されている１種若しくはそれ以上の複製欠損ウイルスを使用する。具体的には、ウイルスゲノム（１種若しくは複数）が（ａ）転写を制御するプロモーターと作動的関連の治療的産物をコードする第一の転写ユニットであって、前記ユニットは最低１個のアブレーション認識部位を含有し（トランスジーンユニット）；および（ｂ）薬理学的作用剤に応答して転写を誘導するプロモーターと作動的関連のアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第二の転写ユニット（アブレーションユニット）を含有するよう操作されている、１種若しくはそれ以上の複製欠損ウイルスを使用する。
一態様において、複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１種若しくは複数）が二量体化可能なドメインユニット（５．１．３節に記述される）を含有するようさらに操作されているようなＰＩＴＡ系が設計される。一態様において、二量体化可能なＴＦドメインユニットを送達することにより、標的細胞は、それぞれ二量体化剤結合ドメインに融合されている、２種の融合タンパク質、すなわちアブレーターを制御する誘導可能なプロモーターを結合する転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含有する一方およびアブレーターを制御する誘導可能なプロモーターを活性化する転写因子の転写活性化ドメイン（ＡＤ）を含有する他方、を共発現するよう改変される（５．１．３節に記述される）。双方の融合タンパク質中に存在する二量体化剤結合ドメインと同時に相互作用し得る薬理学的作用剤すなわち「二量体化剤」（５．１．４節に記述される）の添加が、調節されるプロモーターへのＡＤ融合タンパク質の補充をもたらし、該アブレーターの転写を開始する。例えば、そのそれぞれが引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３４，２６６号明細書および米国特許第７，１０９，３１７号明細書に記述されるＡｒｉａｄ ＡＲＧＥＮＴ(R)系を参照されたい。リガンドおよび適切なミニマルプロモーターの非存在下で相互に対する親和性を有しない二量体化剤結合ドメインを使用することにより、転写が該二量体化剤の添加に絶対的に依存性にされる。
この目的のため、複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１種若しくは複数）を、それぞれ第二の転写ユニット中のアブレーターの誘導可能なプロモーターを調節する転写因子の二量体化可能なドメインをコードする第三および第四の転写ユニット（二量体化可能なＴＦドメインユニット）を含有するようさらに操作し得、ここで（ｃ）第三の転写ユニットは構成的プロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；および（ｄ）第四の転写ユニットはプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子の活性化ドメインをコードする。一態様において、二量体化可能なＴＦドメインの各成分は構成的プロモーター下で発現される。別の態様において、二量体化可能なＴＦドメインユニットの最低１成分が誘導可能なプロモーター下で発現される。
ＰＩＴＡ系の一態様を図２４に具体的に説明し、これは、構成的プロモーターと作動的関連の各転写因子ドメイン融合配列を伴う、構成的プロモーターと作動的関連にある治療的抗体をコードするトランスジーンユニット、転写因子で誘導可能なプロモーターと作動的関連にあるエンドヌクレアーゼをコードするアブレーションユニット、および二量体化可能なＴＦドメインユニットを示す。ラパマイシン若しくはラパログの投与前に、治療的抗体および２種の転写因子ドメイン融合タンパク質のベースライン発現が存在する。ラパマイシン投与に際して、二量体化された転写因子がエンドヌクレアーゼの発現を誘導し、これがトランスジーンユニット中のエンドヌクレアーゼ認識ドメインを切断してそれによりトランスジーン発現をアブレートする。
一態様において、ＰＩＴＡ系で使用される複製欠損ウイルスはアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）である（５．１．５節に記述される）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９若しくはＡＡＶ１０はヒト被験体での使用にとりわけ魅力的である。パッケージングのためのＡＡＶゲノムの大きさの制約により、該転写ユニットは２種若しくはそれ以上のＡＡＶストックに操作かつパッケージングし得る。例えば、第一の転写ユニットを１種のＡＡＶストックにパッケージングし得、ならびに第二、第三および第四の転写ユニットを第二のＡＡＶストックにパッケージングし得る。あるいは、第二の転写ユニットを１種のＡＡＶストックにパッケージングし得、ならびに第一、第三および第四の転写ユニットを第二のＡＡＶストックにパッケージングし得る。
５．１．１．トランスジーンユニット
該ＰＩＴＡ系において、ウイルスゲノム（１種若しくは複数）がトランスジーンユニットを含有するよう操作されている１種若しくはそれ以上の複製欠損ウイルスを使用する。本明細書で使用されるところの「トランスジーンユニット」という用語は、（１）トランスジーンをコードするＤＮＡ配列；（２）トランスジーン若しくはその発現調節領域（例えばプロモーターの上流若しくは下流および／またはポリＡシグナルの上流）を包含する、それ内若しくはそれに隣接するトランスジーン発現を混乱させる場所に含有される最低１個のアブレーション認識部位（ＡＲＳ）；ならびに（３）トランスジーンの発現を調節するプロモーター配列、を含んでなるＤＮＡを指す。トランスジーンをコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または、例えばトランスジーンの発現を高めうる１個若しくはそれ以上のイントロンを包含するｃＤＮＡであり得る。トランスジーンの除去のため設計される系において、使用されるＡＲＳは、トランスジーンをアブレートする若しくは切り出すアブレーター（５．１．２節に記述される）により認識されるもの、例えば、限定されるものでないが組換え酵素（例えばＣｒｅ／ｌｏｘＰ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系）、メガヌクレアーゼ（例えばＩ−Ｓｃｅｌ系）、人工制限酵素系，若しくはＺｎフィンガーヌクレアーゼのような別の人工制限酵素系、またはヒトゲノム中にまれに存在する制限部位に特異的な制限酵素、などを挙げることができるエンドヌクレアーゼ認識配列である。トランスジーンの発現を抑制するため、ＡＲＳはアブレーション認識ＲＮＡ配列（ＡＲＲＳ
）すなわちトランスジーンの転写産物若しくはそのｍＲＮＡの翻訳をアブレートするアブレーターにより認識されるＲＮＡ配列例えばリボザイム認識配列、ＲＮＡｉ認識配列若しくはアンチセンス認識配列をコードし得る。
本発明のトランスジーンユニット中で操作され得るトランスジーンの例は、限定されるものでないが、ＨＩＶ感染性を中和する抗体若しくは抗体フラグメント、ＶＥＧＦ抗体、ＴＮＦ−α抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ）、ＥＧＦ−Ｒ抗体、バシリキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ−ＣＬＬ、ダクリズマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、パビリズマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アダリムマブのような治療的抗体、または前述の治療的抗体のいずれかの抗体フラグメント；可溶性血管内皮細胞増殖因子受容体−１（ｓＦＩｔ−１）、可溶性ＴＮＦ−ａ受容体（例えばエタネルセプト）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インスリン、インスリン様増殖因子（１ＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＴＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＲＯ−１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、β−ＩＦＮ、ＩＬ−６、抗ＥＧＦＲ抗体、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ β−１ ａ、抗ＣＤ２０抗体、グルカゴン様ペプチド−ｌ（ＧＬＰ−ｌ）、抗細胞接着分子、ａ４−インテグリン抗体、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＤＣＣ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ガラニン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−８ファミリーからのケモカイン、ＢＣｌ２、ＩＬ−１０、治療的ｓｉＲＮＡ、治療的ｕ６タンパク質、エンドスタチン、プラスミノーゲン若しくはそのフラグメント、ＴＩＭＰ３、ＶＥＧＦ−Ａ、ＲＩＦＩ α、ＰＥＤＦ、またはＩＬ−１受容体アンタゴニストをコードするトランスジーンを挙げることができる。
トランスジーンは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、組織特異的プロモーター、若しくは生理学的合図により調節されるプロモーターの制御下にあり得る。
治療的産物の発現を制御するのに適する構成的プロモーターの例は、限定されるものでないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、Ｕ６プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ユビキチンプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６２６−４６３０（１９９１）、アデノシン脱アミノ酵素プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター ホスホグリセロールムターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｌａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１０００６−１００１０（１９８９》、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、ならびに当業者に既知の他の構成的プロモーターを挙げることができる。
治療的産物の発現を制御するのに適する誘導可能なプロモーターは、外因性剤（例えば薬理学的作用剤）若しくは生理学的合図に応答性のプロモーターを包含する。これらの応答配列は、限定されるものでないが、ＨＩＦ−Ｉαおよびβを結合する低酸素応答配列（ＨＲＥ）、テトラサイクリン応答配列（ＧｏｓｓｅｎとＢｕｊａｒｄ（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５１）により記述されるような；エクダイソンで誘導可能な応答配列（Ｎｏ Ｄら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−３３５１）Ｍａｙｏら（１９８２、Ｃｅｌｌ ２９：９９−１０８）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）およびＳｅａｒｌｅら（１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９）により記述されるような金属イオン応答配列；Ｎｏｕｅｒら（Ｈｅａ
ｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、フロリダ州ボーカラートン、ｐｐＩ６７−２２０、１９９１中）により記述されるような熱ショック応答配列；若しくはＬｅｅら（１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８−２３２）；Ｈｙｎｅｓら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０３８−２０４２、１９８１）；Ｋｌｏｃｋら（Ｎａｔｕｒｅ ３２９：７３４−７３６、１９８７）；およびＩｓｒａｅｌとＫａｕｆｍａｎ（１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４）により記述されるようなホルモン応答配列、ならびに当該技術分野で既知の他の誘導可能なプロモーターを挙げることができる。好ましくは、応答配列はエクダイソンで誘導可能な応答配列であり、より好ましくは該応答配列はテトラサイクリン応答配列である。
本発明での使用に適する組織特異的プロモーターの例は、限定されるものでないが表１に列挙されるものおよび当該技術分野で既知の他の組織特異的プロモーターを挙げることができる。
例えば、そして制限としてでなく、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、ヒト被験体における急速進行型黄斑変性を処置するためのＶＥＧＦアンタゴニスト；ヒト被験体における血友病Ａを処置するための第ＶＩＩＩ因子；ヒト被験体における血友病Ｂを処置するための第ＩＸ因子；ヒト被験体におけるうっ血性心不全を処置するためのインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）若しくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；ヒト被験体における中枢神経系障害を処置するための神経成長因子（ＮＧＦ）；またはヒト被験体におけるＨＩＶ感染症を処置するためのＨＩＶに対する中和抗体を送達するのに使用し得る。
なお他の有用な治療的産物は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミ
ング増殖因子αスーパーファミリーのいずれか１種、若しくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１−１５のいずれか、成長因子のヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１種、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシンヒドロキシラーゼを制限なしに包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
他の有用なトランスジーン産物は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）のようなサイトカインおよびリンホカイン、単球化学誘引物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを制限なしに包含する免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を制限なしに包含する。有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質のような補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９もまた包含する。
なお他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１種を包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体およびスカベンジャー受容体を包含するコレステロール調節および／若しくは脂質調節のための受容体を包含する。本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体ならびに他の核受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーのような遺伝子産物もまた包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質例えばＧＡＴＡ−３、ならびにウィングドへリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオンβ合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン遺伝子産物［例えばミニ若しくはマイクロジストロフィン］を包含する。なお他の有用な遺伝子産
物は、酵素の不十分な活性から生じる多様な状態で有用である酵素補充療法で有用でありうるような酵素を包含する。例えば、マンノース−６−リン酸を含有する酵素をリソソーム蓄積症の治療で利用しうる（例えば適する遺伝子はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを包含する）。
５．１．２．アブレーションユニット
該ＰＩＴＡ系で使用される１種若しくはそれ以上の複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１種若しくは複数）は、ここで定義されるところのアブレーションユニットすなわちアブレーターのコーディング配列をさらに含有するよう操作されている。
トランスジーン発現の永続的停止のため、アブレーターは、限定されるものでないが、トランスジーンユニットのＡＲＳに結合しかつトランスジーンをアブレートする若しくは切り出す、組換え酵素、メガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーエンドヌクレアーゼ、若しくはヒトゲノム中にまれに存在する制限部位をもついずれかの制限酵素を挙げることができるエンドヌクレアーゼであり得る。こうしたアブレーターの例は、限定されるものでないがＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（Ｇｒｏｔｈら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７、５９９５−６０００）；ＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｓｏｒｒｅｌｌら、２００５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２３、４３１−４６９）；特異的非対称１８ｂｐ配列（Ｔ ＡＧＧＧＡＴ ＡＡＣＡＧＧＧＴ ＡＡＴ（配列番号２５））を認識するＩ−ＳｃｅＩのようなメガヌクレアーゼ、哺乳動物ゲノム中のまれな配列、そして二本鎖中断を創製する（Ｊａｓｉｎ，Ｍ．、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２、２２４−２２８）；ならびに人工制限酵素（例えば、哺乳動物ゲノムに独特のＡＲＳ配列を標的とするよう操作し得るＤＮＡ切断ドメインにＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインを融合することにより生成されるＺｎフィンガーヌクレアーゼ（Ｍｉｌｌｅｒら、２００８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５：５８０９−５８１４））を挙げることができる。一態様において、アブレーターはホモ二量体若しくはヘテロ二量体融合タンパク質に基づくことができるキメラ酵素である。
トランスジーンの一時的停止が望ましい場合、トランスジーンユニットのＲＮＡ転写物のＡＲＲＳに結合しかつ該転写物をアブレートするすなわちその翻訳を阻害するアブレーターを選ぶべきである。こうしたアブレーターの例は、限定されるものでないが、ＡＲＲＳを認識する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、リボスイッチ（ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ）（Ｂａｙｅｒら、２００５、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３３７−４３）のようなリボザイム若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを挙げることができる。ＡＲＲＳを認識するＲＮＡｉ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは当業者に既知のいずれかの方法を使用して設計かつ構築し得る。この系は、治療的トランスジーンが癌を処置するため若しくは宿主免疫応答を媒介するために投与される場合にとりわけ望ましい。
一態様において、アブレーターの発現は、アブレーター遺伝子の転写に対する緊密な制御を提供する誘導可能なプロモーター、例えば薬理学的作用剤、または薬理学的作用剤若しくは代替の態様においては生理学的合図により活性化される転写因子により制御されなければならない。非漏出性でありかつ緊密に制御し得るプロモーター系が好ましい。アブレーターの発現を制御するのに適する誘導可能なプロモーターは、例えば、限定されるものでないがテトラサイクリン（ｔｅｔ）応答配列（ＧｏｓｓｅｎとＢｕｊａｒｄ（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５１）により記述されるような；エクダイソンで誘導可能な応答配列（Ｎｏ Ｄら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−３３５１）Ｍａｙｏら（１９８２、Ｃｅｌｌ．２９：９９−１０８）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）およびＳｅａｒｌｅら（１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．５：１４８０−１４８９）により記述されるような金属イオン応答配列；Ｎｏｕｅｒら（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、フロリダ州ボーカラートン中、ｐｐｌ６７−２２０、１９９１）により記述されるような熱ショック応答配列；若しくはＬｅｅら（１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８−２３２）；Ｈｙｎｅｓら（１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０３８−２０４２）；Ｋｌｏｃｋら（１９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：７３４−７３６）；およびＩｓｒａｅｌとＫａｕｆｍａｎ（１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４）により記述されるようなホルモン応答配列、ならびに当該技術分野で既知の他の誘導可能なプロモーターを挙げることができる応答配列である。こうしたプロモーターを使用して、アブレーターの発現は、例えばいくつかを挙げればＴｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−９；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８９（１２）：５５４７−５１）；ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ系（Ｕｒｒｕｔｉａ Ｒ．、２００３、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｉ．、４（１０）：２３１；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ Ｕら、１９９５、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（４）：１９０７−１４）；ミフェプリストン（ＲＵ４８６）で調節可能な系（Ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ；Ｗａｎｇ Ｙら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９１（１７）：８１８０−４；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒら、２００５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．１０２（３９）：１３７８９−９４）；ヒト化タモキシフェン−ｄｅｐ調節可能な系（Ｒｏｓｃｉｌｌｉら、２００２、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６（５）：６５３−６３）；ならびにエクダイソン−ｄｅｐ調節可能な系（Ｒｈｅｏｓｗｉｔｃｈ；Ｋａｒｎｓら、２００１、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：１１；Ｐａｌｌｉら、２００３、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０（６）：１３０８−１５）により制御し得る。
キメラ酵素は構成的若しくは誘導可能なプロモーターにより制御しうる。一態様において、該系はキメラエンドヌクレアーゼを利用し、ここでヌクレアーゼは最低２ドメインすなわち触媒ドメインおよび配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを有し、そのそれぞれが個別に制御されるプロモーター下で発現されかつそれらは作動的に連結されている。該２ドメインが同時に発現される場合、該２ドメインの産物はキメラエンドヌクレアーゼを形成する。典型的に、ＤＮＡ結合ドメインに連結されているドメインのそれぞれを含有する別個の転写ユニットが提供される。こうしたＤＮＡ結合ドメインは、例えばＺｎフィンガーモチーフ、ホメオドメインモチーフ、ＨＭＧボックスドメイン、ＳＴＡＴタンパク質、Ｂ３、へリックス−ループ−へリックス、ウィングドへリックス−ターン−へリックス、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックス、ウィングドへリックス、ＰＯＵドメイン、リプレッサーのＤＮＡ結合ドメイン、癌遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン、および６を超える塩基対を認識する天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を包含する。［１９９５年７月２５日に交付された米国特許第５，４３６，１５０号明細書］。
一態様において、アブレーターの発現は、５．１．３節に記述される二量体化可能な転写因子ドメインにより調節される誘導可能なプロモーターの制御下にある。こうした誘導可能なプロモーターの一例は、限定されるものでないがＧＡＬ４転写因子に応答性であるＧＡＬ４結合部位ミニマルプロモーターを挙げることができる。ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン若しくはトランス活性化ドメインはエクダイソン受容体（ＥｃＲ）のようなステロイド受容体にもまた融合し得る。本明細書に記述されるようななお他の適する誘導可能なプロモーターを選択しうる。
５．１．３．二量体化可能な転写因子ドメインユニット
一態様において、複製欠損ウイルスのウイルスゲノム（１種若しくは複数）が、ヘテロ二量体融合タンパク質である二量体化可能なユニットを含有するようにさらに操作されているようなＰＩＴＡ系が設計される。これらのユニットは本明細書で定義されるところの
二量体化可能なＴＦユニット若しくは別の二量体化可能な融合タンパク質ユニット（例えばキメラ酵素の一部）でありうる。こうした一例において、二量体化剤結合ドメインに結合しかつＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質および活性化ドメイン融合タンパク質を二量体化（可逆的に架橋）して二機能性転写因子を形成する二量体化剤を使用する（５．１．４節を参照されたい）。例えば、米国特許公開第２００２／０１７３４７４号明細書、米国特許公開第２００９１０１００５３５号明細書、米国特許第５，８３４，２６６号明細書、米国特許第７，１０９，３１７号明細書、米国特許第７，４８５，４４１号明細書、米国特許第５，８３０，４６２号明細書、米国特許第５，８６９，３３７号明細書、米国特許第５，８７１，７５３号明細書、米国特許第６，０１１，０１８号明細書、米国特許第６，０４３，０８２号明細書、米国特許第６，０４６，０４７号明細書、米国特許第６，０６３，６２５号明細書、米国特許第６，１４０，１２０号明細書、米国特許第６，１６５，７８７号明細書、米国特許第６，９７２，１９３号明細書、米国特許第６，３２６，１６６号明細書、米国特許第７，００８，７８０号明細書、米国特許第６，１３３，４５６号明細書、米国特許第６，１５０，５２７号明細書、米国特許第６，５０６，３７９号明細書、米国特許第６，２５８，８２３号明細書、米国特許第６，６９３，１８９号明細書、米国特許第６，１２７，５２１号明細書、米国特許第６，１５０，１３７号明細書、米国特許第６，４６４，９７４号明細書、米国特許第６，５０９，１５２号明細書、米国特許第６，０１５，７０９号明細書、米国特許第６，１１７，６８０号明細書、米国特許第６，４７９，６５３号明細書、米国特許第６，１８７，７５７号明細書、米国特許第６，６４９，５９５号明細書、米国特許第６，９８４，６３５号明細書、米国特許第７，０６７，５２６号明細書、米国特許第７，１９６，１９２号明細書、米国特許第６，４７６，２００号明細書、米国特許第６，４９２，１０６号明細書、第ＷＯ ９４／１８３４７号明細書、第ＷＯ ９６／２０９５１号明細書、第ＷＯ ９６／０６０９７号明細書、第ＷＯ ９７／３１８９８号明細書、第ＷＯ ９６／４１８６５号明細書、第ＷＯ ９８／０２４４１号明細書、第ＷＯ ９５／３３０５２号明細書、第ＷＯ ９９１１０５０８号明細書、第ＷＯ ９９１１０５１０号明細書、第ＷＯ ９９／３６５５３号明細書、第ＷＯ ９９／４１２５８号明細書、第ＷＯ ０１１１４３８７号明細書に記述されるＡｒｉａｄ ＡＲＧＥＮＴTM系、ＡＲＧＥＮＴTMに調節される転写レトロウイルスキット、バージョン２．０（９１０９１０２）、およびＡＲＧＥＮＴTMに調節される転写プラスミドキット、バージョン２．０（９１０９／０２）（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一態様において、二量体化可能なユニットを送達することにより、標的細胞を、使用される薬理学的作用剤により二量体化される２種の融合タンパク質、すなわち、それぞれ二量体化剤結合ドメインに融合されている、アブレーターを制御する誘導可能なプロモーターを結合する転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含有する一方およびアブレーターを制御する誘導可能なプロモーターを活性化する転写因子の転写活性化ドメイン（ＡＤ）を含有する他方を共発現するように改変する。該２種の融合タンパク質の発現は構成的、若しくは付加される安全の特徴として誘導可能でありうる。誘導可能なプロモーターを融合タンパク質の一方の発現に選択する場合、該プロモーターは調節可能でありうるが、しかしウイルス組成物中のいかなる他の誘導可能若しくは調節可能なプロモーターと異なりうる。薬理学的作用剤すなわち双方の融合タンパク質中に存在する二量体化剤結合ドメインと同時に相互作用し得る「二量体化剤」（５．１．４節に記述される）の添加は、調節されるプロモーターへのＡＤ融合タンパク質の補充をもたらしてアブレーターの転写を開始する。リガンドおよび適切なミニマルプロモーターの非存在下で相互に対する親和性を有しない二量体化剤結合ドメインを使用することにより、転写は二量体化剤の添加に完全に依存性にされる。適しては、本発明の複製欠損ウイルス組成物は１種以上の二量体化可能なドメインを含有しうる。組成物中の多様な複製欠損ウイルスは、異なる転写ユニット（例えばｉｎ ｓｉｔｕで二量体化可能なユニットを形成するための融合タンパク質）および／若しくは付加的なアブレーターを提供する異なるストックのものでありうる。
１種若しくはそれ以上の転写因子ドメインを含有する融合タンパク質は、第ＷＯ ９４／１８３１７号明細書、第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８００８号明細書、Ｓｐｅｎｃｅｒら、上記およびＢｌａｕら（ＰＮＡＳ １９９７ ９４：３０７６）（そっくりそのまま本明細書に引用することにより組み込まれる）に開示される。リガンド媒介性遺伝子ノックアウトおよび遺伝子発現のリガンド媒介性の遮断若しくは遺伝子産物機能の阻害のためのこうした融合タンパク質の設計および使用は第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０５９１号明細書に開示される。新規ＤＮＡ結合ドメイン、および標的遺伝子の調節される転写を必要とする態様で有用であるそれらが結合するＤＮＡ配列は、例えばＰｏｍｅｒａｎｚら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３に開示されている。それらの参考文献は、類似の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物、標的遺伝子構築物の設計、構築および使用、ならびに主題の発明の実務者にもまた有用でありうる他の局面に関する実質的情報、手引きおよび実施例を提供する。
好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインおよびそれを含有する融合タンパク質は、選択されたＤＮＡ配列への結合が他の、しばしば多数の他のＤＮＡ配列の存在にもかかわらず検出され得る（ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるところの直接若しくは間接的に）ように十分な選択性を伴いその認識されるＤＮＡ配列に結合する。好ましくは、選択されたＤＮＡ配列へのＤＮＡ結合ドメインを含んでなる融合タンパク質の結合は、いずれかの代替ＤＮＡ配列と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結合研究により、若しくは選択されたＤＮＡと関連する遺伝子の転写の相対的速度若しくはレベルを測定することにより測定されるとおり、いずれか一つの代替ＤＮＡ配列への結合より最低２、より好ましくは３およびなおより好ましくは４桁以上大きい。本発明の二量体化可能な転写因子（ＴＦ）ドメインユニットは当該技術分野で既知のいずれの転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインもコードし得る。こうした転写因子の例は、限定されるものでないがＧＡＬ４、ＺＦＨＤ１、ＶＰＩ６およびＮＦ−ＫＢ（ｐ６５）を挙げることができる。
本発明の二量体化可能なユニットによりコードされる二量体化可能な結合ドメインは、米国特許公開第２００２／０１７３４７４号明細書、米国特許公開第２００９１０１００５３５号明細書、米国特許第５，８３４，２６６号明細書、米国特許第７，１０９，３１７号明細書、米国特許第７，４８５，４４１号明細書、米国特許第５，８３０，４６２号明細書、米国特許第５，８６９，３３７号明細書、米国特許第５，８７１，７５３号明細書、米国特許第６，０１１，０１８号明細書、米国特許第６，０４３，０８２号明細書、米国特許第６，０４６，０４７号明細書、米国特許第６，０６３，６２５号明細書、米国特許第６，１４０，１２０号明細書、米国特許第６，１６５，７８７号明細書、米国特許第６，９７２，１９３号明細書、米国特許第６，３２６，１６６号明細書、米国特許第７，００８，７８０号明細書、米国特許第６，１３３，４５６号明細書、米国特許第６，１５０，５２７号明細書、米国特許第６，５０６，３７９号明細書、米国特許第６，２５８，８２３号明細書、米国特許第６，６９３，１８９号明細書、米国特許第６，１２７，５２１号明細書、米国特許第６，１５０，１３７号明細書、米国特許第６，４６４，９７４号明細書、米国特許第６，５０９，１５２号明細書、米国特許第６，０１５，７０９号明細書、米国特許第６，１１７，６８０号明細書、米国特許第６，４７９，６５３号明細書、米国特許第６，１８７，７５７号明細書、米国特許第６，６４９，５９５号明細書、米国特許第６，９８４，６３５号明細書、米国特許第７，０６７，５２６号明細書、米国特許第７，１９６，１９２号明細書、米国特許第６，４７６，２００号明細書、米国特許第６，４９２，１０６号明細書、第ＷＯ ９４１１８３４７号明細書、第ＷＯ ９６／２０９５１号明細書、第ＷＯ ９６／０６０９７号明細書、第ＷＯ ９７／３１８９８号明細書、第ＷＯ ９６／４１８６５号明細書、第ＷＯ ９８／０２４４１号明細書、第ＷＯ ９５／３３０５２号明細書、第ＷＯ ９９／１０５０８号明細書、第ＷＯ ９９１１０５１０号明細書、第ＷＯ ９９／３６５５３号明細書、第ＷＯ ９９／４１２５８号明細書
、第ＷＯ ０１１１４３８７号明細書、ＡＲＧＥＮＴTMに調節される転写レトロウイルスキット、バージョン２．０（９／０９／０２）およびＡＲＧＥＮＴTMに調節される転写プラスミドキット、バージョン２．０（９／０９／０２）（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるいずれかの二量体化剤結合ドメインであり得る。
ＰＩＴＡ系で使用し得る二量体化剤結合ドメインはイムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）である。ＦＫＢＰは免疫抑制薬ＦＫ５０６およびラパマイシンの細胞内受容体として作用する豊富な１２ｋＤａの細胞質タンパク質である。調節される転写は、複数コピーのＦＫＢＰを転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび転写因子の活性化ドメインに融合すること、次いでＦＫ１０１２（ＦＫ５０６のホモ二量体；Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８２（６５９４）：８２２−６）；若しくはＡＰ１５１０（Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．ら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２０）：１０６１８−２３）のようなより単純な合成アナログの添加により達成し得る。これらの系の効力は、内因性ＦＫＢＰとの相互作用を最小限にする設計された「隆起（ｂｕｍｐ）」をもつＡＰ１８８９のような合成二量体化剤を使用することにより改良し得る（Ｐｏｌｌｏｃｋら、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９９９．３０６：ｐ．２６３−８１）。改良されたアプローチはヘテロ二量体化に基づき、ＦＫ５０６およびラパマイシンがＦＫＢＰを第二の標的タンパク質と一緒にすることにより自然に機能するという発見を活用した。これは、天然の産物それら自身若しくはそれらのアナログが遺伝子発現を制御するための二量体化剤として直接使用されることを可能にする。
カルシニューリンホスファターゼに複合体形成されたＦＫＢＰ−ＦＫ５０６の構造（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｃｅｌｌ、８２：５０７ ５２２、１９９５）が報告されている。カルシニューリンＡ（残基１２ ３９４）は、Ｇａｌ４に融合されている３個のＦＫＢＰおよびＧａｌ４活性化ドメインにＣ末端で融合されているマウスカルシニューリンＡの残基１２ないし３９４を使用して、酵母中で３ハイブリッド系を使用して二量体化剤結合ドメインとして効果的であることが示された（Ｈｏ、１９９６ Ｎａｔｕｒｅ．３８２：８２２ ８２６）。ＦＫ５０６の添加はこれら細胞中で受容体遺伝子の転写を活性化した。より小さくより操作可能なドメインであるＣＡＢと命名された「最小」カルシニューリンドメインを、二量体化剤結合ドメインとして使用し得る。
本発明の二量体化可能な融合タンパク質ユニットによりコードされるＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質および活性化ドメイン融合タンパク質は、１種若しくはそれ以上の異なる二量体化剤結合ドメインの１若しくはそれ以上のコピーを含有しうる。二量体化剤結合ドメインはＮ末端、Ｃ末端にありうるか、若しくはＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインに関して散在されうる。複数コピーの二量体化剤結合ドメインを伴う態様は通常２、３若しくは４個のこうしたコピーを有する。融合タンパク質の多様なドメインは、場合によっては、隣接するドメインの１個に由来しうる若しくは異種でありうるペプチド領域を連結することにより分離されている。
本明細書で使用されるところの二量体化剤結合ドメインのバリアントの文脈での「バリアント」という用語は、天然の二量体化剤結合ドメインに関して欠失、挿入、置換若しくは他の修飾を含有するがしかし二量体化剤に結合するそれらの特異性を保持する二量体化剤結合ドメインを指す。二量体化剤結合ドメインのバリアントは、好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２若しくは１アミノ酸残基を超えない欠失、挿入、置換および／若しくは他の修飾を有する。特定の一態様において、二量体化剤結合ドメインのバリアントは、１ないし５アミノ酸が二量体化剤結合ドメインのカルボキシおよび／若しくはアミノ端から付加若しくは除去される（ここで付加されるアミノ酸は天然の二量体化剤結合ドメイン中に存在する隣接するアミノ酸（１個若しくは複数）である）ことを除き、上
