TWI542686B - The production method of protein - Google Patents

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Description

蛋白質之生產方法
本發明係關於一種目標蛋白質之生產方法及表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞，該目標蛋白質之生產方法係將於包含編碼目標蛋白質之DNA(deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，並將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於該哺乳動物細胞之染色體中而獲得表現該目標蛋白質之哺乳動物細胞，且對該哺乳動物細胞進行懸浮培養，從而生產該目標蛋白質。
利用基因重組技術進行之外源蛋白質之生產被應用於醫藥品及食品業界等各種產業。重組蛋白質之生產多數情況下係藉由下述方式而進行：將包含編碼目標蛋白質之鹼基序列的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、植物細胞及動物細胞等宿主中，選擇染色體中組入有該表現載體之形質轉換體，進而於適當之培養條件下培養該細胞株，使其表現目標蛋白質。
但是，為開發出可效率良好地生產外源蛋白質之宿主，必須針對各目標蛋白質分別選擇生產性良好之宿主細胞，業界期待對各宿主之外源蛋白質生產技術進一步進行技術革新。
於大腸桿菌等細菌及酵母之系統中，多數情況是與動物細胞不同，糖鏈修飾等翻譯後修飾較為困難，於生產具有活性之蛋白質上成為問題。
昆蟲細胞之系統具有所生產之蛋白質可接受磷酸化、糖鏈附加等翻譯後修飾，可保持原本之生理活性而表現之優點。但是，由於分泌蛋白質之糖鏈結構與來自於哺乳類之細胞的糖鏈結構不同，在用於醫藥品用途方面存在抗原性等問題。
另外，由於昆蟲細胞之系統在導入外源基因時使用重組病毒，因此就安全性方面而言，存在必需將該重組病毒鈍化或封鎖之課題。
於動物細胞之系統中，可對來自於以人為代表之高等動物的蛋白質，與原先有機體中生產之蛋白質同樣地實施磷酸化、糖鏈附加及摺疊等翻譯後修飾。為使蛋白質原本所具有之生理活性在重組蛋白質中再現，該正確之翻譯後修飾是必不可少的，因此需要此種生理活性之醫藥品等常使用以哺乳動物細胞作為宿主之蛋白質生產系統。
但是，多數情況是以動物細胞作為宿主的蛋白質表現系統之生產性通常較低，且導入基因之穩定性亦存在問題。提昇以哺乳動物培養細胞作為宿主的蛋白質之生產性不僅對於製造治療用醫藥品或診斷試劑等而言非常重要，而且亦十分有助於其等之開發研究。因此，開發以哺乳動物培養細胞，尤其是中國倉鼠卵巢細胞(CHO(Chinese hamster ovary)細胞)作為宿主，可容易地獲得高效生產株之基因表現系統成為當務之急。
轉位子係可自染色體之一基因座向另一基因座移動的轉位性遺傳要素。轉位子於分子生物學及遺傳學之研究中係一種有力之工具，於昆蟲或線蟲(例如，黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)或秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans))及植物中，利用於變異導入、基因捕獲及基因轉殖(transgenic)個體之製作等。但是，此種技術於含哺乳動物細胞之脊椎動物中則開發較為緩慢。
然而，近年來於脊椎動物中亦報告有具有活性之轉位子，且已確認有幾種轉位子在小鼠或人等哺乳動物細胞中亦具有活性。具有代表性者可列舉：自青鱂魚克隆之轉位子Tol1(專利文獻1)、Tol2(非專利文獻1)，由鮭魚科魚類基因組中存在之非自主性之轉位子重建之Sleeping Beauty(睡美人)(非專利文獻2)，來自於蛙之人工轉位子Frog prince(青蛙王子)(非專利文獻3)以及來自於昆蟲之轉位子piggyBac(非專利文獻4)。
該等DNA轉位子作為用以向哺乳動物細胞之基因組中引入新的表現系統之基因導入工具，而逐漸利用於變異導入、基因捕獲、基因轉殖個體之製作以及表現耐化學藥劑性蛋白質等中(非專利文獻5~12)。
於昆蟲中，業界研究使用來自於鱗翅目昆蟲之轉位子piggyBac，將外源基因導入至蠶染色體中，從而表現該外源基因編碼之蛋白質之方法，並揭示有使用該技術之蛋白質生產方法(專利文獻2)。
但是，上述方法中所表現之目標蛋白質之表現量並不充分，且由於係於蠶全身生產，故而為了自存在大量夾雜蛋白質之體液以高純度之形態回收所表現之外源蛋白質，而需要高度之純化技術，因而在經濟方面存在問題。
另外，使用來自於青鱂魚之Tol2轉位子，於哺乳動物細胞中表現與G418耐性相關之蛋白質之例已眾所周知(非專利文獻12)。
[專利文獻]
[專利文獻1]　國際公開第2008/072540號
[專利文獻2]　日本專利特表2001-532188號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Nature 383,30(1996)
[非專利文獻2] Cell 91,501-510(1997)
[非專利文獻3] Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)
[非專利文獻4] Insect Mol. Biol. 5,141-151(1996)
