CN106834332B - 一种重组质粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组质粒及其制备方法和应用，所述重组质粒的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明首次在多能硫碱弧菌中实现了高效无痕敲除或整合基因，通过构建自杀质粒实现对多能硫碱弧菌目的基因的敲除，此法的建立不但能加深对硫碱弧菌的弧菌的认识，还对其他极端微生物的认识找到一条合适的途径，进而能更好的开发这类微生物，更好的为人类服务，所以此法的建立有着很重要的意义。

Description

一种重组质粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组质粒及其制备方法和应用。

背景技术

多能硫碱弧菌是一种嗜盐嗜碱的化能自养弧状微生物，呈革兰氏阴性，最初是从盐碱环境中的土壤中分离出来，能够耐受较高的pH和盐度。据测定，多能硫碱弧菌生长的pH范围是7-11，而最佳生长范围是9-10；耐受的Na⁺浓度范围是0.3-4M，最佳生长范围是1-2M。硫碱弧菌属生命力普遍极强，能够在比较恶劣的环境中(比如高渗透压、低温溶液等)存活很长时间。由于该菌是化能自养型微生物，所以不能在纯有机物培养基中生长。硫碱弧菌可以利用硫代硫酸盐、硫化物等低价硫化合物作为电子供体，O₂作为电子受体，并利用CO₂作为碳源。

多能硫碱弧菌作为生物脱硫的核心环节和重要影响因素，若能深入对其遗传背景进行研究，确定与脱硫形状相关的基因，然后通过基因工程的手段构建出工况适应能力强的脱硫效果率高的对营养成分需求低的工程菌就显得尤为重要。然而，生物脱硫刚刚兴起，很长一段时间以来，人们仅仅把对脱硫开发应用仅仅停留在工艺优化上，在脱硫菌的遗传背景研究极少，进行基因改造的则更是凤毛麟角。

目前，进行了基因水平的研究的微生物只有异着色菌属(Allochromatium)，硫杆菌属(Acidthiobacillus)，副球菌属(Paracoccus)等几个属，而本研究所用的多能硫碱弧菌所在的硫碱弧菌属中还没有任何分子改造方面的报道。然而，非常值得一提的是，研究人员已经对该属中Thialkalivibriosp.K90mix和Thioalkalivibrio sulfidophilus进行了全基因组测序，并进行了较为详尽的基因注释和基因功能性的分析，这为我们研究Thialkalivibrio versutus提供了非常有重要的参考价值。

目前，对微生物代谢通路进行改在几乎都是通过基因修饰技术来实现的。基因修饰是近几年来分子生物学中经常使用到的技术之一，它主要是指利用分子生物学方法对微生物的染色体序列进行修改，通常利用的手段是把一段目的基因通过转化导入微生物细胞，也可以是将微生物染色体上的一段DNA序列删除掉，进而能够依照人们的目的定向改变微生物的基因组、生长特性及遗传特性等。事实上，主要的依据的理论就是同源重组原理。Red同源重组是目前非常高效成熟的一种技术，主要用于对大肠杆菌的基因组进行基因修饰。但是由于该法在操作过程中所需要修饰酶重组酶表达特异性的原因还不能顺利地应用于其他微生物的改造。尽管后来研究人员又开发了无痕敲除的方法，但是仍需要导入外源质粒表达同源重组酶来促进同源重组的发生。因此，像硫碱弧菌这样的极端微生物，照搬大肠杆菌的遗传操作系统是完全行不通的，建立适合自己的一套遗传操纵系统显得非常重要。

着色菌属等多种微生物是通过构建自杀质粒来实现敲除的。其原理是利用自杀质粒与目的菌株染色体发生整合，再在外界压力发生重组而实现目的基因的敲除；而所谓自杀质粒必须具备如下两个关键条件：(1)质粒所携带复制子不能在目的宿主中复制；(2)质粒有合适的大小的同源臂能与宿主基因组发生重组；(3)质粒带有一定的筛选压力或者一些特定的识别位点。对于(1)，一般选用窄宿主质粒的复制子，例如R6K质粒的pREori、F质粒的复制子甚至E.coli的pMB1复制子均有实现敲除的成功案例，然而，由于pREori复制子需要宿主表达一种π蛋白才能启动复制，而绝大多数微生物不具有这种生理机能，所以这种复制又被称为条件复制，可以认为是最严格的复制方式。对于(2)而言，选择合适的目的基因是很重要的，因为一些基因的失活是带有致死性的。此外还要选择合适大小的同源臂，因为这种基因改造方法依赖的是宿主自身表达的重组酶来实现质粒的整个，所以效率较red重组低很多，为了增加重组效率，则需要更长的同源臂，但是同源臂太长会增加构建质粒是的困难，同时太大的质粒还会给宿主带来负担，所以合适的同源臂长度也显得非常重要。对于(3)则在需要质粒构建过程中加入宿主敏感的抗生素基因或者营养缺陷型基因或者一些特定的酶切位点等等，比如I-SceI大范围核酸内切酶可以识别一段18bp序列，并在此处将DNA切开。理论上，700亿bp的随机序列才可能出现一个18bp序列，所以特异性非常高。

质粒转化也是一个很基因改造很基础但很关键的技术。目前，人们对硫碱弧菌的研究只停留的在工艺水平上，还没有任何关于转化的方面的研究。

CN 102604929 A公开了一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入染色体的方法，是将含有大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点的同源重组质粒采用接合转移的方式转入喜温硫杆菌中，同时利用细胞自身的同源重组系统，将同源重组质粒定向插入到喜温硫杆菌染色体中，筛选到的单交换子用电转化法转入I-SceI表达质粒，在I-SceI酶切断染色体的压力下，单交换子染色体发生第二次同源重组，优化筛选到双交换菌株，实现了基因的敲除或插入。但该方法直接用于硫碱弧菌中，并不能对硫碱弧菌进行改造。

这就需要找到一种可以在硫碱弧菌中进行质粒构建和转化的方法。

发明内容

本发明为了克服上述缺陷，本发明提供了一种重组质粒其制备方法和应用，通过构建自杀质粒实现对多能硫碱弧菌目的基因的敲除，此法的建立不但能加深对硫碱弧菌的弧菌的认识，还对其他极端微生物的认识找到一条合适的途径，进而能更好的开发这类微生物，更好的为人类服务，所以此法的建立有着很重要的意义。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒的核酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。