で明記されたところの二量体化剤結合ドメインの生得の配列を有する。
ウイルスゲノム（１種若しくは複数）内にスペースを保存するため、２シストロン性転写ユニットを操作し得る。例えば、第三および第四の転写ユニットを、単独プロモーターからのメッセージにより異種遺伝子産物の共発現を可能にするＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）を含有する２シストロン性ユニットとして操作し得る。あるいは、単独プロモーターが、自己切断ペプチド（例えばＴ２Ａ）若しくはプロテアーゼ認識部位（例えばフリン）をコードする配列により相互から分離されている２若しくは３種の異種遺伝子（例えば第三および第四の転写ユニット）を単独オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に含有するＲＮＡの発現を指図しうる。該ＯＲＦは、従って、翻訳の間（Ｔ２Ａの場合に）若しくは後のいずれかで個々のタンパク質に切断される単独ポリタンパク質をコードする。しかしながら、これらＩＲＥＳおよびポリタンパク質系をＡＡＶパッケージングスペースを確保するために使用し得るとは言え、それらは同一プロモーターにより駆動され得る成分の発現にのみ使用し得ることに留意すべきである。
下の実施例で具体的に説明されるところの本発明の多様な成分は、
ＩＴＲ：ＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）（１６８ｂｐ）。一態様において、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、シュードタイピングされたＡＡＶ、すなわち該ＩＴＲが由来するＡＡＶのそれと異なるＡＡＶからのキャプシドを有するＡＡＶを生成するよう選択される。
ＣＭＶ：エンハンサーを包含する完全なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター。ＣＭＶ：エンハンサーを包含しないミニマルＣＭＶプロモーター。一態様においてヒトＣＭＶプロモーターおよび／若しくはエンハンサーが選択される。
ＦＲＢ−ＴＡ：転写因子の二量体化剤結合ドメインおよび活性化ドメインの融合。ＦＲＢフラグメントは、ＦＲＡＰのアミノ酸２０２１−２１１３（ＦＫＢＰラパマイシン会合タンパク質、ｍＴＯＲ［哺乳動物のラパマイシン標的］としてもまた知られる）すなわち細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド３−キナーゼホモログに対応する。ＦＲＡＰ配列は、ある種の免疫を抑制しないラパマイシンアナログ（ラパログ）の使用を可能にするように単一点突然変異Ｔｈｒ２０９８Ｌｅｕ（ＦＲＡＰL）を取り込む。ＦＲＡＰはラパマイシン（若しくはそのアナログ）およびＦＫＢＰに結合し、そして転写活性化因子としてのヒトＮＦ−ＫＢ ｐ６５（１９０アミノ酸）の一部分に融合されている。
ＺＦＨＤ−ＦＫＢＰ融合：ＤＮＡ結合ドメインおよび１コピーの二量体化剤結合ドメイン、２コピーの薬物結合ドメイン（２×ＦＫＢＰ、若しくは３（３×ＦＫＢＰ）コピーの薬物結合ドメインの融合。イムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は免疫抑制薬ＦＫ５０６およびラパマイシンの細胞内受容体として作用する豊富な１２ｋＤａの細胞質タンパク質である。ＺＦＨＤはＺｎフィンガー対およびホメオドメインから構成されるＤＮＡ結合ドメインである。別の代替において、多様な他のコピー数の選択された薬物結合ドメインを選択しうる。こうした融合タンパク質は、５’および／若しくは３’端にヒトｃ−ＭｙｃからのＮ末端核局在化配列を含有しうる。
Ｚ８Ｉ：８コピーのＺＦＨＤの結合部位（Ｚ８）次いでヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子からのミニマルプロモーターを含有する（配列番号３２）。例えば１から約２０コピーまでのＺＦＨＤの結合部位次いでプロモーター例えばＩＬ−２からのミニマルプロモーター若しくは別の選択されたプロモーターを含有するこれのバリアントを使用しうる。
Ｃｒｅ：Ｃｒｅ組換え酵素。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１から単離されるＩ型トポイソメラーゼである。Ｃｒｅは欠失若しくは遺伝子変換につながる２個のｌｏｘＰ部位の間のＤＮＡの部位特異的組換えを媒介する（１０２９ｂｐ、配列番号３３）。
Ｉ−ＳｃｅＩ：大きな分類のメガヌクレアーゼであるイントロンエンドヌクレアーゼ若しくはホーミングエンドヌクレアーゼの１メンバー（７０８ｂｐ、配列番号３４）。それらは細菌および植物中で見出されるイントロンのような移動性遺伝要素によりコードされ
る。Ｉ−ＳｃｅＩはイントロンホーミング過程に関与する酵母エンドヌクレアーゼである。Ｉ−ＳｃｅＩは哺乳動物ゲノム中のまれな配列である特異的非対称１８ｂｐ配列を認識し、そして二本鎖の中断を創製する。Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２、２２４−２２８を参照されたい。
ｈＧＨポリＡ：ヒトＧＨからの最小ポリアデニル酸化シグナル（配列番号３５）。
ＩＲＥＳ：ＥＣＭＶ（脳心筋炎ウイルス）からの配列内リボソーム進入部位配列（配列番号３６）
を包含しうる。
５．１．４．二量体化剤および薬理学的作用剤
本明細書で使用されるところの「二量体化剤」という用語はＴＦドメイン融合タンパク質（５．１．３節に記述される）の二量体化剤結合ドメインに結合し得かつ融合タンパク質の二量体化を誘導し得る化合物である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされるところの転写因子のドメインを二量体化するいかなる薬理学的作用剤も使用し得る。好ましくは、ラパマイシンおよび「ラパログ」と称されるそのアナログを使用し得る。以下すなわち米国特許公開第２００２／０１７３４７４号明細書、米国特許公開第２００９／０１００５３５号明細書、米国特許第５，８３４，２６６号明細書、米国特許第７，１０９，３１７号明細書、米国特許第７，４８５，４４１号明細書、米国特許第５，８３０，４６２号明細書、米国特許第５，８６９，３３７号明細書、米国特許第５，８７１，７５３号明細書、米国特許第６，０１１，０１８号明細書、米国特許第６，０４３，０８２号明細書、米国特許第６，０４６，０４７号明細書、米国特許第６，０６３，６２５号明細書、米国特許第６，１４０，１２０号明細書、米国特許第６，１６５，７８７号明細書、米国特許第６，９７２，１９３号明細書、米国特許第６，３２６，１６６号明細書、米国特許第７，００８，７８０号明細書、米国特許第６，１３３，４５６号明細書、米国特許第６，１５０，５２７号明細書、米国特許第６，５０６，３７９号明細書、米国特許第６，２５８，８２３号明細書、米国特許第６，６９３，１８９号明細書、米国特許第６，１２７，５２１号明細書、米国特許第６，１５０，１３７号明細書、米国特許第６，４６４，９７４号明細書、米国特許第６，５０９，１５２号明細書、米国特許第６，０１５，７０９号明細書、米国特許第６，１１７，６８０号明細書、米国特許第６，４７９，６５３号明細書、米国特許第６，１８７，７５７号明細書、米国特許第６，６４９，５９５号明細書、米国特許第６，９８４，６３５号明細書、米国特許第７，０６７，５２６号明細書、米国特許第７，１９６，１９２号明細書、米国特許第６，４７６，２００号明細書、米国特許第６，４９２，１０６号明細書、第ＷＯ ９４１１８３４７号明細書、第ＷＯ ９６／２０９５１号明細書、第ＷＯ ９６／０６０９７号明細書、第ＷＯ ９７／３１８９８号明細書、第ＷＯ ９６／４１８６５号明細書、第ＷＯ ９８／０２４４１号明細書、第ＷＯ ９５／３３０５２号明細書、第ＷＯ ９９／１０５０８号明細書、第ＷＯ ９９／１０５１０号明細書、第ＷＯ ９９／３６５５３号明細書、第ＷＯ ９９／４１２５８号明細書、第ＷＯ ０１１１４３８７号明細書、ＡＲＧＥＮＴTMに調節される転写レトロウイルスキット、バージョン２．０（９１０９／０２）およびＡＲＧＥＮＴTMに調節される転写プラスミドキット、バージョン２．０（９／０９／０２）（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される二量体化剤のいずれも使用し得る。
本発明で使用し得る二量体化剤の例は、限定されるものでないがラパマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫＩ０１２（ＦＫ５０６のホモ二量体）、内因性ＦＫＢＰおよび／若しくはＦＲＡＰに対する親和性を低下若しくは排除する「隆起」を付加するための天然産物の化学修飾により容易に製造されるラパマイシンアナログ（「ラパログ」）を挙げることができる。ラパログの例は、限定されるものでないが、内因性ＦＫＢＰとの相互作用を最小限にする設計された「隆起」をもつＡＰ２６１１３（Ａｒｉａｄ）、ＡＰ１５１０（Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．ら、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４（２０
）：１０６１８−２３）ＡＰ２２６６０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２１３７０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２３０５４、ＡＰ１８５５、ＡＰ１８５６、ＡＰ１７０１、ＡＰ１８６１、ＡＰ１６９２およびＡＰ１８８９のようなを挙げることができる。
二量体化剤結合ドメイン若しくは他の内因性構成要素に結合することが可能な他の二量体化剤は、ファージディスプレイ、およびペプチジル結合化合物を同定するための他の生物学的アプローチ；合成多様性若しくはコンビナトリアルアプローチ（例えばＧｏｒｄｏｎら、１９９４、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７（９）：１２３３−１２５１および３７（１０）：１３８５−１４０１を参照されたい）；ならびにＤｅＷｉｔｔら、１９９３、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３）、ならびに慣習的スクリーニング若しくは合成プログラムを包含する多様なアプローチを使用して容易に同定し得る。目的の二量体化剤結合ドメインに結合することが可能な二量体化剤は、多様な親和性精製方法により、またはピン、ビーズ、チップなど）のような固体支持体に固定されている化合物へのタンパク質の結合を伴うアッセイを包含する直接若しくは競合結合アッセイにより同定しうる。Ｇｏｒｄｏｎら、上記を参照されたい。
一般的に言って、二量体化剤はいずれかの順序で若しくは同時に、好ましくは約１０-6より下、より好ましくは約１０-7より下、なおより好ましくは約１０-8より下、およびいくつかの態様において約１０-9Ｍより下のＫｄ値で２種（若しくはそれ以上）のタンパク質分子に結合することが可能である。二量体化剤は好ましくはタンパク質以外でありかつ約５ｋＤａ未満の分子量を有する。そのようにオリゴマー化されるタンパク質は同一若しくは異なってよい。
多様な二量体化剤は疎水性であるか、若しくは親油基での適切な修飾によりそのようにし得る。とりわけ、連結部分を含有する二量体化剤は、リンカー部分に約１２から２４個までの炭素原子の１個若しくはそれ以上の脂肪族側鎖を包含することにより親油性を高めるよう修飾し得る。
５．１．５．複製欠損ウイルス組成物の生成
遺伝子移入（例えば遺伝子治療）に適するいかなるウイルスも、限定されるものでないがアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）；アデノウイルス；アルファウウイルス；ヘルペスウイルス；レトロウイルス（例えばレンチウイルス）；ワクシニアウイルス；などを挙げることができる複製欠損ウイルスの１種若しくはそれ以上のストックに転写ユニットをパッケージングするのに使用しうる。複製欠損ウイルスに外来遺伝子をパッケージングするための当該技術分野で公知の方法を使用して、治療的トランスジーンユニット、アブレーションユニット、および場合によっては（しかし好ましくは）二量体化可能な転写因子ドメインユニットを含有する複製欠損ウイルスを製造し得る。例えば、ＧｒａｙとＳａｍｕｌｓｋｉ、２００８、“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ”、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：９１１−９２２；ＭｕｒｐｈｙとＨｉｇｈ、２００８、“Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ”、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １４０：４７９−４８７；Ｈｕ、２００８、“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ”、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：５４−６５；Ｇｏｍｅｚら、２００８、“Ｔｈｅ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ＭＶ Ａ ａｎｄ ＮＹＶ ＡＣ ａｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ”、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：９７−１２０を参照されたい。
好ましい態様において、治療的使用のための複製欠損ウイルス組成物はＡＡＶを使用して生成される。遺伝子治療に適するＡＡＶの生成および単離方法は当該技術分野で既知である。全般として、例えば、ＧｒｉｅｇｅｒとＳａｍｕｌｓｋｉ、２００５、“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５；Ｂｕｎｉｎｇら、２００８、“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３；ならびに下に引用される参考文献（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
アデノ随伴ウイルス（デペンドウイルス属、パルボウイルス科）はヒトおよび他の霊長類を感染させる小型（およそ２０〜２６ｎｍ）の無エンベロープ一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは現在、疾患を引き起こすことが知られていない。アデノ随伴ウイルスは分裂細胞および非分裂細胞双方を感染させることができる。機能的ヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス若しくはヘルペスウイルス）の非存在下でＡＡＶは複製欠損である。アデノ随伴ウイルスは宿主細胞核中でエピソームコンカテマーを形成する。非分裂細胞において、これらコンカテマーは宿主細胞の一生の間無傷のまま留まる。分裂細胞中では、ＡＡＶのＤＮＡは、該エピソームＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡと一緒に複製されないため細胞分裂により喪失される。しかしながらＡＡＶのＤＮＡはまた宿主ゲノム中に低レベルで組み込みうる。
ＡＡＶゲノムは約４．７キロ塩基長であるプラス若しくはマイナスいずれかのセンスのｓｓＤＮＡから構築される。それが天然に存在するところのＡＡＶのゲノムは、ＤＮＡ鎖の双方の端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）すなわちｒｅｐおよびｃａｐを含んでなる。前者はＡＡＶの生活環に必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４個のオーバーラップ遺伝子から構成され、また、後者は、相互作用して正二十面体の対称のキャプシドを形成するキャプシドタンパク質（Ｃａｐ）すなわちＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするオーバーラップ配列を含有する。
該ＩＴＲはそれぞれ１４５塩基であり、そして第二のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存性の合成を可能にするいわゆる「自己プライミング」に寄与するヘアピンを形成する。該ＩＴＲはまた、宿主細胞ゲノム中への（例えばヒトにおいて第１９染色体への）ＡＡＶ ＤＮＡ組み込みおよびそれからのレスキュー、ならびにＡＡＶ ＤＮＡの効率的被包化およびＡＡＶ粒子の集成にも必要とされるようである。
トランスジーンをビリオン中にパッケージングするため、ＩＴＲはトランスジーンと同一構築物中にシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子はトランスで供給され得る。従って、ＡＡＶ ＩＴＲが転写ユニットの１種若しくはそれ以上（すなわちトランスジーンユニット、アブレーターユニットおよび二量体化可能な転写因子ユニット）に隣接して従って増幅およびパッケージングされる領域を定義するようなＤＮＡ構築物を設計し得、唯一の設計の制約はパッケージングされるべきＤＮＡの大きさの上限である（およそ４．５ｋｂ）。スペースを確保するために使用し得るアデノ随伴ウイルスの操作および設計の選択を下述する。
１０×Ｚｎフィンガー構築物を利用する組成物および系
本発明は、制御される遺伝子発現アブレーション系を有する治療的産物のベクター媒介性送達方法を提供する。便宜上、該方法をＡＡＶベクターの文脈で記述する。しかしなが
ら、当業者は、本明細書に記述される組成物および方法での使用のための別の適するベクター（例えば複製欠損アデノウイルス、複製欠損レンチウイルス、または他のウイルス若しくは遺伝要素）を選択し得る。ウイルスおよび他のベクターの例は先に記述され、そして引用することにより本明細書に組み込まれる。一態様において、ＡＡＶベクターは、最低１０個（１０×）のＺｎフィンガーの構築物により特異的かつ選択的に認識される最低３０核酸塩基対の配列を含んでなる、転写を制御するプロモーターに作動可能に連結されている治療的若しくはワクチン産物（または目的の別の遺伝子若しくは配列）および最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位をコードする核酸配列を含んでなる核酸分子を含有する。該最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位は目的の遺伝子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはタンパク質、ペプチド、系の生物学操作された経路など）をコードする配列に対し少なくとも５’に配置される。該方法はさらに、プロモーターと作動的関連の機能的エンドヌクレアーゼ触媒ドメインに連結されている最低１０個のＺｎフィンガーを含んでなるキメラエンドヌクレアーゼを含んでなる最低１種のアブレーターの使用を必要とし、ここで転写および／若しくはアブレーション活性が薬理学的作用剤に応答して誘導される。該最低１０個（１０×）のＺｎフィンガーは、最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位中の最低約３０塩基対配列を特異的かつ選択的に認識し、そして最低１０個の独立に選択された認識へリックスを含有する。
一態様において、本発明は、例えばトランスジーン産物がもはや必要とされない若しくは生物体の内側で毒性／オフターゲット効果を現す場合に、ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子送達の応用［遺伝子治療、ワクチンなどを包含する］で目的の遺伝子を破壊するのに必要な安全手段としてキメラエンドヌクレアーゼを利用する。従って、本発明のキメラエンドヌクレアーゼは以下の特徴の１つ若しくはそれ以上を有する。それらは哺乳動物（例えばヒト）ゲノム中に存在しない配列（従って用語「最低３０ｂｐ特有の配列」）を意図的に標的とし、それらは標的位置のみに対する高いｉｎ ｖｉｖｏ選択性を有し、ならびにそれらは最小限のオフターゲットおよび細胞傷害性効果を有する。文献に以前に記述されたエンドヌクレアーゼは、多様な目的上すなわち目的の特定の遺伝子のノックアウト若しくは是正（ノックイン）を可能にするための哺乳動物ゲノムのｉｎ ｓｉｔｕ操作のため使用されたという事実により、発明者は、長いストレッチ（すなわち７、８、９、１０、１１、１２若しくはそれ以上のＺｎフィンガーが過剰の）を設計することを包含する、本発明に必要とされる特徴をもつキメラエンドヌクレアーゼを設計するため、および標的ゲノム（例えばヒト若しくは他の哺乳動物被験体）内に存在しない独特の配列を選択するための新たな方法論を開発することを必要とされた。
一態様において、Ｚｎフィンガータンパク質は、通例に使用される設計に伴うオフターゲット効果および細胞傷害性を軽減するために、標的ゲノムの一部でないＤＮＡ配列を特異的に標的とするよう操作される。
例えば、ヒトへの送達のため、最低３２塩基対のランダム配列がフレームシフトに適応するために生成されるとは言え、より小さい配列（例えば最低３０塩基対）を選択し得る。この大きさはヒトゲノム中に約３．４×１０9塩基対が存在するため選択された。４ヌクレオチドの順列をもつ全部の可能な１５塩基対長配列の数は４15であり、これはおよそ１０9と同一である。それは、１５塩基対に等しいか若しくはそれ未満であるいずれの所定のＤＮＡ配列についてもヒトゲノム内に同一の下位配列が見出され得ることを意味している。逆に、いずれの短いＤＮＡ配列についてもヒトＤＮＡ配列の一片に同一である最低１５位置が存在することができる。初期評価の間に、いずれかのヒトＤＮＡ配列とのその最大の配列同一性が６５％未満である短い配列は同定されなかった。
驚くことに、アブレーション認識部位としての使用のためランダムに生成かつ試験され
た第一の独特の配列、すなわち配列番号８０６−ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡが所望のパラメータに適合することが見出された。下の実施例は、目的の遺伝子を運搬しかつ最低１０個のＺｎフィンガーを含んでなる本発明のキメラエンドヌクレアーゼにより特異的に認識される発現プラスミドベクター中に操作されている配列を具体的に説明する。アブレーション認識部位をコードする配列およびキメラエンドヌクレアーゼの配列は、ＡＡＶベクター、組成物を得るためおよび本発明の方法を実施するために慣習的技術を使用して適するウイルスベクター（例えばＡＡＶベクター）に操作し得る。
図２１８を参照して、本発明の独特の配列の合理化された選択方法が提供される。これは、２百万の短いＤＮＡ配列をランダムに生成することおよび相互に対し２０％未満（＜）の配列同一性をもつものを選択することを必要とする。生じる配列を、標的ゲノム（例えばヒト）に対し慣習的パラメータを使用するＢＬＡＳＴを介して比較し、そして１００以上のＥ値をもつものを選択する。［Ｅ値は期待（Ｅｘｐｅｃｔ）値である。データベース配列に対する一致を報告するための統計学的有意性閾値；初期設定値は１０であり、ＫａｒｋｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率論的モデルに従って１０個の一致が単に偶然に見出されることが期待されることを意味している。一致に帰される統計学的有意性がＥｘｐｅｃｔ閾値より大きい場合、該一致は報告されないことができる。より小さいＥｘｐｅｃｔ閾値はより厳格であり、報告されるより少ない偶然の一致につながる。閾値を増大させることはより少なく厳格な一致を示す。小数値は許容される。］例示的一配列を、スライド窓を用いヒトゲノムに対し類似性について比較する。［窓をスライドさせるため、３２塩基対の窓がヒトゲノムのヌクレオチド上をスライドする。窓は各段階について１ヌクレオチド移動する。窓のすべての位置について同一性レベルを計算する。］７０％以上の類似性をもついかなる配列も廃棄する。配列が７０％未満の類似性を有する場合には、それをいずれかの８連続塩基対の存在について標的ゲノムに対して解析し、そして標的配列と共通の８若しくはそれ以上の連続塩基対を有するいずれも廃棄する。残部をアブレーション認識部位での使用に選択しうる。
かように、本発明のアブレーション認識部位の独特の配列は、ヒトゲノム中のいずれかの配列と７０％未満の同一性を有し、ヒトゲノム中のいずれかの配列と８個を超えない隣接する同一位置を有する。本明細書に記述されるところのこの配列を特異的に標的とするＺｎフィンガーをその後設計する。該独特の配列は、２種の別個のＺｎフィンガーが単独の独特の最低３２ｂｐ配列に特異的であることが可能であるような異なるリーディングフレームを認識する異なるＺｎフィンガー設計により読み取ることができる。該配列は長さが３２、３３、３４、３５、３６、３８、４１、４４若しくはそれ以上の配列でありうる。
上で同定される独特の配列に加え、アブレーション認識部位での使用のための他の独特の配列もまた生成した。すなわち
配列番号８０１：配列番号ＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＡＣ
配列番号８０２：配列番号ＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＡＣおよび
配列番号８０３：ＡＣＴＡＴＴＣＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＡＧＴＣＧＧＣＧＣＧＡ。
特異的アブレーション部位配列を一旦選択すれば、アブレーターを、目的の遺伝子を運搬するベクターのアブレーション部位内のこの独特の最低３０ｂｐ配列を特異的に認識することができるＺｎフィンガータンパク質を含有するよう操作し得る。
一態様において、本発明のキメラエンドヌクレアーゼは、場合によってはリンカーを介してＺｎフィンガータンパク質に融合されるエンドヌクレアーゼの少なくとも触媒ドメインを含有するよう操作する。触媒ドメインはＺｎフィンガーのＮ末端、ＺｎフィンガーのＣ末端に配置しうるか、若しくはそれはＺｎフィンガー内に配置しうる（すなわち、触媒ドメインはそのＮおよびＣ双方の末端でＺｎフィンガーモジュールにより隣接される）。場合によっては、核局在化シグナルを、キメラエンドヌクレアーゼのＮ若しくはＣ末端またはタンパク質のＺｎフィンガー部分のＮ若しくはＣ末端に包含する。これらの配列は本明細の別の場所に記述され、その一節は引用することにより本明細書に組み込まれる。
一態様において、ＦｏｋＩ触媒ドメインをＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのいずれかの他の機能的配列を伴わずに使用する。すなわちＤＮＡ結合ドメインが存在しない。さらに、本明細書に記述されるキメラエンドヌクレアーゼが操作されている様式により、既知のＦｏｋＩ認識部位（５’−ＣＡＴＣＣ−３’）が必要とされない。ＦｏｋＩ触媒ドメインは配列特異的でないエンドヌクレアーゼであり、アブレーターがアブレーション部位を一旦認識すれば、ＦｏｋＩが切断するアブレーション認識部位中の位置を、ＦｏｋＩ触媒ドメインとＺｎフィンガーの間の任意のリンカー配列の長さにより変えることができる。
例えば、５アミノ酸のリンカー配列（例えば配列番号８０５、ＧＴＳＧＫ）はＺｎフィンガー結合部位の直後に続くＦｏｋＩキメラアブレーターが切断する６ｂｐをもたらす。［リンカー長さはＹｕｋａ Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００９ Ｊｕｌｙ １５；１９（１４）：３９７０−３９７２に示される規約を使用して定義される］。従って、ＦｏｋＩキメラアブレーターによりなされる切断の場所を、リンカーの長さを増大若しくは減少させることにより調節し得る。例えば、キメラアブレーターの他のリンカー（長さ０、１、２、３、４、５若しくは６アミノ酸のアミノ酸）をアブレーション部位の６、７、８、９若しくはより長いスペーサーと組合せで使用しうる。
Ｚｎフィンガーは逆方向でＤＮＡを結合するモジュラータンパク質である（すなわちＺｎフィンガーのＮ末端がセンス鎖の３’端で開始して結合する）。典型的には、各モジュールすなわちフィンガーは、位置すなわちそのα−へリックスの−１、３および６のアミノ酸を使用してＤＮＡ上の特異的３ｂｐ認識部位（すなわち「トリプレット」）を標的とする。これらへリックスは特異的でありかつ特定のＤＮＡトリプレットについて選択される。かように、１０×Ｚｎフィンガータンパク質について、１０個のＺｎフィンガー（すなわちモジュール）のそれぞれを、本発明の最低３０核酸配列中に存在する独特のトリプレットを標的とするよう独立に選択しうる。
本発明は、アブレーターの独特の配列に特異的な１０×Ｚｎフィンガータンパク質に融合されているＦｏｋＩ触媒ドメインを使用する本発明の特異的かつ選択的アブレーションを示した。有意により小さい大きさ（２〜３）のＺｎフィンガーの当該技術分野での記述および６×より大きいＺｎフィンガーが成功裏のタンパク質でないという最近の刊行物［Ｙｕｋａ Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ａｄｄｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒｓ ｔｏ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｎ Ｒｅｄｕｃｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１、５０、５０３３−５０４１］を考えれば、この結果は予期されなかった。
アブレーション認識部位の最低３０塩基対の独特の核酸配列の大きさおよび配列が一旦知られれば（例えばベクターがヒトに送達されるはずである最低３０塩基対）、各トリプレットについて最低１モジュール（１×）を提供するＺｎフィンガーを操作し得る。各Ｚｎフィンガーは所定のトリプレットに特異的な認識へリックスを含有し、ここで認識へリックスの配列は、適正ならせん形に約７アミノ酸配列を提示するために保存されたＺｎフ
ィンガー構造に折り畳むよう操作される。より具体的には、出願人は、Ｚｎフィンガーを構築するのに使用しうる具体的に説明する保存された配列の一選択を以下の表に提供する。この表で、７個のダッシュは、７アミノ酸へリックス認識部位の１つを複数（×）Ｚｎフィンガーを構築するために挿入しうる場所を表す。
最低１０×のＺｎフィンガー若しくは別の長さのＺｎフィンガー（例えばヒト以外若しくは他の応用に選択される）は、認識へリックスのそれぞれが同一の保存された配列中に挿入されているＺｎフィンガーモジュールを含有しうる。別の態様において、アブレーターは、異なる保存された配列中に挿入されている認識へリックスを含有するＺｎフィンガーモジュールを含有しうる。本明細書の実施例において、（Ｎ末端）−ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ−ＸＸＸＸＸＸＸ−ＨＱＲＴＨ（カルボキシ末端）、ＣＯＯＨ［配列番号７４５］という保存された配列、若しくは、使用される場合は（Ｎ末端）−ＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳ−ＸＸＸＸＸＸＸ−ＨＬＲＴＨ（カルボキシ末端）−ＣＯＯＨ（ここでＸＸＸＸＸＸＸ［配列番号８０７］はＺｎフィンガー認識へリックスである）を使用した。しかしながら本発明はこれら配列に制限されない。
本発明により、一態様において、最低３０核酸配列はＺｎフィンガーの収容代替のリーディングフレームのため長さ３２塩基対でありうる。
アブレーション部位の独特の核酸配列の配列に依存して、特定のＺｎフィンガーへリックスをＺｎフィンガーが保存された配列への挿入のため選択する。いくつかの態様において、アブレーション部位の独特の核酸配列は同一の３塩基対トリプレットの１種以上を含有しうる。この例において、同一の認識へリックス若しくは異なる認識へリックスを選択しうる。
一態様において、最低３０塩基対配列のＺｎフィンガーすなわち配列番号８０６：ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡを操作し、その結果、Ｚｎフィンガーは、（ａ）ＴＧＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第一のＮ末端Ｚｎフィンガー；（ｂ）ＡＣＧに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第
二のＺｎフィンガー；（ｃ）ＣＧＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第三のＺｎフィンガー；（ｄ）ＧＡＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第四のＺｎフィンガー；（ｅ）ＧＴＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第五のＺｎフィンガー；（ｆ）ＡＡＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第六のＺｎフィンガー；（ｇ）ＣＧＣに結合する認識へリックスを含んでなる第七のＺｎフィンガー；（ｈ）ＧＴＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第八のＺｎフィンガー；（ｉ）ＧＡＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第九のＺｎフィンガー；および（ｊ）ＧＴＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第十のＺｎフィンガーよりなる最低１０種のＺｎフィンガーをコードする核酸配列を含んでなる。
本明細書に提供される実施例において、ＴＧＣに特異的に結合する（ａ）の認識へリックスはＱＲＲＳＬＧＨ（配列番号６６３）であり；ＡＣＧに特異的に結合する（ｂ）の認識へリックスはＫＫＮＤＬＴＲ（配列番号６０のａａ２９−５６）であり；ＣＧＴに特異的に結合する（ｃ）の認識へリックスはＳＲＲＴＣＲＡ（配列番号１５５）であり；ＧＡＴに特異的に結合する（ｄ）の認識へリックスはＶＲＨＮＬＴＲ（配列番号２７０）であり；ＧＴＣに特異的に結合する（ｅ）の認識へリックスはＤＲＴＳＬＡＲ（配列番号５４０）であり；ＡＡＣに特異的に結合する（ｆ）の認識へリックスはＤＳＧＮＬＲＶ（配列番号６４）であり；ＣＧＣに特異的に結合する（ｇ）の認識へリックスはＨＴＧＨＬＬＥ（配列番号１５１）であり；ＧＴＴに特異的に結合する（ｈ）の認識へリックスはＴＮＱＡＬＧＶ（配列番号６０のａａ１９７−２２４）であり；ＧＡＴに特異的に結合する（ｊ）の認識へリックスはＶＲＨＮＬＴＲ（配列番号２７０）であり；およびＧＣＴに特異的に結合する（ｋ）の認識へリックスはＤＲＴＳＬＡＲ（配列番号５４０）である。しかしながら他の認識へリックスがこれらのトリプレットの多くについて存在する。例えば、ＴＧＣに特異的に結合する（ａ）の認識へリックスはＡＲＮＴＬＶＨ、ＱＲＲＳＬＧＨ、ＱＡＲＳＬＲＡ、ＱＱＲＳＬＫＮ、およびＱＮＲＳＬＡＨ、ＱＧＲＳＬＲＡ、ＲＡＲＮＬＴＬ、ＲＧＲＮＬＥＭ、ＲＫＲＮＬＩＭ、ＲＭＲＮＬＩＩ、ＲＮＲＮＬＶＬ、ＲＲＲＮＬＨＬ、ＲＲＲＮＬＴＬ、ＲＳＲＮＬＤＩ、ＲＳＲＮＬＬＬならびにＲＳＲＮＬＴＬ（配列番号６５８−６７３）よりなる群から選択されることができ；ＡＣＧに特異的に結合する（ｂ）の認識へリックスはＫＮＮＤＬＴＲ；ＫＲＩＤＬＱＲ；ＲＫＨＤＬＮＭ；ＲＲＱＴＬＲＱ；ＫＧＮＤＬＴＲ；ＲＮＩＴＬＶＲ、ＲＳＨＤＬＴＶ、ＡＳＡＤＬＴＲ、ＱＮＡＴＲＫＲ、ＱＳＧＤＬＴＲ、ＲＳＱＴＬＡＱ；およびＲＴＤＴＬＲＤ（配列番号１０４−１１９）よりなる群から選択されることができ；ＣＧＴに特異的に結合する（ｃ）の認識へリックスはＲＳＱＴＲＫＴ（配列番号１５４）およびＳＲＲＴＣＲＡ（配列番号１５５）よりなる群から選択されることができ；ＧＡＴに特異的に結合する（ｄ）の認識へリックスはＶＲＨＮＬＴＲ、ＩＳＨＮＬＡＲ、ＩＳＳＮＬＱＲ、ＬＧＮＮＬＫＲ、ＬＮＳＮＬＡＲ、ＬＳＴＮＬＴＲ、ＬＴＨＮＬＲＲ、ＱＳＳＮＬＡＲ、ＲＳＤＡＬＩＱ、ＳＫＱＡＬＡＶ、ＴＧＱＱＬＲＶ、ＴＫＱＲＬＶＶ、ＴＲＱＲＬＲＩ、ＴＳＡＮＬＳＲ、ＴＳＧＮＬＶＲ、ＴＳＱＭＬＶＶ、ＴＳＳＮＬＳＲ、ＴＴＳＮＬＲＲ、ＶＧＨＮＬＳＲ、ＶＧＳＮＬＴＲ（配列番号２５１−２７０）よりなる群から選択されることができ；ＧＴＣに特異的に結合する（ｅ）の認識へリックスはＤＲＴＳＬＡＲ、ＤＨＳＳＬＫＲ、ＡＰＳＳＬＲＲ、ＤＡＴＱＬＶＲ、ＤＰＧＡＬＶＲ、ＤＰＴＳＬＮＲ、ＤＲＳＡＬＡＲ、ＤＲＳＡＬＳＲ、ＤＲＳＳＬＲＲ、ＤＲＴＰＬＮＲ、ＤＲＴＰＬＱＮ、ＥＧＧＡＬＲＲ、ＥＳＧＡＬＲＲ、ＮＴＳＬＬＲＲ、ＲＳＤＶＬＳＥ、ＴＧＡＶＬＲＲ、ＴＧＡＶＬＴＲ、ＴＫＫＩＬＴＶ、ＴＫＳＬＬＡＲ、ＴＭＡＶＬＲＲ、ＴＲＡＶＬＲＲ、ＴＳＴＩＬＡＲ、ＴＳＴＬＬＫＲおよびＴＳＴＬＬＮＲ（配列番号５３０−５５３）よりなる群から選択されることができ；ＡＡＣに特異的に結合する（ｆ）の認識へリックスはＤＲＳＮＲＫＴ、ＤＳＧＮＬＲＶ、ＧＡＳＡＬＲＱ、ＧＡＳＡＬＲＳ、ＧＧＴＡＬＲＭ、ＧＧＴＡＬＶＭ、ＧＨＴＡＬＡＬ、ＧＨＴＡＬＲＨ、ＧＨＴＡＬＲＮ、ＧＰＴＡＬＶＮおよびＨＲＴＮＬＩＡ（配列番号６３−７３）よりなる群から選択されることができ；ＣＧＣに特異的に結合する（ｇ）の認識へリックスはＨＴＧＨＬＬＥ（配列番号１５１）であることができ；ならびに、ＧＴＴに特
異的に結合する（ｈ）の認識へリックスはＨＫＳＳＬＴＲ、ＴＮＱＡＬＧＶ、ＡＡＴＡＬＲＲ、ＨＨＮＳＬＴＲ、ＨＳＳＳＬＶＲ、ＩＫＡＩＬＴＲ、ＩＮＨＳＬＲＲ、ＩＲＴＳＬＫＲ、ＭＮＳＶＬＫＲ、ＭＴＳＳＬＲＲ、ＱＡＴＬＬＲＲ、ＱＳＳＡＬＴＲ、ＴＨＴＶＬＡＲ、ＴＫＰＶＬＫＩ、ＴＮＳＶＬＧＲ、ＴＲＨＳＬＧＲ、ＴＳＧＡＬＴＲ、ＴＳＧＳＬＴＲ、ＴＳＧＳＬＶＲ、ＴＳＴＬＬＫＲ、ＴＳＴＲＬＤＩ、ＴＴＡＬＬＫＲ、ＴＴＳＡＬＴＲ、ＴＴＴＶＬＡＲおよびＶＧＧＳＬＮＲ（配列番号５８３−６０７）よりなる群から選択されることができ；ＧＡＴに特異的に結合する（ｉ）の認識へリックスはＩＳＨＮＬＡＲ、ＶＲＨＮＬＴＲ、ＩＳＳＮＬＱＲ、ＬＧＮＮＬＫＲ、ＬＮＳＮＬＡＲ、ＬＳＴＮＬＴＲ、ＬＴＨＮＬＲＲ、ＱＳＳＮＬＡＲ、ＲＳＤＡＬＩＱ、ＳＫＱＡＬＡＶ、ＴＧＱＱＬＲＶ、ＴＫＱＲＬＶＶ、ＴＲＱＲＬＲＩ、ＴＳＡＮＬＳＲ、ＴＳＧＮＬＶＲ、ＴＳＱＭＬＶＶ、ＴＳＳＮＬＳＲ、ＴＴＳＮＬＲＲ、ＶＧＨＮＬＳＲおよびＶＧＳＮＬＴＲ（配列番号２５１−２７０）よりなる群から選択されることができ；ならびに、ＧＴＣに特異的に結合する（ｊ）の認識へリックスはＤＲＴＳＬＡＲ、ＤＨＳＳＬＲＫＲ、ＡＰＳＳＬＲＲ、ＤＡＴＱＬＶＲ、ＤＰＧＡＬＶＲ、ＤＰＴＳＬＮＲ、ＤＲＳＡＬＡＲ、ＤＲＳＡＬＳＲ、ＤＲＳＳＬＲＲ、ＤＲＴＰＬＮＲ、ＤＲＴＰＬＱＮ、ＥＧＧＡＬＲＲ、ＥＳＧＡＬＲＲ、ＮＴＳＬＬＲＲ、ＲＳＤＶＬＳＥ、ＴＧＡＶＬＲＲ、ＴＧＡＶＬＴＲ、ＴＫＫＩＬＴＶ、ＴＫＳＬＬＡＲ、ＴＭＡＶＬＲＲ、ＴＲＡＶＬＲＲ、ＴＳＴＩＬＡＲ、ＴＳＴＬＬＫＲおよびＴＳＴＬＬＮＲ（配列番号５３０−５５３）よりなる群から選択されることができる。
これらおよび他のトリプレットのなお他の認識へリックスを本発明の多様な態様で利用しうる。以下の表は多様な３塩基対トリプレットの具体的に説明する認識へリックスを提供する。
一態様において、エンドヌクレアーゼ触媒ドメインは、該最低１０個の独立に選択された認識へリックスが全部異なるＺｎフィンガーに連結される。ある態様において、アブレーション部位の塩基対の反復されるトリプレットに対する異なる認識へリックスを包含することが望ましいことができる。他の態様において、いずれの反復されるトリプレットに対する認識へリックスも同一である。例えば選択される認識へリックスの０、１、２若し
くは３個が同一である。
ある態様において、ＡＡＶベクターは、同一若しくは相互と異なってよい２個若しくはそれ以上のエンドヌクレアーゼアブレーション部位を含有する。これらのエンドヌクレアーゼアブレーション部位は多様な配置でベクター中に操作しうる。より具体的には、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を運搬するＡＡＶベクターは、目的の遺伝子のコーディング鎖に対し５’に最低１個のアブレーション部位を含有するように操作される。ベクターが２個若しくはそれ以上のアブレーション部位を含有する場合、第二のアブレーション部位は：センス方向の目的の遺伝子に対し３’；逆方向で目的の遺伝子に対し３’に配置されることができ；２個のアブレーション部位がセンス方向の一方および逆方向の他方、または双方がセンス方向で目的の遺伝子に対し５’に配置され得るか；あるいは、該ベクターは、目的の遺伝子に対し５’に１若しくは２個のアブレーション部位（１個がセンスおよび１個が逆方向で、若しくは双方がセンス方向で）ならびに目的の遺伝子に対し３’に２個のアブレーション部位（１個がセンスおよび１個が逆方向で、若しくは双方がセンス方向で）を含有しうる。
目的の介在遺伝子が存在しないような２個のアブレーション部位が配置される（すなわち２個の５’若しくは２個の３’アブレーション部位）場合、アブレーション部位はスペーサーにより分離されうる。いかなる適するスペーサーも選択してよく、そしてスペーサー配列は非コーディング配列でありうる。別の態様において、スペーサー配列はレポーター遺伝子、トランスジーン若しくは目的の遺伝子でありうる。