[非專利文獻5] Genetics. 166,895-899(2004)
[非專利文獻6] PLoS Genet,2,e169(2006)
[非專利文獻7] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,10769-10773(1998)
[非專利文獻8] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6759-6764(2001)
[非專利文獻9] Nature 436,221-226(2005)
[非專利文獻10] Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)
[非專利文獻11] Nucleic Acids Res. 35,e87(2007)
[非專利文獻12] Proc Natl Acad Sci USA,103,15008-15013(2006)
為了生產、分析目標蛋白質，而必須使用來自於哺乳動物之培養細胞，選擇穩定地高效地表現目標蛋白質之細胞株，但生產目標蛋白質之細胞的製作及培養需要大量之勞力及時間。
另外，此前使用轉位子序列於哺乳動物細胞中表現目標蛋白質之技術已眾所周知，但是，關於藉由使用轉位子序列而製作可用作蛋白質之生產系統的高效地表現目標蛋白質之細胞，高效率地生產使用了轉位子序列之目標蛋白質之哺乳動物細胞的製作方法以及使用了該細胞之蛋白質的生產方法則一無所知。
如上所述，先前一直謀求使用哺乳動物培養細胞來高效率且短時間地製作高效地表現目標蛋白質之蛋白質生產系統，從而高效率地生產目標蛋白質。因此，本發明之目的在於提供一種可高效率地製作之高效地表現目標蛋白質之細胞以及使用該細胞生產目標蛋白質之方法。
本發明者等人為解決上述課題而反覆銳意研究，結果發現，藉由將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，並將插入在一對(兩個)轉位子序列間之該基因片段組入於該哺乳動物細胞之染色體中，可高效率地製作高效地表現該目標蛋白質之哺乳動物細胞。進而發現藉由使用該細胞，可高效率地生產目標蛋白質，從而完成本發明。
亦即，本發明為如下所述。
1.　一種目標蛋白質之生產方法，其係將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，並將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於該哺乳動物細胞之染色體中而獲得表現該目標蛋白質之哺乳動物細胞，且對該哺乳動物細胞進行懸浮培養，從而生產該目標蛋白質。
2.　一種目標蛋白質之生產方法，其特徵在於包含以下之步驟(A)~(C)：
(A)　將以下之表現載體(a)及(b)同時導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之步驟：
(a)　於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的表現載體
(b)　包含對具有識別轉位子序列，且使插入在一對轉位子序列間的基因片段轉移至染色體中之活性的轉位酶編碼之DNA的表現載體；
(B)　藉由步驟(A)中所導入之表現載體(b)使轉位酶暫時性地表現，將插入在一對轉位子序列間的上述基因片段組入於上述哺乳動物細胞之染色體中，獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞之步驟；及
(C)　對步驟(B)中所獲得的表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞進行懸浮培養，而生產目標蛋白質之步驟。
3.一種獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞之方法，其係將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，並將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於該哺乳動物細胞之染色體中，從而獲得表現該目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞。
4.如前項1至3中任一項之方法，其中懸浮性之哺乳動物細胞係可於無血清培養下生存及增殖之細胞。
5.如前項1至4中任一項之方法，其中懸浮性之哺乳動物細胞係選自將CHO細胞馴化為懸浮培養所得的懸浮性之CHO細胞、PER.C6細胞、大白鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(或亦稱為YB2/0)及馴化為懸浮培養之懸浮性之小鼠骨髓瘤細胞NS0中的至少一種。
6.如前項5之方法，其中CHO細胞係選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中的至少一種。
7.如前項1至6中任一項之方法，其中選擇標記基因係耐環己醯亞胺性基因。
8.如前項7之方法，其中耐環己醯亞胺性基因係編碼人脂質體蛋白質L36a之變異體之基因。
9.如前項8之方法，其中變異體係人脂質體蛋白質L36a之54位之脯胺酸被置換為其他胺基酸所得的變異體。
10.　如前項9之方法，其中其他胺基酸為麩胺酸。