所述重组质粒pRE112-SceI(SEQ ID NO.1)所示的核酸序列如下：TGATAGGGCCCGATCCCAAGCTTCTTCTAGAGGTACCGCATGCGATATCGAGCTCTCCCGGGAATTCATGCAGTTCACACACACCGCTTCTCAACCCGGTACGCACCAGAAAATCATTGATATGGCCATGAATGGCGTTGGATGCCGGGCAACAGCCCGCATTATGGGCGTTGGCCTCAACACGATTTTACGTCACTTAAAAAACTCAGGCCGCAGTCGGTAATAGGGATAACAGGGTAATGGTGTACTGCCTTCCAGAAACGAAGAGCGATTGAGGAAAATAGGGATAACAGGGTAATGGCGCGCGGCCGGCATGAGCCTGCGCCTACCTGCTGGCCGTCGGTAGGGATAACAGGGTAATCCAGCTACAAAATCACGGGGTCGGCTACCTGCTGGCCGTCGGCGTCGTGACTATGAGCACGTCCGCGAGTAGGGATAACAGGGTAATCTGGCCCGCATCATGGCGACTGGTCGAGTTCATGTGCAGCTCCATCAGCAAAAGGGGATGATAAGTTTATCACCACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCGTGCTATGATCGACTGATGTCATCAGCGGTGGAGTGCAATGTCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAAGATGCCGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGCTCATGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCGCGAACGCGTAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACGAACGGCAGGTATATGTGATGGGTTAAAAAGGATCAGAATTCCCATGTCAGCCGTTAAGTGTTCCTGTGTCACTCAAAATTGCTTTGAGAGGCTCTAAGGGCTTCTCAGTGCGTTACATCCCTGGCTTGTTGTCCACAACCGTTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCCTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAACTGCTGATCTTCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGATCGATCCAGCCGACCAGGCTTTCCACGCCCGCGTGCCGCTCCATGTCGTTCGCGCGGTTCTCGGAAACGCGCTGCCGCGTTTCGTGATTGTCACGCTCAAGCCCGTAGTCCCGTTCGAGCGTCGCGCAGAGGTCAGCGAGGGCGCGGTAGGCCCGATACGGCTCATGGATGGTGTTTCGGGTCGGGTGAATCTTGTTGATGGCGATATGGATGTGCAGGTTGTCGGTGTCGTGATGCACGGCACTGACGCGCTGATGCTCGGCGAAGCCAAGCCCAGCGCAGATGCGGTCCTCAATCGCGCGCAACGTCTCCGCGTCGGGCTTCTCTCCCGCGCGGAAGCTAACCAGCAGGTGATAGGTCTTGTCGGCCTCGGAACGGGTGTTGCCGTGCTGGGTCGCCATCACCTCGGCCATGACAGCGGGCAGGGTGTTTGCCTCGCAGTTCGTGACGCGCACGTGACCCAGGCGCTCGGTCTTGCCTTGCTCGTCGGTGATGTACTTCACCAGCTCCGCGAAGTCGCTCTTCTTGATGGAGCGCATGGGGACGTGCTTGGCAATCACGCGCACCCCCCGGCCGTTTTAGCGGCTAAAAAAGTCATGGCTCTGCCCTCGGGCGGACCACGCCCATCATGACCTTGCCAAGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGATCTTCGCCAGCAGGGCGAGGATCGTGGCATCACCGAACCGCGCCGTGCGCGGGTCGTCGGTGAAGCCAGAGTTTCAGCAGGCCGCCCAGGCGGCCCAGGTCGCCATTGATGCGGGCCAGCTCGCGGACGTGCTCATAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTAGCCCTGGCCGACGGCCAGCAGGTAGGCCGACAGGCTCATGCCGGCCGCCGCCGCCTTTTCCTCAATCGCTCTTCGTTCGTCTGGAAGGCAGTACACCTTGATAGGTGGGCTGCCCTTCCTGGTTGGCTTGGTTTCATCAGCCATCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCCGGCGGTAGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATAAGGGACAGTGAAGAAGGAACACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCCTGCCCGGCTGACGCCGTTGGATACACCAAGGAAAGTCTACACGAACCCTTTGGCAAAATCCTGTATATCGTGCGAAAAAGGATGGATATACCGAAAAAATCGCTATAATGACCCCGAAGCAGGGTTATGCAGCGGAAAAGCGCTGCTTCCCTGCTGTTTTGTGGAATATCTACCGACTGGAAACAGGCAAATGCAGGAAATTACTGAACTGAGGGGACAGGCGAGAGACGATGCCAAAGAGCTACACCGACGAGCTGGCCGAGTGGGTTGAATCCCGCGCGGCCAAGAAGCGCCGGCGTGATGAGGCTGCGGTTGCGTTCCTGGCGGTGAGGGCGGATGTCGAGGCGGCGTTAGCGTCCGGCTATGCGCTCGTCACCATTTGGGAGCACATGCGGGAAACGGGGAAGGTCAAGTTCTCCTACGAGACGTTCCGCTCGCACGCCAGGCGGCACATCAAGGCCAAGCCCGCCGATGTGCCCGCACCGCAGGCCAAGGCTGCGGAACCCGCGCCGGCACCCAAGACGCCGGAGCCACGGCGGCCGAAGCAGGGGGGCAAGGCTGAAAAGCCGGCCCCCGCTGCGGCCCCGACCGGCTTCACCTTCAACCCAACACCGGACAAAAAGGATCGGGCCCTAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATACATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTTGCTACGCCTGAAT.

所述重组质粒pBBR-IsceI(SEQ ID NO.2)所示的核酸序列如下：CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATACTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGATTGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGCGGCGAGTGCGGGGGTTCCAAGGGGGCAGCGCCACCTTGGGCAAGGCCGAAGGCCGCGCAGTCGATCAACAAGCCCCGGAGGGGCCACTTTTTGCCGGAGGGGGAGCCGCGCCGAAGGCGTGGGGGAACCCCGCAGGGGTGCCCTTCTTTGGGCACCAAAGAACTAGATATAGGGCGAAATGCGAAAGACTTAAAAATCAACAACTTAAAAAAGGGGGGTACGCAACAGCTCATTGCGGCACCCCCCGCAATAGCTCATTGCGTAGGTTAAAGAAAATCTGTAATTGACTGCCACTTTTACGCAACGCATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAGTTGCAGCTGATTGCGCATGGTGCCGCAACCGTGCGGCACCCTACCGCATGGAGATAAGCATGGCCACGCAGTCCAGAGAAATCGGCATTCAAGCCAAGAACAAGCCCGGTCACTGGGTGCAAACGGAACGCAAAGCGCATGAGGCGTGGGCCGGGCTTATTGCGAGGAAACCCACGGCGGCAATGCTGCTGCATCACCTCGTGGCGCAGATGGGCCACCAGAACGCCGTGGTGGTCAGCCAGAAGACACTTTCCAAGCTCATCGGACGTTCTTTGCGGACGGTCCAATACGCAGTCAAGGACTTGGTGGCCGAGCGCTGGATCTCCGTCGTGAAGCTCAACGGCCCCGGCACCGTGTCGGCCTACGTGGTCAATGACCGCGTGGCGTGGGGCCAGCCCCGCGACCAGTTGCGCCTGTCGGTGTTCAGTGCCGCCGTGGTGGTTGATCACGACGACCAGGACGAATCGCTGTTGGGGCATGGCGACCTGCGCCGCATCCCGACCCTGTATCCGGGCGAGCAGCAACTACCGACCGGCCCCGGCGAGGAGCCGCCCAGCCAGCCCGGCATTCCGGGCATGGAACCAGACCTGCCAGCCTTGACCGAAACGGAGGAATGGGAACGGCGCGGGCAGCAGCGCCTGCCGATGCCCGATGAGCCGTGTTTTCTGGACGATGGCGAGCCGTTGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCTGCCGCGCCGGTAGCACTTGGGTTGCGCAGCAACCCGTAAGTGCGCTGTTCCAGACTATCGGCTGTAGCCGCCTCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCGGATGAGGAGGCAGATTGCCTTGAATATATTGACAATACTGATAAGATAATATATCTTTTATATAGAAGATCGACCGTGCTATAATTATACTAATTTTATAAGGAGGAAAAAATATGGGCATTTTTAGTATTTTTGTAATCAGCACAGTTCATTATCAACCAAACAAAAAATAAGTGGTTATAATGAATCGTTAATAAGCAAAATTCATATAACCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACGAGAAAAATATAAAACACAGTCAAAACTTTATTACTTCAAAACATAATATAGATAAAATAATGACAAATATAAGATTAAATGAACATGATAATATCTTTGAAATCGGCTCAGGAAAAGGCCATTTTACCCTTGAATTAGTAAAGAGGTGTAATTTCGTAACTGCCATTGAAATAGACCATAAATTATGCAAAACTACAGAAAATAAACTTGTTGATCACGATAATTTCCAAGTTTTAAACAAGGATATATTGCAGTTTAAATTTCCTAAAAACCAATCCTATAAAATATATGGTAATATACCTTATAACATAAGTACGGATATAATACGCAAAATTGTTTTTGATAGTATAGCTAATGAGATTTATTTAATCGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTGGCATTACTTTTAATGGCAGAAGTTGATATTTCTATATTAAGTATGGTTCCAAGAGAATATTTTCATCCTAAACCTAAAGTGAATAGCTCACTTATCAGATTAAGTAGAAAAAAATCAAGAATATCACACAAAGATAAACAAAAGTATAATTATTTCGTTATGAAATGGGTTAACAAAGAATACAAGAAAATATTTACAAAAAATCAATTTAACAATTCCTTAAAACATGCAGGAATTGACGATTTAAACAATATTAGCTTTGAACAATTCTTATCTCTTTTCAATAGCTATAAATTATTTAATAAGTAAGTTAAGGGATGCATAAACTGCATCCCTTAACTTGTTTTTCGTGTGCCTCTAGAAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTGCTTAATTTGATGCCTGGCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAACGTTCAAATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGAGACCCCACACTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCAGGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAAATTCTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCGTTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAGATAGTGTTCGGCAGTTTGTACATCATCTGCGGGATCAGGTACGGTTTGATCAGGTTGTAGAAGATCAGGTAAGACATAGAATCGATGTAGATGATCGGTTTGTTTTTGTTGATTTTTACGTAACAGTTCAGTTGGAATTTGTTACGCAGACCCTTAACCAGGTATTCTACTTCTTCGAAAGTGAAAGACTGGGTGTTCAGTACGATCGATTTGTTGGTAGAGTTTTTGTTGTAATCCCATTTACCACCATCATCCATGAACCAGTATGCCAGAGACATCGGGGTCAGGTAGTTTTCAACCAGGTTGTTCGGGATGGTTTTTTTGTTGTTAACGATGAACAGGTTAGCCAGTTTGTTGAAAGCTTGGTGTTTGAAAGTCTGGGCGCCCCAGGTGATTACCAGGTTACCCAGGTGGTTAACACGTTCTTTTTTGTGCGGCGGGGACAGTACCCACTGATCGTACAGCAGACATACGTGGTCCATGTATGCTTTGTTTTTCCACTCGAACTGCATACAGTAGGTTTTACCTTCATCACGAGAACGGATGTAAGCATCACCCAGGATCAGACCGATACCTGCTTCGAACTGTTCGATGTTCAGTTCGATCAGCTGGGATTTGTATTCTTTCAGCAGTTTAGAGTTCGGACCCAGGTTCATTACCTGGTTTTTTTTGATGTTTTTCATATGCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTAAGTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGATCTCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCATGCATAAAAACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGCCCGCGTTCCTGCTGGCGCTGGGCCTGTTTCTGGCGCTGGACTTCCCGCTGTTCCGTCAGCAGCTTTTCGCCCACGGCCTTGATGATCGCGGCGGCCTTGGCCTGCATATCCCGATTCAACGGCCCCAGGGCGTCCAGAACGGGCTTCAGGCGCTCCCGAAGGT.

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计引物，通过反向PCR扩增去掉pRE112质粒的SacB序列；

(2)将壮观霉素和I-SceI识别位点通过Gibson连接到步骤(1)的质粒上，得到pRE112-SceI；

(3)根据改造的硫碱弧菌基因组上的基因设计带有同源臂的引物，扩增同源臂，将同源臂通过Gibson连接插入如第一方面所述的重组质粒pRE112-SceI中，得到pRE-G重组质粒，其中，G表示待操作基因。

本发明所选用的自杀质粒为pRE112带有R6K复制子，粒复制需要宿主表达一种π蛋白，所以宿主选择已经整合了可以表达π蛋白基因的E.coli SM10，质粒带有氯霉素抗性，可用于质粒构建过程的中筛选标记，质粒上的SacB基因是无用序列，在进一步的构建中将被除去，使得质粒更小，更容易进入细胞，质粒带有接合转移的oriT位点。

本发明中，所述引物本领域技术人员可以根据需要自行设计，在此不做特殊限定。

优选地，所述I-SceI识别位点数量为1个以上，优选为1-5个。

优选地，步骤(1)所述同源臂插入重组质粒pRE112-SceI的XbaI和KpnI之间。

根据本发明，为了提高同源重组的效率，所述同源臂的大小500-3000bp，例如可以是500bp、800bp、1000bp、1200bp、1500bp、1800bp、2000bp、2200bp、2300bp、2500bp、2600bp、2800bp或3000bp，优选为1500-2500bp，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组质粒用于硫碱弧菌的基因改造。

优选地，所述基因改造的方法包括如下步骤：

(1)将pRE-G质粒通过接合转移的方法导入目的菌株硫碱弧菌中，筛选验证阳性单交换子；

(2)将质粒pBBR-IsceI导入步骤(1)中验证成功的阳性单交换子中，再筛选出成功突变的菌株，即为改造后的硫碱弧菌。

在本发明中，接合转移是通过供体菌与受体菌相接触的方法实现目的质粒的转移，其原理是携带转移质粒的受体菌在质粒转移接合系统的作用下，通过生长的出的坚硬性菌毛与受体菌接触，消耗ATP实现性菌毛的收缩，将供体和受体菌拉在较近位置，然后目的质粒从oriT的nic位点被切开解旋，以单链的形式通过性菌毛通道进入受体中，单链受调节蛋白的保护与作用，在受体内重新环化，在这个过程中非常重要的一点是单链的短期存在也会提高质粒的重组效率。供体对于接合转移的另一种形式—辅助转移，需要满足两个条件：必须有辅助质粒参与，例如RP4；构建的目的质粒必须有辅助质粒能够识别的转移接合位点oriT。

本发明中，步骤(2)中在单交换成功的宿主中导入表达IsceI大范围核酸内切酶的质粒pBBR-IsceI，IsceI内切酶在识别位点切开染色体，迫使重组事件再次发生，此时，在两同源臂处将发生二次交换而进一步形成敲出子和野生型两种形式。