一態様において、本発明の組成物が１個以上のアブレーション部位を含有する場合、該アブレーション部位は同一である。別の態様において、本発明の組成物若しくはベクター系が１個以上のアブレーション部位を含有する場合、各部位は他者と異なり、そしてそれぞれが異なるキメラエンドヌクレアーゼにより特異的かつ選択的に標的とされる。
下の作業実施例において、配列：１０ｘＺＦ−ＦｏｋＩ＿Ｃａｔヌクレオチド配列すなわち配列番号５９によりコードされるアブレーターが具体的に説明される。すなわち
ＡＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣＴＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＴＧＣＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＧＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ
ＧＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＡＧ。
転写された具体的に説明するアブレーターは配列すなわち１０ｘＺＦ−ＦｏｋＩ＿Ｃａｔアミノ酸配列：配列番号６０すなわち
ＭＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＲＲＳＬＧＨＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＫＫＮＤＬＴＲＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＳＲＲＴＣＲＡＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＴＳＬＡＲＨＬＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＤＳＧＮＬＲＶＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＨＴＧＨＬＬＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＮＱＡＬＧＶＨＬＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＤＲＴＳＬＡＲＨＱＲＴＨ−ＧＴＳＧＫＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＰＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＥＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ
を有する。
付加的な一態様において、それが、本明細に詳細に記述されかつ引用することにより本明細書に組み込まれるような薬理学的作用剤により二量体化された後に転写因子により活性化されるカセットにより制御されるようなアブレーターが操作される。典型的には、このカセットは２個の転写ユニットを含んでなる。該２個の転写ユニットの１個は第一のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；および該２個の転写ユニットの第二は第二のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子の活性化ドメインをコードする。本明細の別の場所により詳細に記述されかつ本明細書に組み込まれるとおり、該第一のプロモーターおよび第二のプロモーターは構成的プロモーターおよび誘導可能なプロモーターから独立に選択される。一態様において、第一および第二のプロモーターは双方が構成的プロモーターであり、ならびに薬理学的作用剤は転写因子のドメインを二量体化する二量体化剤である。別の態様において、第一のプロモーターおよび第二のプロモーターの一方が誘導可能なプロモーターである。場合によっては該２個の転写ユニットはＩＲＥＳ若しくはフリン−２Ａを含有する２シストロン性ユニットである。ベクター構築に適する多様な遺伝要素および方法は本明細の別の場所に記述されかつ引用することにより本明細書に組み込まれる。
さらなる一態様において、プロモーターはラパマイシンで調節可能な系により制御され、および薬理学的作用剤はラパマイシン若しくはラパログである。
本態様は、アブレーション認識部位中の独特の（最低３０ｂｐ）核酸配列および最低１０×のＺｎフィンガーを含有するキメラエンドヌクレアーゼを使用して、本明細書および当業者に既知の他の技術に記述されるとおり生成しうる。
複製欠損ウイルス組成物の生成方法
トランスジーンをパッケージングする組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の多くの効率的製造方法が確立されている。これらを本発明の複製欠損ウイルス組成物を生成するのに使用若しくは適合しうる。１つの一系において、産生株細胞株を、ＩＴＲにより隣接されているトランスジーンをコードする構築物ならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物（１種若しくは複数）で一過性にトランスフェクトする。第二の系において、ｒｅｐおよびｃａｐを安定に供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲにより隣接されているトランスジーンをコードする構築物で一過性にトランスフェクトする。第三の系において、ＩＴＲにより隣接されているトランスジーンおよびｒｅｐ／ｃａｐを供給する安定細胞株を使用する。これらの系を使用して複製能力のあるＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）を生成する可能性を最小限にするための一方法は、ｒｅｐ／ｃａｐカセットに隣接する領域とトランスジーンに隣接するＩＴＲの間の相同な領域を排除することによる。しかしながら、これらの系のそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンがヘルパーアデノウイルス若しくはヘルペスウイルスへの感染に応答して産生されて、汚染するウイルスからのｒＡＡＶの分離を必要とする。
より最近、ＡＡＶを回収するためのヘルパーウイルスへの感染を必要としない系が開発された。必要とされるヘルパー機能（すなわちアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４若しくはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた該系によりトランスに供給される。これらのより新たな系において、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションにより供給し得るか、または、細胞は、その発現を転写若しくは転写後レベルで制御し得るヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含有するよう操作し得る。なお別の系において、ＩＴＲにより隣接されているトランスジーンおよびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バキュロウイルスに基づくベクターへの感染により昆虫細胞に導入する。これら産生系に関する総説については、全般として、例えばＧｒｉｅｇｅｒとＳａｍｕｌｓｋｉ，２００５；およびＢｔｉｎｉｎｇら、２００８；Ｚｈａｎｇら、２００９、“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２−９２９（そのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらおよび他のＡＡＶ産生系の作成および使用方法は以下の米国特許（そのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）すなわち第５，１３９，９４１号明細書；第５，７４１，６８３号明細書；第６，０５７，１５２号明細書；第６，２０４，０５９号明細書；第６，２６８，２１３号明細書；第６，４９１，９０７号明細書；第６，６６０，５１４号明細書；第６，９５１，７５３号明細書；第７，０９４，６０４号明細書；第７，１７２，８９３号明細書；第７，２０１，８９８号明細書；第７，２２９，８２３号明細書および第７，４３９，０６５号明細書にもまた記述されている。これらの系およびそれらの変形を使用するＡＡＶ製造のスケールアップ方法を記述する下の段落もまた参照されたい。
パッケージングする（およそ４．５ｋｂのトランスジーンを許容する）ためのＡＡＶの
大きさの制約により、記述される転写ユニット（ｕｎｉｔｅｓ）（すなわちトランスジーンユニット、アブレーターユニットおよび二量体化可能な転写因子ユニット）は、操作されかつ２種若しくはそれ以上の複製欠損ＡＡＶストックにパッケージングされることを必要としうる。パッケージング能力を超えることがより多数の「空の」ＡＡＶ粒子の生成につながりうるという証拠が存在するため、これは好ましいかもしれない。
あるいは、パッケージングに利用可能なスペースを、１種以上の転写ユニットを単独構築物中に組合せて従って必要とされる制御配列スペースの量を低下させることにより保存しうる。例えば、単独プロモーターが目的の２若しくは３種またはそれ以上の遺伝子をコードする単独ＲＮＡの発現を指図してよく、そして下流の遺伝子の翻訳がＩＲＥＳ配列により駆動される。別の例において、単独プロモーターは、自己切断ペプチド（例えばＴ２Ａ）若しくはプロテアーゼ認識部位（例えばフリン）をコードする配列により相互から分離されている目的の２若しくは３種またはそれ以上の遺伝子を単独オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に含有するＲＮＡの発現を指図しうる。該ＯＲＦは従って、翻訳の間（Ｔ２Ａの場合に）若しくは後のいずれかに個々のタンパク質（例えばトランスジーンおよび二量体化可能な転写因子のような）に切断される単独ポリタンパク質をコードする。しかしながら、これらＩＲＥＳおよびポリタンパク質系を使用してＡＡＶパッケージングスペースを確保し得るとは言え、それらは同一プロモーターにより駆動され得る成分の発現にのみ使用し得ることに留意すべきである。
別の代替において、ＡＡＶのトランスジーン容量を、アニーリングしてヘッドトゥテールコンカテマーを形成し得る２種のゲノムのＡＡＶ ＩＴＲを提供することにより増大させ得る。一般に、宿主細胞へのＡＡＶの進入に際して、トランスジーンを含有する一本鎖ＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体により二本鎖ＤＮＡに転化され、その後ＩＴＲが核中でのコンカテマー形成で補助する。一代替として、ＡＡＶを、ウイルスが標的細胞への進入に際して第二鎖合成の段階を迂回することを可能にしてより迅速かつ潜在的にはより高い（例えば１００倍まで）トランスジーン発現を自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶに提供するｓｃＡＡＶとなるよう操作しうる。例えば、ＡＡＶは、標的細胞中への送達後に一緒に切れて目的のトランスジーンユニットをコードする二本鎖ＤＮＡを生じることができる、それぞれトランスジーンユニットおよびその相補物をコードする２個の結合された一本鎖ＤＮＡを含んでなるゲノムを有するよう操作しうる。自己相補的ＡＡＶは例えば米国特許第６，５９６，５３５号明細書；第７，１２５，７１７号明細書；および第７，４５６，６８３号明細書（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
複製欠損ｒＡＡＶ中の転写ユニット（１個若しくは複数）は、本明細書に記述されるか、当該技術分野で既知であるか若しくは発見されるべきいずれのＡＡＶキャプシドタンパク質（Ｃａｐ）でもパッケージングされうる。血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９若しくはｒｈ１０からのＣａｐはヒト被験体での使用のためのｒＡＡＶを生成するのにとりわけ好ましい。好ましい一態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは血清型ＡＡＶ８に基づく。別の態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは２若しくは３種またはそれ以上のＡＡＶ血清型からのＣａｐに基づく。例えば、一態様において、ｒＡＡＶ ＣａｐはＡＡＶ６およびＡＡＶ９に基づく。
Ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主向性、細胞、組織若しくは器官特異性、受容体使用、感染効率および免疫原性に対する影響を有することが報告されている。例えば、ＧｒｉｅｇｅｒとＳａｍｕｌｓｋｉ、２００５；Ｂｕｎｉｎｇら、２００８；および本下位節で下に引用される参考文献（その全部はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。従って、ｒＡＡＶでの使用のためのＡＡＶ Ｃａｐは、例えば、処置されるべき被験体（例えばヒト若しくはヒト以外、被験体の免疫学的
状態、長期若しくは短期処置への被験体の適合性など）あるいは特定の治療応用（例えば特定の疾患若しくは障害の処置、または特定の細胞、組織若しくは器官への送達）の考慮に基づき選択しうる。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは、例えば特定の治療が標的とされる特定の細胞、組織若しくは器官に効率的に形質導入するその能力について選択される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ Ｃａｐは、緊密な内皮細胞バリアー、例えば血液脳関門、血液眼関門、血液精巣関門、血液卵巣関門、心を取り巻く内皮細胞バリアー、若しくは血液胎盤関門を横断するその能力について選択される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型の組織特異性はキャプシドの血清型により決定され、また、異なるＡＡＶキャプシドに基づくウイルスベクターは異なる組織を感染させるそれらの能力を考慮に入れて生成しうる。ＡＡＶ２は骨格筋、中枢神経系のニューロン、血管平滑筋細胞に対する天然の向性を提示する。ＡＡＶ１は、筋、関節炎の関節、膵島、心、血管内皮、中枢神経系（ＣＮＳ）および肝細胞の形質導入においてＡＡＶ２より効率的であることが記述されている一方、ＡＡＶ３は蝸牛内有毛細胞の形質導入、ＡＡＶ４は脳、ＡＡＶ５はＣＮＳ、肺、眼、関節炎の関節および肝細胞、ＡＡＶ６は筋、心および気道上皮、ＡＡＶ７は筋、ＡＡＶ８は筋、膵、心および肝、ならびにＡＡＶ９は心に十分に適するようである。例えばＢｕｎｉｎｇら、２００８を参照されたい。当該技術分野で既知のＡＡＶのいずれの血清型、例えば血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７［第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書を参照されたい］、ＡＡＶ８［例えば米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書を参照されたい］、ＡＡＶ９［第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書を参照されたい］、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、改変ＡＡＶ［例えば第ＷＯ ２００６／１１０６８９号明細書を参照されたい］若しくは未だ発見されるべきまたはそれらに基づく組換えＡＡＶもｒＡＡＶキャプシドの供給源として使用しうる。
多様な天然に存在するおよび組換えＡＡＶ、それらのコーディング核酸、ＡＡＶ ＣａｐおよびＲｅｐタンパク質ならびにそれらの配列、ならびに、ｒＡＡＶの製造における使用に適するこうしたＡＡＶおよびとりわけそれらのキャプシドの単離若しくは生成、増殖および精製方法は、Ｇａｏら、２００４、“Ｃｌａｄｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ”、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１−６３８８；米国特許第７，３１９，００２号明細書；第７，０５６，５０２号明細書；第７，２８２，１９９号明細書；第７，１９８，９５１号明細書；第７，２３５，３９３号明細書；第６，１５６，３０３号明細書；および第７，２２０，５７７号明細書；米国特許出願公開第ＵＳ ２００３−０１３８７７２号明細書；第ＵＳ ２００４−００５２７６４号明細書；第ＵＳ ２００７−００３６７６０号明細書；第ＵＳ ２００８−００７５７３７号明細書；および第ＵＳ ２００８−００７５７４０号明細書；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ ２００３１０１４３６７号明細書；第ＷＯ ２００１１０８３６９２号明細書；第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書（ＡＡＶ７および多様なサルＡＡＶ）；第ＷＯ ２００３／０５２０５２号明細書；第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書；第ＷＯ ２００６１１１０６８９号明細書；第ＷＯ ２００８／０２７０８４号明細書；ならびに第ＷＯ ２００７／１２７２６４号明細書（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶでの使用のためのＡＡＶ Ｃａｐは前述のＡＡＶ Ｃａｐ若しくはそのコーディング核酸の１種の突然変異誘発により（すなわち挿入、欠失若しくは置換により）生成し得る。いくつかの態様において、ＡＡＶ Ｃａｐは、前述の
ＡＡＶ Ｃａｐの１種若しくはそれ以上に最低７０％同一、７５％同一、８０％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同一、９８％同一または９９％若しくはそれ以上同一である。
いくつかの態様において、ＡＡＶ Ｃａｐは前述のＡＡＶ Ｃａｐの２若しくは３若しくは４種またはそれ以上からのドメインを含んでなるキメラである。いくつかの態様において、ＡＡＶ Ｃａｐは２若しくは３種の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶからのＶｐ１、Ｖｐ２およびＶｐ３単量体のモザイクである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は前述のＣａｐの１種以上を含んでなる。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物での使用のためのＡＡＶ Ｃａｐは、異種配列若しくは他の改変を含有するよう操作される。例えば、選択的ターゲッティング若しくは免疫回避を付与するペプチド若しくはタンパク質配列をＣａｐタンパク質中に操作しうる。あるいは、若しくは加えて、Ｃａｐは、ｒＡＡＶの表面が免疫回避を助長しうるポリエチレングリコール化（ペグ化）されるように化学修飾しうる。Ｃａｐタンパク質は、例えばその天然の受容体結合を除去する若しくは免疫原性エピトープを遮蔽するようにもまた突然変異誘発しうる。
ＡＡＶのスケーラブル製造方法
臨床応用での使用のため適して均質でありかつ汚染物質を含まないｒＡＡＶ組成物を生成するために適合しうるＡＡＶのスケーラブル（例えば商業的スケールでの製造のため）製造方法もまた当該技術分野で既知であり、そして下に簡単に要約する。
アデノ随伴ウイルスは、Ｔｈｏｍｅら、２００９、“Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ”、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７０７−７１４（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される安定産生株細胞株を使用するアプローチのような哺乳動物細胞株に基づくアプローチを使用するスケールで製造し得る。Ｔｈｏｒｐｅらにより記述されるアプローチにおいて、ｒＡＡＶを生成するのに必要とされる全部の成分、すなわちトランスジーン構築物（ＩＴＲにより隣接されているトランスジーン）ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、を安定に含有する産生株細胞株を操作し、それを生存アデノウイルス５型（Ａｄ５）（そのスケーラブル製造方法もまた当該技術分野で公知である）のようなヘルパーウイルスへの感染によりウイルスを作成するよう誘導する。産生株細胞株を、（ｉ）パッケージングカセット（所望の血清型のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにそれらの発現に必要とされる調節エレメント）、（ｉｉ）ＩＴＲにより隣接されているトランスジーン、（ｉｉｉ）哺乳動物細胞の選択マーカー、ならびに（ｉｖ）細菌中でのプラスミド増殖に必要な成分、を含有する構築物（１種若しくは複数）で安定にトランスフェクトする。安定な産生株細胞株は、パッケージング構築物（１種若しくは複数）をトランスフェクトすること、薬剤耐性細胞を選択すること、およびヘルパーウイルスの存在下で組換えＡＡＶの産生を確認するためのレプリカプレーティングにより得られ、それをその後性能および質についてスクリーニングする。適切なクローンが一旦選ばれれば、該細胞株の増殖をスケールアップし、細胞をアデノウイルスヘルパーに感染させ、そして生じるｒＡＡＶを細胞から収集する。
Ｔｈｏｒｐｅらに記述される方法の一代替において、パッケージング細胞株をＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子で安定にトランスフェクトし、そしてｒＡＡＶの産生が望ましい場合はトランスジーン構築物を別個に導入する。Ｔｈｏｒｐｅらは産生株細胞株にＨｅＬａ細胞を使用するとは言え、ヘルパーウイルスへの感染に感受性であり、ｒｅｐ遺伝子の安定に組み込まれたコピーを維持することが可能であり、そして好ましくはバイオリア
クター中での増殖および生産のため懸濁液中で良好に増殖することが可能であるいかなる細胞株（例えばＶｅｒｏ、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３）も、Ｔｈｏｒｐｅらに記述される方法に従って使用しうる。
前述の方法において、ｒＡＡＶはヘルパーウイルスとしてアデノウイルスを使用して製造する。これらの方法の一改変において、ｒＡＡＶはアデノウイルスヘルパー機能を含有する１種若しくはそれ以上の構築物で安定にトランスフェクトされている産生株細胞を使用して生成し得、アデノウイルスに細胞を感染させる要件を回避する。一変形において、アデノウイルスヘルパー機能の１種若しくはそれ以上はｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子と同一の構築物内に含有される。これらの方法において、アデノウイルスヘルパー機能の発現は、アデノウイルスに関連する細胞傷害性を回避するため転写若しくは転写後制御下に置くことができる。
安定細胞株を製造することに対する一代替において、ＡＡＶは、Ｗｒｉｇｈｔ、２００９、“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：６９８−７０６（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されるような一過性トランスフェクション法を使用してスケールでもまた製造しうる。Ｗｒｉｇｈｔのアプローチは、（ｉ）ＩＴＲにより隣接されている目的のトランスジーン；（ｉｉ）ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子；ならびに（ｉｉｉ）ゲノムの複製およびパッケージングを支援するのに必要とされるヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）遺伝子（若しくは、あるいは、Ｔｈｏｒｐｅらに記述されるところのヘルパーウイルス）を含有する構築物での細胞のトランスフェクションを必要とする。あるいは、アデノウイルスヘルパー機能はｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子と同一の構築物内に含有されてもよい。従って、ｒＡＡＶは、トランスジーンおよびｒｅｐ／ｃａｐ構築物の安定なトランスフェクションを確保しなければならないことなく製造される。これは融通がききかつ迅速なＡＡＶ生成方法を提供し、ならびに従って前臨床および初期臨床開発に理想的である。組換えＡＡＶは、当該技術分野で既知の一過性トランスフェクション法を使用して哺乳動物細胞株を該構築物で一過性にトランスフェクトすることにより生成し得る。例えば、大スケール製造に最も適するトランスフェクション法は、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥ）のようなポリカチンの使用、および陽イオン性脂質を包含する。
ヘルパーとしてのアデノウイルスの有効性もまた、例えばアデノウイルスおよびＡＡＶに基づくハイブリッドウイルス（「Ａｄ−ＡＡＶハイブリッド」）を使用する大スケール組換えＡＡＶ製造の代替法を開発するのに活用されている。この製造法は、それがトランスフェクションを必要とせず、ｒＡＡＶ製造に必要とされる全部がアデノウイルスによるｒｅｐ／ｃａｐパッケージング細胞の感染であるという利点を有する。この方法において、安定なｒｅｐ／ｃａｐ細胞株を、機能的Ｅ１遺伝子を保有するヘルパーアデノウイルス、そしてその後、ＡＡＶトランスジーンおよびＩＴＲ配列がアデノウイルスＥ１領域に挿入されている組換えＡｄ−ＡＡＶハイブリッドウイルスに感染させる。Ａｄ−ＡＡＶハイブリッドの生成方法および組換えＡＡＶ製造におけるそれらの使用は、Ｚｈａｎｇら、２００９（そっくりそのまま本明細書に引用することにより組み込まれる）に記述されている。
別の変形において、ｒＡＡＶを、Ｃｌｅｍｅｎｔら、２００９、“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ”、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７９６−８０６（そっくりそのまま引
用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるようなＡＡＶおよび単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ）に基づくハイブリッドウイルス（「ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッド」）を使用して生成し得る。この方法はＡＡＶ製造のためのヘルパーウイルスとしてＨＳＶを使用することの可能性（当該技術分野で公知かつＣｌｅｍｅｎｔらにもまた総説される）を詳述する。簡潔には、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドはＨＳＶバックボーン内にＡＡＶトランスジーン構築物を含んでなる。これらハイブリッドを使用して、ｒｅｐ／ｃａｐおよびヘルペスウイルスヘルパー機能を供給する産生株細胞を感染させ得るか、若しくはヘルパー機能を供給する組換えＨＳＶとのコトランスフェクションで使用することができ、目的のトランスジーンを被包化するｒＡＡＶの生成をもたらす。
別の方法において、ｒＡＡＶ組成物は、例えばＶｉｒａｇら、２００９、“Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｆｏｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ：Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ”、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：８０７−８１７（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところの昆虫細胞中でのＡＡＶ成分の組換えバキュロウイルス媒介性発現を使用してスケールで製造しうる。この系において、公知のバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）系を組換えＡＡＶを製造するように適合させる。例えば、Ｖｉｒａｇらにより記述される系は、（ｉ）ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ（１若しくは２種いずれかのＢＥＶ中の）ならびに（ｉｉ）トランスジーン構築物を提供する２（若しくは３）種の異なるＢＥＶへのＳｆ９昆虫細胞の感染を含んでなる。あるいは、Ｓｆ９細胞をｒｅｐおよびｃａｐを発現するよう安定に操作して、トランスジーン構築物を含有する単独ＢＥＶのみへの感染後の組換えＡＡＶの産生を可能にすることができる。ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質（その後者は効率的パッケージングに必要とされる）の化学量論的製造を確実にするため、ＢＥＶは遺伝子発現の転写前および後調節を可能にする機能を包含するよう操作し得る。Ｓｆ９細胞がその後トランスジーン構築物をＡＡＶキャプシド中にパッケージングし、そして生じるｒＡＡＶを細胞上清から若しくは細胞を溶解することにより収集し得る。
前述の方法のそれぞれはｒＡＡＶ組成物のスケーラブル製造を可能にする。商業的使用（診療室での使用を包含する）に適するｒＡＡＶ組成物の製造方法はまた、汚染する細胞の除去の段階；ヘルパーウイルス（および内因性レトロウイルス様粒子のようないかなる他の汚染するウイルスも）を除去および不活性化する段階；いかなるｒｃＡＡＶも除去および不活性化する段階；（例えば遠心分離により）空の（トランスジーンなし）ＡＡＶ粒子の産生を最小限にする、定量するおよび除去する段階；（例えば濾過または大きさおよび／若しくは親和性に基づくクロマトグラフィーにより）ｒＡＡＶを精製する段階；ならびに純度および安全性についてｒＡＡＶ組成物を試験する段階も含まなければならない。これら方法は前述の段落で引用される参考文献にもまた提供されており、そしてこの目的上本明細書に組み込まれる。
前述のスケーラブルｒＡＡＶ製造方法の一欠点は、ｒＡＡＶの多くが産生株細胞を溶解することにより得られることであり、これはウイルスを得るだけでなくしかしまたそれを細胞性汚染物質から単離するための大きな努力を必要とする。これら要件を最小限にするため、国際特許出願公開第ＷＯ ２００７／１２７２６４号明細書（その内容はそっくりそのまま本明細書に引用することにより組み込まれる）に提供されるような細胞溶解を必要としないスケーラブルｒＡＡＶ製造方法を使用しうる。下の６節の実施例において、細胞培養上清からｒＡＡＶを得る新しいスケーラブルな方法が提供され、これは本明細書に記述される方法による使用のためのｒＡＡＶ組成物の製造にもまた適合させうる。
なお別の態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物および／若しくはウイルス組成物の１種若しくはそれ以上を含有するヒト若しくはヒト以外の細胞を提供する。こうした細胞は遺伝子操作することができ、そして例えば植物、細胞、ヒト以外の哺乳動物若しくは哺乳動物細胞を包含しうる。細胞型の選択は本発明の制限でない。
５．２．組成物
本発明は、ウイルスのゲノム（または組合せで用いられる２種若しくはそれ以上の複製欠損ウイルスストックの集合的ゲノム）が、３．１節に定義されかつ上述される治療的トランスジーンユニットおよびアブレーターユニットを含んでなり；ならびに、二量体化可能な融合タンパク質若しくはＴＦドメインユニット（１個若しくは複数）（便宜さの目的上二量体化可能なユニット（１個若しくは複数）と称される）をさらに含みうる、治療（ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏ）での使用に適する複製欠損ウイルス組成物を提供する。限定されるものでないがアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レンチウイルス若しくはレトロウイルスを挙げることができる、遺伝子治療に適するいかなるウイルスも本発明の組成物で使用しうる。好ましい一態様において、組成物は本明細書の５．２．１節により詳細に記述される複製欠損ＡＡＶである。
本発明の組成物は、ウイルス（１種若しくは複数）のゲノムがトランスジーンユニット、アブレーションユニットおよび／若しくは二量体化可能なユニットを含んでなる、治療（ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏ）に適する複製欠損ウイルス（１種若しくは複数）を含んでなる。一態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがトランスジーンユニットを含んでなる遺伝子治療に適するウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがアブレーションユニットを含んでなる遺伝子治療に適するウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムが二量体化可能なユニットを含んでなる遺伝子治療に適するウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがトランスジーンユニットおよびアブレーションユニットを含んでなる遺伝子治療に適するウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがトランスジーンユニットおよび二量体化可能なユニットを含んでなる遺伝子治療に適するウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがアブレーションユニットおよび二量体化可能なユニットを含んでなる遺伝子治療に適するウイルスを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物は、ウイルスのゲノムがトランスジーンユニット、アブレーションユニットおよび二量体化可能なユニットを含んでなる遺伝子治療に適するウイルスを含んでなる。
本発明はまた、本明細書に記述される１種若しくはそれ以上の転写ユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物を含んでなる組成物も提供する。組換えＤＮＡ構築物を含んでなる組成物は５．２．２節により詳細に記述される。
５．２．１．遺伝子治療のための複製欠損ウイルス組成物
本発明は、複製欠損ウイルスストック（１種若しくは複数）を含んでなる組成物および生理学的に許容できる担体中の複製欠損ウイルス（１種若しくは複数）の製剤を提供する。これら製剤は遺伝子移入および／若しくは遺伝子治療に使用し得る。該組成物のウイルスゲノムは、（ａ）転写を制御するプロモーターと作動的関連の治療的産物をコードする第一の転写ユニットであって、前記ユニットは最低１個のアブレーション認識部位を含有し（トランスジーンユニット）；および（ｂ）プロモーターと作動的関連のアブレーション認識部位若しくはそのフラグメントに特異的なアブレーターをコードする第二の転写ユニットを含んでなる。一態様において複製欠損ウイルスのウイルスゲノム。アブレーターは本明細の別の場所で定義されるとおりである。
ＡＡＶストック
好ましい一態様において、本発明の組成物の複製欠損ウイルスはＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９若しくはｒｈ１０である。一態様において組成物のＡＡＶはＡＡＶ８である。ほとんどの場合のＡＡＶのパッケージングの制約（およそ４．５ｋｂ）により、製造の容易さのため、トランスジーンユニット、アブレーションユニットおよび二量体化可能なユニットは、２種若しくはそれ以上のウイルスベクター間で分割しそして別個のＡＡＶストックにパッケージングされることができる。一態様において、該複製欠損ウイルス組成物は、１種のＡＡＶストックにパッケージングされる第一の転写ユニット（トランスジーンユニット）、ならびに第二のＡＡＶストックにパッケージングされる第二（アブレーターユニット）、第三および第四の転写ユニット（二量体化可能なＴＦドメインユニット）を含んでなる。別の態様において、該複製欠損ウイルス組成物は、１種のＡＡＶストックにパッケージングされる第二の転写ユニット（アブレーターユニット）、ならびに第二のＡＡＶストックにパッケージングされる第一（トランスジーンユニット）、第三および第四の転写ユニット（二量体化可能なＴＦドメインユニット）を含んでなる。別の態様において、全４ユニットを１種のＡＡＶストックにパッケージングし得るが、しかしこれはパッケージングされ得るＤＮＡの大きさに対する制限を課す。例えば、アブレーターとしてＣｒｅおよび二量体化可能なＴＦドメインとしてＦＲＢ／ＦＫＢを使用する場合（下の実施例に示されるところの）、１種のＡＡＶストックに全４ユニットをパッケージングするために、治療的トランスジーンをコードするＤＮＡの大きさは長さが約９００塩基対未満であるべきであり；これはサイトカインをコードするＤＮＡ、ＲＮＡｉ治療薬などを収容するとみられる。
パッケージングのためのＡＡＶゲノムの大きさの制約により、転写ユニットは２種若しくはそれ以上のＡＡＶストック中で操作かつパッケージングし得る。本発明のウイルス組成物として使用される１種のウイルスストックにパッケージングされようと、本発明のウイルス組成物を形成する２種若しくはそれ以上のウイルスストックにパッケージングされようと、処置に使用されるウイルスゲノムは、治療的トランスジーンおよびアブレーターをコードする第一および第二の転写ユニットを集合的に含有しなければならず；また、付加的な転写ユニット（例えば、二量体化可能なＴＦドメインをコードする第三および第四の転写ユニット）をさらに含んでよい。例えば、第一の転写ユニットを１種のウイルスストックにパッケージングし得、ならびに第二、第三および第四の転写ユニットを第二のウイルスストックにパッケージングし得る。あるいは、第二の転写ユニットを１種のウイルスストックにパッケージングし得、ならびに第一、第三および第四の転写ユニットを第二のウイルスストックにパッケージングし得る。大きさによりＡＡＶに有用ながＡＡＶゲノムのパッケージングにおいて含有する一方、他のウイルスを使用して本発明のウイルス組成物を製造しうる。別の態様において、それらが複数のウイルスを含有する本発明のウイルス組成物は、異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有しうる。
一態様において、本発明のウイルス組成物は上述されるような組合せで２種若しくはそれ以上の異なるＡＡＶ（若しくは別のウイルス）を含有する。例えば、ウイルス組成物は、アブレーター認識部位および第一のアブレーターを伴う治療的遺伝子を含んでなる第一のウイルスストック、ならびに付加的なアブレーター（１個若しくは複数）を含有する第二のウイルスストックを含有しうる。別のウイルス組成物は、治療的遺伝子およびアブレーターのフラグメントを含んでなる第一のウイルスストック、ならびにアブレーターの別のフラグメントを含んでなる第二のウイルスストックを含有しうる。本発明のウイルス組成物中の２種若しくはそれ以上のウイルスストックの多様な他の組合せが本系の成分の記述から明らかであろう。
ウイルス製剤
本発明の組成物は、獣医学の目的上動物（例えば家畜（畜牛、豚など）および他のヒト以外の哺乳動物被験体ならびにヒト被験体への送達のため処方しうる。該複製欠損ウイルスは、遺伝子移入および遺伝子治療の応用での使用のため生理学的に許容できる担体とともに処方し得る。該ウイルスは複製欠損であるため、製剤の投薬量はＰＦＵ（プラーク形成単位）として測定若しくは計算し得ない。代わりに、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化を、製剤に含有される用量の尺度として使用しうる。
当該技術分野で既知のいかなる方法も、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するのに使用し得る。ＡＡＶ ＧＣ数用量設定の一実施方法は後に続くとおりである。すなわち、精製されたＡＡＶベクターサンプルを最初にＤＮアーゼで処理して、被包化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡ若しくは汚染するプラスミドＤＮＡを製造工程から排除する。ＤＮアーゼ耐性粒子をその後熱処理にかけてキャプシドからゲノムを放出させる。放出されたゲノムをその後、ウイルスゲノムの特定領域（通常ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブ組を使用するリアルタイムＰＣＲにより定量する。
また、複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者について、約１．０×１０9ＧＣないし約１．０×１０15ＧＣ（体重が７０ｋｇの平均的被験体を処置するため）、および好ましくは１．０×１０12ＧＣないし１．０×１０14ＧＣの範囲にある複製欠損ウイルスの量を含有するよう、投薬量単位に処方し得る。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルスの用量は、１．０×１０9ＧＣ、５．０×１０9ＧＣ、１．０×１０10ＧＣ、５．０×１０10ＧＣ、１．０×１０11ＧＣ、５．０×１０11ＧＣ、１．０×１０12ＧＣ、５．０×１０12ＧＣ、若しくは１．０×１０13ＧＣ、５．０×１０13ＧＣ、１．０×１０14ＧＣ、５．０×１０14ＧＣ、または１．０×１０15ＧＣである。