11.　如前項1至10中任一項之方法，其中一對轉位子序列係於哺乳動物細胞中發揮功能的一對來自於DNA型轉位子之鹼基序列。
12.　如前項11之方法，其中一對來自於DNA型轉位子之鹼基序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
13.　如前項12之方法，其中一對來自於Tol2轉位子之鹼基序列係包含以序列編號2表示之鹼基序列之鹼基序列及以序列編號3表示之鹼基序列。
14.　如前項12之方法，其中一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列係以序列編號14表示之鹼基序列及以序列編號15表示之鹼基序列。
15.　一種懸浮性之哺乳動物細胞，其導入有於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體，將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於染色體中，且生產該目標蛋白質。
16.　一種懸浮性之哺乳動物細胞，其藉由將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的表現載體(a)、及包含對具有識別該轉位子序列且使插入在一對轉位子序列間的基因片段轉移至染色體中之活性的轉位酶(轉移酶)編碼之DNA的表現載體(b)同時導入，而將插入在該一對轉位子序列間的該基因片段組入於染色體中，且生產該目標蛋白質。
17.　如前項15或16之細胞，其係可於無血清培養下生存及增殖之懸浮性之哺乳動物細胞。
18.　如前項15至17中任一項之細胞，其係選自將CHO細胞馴化為懸浮培養所得的懸浮性之CHO細胞、PER.C6細胞、大白鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(或亦稱為YB2/0)及馴化為懸浮培養之懸浮性之小鼠骨髓瘤細胞NS0中的至少一種之懸浮性之哺乳動物細胞。
19.　如前項18之細胞，其中CHO細胞係選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中的至少一種。
20.　如前項15至19中任一項之細胞，其中選擇標記基因係耐環己醯亞胺性基因。
21.　如前項20之細胞，其中耐環己醯亞胺性基因係編碼人脂質體蛋白質L36a之變異體之基因。
22.　如前項21之細胞，其中變異體係人脂質體蛋白質L36a之54位之脯胺酸被置換為其他胺基酸所得的變異體。
23.　如前項22之細胞，其中其他胺基酸為麩胺酸。
24.　如前項15至23中任一項之細胞，其中一對轉位子序列係於哺乳動物細胞中發揮功能的一對來自於DNA型轉位子之鹼基序列。
25.　如前項24之細胞，其中一對來自於DNA型轉位子之鹼基序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
26.　如前項25之細胞，其中一對來自於Tol2轉位子之鹼基序列係以序列編號2表示之鹼基序列及以序列編號3表示之鹼基序列。
27.　如前項25之細胞，其中一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列係以序列編號14表示之鹼基序列及以序列編號15表示之鹼基序列。
28.　一種蛋白質表現載體，其於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有一對轉位子序列。
29.　如前項28之蛋白質表現載體，其中一對轉位子序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
30.　如前項29之蛋白質表現載體，其中一對來自於Tol2轉位子之鹼基序列係以序列編號2表示之序列及以序列編號3表示之鹼基序列。
31.　如前項29之蛋白質表現載體，其中一對來自於Tol1轉位子之序列係以序列編號14表示之鹼基序列及以序列編號15表示之鹼基序列。
根據本發明之蛋白質之生產方法，可使用哺乳動物細胞來效率良好地生產目標蛋白質。另外，本發明之細胞可用作用於高效率地生產基因重組蛋白質之蛋白質生產細胞。
本發明係關於一種目標蛋白質之生產方法，其係將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，並將插入在一對(兩個)轉位子序列間的該基因片段組入於該哺乳動物細胞之染色體中而獲得表現該目標蛋白質之哺乳動物細胞，且對該哺乳動物細胞進行懸浮培養，從而生產該目標蛋白質。
作為本發明之目標蛋白質之生產方法，可列舉包含以下之步驟(A)~(C)的目標蛋白質之生產方法：
(A)　將以下之表現載體(a)及(b)同時導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之步驟：
(a)　於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體
(b)　包含對具有識別轉位子序列且使插入在一對轉位子序列間的基因片段轉移至染色體中之活性的轉位酶編碼之DNA的載體；
(B)　藉由步驟(A)中所導入之表現載體(b)使轉位酶暫時性地表現，將插入在一對轉位子序列間的上述基因片段組入於上述哺乳動物細胞之染色體中，獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞之步驟；及