优选地，步骤(1)所述的接合转移法包括如下步骤：

(1)将pRE-G质粒转入E.coli SM10中，同时培养E.coli SM10和硫碱弧菌；

(2)将培养至对数中后期的E.coli SM10和硫碱弧菌离心收集细胞，并用洗涤培养基进行洗涤，再用洗涤培养基重悬细胞，并调节OD600至10以上；

(3)将E.coli SM10和硫碱弧菌按照体积比1:(1-5)进行混合，涂布在接合平板上，倒置培养；

(4)用洗涤培养基洗下长出的菌膜，离心收集混合细胞，将混合细胞涂布于硫碱弧菌的壮观霉素抗性平板上，-培养，直到长出白色菌落即初步认定为导入成功的硫碱弧菌。

根据本发明，步骤(1)所述培养E.coli SM10采用LB培养基。

根据本发明，步骤(1)所述培养硫碱弧菌采用TD培养基。

优选地，所述TD培养基包括以下组分：Na₂S₂O₃·5H₂0 10-30g/L，NaHCO₃ 30-70g/L，NaOH 1-10g/L，NH₄Cl 0-1g/L，KNO₃ 0-1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0-10g/L，MgCl₂·6H₂O 0-1g/L，微量元素液2mL/L。

根据本发明，步骤(2)所述洗涤培养基为MTD培养基。

优选地，所述MTD培养基包括以下组分：Na₂S₂O₃·5H₂0 10-30g/L，NaCl 15-50g/L，NH₄Cl 0-1g/L，KNO₃ 0-1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0-10g/L，MgCl₂·6H₂O0-1g/L，微量元素液2mL/L；

根据本发明，步骤(2)所述调节OD600至10以上，例如可以是10、12、15、18、20、23、25、28、30、32、35、38、40、42、45、48、50、55、60、65、70，优选为26-30，进一步优选为30，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

根据本发明，步骤(3)所述E.coli SM10和硫碱弧菌的体积比为1:(1-5)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，优选为1:3，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

根据本发明，步骤(3)所述的结合平板为表面附着0.45μm的MTDS固体培养基。

优选地，所述MTDS固体培养基包括以下组分：Na₂S₂O₃·5H₂0 10-30g/L，NaCl 15-50g/L，NH₄Cl 0-1g/L，KNO₃ 0-1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0-10g/L，MgCl₂·6H₂O 0-1g/L，酵母粉0-20g/L，琼脂粉10-30g/L，微量元素液2mL/L。

优选地，步骤(3)所述培养的温度为25-40℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，优选为27-38℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

优选地，步骤(3)所述培养的时间为1h以上，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、16h、18h、20h、22h、23h、25h、26h、28h、30h、32h、35h、38h、40h、42h、45h、48h、50h，优选为15-30h，进一步优选为24h，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

优选地，步骤(4)所述壮观霉素的浓度为50-500μg/mL，例如可以是50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL、230μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、420μg/mL、450μg/mL、480μg/mL、500μg/mL，优选为80-450μg/mL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

优选地，步骤(4)所述培养的温度为25-40℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，优选为27-38℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

作为最优选技术方案，所述基因改造的方法包括如下步骤：

(1)构建pRE-G重组质粒：设计引物，通过反向PCR扩增去掉pRE112质粒的SacB序列，将壮观霉素和SceI基因通过Gibson连接到步骤质粒上，得到pRE112-SceI，根据改造的硫碱弧菌基因组上的基因设计带有同源臂的引物，扩增同源臂，将同源臂通过Gibson连接插入如第一方面所述的重组质粒pRE112-SceI的XbaI和KpnI之间，得到pRE-G重组质粒；

(2)接合转移：将pRE-G质粒转入E.coli SM10中，同时培养E.coli SM10和硫碱弧菌，将培养至对数中后期的E.coli SM10和硫碱弧菌离心收集细胞，并用洗涤培养基进行洗涤，再用洗涤培养基重悬细胞，并调节OD600至10以上，将E.coli SM10和硫碱弧菌按照体积比1:(1-5)进行混合，涂布在接合平板上，倒置培养1小时以上，用洗涤培养基洗下长出的菌膜，离心收集混合细胞，将混合细胞涂布于硫碱弧菌的链霉素抗性平板上，25-40℃下培养，长出的白色菌落即初步认定为导入成功的硫碱弧菌；

(3)交换子的筛选验证：对生长出的白色菌落进行菌落PCR验证，检验阳性单交换子；

(4)双交换的敲除子的筛选：将质粒pBBR-IsceI导入步骤(3)中验证成功的阳性单交换子中，再筛选出成功突变的菌株，即为改造后的硫碱弧菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次在多能硫碱弧菌中实现了高效无痕敲除或整合基因，通过构建自杀质粒实现对多能硫碱弧菌目的基因的敲除，此法的建立不但能加深对硫碱弧菌的认识，还对其他极端微生物的认识找到一条合适的途径，进而能更好的开发这类微生物，更好的为人类服务，所以此法的建立有着很重要的意义。

附图说明

图1为本发明重组质粒的构建过程；

图2为本发明接合转移的流程图；

图3为本发明基因G的敲除过程；

图4为本发明pRE112质粒图谱；

图5为本发明pBBR-IsceI质粒图谱；

图6为本发明hsdM敲除菌株电泳结果图，其中，hsdM+为未敲除的菌株，hsdM-为hsdM敲除的菌株；

图7为本发明TrkA敲除菌株电泳结果图，其中，TrkA+为未敲除的菌株，TrkA-为hsdM敲除的菌株；

图8为本发明得到hsdM启动子替换菌株电泳结果图，其中，Pm为未为替换的启动子，Ptac为替换后的启动子；

图9为本发明hsdM敲除菌株电泳结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：构建重组质粒

所述的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计引物，通过反向PCR扩增去掉pRE112质粒的SacB序列；

(2)将壮观霉素和SceI基因通过Gibson连接到步骤(1)的质粒上，得到pRE112-SceI；

(3)根据改造的硫碱弧菌基因组上的基因设计带有同源臂的引物，扩增同源臂，将同源臂通过Gibson连接插入所述的重组质粒pRE112-SceI中，得到pRE-G重组质粒。

实施例2：无痕敲除多能硫碱弧菌D301的hsdM

(1)hsdM基因序列如SEQ ID NO.3所示。用引物M1F/R(GATCCCAAGCTTCTTCTAGAGGAGATCGAATGCGAGAATG/CGTTCTCCAGCTCATAACATCCTCAGTCACCAGTGCTGTTTGGA)和M2F/R(TCCAAACAGCACTGGTGACTGAGGATGTTATGAGCTGGAGAACG/TCGATATCGCATGCGGTACCCTACCAGCTTTCTACGTTGAACG)扩增同源臂MH1和MH2；

(2)对质粒pRE-G进行双酶切，酶切位点使用HindIII和XbaI；

(3)通过Gibson连接将MH1与MH2同时插入pRE-G的方式构建pRE-hsdM敲除质粒。利用pRE112F(ATGTCGGCAGAATGCTTAATG)/M1R以及M3F/R(GTAATG CACAATTCACCGATGG/TCCAAATCGCTTCTCAAAATCG)阳性检验；

(4)将pRE-hsdM导入E.coli SM10，然后通过接合转移导入D301中。用壮观霉素抗性进行筛选，用M4F/pRE112R(GAGGTTCGCTATATCGGTGTGAC/ACGTAAAATCGTGTTGAGGCCA)进行阳性检验，筛选单交换子；

(5)通过接合转移将pBBR-IsceI质粒导入到单交换子中，然后用红霉素抗性筛选。最后用引物M3F/R与M4F/R(AGCTCGCCTTCCTTGTAGATGTTAC)进行鉴定，筛选双交换子，并进行测序，最终得到hsdM敲除菌株。