該複製欠損ウイルスは１種若しくはそれ以上の生理学的に許容できる担体若しくは賦形剤を使用して慣習的様式で処方し得る。該複製欠損ウイルスは、注入による、例えばボーラス注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは連続的注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による非経口投与のため処方しうる。注入のための製剤は、添加される保存剤を伴い単位剤形例えばアンプル若しくは複数用量容器中で提示しうる。該複製欠損ウイルス組成物は、油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液若しくは乳剤のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定化剤および／若しくは分散助剤のような製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ
ａｇｅｎｔ）を含有しうる。複製欠損ウイルス製剤の液体製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体若しくは水素添加可食脂肪）；乳化剤（例えばレシチン若しくはアカシア）；非水性ベヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール若しくは分画植物油）；および保存剤（例えばメチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）のような製薬学的に許容できる添加物を用いて慣習的手段により製造しうる。該製剤は緩衝塩もまた含有しうる。あるいは、該組成物は使用前に適するベヒクル例えば無菌のパイロジェンフリー水での構成のための粉末形態にありうる。
本発明の複製欠損ウイルスと組合せ若しくは混合状態のアジュバントの使用もまた包含される。企図されるアジュバントは限定されるものでないが無機塩アジュバント若しくは無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜性アジュバントおよび免疫刺激性アジュバントを挙げることができる。アジュバントは本発明の複製欠損ウイルスとの混合物として被験体に投与し得るか、若しくは本発明の複製欠損ウイルスと組合せで使用し得る。
５．２．２．治療目的上有用な複製欠損ウイルスベクターの製造のための組換えＤＮＡ構築物組成物
本発明は、増幅されかつ複製欠損ウイルス粒子にパッケージングされるべき領域を定義するウイルスシグナルにより隣接されているトランスジーンユニット、アブレーションユニット、および／または１若しくは２個の二量体化可能なドメインユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物を提供する。これらＤＮＡ構築物を使用して複製欠損ウイルス組成物およびストックを生成し得る。
一態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されているトランスジーンユニットを含んでなる。別の態様において、本発明の組成物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されているアブレーションユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物を含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されている二量体化可能なユニットを含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されているトランスジーンユニットおよびアブレーションユニットを含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されているトランスジーンユニットおよび二量体化可能なユニットを含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されているアブレーションユニットおよび二量体化可能なユニットを含んでなる。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物は、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されているトランスジーンユニット、アブレーションユニットおよび二量体化可能なユニットを含んでなる。
第一の転写ユニットは、転写を制御するプロモーターと作動的に組み合わさった治療的産物であって、前記ユニットは最低１個のアブレーション認識部位（トランスジーンユニット）；および（ｂ）薬理学的作用剤に応答して転写を誘導するプロモーターと作動的に組み合わさった結合ドメインに融合されているアブレーション認識部位若しくはそのフラグメントに特異的なアブレーターをコードする第二の転写ユニット（アブレーションユニット）をコードする。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されている二量体化可能なＴＦドメインユニットを含んでなる。
好ましい一態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスのパッケージングシグナル内に入れ子状態の二量体化可能なユニットをさらに含んでなる。一態様において、各ユニットは、第二の転写ユニットの誘導可能なプロモーターを調節する転写因子の二量体化可能なドメインをコードし、ここで（ｃ）第三の転写ユニットは、構成的プロモーターと作動的に組み合わさった薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；および（ｄ）第四の転写ユニットは、構成的プロモーターと作動的に組み合わさった薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子の活性化ドメインをコードする。別の態様において、（ｃ）若しくは（ｄ）の少なくとも一方が誘導可能なプロモーター下で発現される。特定の一態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第二のユニットと作動的に組み合わさったプロモーターの転写を誘導する薬理学的作用剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるところの転写因子のドメインを二量体化する二量体化剤である。なお別の特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第二のユニットと作動的に組み合わさったプロモーターの転写を誘導する薬理学的作用剤はラパマイシンである。なおさらなる一態様において、組換えＤＮＡ構築物は二量体化可能な融合タンパク質ユニットを含んでなる。例えば、二量体化可能な融合タンパク質ユニットは、（ａ）結合ドメインに融合されている酵素の結合ドメインおよび（ｂ）結合ドメインに融合されている酵素の触媒ドメインをコードすることができ、ここで該結合ドメインはＤＮＡ結合ドメイン若しくは二量体化剤の結合ドメインいずれかである。
ウイルスゲノム（１種若しくは複数）内にスペースを保存するため、２シストロン性転
写ユニットを操作し得る。例えば、第三および第四の転写ユニットをＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）を含有する２シストロン性ユニットとして操作し得、これは単独のプロモーターからのメッセージによる異種遺伝子産物の発現を可能にする。あるいは、単独プロモーターが、自己切断ペプチド（例えばＴ２Ａ）若しくはプロテアーゼ認識部位（例えばフリン）をコードする配列により相互から分離されている２若しくは３種の異種遺伝子（例えば第三および第四の転写ユニット）を単独オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に含有するＲＮＡの発現を指図しうる。該ＯＲＦは、従って、翻訳の間（Ｔ２Ａの場合に）若しくは後に個々のタンパク質に切断される単独ポリタンパク質をコードする。しかしながら、これらＩＲＥＳおよびポリタンパク質系をＡＡＶパッケージングスペースを確保するために使用し得るとは言えそれらは同一プロモーターにより駆動され得る成分の発現にのみ使用し得ることに留意すべきである。
特定の一態様において、二量体化可能なユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、第三および第四の転写ユニット（二量体化可能なＴＦドメインユニット）を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はおよびＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、トランスジーンユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、アブレーションユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。別の特定の態様において、二量体化可能なユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＩＲＥＳを含んでなる。
特定の一態様において、第三および第四の転写ユニット（二量体化可能なＴＦドメインユニット）を含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。別の特定の態様において、トランスジーンユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。別の特定の態様において、アブレーションユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。別の特定の態様において、二量体化可能なＴＦドメインユニットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物組成物はＴ２Ａ配列を含んでなる。
一態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第二の転写ユニットによりコードされるアブレーターは、第一の転写ユニット中のアブレーション認識部位に結合しかつ切り出す若しくはアブレートするエンドヌクレアーゼ、組換え酵素、メガヌクレアーゼ、若しくは人工Ｚｎフィンガーエンドヌクレアーゼである。特定の一態様において、アブレーターがｅｒｅでありかつアブレーション認識部位がＬｏｘＰであるか、若しくはアブレーターがＦＬＰでありかつアブレーション認識部位がＦＲＴである。別の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物の第二の転写ユニットによりコードされるアブレーターは、第一の転写ユニットのＲＮＡ転写物をアブレートするか若しくは第一の転写ユニットのＲＮＡ転写物の翻訳を抑制する干渉ＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンスである。特定の一態様において、アブレーターの転写は、ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ系、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）で調節可能な系、タモキシフェン−ｄｅｐで調節可能な系、若しくはエクダイソン−ｄｅｐで調節可能な系により制御される。
組換えＤＮＡ構築物組成物は、複製欠損ウイルスベクター中で複製かつパッケージングされることが望ましい転写ユニットに隣接するパッケージングシグナルを含有する。特定の一態様においてパッケージングシグナルはＡＡＶ ＩＴＲである。シュードタイピングされたＡＡＶが産生されるべきである場合、ＩＴＲはキャプシドのＡＡＶ供給源と異なる供給源から選択する。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲをＡＡＶ１、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９キャプシドでの使用のため選択することができる、などである。別の特定の態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはキャプシドと同一供給源例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０ ＩＴＲなどからでありうる。別の特定の態様において、組換
えＤＮＡ構築物組成物は、ＡＡＶ ＩＴＲにより隣接されている第一の転写ユニット（トランスジーン）、ならびに、ＡＡＶ ＩＴＲにより隣接されている第二（アブレーションユニット）ならびに任意の第三および第四の転写ユニット（二量体化可能なＴＦドメインユニット）ならびに／若しくは二量体化可能な融合タンパク質ユニット（１種若しくは複数）を含んでなる。なお別の特定の態様において、組換えＤＮＡ構築物組成物は、ＡＡＶ
ＩＴＲにより隣接されている第二の転写ユニット（アブレーションユニット）を含んでなり、ならびに第一（トランスジーンユニット）、第三および第四の転写ユニット（二量体化可能なＴＦドメインユニット）はＡＡＶ ＩＴＲにより隣接されている。好ましい一態様において、ＰＩＴ Ａ系の転写ユニットが２種若しくはそれ以上の組換えＤＮＡ組成物に含有される。
特定の一態様において、組換えＤＮＡ構築物は、以下の治療的産物、すなわち、ＨＩＶ感染性を中和する抗体若しくは抗体フラグメント、可溶性内皮細胞増殖因子受容体−１（ｓＦｌｔ−Ｉ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、若しくは神経成長因子（ＮＧＦ）の誰か若しくはそれ以上をコードするトランスジーンユニットを含有する。特定の一態様において、組換えＤＮＡ構築物は、治療的遺伝子の転写を制御する以下のプロモーターすなわち構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導可能なプロモーター、若しくは生理学的合図に応答性のプロモーターの誰かを含んでなるトランスジーンユニットを含有する。
該ＤＮＡ構築物は複製欠損ウイルスストックを生成するため５．１．５節に記述される方法のいずれでも使用し得る。
５．２．３．二量体化剤の製薬学的組成物および製剤
本発明は５．１．４節に記述される本発明の二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物を提供する。好ましい一態様において、製薬学的組成物は製薬学的に許容できる担体若しくは賦形剤を含んでなる。場合によっては、これら製薬学的組成物は、本明細書に記述されるような獣医学の目的上例えばヒト以外の哺乳動物（例えば家畜）への送達のため適合される。
本発明の製薬学的組成物は、本発明のトランスジーンユニットのトランスジーンをアブレートする若しくは切り出す、またはトランスジーンの転写物をアブレートするすなわちその翻訳を阻害するための治療的有効用量で被験体に投与し得る。治療的有効用量は、該トランスジーンの発現により引き起こされる症状例えば毒性の軽減をもたらす、若しくは該トランスジーンの発現の最低６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％阻害をもたらすのに十分な製薬学的組成物の量を指す。
一態様において、約０．１〜５マイクログラム（μｇ）／キログラム（ｋｇ）の範囲にある、本発明の二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物の量を投与する。この目的のため、本発明の二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物は、体重が７０ｋｇの平均的被験体を処置するために約７ｍｇないし約３５０ｍｇの範囲の用量で処方される。投与される本発明の二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物の量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５若しくは５．０ｍｇ／ｋｇである。製剤中の二量体化剤の用量は、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５ ９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、若しくは７５０ｍｇ（体重が７０ｋｇの平均的被験体を処置するために処置
するために）である。これら用量は好ましくは経口投与される。これら用量は１回、または毎日、一日おき、毎週、２週間ごと若しくは毎月のような反復して与えることができる。好ましくは、製薬学的組成物は約４〜６週の期間、週１回与える。いくつかの態様において、二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物は、１用量で、若しくは２用量で、若しくは３用量で、若しくは４用量で、若しくは５用量で、または６用量若しくはそれ以上で被験体に投与する。投薬間の間隔は、例えばトランスジーンの発現により引き起こされる症状例えば毒性を軽減するためにトランスジーン発現の阻害に対する必要性が存在するという実務者の決定に基づき決定しうる。例えば、トランスジーンアブレーションに対する必要性が急性であるいくつかの態様において、二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物の１日投薬量を投与しうる。例えばトランスジーンアブレーションに対する必要性がより少なく急性である若しくは急性でない他の態様において、二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物の毎週の投薬量を投与しうる。
本発明の使用のための製薬学的組成物は、１種若しくはそれ以上の生理学的に許容できる担体若しくは賦形剤を使用して慣習的様式で処方しうる。従って、二量体化剤ならびにそれらの生理学的に許容できる塩および溶媒和物を、吸入若しくはガス注入（口若しくは鼻いずれかにより）による投与、経口、頬側、非経口、直腸若しくは経皮投与のため処方しうる。非侵襲的投与方法もまた企図している。
経口投与のため、該製薬学的組成物は、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば乳糖、結晶セルロース若しくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ）；崩壊剤（例えばバレイショデンプン若しくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）のような製薬学的に許容できる賦形剤を用いて慣習的手段により製造される例えば錠剤若しくはカプセル剤の形態をとりうる。錠剤は当該技術分野で公知の方法によりコーティングしうる。経口投与のための液体製剤は例えば溶液、シロップ剤若しくは懸濁剤の形態をとりうるか、またはそれらは使用前に水若しくは他の適するベヒクルとの構成のための乾燥製品として提示しうる。こうした液体製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体若しくは水素添加可食脂肪）；乳化剤（例えばレシチン若しくはアカシア）；非水性ベヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール若しくは分画植物油）；および保存剤（例えばメチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）のような製薬学的に許容できる添加物を用いて慣習的手段により製造しうる。該製剤は緩衝塩、香料、着色料および甘味料もまた適宜含有しうる。
経口投与のための製剤は適しては二量体化剤の制御放出を与えるよう処方しうる。
頬側投与のため、該組成物は慣習的様式で処方されている錠剤若しくは舐剤の形態をとりうる。
吸入による投与のため、本発明の使用のための二量体化剤は、適する噴射剤例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素若しくは他の適するガスの使用を伴い加圧パック若しくはネブライザーからエアゾルスプレー提示の形態で便宜的に送達される。加圧エアゾルの場合、投薬量単位は計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定しうる。吸入器若しくはガス注入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）中での使用のための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、二量体化剤および乳糖若しくはデンプンのような適する粉末基剤の粉末混合物を含有して処方しうる。
二量体化剤は、注入による、例えばボーラス注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは連続
注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による非経口投与のため処方しうる。注入のための製剤は、添加される保存剤を伴い単位剤形例えばアンプル若しくは複数用量容器中で提示しうる。該組成物は、油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液若しくは乳剤のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定化剤および／若しくは分散助剤のような製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有しうる。あるいは、有効成分は、使用前に適するベヒクル例えば無菌のパイロジェンフリー水での構成のための粉末形態にありうる。
二量体化剤は、例えばカカオバター若しくは他のグリセリドのような慣習的坐剤基剤を含有する坐剤若しくは保持浣腸のような直腸組成物にもまた処方しうる。
前述された製剤に加え、二量体化剤はデポー製剤としてもまた処方しうる。こうした長時間作用型製剤は埋め込み（例えば皮下若しくは筋肉内）または筋肉内注入により投与しうる。従って、例えば、二量体化剤は適するポリマー若しくは疎水性材料（例えば許容できる油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性誘導体として例えば難溶性塩として処方しうる。
該組成物は、所望の場合は、有効成分を含有する１種若しくはそれ以上の単位剤形を含有しうるパック若しくは分注器装置中で提示しうる。該パックは例えば、ブリスターパックのような金属若しくはプラスチック製箔を含みうる。該パック若しくは分注器装置は投与のための説明書により付随されうる。
本発明の二量体化剤と組合せ若しくは混合状態のアジュバントの使用もまた包含される。企図されるアジュバントは、限定されるものでないが無機塩アジュバント若しくは無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバントおよび免疫刺激性アジュバントを挙げることができる。アジュバントは本発明の二量体化剤との混合物として被験体に投与し得るか、若しくは本発明の二量体化剤と組合せで使用し得る。
５．３．疾患および障害の処置
本発明は遺伝子治療の影響を受けやすいいずれの疾患若しくは障害の処置方法も提供する。一態様において、「処置」若しくは「処置すること」は疾患若しくは障害またはその最低１種の認識される症状の軽減を指す。別の態様において、「処置」若しくは「処置すること」は、被験者により必ずしも認識されない疾患若しくは障害と関連する最低１種の測定可能な生理学的パラメータの軽減を指す。なお別の態様において、「処置」若しくは「処置すること」は、身体的に例えば認識される症状の安定化、生理学的に例えば身体的パラメータの安定化、若しくは双方のいずれかで疾患若しくは障害の進行を阻害することを指す。癌、免疫不全および獣医学の状態を包含する他の状態もまた処置しうる。
５．３．１．標的疾患
本発明の方法により処置し得る疾患および障害の型は、限定されるものでないが加齢黄斑変性症；糖尿病性網膜症；感染性疾患例えばＨＩＶ、パンデミックインフルエンザ、生物兵器のカテゴリー１および２の剤、若しくはいずれかの新たな新興ウイルス感染症；自己免疫疾患；癌；多発性骨髄腫；糖尿病；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；Ｃ型肝炎；多発性硬化症；アルツハイマー病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病；てんかん；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；関節の炎症すなわち関節炎；心筋梗塞（ＭＩ）；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；血友病Ａ；または血友病Ｂを挙げることができる。
本発明の方法により処置若しくは予防し得る感染性疾患は、限定されるものでないがウイルス、細菌、真菌、原生動物、蠕虫および寄生生物を挙げることができる感染性病原体
により引き起こされる。本発明は細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患を処置若しくは予防することに制限されない。多くの医学的に関連のある微生物が文献に広範囲に記述されている。例えばＣ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ、英国 １９８３（その内容全体はここに引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明の方法により処置若しくは予防し得る細菌感染症若しくは疾患は、限定されるものでないが、ミコバクテリア（例えばヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍ ｂｏｖｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ ａｖｉｕｍ）、らい菌（Ｍ ｌｅｐｒａｅ）若しくはＭ アフリカヌム（Ｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジアおよびレジオネラのようなその生活環に細胞内段階を有する細菌を挙げることができる細菌により引き起こされる。企図される細菌感染症の他の例は、限定されるものでないが、グラム陽性桿菌（例えばリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）スピーシーズ）、グラム陰性桿菌（例えばバルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィラス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）スピーシーズ）、スピロヘータ細菌（例えばライム病を引き起こすボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）を包含するボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）スピーシーズ）、嫌気性細菌（例えばアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）スピーシーズ）、グラム陽性および陰性球菌細菌、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズ、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズ、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズ、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズ、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）スピーシーズにより引き起こされる感染症を挙げることができる。感染性細菌の特定の例は、限定されるものでないが、ヘリコバクター ピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ ａｖｉｕｍ）、Ｍ イントラセルラーレ（Ｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ カンサイイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ ゴルドネ（Ｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、ヴィリダンス型連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ
菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、フゾバクテリウム ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、フランベジアトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）を挙げることができる。
ヒトおよびヒト以外の脊椎動物双方の感染性ウイルスは、レトロウイルス、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスを包含する。ヒトで見出されたウイルスの例は、限定されるものでないが、レトロウイルス科（例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩ、ＬＡ Ｖ若しくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡ Ｖ、またはＨＩＶ−ＩＩＩともまた称される）のようなヒト免疫不全ウイルス；およびＨＩＶ−ＬＰのような他の単離物：ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えばデングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばハンタンウイルス、ブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ ｖｉｒｕｓ））；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ））；ならびにイリドウイルス科（例えばアフリカ豚コレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病因病原体、Ｄ型肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎の病原体（クラス１＝内的感染する；クラス２＝非経口感染する（すなわちＣ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）を挙げることができる。
本発明の方法により処置若しくは予防し得る寄生生物疾患は、限定されるものでないがアメーバ症、マラリア、リーシュマニア、コクシジウム、ジアルジア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症およびトリパノソーマ症を挙げることができる。限定されるものでないが回虫症、鉤虫症、鞭虫症、糞線虫症、トキソッカラ症（ｔｏｘｏｃｃａｒｉａｓｉｓ）、旋毛虫症、オンコセルカ症、フィラリアおよびイヌ糸状虫症のような多様な寄生虫による感染症もまた包含される。限定されるものでないが住血吸虫症、肺吸虫症および肝吸虫症のような多様な吸虫による感染症もまた包含される。これら疾患を引き起こす寄生生物は、それらが細胞内であるか若しくは細胞外であるかに基づいて分類し得る。本明細書で使用されるところの「細胞内寄生生物」はその生活環全体が細胞内である寄生生物である。ヒト細胞内寄生生物の例は、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）スピーシーズ、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）スピーシーズ、クルーズトリ
パノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トキソプラズマ ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）スピーシーズおよび旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）を包含する。本明細書で使用されるところの「細胞外寄生生物」はその生活環全体が細胞外である寄生生物である。ヒトを感染させることが可能な細胞外寄生生物は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、エンテロシトゾーン ビエヌーシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ）、ネグレリア属（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）およびアカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）ならびに大部分の蠕虫を包含する。寄生生物のなお別の分類は、主として細胞外しかしそれらの生活環の決定的に重要な段階で偏性の細胞内の存在を伴うと定義される。こうした寄生生物は本明細書で「偏性細胞内寄生生物」と称される。これら寄生生物はそれらの生涯の大部分若しくはそれらの生涯の小さな一部分のみ細胞外環境で存在しうるが、しかしそれらは全部、それらの生活環で最低１つの偏性細胞内段階を有する。寄生生物のこの後者の範疇は、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｎｓｉｅｎｓｅ）およびガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａｎｂｉｅｎｓｅ）、イソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）スピーシーズ、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）スピーシーズ、アイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）スピーシーズ、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）スピーシーズ、肉胞子虫属（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）スピーシーズおよび住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）スピーシーズを包含する。
本発明の方法により処置若しくは予防し得る癌の型は、限定されるものでないがヒトの肉腫および癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィムス腫瘍、子宮頚癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起細胞腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫；白血病例えば急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症ならびに重鎖病を挙げることができる。
５．３．２．ウイルスベクターの投薬量および投与様式
本発明の複製欠損ウイルス組成物は当該技術分野で既知のいずれかの方法若しくは投与計画によりヒト被験体に投与し得る。例えば、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、多様な治療応用でのＡＡＶベクターの使用方法に関する以下の特許および特許出願すなわち米国特許第７，２８２，１９９号明細書；第７，１９８，９５１号明細書；米国特許出願公開第ＵＳ ２００８−００７５７３７号明細書；第ＵＳ ２００８−００７５７４０号明細書；国際特許出願公開第ＷＯ ２００３／０２４５０２号明細書；第ＷＯ ２００４／１０８９２２号明細書；第ＷＯ ２００５１０３３３２１号明細書（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより組み込まれる）に記述されるいずれかの方法によりヒト被験体に投与し得る。
一態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は門脈の腸間膜支流の注入により肝を介して全身に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は例えば四頭筋若しくは二頭筋中への筋肉内注入により筋を介して全身に送達される。別の態様
において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、両側定位注入によりマイネルト基底核（ＮＢＭ）を含有する脳の前脳基底核領域に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は両側被殻内および／若しくは黒質内注入によりｅＮＳに送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は関節内注入により関節に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は冠動脈内注入により心に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は網膜下空隙への注入により網膜に送達される。
別の態様において、ヒト患者に約１．０×１０8ゲノムコピー（ＧＣ）／キログラム（ｋｇ）ないし約１．０×１０14ＧＣ／ｋｇ、および好ましくは１．０×１０11ＧＣ／ｋｇないし１．０×１０13ＧＣ／ｋｇの範囲にある有効用量の複製欠損ウイルス組成物の量を投与する。好ましくは、投与される複製欠損ウイルス組成物の量は、１．０×１０8ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０8ＧＣ／ｋｇ、１．０×１０9ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０9ＧＣ／ｋｇ、１．０×１０10ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０10ＧＣ／ｋｇ、１．０×１０11ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０11ＧＣ／ｋｇ若しくは１．０×１０12ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０12ＧＣ／ｋｇ、１．０×１０13ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０13ＧＣ／ｋｇ、１．０×１０14ＧＣ／ｋｇである。
これら用量は１回、または毎日、一日おき、毎週、２週間ごと、若しくは毎月のような反復して、あるいは十分なトランスジーン発現が患者で検出されるまで与えることができる。一態様において、複製欠損ウイルス組成物は約４〜６週の期間、週１回与えられ、そして投与の様式若しくは部位は好ましくは各投与で変えられる。反復注入は、もっともありそうにはトランスジーン発現の完全なアブレーションに必要とされる。同一部位は１回若しくはそれ以上の注入の空白の後に反復しうる。また、分割注入を与えてよい。従って、例えば用量の半分を一部位に与えかつ他方の半分を同日に別の部位で与えてよい。
２種若しくはそれ以上のウイルスストックにパッケージングされる場合、該複製欠損ウイルス組成物は同時に若しくは連続して投与し得る。２種若しくはそれ以上のウイルスストックを連続して送達する場合、後に送達されるウイルスストックは第一のウイルスストックの投与の１、２、３若しくは４日後に送達し得る。好ましくは、２種のウイルスストックを連続して送達する場合、第二の送達されるウイルスストックは第一のウイルスストックの送達の１若しくは２日後に送達する。
当該技術分野で既知のいかなる方法も本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するのに使用し得る。ＡＡＶ ＧＣ数用量設定の一実施方法は後に続くとおりである。すなわち、精製されたＡＡＶベクターサンプルを最初にＤＮアーゼで処理して被包化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡ若しくは汚染するプラスミドＤＮＡを製造工程から排除する。ＤＮアーゼ耐性粒子をその後熱処理にかけてキャプシドからゲノムを放出させる。放出されたゲノムをその後、ウイルスゲノムの特定領域（通常ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブ組を使用するリアルタイムＰＣＲにより定量する。