(C)　對步驟(B)中所獲得的表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞進行懸浮培養，而生產目標蛋白質之步驟。
另外，本發明係關於一種懸浮性之哺乳動物細胞，其導入有於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體，將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於染色體中，且生產該目標蛋白質。
另外，作為本發明之生產目標蛋白質之細胞，可列舉下述懸浮性之哺乳動物細胞：其藉由將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體(a)、及包含對具有識別該轉位子序列且使插入在一對轉位子序列間的基因片段轉移至染色體中之活性的轉位酶(轉移酶)編碼之DNA的載體(b)同時導入，而將插入在該一對轉位子序列間的該基因片段組入於染色體中，且生產該目標蛋白質。
於本說明書中，「轉位子」係轉位性遺傳要素，表示在保持為固定結構之狀態下轉位至染色體上、或自染色體向其他染色體轉位(transposition)之基因單位。
轉位子包含：位於基因單位之兩端的反向或同向之重複之轉位子序列[亦稱為Inverted Repeat Sequence(IR序列，反向重複序列)或Terminal Inverted Repeat Sequence(TIR序列，末端反向重複序列)]，及對識別該轉位子序列，且使存在於該轉位子序列間之基因轉移之轉位酶編碼之鹼基序列。
由轉位子翻譯之轉位酶識別轉位子兩端之轉位子序列，切割插入在一對轉位子序列間的DNA片段，並將其插入至轉移目的地，藉此可將DNA轉移。
於本說明書中，所謂「轉位子序列」，係指可由轉位酶識別之轉位子之鹼基序列，與IR序列或TIR序列同義。包含該鹼基序列之DNA只要可藉由轉位酶之作用而轉移(插入至基因組中之其他位置)，則亦可含有不完全重複之部分，存在對轉位酶具有特異性之轉位子序列。
本發明中所使用之轉位子序列較好的是來自於DNA型轉位子之鹼基序列，更好的是可由轉位酶識別，且可於哺乳動物細胞內轉位的天然或人工之一對來自於DNA型轉位子之鹼基序列。
作為來自於DNA型轉位子之鹼基序列，例如可列舉：來自於青鱂魚之Tol1轉位子及Tol2轉位子，由鮭魚科魚類基因組中存在之非自主性之轉位子重建之Sleeping Beauty，來自於蛙之人工轉位子Frog Prince以及來自於昆蟲之轉位子piggyBac。
該等中，較好的是來自於下述轉位子之鹼基序列：包含以序列表之序列編號6表示之鹼基序列的來自於青鱂魚之Tol2轉位子、及包含以序列表之序列編號13表示之鹼基序列的來自於青鱂魚之Tol1轉位子。
作為一對來自於Tol2轉位子之鹼基序列，可列舉：以序列表之序列編號6表示之Tol2轉位子之鹼基序列的第1位至第2229位鹼基序列、以及第4148位至第4682位鹼基序列。
作為一對來自於Tol2轉位子之鹼基序列，更好的是可列舉：以序列表之序列編號1表示的Tol2轉位子之鹼基序列中的第1位至第200位鹼基序列(序列編號2)(以下，記載為「Tol2-L序列」)，及第2285位至第2788位鹼基序列(序列編號3)(以下，記載為「Tol2-R序列」)。
作為一對來自於Tol1轉位子之轉位子序列，可列舉：以序列表之序列編號13表示之Tol1轉位子之鹼基序列的包含第1位至第157位鹼基序列之鹼基序列、及第1748位至第1855位鹼基序列。
作為一對來自於Tol1轉位子之轉位子序列，更好的是可列舉：以序列表之序列編號13表示之Tol1轉位子之鹼基序列中的第1位至第200位鹼基序列(序列編號14)(以下，記載為「Tol1-L序列」)、及第1351位至第1855位鹼基序列(序列編號15)(以下，記載為「Tol1-R序列」)。
用於本發明之轉位子序列亦包含：藉由使用來自於上述轉位子之轉位子序列之部分序列，調節鹼基序列之長度，以及對鹼基序列進行附加、缺失或置換之改變，而轉移反應受到控制之轉位子序列。
關於轉位子之轉移反應之控制，可藉由促進或抑制轉位酶識別轉位子序列，而促進或抑制轉移反應。
於本說明書中，所謂「轉位酶」，係指識別具有轉位子序列之鹼基序列，使存在於該鹼基序列間之DNA轉位至染色體上、或自染色體向其他染色體轉位之酶。
作為轉位酶，例如可使用來自於下述轉位子之酶：來自於青鱂魚之Tol1及Tol2，由鮭魚科魚類基因組中存在之非自主性之轉位子重建之Sleeping Beauty，來自於蛙之人工轉位子Frog Prince以及來自於昆蟲之轉位子piggyBac。
轉位酶亦可使用天然型之酶，但只要保持與轉位酶相同之轉位活性，則其一部分胺基酸亦可經置換、缺失、插入及/或附加。藉由控制轉位酶之酶活性，而可控制存在於轉位子序列間之DNA之轉移反應。
要分析是否保持與轉位酶相同之轉移活性，可藉由日本專利特開2003-235575號公報中所揭示之雙成分分析系統進行測定。
具體而言，可使用單獨的包含缺失Tol2轉位酶之Tol2轉位子(來自於Tol2之非自主性轉位子)之質體與包含Tol2轉位酶之質體，來分析非自主性Tol2部分是否可藉由轉位酶之作用而轉移、插入至哺乳動物細胞之染色體內。