得到的hsdM敲除菌株结果如图6所示，其中，前两个泳道为敲除前的hsdM基因，其具有1476bp，后两个泳道为hsdM敲除菌株，其基因大小为474bp，可见得到了成功的hsdM敲除菌株。

作为本领域技术人员应该知晓，由于电泳图是引物扩增得到的，引物设计在所插入位置上下两侧的，因此电泳上其基因大小会稍微大一些。

SEQ ID NO.3：

ATGTTCGAGCAAACCTTCCGCAACATCGATGACGTGCTCTGGAAAGAGGCCGGCTGCGCGACGGAGCTGGATTACACGGAGCAGACGTCGTGGATGTTGTTCCTCAAGTATCTGGATGATCTGGAGTACGAGCGCGCGCAGGAGGCGGAGCTGGTGGGCAAGTCCTACCGGTACATCATCGATGAGCCGTATCGCTGGTCGGCGTGGGCTGCGCCGAAGACGGCCGATGGCGCGTTCGACCATGACGAGGCGCTGACGGGCGCGGATCTGATCGGCTTCGTCAACGACGATCTGTTTCCGTATCTCCAGGGCTTCCGCACGCGCGCGACGGGGCCGGACACCATCGAATACAAGATCGGGGAGATCTTCAGCGAGATCCGCAACAAGTTCTCCAGTGGCTACAGCCTGCGCGATGCGCTGGAGCTGATCGACAGCCTGAGCTTCCGCTCGCAGAAGGAGAAGCACGAGCTTTCCCATCTGTACGAGGCGAAGATCCGCAACATGGGCAACGCGGGGCGCAACGGCGGGGAGTACTACACGCCGCGCCCGTTGATCCGCGCGATGATCCAGGTGGTGAAGCCGCGCATCGGCGAACGCATCTATGACGCCGCCGCCGGGTCCGCGGGCTTTCTGTGCGAGGCGCATGACTACCTGCGATATGGGCCGGACGGCCAGGGCGACGGCAGCCATCTCTCCACCAGCGACCTGGATACCCTCCAGGCCCGCACCTTCTACGCCAAGGAGAAGAAGAGCCTGCCCTATGTCATCGGGATCATGAACCTGATCCTGCACGGCATCGAGGCGCCCAACGTCGTCCACACCAACAGCCTCACCGAGAACCTGAGCGACATCCAGGAGAAGGACCGCTTCGACGTGATCCTCGCCAACCCGCCCTTTGGCGGCAAGGAGCGCAAGGAGATCCAGCAGAATTTCCCGATCAAGACCGGCGAGACGGCGTTCCTGTTCCTGCAGCATTTCATCAAGTACCTGAAGGCCGGTGGCCGCGCCGCCATCGTCATCAAGAACACCTTCCTGTCCAACGGCGACAACGCCTCGCGCGCGCTGCGCAAGGAGCTGCTGGAGAGCTGCAATCTGCACACCATCCTCGACTGCCCGGGCGGCACCTTCCTCGGCGCCGGCGTGAAAACGGTGGTGCTGTTCTTCGAGAAGGGCGCCCCGACCCGGCAGATCTGGTACTACCAGCTCGACCCCGGCCGCAGCCTGGGCAAGACCAACCCGCTCAATGACAACGACCTGCAGGACTTCGTCGCACGCCAGGCCGGCTTCGAGGATTCCGACAATTCCTGGACCGTGGACGTCAAGGACATCGACCCGGACACCGTCGATCTGTCGGTGAAGAACCCCAACAAGGCCGAGGCCGCCCCCCTGCGCGATCCCGAGGTAATCATCAACGAGATCGAGACGCTGGACCGGGAGAGCGAAGAGATCCTGGAAGGCATTCGGGGGATGTTATGA.

实施例3：无痕敲除多能硫碱弧菌D301的TrKA

(1)TrKA基因序列如SEQ ID NO.4所示。用引物A1F/R(GATCCCAAGCTTCTTCTAGAGGATCTGCAGGTGCACCTC/GCTACAGACACCACGAGCCGACGCGCAAGGCAGACCAG)和A2F/R(CTGGTCTGCCTTGCGCGTCGGCTCGTGGTGTCTGTAGC/TCGATATCGCATGCGGTACCGATGCTGCTTGCTAGCTGCG)扩增同源臂KH1和KH2；

(2)对质粒pRE-G进行双酶切，酶切位点使用HindIII和XbaI；

(3)通过Gibson连接将AH1与AH2同时插入pRE-G的方式构建pRE-TrKA敲除质粒，利用pRE112F/A1R以及A3F/R(GCAGATCTGTGCGACACGCTC/GAGCG TGTCGCACAGATCTGC)阳性检验；

(4)将pRE-hsdM导入E.coli SM10，然后通过接合转移导入D301中。用壮观霉素抗性进行筛选，用A4F/pRE11R进行阳性减员，筛选单交换子；

(5)通过接合转移将pBBR-IsceI质粒导入到单交换子中，然后用红霉素抗性筛选。最后用引物A3F/R与A4F/R(GCAACACCTGGCACGGTCACTC/GCATGGATGCGATGTTCATGG)进行鉴定，筛选双交换子，并进行测序，最终得到TrkA敲除菌株。

得到的TrkA敲除菌株结果如图7所示，其中，前两个泳道为敲除前的TrkA基因，其具有1707bp，后两个泳道为TrkA敲除菌株，其基因大小为365bp，可见得到了成功的TrkA敲除菌株。