一態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は約３．０×１０12ＧＣ／ｋｇの用量での門脈の腸間膜支流の注入により肝を介して全身に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約５．０×１０12ＧＣ／ｋｇの用量での四頭筋若しくは二頭筋いずれかへの２０回までの筋肉内注入により筋を介して全身に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約５．０×１０11ＧＣ／ｋｇの用量での両側定位注入によりマイネルト基底核（ＮＢＭ）を含有する脳の前脳基底核領域に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約１．０×１０11ＧＣ／ｋｇないし約５．０×１０11ＧＣ／ｋｇの範囲の用量での両側被殻内および／若しくは黒質内注入によりＣＮＳに送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイル
ス組成物は、炎症性関節炎の処置のため約１．０×１０１１ＧＣ／ｍＬ関節容量の用量での関節内注入により関節に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約１．４×１０11ＧＣ／ｋｇないし約３．０×１０12ＧＣ／ｋｇの範囲の用量での冠動脈内への点滴注入により心に送達される。別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物は、約１．５×１０10ＧＣ／ｋｇの用量での網膜下空隙への注入により網膜に送達される。
表２は特定の疾患を処置するために本発明のＰＩＴＡ系により特定の組織／器官を介して送達し得るトランスジーンの例を示す。
一態様において、ヒト被験体における加齢黄斑変性症の処置方法は、治療的産物がＶＥＧＦアンタゴニストである複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
別の態様において、ヒト被験体における血友病Ａの処置方法は、治療的産物が第ＶＩＩ因子、若しくはヘテロ二量体のＬ鎖およびＨ鎖ならびにＢ欠失ドメインのようなそのバリアントである複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなり；米国特許第６，２００，５６０号明細書および米国特許第６，２２１，３４９号明細書）。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１アミノ酸をコードし、そして該タンパク質はアミノから末端カルボキシ末端までＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と呼称される６ドメインを有する［Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：３３０（１９８４）；Ｖｅｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７（１９８４）；およびＴｏｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：３３７（１９８４）］。ヒト第ＶＩＩＩ因子は細胞内でプロセシングされて、Ａ１、Ａ２およびＢド
メインを含有するＨ鎖ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含有するＬ鎖を主に含んでなるヘテロ二量体を生じる。一本鎖ポリペプチドおよびヘテロ二量体双方が、Ｂドメインを放出しかつＡ１およびＡ２ドメインよりなるＨ鎖をもたらすＡ２およびＢドメインの間のトロンビン切断により活性化されるまで、不活性前駆体として血漿中を循環する。Ｂドメインは該タンパク質の活性化凝血原の形態において欠失されている。加えて、天然のタンパク質中では、Ｂドメインに隣接している２ポリペプチド鎖（「ａ」および「ｂ」）が二価カルシウム陽イオンに結合されている。いくつかの態様において、該ミニ遺伝子は、１０アミノ酸シグナル配列をコードする第ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル酸化配列を含んでなる。代替の態様において、該ミニ遺伝子は、Ａ１およびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５アミノ酸、ならびに／若しくはＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをさらに含んでなる。なお他の態様において、第ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする核酸が、Ｂドメインの１４アミノ酸をコードする４２種の核酸により分離される単独ミニ遺伝子中に提供される［米国特許第６，２００，５６０号明細書］。天然に存在するおよび組換えの形態の第ＶＩＩ因子の例は、米国特許第５，５６３，０４５号明細書、米国特許第５，４５１，５２１号明細書、米国特許第５，４２２，２６０号明細書、米国特許第５，００４，８０３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第５，６６１，００８号明細書、米国特許第５，７８９，２０３号明細書、米国特許第５，６８１，７４６号明細書、米国特許第５，５９５，８８６号明細書、米国特許第５，０４５，４５５号明細書、米国特許第５，６６８，１０８号明細書、米国特許第５，６３３，１５０号明細書、米国特許第５，６９３，４９９号明細書、米国特許第５，５８７，３１０号明細書、米国特許第５，１７１，８４４号明細書、米国特許第５，１４９，６３７号明細書、米国特許第５，１１２，９５０号明細書、米国特許第４，８８６，８７６号明細書；国際特許公開第ＷＯ ９４／１１５０３号明細書、第ＷＯ ８７／０７１４４号明細書、第ＷＯ ９２／１６５５７号明細書、第ＷＯ ９１／０９１２２号明細書、第ＷＯ ９７／０３１９５号明細書、第ＷＯ ９６／２１０３５号明細書および第ＷＯ ９１／０７４９０号明細書；欧州特許出願第ＥＰ ０ ６７２ １３８号明細書、第ＥＰ ０ ２７０ ６１８号明細書、第ＥＰ ０ １８２ ４４８号明細書、第ＥＰ ０ １６２ ０６７号明細書、第ＥＰ ０ ７８６ ４７４号明細書、第ＥＰ ０ ５３３ ８６２号明細書、第ＥＰ ０ ５０６ ７５７号明細書、第ＥＰ ０ ８７４ ０５７号明細書、第ＥＰ ０ ７９５ ０２１号明細書、第ＥＰ ０ ６７０ ３３２号明細書、第ＥＰ ０ ５００ ７３４号明細書、第ＥＰ ０ ２３２ １１２号明細書および第ＥＰ ０ １６０ ４５７号明細書；Ｓａｎｂｅｒｇら、ＸＸｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄ．Ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（１９９２）、ならびにＬｉｎｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３２：１９（１９９５）を包含する特許および学術文献に見出し得る。
別の態様において、ヒト被験体における血友病Ｂの処置方法は、治療的産物が第ＩＸ因子である複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
別の態様において、ヒト被験体におけるうっ血性心不全の処置方法は、治療的産物がインスリン様増殖因子若しくは肝細胞増殖因子である複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
別の態様において、ヒト被験体における中枢神経系障害の処置方法は、治療的産物が神経成長因子である複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる。
５．４．トランスジーン発現および望ましくない副作用のモニタリング
５．４．１．トランスジーン発現のモニタリング
本発明の複製欠損ウイルス組成物の投与後に、トランスジーン発現を当業者に既知のい
ずれかの方法によりモニターし得る。投与されたトランスジーンの発現は、例えば前記トランスジーンによりコードされるタンパク質および／若しくはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。限定されるものでないがタンパク質発現を検出かつ／若しくは可視化するためのイムノアッセイ（例えばウエスタンブロット、免疫沈降次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、免疫細胞化学、切片での免疫組織化学染色など）、ならびに／または遺伝子をコードするそれぞれのｍＲＮＡを検出かつ／若しくは可視化することにより遺伝子発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドットブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）を挙げることができる、当該技術分野で標準的な多くの方法を従って使用し得る。ウイルスゲノムおよび該トランスジーン由来のＲＮＡは定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によってもまた検出し得る。こうしたアッセイは慣例かつ当該技術分野で公知である。免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／若しくはプロテアーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充されたＲＩＰ Ａ緩衝液（１％ＮＰ−４０若しくはＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００、Ｉ％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解すること、目的の抗体を細胞ライセートに添加すること、ある期間（例えば１ないし４時間）４０℃でインキュベートすること、プロテインＡおよび／若しくはプロテインＧセファロースビーズを細胞ライセートに添加すること、４０℃で約１時間若しくはそれ以上インキュベートすること、溶解緩衝液中でビーズを洗浄すること、ならびにビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液に再懸濁することを含んでなる。目的の抗体の特定の抗原を免疫沈降させる能力は例えばウエスタンブロット分析により評価し得る。当業者は、抗原への抗体の結合を増大させかつバックグラウンド（例えばセファロースビーズで細胞ライセートを浄化する前）を減少させるよう改変し得るパラメータに関して知っているとみられる。
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製すること、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に依存して８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのタンパク質サンプルの電気泳動、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ若しくはナイロンのような膜に転写すること、膜をブロッキング溶液（例えば３％ＢＳＡ若しくは無脂肪乳を含むＰＢＳ）でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液（例えばＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄すること、ブロッキング緩衝液で希釈された一次抗体（目的の抗体）と膜をインキュベートすること、膜を洗浄緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で洗浄すること、ブロッキング緩衝液で希釈された酵素基質（例えばワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼ）または放射活性分子（例えば32ｐ若しくは125Ｉ）に複合されている二次抗体（一次抗体を認識する、例えば抗ヒト抗体）と膜をインキュベートすること、膜を洗浄緩衝液（ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄すること、および抗原の存在を検出することを含んでなる。当業者は、検出されるシグナルを増大させかつバックグラウンドノイズを減少させるよう改変し得るパラメータに関して知っているとみられる。
ＥＬＩＳＡは、一般に、抗原を調製すること、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆すること、酵素基質（例えばワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な剤に複合されている目的の抗体をウェルに添加すること、およびある時間インキュベートすること、ならびに抗原の存在を検出することを含んでなる。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は検出可能な剤に複合されている必要はなく；代わりに、検出可能な化合物に複合されている二次抗体（目的の抗体を認識する）をウェルに添加しうる。さらに、ウェルを抗原で被覆することの代わりに抗体をウェルに被覆しうる。この場合、検出可能な剤に複合されている二次抗体を、被覆されているウェルへの目的の抗原の添加後に添加しうる。当業者は、検出されるシグナルを増大させるよう
改変し得るパラメータ、ならびに当該技術分野で既知のＥＬＩＳＡの他の変形に関して知っているとみられる。
表現型若しくは生理学的読み出しを使用してもまたトランスジーンの発現を評価し得る。例えば、疾患若しくはそれと関連する症状の重症度を軽減するトランスジーン産物の能力を評価し得る。さらに、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）走査および中和抗体アッセイを実施し得る。
さらに、トランスジーン産物の活性を、当業者に公知の技術を利用して評価し得る。例えば、トランスジーン産物の活性は、細胞のセカンドメッセンジャー（例えば細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ｌＰ３など）の誘導を検出すること、タンパク質のリン酸化を検出すること、転写因子の活性化を検出すること、あるいは、細胞に基づくアッセイを介して細胞応答例えば細胞分化または細胞増殖若しくはアポトーシスを検出することにより測定し得る。細胞のセカンドメッセンジャー若しくはタンパク質のリン酸化のレベルの変化を、例えば当業者に公知かつ本明細書に記述されるイムノアッセイにより測定し得る。転写因子の活性化若しくは阻害を例えば電気移動度シフトアッセイにより検出し得、また、細胞増殖のような細胞応答は、例えばトリパンブルー細胞数、3Ｈ−チミジン取り込みおよびフローサイトメトリ−により検出し得る。
５．４．２．望ましくない副作用／毒性のモニタリング
本発明の複製欠損ウイルス組成物の患者への投与後、望ましくない副作用および／若しくは毒性を、トランスジーンをアブレートする若しくは切り出すまたはトランスジーンの転写物をアブレートするすなわちその翻訳を阻害するために二量体化剤（５．２．３節に記述される）を含んでなる製薬学的組成物を患者に投与するかどうかの決定のため、当業者に既知のいずれかの方法でモニターし得る。
本発明は、（ａ）患者から得られた組織サンプル中の治療的産物の発現を検出すること、および（ｂ）前記被験体での該治療的産物の存在に関連する副作用を検出すること、を含んでなり、ここで前記被験体における該治療的産物の存在に関連する副作用の検出が、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤を投与することの必要性を示す、治療的産物およびアブレーターをコードする複製欠損ウイルス組成物を受領した被験体に治療的産物をアブレートするための薬理学的作用剤をいつ投与するかの決定方法を提供する。
本発明はまた、前記被験体から得られた組織サンプル中の治療的産物の存在と関連する毒性の生化学的マーカーのレベルを検出することであって、ここで毒性を反映する前記マーカーのレベルがアブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤を投与することの必要性を示す、を含んでなる、治療的産物およびアブレーターをコードする複製欠損ウイルス組成物を受領した被験体に治療的産物をアブレートするための薬理学的作用剤をいつ投与するかの決定方法も提供する。毒性の生化学的マーカーは当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが異常な腎機能のマーカー（例えば、腎毒性について上昇された血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン）；全身性炎症のマーカーとしての増大された赤血球沈降速度；骨髄毒性のマーカーとしての低い白血球数、血小板若しくは赤血球；などのような臨床病理学血清尺度を包含する。肝機能検査（Ｉｆｔ）を実施して肝毒性と関連する異常を検出し得る。こうしたＩｆｔの例は、アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、ビリルビンおよびγ−グルタミルトランスペプチダーゼの検査を包含する。
本発明はさらに、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤での処置後の被験体からの組織サンプル中の治療的遺伝子産物をコードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物若しくはそのコードされるタンパク質の存在の決定方法を含んでなり、ここで治療的遺伝子産物を
コードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物若しくはそのコードされるタンパク質の存在が、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤での反復処置に対する必要性を示す。
本発明の複製欠損ウイルス組成物を受領した患者でモニターし得る１つの望ましくない副作用は、分泌されるトランスジーン産物に対する抗体応答である。分泌されるトランスジーン産物に対するこうした抗体応答は、抗体が該分泌されるトランスジーン産物を若しくは該トランスジーン産物とエピトープを共有する自己抗原に結合する場合に起こる。トランスジーン産物が抗体である場合、該応答は「抗イディオタイプ」応答と称される。可溶性抗原が血管コンパートメント中で抗体と結合する場合、それらは多様な器官の血管床で非特異的に捕捉される循環免疫複合体を形成して、血清病、血管炎、腎炎 血管炎若しくは糸球体腎炎を伴う全身性エリテマトーデスのようないわゆる免疫複合体病を引き起こしうる。
分泌されるトランスジーン産物に対する別のより全身性の望ましくない免疫反応においては、トランスジーン産物に対する抗体応答が１種若しくはそれ以上の自己抗原に対する交差反応する免疫応答をもたらして、ほぼいかなる種類の自己免疫も引き起こす。自己免疫は、それ自身の構成部品を自己として認識することの免疫系の失敗であり、それ自身の細胞および組織に対する免疫応答を可能にして自己免疫疾患を生じさせる。本発明のトランスジーン産物に対する自己免疫は、限定されるものでないが強直性脊椎炎、クローン病、特発性炎症性腸疾患、皮膚筋炎、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン・バレ症候群（ＧＢＳ）、抗ガングリオシド、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、エリテマトーデス、混合型結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としてもまた知られる）、潰瘍性大腸炎（２つの型の特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の一方）、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症を挙げることができるいずれかの自己免疫疾患を生じさせ得る。
免疫複合体病および自己免疫は、当該技術分野で既知のいずれかの方法により本発明の複製欠損ウイルス組成物で処置された患者で検出かつ／若しくはモニターし得る。例えば、免疫複合体病および／若しくは自己免疫を評価するために実施し得る一方法は免疫複合体検査であり、その目的は、血液中の循環免疫複合体を示すこと、免疫複合体病および／若しくは自己免疫疾患の重症度を推定すること、ならびに二量体化剤の投与後の応答をモニターすることである。免疫複合体検査は当業者に既知のいずれの方法によっても実施し得る。具体的には、免疫複合体検査は、米国特許第４，１４１，９６５号明細書、米国特許第４，２１０，６２２号明細書、米国特許第４，２１０，６２２号明細書、米国特許第４，３３１，６４９号明細書、米国特許第４，５４４，６４０号明細書、米国特許第４，７５３，８９３号明細書および米国特許第５，８８８，８３４号明細書（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される方法の誰か若しくはそれ以上を使用して実施し得る。
当該技術分野で既知の方法を使用する以下の自己免疫疾患すなわち強直性脊椎炎、クローン病、特発性炎症性腸疾患、皮膚筋炎、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン・バレ症候群（ＧＢＳ）、抗ガングリオシド、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、エリテマトーデス、混合型結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としてもまた知られる）、潰瘍性大腸炎（２つの型の特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の一方）、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症の誰かにより引き起こされる若しくはそれと関連する症状の検出は、ヒト被験体に投与される複製欠損ウイルス組成物によりコードされた分泌されるトランスジーン産物により引き起こされる自己免疫若しくは免疫複合体病のなお別の検出方法である。
自己免疫および免疫複合体病に起因する普遍的一疾患は血管の炎症である血管炎である。血管炎は肥厚化、弱化、狭窄および瘢痕を包含する血管の壁の変化を引き起こす。血管炎を診断するのに使用し得る普遍的検査および処置は、限定されるものでないが、赤血球沈降速度、Ｃ反応性タンパク質検査、全血球数および抗好中球細胞質抗体検査のような血液検査；増大された量のタンパク質を示しうる尿検査；大動脈およびその分枝のようなより大きな動脈が冒されているかどうかを決定するためのＸ線、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のような画像検査；血管のＸ線（血管造影図）；ならびに血管の一部の生検を実施することを挙げることができる。本発明の方法により処置された患者で観察され得る血管炎の全身性の徴候および症状は、限定されるものでないが発熱、疲労、体重減少、筋および関節の疼痛、食欲減退、ならびにしびれ若しくは脱力感のような神経の問題を挙げることができる。
本発明の複製欠損ウイルス組成物の投与が局所トランスジーン発現をもたらす場合、局所性毒性を、トランスジーンをアブレートする若しくは切り出すためまたはトランスジーンの転写物をアブレートするためすなわちその翻訳を阻害するために二量体化剤（５．２．３節に記述される）を含んでなる製薬学的組成物を該患者に投与するかどうかの決定のために検出かつ／若しくはモニターし得る。例えば、加齢黄斑変性症の処置のためＶＥＧＦ阻害剤をコードするトランスジーンユニットを含んでなる複製欠損ウイルス組成物を網膜に投与する場合、ＶＥＧＦが網膜で神経保護的であることができ、そしてそれを阻害することが神経節細胞の脱落により視力を悪化させ得ることが考えられる。従って、こうした複製欠損ウイルス組成物の投与後に、視力を定期的にモニターし得、そして神経節細胞の脱落をいずれかの当該技術分野で既知の方法、例えば網膜の非侵襲的画像法により検出し得る。さらに、ＶＥＧＦ阻害は、フルオレセイン血管造影法若しくは当該技術分野で既知のいずれかの他の方法を使用してモニターし得る網膜の必要な微小血管系もまた枯渇させうる。
一般に、患者に二量体化剤（５．２．３節に記述される）を含んでなる製薬学的組成物を投与するかどうかの決定のために本発明の複製欠損ウイルスの投与後に患者で検出／モニターされ得る副作用は、限定されるものでないが、腸若しくはいずれかの器官の出血、聴覚消失、視力の低下、腎不全、認知症、うつ、糖尿病、下痢、嘔吐、勃起不全、発熱、緑内障、脱毛、頭痛、高血圧、心悸亢進、不眠、乳酸アシドーシス、肝損傷、肝斑、血栓症、持続勃起症 横紋筋融解、発作、眠気、食欲増進、食欲低下、めまい、卒中、心不全若しくは心臓発作を挙げることができる。前述の症状若しくはいずれかの他の副作用を検出するため当該技術分野で普遍的に使用されるいかなる方法も使用し得る。
アブレーター治療：本発明の方法により患者に送達されたトランスジーン産物が患者で望ましくない副作用を引き起こしたことが一旦決定されれば、二量体化剤を含んでなる製薬学的組成物を、本明細書の５．２．３節に記述される投与計画、投与様式若しくは用量のいずれかを使用して患者に投与し得る。
本発明は本明細書に記述される特定の態様により範囲を制限されるべきでない。事実、記述されるものに加えて本発明の多様な改変が、前述の記述および付随する図面から当業者に明らかになるであろう。こうした改変は付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
６．実施例１：組換えＡＡＶベクターのスケールでの製造
哺乳動物細胞のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクションおよび濃縮された培養上清のイオジキサノール勾配遠心分離に基づく高収量の組換えＡＡＶ製造方法
。該新たな方法で製造されるＡＡＶベクターは、小スケールの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配で精製されるベクターと比較した場合にｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方で同等若しくはより良好な形質導入を示す。加えて、記述されるイオジキサノール勾配精製方法は、機能的ベクター粒子を空のキャプシドから効果的に分離し、前臨床研究の間に毒性および不要な免疫応答を低下させるために望ましい特性である。
最近、ＡＡＶ２と対照的に、ほとんどの他のＡＡＶ血清型が、リン酸カルシウムでトランスフェクトされた生産培養物の培地に主に放出されかつ細胞ライセートに保持されないことが観察された（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．、Ｌｏｃｋ，Ｍ．、Ｘｉａｏ，Ｒ．、Ｌｉｎ，Ｊ．、Ｋｏｒｎ，Ｍ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．２０１０．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＡＡＶ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．提出されかつ現在“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ”、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２１：１２５１−１２５７（２０１０年１０月）として刊行された。
ＰＥＩトランスフェクションおよび上清収集に基づく大規模動物研究に適するスケーリングされたｒＡＡＶ製造法を利用し得る。該方法は、高収量であり、多様な血清型およびトランスジーンをもつベクターの製造に融通が利き、そして最小限の特殊技術および機器を用いてほとんどの実験室でそれを実施しうるのに十分単純である。本方法は現在、Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ、２０１０ Ｏｃｔ；２１（１０）：１２５９−７１（引用することにより本明細書に組み込まれる）に刊行されている。
参考文献
Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｆｕｎｇ，Ｖ．Ｐ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｔａｋｅｙａ，Ｒ．，Ｋ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ Ａｒａｎｈａ，Ｉ．Ｌ．２００５．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｈｅｌｐｅｒ ｆｒｅｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｌｅａｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ．ＵＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５／０２６６５６７．
Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，Ａ．，Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｅ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．２００１，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｄ ｐｕｒｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ ｇｒａｖｉｔｙ−ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２（１）：７１−７６．
Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｃｈｕｌａｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｌ．Ｔ．，Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｆ．，Ｃｏｎｌｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｂｅｔｔｓ，Ｍ．Ｒ．２００９．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｓｐｉｔｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｒＡＡＶ１−ＡＡＴ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６（３８）：１６３６３−１６３６８．
Ｂｒｕｍｅｎｔ，Ｎ．，Ｍｏｒｅｎｗｅｉｓｅｒ，Ｒ．，Ｂｌｏｕｉｎ，Ｖ．，Ｔｏｕｂｌａｎｃ，Ｅ．，Ｒａｉｍｂａｕｄ，１．，Ｃｈｅｒｅｌ，Ｙ．，Ｆｏｌｌｉｏｔ，Ｓ．，Ｇａｄｅｎ，Ｆ．，Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｐ．，Ｋｒｏｎｅｒ−Ｌｕｘ，Ｇ．２００２．Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｌｅ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ−２ ａｎｄ −５．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ６（５）：６７８−６８６．
Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎ．，Ｋｎｏｐ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂｙｒｎｅ，Ｂ．Ｊ．２００９．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０（８）：７９６−８０６．
Ｄａｖｉｄｏｆｆ，Ａ．Ｍ．，Ｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｓｌｅｅｐ，Ｓ．，Ｇｒａｙ，Ｊ．，Ａｚａｍ，Ｓ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．，ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｊ．Ｈ．，Ｋａｒｉｍｉｐｏｏｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．２００４．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｏｃｋ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１（２）：２０９−２１５．
Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｐｈａｍ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｇ．，Ｊａｃｏｂ，Ｄ．，Ｃａｓｓ，Ｂ．，Ｃｈａｈａｌ，Ｐ．，Ｌａｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｎａｌｂａｎｔｏｇｌｕ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋａｍｅｎ，Ａ．２００７．Ｓｃａｌａｂｌｅ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２９３ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４４（１−２）：３２−４０．
Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．２００２．Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９（１８）：１１８５４−１１８５９．
Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．，Ｋｅｒｎ，Ａ．，Ｒｉｔｔｎｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，ｌ．Ａ．１９９８．Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９（１８）：２７４５−２７６０．
Ｈｅｒｍｅｎｓ，Ｗ．Ｔ．，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｓｏｎｎｅｍａｎｓ，Ｍ．Ａ．，Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ ．Ａ．，ａｎｄ Ｖｅｒｈａａｇｅｎ，Ｊ．１９９９．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｉｏｄｉｘａｎｏｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｌｌｏｗｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｏｃｋｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（１１）：１８８５−１８９１．
Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｂａｌｄｉ，Ｌ．，Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．２００７．Ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ，ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２９（１１）：１７１３−１７２１．
Ｋａｌｕｄｏｖ，Ｎ．，Ｈａｎｄｅｌｍａｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．．２００２．Ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２，４，ｏｒ ５ ｕｓｉｎｇ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１０）：１２３５−１２４３．
Ｍａｇｕｉｒｅ，Ａ．Ｍ．，Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ，Ｆ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｅ．Ａ．，Ｐｕｇｈ，Ｅ．Ｎ．，Ｊｒ．，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，Ｂｅｎｎｉｃｅｌｌｉ，Ｊ．，Ｂａｎｆｉ，Ｓ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ａ．，Ｔｅｓｔａ，Ｆ．，Ｓｕｒａｃｅ，Ｅ．Ｍ．２００８．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ Ｌｅｂｅｒ’ｓ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５８（２１）：２２４０−２２４８．
Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｅｌｌｉｇｅｒ，Ｓ．，Ｅｌｌｉｇｅｒ，Ｃ．，Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ，Ｇ．，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，Ｌ．，Ｋｕｒｔｚｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｉｗａｋｉ，Ｙ．，ａｎｄ Ｃｏｌｏｓｉ，Ｐ．１９９８．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５（７）：９３８−９４５．
Ｍｏｓｓ，ＲＢ．，Ｒｏｄｍａｎ，Ｄ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｌ．Ｔ．，Ａｉｔｋｅｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｐ．Ｌ．，Ｗａｌｔｚ，Ｄ．，ＭｉＨａ，Ｃ．，Ｂｒｏｄｙ，Ａ．Ｓ．，Ｃｌａｎｃｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｒａｍｓｅｙ，Ｂ．２００４．Ｒｅｐｅａｔｅｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２ ａｅｒｏｓｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｌｕｎｇｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｃｈｅｓｔ １２５（２）：５０９−５２１．
Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ ２００８．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５（１１）：８５８−８６３．
Ｎｅｉｎｈｕｉｓ，Ａ．２００９．Ｄｏｓｅ−Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ Ｏｆ Ａ Ｓｅｌｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｄｅｎｏ− Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．
Ｏｋａｄａ，Ｔ．，Ｎｏｎａｋａ−Ｓａｒｕｋａｗａ，Ｍ．，Ｕｃｈｉｂｏｒｉ，Ｒ．，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｈａｙａｓｈｉｔａ−Ｋｉｎｏｈ，Ｈ．，Ｎｉｔａｈａｒａ−Ｋａｓａｈａｒａ，Ｙ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｏｚａｗａ，Ｋ．２００９．Ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １（ＡＡＶ１）ａｎｄ ＡＡＶ８ ｖｅｃｔｏｒｓ，ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０（９）：１０１３−１０２１．