於本說明書中，所謂「非自主性轉位子」，係指缺失存在於轉位子內之轉位酶而無法自主轉移之轉位子。非自主性轉位子可藉由使轉位酶之蛋白質、編碼轉位酶之蛋白質之mRNA(messenger ribonucleic acid，信使核糖核酸)或編碼轉位酶之蛋白質之DNA同時存在於細胞內，而將插入在非自主性轉位子之轉位子序列間的DNA轉移至宿主細胞之染色體內。
所謂轉位酶基因，係指編碼轉位酶之基因。為提昇其於哺乳動物細胞中之表現效率，可於該基因之翻譯起始密碼子ATG之上游，連結kozak之共有序列(Kozak,M. Nucleic Acids Res.,12,857-872(1984))、或將作為脂質體結合序列之Shine-Dalgarno序列與起始密碼子之間調整為適當距離(例如6~18個鹼基)之序列。
於本發明之方法中，為將表現載體中之包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段組入於宿主細胞之染色體中，而將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的表現載體導入至宿主細胞內，並使轉位酶作用於導入至該細胞內的表現載體所含之轉位子序列。
為使轉位酶作用於導入至宿主細胞內的表現載體所含之轉位子序列，可將轉位酶注入至該細胞內，亦可將包含編碼轉位酶之DNA之表現載體，與包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之表現載體一起導入至宿主細胞中。另外，還可將編碼轉位酶基因之RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)導入至宿主細胞內，使轉位酶於該細胞內表現。
作為表現載體並無特別限定，可根據導入組入有轉位酶基因之表現載體之宿主細胞、用途等而自業者公知之表現載體中適當選擇使用。
本發明之方法中，於生產包含2個以上之多肽之蛋白質的情形時，可將編碼2個以上之多肽之DNA組入於同一或不同之表現載體中，並將該表現載體導入至宿主細胞中，藉此將該DNA組入於該細胞之染色體中。
轉位酶可組入於表現載體中與目標蛋白質一起表現，亦可組入於與表現載體不同之載體中並表現。轉位酶可暫時性地發揮作用，亦可持續性地發揮作用，為製作穩定之產生細胞，較理想的是使轉位酶暫時性地發揮作用。
作為使轉位酶暫時性地發揮作用之方法，例如可列舉：將編碼轉位酶之DNA組入於與包含編碼目標蛋白質之DNA的表現載體不同之表現載體中，並將兩表現質體同時導入至宿主細胞中之方法。
於本說明書中，所謂「表現載體」，係指為表現目標蛋白質，而用於使哺乳動物細胞進行形質轉換之表現載體。本發明中所使用之表現載體具有於表現盒之兩側存在至少1對轉位子序列的結構。
於本說明書中，所謂「表現盒」，係指包含為表現目標蛋白質所必需之基因表現控制區域及編碼目標蛋白質之序列的核酸序列。作為該基因表現控制區域，例如可列舉促進子、啟動子及終止子等。表現盒中亦可含有選擇標記基因。
作為啟動子，只要可於哺乳動物細胞中發揮功能則可使用任一種。例如可列舉：巨細胞病毒(CMV，cytomegalo virus)之IE(immediate early，立即早期)基因之啟動子、SV40(Simian virus 40，猿猴病毒40)之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)之啟動子及促進子等。另外，亦可將人CMV之IE基因之促進子與啟動子一同使用。
所謂「選擇標記基因」，係指可用於區分導入有質體載體之細胞與缺少該載體之細胞的任意之其他標記基因。
作為選擇標記基因，例如可使用：耐化學藥劑性基因(耐新黴素性基因、DHFR(dihydrofolate reductase，二氫葉酸還原酶)基因、耐嘌呤黴素(puromycin)性基因、耐保米黴素(blasticidin)性基因、耐潮黴素(hygromycin)性基因、耐環己醯亞胺性基因(日本專利特開2002-262879號公報))以及螢光及有機體發光標記基因(綠色螢光蛋白質GFP(green fluorescent protein)等)等。
於本發明中，較好的選擇標記為耐化學藥劑性基因，特別好的選擇標記為耐環己醯亞胺性基因。進而，亦可藉由改變選擇標記基因之基因，而改變選擇標記蛋白質之耐化學藥劑性能及發光能力。
環己醯亞胺(以下，有時亦簡記為CHX)係蛋白質合成抑制劑，作為將耐CHX性基因作為選擇標記之利用例，已知酵母(Kondo K. J. Bacteriol.,177,24,7171-7177(1995))、動物細胞(日本專利特開2002-262879號公報)之例。
於動物細胞中，已經明瞭的是表現下述蛋白質之形質轉換體賦予對環己醯亞胺之耐性，即由以序列表之序列編號5表示之鹼基序列編碼的人脂質體蛋白質亞單位之L36a之54位之脯胺酸被置換為麩胺酸所得的由以序列表之序列編號7表示之鹼基序列編碼的蛋白質。
向宿主細胞中導入上述之包含轉位子序列之蛋白質表現載體、表現轉位酶之質體載體及RNA之方法並無特別限定，例如可使用：磷酸鈣法、電穿孔法(electroporation method)、脂質體法、基因槍法(gene gun method)及脂轉染法(lipofection method)等。
作為將轉位酶直接作為蛋白質而導入之方法，例如可列舉顯微注射法(microinjection method)及藉由內吞作用(endocytosis)而向細胞中供給之方法。基因導入例如可利用新基因工程手冊，村松正寶‧山本雅/編，羊土公司，ISBN 9784897063737中記載之方法而實施。