作为本领域技术人员应该知晓，由于电泳图是引物扩增得到的，引物设计在所插入位置上下两侧的，因此电泳上其基因大小会稍微大一些。

SEQ ID NO.4：

ATCAACAAGGTGCTGTTCCTGTTCCTGCGGCGCATGCGGGCACCCCTGCTTGCGCTGACGGCGGCCTACGCGATCTCCGTTCTCGGCCTGGTGCTGATACCCGGCGTGGACGATCAGGGGGAGCCCTGGCGCATGGATTTCTTCCATGCCTTCTACTTCGTGACCTACATGGCCACCACCATCGGCTTCGGCGAGATCCCCCACGCCTTCACCGAGGCGCAGAGGATGTGGACGGTGGTTGCCGTTTACCTGTCGGTGGTGGCCTGGCTGTATGCGATCGGCAAGATCCTCGCACTGATCCAGGACCCGGCCTTCCGCCTGGCCGTCAGCCAGCATGCGTTCGACCGCACGATCCGCAAGCTGCAGCGACCGTTCCATATCGTGTGCGGTTATGGCGACACCGGGGCCCTGGTGGTGCGTTCCCTGCTCGGGCGCAATGGCTTTGCCGTGGTGATCGACCAGAACCCGGATCGCATCAACGAGCTGGTTCTGGAGGATTACCCGCTGCAGATCCCCGGTCTGTGCGCGGATGCCAGCATCGCCAATCGCCTGCTTGATGCCGGGCTCCTCAACCCGCACTGCCAGGGTGTGGTGGCGCTGACCAGCGACGATGCGGTGAACCTGCGGATCGCCATTGCCGCCAAACTCCTCAACCCGGAGCGCCCCGTGATCTGCCGTGCCGAGAGCCACGACACAGAGAAGAACATGGCCTCGTTCGGGACTGACCAGGTCATCAACCCGTTCGACATCTTCGGCCAGCGCCTCGCCCTCGCGCTGCATTCCCCCGCGCATCACCTGTTGCACGAGTGGCTTGGGAGCATCCCCGGGAGCCCGCTGCCGATGCCGATCGACCCGCCCTGCGGGCGCTGGATCCTGTGCGGCTTCGGGCGCTTCGGCAAGGCCGTGCATGCCGGGCTGATCCAGGAGGGCGTGGAGGTAACCCTGGTGGAAACGGACCCCGAGGGCGCGGACTGTCCGCCCGACTGCATCAAGGGCCGCGGCACCGAGGCGGACACCCTGCACGAGGCCGGCATCGAGAGCGCCTCCGGGATCGTGGCCGGAACCGGCCGCGACGACTACAACCTGTCCATCGTGATGACCGCGCGCGAGCTGAACCCGGAGCTGTTCATGGTCGGACGCCAGAACCGCGAGTGCGATTCGCTCCTGTTCGCGGCGGCCGACCTGCCGCTGGTGATGCGCCACGACCGGGTGATCGCCGAGGCGATCCTGGCCCATCTGACCTCGCCGCTCCTGCCGCGCTTCCTGGAACTGAGCCGCAACCAGACAACCGACTGGGCGAACGAGCAAGTCAGCTCCATCACGGCCGTGGTCGGCGACCGTGTGCCGGCCATCTGGAACGAGCAACTGGACGAGGGGACAGCCCCGGCCCTCCTTGCCCATCTGGAGCAGGAGCCGGTGACCCTGGGCCAGCTGCTGCGCGCCGACCATCCCGTGCGCCAGCGACACGCCTGCATTGTGCTGCTACTACGGCGCGAAGCCGGAGGCGAGGACATCCTCGCGCCCGATGACAACACGCCCCTGCAACCCGGCGACCACCTGCTGTTCTGCGGCCGCTTCGCGAGCGCCCTCACCATCTCGCACACCCTGCGCGACCCGCACGCCCTGCGTTACCTGCTGACCGGCGAAGATACCCCGGAAGGCTGGATCTGCCGTGCCCTCCGCGCGGCCCGCAGACAACCGGCCTGA.

实施例4：无痕敲除多能硫碱弧菌D301的启动子的替换

(1)hsdM基因上游445bp的序列内包含基因的启动子Pm。启动子序列为SEQ IDNO.5。我们利用该基因操作方法将该启动子替换为277bp的tac启动子。Tac启动子序列为SEQ ID NO.6利用引物P1F/R(GATCCCAAGCTTCTTCTAGAGCCGCATCACAAACCGATTC/TGCACCGTGCAGTCGATCTCTCAGCCGGACAAGCGTCGTT)和P2F/R(ATGTTCGAGCAAACCTTCCGAGAAAGAGGAGAAATACTAG/TCGATATCGCATGCGGTACCTTCTCCAGCTCATAACATCC)扩增同源臂KH1和KH2，P3F/R(TGCACCGTGCAGTCGATCTCTCAGCCGGACAAGCGTCGTT/ATGTTCGAGCAAACCTTCCGAGAAAGAGGAGAAATACTAG)扩增tac启动子。

(2)对质粒pRE-G进行双酶切，酶切位点使用HindIII和XbaI。

(3)通过Gibson连接将PH1、PH2、PH3同时插入pRE-G的方式构建pRE-phsdM敲除质粒。利用pRE112F/P1R以及P4F/R(GCAGATCTGTGCGACACGCTC/GAAACAGATCGTCGTTGACGAAG)阳性检验。

(4)将pRE-phsdM导入E.coli SM10，然后通过接合转移导入D301中。用壮观霉素抗性进行筛选，用P5F/pRE112R进行阳性减员，筛选单交换子。

(5)通过接合转移将pBBR-IsceI质粒导入到单交换子中，然后用红霉素抗性筛选，最后用引物P4F/R与P5F/R(TGCTGGTGGCGCTTCGTTTCC/CTCTTTCCAGAGCACGTCATC)进行鉴定，筛选双交换子，并进行测序，最终得到hsdM启动子替换菌株。

得到的hsdM启动子替换菌株结果如图8所示，其中，前两个泳道为未替换的Pm启动子，其大小为533bp，后两个泳道为替换后的Ptac启动子，其基因大小为365bp，可见得到了成功的hsdM启动子替换菌株。

作为本领域技术人员应该知晓，由于电泳图是引物扩增得到的，引物设计在所插入位置上下两侧的，因此电泳上其基因大小会稍微大一些。

SEQ ID NO.5：

TCCGGTTCTGCAGCGCAAAGCATCTGCAGGAGCTTGCTAGCAGGCGAAGGGGACACTGGAGCTCCCGGCCGCACAGGAGAATGGATGCCGAAACTCTCGACCCGTGCTGGGCGGGACCCCTGACTTCCCTGACCGGTTCGCGCATCCGCTGCGTGTAATGCACAATTCACCGATGGTTACGCGCCCGGTTATGACCCTGCGGGCCGACAGGGCCAGGGTCGGCGTTATCGGCACTTGCACGCCATTCAGCACCAACCGCCGCGAACCATGCACCCCTTCCCAGGCGACACCTGCAGGGGCCATTGGGCCCCGATGAGCGTTTACGACGCCCGCGGGCGTGGGTGCTAAACAGAACCTGCTGACTACCCCTATCGCAGAACCTGTCTTAATTGCGGTTAGCCCCCACCACCCGAGGGTGGTGCATCCAAACAGCACTGGTGACTGA.

SEQ ID NO.6：

GAGATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACACTTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG.

实施例5：无痕敲除多能硫碱弧菌D301的基因组中插入rfp基因

(1)hsdS与hsdR基因之间有一段997bp的序列，在该片段CTG与相邻的hsdS基因的TGA之间插入994bp的带有启动子的rfp基因，基因序列为SEQ ID NO.7：利用引物R1F/R(GATCCCAAGCTTCTTCTAGAACGGTGGTGCTGTTCTTCGA/TGCACCGTGCAGTCGATCTCTCATGCGATTTCCTCCACCT)和R2F/R(GAGCTGTACAAGGCCGGCTAACTGCTGAATCCCAGGCTCCC/TCGATATCGCATGCGGTACCTTCTCCAGCTCATAACATCC)扩增同源臂RH1和RH2，R3F/R(AGGTGGAGGAAATCGCATGAGAGATCGACTGCACGGTGCA/AGCAGGAAAATAAGCCATTGAATGGCGTTGTGCTGGTAGTAGC)扩增rfp序列；

(2)对质粒pRE-G进行双酶切，酶切位点使用HindIII和XbaI；

(3)通过Gibson连接将RH1、RH2、RH3同时插入pRE-G的方式构建pRE-RFP敲除质粒。利用pRE112F/R1R以及R4F/R(CGTTCAACGTAGAAAGCTGGTAG/AGCTCGCCTTCCTTGTAGATGTTAC)阳性检验；