Ｑｕ，Ｇ．，Ｂａｈｒ−Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｐｒａｄｏ，Ｊ．，Ｔａｉ，Ａ．，Ｃａｔａｎｉａｇ，Ｆ．，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｊ．，Ｈａｕｃｋ，Ｂ．，Ｌｕｎａ，Ｊ．，Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．２００７．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｅｍｐｔｙ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０（１−２）：１８３−１９２．
Ｓａｌｖｅｔｔｉ，Ａ．，Ｏｒｅｖｅ，Ｓ．，Ｃｈａｄｅｕｆ，Ｇ．，Ｆａｖｒｅ，Ｄ．，Ｃｈｅｒｅｌ，Ｙ．，Ｃｈａｍｐｉｏｎ−Ａｒｎａｕｄ，Ｐ．，Ｄａｖｉｄ−Ａｍｅｌｉｎｅ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．１９９８．Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９（５）：６９５−７０６．
Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｍ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ，ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｌ，Ｐ．１９９７．Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｏｄｉｘａｎｏｌ ｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４４（１）：１７４−１７６．
Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｈ．，Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．２００９．Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ＡＡＶ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ ｒＡＡＶ ｓｔｏｃｋｓ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（１１）：１８８８−１８９６．
Ｓｎｙｄｅｒ，ＲＯ．ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ ２００２．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１３（５）：４１８−４２３．
Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｈ．，Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｓ．，Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．，Ｖｉｊａｙ，Ｓ．，Ｋｉｅｒａｎ，Ｊ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｋ．，ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ａ．，ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．２００３．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｓ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ７（１）：１２２−１２８．
Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｘｉａｏ，Ｒ．，Ｌｉｎ，Ｊ．，Ｋｏｒｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．２０１０．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＡＡＶ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ，ａｎｄ ｎｏｗ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ａｓ “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ”，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２１：１２５１−１２５７（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１０）．
Ｖｉｒａｇ，Ｔ．，Ｃｅｃｃｈｉｎｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．２００９．Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｆｏｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０（８）：８０７−８１７．
Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．，ＭｃＣａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｈｅ，ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｍｏｒｉｚｏｎｏ，Ｈ．，Ｂａｔｓｈａｗ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．２０１０．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８（１）：１１８−１２５．
Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｊｒ．ａｎｄ Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．Ｗ．２００６．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １１９（６）：５７１−６０３．
Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．２００９．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０（７）：６９８−７０６．
Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｅ，Ｔ．，Ｐｒａｄｏ，Ｊ．，Ｂａｈｒ−Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｈ．，Ｚｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．，ａｎｄ Ｑｕ，Ｇ．２００５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ２ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｔｓ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １２（１）：１７１−１７８．
Ｘｉａｏ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．１９９８．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（３）：２２２４− ２２３２．
Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｘｉｅ，Ｑ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇａｏ，Ｇ．２００９．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０（９）：９２２−９２９．
Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｍａｓｏｎ，Ｅ．，Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｉ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｃｈｅｓｎｕｔ，Ｋ．，Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．，Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．１９９９．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６（６）：９７３−９８５．
Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｉ．，Ｓａｋａｉ，Ｙ．，Ｌｏｉｌｅｒ，Ｓ．，Ｆｒａｉｔｅｓ，Ｔ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｃｈｉｏｄｏ，Ｖ．Ａ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｅｒｇ，Ｔ．，Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ，Ｗ．Ｗ．２００２．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １，２，ａｎｄ ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（２）：１５８−１６７．
７．実施例２：ＡＡＶベクターのセシウム精製
本実施例は、トランスフェクトされた細胞ペレットからのＡＡＶベクターの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）精製の新たな手順を記述する。
第１日−ペレット処理およびＣｓＣｌ回転
１）ライセート調製
・−８０℃の冷凍庫からの細胞を３７℃で１５分間融解する。
・細胞ペレットを、４０枚のプレートの細胞および２０ｍＬの最終容量のため約２０ｍＬの再懸濁緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ）に再懸濁し、そして氷上に置く。
・３回凍結／融解する（ドライアイスおよびエタノール浴／３７℃水浴）。
・調製物（ｐｒｅｐ）あたり１００μＬのベンゾナーゼ（２５０Ｕ／ｍＬ）を添加しかつ穏やかに反転し、サンプルを３７℃で２０分間インキュベートし、チューブを５ｍｉｎごとに反転する。
・６ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌを添加して最終塩濃度を１Ｍにする。混合する。
・ソーバール（Ｓｏｒｖａｌ）遠心機中４℃で８，０００ｒｐｍで１５分間回転する。注：Ｓｏｒｖａｌが清浄であることを確認する。遠心分離後にさらに進める前にチューブを７０％で滅菌する。上清を新たなチューブに移す。
・ソーバール（Ｓｏｒｖａｌ）中４℃で８，０００ｒｐｍで１５分間再度回転する。注：Ｓｏｒｖａｌが清浄であることを確認する。遠心分離後にさらに進める前にチューブを７０％で滅菌する。
・１．８ｍＬの１０％ＯＧＰを０．５％の最終濃度のため添加し、そして反転により穏やかに混合する。
２）塩化セシウムステップ勾配精製
・各調製について、７．５ｍＬの１．５ｇ／ｍＬ ＣｓＣｌおよび１５ｍＬの１．３ｇ／ｍＬ ＣｓＣｌよりなる２個の２層勾配をＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ−２８チューブ中で調製する（ウルトラクリア（ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ）チューブを使用しない）。より小さく密のＣｓＣｌを最初に負荷し、およびその後より重いＣｓＣｌを底負荷する（ｂｏｔｔｏｍ ｌｏａｄ）。
・１５ｍＬのサンプルを各勾配の上部に添加する。サンプルは勾配を混乱しないようにチューブの側にゆっくりと添加する。チューブをロット番号で標識する。
・２５，０００ｒｐｍで１５℃で最低２０時間回転する。
第２日−第一のＣｓＣｌ回転からＡＡＶバンドを収集しかつ第二のＣｓＣｌ回転を設定する
１）バンドをＣｓＣｌ回転から収集する。
・勾配を混乱しないよう注意して、遠心管（ＡおよびＢ）をバケットから慎重に取り出す。第一のチューブ（Ａ）をチューブホルダーに固定する。
・２個の１／１６インチのオスルアー（Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９５０７０９０）を取り付けられた予め滅菌された２ｆｔ長のタイゴン（ｔｙｇｏｎ）−シリコーン管（内径１．６ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９４２２０８０）を取り、そして１８Ｇ １”針をルアーに挿入する。
・チューブを、１８Ｇ １”針（ベベルを上に向ける）の１個を用いて底にできるだけ近くに直角に貫通し、そして管をマスターフレックスポンプの簡易負荷ローラー（ｅａｓｙ ｌｏａｄ ｒｏｌｌｅｒ）にクランプ止めする。速度を約１ｍＬ／ｍｉｎまで穏やかに増大する。最初の４．５ｍＬを１５ｍＬファルコンチューブに収集し、そしてその後画分（２５０μＬ）を９６ウェルプレートに（チューブＡから）収集する。４８画分を収集する。
・勾配の残りを、２０％漂白剤溶液を含有するビーカーに流し、そして針／管集成体を廃棄する。
・２個の１／１６インチのオスルアー（Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９５０７０９０）を取り付けられた、別の予め滅菌された２ｆｔ長のタイゴン（ｔｙｇｏｎ）−シリコーン管（内径１．６ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９４２２０８０）を取り、そして第二のチューブから（チューブＢから）画分を収集するため１８Ｇ １”針をルアーに挿入する。
・収集全体をチューブＢについて反復する。針／管集成体を使用後に廃棄する。
２）屈折率（ＲＪ）を読み取る
・マルチチャンネルピペッターを使用して、１０μＬの各画分（収集された４８個の、最初に９６ウェルプレートＡから）を新たなプレート（１ないし４８で標識する）に移し、そして画分の残りはバイオセイフティーキャビネットに残す。
・５μＬの各画分を取り、そして屈折計を使用してＲＩを読み取る。ＡＡＶを含有する画分は１．３７４０〜１．３６６０という屈折率を有するはずである。ＲＩを１．３６５０まで読み取り、そしてその後１．３７４０ないし１．３６６０範囲のＲＩを伴う画分をバイオセイフティーキャビネット中でプールする。（チューブ１および２に属する双方の９６ウェルプレートをプールした後に総容量を測定する。より多くを添加するためのなお若干の空隙が存在する場合、１．３７５のＲＩを伴うウェルから添加する。）
・この過程を第二の９６ウェルプレート（チューブＢから）について反復する。
３）第二の勾配を負荷する
・各画分から（チューブＡおよびＢから）の合計のプールされた容量は５〜６ｍＬと
なるはずである。２種の勾配収集物を５０ｍＬファルコンチューブにプールし、そして容量をＣｓＣｌの１．４１ｇ／ｍＬ溶液で１３ｍＬにする。ピペットで十分に混合する。
・１０ｍＬシリンジおよび１８Ｇ針を使用して、プールされた第一の勾配収集物を１３ｍＬの封止可能な遠心管に添加する。該溶液は気泡を伴わずチューブの首の線まで添加するべきである。
・携帯式封止装置、金属製チューブキャップおよびヒートシンクを使用してチューブを封止する。
・チューブを握って漏出について試験し、そしてその後適切な天秤を用いてＴｉ７０．１ローターに入れる。ローターのキャップおよび蓋を挿入し、そしてその後６０，０００ｒｐｍ、１５℃で２０時間回転する。
第３日−第二のＣｓＣｌ回転からＡＡＶバンドを収集しかつ脱塩する
１）ＣｓＣｌ回転からバンドを収集する
勾配を混乱しないよう注意して、遠心管をバケットから慎重に取り出す。チューブをチューブホルダーに固定する。この時点で、単独バンドが底部照射後にチューブのほぼ中央に見えるはずである。
・２個の１／１６インチのオスルアー（Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９５０７０９０）を取り付けられた予め滅菌された２ｆｔ長のタイゴン（ｔｙｇｏｎ）−シリコーン管（内径１．６ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ ＮＣ９４２２０８０）を取り、そして１８Ｇ １”針をルアーに挿入する。調製物あたりに１長さの管を使用する。
・チューブを、１８Ｇ １”針（ベベルを上に向ける）の１個を用いて底にできるだけ近くに直角で貫通し、そして管をマスターフレックスポンプの簡易負荷ローラーにクランプ止めする。チューブを第二の１８Ｇ針を用いて上部で再度貫通する。速度を約１ｍＬ／ｍｉｎまで穏やかに増大し、そしてその後、画分（２５０μＬ）を９６ウェルプレートに収集することを開始する。勾配全体を収集する（約４５画分）。
２）屈折率（ＲＩ）を読み取る：
・マルチチャンネルピペッターを使用して、１０μＬの各画分を新たなプレートに移し、そして画分の残りをバイオセイフティーキャビネットに残す。
・５μＬの各画分を取り、そして屈折計を使用してＲＩを読み取る。ＡＡＶを含有する画分は１．３７５０〜１．３６６０という屈折率を有するはずである。ＲＩを１．３６５０まで読み取り、そしてその後１．３７５０ないし１．３６６０の範囲のＲＩを伴う画分をプールする。
３）脱塩：アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）−Ｉ ５遠心濃縮装置
この手順において、ベクターをＰＢＳで希釈しかつ１００ｋＤａのＭＷＣＯのフィルター装置を通して低速で回転する。ＡＡＶ粒子の大きな分子量（約５０００ｋＤａ）のため、ベクターは膜により保持されかつ塩は通過する。ベクターが膜上で蓄積することができ、従ってすすぎが最終段階で必要とされる。
・５０ｍＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌを５０ｍＬチューブに分注する。
・上の段階２からのプールされた画分をＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌで総容量１５ｍＬに希釈する。穏やかに混合しそしてＡｍｉｃｏｎフィルター装置に添加する。
・ベンチトップソーバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）遠心機で２，０００ないし４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。フィルター表面の上部より上の液体の水準（約１．８ｍＬ）を、ベクターが膜上で完全に乾燥しないようにその間ずっと保つことが重要であるため、より低い速度の回転を最初に試みてサンプルの流速を決定することが推奨される。最終目標は保持物の容量を約１．８ｍＬに低減することである。付加的な短い回転）が、これを達成するために必要なことがある。容量が望ましいものより下になる場合、それをＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌで１．８ｍＬに戻す。
・さらなる１３．２ｍＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌを添加し、装置中に残存する保持物とピペットにより混合し、そして上述された回転過程を反復する。この過程を、以前に分注された５０ｍＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌ全部が装置を通して回転されるま
で継続する。
・最終保持物（約１．８ｍＬ）を伴う膜を、表面全体に対し反復してピペットで出し入れすることによりすすぐ。保持物を、１ｍＬおよび２００μＬのエッペンドルフチップを使用して適した大きさの無菌遠心管に回収する（２００μＬチップは１ｍＬチップで到達不可能である装置の底部の最終保持物のためである）。最低１００μＬのＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌを使用して膜を２回すすぎ、そしてそれをあなたの最終保持物とともにプールする。
・正確な容量を測定し、そしてグリセロールを５％まで添加する。
・５×２５μすなわちアリコート、保存のための１×１００μＬ、および残りを１０５μＬアリコートに分注する。
・直ちに−８０℃で凍結する。
ｒＡＡＶ精製で使用される試薬
・再懸濁緩衝液１［５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ］：５０ｍＬの１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、２ｍＬ／ＭのＭｇＣｈ、９４８ｍＬのＭＱ水、濾過滅菌する。
・１．５ｇ／ｍＬのＣｓＣＩ溶液：６７５ｇのＣｓＣＩを６５０ｍＬのＰＢＳに溶解し、そして最終容量を１０００ｍＬに調節する。１ｍＬの該溶液を秤量して密度を確認する。該溶液を濾過滅菌する。
・１．３ｇ／ｍＬのＣｓＣＩ溶液：４０５ｇのＣｓＣＩを９０６ｍＬのＰＢＳに溶解し、そして最終容量を１０００ｍＬに調節する。１ｍＬの該溶液を秤量して密度を確認する。該溶液を濾過滅菌する。
・１０％（Ｗ／Ｖ）オクチル−ＰＤ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）（Ｓｉｇｍａ、０８００１−１０Ｇ）：１０グラムをｍｉｌｌｉＱ水で１００ｍＬにする。該溶液を濾過滅菌する。
・最終処方緩衝液：ＰＢＳ＋３５ｍＭ ＮａＣｌ。１リットルの無菌ＰＢＳに７．０５ｍＬの無菌５Ｍ ＮａＣｌを添加する。
・無菌グリセロール：グリセロールを１００ｍＬガラス瓶に分注する。液体サイクルで２０分間オートクレーブ処理する。
８．実施例３：ＰＩＴＡ ＡＡＶベクターの製造のためのＤＮＡ構築物
本発明は実施例３〜５により具体的に説明され、Ｃｒｅ組換え酵素の発現を誘導する転写因子ドメインを二量体化するためのラパマイシンを使用するアブレーター発現の緊密な調節；および細胞中でのＣｒｅ認識部位（ｌｏｘＰ）を含有するトランスジーンの成功裏の誘導可能なアブレーションを示す。アブレーターの発現の緊密な調節は動物モデルで示される。
以下は、ＤＮＡ構築物の例であり、および、本発明のＰＩＴＡ系による使用のための複製欠損ＡＡＶベクターを生成するためのそれらの使用を下の実施例に具体的に説明する。
８．１．二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットをコードする構築物
図１Ａ−Ｂから図５Ｂは、二量体化可能な転写因子ドメインユニットおよびアブレーションユニットをコードするＡＡＶベクターを生成するのに使用し得る以下のＤＮＡ構築物すなわち（１）ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−ＩｌＲＥＳ−１ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図１Ａ−Ｂ）；（２）ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図２Ａ−Ｂ）；（３）ｐＡＡＶ．ＣＭＶＩ７３．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−３ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図３Ａ−Ｂ）；および（４）ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．ＩＳｃｅ−Ｉ（図４Ａ−Ｂ）の図解である。
該ＤＮＡ構築物に含有される多様なドメインの記述が後に続く。すなわち、
ＩＴＲ：ＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復配列（１６８ｂｐ）。［配列番号２６］
ＣＭＶ：完全なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；エンハンサーを包含する。［配列番号２７］
ＣＭＶ（１７３ｂｐ）：ミニマルＣＭＶプロモーター、エンハンサーを包含しない。［配列番号２８］
ＦＲＢ−ＴＡ融合：二量体化剤結合ドメインおよび転写因子の活性化ドメインの融合（９００ｂｐ、配列番号２９）。該タンパク質は配列番号３０として本明細書に提供される。ＦＲＢフラグメントは、細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド３−キナーゼホモログＦＲＡＰ（ＦＫＢＰラパマイシン会合タンパク質、ｍＴＯＲ［哺乳動物ラパマイシン標的］としてもまた知られる）のアミノ酸２０２１−２１１３に対応する。該ＦＲＡＰ配列は、ある種の免疫抑制しないラパマイシンアナログ（ラパログ）の使用を可能にするため単独点突然変異Ｔｈｒ２０９８Ｌｅｕ（ＦＲＡＰL）を組み込む。ＦＲＡＰはラパマイシン（若しくはそのアナログ）およびＦＫＢＰに結合し、そして転写活性化因子としてのヒトＮＦ−ＫＢ ｐ６５（１９０アミノ酸）の一部分に融合される。
ＺＦＨＤ−ＦＫＢＰ融合：ＤＮＡ結合ドメインおよび１コピーの二量体化剤結合ドメイン（１×ＦＫＢＰ；７３２ｂｐ）、２コピーの薬物結合ドメイン（２×ＦＫＢＰ；１０５９ｂｐ）若しくは３（３×ＦＫＢＰ；１３８９ｂｐ）コピーの薬物結合ドメインの融合。イムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、免疫抑制薬ＦＫ５０６およびラパマイシンの細胞内受容体として作用する豊富な１２ｋＤａの細胞質タンパク質である。ＺＦＨＤはＺｎフィンガー対およびホメオドメインから構成されるＤＮＡ結合ドメインである。双方の融合タンパク質は５’端にヒトｃ−ＭｙｃからのＮ末端核局在化配列を含有する。配列番号４５を参照されたい。
Ｔ２Ａ：自己切断ペプチド２Ａ（５４ｂｐ）（配列番号３１）。
Ｚ８Ｉ：８コピーのＺＦＨＤの結合部位（Ｚ８）次いでヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子からのミニマルプロモーター（配列番号３２）。例えば、１から約２０コピーまでのＺＦＨＤの結合部位次いでプロモーター例えばＩＬ−２からのミニマルプロモーターを含有するこのプロモーターのバリアントを使用してよい。
Ｃｒｅ：Ｃｒｅ組換え酵素。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１から単離されたＩ型トポイソメラーゼである。Ｃｒｅは、欠失若しくは遺伝子変換につながる、２個のｌｏｘＰ部位の間のＤＮＡ中の部位特異的組換えを媒介する（１０２９ｂｐ、配列番号３３）。
Ｉ−ＳｃｅＩ：大きな分類のメガヌクレアーゼであるイントロンエンドヌクレアーゼ若しくはホーミングエンドヌクレアーゼの１メンバー（７０８ｂｐ、配列番号３４）。それらは細菌および植物中で見出されるイントロンのような移動性遺伝要素によりコードされる。Ｉ−ＳｃｅＩはイントロンホーミング過程に関与する酵母エンドヌクレアーゼである。Ｉ−ＳｃｅＩは哺乳動物ゲノム中でまれな配列である特異的非対称１８ｂｐ配列を認識し、そして二本鎖の中断を創製する。Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２、２２４−２２８を参照されたい。
ｈＧＨポリＡ：ヒトＧＨからの最小ポリアデニル酸化シグナル（配列番号３５）。
ＩＲＥＳ：ＥＣＭＶ（脳心筋炎ウイルス）からの配列内リボソーム進入部位配列（配列番号３６）。
８．２ トランスジーンユニットをコードする構築物
図５Ａ−Ｂおよび図６Ａ−Ｂは、Ｃｒｅ組換え酵素のｌｏｘＰ認識部位により隣接されているトランスジーンをコードするＡＡＶベクターを生成するための以下のＤＮＡ構築物すなわち
（１）ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図５Ａ−Ｂ）；および（２）ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｓｃｅ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図６Ａ−Ｂ）の図解である。該構築物の多様なドメインの記述が後に続く。すなわち
ＩＴＲ：ＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復配列（配列番号２６）。
ＣＭＶ：前初期遺伝子発現を調節するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびエンハンサー（８３２ｂｐ、配列番号２７）。
ｌｏｘＰ：Ｃｒｅの認識配列。それは方向を付与する８ｂｐ領域に隣接している２個の１３ｂｐ逆位配列を含む３４ｂｐの配列である（３４ｂｐ、配列番号３７）。
Ｆｆルシフェラーゼ：ホタルルシフェラーゼ（１６５６ｂｐ、配列番号３８）。
ＳＶ４０：後期ポリアデニル酸化シグナル（２３９ｂｐ、配列番号３９）。
Ｉ−ＳｃｅＩ部位：ＳｃｅＩ認識部位（１８ｂｐ、配列番号２５）。
８．３．トランスジーンユニットおよび二量体化可能な転写因子ドメインユニットをコードする構築物
図７はトランスジーンユニットおよび二量体化可能な転写因子ドメインユニットを含有するＡＡＶベクターを生成するためのＤＮＡ構築物の図解である。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を含有するＡＡＶプラスミドバックボーンに、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、転写因子（ＴＦ）ドメインユニット、ＣＭＶプロモーター、ＦＲＢ（ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰラパマイシン会合タンパク質、ｍＴＯＲ［哺乳動物ラパマイシン標的］としてもまた知られる）のアミノ酸２０２１−２１１３）、細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド３−キナーゼホモログ）、Ｔ２Ａ自己切断ドメイン、ＦＫＢＰドメイン、ならびにヒト成長ホルモンポリＡ部位、ＣＭＶプロモーター、ｌｏｘＰ部位、インターフェロンαコーディング配列ならびにＳＶ４０ポリＡ部位を提供する。アブレーションユニット（ｃｒｅ発現カセット）を別個の構築物に配置し得る。この戦略は、上流のＣＭＶプロモーター由来のｃｒｅのいかなる潜在的なバックグラウンドレベルの発現も最小限にし得る。
９．実施例４：ＰＩＴＡのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル
本実施例は、ＡＡＶベクター中に操作されているＤＮＡ配列（ユニット）が、細胞中での該トランスジーンの緊密に制御される誘導可能なアブレーションを成功裏に達成することを示す。具体的には、本実施例は、ルシフェラーゼトランスジーン発現が、トランスジーンユニット（ルシフェラーゼを発現しかつｌｏｘ ｐ部位を含有する）、アブレーションユニット（Ｃｒｅを発現する）および二量体化可能な転写因子ドメインユニットを含有する構築物でトランスフェクトされている細胞の二量体化剤（ラパマイシン）処理に際してアブレートされ得ることを示す。
ヒト胎仔腎線維芽細胞２９３細胞を１２ウェルプレートに播種した。本明細書の９．１節に記述される多様なＤＮＡ構築物での該細胞のトランスフェクションを、細胞密度が９０％コンフルエンシーに達した翌日に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入されたリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を使用して実施した。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするベクターを、トランスフェクションの内部対照としてはたらくよう全ＤＮＡの１０％で各ウェルに添加した。ＤＭＥＭに懸濁されたＤＮＡをリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００と混合してＤＮＡ−脂質複合体を形成し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供される説明書に従ってトランスフェクションのため２９３細胞に添加した。トランスフェクション後６時間にウェルの半分を最終濃度５０ｎＭのラパマイシンで処理した。培地（１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ）を新鮮なラパマイシンで毎日置き換えた。トランスフェクション後４８および７２時間に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そしてその後ウェルから掻き取り、Ｐｒｏｍｅｇａから購入されたルシフェラーゼアッセイキット中で供給される溶解緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液をボルテックス攪拌しそして破片を沈降させた。ルシフェラーゼ活性を、１０μＬのライセートを１００μＬの基質と混合することおよび発光計からの１秒あたりの発光の読み出しにより測定した。
９．１．構築物
以下の構築物（その大部分が８節、実施例１に記述される）すなわち
１．対照としてのｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＲＢＧ、ＣＭＶプロモーターを含有しかつトランスジーンを含有しない
２．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図５Ａ−Ｂ）／ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＲＢＧ（ＣＭＶプロモーター、およびトランスジーンなし）
３．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図５Ａ−Ｂ／ｐＡＡＶ．ＴＦ．ＣＭＶ．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−２ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図２Ａ−Ｂ）
４．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図５Ａ−Ｂ／ｐＡＡＶ．ＴＦ．ＣＭＶ．ＦＲＢ−ＩＲＥＳ−ＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図１Ａ−Ｂ）
５．ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．Ｐｌ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図５Ａ−Ｂ）／ｐＡＡＶ．ＣＭＶＩ７３．ＦＲＢ−Ｔ２Ａ−３ｘＦＫＢＰ．Ｃｒｅ（図３Ａ−Ｂ）
６．構成的プロモーターからＣｒｅ遺伝子を発現する、ｐＥＮＮ．ＣＭＶ．ＰＩ．ｌｏｘＰ．Ｌｕｃ．ＳＶ４０（図５Ａ−Ｂ）／ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＰＩ．Ｃｒｅ．ＲＢＧ
を使用して、感染性の複製欠損ＡＡＶベクターを生成した。
９．２．結果
４８時間の結果を図８Ａに示し、および７２時間の結果を図８Ｂに示す。Ｃｒｅが構成的に発現される対照（処理６）において、ルシフェラーゼ発現は、１０×Ｐ部位を伴わないルシフェラーゼの対照発現（処理２、ルシフェラーゼ構築物でトランスフェクトされている細胞）と比較してラパマイシンに独立にアブレートされた。対照的に、１０×Ｐに隣接するルシフェラーゼ構築物、およびＰＩＴＡ系の制御下にｃｒｅを運搬する該構築物の１種を受領する細胞（処理３、４および５）において、レポーター遺伝子発現のレベルは二量体化剤ラパマイシンの非存在下で対照に匹敵し、非常にわずかなｃｒｅ発現が誘導されるか若しくはｃｒｅ発現が誘導されないことを示す。しかしながら、ラパマイシンでの処理による誘導に際して、ＰＩＴ Ａに制御されるｃｒｅ構築物を受領する細胞中のレポーター遺伝子発現のレベルは対照（処理２）と比較して有意に低減され、ｃｒｅ発現が活性化されたことを示す。該結果は、アブレーターの発現が二量体化剤ラパマイシンにより特異的に調節されることを確認する。
１０．実施例５：二量体化剤で誘導可能な系のｉｎ ｖｉｖｏモデル
本実施例は、本明細書に記述される二量体化剤で誘導可能な系により調節される肝特異的プロモーターを使用するトランスジーン発現の緊密な組織特異的制御を示す。これらデータはＰＩＴＡ系におけるアブレーターの緊密な調節のモデルとしてはたらく。
４群の３マウスが、それぞれ、３×１０10、１×１０11および３×１０11粒子のウイルスの用量の２シストロン性レポーター遺伝子（ＧＦＰ−ルシフェラーゼ）をコードするＡＡＶベクターのＩＶ注入を受領した。すなわち、群１（Ｇ１、Ｇ２およびＧ３）は遍在性構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にＧＦＰルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターを受領した（ＤＮＡ構築物の図解については図９Ａを参照されたい）。群２（Ｇ４、Ｇ５およびＧ６）は、以下の２種のＡＡＶベクターすなわち（１）ＣＭＶプロモーターにより駆動される二量体化可能な転写因子ドメインユニット（ｐ６５活性化ドメインと融合されたＦＲＢおよび３コピーのＦＫＢＰと融合されているＤＮＡ結合ドメインＺＦＨＤ）を発現するＡＡＶベクター（図２Ｂに示されるＤＮＡ構築物；ならびに（２）二量体化されたＴＦにより誘導されるプロモーターにより駆動されるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクター（ＤＮＡ構築物の図解については図１２Ｃを参照されたい）の共注入を受領した。群３（Ｇ７、Ｇ８およびＧ９）は、肝構成的プロモーターＴＢＧの制御下にＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターを受領した（ＤＮＡ構築物の図解については図９Ｃを参照されたい）。群４（Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２）は、以下の２種のＡＡＶベクターすなわち（１）ＴＢＧプロモーターにより駆動される二量体化可能な転写因子ドメインユニット（ｐ６５活性化ドメインと融合されているＦＲＢおよび３コピーのＦＫＢＰと
融合されているＤＮＡ結合ドメインＺＦＨＤ）を発現するＡＡＶベクター；ならびに（２）二量体化されたＴＦにより誘導されるプロモーターにより駆動されるＧＦＰ−ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクター（ＤＮＡ構築物の図解については図９Ｄを参照されたい）の共注入を受領した。
ウイルス投与の約２週間後に、マウスに２ｍｇ／ｋｇの用量の二量体化剤ラパマイシンのＩＰ注入を与えた。翌日から開始して、ルシフェラーゼ発現をＸｅｎｏｇｅｎ画像化分析によりモニターした。ラパマイシン注入のおよそ２４時間後にマウスにルシフェラーゼの基質ルシフェリンをＩＰ注入し、その後画像化のため麻酔した。
３×１０11粒子のウイルスを受領したマウスはルシフェリン投与３０分後に画像を撮影させた（図１０Ａ−Ｄ）。ＧＦＰ−ルシフェラーゼを運搬するベクターを受領した群１のマウスについて、ＣＭＶプロモーターにより駆動される発現すなわちルシフェラーゼ発現が、多様な組織中でかつ主として肺、肝および筋で観察された（図１０Ａを参照されたい）。対照的に、ルシフェラーゼ発現は、発現がＴＢＧプロモーターにより制御されたルシフェラーゼベクターを受領した群３のマウスで肝に制限された（図１０Ｂを参照されたい）。群２のマウスにおいて、ルシフェラーゼ発現のレベルは誘導前のレベルと比較して２対数以上だけ上昇され、そして発現は主として肝および筋においてであった（図１０Ｃを参照されたい）。群４のマウスにおいて、誘導前と比較して１００倍以上のルシフェラーゼ発現が誘導されかつ肝に制限された（図１０Ｄを参照されたい）。
１×１０11粒子のウイルスを受領したマウスは高用量群のものに類似の結果を示すが、しかし誘導に際して発現のより低いレベルを伴いかつ主として肝においてであった（図１１Ａ−Ｄを参照されたい）。
結論：
１．二量体化剤で誘導可能な系は、ベースラインの２対数を上回るかつ１週以内にベースライン近くに戻るルシフェラーゼ発現のピークレベルを伴い確実である（示されない）。
２．肝はウイルスをＩＶで与えた場合に感染されるのに最も効率的な組織である。
３．肝はまた、二量体化剤で誘導可能な系が作用するのに決定的に重要である２種のウイルスで共形質導入されるのに最も効率的な組織でもある。
４．ＣＭＶプロモーターにより制御される転写因子発現を伴うその二量体化剤で誘導可能な系により調節されるルシフェラーゼ発現は、マウス肝において、調節を伴わないＣＭＶプロモーターから来る発現より有意に高い。これは、誘導可能なプロモーターが、それが一旦活性化されれば肝においてＣＭＶプロモーターに比較してより強いプロモーターであることを示した。
５．ルシフェラーゼ発現は、誘導可能なＴＢＧプロモーター系を運搬するベクターを受領するマウスでラパマイシンによる誘導に際して肝で特異的に検出された。肝特異的な調節可能なベクターにより媒介されるルシフェラーゼ発現はラパマイシンによる誘導に完全に依存し、そしてルシフェラーゼ発現のピークレベルはＴＢＧプロモーターの制御下のものに匹敵する。本研究は、肝特異的遺伝子調節が肝特異的な二量体化剤で誘導可能な系のＡＡＶ媒介性遺伝子送達により達成され得ることを確認した。