作為宿主細胞，可列舉可進行繼代培養且可穩定地表現目標蛋白質之哺乳動物細胞。宿主細胞例如可列舉：PER.C6細胞、人白血病細胞Namalwa細胞、猴細胞COS細胞、大白鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NS0、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14、敍利亞倉鼠(Syrian hamster)細胞BHK、HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞(Journal of Experimental Medicine,108,945(1958);Proc. Natl. Acad. Sci. USA,601275(1968);Genetics,55,513(1968);Chromosoma,41,129(1973);Methods in Cell Science,18,115(1996);Radiation Research,148,260(1997);Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77,4216(1980);Proc. Natl. Acad. Sci.,60,1275(1968);Cell,6,121(1975);Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp. 883-900))、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat #11619)、Pro-3及CHO細胞之亞株。
另外，上述宿主細胞亦可藉由改變染色體DNA以及導入外源性基因等，而改變成適合於生產蛋白質，而應用於本發明之蛋白質之生產方法。
另外，作為宿主細胞，為控制所生產之目標蛋白質上結合之糖鏈結構，亦可使用：獲得耐凝集素性之Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]以及缺失α1,6-海藻糖轉移酶基因之CHO細胞(國際公開第05/35586號、國際公開第02/31140號)。
目標蛋白質只要可藉由本發明之方法而表現，則可為任意蛋白質。具體而言，例如可列舉：人血清蛋白質、胜肽激素、增殖因子、細胞激素、凝血因子、線溶系蛋白質及抗體以及各種蛋白質之部分片段等。
另外，作為目標蛋白質，例如可較佳地列舉：嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體等單株抗體，Fc融合蛋白質及白蛋白結合蛋白質以及其部分片段等。
藉由本發明之方法所生產的單株抗體之效應器(effector)活性可利用各種方法而加以控制。例如，已知有以下方法：對結合於抗體之Fc區域之第297位之天冬醯胺(Asn)的N結合複合型糖鏈之還原末端上存在的N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)上以α-1,6結合之海藻糖(亦稱為核心海藻糖)的量加以控制之方法(國際公開第05/035586號、國際公開第02/31140號、國際公開第00/61739號)：或藉由改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基而進行控制之方法等。藉由本發明之方法生產之單株抗體可採用任一種方法控制效應器活性。
所謂「效應器活性」，係指經由抗體之Fc區域而引起的抗體依賴性之活性，已知有：抗體依賴性細胞毒性活性(ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)活性)、補體依賴性毒性活性(CDC(complement dependent cytoxicity)活性)、或者巨噬細胞或樹狀細胞等吞噬細胞的抗體依賴性吞噬作用(Antibody-dependent phagocytosis，ADP活性)等。
另外，藉由對利用本發明之方法而生產之單株抗體的Fc區域之N結合複合型糖鏈之核心海藻糖的含量進行控制，可使抗體之效應器活性增加或降低。
作為降低結合於抗體之Fc區域的N結合複合型糖鏈上所結合之海藻糖之含量的方法，可藉由使用缺失α1,6-海藻糖轉移酶基因之CHO細胞表現抗體，而獲得未結合有海藻糖之抗體。未結合有海藻糖之抗體具有高ADCC活性。
另一方面，作為增加結合於抗體之Fc區域的N結合複合型糖鏈上所結合之海藻糖之含量的方法，可藉由使用導入有α1,6-海藻糖轉移酶基因之宿主細胞表現抗體，而獲得結合有海藻糖之抗體。結合有海藻糖之抗體與未結合有海藻糖之抗體相比，具有較低之ADCC活性。
另外，可藉由改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基而增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，藉由使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書中所記載的抗體之Fc區域之胺基酸序列，而增加抗體之CDC活性。
另外，藉由如美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書或美國專利第7,317,091號說明書中所記載般地改變胺基酸，可增加亦可降低抗體之ADCC活性或CDC活性。