(4)将pRE-phsdM导入E.coli SM10，然后通过接合转移导入D301中，用链霉素抗性进行筛选，用R5F/pRE112R进行阳性检验，筛选单交换子；

(5)通过接合转移将pBBR-IsceI质粒导入到单交换子中，然后用红霉素抗性筛选，最后用引物R4F/R与R5F/R(CATCGTCATCAAGAACACCTTCCTG/ATTGGCCAGGATGTTGCGAT)进行鉴定，筛选双交换子，并进行测序，最终得到rfp插入菌株。

得到的rfp插入菌株结果如图9所示，其中，前两个泳道为未包含rfp的野生型菌种，其大小为308bp，后两个泳道为rfp插入菌株，其基因大小为1302bp，可见得到了成功的rfp插入菌株。

作为本领域技术人员应该知晓，由于电泳图是引物扩增得到的，引物设计在所插入位置上下两侧的，因此电泳上其基因大小会稍微大一些。

SEQ ID NO.7：

GAGATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACACTTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGGTTCAAGGTGCACATGGAGGGCAGCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAGACCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCTCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGAGCCCCCAGTTCATGTACGGCAGCAAGGCCTACGTGAAGCACCCTGCCGACATCCCCGACTACCTGAAGCTGAGCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGAGAGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCTCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGAGGGGCACCAACTTCCCTAGCGACGGCCCAGTGATGCAGAAGAAGACAATGGGCTGGGAGGCCAGCTCCGAGAGAATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGACTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCCGAGGTGAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTGAACATCAAGCTGGACATCACCTCTCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCGCCGAGGGCAGGCACAGCACAGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCCGGCTAA.

实施例6：无痕敲除多能硫碱弧菌D301的基因组中hsdM基因点突变

(1)将hsdM基因的起始密码子ATG替换成GTG，从而实现对基因的点突变，利用引物C1F/R(GATCCCAAGCTTCTTCTAGAGGAGATCGAATGCGAGAACTG/CGGAAGGTTTGCTCGAACACTCAGTCACCAGTGCTGTTTGGA)和C2F/R(TCCAAACAGCACTGGTGACTGAGTGTTCGAGCAAACCTTCCG/TCGATATCGCATGCGGTACCACGTTCTCCAGCTCATAACATCC)扩增同源臂CH1和CH2。(2)对质粒pMK-2进行双酶切，酶切位点使用HindIII和XbaI；

(3)通过Gibson连接将CH1、CH2同时插入pRE-G的方式构建pRE-PM敲除质粒，利用pRE112F/C1R以及C3F/R(GTAATGCACAATTCACCGATGG/GAAACAGA TCGTCGTTGACGAAG)阳性检验；

(4)将pRE-phsdM导入E.coli SM10，然后通过接合转移导入D301中，用链霉素抗性进行筛选，用C4F/pRE112R进行阳性减员，筛选单交换子；

(5)通过接合转移将pBBR-IsceI质粒导入到单交换子中，然后用红霉素抗性筛选，最后用引物C3F/R与C4F/R(GAGGTTCGCTATATCGGTGTGAC/TCCAA ATCGCTTCTCAAAATCG)进行鉴定，筛选双交换子，并进行测序，最终得到hsdM起始密码子突变菌株。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种重组质粒及其制备方法和应用

<130> 2017

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4635

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

tgatagggcc cgatcccaag cttcttctag aggtaccgca tgcgatatcg agctctcccg 60

ggaattcatg cagttcacac acaccgcttc tcaacccggt acgcaccaga aaatcattga 120

tatggccatg aatggcgttg gatgccgggc aacagcccgc attatgggcg ttggcctcaa 180

cacgatttta cgtcacttaa aaaactcagg ccgcagtcgg taatagggat aacagggtaa 240

tggtgtactg ccttccagaa acgaagagcg attgaggaaa atagggataa cagggtaatg 300

gcgcgcggcc ggcatgagcc tgcgcctacc tgctggccgt cggtagggat aacagggtaa 360

tccagctaca aaatcacggg gtcggctacc tgctggccgt cggcgtcgtg actatgagca 420

cgtccgcgag tagggataac agggtaatct ggcccgcatc atggcgactg gtcgagttca 480

tgtgcagctc catcagcaaa aggggatgat aagtttatca ccaccgacta tttgcaacag 540

tgccgttgat cgtgctatga tcgactgatg tcatcagcgg tggagtgcaa tgtcatgagg 600

gaagcggtga tcgccgaagt atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc 660

catctcgaac cgacgttgct ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg 720

aagccacaca gtgatattga tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg 780

cggcgagctt tgatcaacga ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt 840

ctccgcgctg tagaagtcac cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca 900

gctaagcgcg aactgcaatt tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc 960

gagccagcca cgatcgacat tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc 1020

gttgccttgg taggtccagc ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta 1080

tttgaggcgc taaatgaaac cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat 1140

gagcgaaatg tagtgcttac gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc 1200

gcgccgaagg atgtcgctgc cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc 1260

gtcatacttg aagctagaca ggcttatctt ggacaagaag aagatcgctt ggcctcgcgc 1320

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caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt 3900

ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat 3960

atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta 4020

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ttgctacgcc tgaat 4635

<210> 2

<211> 6951

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

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cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680

taattgactg ccacttttac gcaacgcata attgttgtcg cgctgccgaa aagttgcagc 1740

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ttgaatatat tgacaatact gataagataa tatatctttt atatagaaga tcgaccgtgc 3300

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cagcacagtt cattatcaac caaacaaaaa ataagtggtt ataatgaatc gttaataagc 3420

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caaaacttta ttacttcaaa acataatata gataaaataa tgacaaatat aagattaaat 3540

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aagaggtgta atttcgtaac tgccattgaa atagaccata aattatgcaa aactacagaa 3660

aataaacttg ttgatcacga taatttccaa gttttaaaca aggatatatt gcagtttaaa 3720

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ataatacgca aaattgtttt tgatagtata gctaatgaga tttatttaat cgtggaatac 3840

gggtttgcta aaagattatt aaatacaaaa cgctcattgg cattactttt aatggcagaa 3900

gttgatattt ctatattaag tatggttcca agagaatatt ttcatcctaa acctaaagtg 3960

aatagctcac ttatcagatt aagtagaaaa aaatcaagaa tatcacacaa agataaacaa 4020

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tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa ggcccagtct ttcgactgag 4440

cctttcgttt tatttgatgc ctggcagttc cctactctcg catggggaga ccccacacta 4500

ccatcggcgc tacggcgttt cacttctgag ttcggcatgg ggtcaggtgg gaccaccgcg 4560

ctactgccgc caggcaaatt ctgttttatc agaccgcttc tgcgttctag aactagtgga 4620

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ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 5760

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cactccagag cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa 6300

cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acggaattcc ggatgagcat 6360

tcatcaggcg ggcaagaatg tgaataaagg ccggataaaa cttgtgctta tttttcttta 6420

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agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt 6660

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<210> 3

<211> 1496

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<400> 3

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<210> 4

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

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gccgtttacc tgtcggtggt ggcctggctg tatgcgatcg gcaagatcct cgcactgatc 300

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gccccggccc tccttgccca tctggagcag gagccggtga ccctgggcca gctgctgcgc 1440