１１．実施例６：加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）治療のためのＰＩＴＡ
モノクローナル抗体の硝子体内投与は、患者の一亜集団で疾患進行を遅らせかつ視力を改善するためのＡＭＤの効果的治療であることが判明している。このアプローチの重要な一制限は、しかしながら、反復される硝子体内注入に対する要件である。遺伝子治療は長期是正を提供する能力を有し、そして単回注入が治療効果を達成するのに十分であるべきである。図１２Ａ−Ｃは、抗ＶＥＧＦ抗体（Ａｖａｓｔｉｎ Ｈ鎖（ＡｖａｓｔｉｎＨ）
およびＡｖａｓｔｉｎ Ｌ鎖（ＡｖａｓｔｉｎＬ）；図１２Ｂおよび１２Ｃ）若しくは可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＦｌｔ−１；図１２Ａ）のようなＶＥＧＦアンタゴニストを含んでなるトランスジーンユニットを含有する、ＡＭＤを処置するためのＰＩＴＡ ＤＮＡ構築物を示す。これらＤＮＡ構築物を含んでなるベクターは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で網膜下注入を介して送達し得る。トランスジーン発現のアブレーションは、長期抗ＶＥＧＦ治療の副作用が観察される場合に経口二量体化剤投与により達成し得る。
１２．実施例７：肝代謝性疾患治療のためのＰＩＴＡ
ＰＩＴＡはＣ型肝炎および血友病のような肝代謝性疾患を処置するために潜在的に有用である。図１３Ａは、第ＩＸ因子を含んでなるトランスジーンユニットを含有する血友病Ａおよび／若しくはＢを処置するためのＰＩＴＡ構築物を示す。第ＶＩＩＩ因子もまたそれぞれ血友病ＡおよびＢの処置のため送達し得る（それぞれ血友病ＡおよびＢのため第ＶＩＩＩおよびＩＸ因子）。該治療は阻害剤形成が発生する場合に患者においてアブレートし得る。図１３ＢはＨＣＶのＩＲＥＳを標的とするｓｈＲＮＡの送達のためのＰＩＴＡ構築物を示す。本構築物を含んでなるベクターを３×１０12ＧＣ／ｋｇの用量で門脈の腸間膜支流を介し注入し得る。ｓｈＲＮＡの発現は、ＲＮＡ干渉の非特異的毒性が発生する若しくは治療がもはや必要とされない場合にアブレートし得る。
１３．実施例８：心疾患治療のためのＰＩＴＡ
ＰＩＴＡは、限定されるものでないがうっ血性心不全（ＣＨＦ）および心筋梗塞（ＭＩ）を挙げることができる心疾患の応用に利用し得る。ＣＨＦの処置は、図１４Ａおよび図１４Ｂに示される構築物を使用するインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）若しくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の送達を必要とし得る。心筋梗塞の処置のためには、ＭＩの初期段階での遺伝子送達が、虚血の有害な影響から心を保護し得るがしかしもはや必要とされない場合に該治療のアブレーションを可能にし得る。このアプローチのための治療的遺伝子は虚血性傷害の程度を制限するよう機能し得るヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）を包含する。心へのベクター媒介性遺伝子送達の送達方法は経皮、静脈内、筋肉内および心肺バイパス技術を包含する。ヒトについては、最適のベクター媒介性遺伝子送達プロトコルは、ありそうには、冠動脈若しくは前心静脈中への逆行性若しくは順行性経冠動脈送達を利用することができる。
１４．実施例９：中枢神経系（ＣＮＳ）疾患治療のためのＰＩＴＡ
中枢神経系におけるＰＩＴＡの応用の魅力的な候補は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病および眼疾患の処置のための神経栄養因子を包含する。図１５は、神経成長因子（ＮＧＦ）を含んでなるトランスジーンユニットを含有するアルツハイマー病を処置するためのＰＩＴＡ構築物を示す。ＮＧＦのＡＡＶベクター媒介性遺伝子送達は現在、アルツハイマー病の処置のためＣｅｒｅｇｅｎｅにより実施されている第Ｉ相臨床試験で研究されている。ＮＧＦは、神経変性疾患の動物モデルでコリン作動性細胞消失の低減において有効であることが示されかつＡＤを伴う患者での記憶および認知能力の低下の予防において有効でありうる神経栄養因子である。該アプローチのための送達方法は、マイネルト基底核（ＮＢＭ）を含有する脳の前脳基底核領域を標的とするための両側定位注入よりなる。処置を終了させることの必要性をもたらす副作用の可能性により、ＰＩＴＡを包含するための該構築物のさらなる操作が正当化される。
てんかんの処置のための中枢神経系におけるＰＩＴＡの応用もまた、発作を取り巻く問題が一旦解消されれば遺伝子発現をアブレートする可能性により、ならびに薬物療法に不応性でありかつ処置することが外科的に困難であるてんかんの処置に利用可能な制限された代替アプローチにより、の双方でも価値があることができる。これらの場合、とりわけ、治療的遺伝子を発現するベクターの定位注入を必要とする送達方法は代替の外科的処置
よりはるかにより少なく侵襲的であるとみられる。遺伝子発現の候補は、てんかんの動物モデルで治療効果を有することが示されているガラニン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）およびグリア細胞株由来神経栄養因子ＧＤＮＦを包含し得る。他の応用は、アルツハイマー病のための神経成長因子（ＮＧＦ）およびパーキンソン病のための芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＤＣＣ）を送達することを包含する。
１５．実施例１０：ＨＩＶ治療のためのＰＩＴＡ
ＨＩＶに対する天然に誘導される中和抗体が長期感染患者の血清中で同定されている。ＡＡＶにより送達される中和抗体の不十分な誘導しかし十分なレベルをもたらした活性ワクチンのアプローチに対する一代替として、ＰＩＴＡは受動免疫療法のため抗ＨＩＶ中和抗体を送達するための有望なアプローチである。図１６を参照されたい。構築物設計はＡＭＤ治療のためのアバスチン（ａｖａｓｔｉｎ）遺伝子送達と同様である（図１２Ｂおよび１２Ｃを参照されたい）。肝特異的プロモーター（ＴＢＧ）により調節される抗体をコードする構築物を含んでなるベクターを３×１０12ＧＣ／ｋｇの用量で肝に注入し得る。あるいは、抗体発現を駆動する遍在性ＣＢ７プロモーターを運搬する構築物を含んでなるベクターを、四頭筋若しくは二頭筋中への２０回までの注入について５×１０12ＧＣ／ｍＬの用量の筋肉内注入により送達し得る。該治療は、それがもはや必要とされない場合若しくは毒性が抗薬物抗体の誘導により発生する場合にアブレートし得る。
１６．実施例１１：
以下の実施例に記述されるＤＮＡ構築物を、本発明の複製欠損ＡＡＶウイルスおよびウイルス組成物を製造するのに使用しうる。
多様なエンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが、ＧｅｎｅＡｒｔによりコドンを最適化されかつデノボ合成された。アブレーター発現および標的プラスミドは標準的分子生物学的クローニング技術を使用して製造した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で実施した。全部のトランスフェクションは、トランスフェクション試薬プロトコルで定義されるところの最適トランスフェクション条件を使用して実施した。簡潔には、２００〜２５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（トランスフェクション対照プラスミドを排除する）をリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と複合体形成しかつ９６ウェルプレート中の細胞に添加した。ＤＮＡ量は、試験プラスミドと同一プロモーターを含有する無関係のプラスミドの補充により全条件にわたり一貫した。トランスフェクション複合体を、ＦＢＳ補充された培地の添加前にトランスフェクション試薬プロトコルのとおり細胞と４〜６時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞を３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、製造元の説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌルシフェラーゼ検出キットを使用してレポーター遺伝子発現についてＢｉｏＴｅｋ Ｃｌａｒｉｔｙプレートリーダーでアッセイし、そしてウミシイタケルシフェラーゼを使用してトランスフェクション効率を対照した。全サンプルは四重で実施しそして平均の標準誤差を計算した。
Ａ．野生型ＦｏｋＩの共発現はＦｏｋＩタンパク質の送達より効率的にトランスジーンの発現をアブレートする
ＦｏｋＩ酵素のアミノ酸配列は配列番号１２に提供され、ここでアミノ酸１ないし３８７はＤＮＡ結合ドメインでありかつアミノ酸３８７ないし５８４は触媒ドメインである。コドン最適化されたＦｏｋＩ配列を配列番号１に提供する。
図１８は、野生型ＦｏｋＩがＨＥＫ２９５細胞へのコトランスフェクション後にルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を効果的にアブレートした（図１８Ａ 棒２）一方、部分的アブレーションのみがＦｏｋＩタンパク質を細胞に送達した場合に観察された（図１
８Ａ、棒３）ことを具体的に説明する。
用量依存的実験において、ＦｏｋＩ発現ベクターはＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＨＤ）に融合されているＦｏｋＩ触媒ドメインを含有した。９６３ｂｐである本構築物は配列番号２１に提供され、そして、塩基対１ないし３６６ｂｐのＺＦＨＤ、３６７ないし３７２ｂｐのリンカーおよび３７３ないし９６３ｂｐのＦｏｋＩ触媒ドメインから構成される。生じる発現産物はアミノ酸１ないし１２２（ＺＦＨＤ）を含んでなり、アミノ酸１２３−１３４はリンカーでありかつアミノ酸１２５ないし３２１はＦｏｋＩ触媒ドメインからである。図１８Ｂは、ＦｏｋＩの濃度を増大させることがＬｕｃレポーターの用量依存的アブレーションをもたらしたことを具体的に説明する。ルシフェラーゼが複数の天然のＦｏｋＩ部位を含有するため、アブレーション部位は、本具体的説明でトランスジーンを含有する転写ユニット中に操作されることを必要とされなかった。
これは、細胞への送達のためのトランスジーンを含有する転写ユニット中の特定のアブレーション部位に向けられるトランスフェクトされるＦｏｋＩ酵素を使用するＰＩＴＡ系の使用についての裏付けを提供する。
Ｂ．Ｚｎフィンガー−ホメオドメインによりＤＮＡ上の非同族認識部位に繋ぎ止められているキメラの操作されたＦｏｋＩがＬｕｃレポーター遺伝子の発現を効果的にアブレートする
本実施例のプラスミド構築物は、ＦｏｋＩ触媒ドメイン（完全長タンパク質のアミノ酸３８７ないし５８４に対応する１８９アミノ酸（配列番号１４））（繋ぎ止められていないＦｏｋＩ）若しくは上のＡ部に記述されるところの９６３ｂｐのＺＦＨＤ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（繋ぎ止められているＦｏｋＩ）いずれかを含有する。最高濃度ででさえ、ＤＮＡに繋ぎ止められていないＦｏｋＩの触媒ドメインはＬｕｃレポーター遺伝子の発現に対する影響を有しない（図１９Ａ）。ＺＦＨＤとの融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているキメラの操作されたＦｏｋＩは、増大する濃度のＺＦ−ＨＤ−ＦｏｋＩ発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした場合に、用量依存的様式でルシフェラーゼレポーターの発現を効果的にアブレートした（図１９Ｂ）。
これは、ＰＩＴＡ系、および細胞への送達のためのトランスジーンを含有する転写ユニット中の特定のアブレーション部位に向けられるキメラ酵素により提供される付加的な安全要素の使用を裏付ける。
Ｃ．キメラＦｏｋＩのＤＮＡ結合特異性は多様な分類の異種ＤＮＡ結合ドメインとの融合により再現可能に変えることができ、また、標的トランスジーンのアブレーションは異種ＮＬＳの付加によりさらに改良し得る
本実施例は、Ｚｎフィンガーホメオドメイン（ＺＦＨＤ）がキメラの操作されている酵素により媒介されるアブレーションの特異性を変えるのに適する唯一のドメインではないことを具体的に説明する。ＦｏｋＩは、ＨＴＨ ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩ触媒ドメインに融合した場合にルシフェラーゼレポーターの発現を用量依存的様式で効果的にアブレートした（図２０Ａ）。別個の実験（図２７Ｂ）において、ＨＴＨ−ＦｏｋＩの活性はＨＴＨ−ＦｏｋＩコーディング配列のＮ末端に異種ＮＬＳを付加することによりさらに改良された。
ＨＴＨ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（配列番号５）は、１−１７１ｂｐのＧｉｎ（セリン組換え酵素）からのＨＴＨ、リンカー（ｂｐ １７２−１７７）およびコドン最適化されたＦｏｋＩ由来のＦｏｋＩ触媒ドメイン（１７８−７６８ｂｐ）から構成される。生じるキメラ酵素（配列番号６）は、ＧｉｎからのＨＴＨのａａ１−５７、リンカー（ａａ５８−５９）およびＦｏｋＩ触媒ドメイン（アミノ酸６０−２５６）を含有する。
図２０Ａ−２０Ｂは、キメラＦｏｋＩのＤＮＡ結合特異性は別の分類の異種ＤＮＡ結合ドメインとの融合により再現可能に変えることができ、また、標的トランスジーンのアブレーションを異種核局在化シグナル（ＮＬＳ）の付加的なによりさらに改良し得ることを具体的に説明する棒グラフである。図２０Ａは、増大する濃度の、ＨＴＨ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）でのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのコトランスフェクションの結果を具体的に説明する。第一の棒は５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ単独を示す対照である。図２０Ｂ 増大する濃度の、そのＮ末端にＮＬＳをさらに有するＨＴＨ−ＦｏｋＩ融合をコードする発現プラスミドを伴うｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ。
１７．実施例１２：
ここに具体的に説明されないとは言え、他のキメラ酵素が本明細書に記述される技術を使用して作成されている。すなわち
ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇの核局在化シグナル（１−２４ｂｐ）、およびＧｉｎからのＨＴＨ、セリン組換え酵素（２５−１９２ｂｐ）を包含する、ＧｉｎからのＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ
ＮＬＳ−へリックス−ターン−へリックス（ＨＴＨ）（１９２ｂｐ、配列番号７）を含有するＡＡＶプラスミド。生じる酵素（配列番号８）において、アミノ酸１−８はＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳからでありかつアミノ酸９−６４はＧｉｎからのＨＴＨである。
ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ（ｂｐ１−２４）、ＧｉｎからのＨＴＨ（ｂｐ２５−１９２）、リンカー（ｂｐ１９３−１９８）およびＦｏｋＩの触媒ドメイン（ｂｐ１９９−７８９）を包含する、ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ−ＨＴＨ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（７８９ｂｐ、配列番号９）を含有するＡＡＶプラスミド。生じるキメラ酵素（配列番号１０）において、アミノ酸１−８はＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳからであり、アミノ酸９−６４はＧｉｎからのＨＴＨであり、アミノ酸６５−６６はリンカー残基であり、そしてアミノ酸６７−２６３はＦｏｋＩ触媒ドメインである。
ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ（ｂｐ１−２４）、Ｚｎフィンガーホメオドメイン（ｂｐ２５−３８７）、リンカー（ｂｐ３８８−３９３）およびＦｏｋＩの触媒ドメイン（ｂｐ３９４−９８４）を包含する、ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳ−ＺＦＨＤ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン（９８４ｂｐ）を含有するＡＡＶプラスミドを製造した（配列番号２３）。生じるキメラ酵素（配列番号２１、３２８ａａ）において、アミノ酸１−８はＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ ＮＬＳであり、アミノ酸９−１２９はＺＦＨＤであり、アミノ酸１３０−１３１はリンカー残基であり、そしてアミノ酸１３２−１３８はＦｏｋＩ触媒ドメインである。
これらおよび他の構築物は、ウイルス組成物およびＰＩＴＡ系での使用のために本発明の方法に従ってウイルスを製造するのに使用し得る。
１８．実施例１３：ＨＩＶの処置における複製欠損ＡＡＶウイルス組成物の使用
本組成物はＨＩＶの処置における安全機構として潜在的に使用し得る。最近、長期未発症者すなわちＡＩＤＳへの進行を伴わずＨＩＶ+状態を数十年間維持する個体からの広範に中和する抗体がいくつかの研究グループにより同定された。
ＨＩＶに対する中和抗体（ＨＩＶ ＮＡｂ）の全コーディング領域はＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の間に置かれる。構築物の全体的大きさが４．７ｋｂより下（２個のＩＴＲを包含して）である場合、それらはＡＡＶキャプシドにパッケージングされる。選ばれるＡＡＶ血清型キャプシドは、遺伝子発現のレベル、送達の方法、および必要とされる注入部位からの生体内分布の程度に依存することができる。加えて、ＨＩＶ ＮＡｂ
（および潜在的には該１種の小分子の状況で誘導可能な系の部分）の発現に使用される構成的プロモーターは、標的とされる組織型に依存するとみられる。潜在的臨床研究の以下の実施例において、選ばれるベクター血清型は、肝特異的プロモーターＴＢＧの利用を可能にするとみられる静脈内注入により投与されるＡＡＶ８であることができる。
ＨＩＶ+患者において、これらＨＩＶ中和抗体の１種若しくはそれ以上を発現するＡＡＶベクターの投与は、１種若しくはより広範なＨＩＶ ＮＡｂの長期の高レベル発現につながるとみられ、および、ウイルス量を低減しかつＨＩＶの獲得を潜在的に予防するとみられる。この状況で、個体は５×１０12ゲノムコピー／キログラムの各ベクターの用量の２種のＡＡＶベクターの静脈内注入を受領するとみられる。構成的プロモーターの制御下のＨＩＶ中和抗体が該２種のＡＡＶベクター内に含有されることができ、発現が該ベクターの投与後迅速に起こることを可能にする。
Ａ．ヘテロ二量体および２種の小分子
ＨＩＶ ＮＡｂに対する潜在的毒性の最初の徴候後に、第一の小分子薬物を誘導可能な系の成分の発現を誘導するために投与することができ、この場合、ＤＮＡ結合ドメインはＦＫＢＰに連結されかつＦＲＡＰLはエンドヌクレアーゼ酵素の触媒ドメインに連結される。これは、ＨＩＶ ＮＡｂに対するさらなる毒性が発生する場合に該系が作用のためプライミングされることを可能にするとみられる。毒性レベルが上昇することを継続する場合には、エンドヌクレアーゼ活性の開始を、活性酵素の形成およびＨＩＶ ＮＡｂ遺伝子発現のアブレーションにつながるとみられる第二の小分子薬物の投与により誘導することができる。
Ｂ．ヘテロ二量体および１種の小分子
ラパマイシンで誘導可能な系の要素ＦＫＢＰおよびＦＲＡＰLもまた構成的発現の制御下にあるとみられる。ＡＡＶベクターの投与後に、患者は定期的間隔で数年間緊密にモニターされるとみられる。ＨＩＶ ＮＡｂに対する毒性が発生する場合には、ラパマイシン若しくはラパログの送達を企図することができる。反復される投与に増大する可能性をもつ第一の場合の１ｍｇ／ｋｇのラパマイシン／ラパログのＩＶ投与が、ＨＩＶ抗体の発現をアブレートするために投与されるとみられる。
毒性およびＨＩＶ抗体のレベルを、ＨＩＶ ＮＡｂの発現が検出不可能なレベルに達するまで緊密にモニターすることができる。従って、ＨＩＶ ＮＡｂの遺伝子発現のアブレーションは、克服できない毒性が発生する場合に遺伝子発現をアブレートするための安全スイッチを提供するとみられる。
一局面において、本発明は、ウイルスゲノムが（ａ）転写を制御するプロモーターと作動的関連の治療的産物をコードする第一の転写ユニットであって、前記ユニットは最低１個のアブレーション認識部位を含有し；ならびに（ｂ）プロモーターと作動的関連の最低１個のアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第二の転写ユニットであって、ここで転写および／若しくはアブレーション活性は薬理学的作用剤例えば二量体化剤により制御される、を含有するよう操作されている、ヒト被験体での使用に適する複製欠損ウイルス組成物を提供する。例えば、１種の適する薬理学的作用剤はラパマイシン若しくはラパマイシンアナログでありうる。該ウイルス組成物は２種若しくはそれ以上の異なるウイルスストックを含有しうる。
一局面において、本発明は、ウイルスゲノムが（ａ）転写を制御するプロモーターと作動的関連の治療的産物をコードする第一の転写ユニットであって、前記第一の転写ユニットはアブレーション認識部位を含有し；ならびに、プロモーターと作動的関連のアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第二の転写ユニットであって、ここ
で転写および／若しくはアブレーション活性は薬理学的作用剤により制御される、を含んでなる、ヒト被験体での使用に適する複製欠損ウイルス組成物を提供する。該第一の転写ユニットは１個以上のアブレーション認識部位を含有し得る。ゲノムが１個以上のアブレーション認識部位を含んでなる場合、前記１個以上のアブレーション認識部位は、第一のアブレーション認識部位および前記第一のアブレーション認識部位と異なる第二のアブレーション認識部位を含んでなり、前記ウイルスは、第一のアブレーション認識部位に特異的な第一のアブレーターおよび第二の認識部位に特異的な第二のアブレーターをさらに含んでなる。
一態様において、アブレーターの転写、生物活性および／若しくはＤＮＡ結合特異性は調節可能な系により制御される。該調節可能な系は、ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ系、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）で調節可能な系、タモキシフェン依存性の調節可能な系、ラパマイシンで調節可能な系若しくはエクダイソンに基づく調節可能な系から選択し得る。
一態様において、アブレーターは、第一の転写ユニット中のアブレーション認識部位に結合しかつＤＮＡを切り出す若しくはアブレートするエンドヌクレアーゼ、組換え酵素、メガヌクレアーゼ、若しくはＺｎフィンガーエンドヌクレアーゼ、および第一の転写ユニットのＲＮＡ転写物をアブレートするか若しくは第一の転写ユニットのＲＮＡ転写物の翻訳を抑制する干渉ＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンスよりなる群から選択される。特定の一態様において、アブレーターはＣｒｅでありかつアブレーション認識部位はｌｏｘＰであるか、若しくはアブレーターはＦＬＰでありかつアブレーション認識部位はＦＲＴである。
一態様において、アブレーターはキメラの操作されたエンドヌクレアーゼであり、ここでウイルス組成物は、（ｉ）第一の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されているエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第一の配列を含んでなり；およびここでウイルス組成物は、（ｉｉ）第一の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されているエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ切断ドメインをコードする第二の配列をさらに含んでなり、ここで第一の配列（ｉ）および第二の配列（ｉｉ）はそれぞれ、それらの発現を制御する最低１種のプロモーターと作動的関連にある。該キメラの操作されたエンドヌクレアーゼは、第二の転写ユニット中の単独の２シストロン性オープンリーディングフレーム内に含有されることができ、前記転写ユニットは（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーをさらに含んでなる。場合によっては、配列（ｉｉ）は誘導可能なプロモーターを有する。別の態様において、キメラの操作されたエンドヌクレアーゼの融合パートナー／フラグメントは別個のオープンリーディングフレーム内に含有される。一態様において、第一の配列および第二の配列のそれぞれは構成的プロモーターの制御下にあり、そしてアブレーターは第一の薬理学的作用剤により生物活性化される。
アブレーターのコーディング配列は、アブレーターコーディング配列に対し５’若しくは３’に配置されている核局在化シグナルをさらに含みうる。
一態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｚｎフィンガー、へリックス−ターン−へリックス、ＨＭＧボックス、Ｓｔａｔタンパク質、Ｂ３、へリックス−ループ−へリックス、ウィングドへリックス−ターン−へリックス、ロイシンジッパー、ウィングドへリックス、ＰＯＵドメインおよびホメオドメインよりなる群から選択される。
なお別の態様において、エンドヌクレアーゼはＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、イントロンエンドヌクレアーゼおよびセリン若しくはチロシン組換え酵素よりなる群から選択される。特定の一態様において、アブレーターはキメラＦｏｋＩ酵素である。
なお別の態様において、本発明の複製欠損ウイルス組成物中で、ウイルスゲノムは、アブレーターの誘導可能なプロモーターを調節する転写因子の二量体化可能なドメインをコードする第三および第四の転写ユニットをさらに含んでなり、ここで：（ｃ）第三の転写ユニットは、第一のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードし；および（ｄ）第四の転写ユニットは、第二のプロモーターと作動的関連の薬理学的作用剤の結合ドメインに融合されている転写因子の活性化ドメインをコードする。（ｃ）の第一のプロモーターおよび（ｄ）の第二のプロモーターは構成的プロモーターおよび誘導可能なプロモーターから独立に選択される。別の態様において、第一および第二のプロモーターは双方が構成的プロモーターであり、ならびに薬理学的作用剤は転写因子のドメインを二量体化する二量体化剤である。なおさらなる一態様において、第一のプロモーターおよび第二のプロモーターの一方が誘導可能なプロモーターである。第三および第四の転写ユニットはＩＲＥＳ若しくはフリン−２Ａを含有する２シストロン性ユニットであり得る。
一態様において、薬理学的作用剤はラパマイシン若しくはラパログである。
一態様において、ウイルスはＡＡＶである。こうしたＡＡＶは例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびｒｈ１０のなかから選択しうる。例えばアデノウイルス、単純疱疹ウイルスなどを包含するなお他のウイルスを、本発明のＤＮＡ構築物および複製欠損ウイルスを生成するのに使用しうる。
一態様において、治療的産物は、ＨＩＶの感染性を中和する抗体若しくは抗体フラグメント、可溶性血管内皮細胞増殖因子受容体−１（ｓＦｌｔ−１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）若しくは神経成長因子（ＮＧＦ）である。
複製欠損ウイルス組成物の一態様において、第一の転写ユニットおよび第二の転写ユニットは組成物中の異なるウイルスストック上にある。場合によっては、第一の転写ユニットおよび第二の転写ユニットは第一のウイルスストックにありかつ第二のウイルスストックは第二のアブレーター（１種若しくは複数）を含んでなる。
一態様において、組換えＤＮＡ構築物はウイルスゲノムのパッケージングシグナルにより隣接されている第一および第二の転写ユニットを含んでなり、ここで：（ａ）転写を制御するプロモーターと作動的に組み合わさって治療的産物をコードする第一の転写ユニットであって、前記第一の転写ユニットは最低１個のアブレーション認識部位を含有し；および（ｂ）薬理学的作用剤に応答して転写を誘導するプロモーターと作動的関連の最低１個のアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第二の転写ユニット。転写ユニットに隣接するパッケージングシグナルはＡＡＶの５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびＡＡＶの３’ＩＴＲでありうる。場合によっては、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９若しくはｒｈ１０ ＩＴＲである。一態様において、第一の転写ユニットはＡＡＶ ＩＴＲにより隣接され、ならびに第二、第三および第四の転写ユニットはＡＡＶ ＩＴＲにより隣接されている。場合によっては、転写ユニットは２種若しくはそれ以上のＤＮＡ構築物に含有される。
一態様において、治療的産物は、ＨＩＶの感染性を中和する抗体若しくは抗体フラグメント、可溶性血管内皮細胞増殖因子受容体−１（ｓＦｌｔ−１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）若しくは神経成長因子（ＮＧＦ）である。
一態様において、治療的産物の転写を制御するプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導可能なプロモーター、若しくは生理学的合図に応答性のプロモーターである。
治療的産物がＶＥＧＦアンタゴニストである、本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト被験体における加齢黄斑変性症の処置方法が記述される。
治療的産物が第ＶＩＩＩ因子である、本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト被験体における血友病Ａの処置方法が提供される。
治療的産物が第ＩＸ因子である、本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト被験体における血友病Ｂの処置方法が提供される。
治療的産物がインスリン様増殖因子若しくは肝細胞増殖因子である、本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト被験体におけるうっ血性心不全の処置方法が記述される。
治療的産物が神経成長因子ある、本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト被験体における中枢神経系障害の処置方法が提供される。
治療的産物がＨＩＶに対する中和抗体である、本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト被験体におけるＨＩＶ感染症の処置方法が提供される。
トランスジーン産物の送達の制御における使用のための複製欠損ウイルスが本明細書に提供される。該産物は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン様増殖因子、肝細胞増殖因子、神経成長因子、およびＨＩＶに対する中和抗体よりなる群から選択しうる。
本明細書に提供されるところの複製欠損ウイルス若しくはＤＮＡ構築物を含んでなる遺伝子操作されている細胞が提供される。遺伝子操作されている細胞は植物、細菌若しくはヒト以外の哺乳動物細胞から選択しうる。
（ａ）患者から得られた組織サンプル中の治療的産物の発現を検出すること、ならびに（ｂ）前記被験体における治療的産物の存在と関連する副作用を検出することを含んでなる、治療的産物およびアブレーターをコードする本明細書に提供されるところの複製欠損ウイルスを受領した被験体に治療的産物をアブレートするための薬理学的作用剤をいつ投与するかの決定方法が提供され、ここで、前記被験体における治療的産物の存在と関連する副作用の検出が、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤を投与することの必要性を示す。
前記被験体から得られた組織サンプル中の治療的産物の存在と関連する毒性の生化学的マーカーのレベルを検出することを含んでなる、治療的産物およびアブレーターをコードする本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物を受領した被験体に治療的産物をアブレートするための薬理学的作用剤をいつ投与するかの決定方法が提供され、ここで毒性を反映する前記マーカーのレベルが、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用
剤を投与することの必要性を示す。
これらの方法は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤での処置の後に被験体からの組織サンプル中の治療的遺伝子産物をコードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物若しくはそのコードされるタンパク質の存在を測定することをさらに含んでなることができ、ここで治療的遺伝子産物をコードするＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物若しくはそのコードされるタンパク質の存在が、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤での反復処置に対する必要性を示す。
本発明はさらに、トランスジーン産物の送達の制御における使用のための本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルスを提供する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス若しくはＤＮＡ構築物を含んでなる、遺伝子操作されている細胞を提供する。こうした細胞は、植物、酵母、真菌、昆虫、細菌、ヒト以外の哺乳動物細胞、若しくはヒト細胞でありうる。
なおさらなる一態様において、本発明は、（ａ）患者から得られた組織サンプル中の治療的産物の発現を検出すること、および（ｂ）前記被験体における治療的産物の存在と関連する副作用を検出することを含んでなる、治療的産物およびアブレーターをコードする本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルスを受領した被験体に治療的産物をアブレートするための薬理学的作用剤をいつ投与するかの決定方法を提供し、ここで、前記被験体における治療的産物の存在と関連する副作用の検出が、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤を投与することの必要性を示す。なおさらなる一態様において、本発明は、前記被験体から得られた組織サンプル中の治療的産物の存在と関連する毒性の生化学的マーカーのレベルを検出することを含んでなる、治療的産物およびアブレーターをコードする本明細書に記述されるところの複製欠損ウイルス組成物を受領した被験体に治療的産物をアブレートするための薬理学的作用剤をいつ投与するかの決定方法を提供し、ここで毒性を反映する前記マーカーのレベルが、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用剤を投与することの必要性を示す。
実施例１４：１０×ＺＦ構築物の生成
多様なエンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが、ＧｅｎｅＡｒｔによりコドンを最適化されかつデノボ合成された。アブレーター発現および標的プラスミドは標準的分子生物学的クローニング技術を使用して製造した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で実施した。全部のトランスフェクションは、トランスフェクション試薬プロトコルで定義されるところの最適トランスフェクション条件を使用して実施した。簡潔には、１５０〜２００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（トランスフェクション対照プラスミドを排除する）をリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と複合体形成しかつ９６ウェルプレート中の細胞に添加した。ＤＮＡ量は、試験プラスミドと同一プロモーターを含有する無関係のプラスミドの補充により全条件にわたり一貫した。トランスフェクション複合体は、ＦＢＳ補充された培地の添加前にトランスフェクション試薬プロトコルのとおり細胞と４時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、製造元の説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌルシフェラーゼ検出キットを使用してレポーター遺伝子発現についてＢｉｏＴｅｋ Ｃｌａｒｉｔｙプレートリーダーでアッセイし、そしてウミシイタケルシフェラーゼを使用してトランスフェクション効率を対照した。全サンプルは四重で実施し、そして平均の標準誤差を計算した。
Ａ．１０×ＺＦ発現プラスミドの生成
ランダム配列１を標準的Ｚｎフィンガー設計の方法論により一旦生成しかつ標的化可能であることが決定されれば、ヌクレアーゼの設計を、Ｚｎフィガー（ＺＦ）共同体（Ｚｎ
Ｆｉｎｇｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）およびＺｎフィンガーデーターベース（これらは公的に利用可能である。例えばｂｉｎｄｒ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ：８０８０／ＺｉＦＤＢ／を参照されたい）から入手可能な資源を使用して実施した。２８〜３２ｂｐ配列の１０×３ｂｐのＺＦ結合部位への分解に基づき、該３ｂｐ配列のそれぞれに結合するＺＦドメインを同定した。
以下の２８〜３２ｂｐ配列を生成した。すなわち、
［配列番号８０６］ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡ。この配列について、異なるＺｎフィンガーにより標的化可能である２個のリーディングフレームが存在する。すなわちＧＧＴ−ＣＧＡ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−ＣＡＡ−ＣＧＴ−ＣＧＡ−ＴＣＧ−ＴＡＣ−ＧＴＧ−ＣＡ−標的化可能
Ｇ−ＧＴＣ−ＧＡＴ−ＧＴＴ−ＣＧＣ−ＡＡＣ−ＧＴＣ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＡＣＧ−ＴＧＣ−Ａ−標的化可能（本明細書に記述される実験はこの配列について生成された）
［配列番号８１７］：ＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＡＣ。この配列について、異なるＺｎフィンガーにより標的化可能である２個のリーディングフレームが存在する。Ｇ−ＧＴＣ−ＧＧＣ−ＧＡＣ−ＧＣＧ−ＴＡＡ−ＴＣＧ−ＴＣＧ−ＡＴＴ−ＧＧＣ−ＧＴＡ−Ｃ−標的化可能
ＧＧ−ＴＣＧ−ＧＣＧ−ＡＣＧ−ＣＧＴ−ＡＡＴ−ＣＧＴ−ＣＧＡ−ＴＴＧ−ＧＣＧ−ＴＡＣ−標的化可能
［配列番号８０１］ＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＡＣ。この配列について、異なるＺｎフィンガーにより標的化可能である２個のリーディングフレームが存在する。Ｇ−ＧＴＣ−ＧＧＣ−ＧＡＣ−ＧＣＧ−ＴＡＡ−ＴＣＧ−ＴＣＧ−ＡＴＴ−ＧＧＣ−ＧＴＡ−Ｃ−標的化可能
ＧＧ−ＴＣＧ−ＧＣＧ−ＡＣＧ−ＣＧＴ−ＡＡＴ−ＣＧＴ−ＣＧＡ−ＴＴＧ−ＧＣＧ−ＴＡＣ−標的化可能
［配列番号８０２］ＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＡＣ。
この配列について、Ｚｎフィンガーにより標的化可能な１つの可能性が存在する。すなわちＧＧＴ−ＣＧＧ−ＣＧＡ−ＣＧＣ−ＧＴＡ−ＴＣＧ−ＡＴＴ−ＧＧＣ−ＧＴＡ−Ｃ−標的化可能
［配列番号８０３］ＡＣＴＡＴＴＣＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＡＧＴＣＧＧＣＧＣＧＡ。この配列について、異なるＺｎフィンガーにより標的化可能な２個のリーディングフレームが存在する。すなわちＡＣＴ−ＡＴＴ−ＣＧＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＴＡＣ−ＧＡＴ−ＡＧＴ−ＣＧＧ−ＣＧＣ−ＧＡ−標的化可能、およびＡ−ＣＴＡ−ＴＴＣ−ＧＣＡ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＡＣＧ−ＡＴＡ−ＧＴＣ−ＧＧＣ−ＧＣＧ−Ａ−標的化可能。