本發明中使用之「懸浮性之哺乳動物細胞」，係指不會黏附於微珠或組織培養用培養器(亦稱為組織培養或黏附培養容器等)等培養細胞容易黏附且經塗佈之細胞培養支持體上，可於培養液中懸浮生存及增殖之細胞。
只要細胞不黏附於細胞培養支持體上，則為於培養液中以1個細胞之狀態而生存、增殖，或者以複數個細胞彼此凝集之細胞塊之狀態而生存、增殖的任意狀態均可。
進而，作為本發明中使用之懸浮性之哺乳動物細胞，較好的是可於不含胎牛血清(fetal calf serum，以下記作FCS)等之無血清培養基中，不黏附於細胞培養支持體而於培養液中懸浮生存及增殖之細胞，更好的是可於不含蛋白質之無蛋白質培養基中懸浮生存及增殖之哺乳動物細胞。
作為組織培養用培養器，只要是經實施黏附培養用之塗佈之燒瓶、培養皿等則可使用任意培養器。具體而言，例如可藉由使用市售之組織培養燒瓶(Greiner公司製造)及黏附培養燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製造)等，而確認是否為懸浮性之哺乳動物細胞。
作為本發明中使用之懸浮性之哺乳動物細胞，可為原本具有懸浮性之性質的馴化為懸浮培養之細胞，或使黏附性之哺乳動物細胞馴化為懸浮性之培養條件所得的懸浮性之哺乳動物細胞的任一種。
作為原本具有懸浮性之性質的哺乳動物細胞，例如可列舉：PER. C6細胞、大白鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(或亦稱為YB2/0)以及CHO-S細胞(Invitrogen公司製造)等。
上述「使黏附性之哺乳動物細胞馴化為懸浮性之培養條件所得的懸浮性之哺乳動物細胞」，可藉由Mol. Biotechnol. 2000,15(3),249-57中記載之方法、或以下所示之方法等而製作，且可藉由構建顯示與懸浮培養馴化前同樣、或較懸浮培養馴化前優異之增殖及生存性之細胞而製作(J. Biotechnol. 2007,130(3),282-90)。
所謂「與懸浮培養馴化前同等」，表示馴化為懸浮培養之細胞之生存率及增殖速度(倍增時間)等相比懸浮培養馴化前之細胞而言實質上相同。
於本發明中，作為使黏附性之哺乳動物細胞馴化為懸浮性之培養條件的方法，可列舉以下方法。將含血清之培養基之血清含量減少至1/10，於相對較高之細胞濃度下反覆進行繼代培養，當達到哺乳動物細胞可生存及增殖之狀態時，進一步減少血清含量，反覆進行繼代培養。藉由該方法，可製作可於非血清下生存、增殖之懸浮性之哺乳動物細胞。
另外，藉由於培養液中添加適當之非離子性界面活性劑Pluronic-F68等進行培養之方法，亦可製作懸浮性之哺乳動物細胞。
作為藉由馴化為懸浮性之培養條件而變成懸浮性的黏附性之哺乳動物細胞，例如可列舉小鼠骨髓瘤細胞NS0及CHO細胞等。
於本發明中，作為懸浮性之哺乳動物細胞所具備之性質，將該細胞於2×105細胞/mL之條件下進行懸浮培養時，3~4日後培養結束時之細胞密度較好的是5×105細胞/mL以上，更好的是8×105細胞/mL以上，特別好的是1×106細胞/mL以上，最好的是1.5×106細胞/mL以上。
另外，作為本發明之懸浮性之哺乳動物細胞之倍增時間，較好的是48小時以下，更好的是24小時以下，特別好的是18小時以下，最好的是11小時以下。
懸浮培養基例如可使用：CD-CHO培養基(Invitrogen公司)、EX-CELL 325-PF培養基(SAFC Biosciences公司)及SFM4CHO培養基(HyClone公司)等市售之培養基。另外，亦可藉由調配培養哺乳動物細胞所需之糖類、胺基酸類等來製備獲得懸浮培養基。
懸浮性之哺乳動物細胞之培養可使用能夠進行懸浮培養之培養容器，藉由能夠進行懸浮培養之培養條件而實施。作為培養容器，例如可利用：細胞培養用之96孔板(Corning公司)、T型燒瓶(Becton Dickinson公司)及三角燒瓶(Corning公司)等。
作為培養條件，例如可於5%之CO2環境中、培養溫度37℃下藉由靜置培養等而進行。亦可使用作為懸浮培養專用之培養設備的搖擺式生物反應器(Wave bioreactor)(GE Healthcare Bio-Science公司)等振盪培養裝置等。
關於使用搖擺式生物反應器裝置的懸浮性之哺乳動物細胞之懸浮培養條件，可採用GE Healthcare Bio-Science公司主頁http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf記載之方法而進行。
除振盪培養以外，亦可使用生物反應器等旋轉攪拌裝置進行培養。於生物反應器中之培養可藉由Cytotechnology(2006)52:199-207之方法等而進行。
於本發明中，使用懸浮性之哺乳動物細胞以外之細胞株之情形時，只要是以如上所述之方法而馴化為懸浮培養之哺乳動物細胞株，且為可使用本發明之蛋白質生產方法之細胞株，則可利用任意細胞株。
懸浮性之哺乳動物細胞中生產的目標蛋白質之純化，可藉由自包含目標蛋白質之培養液或細胞破碎液中將目標蛋白質與目標蛋白質以外之雜質加以分離而進行。分離之方法例如可採用離心、透析、硫酸銨沈澱法、管柱層析及過濾等，利用目標蛋白質與雜質之物理化學性質之差異、或與管柱單元之結合力之差異而進行分離。