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<210> 5

<211> 445

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

tccggttctg cagcgcaaag catctgcagg agcttgctag caggcgaagg ggacactgga 60

gctcccggcc gcacaggaga atggatgccg aaactctcga cccgtgctgg gcgggacccc 120

tgacttccct gaccggttcg cgcatccgct gcgtgtaatg cacaattcac cgatggttac 180

gcgcccggtt atgaccctgc gggccgacag ggccagggtc ggcgttatcg gcacttgcac 240

gccattcagc accaaccgcc gcgaaccatg caccccttcc caggcgacac ctgcaggggc 300

cattgggccc cgatgagcgt ttacgacgcc cgcgggcgtg ggtgctaaac agaacctgct 360

gactacccct atcgcagaac ctgtcttaat tgcggttagc ccccaccacc cgagggtggt 420

gcatccaaac agcactggtg actga 445

<210> 6

<211> 277

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

gagatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt 60

atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc 120

tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgagctg 180

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 240

caggaaacac ttactagaga aagaggagaa atactag 277

<210> 7

<211> 994

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

gagatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt 60

atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc 120

tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgagctg 180

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 240

caggaaacac ttactagaga aagaggagaa atactagatg gtgagcaagg gcgaggagga 300

caacatggcc atcatcaagg agttcatgcg gttcaaggtg cacatggagg gcagcgtgaa 360

cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggcaga ccctacgagg gcacccagac 420

cgccaagctg aaggtgacca agggcggccc tctgcccttc gcctgggaca tcctgagccc 480

ccagttcatg tacggcagca aggcctacgt gaagcaccct gccgacatcc ccgactacct 540

gaagctgagc ttccccgagg gcttcaagtg ggagagagtg atgaacttcg aggacggcgg 600

cgtggtgacc gtgacccagg actcctctct gcaggacggc gagttcatct acaaggtgaa 660

gctgaggggc accaacttcc ctagcgacgg cccagtgatg cagaagaaga caatgggctg 720

ggaggccagc tccgagagaa tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca 780

gagactgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgccgag gtgaagacca cctacaaggc 840

caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtgaac atcaagctgg acatcacctc 900

tcacaacgag gactacacca tcgtggagca gtacgagcgc gccgagggca ggcacagcac 960

aggcggcatg gacgagctgt acaaggccgg ctaa 994

Claims (26)

1.一组重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

2.一种如权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计引物，通过反向PCR扩增去掉pRE112质粒的SacB序列；

(2)将壮观霉素和多个18bp的I-SceI识别序列通过Gibson连接到步骤(1)的质粒上，得到pRE112-SceI；

(3)根据改造的硫碱弧菌基因组上的基因设计带有同源臂的引物，扩增同源臂，将同源臂通过Gibson连接插入如权利要求1所述的重组质粒pRE112-SceI中，得到pRE-G重组质粒，其中，G表示待操作基因。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述I-SceI序列的数量为1个以上。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述I-SceI序列的数量为1-58个。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述同源臂插入重组质粒pRE112-SceI的XbaI和KpnI之间。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述同源臂的大小为500-3000bp。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述同源臂的大小为1500-2500bp。

8.一组如权利要求1所述的重组质粒用于硫碱弧菌的基因改造。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因改造的方法包括如下步骤：

(1)将pRE-G质粒通过接合转移的方法导入目的菌株硫碱弧菌中，筛选验证阳性单交换子；

(2)将质粒pBBR-IsceI导入步骤(1)中验证成功的阳性单交换子中，再筛选出成功突变的菌株，即为改造后的硫碱弧菌。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述的接合转移法包括如下步骤：

(1)将pRE-G质粒转入E.coli SM10中，同时培养E.coli SM10和硫碱弧菌；

(2)将培养至对数中后期的E.coli SM10和硫碱弧菌离心收集细胞，并用洗涤培养基进行洗涤，再用洗涤培养基重悬细胞，并调节OD600至10以上；

(3)将E.coli SM10和硫碱弧菌按照体积比1:(1-5)进行混合，涂布在接合平板上，倒置培养；

(4)用洗涤培养基洗下长出的菌膜，离心收集混合细胞，将混合细胞涂布于硫碱弧菌的壮观霉素抗性平板上，倒置培养，直到长出白色菌落即初步认定为导入成功的硫碱弧菌。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述培养E.coli SM10采用LB培养基；

步骤(1)所述培养硫碱弧菌采用TD培养基，所述TD培养基包括以下组分：Na₂S₂O₃·5H₂010-30g/L，NaHCO₃ 30-70g/L，NaOH 1-10g/L，NH₄Cl 0-1g/L，KNO₃ 0-1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0-10g/L，MgCl₂·6H₂O 0-1g/L，微量元素液2mL/L。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述洗涤培养基为MTD培养基，所述MTD培养基包括以下组分：Na₂S₂O₃·5H₂0 10-30g/L，NaCl 15-50g/L，NH₄Cl 0-1g/L，KNO₃ 0-1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0-10g/L，MgCl₂·6H₂O 0-1g/L，微量元素液2mL/L。

13.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述调节OD600至26-30。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述调节OD600为30。

15.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述E.coli SM10和硫碱弧菌的体积比为1:3。

16.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述的接合 平板为表面附着0.45μm的MTDS固体培养基，所述MTDS固体培养基包括以下组分：Na₂S₂O₃·5H₂0 10-30g/L，NaCl 15-50g/L，NH₄Cl 0-1g/L，KNO₃ 0-1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0-10g/L，MgCl₂·6H₂O 0-1g/L，酵母粉0-20g/L％，琼脂粉10-30g/L，微量元素液2mL/L。

17.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述培养的温度为25-40℃。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述培养的温度为27-38℃。

19.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述培养的时间为1h以上。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述培养的时间为15-30h。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述培养的时间为24h。

22.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述壮观霉素的浓度为50-500μg/mL。

23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述壮观霉素的浓度为80-450μg/mL。

24.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述培养的温度为25-40℃。

25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述培养的温度为27-38℃。

26.根据权利要求8-25中任一项所述的应用，其特征在于，所述基因改造的方法包括如下步骤：

(1)构建pRE-G重组质粒：设计引物，通过反向PCR扩增去掉pRE112质粒的SacB序列，将壮观霉素和SceI基因通过Gibson连接到步骤质粒上，得到pRE112-SceI，根据改造的硫碱弧菌基因组上的基因设计带有同源臂的引物，扩增同源臂，将同源臂通过Gibson连接插入如权利要求1或2所述的重组质粒pRE112-SceI的XbaI和KpnI之间，得到pRE-G重组质粒；

(2)接合转移：将pRE-G质粒转入E.coli SM10中，同时培养E.coli SM10和硫碱弧菌，将培养至对数中后期的E.coli SM10和硫碱弧菌离心收集细胞，并用洗涤培养基进行洗涤，再用洗涤培养基重悬细胞，并调节OD600至10以上，将E.coli SM10和硫碱弧菌按照体积比1:(1-5)进行混合，涂布在接合平板上，倒置培养1小时以上，用洗涤培养基洗下长出的菌膜，离心收集混合细胞，将混合细胞涂布于硫碱弧菌的壮观霉素抗性平板上，在25-40℃下倒置培养，长出的白色菌落即初步认定为导入成功的硫碱弧菌；

(3)交换子的筛选验证：对生长出的白色菌落进行菌落PCR验证，检验阳性单交换子；

(4)双交换的敲除子的筛选：将质粒pBBR-IsceI导入步骤(3)中验证成功的阳性单交换子中，再筛选出成功突变的菌株，即为改造后的硫碱弧菌。

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