ただ１種の既知のＺＦ配列がコンソーシアム内で入手可能であったいずれの３ｂｐ配列についても、この配列を最終タンパク質に選択した。これは１０×ＺＦドメインのうち３種について真実であった。
ＤＮＡへの結合のため特定の一方向に一緒に連結されている２若しくは３個のＺＦの以前に試験された組合せの表がコンソーシアムのデータベース内で提供された。われわれのランダム配列１内に、以前に試験された組合せを含有する２領域が存在する。一方は３個の３ｂｐストレッチでありかつ他方は２個の３ｂｐストレッチである。ＺＦの以前の組合せが作用することが報告された場合、これを該１０×ＺＦ配列に採り入れた。
１０×ＺＦ配列のうち３種について、ＤＮＡ結合領域の認識へリックスのみがコンソーシアムに包含された。１０×ＺＦ配列のうち７種について、完全なＺＦ配列がコンソーシ
アムで入手可能であった。従って、認識へリックスのみが該コンソーシアムにより入手可能であったＺＦの完全な配列を生成しなければならなかった。加えて、１０×ＺＦタンパク質間の高レベルの配列相同性を予防するため、ＺＦタンパク質ドメインの保存されたタンパク質配列をコンソーシアム中の２種の保存された配列の一方の間で変えた。すなわちＰ開始保存配列 ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ−−−−−−−ＨＱＲＴＨ［配列番号７４５］
Ｔ開始保存配列 ＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳ−−−−−−−ＨＬＲＴＨ［配列番号８０７］
ＺＦは、そこで生得的タンパク質配列が最終タンパク質の正しい構造を見込むとみられるため、Ｎ末端からＣ末端に直接連結した。
１０×ＺＦ配列をその後、１０×ＺＦタンパク質のＣ末端の標準的リンカー配列によりＦｏｋＩ酵素（ＤＮＡ結合ドメインは野生型配列から除去した）の触媒ドメインに連結した。
下の作業実施例において、配列１０ｘＺＦ−ＦｏｋＩ＿Ｃａｔヌクレオチド配列：配列番号５９によりコードされるアブレーターを具体的に説明する。すなわち
ＡＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣＴＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＴＧＣＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＧＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣ
ＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＡＧ。
本構築物において、ｂｐ１−８４：ＺｎフィンガーＮ１（認識へリックスＱＲＲＳＬＧＨ、Ｐ形態、ＴＧＣに結合する）；ｂｐ８５−１６８：ＺｎフィンガーＮ２（認識へリックスＫＫＮＤＬＴＲ、Ｐ形態、ＡＣＧに結合する）；ｂｐ１６９−２５２：ＺｎフィンガーＮ３（認識へリックスＳＲＲＴＣＲＡ、Ｐ形態、ＣＧＴに結合する）；ｂｐ２５３−３３６：ＺｎフィンガーＮ４（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｔ形態、ＧＡＴに結合する）；ｂｐ３３７−４２０：ＺｎフィンガーＮ５（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｔ形態、ＧＴＣに結合する）、ｂｐ４２１−５０４：ＺｎフィンガーＮ６（認識へリックスＤＳＧＮＬＲＶ、Ｐ形態、ＡＡＣに結合する）；ｂｐ５０５−５８８：ＺｎフィンガーＮ７（認識へリックスＨＴＧＨＬＬＥＭ、Ｐ形態、ＣＧＣに結合する）；ｂｐ５８９−６７２：ＺｎフィンガーＮ８（認識へリックスＴＮＱＡＬＧＶ、Ｔ形態、ＧＴＴに結合する）；ｂｐ６７３−７５６：ＺｎフィンガーＮ９（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｐ形態、ＧＡＴに結合する）；ｂｐ７５７−８４０：ＺｎフィンガーＮ１０（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｐ形態、ＧＴＣに結合する）；ｂｐ８４１−８５５：５アミノ酸リンカー；ｂｐ８５６−１４４３：ＦｏｋＩ触媒ドメイン。
転写された具体的に説明するアブレーターは以下の配列を有し、ここで奇数番号のＺｎフィンガーは該１０個のＺｎフィンガーのそれぞれの場所を具体的に説明するため下線を付けられ；該Ｚｎフィンガーはそれらの同定を容易にするためにのみハイフンにより分離される。すなわち、１０ｘＺＦ−ＦｏｋＩ＿Ｃａｔアミノ酸配列：配列番号６０すなわちＭＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＲＲＳＬＧＨＨＱＲＴＨ−ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣ（Ｎ１）
ＧＫＳＦＳＫＫＮＤＬＴＲＨＱＲＴＨ−ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＳＲＲＴＣＲ
（Ｎ２） （Ｎ３）
ＡＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＬＲＴＨ−ＴＧＥＫ
（Ｎ４）
ＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＴＳＬＡＲＨＬＲＴＨ−ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦ（Ｎ５） （Ｎ６）
ＳＤＳＧＮＬＲＶＨＱＲＴＨ−ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＨＴＧＨＬＬＥＨＱＲ
（Ｎ７）
ＴＨ−ＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＮＱＡＬＧＶＨＬＲＴＨ−ＰＧＥＫＰＹＫＣ
（Ｎ８）
ＰＥＣＧＫＳＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＱＲＴＨ−ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＤＲＴ
（Ｎ９） （Ｎ１０）
ＳＬＡＲＨＱＲＴＨ
ＧＴＳＧＫＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＰＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＥＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ。１−２８ａａ−ＺｎフィンガーＮ１（認識へリックスＱＲＲＳＬＧＨ、Ｐ形態、ＴＧＣに結合する）；２９−５６ａａ−ＺｎフィンガーＮ２（認識へリックスＫＫＮＤＬＴＲ、Ｐ形態、ＡＣＧに結合する）；５７−８４ａａ−ＺｎフィンガーＮ３（認識へリックスＳＲＲＴＣＲＡ、Ｐ形態、ＣＧＴに結合する）；８５−１１２ａａ−ＺｎフィンガーＮ４（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｔ形態、ＧＡＴに結合する）；１１３−１４０ａａ−ＺｎフィンガーＮ５（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｔ形態、ＧＴＣに結合する）；１
４１−１６８ａａ−ＺｎフィンガーＮ６（認識へリックスＤＳＧＮＬＲＶ、Ｐ形態、ＡＡＣに結合する）；１６９−１９６ａａ−ＺｎフィンガーＮ７（認識へリックスＨＴＧＨＬＬＥＭ、Ｐ形態、ＣＧＣに結合する）；１９７−２２４ａａ−ＺｎフィンガーＮ８（認識へリックスＴＮＱＡＬＧＶ、Ｔ形態、ＧＴＴに結合する）；２２５−２５２ａａ−ＺｎフィンガーＮ９（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｐ形態、ＧＡＴに結合する）；２５３−２８０ａａ−ＺｎフィンガーＮ１０（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｐ形態、ＧＴＣに結合する）；２８１−２８４ａａ−５アミノ酸リンカー；および２８５−４８１ａａ−ＦｏｋＩ触媒ドメイン。
別の態様において、アブレーターは、上の構築物（配列番号１５）中の第一のＺｎフィンガー（Ｎ１）の配列が開始コドンの後にＰが挿入されている配列番号１８８により置き換えられていることを除き、配列番号６０の配列を有する。
別の態様において、１０×ＺＦ配列は、１０×ＺＦタンパク質のＮ末端でリンカー配列によりＦｏｋＩ酵素（ＤＮＡ結合ドメインは野生型配列から除去した）の触媒ドメインに連結されている。
Ｎ連結ＦｏｋＩ＿Ｃａｔ−１０ｘＺＦヌクレオチド配列：配列番号８０８すなわち
ＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣＴＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＴＧＣＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＧＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴ
ＴＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ。
本核酸配列は：ＦｏｋＩ触媒ドメイン（１−５９４ｂｐ）、４アミノ酸リンカー（５９５−６０６ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ１（認識へリックスＱＲＲＳＬＧＨ、Ｐ形態、ＴＧＣに結合する）（６０７−６８７ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ２（認識へリックスＫＫＮＤＬＴＲ、Ｐ形態、ＡＣＧに結合する）（６８８−７７１ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ３（認識へリックスＳＲＲＴＣＲＡ、Ｐ形態、ＣＧＴに結合する）（７７２−８５５ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ４（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｔ形態、ＧＡＴに結合する）（８５６−９３９ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ５（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｔ形態、ＧＴＣに結合する）（９４０−１０２３ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ６（認識へリックスＤＳＧＮＬＲＶ、Ｐ形態、ＡＡＣに結合する）（１０２４−１１０７ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ７（認識へリックスＨＴＧＨＬＬＥＭ、Ｐ形態、ＣＧＣに結合する）（１１０８−１１９１ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ８（認識へリックスＴＮＱＡＬＧＶ、Ｔ形態、ＧＴＴに結合する）（１１９２−１２７５ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ９（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｐ形態、ＧＡＴに結合する）（１２７６−１３５９ｂｐ）、ＺｎフィンガーＮ１０（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｐ形態、ＧＴＣに結合する）（１３６０−１４４３ｂｐ）でコードする。
転写されたＮ連結１０ｘＺＦ−ＦｏｋＩ＿Ｃａｔアミノ酸配列：配列番号８０９は後に続くとおりである。
ＭＫＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＰＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＥＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＧＴＳＧＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＲＲＳＬＧＨＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＫＫＮＤＬＴＲＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＳＲＲＴＣＲＡＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＴＳＬＡＲＨＬＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＤＳＧＮＬＲＶＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＨＴＧＨＬＬＥＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＮＱＡＬＧＶＨＬＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＱＲＴＨＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＤＲＴＳＬＡＲＨＱＲＴＨ。
このキメラエンドヌクレアーゼは：ＦｏｋＩ触媒ドメイン（１−１９８ａａ）、５アミノ酸リンカー（１９９−２０２ａａ）、ＺｎフィンガーＮ１（認識へリックスＱＲＲＳＬＧＨ、Ｐ形態、ＴＧＣに結合する）（２０３−２２９ａａ）、ＺｎフィンガーＮ２（認識へリックスＫＫＮＤＬＴＲ、Ｐ形態、ＡＣＧに結合する）（２３０−２５７ａａ）、ＺｎフィンガーＮ３（認識へリックスＳＲＲＴＣＲＡ、Ｐ形態、ＣＧＴに結合する）（２５８−２８５ａａ）、ＺｎフィンガーＮ４（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｔ形態、ＧＡＴに結合する）（２８６−３１３ａａ）、ＺｎフィンガーＮ５（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｔ形態、ＧＴＣに結合する）（３１４−３４１ａａ）、ＺｎフィンガーＮ６（認識へリックスＤＳＧＮＬＲＶ、Ｐ形態、ＡＡＣに結合する）（３４２−３６９ａａ）、ＺｎフィンガーＮ７（認識へリックスＨＴＧＨＬＬＥＭ、Ｐ形態、ＣＧＣに結合する）（３７０−３９７ａａ）、ＺｎフィンガーＮ８（認識へリックスＴＮＱＡＬＧＶ、Ｔ形態、ＧＴＴに結合する）（３９８−４２５ａａ）、ＺｎフィンガーＮ９（認識へリックスＶＲＨＮＬＴＲ、Ｐ形態、ＧＡＴに結合する）（４２６−４５３ａａ）およびＺｎフィンガーＮ１
０（認識へリックスＤＲＴＳＬＡＲ、Ｐ形態、ＧＴＣに結合する）（４５４−４８１ａａ）である。
Ｂ．１０ｘＺＦ−ＦｏｋＩ＿Ｃａｔタンパク質のレポータープラスミドの生成
１０×ＺＦ発現プラスミドの効率を研究するため、一連のルシフェラーゼレポータープラスミドもまた、独特の３２ｂｐ配列すなわち上のＡで記述されるとおり生成される［配列番号８０６］ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡを用いて設計した。これらのベクターは：
配列番号８１１の、５’から３’まで：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター（ｂｐ１−８３２）、ＰｒｏｍｅｇａTMイントロン（８３３−１０２９ｂｐ）、センス方向の３２ｂｐ配列（１０６９−１１００ｂｐ）、スペーサー（１１０１−１１０６ｂｐ）、逆方向の３２ｂｐ配列（１１０７−１１３８ｂｐ）、コザック配列（１１４７−１１５２ｂｐ）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコーディング配列（１１５３−２８０２ｂｐ）およびＳＶ４０ポリＡ配列（２８２２−３０６１ｂｐ）を含有するｐＩＴＡ−０３０。
配列番号８１２の、５’から３’まで：ＣＭＶプロモーターＩＥエンハンサー／プロモーター（１−８３２ｂｐ）、ＰｒｏｍｅｇａTMイントロン（８３３−１０２９ｂｐ）、直接（ｄｉｒｅｃｔ）／センス方向の３２ｂｐ配列（１０６９−１１００ｂｐ）、スペーサー（１１０１−１１０６ｂｐ）、逆方向の３２ｂｐ配列（１１０７−１１３８ｂｐ）、コザック配列（１１４７−１１５２ｂｐ）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコーディング配列（１１５３−２８０２ｂｐ）、センス方向の３２ｂｐ配列（２８１５−２８４６ｂｐ）、スペーサー（２８４７−２８５２ｂｐ）、逆方向の３２ｂｐ配列（２８５３−２８８４ｂｐ）およびＳＶ４０ポリＡ配列（２８９３−３１３１ｂｐ）を含有するｐＩＴＡ−０３１。
配列番号８１３の、５’から３’まで：ＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター（１−８３２ｂｐ）、ＰｒｏｍｅｇａTMイントロン（８３３−１０２９ｂｐ）、センス方向の３２ｂｐ配列（１０６９−１１００ｂｐ）、コザック配列（１１１５−１１２０ｂｐ）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコーディング配列（１１２１−２７７０ｂｐ）およびＳＶ４０ポリＡ配列（２７９１−３０２９ｂｐ）を含有するｐＩＴＡ−０３２。
配列番号８１４の、５’から３’まで：ＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター（１−８３２ｂｐ）、ＰｒｏｍｅｇａTMイントロン（８３３−１０２９ｂｐ）、センス方向の３２ｂｐ配列（１０６９−１１００ｂｐ）、コザック配列（１１１５−１１２０ｂｐ）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコーディング配列（１１２１−２７７０ｂｐ）、センス方向の３２ｂｐ配列（２７８３−２８１４ｂｐ）およびＳＶ４０ポリＡ配列（２８２９−３０６７ｂｐ）を含有するｐＩＴＡ−０３３。
配列番号８１５の、５’から３’まで：ＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター（１−８３２ｂｐ）、ＰｒｏｍｅｇａTMイントロン（８３３−１０２９ｂｐ）、センス方向の３２ｂｐ配列（１０６９−１１００ｂｐ）、コザック配列（１１１５−１１２０ｂｐ）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコーディング配列（１１２１−２７７０ｂｐ）、直接方向の３２ｂｐ配列（２７８９−２８２０ｂｐ）およびＳＶ４０ポリＡ配列（２８２９−３０６７ｂｐ）を含有するｐＩＴＡ−０３４
を包含する。
ｐＩＴＡ−００５（対照）は、５’から３’まで：ＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター（１−８３２ｂｐ）、ＰｒｏｍｅｇａTMイントロン（８３３−１０２９ｂｐ）、コザック配列（１０７７−１０８２ｂｐ）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコーディン
グ配列（１０８３−２７３２ｂｐ）およびＳＶ４０ポリＡ配列（２７５２−２９９１ｂｐ）を含有する。
これらレポータープラスミドは配列番号８１０の用量依存的研究で研究した。
（Ａ）増大する濃度の、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．３２ｂｐ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＩＴＡ−０３２、ルシフェラーゼ遺伝子の５’端に１０×ＺＦタンパク質の単独の特異的部位）とともに２９３細胞にコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。
（Ｂ）増大する濃度の、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．３２ｂｐ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−３２ｂｐ（ｐＩＴＡ−０３３、ルシフェラーゼ遺伝子の５’および３’端に頭から尾の方向の１０×ＺＦタンパク質の単独の特異的部位）とともに２９３細胞にコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。
（Ｃ）増大する濃度の、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．３２ｂｐ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−３２ｂｐ（ｐＩＴＡ−０３４、ルシフェラーゼの５’端に１０×ＺＦタンパク質の単独の特異的部位およびルシフェラーゼ遺伝子の３’端に単独の特異的逆位部位）とともに２９３細胞にコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。
（Ｄ）増大する濃度の、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．３２ｂｐＳｐａｃｅｒ３２ｂｐ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＩＴＡ−０３０、ルシフェラーゼ遺伝子の５’端に同一のしかし逆位の３２ｂｐを分離するスペーサーを伴う３２ｂｐ部位を含有する１０×ＺＦの単独の組合せられた特異的部位）とともにコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。
（Ｅ）増大する濃度の、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．３２ｂｐＳｐａｃｅｒ３２ｂｐ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−３２ｂｐＳｐａｃｅｒ３２ｂｐ（ｐＩＴＡ−０３１、ルシフェラーゼ遺伝子の５’端および３’端双方に同一のしかし逆位の３２ｂｐを分離するスペーサーを伴う３２ｂｐ部位を含有する１０×ＺＦの単独の組合せられた特異的部位）とともにコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。（Ｆ）増大する濃度の、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＩＴＡ−００５、１０×ＺＦの特異的部位を含有しないルシフェラーゼ発現プラスミド）とともにコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション２４時間後にアッセイした。
（Ｇ）増大する濃度の、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＩＴＡ−００５、１０×ＺＦの特異的部位を含有しないルシフェラーゼ発現プラスミド）とともにコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。
（Ａ）〜（Ｅ）のそれぞれにおいて、用量依存的アブレーションが全５種のレポータープラスミドについて観察され、本発明により提供される１０×ＺＦ設計は１個のみの３２ｂｐ配列がレポーター遺伝子内にそして従って本明細書に記述される応用でのベクター内に存在することを必要とすることを示す。
レポータープラスミドの異なる方向を用量依存的研究で研究した。
（Ｈ）増大する濃度の、タンパク質のＮ末端に１０×ＺＦドメインを伴い１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５および５０ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．３２ｂｐＳｐａｃｅｒ３２ｂｐＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＩＴＡ−０３０、ルシフェラーゼ遺伝子の５’端に同一のしかし逆位の３２ｂｐを分離するスペーサーを伴う３２ｂｐ部位を含有する１０×ＺＦの単独の組合せられた特異的部位）とともに２９３細胞にコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。
（Ｉ）増大する濃度の、タンパク質のＮ末端にＦｏｋＩ触媒ドメインを伴い１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド（１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５および５０ｎｇ）を、５０ｎｇのｐＣＭＶ．３２ｂｐＳｐａｃｅｒ３２ｂｐＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＩＴＡ−０３０、ルシフェラーゼ遺伝子の５’端に同一のしかし逆位の３２ｂｐを分離するスペーサーを伴う３２ｂｐ部位を含有する１０×ＺＦの単独の組合せられた特異的部位）とともに２９３細胞にコトランスフェクトした。細胞を、上述されたところのレポーター遺伝子発現についてトランスフェクション４８時間後にアッセイした。
異なるＡＡＣトリプレットを標的とする影響を評価するため、多様なＺｎフィンガーを、本明細書の実施例１４Ａに記述されるとおり製造した、１０×ＺＦ融合を介してＤＮＡに繋ぎ止められているＦｏｋＩをコードする発現プラスミド中の第六の（Ｎ６）Ｚｎフィンガーの代わりに用いた。ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲ戦略を使用して、代替の認識へリックスＤＳＧＮＬＲＶ（配列番号６４）を実施例１４Ａの発現プラスミドのＮ６中のＧＡＳＡＬＲＳ（配列番号６６）の場所に挿入した。この第二世代の構築物はｐＩＴＡ−０４７と命名され、そして５’ＩＴＲ、ＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー、Ｚｎフィンガー−ＦｏｋＩ触媒ドメイン、ポリＡおよび３’ＩＴＲを含有する。別個の研究において、上述されたレポータープラスミド（ｐＩＴＡ−３０、ｐＩＴＡ−０３１、ｐＩＴＡ−０３２およびｐＩＴＡ−００５）を、増大する濃度のｐＩＴＡ−０４７プラスミドとともに２９３細胞にコトランスフェクトし（５０ｎｇのレポータープラスミド）、そしてルシフェラーゼ発現をトランスフェクション４８時間後に測定した。低下されたルシフェラーゼ発現はより高いエンドヌクレアーゼ活性を示す。該結果は、変えられたＡＡＣターゲッティング配列をもつｐＩＴＡ−０４７構築物が、同一ベクター要素を含有するがしかし野生型Ｚｎフィンガードメインを伴う第一世代プラスミドと比較してルシフェラーゼ発現を成功裏に低下させたことを示した。
本出願で引用される全部の刊行物、特許および特許出願、ならびに２０１１年３月２８
日出願の優先出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３０２１３号明細書および米国特許出願第６１／３１８，７５５号明細書、ならびに配列表は、各個々の刊行物若しくは特許出願が引用することにより組み込まれることを明確にかつ個々に示されたかのように、そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる。前述の発明は、理解の明確さの目的上具体的説明および実施例により若干詳細に記述されたとは言え、ある種の変更および改変が、付属として付けられる請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなくそれらに対しなされ得ることが、本発明の教示を踏まえ、当業者に容易に明らかであろう。
以下の情報が数値識別子＜２２３＞の下にフリーテキストを含有する配列について提供される。

Claims (22)

  1. 制御されるトランスジーン発現アブレーション系を有する治療的産物のＡＡＶ媒介性送達のための組成物であって、前記組成物が
    （ａ）（ｉ）治療的産物の転写を制御するプロモーターに作動可能に連結されている前記治療的産物をコードする核酸配列；および
    （ｉｉ）最低１０個（１０×）のＺｎフィンガーにより特異的に認識される最低３０核酸塩基対の配列を含む最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位であって、前記治療的産物をコードする配列に対し少なくとも５’に配置されている、最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位、
    を含んでなる核酸分子を含有するＡＡＶベクター；と
    （ｂ）プロモーターと作動的に組み合わさった機能的エンドヌクレアーゼ触媒ドメインに連結されている最低１０個のＺｎフィンガードメインを含むキメラエンドヌクレアーゼを含んでなる最低１種のアブレーターであって、ここで最低１個のアブレーターの転写および／若しくはアブレーション活性が薬理学的作用剤に応答して誘導され、前記最低１０個（１０×）のＺｎフィンガードメインは、前記最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位中における（ａ）（ｉｉ）の前記最低約３０塩基対配列を特異的に認識しかつ最低１０個の認識へリックスを含む、アブレーター
    とを含んでなり、かつ、
    前記エンドヌクレアーゼ触媒ドメインがＦｏｋＩ触媒ドメインである、
    ことを特徴とする上記組成物。
  2. 最低１０個の認識へリックスが全部異なる、請求項１に記載の組成物。
  3. 最低１０個の認識へリックスが、アブレーション部位の塩基対の同一トリプレットに対する異なる認識へリックスを包含する、請求項２に記載の組成物。
  4. 最低１０個の認識へリックスが同一である１ないし３個のへリックスを含有する、請求項１に記載の組成物。
  5. エンドヌクレアーゼアブレーション部位中の最低３０塩基対配列が最低３２塩基対を含んでなる、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の組成物。
  6. 核酸分子が第一のエンドヌクレアーゼアブレーション部位および第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位を含んでなり、ここで前記第一および前記第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位が同一若しくは異なる配列でありうる、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の組成物。
  7. 第一のエンドヌクレアーゼアブレーション部位および第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位が双方とも治療産物をコードする配列に対し５’に配置されかつ前記第一のアブレーション部位と第二のアブレーション部位がスペーサー配列により分離されている、請求項６に記載の組成物。
  8. 第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位が逆方向で治療産物の遺伝子に対し配置されている、請求項７に記載の組成物。
  9. スペーサー配列が非コーディング配列である、請求項７に記載の組成物。
  10. 第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位が治療産物をコードする配列に対し３’に配置されている、請求項６に記載の組成物。
  11. エンドヌクレアーゼの触媒ドメインが、Ｚｎフィンガードメイン配列のＮ若しくはＣ末端でＺｎフィンガードメイン配列に連結されている、請求項１に記載の組成物。
  12. エンドヌクレアーゼの触媒ドメインがリンカー配列を介してＺｎフィンガードメイン配列に連結されている、請求項１１に記載の組成物。
  13. エンドヌクレアーゼの触媒ドメインがＺｎフィンガードメイン配列内に配置されている、請求項１に記載の組成物。
  14. 核酸分子が二本鎖ＤＮＡ分子よりなり、ここで最低１個のエンドヌクレアーゼアブレーション部位が前記ＤＮＡ分子の第一鎖上にあり、かつ、少なくとも１個の第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位が前記ＤＮＡ分子の第二鎖上にあり、ここで前記第二のエンドヌクレアーゼアブレーション部位は第一鎖上の前記エンドヌクレアーゼアブレーション部位と異なり、かつ異なるＺｎフィンガーにより特異的かつ選択的に認識される、請求項１ないし１３のいずれか１つに記載の組成物。
  15. 最低３０塩基対配列が、
    （ｉ）配列番号８０６：５’−ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡ−３’；
    （ｉｉ）配列番号８０１：５’−ＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＡＣ−３’
    および
    （ｉｉｉ）配列番号８０３：５’−ＡＣＴＡＴＴＣＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＡＧＴＣＧＧＣＧＣＧＡ−３’
    よりなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  16. Ｚｎフィンガードメインが、（ａ）ＴＧＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第一のＮ末端Ｚｎフィンガー；（ｂ）ＡＣＧに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第二のＺｎフィンガー；（ｃ）ＣＧＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第三のＺｎフィンガー；（ｄ）ＧＡＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第四のＺｎフィンガー；（ｅ）ＧＴＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第五のＺｎフィンガー；（ｆ）ＡＡＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第六のＺｎフィンガー；（ｇ）ＣＧＣに結合する認識へリックスを含んでなる第七のＺｎフィンガー；（ｈ）ＧＴＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第八のＺｎフィンガー；（ｉ）ＧＡＴに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第九のＺｎフィンガー；および（ｊ）ＧＴＣに特異的に結合する認識へリックスを含んでなる第十のＺｎフィンガーよりなる最低１０個のＺｎフィンガーをコードする核酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
  17. ＴＧＣに特異的に結合する（ａ）の認識へリックスが、ＡＲＮＴＬＶＨ、ＱＲＲＳＬＧＨ、ＱＡＲＳＬＲＡ、ＱＱＲＳＬＫＮ、およびＱＮＲＳＬＡＨ、ＱＧＲＳＬＲＡ、ＲＡＲＮＬＴＬ、ＲＧＲＮＬＥＭ、ＲＫＲＮＬＩＭ、ＲＭＲＮＬＩＩ、ＲＮＲＮＬＶＬ、ＲＲＲＮＬＨＬ、ＲＲＲＮＬＴＬ，ＲＳＲＮＬＤＩ、ＲＳＲＮＬＬＬ、ならびにＲＳＲＮＬＴＬ（配列番号６５８−６７３）よりなる群から選択され；
    ＡＣＧに特異的に結合する（ｂ）の認識へリックスが、ＫＮＮＤＬＴＲ；ＫＲＩＤＬＱＲ；ＲＫＨＤＬＮＭ；ＲＲＱＴＬＲＱ；ＫＧＮＤＬＴＲ；ＲＮＩＴＬＶＲ、ＲＳＨＤＬＴＶ、ＡＳＡＤＬＴＲ、ＱＮＡＴＲＫＲ、ＱＳＧＤＬＴＲ、ＲＳＱＴＬＡＱ；およびＲＴＤＴＬＲＤ（配列番号８４−９５）よりなる群から選択され；
    ＣＧＴに特異的に結合する（ｃ）の認識へリックスがＲＳＱＴＲＫＴ（配列番号１５４）およびＳＲＲＴＣＲＡ（配列番号１５５）よりなる群から選択され；
    ＧＡＴに特異的に結合する（ｄ）の認識へリックスが、ＶＲＨＮＬＴＲ、ＩＳＨＮＬＡＲ，ＩＳＳＮＬＱＲ、ＬＧＮＮＬＫＲ、ＬＮＳＮＬＡＲ、ＬＳＴＮＬＴＲ、ＬＴＨＮＬＲＲ、ＱＳＳＮＬＡＲ、ＲＳＤＡＬＩＱ、ＳＫＱＡＬＡＶ、ＴＧＱＱＬＲＶ、ＴＫＱＲＬＶＶ、ＴＲＱＲＬＲＩ、ＴＳＡＮＬＳＲ、ＴＳＧＮＬＶＲ、ＴＳＱＭＬＶＶ、ＴＳＳＮＬＳＲ、ＴＴＳＮＬＲＲ、ＶＧＨＮＬＳＲ、ＶＧＳＮＬＴＲ（配列番号２５１−２７０）よりなる群から選択され；
    ＧＴＣに特異的に結合する（ｅ）の認識へリックスが、ＤＲＴＳＬＡＲ、ＤＨＳＳＬＫＲ、ＡＰＳＳＬＲＲ、ＤＡＴＱＬＶＲ、ＤＰＧＡＬＶＲ、ＤＰＴＳＬＮＲ、ＤＲＳＡＬＡＲ、ＤＲＳＡＬＳＲ、ＤＲＳＳＬＲＲ、ＤＲＴＰＬＮＲ、ＤＲＴＰＬＱＮ、ＥＧＧＡＬＲＲ、ＥＳＧＡＬＲＲ、ＮＴＳＬＬＲＲ、ＲＳＤＶＬＳＥ、ＴＧＡＶＬＲＲ、ＴＧＡＶＬＴＲ、ＴＫＫＩＬＴＶ、ＴＫＳＬＬＡＲ、ＴＭＡＶＬＲＲ、ＴＲＡＶＬＲＲ、ＴＳＴＩＬＡＲ、ＴＳＴＬＬＫＲおよびＴＳＴＬＬＮＲ（配列番号５３０−５５３）よりなる群から選択され；
    ＡＡＣに特異的に結合する（ｆ）の認識へリックスが、ＤＲＳＮＲＫＴ、ＤＳＧＮＬＲＶ、ＧＡＳＡＬＲＱ、ＧＡＳＡＬＲＳ、ＧＧＴＡＬＲＭ、ＧＧＴＡＬＶＭ、ＧＨＴＡＬＡＬ、ＧＨＴＡＬＲＨ、ＧＨＴＡＬＲＮ、ＧＰＴＡＬＶＮおよびＨＲＴＮＬＩＡ（配列番号６３−７３）よりなる群から選択され；
    ＣＧＣに特異的に結合する（ｇ）の認識へリックスがＨＴＧＨＬＬＥ（配列番号１５１）であり；
    ＧＴＴに特異的に結合する（ｈ）の認識へリックスが、ＨＫＳＳＬＴＲ、ＡＡＴＡＬＲＲ、ＨＨＮＳＬＴＲ、ＨＳＳＳＬＶＲ、ＩＫＡＩＬＴＲ、ＩＮＨＳＬＲＲ、ＩＲＴＳＬＫＲ、ＭＮＳＶＬＫＲ、ＭＴＳＳＬＲＲ、ＱＡＴＬＬＲＲ、ＱＳＳＡＬＴＲ、ＴＨＴＶＬＡＲ、ＴＫＰＶＬＫＩ、ＴＲＨＳＬＧＲ、ＴＳＧＡＬＴＲ、ＴＳＧＳＬＴＲ、ＴＳＧＳＬＶＲ、ＴＳＴＬＬＫＲ、ＴＳＴＲＬＤＩ、ＴＴＡＬＬＫＲ、ＴＴＳＡＬＴＲ、ＴＴＴＶＬＡＲおよびＶＧＧＳＬＮＲ（配列番号５８３−５９５および５９８−６０７）よりなる群から選択され；
    ＧＡＴに特異的に結合する（ｉ）の認識へリックスが、ＩＳＨＮＬＡＲ、ＶＲＨＮＬＴＲ、ＩＳＳＮＬＱＲ、ＬＧＮＮＬＫＲ、ＬＮＳＮＬＡＲ、ＬＳＴＮＬＴＲ、ＬＴＨＮＬＲＲ、ＱＳＳＮＬＡＲ、ＲＳＤＡＬＩＱ、ＳＫＱＡＬＡＶ、ＴＧＱＱＬＲＶ、ＴＫＱＲＬＶＶ、ＴＲＱＲＬＲＩ、ＴＳＡＮＬＳＲ、ＴＳＧＮＬＶＲ、ＴＳＱＭＬＶＶ、ＴＳＳＮＬＳＲ、ＴＴＳＮＬＲＲ、ＶＧＨＮＬＳＲおよびＶＧＳＮＬＴＲ（配列番号２５１−２７０）よりなる群から選択され；
    ならびに
    ＧＴＣに特異的に結合する（ｊ）の認識へリックスが、ＤＲＴＳＬＡＲ、ＤＨＳＳＬＲＫＲ、ＡＰＳＳＬＲＲ、ＤＡＴＱＬＶＲ、ＤＰＧＡＬＶＲ、ＤＰＴＳＬＮＲ、ＤＲＳＡＬＡＲ、ＤＲＳＡＬＳＲ、ＤＲＳＳＬＲＲ、ＤＲＴＰＬＮＲ、ＤＲＴＰＬＱＮ、ＥＧＧＡＬＲＲ、ＥＳＧＡＬＲＲ、ＮＴＳＬＬＲＲ、ＲＳＤＶＬＳＥ、ＴＧＡＶＬＲＲ、ＴＧＡＶＬＴＲ、ＴＫＫＩＬＴＶ、ＴＫＳＬＬＡＲ、ＴＭＡＶＬＲＲ、ＴＲＡＶＬＲＲ、ＴＳＴＩＬＡＲ、ＴＳＴＬＬＫＲおよびＴＳＴＬＬＮＲ（配列番号５３０−５５３）よりなる群から選択される、
    請求項１６に記載の組成物。
  18. Ｚｎフィンガー（ａ）〜（ｊ）のそれぞれが、
    配列番号７４５：（Ｎ末端）−ＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ−ＸＸＸＸＸＸＸ−ＨＱＲＴＨ（カルボキシ末端）、ＣＯＯＨ、および
    配列番号８０７：（Ｎ−末端）−ＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳ−ＸＸＸＸＸＸＸ−ＨＬＲＴＨ（カルボキシ末端）、ＣＯＯＨ、
    （ここで、ＸＸＸＸＸＸＸはＺｎフィンガー認識へリックスである）
    から選択されるＺｎフィンガー構築物に挿入されている選択された認識ドメインを有する、請求項１７に記載の組成物。
  19. ＴＧＣに特異的に結合する（ａ）の認識へリックスがＱＲＲＳＬＧＨ（配列番号６６３）であり；
    ＡＣＧに特異的に結合する（ｂ）の認識へリックスがＫＮＮＤＬＴＲ（配列番号８６）であり；
    ＣＧＴに特異的に結合する（ｃ）の認識へリックスがＳＲＲＴＣＲＡ（配列番号１５５）であり；
    ＧＡＴに特異的に結合する（ｄ）の認識へリックスがＶＲＨＮＬＴＲ（配列番号２７０）であり；
    ＧＴＣに特異的に結合する（ｅ）の認識へリックスがＤＲＴＳＬＡＲ（配列番号５４０）であり；
    ＡＡＣに特異的に結合する（ｆ）の認識へリックスがＤＳＧＮＬＲＶ（配列番号６４）であり；
    ＣＧＣに特異的に結合する（ｇ）の認識へリックスがＨＴＧＨＬＬＥ（配列番号１５１）であり；
    ＧＡＴに特異的に結合する（ｊ）の認識へリックスがＶＲＨＮＬＴＲ（配列番号２７０）であり；
    および
    ＧＴＣに特異的に結合する（ｋ）の認識へリックスがＤＲＴＳＬＡＲ（配列番号５４０）である、
    請求項１７に記載の組成物。
  20. Ｚｎフィンガードメインが、５アミノ酸ＧＴＳＧＫ（配列番号８０５）をコードする配列によりＦｏｋＩ触媒ドメインをコードする配列に連結されており、それにより生じるキメラエンドヌクレアーゼがＺｎフィンガー結合部位直後６ｂｐを切断する、請求項１に記載の組成物。
  21. （ａ）のプロモーターがラパマイシンで調節可能な系により制御される、請求項１に記載の組成物。
  22. 薬理学的作用剤がラパマイシン若しくはラパログである、請求項１に記載の組成物。
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