純化目標蛋白質之方法例如可藉由蛋白質實驗筆記(上)萃取‧分離及重組蛋白質之表現(羊土公司，岡田雅人‧宮崎香/編，ISBN 9784897069180)記載之方法而實施。
本說明書中所引用的科學文獻、專利、專利申請等參考文獻之全部內容係以與分別具體記載者相同之程度作為參考而援用於本說明書中。
以上，為容易理解本發明而揭示較好的實施形態加以說明。以下，基於實施例來更具體地說明本發明，但上述之說明以及以下之實施例僅以例示之目的而提供，並不限定本發明。因此，本發明之範圍並不受本說明書中具體記載之實施形態或實施例之限定，而僅由申請專利範圍限定。
以下所述之克隆等關於基因重組之各種實驗技術，係依據J. Sambrook,E. F. Frisch,T. Maniatis著之分子克隆第2版(Molecular Cloning 2nd edition)以及Frederick M. Ausubel等編，Current Protocols發行之Current Protocols in Molecular Biology等中記載之基因工程方法而進行。
實施例 [實施例1]
抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體之製作
蛋白質表現用質體載體係使用含有包含插入在一對Tol2轉位子序列間的任意之人類抗體基因及耐化學藥劑性標記基因之哺乳動物細胞用基因表現盒的質體。
所使用之基因之DNA係藉由下述方式而獲得：依據已知之鹼基序列人工進行化學合成，或者製作其兩端序列之引子(primer)，以適當之DNA源作為模板而進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)。為進行後續之基因操作，於引子端部附加限制酶切割部位。
轉位子序列係使用日本專利特開2003-235575號公報所揭示的非自主性Tol2轉位子之鹼基序列(序列編號1)中的第1位至第200位鹼基序列(Tol2-L序列)(序列編號2)、及第2285位至第2788位鹼基序列(Tol2-R序列)(序列編號3)之鹼基序列。
藉由以下方法，製作分別包含一對轉位子序列之合成DNA片段(Takara Bio股份有限公司製造)。製作包含於Tol2-R序列之5'末端及3'末端兩端連結有限制酶NruI之識別序列的鹼基序列之DNA片段。另外，製作包含於Tol2-L序列之5'末端連結有限制酶FseI之識別序列，於3'末端連結有限制酶AscI之識別序列的鹼基序列之DNA片段。
繼而，將所製作之包含Tol2-R序列及Tol2-L序列之DNA片段，插入至包含編碼抗人流行性感冒M2抗體Z3G1之胺基酸序列的鹼基序列之表現載體N5LG1_M2_Z3載體(國際公開第06/061723號)中。
抗體基因表現盒係使用於CMV促進子/啟動子之控制下，插入有編碼抗人流行性感冒M2抗體Z3G1(ATCC寄存編號：PTA-5968，寄存日期：2004.3.13，美國弗吉尼亞州馬納薩斯美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA))之H鏈的鹼基序列(序列編號8)及編碼L鏈(序列編號9)的鹼基序列(序列編號10及序列編號11)的N5LG1_M2_Z3載體(國際公開第06/061723號)。
於M5LG1_M2_Z3載體的包含抗體基因表現盒及耐性標記基因表現盒之基因片段之5'末端側存在的限制酶NruI位點上，插入包含Tol2-R序列之DNA片段。另外，於3'末端側存在的限制酶FseI及AscI位點上，插入包含Tol2-L序列之DNA片段。
進而，於CMV促進子/啟動子之控制下，將連接有編碼對環己醯亞胺具有耐性之基因(人脂質體蛋白質L36a之54位之脯胺酸變異成麩胺酸所得之基因)的鹼基序列(序列編號5)之耐環己醯亞胺性基因表現盒，插入至連結有Tol2轉位子序列的N5LG1_M2_Z3載體之FseI識別部位，而構建抗人流行性感冒M2抗體轉位子表現載體(圖1)。
另一方面，將不包含轉位子序列之載體稱為抗人流行性感冒M2抗體表現載體，用作控制載體(圖2)。
[實施例2] 轉位酶表現載體之製作
轉位酶係使用獨立於目標抗體之表現載體的表現載體而表現。亦即，於pCAGGS載體(Gene 108,193-200,1991)的CAGGS啟動子之下游插入編碼來自於青鱂魚之To12轉位酶之基因(序列編號4)，而用作表現載體(圖3)。
[實施例3] 使用哺乳動物細胞之形質轉換體之製作 (1)　懸浮化CHO細胞之製作
對在添加有10%血清(FCS)之α-MEM培養基(Invitrogen公司)中培養所得的黏附性CHO細胞，藉由胰蛋白酶處理而進行剝離並回收，使用新的添加有10%FCS之α-MEM培養基，於5%CO2培養箱內、37℃下振盪培養。於數日後確認該等細胞正在增殖後，以2×105個/mL之濃度而播種至添加有5%FCS之α-MEM培養基中進行振盪培養。
進而於數日後，使用添加有5%FCS之α-MEM培養基進行同樣之播種作業。最後，使用不含血清之α-MEM培養基反覆進行繼代、振盪培養，確認具有與血清存在下之培養同樣之增殖能力，從而製作懸浮培養馴化株。
(2)　生產抗體之CHO細胞之製作
作為表現載體，使用實施例1及實施例2之抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體(以下，簡記為轉位子載體)及Tol2轉位酶表現載體pCAGGS-T2TP(圖3，Kawakami K ＆ Noda T. Genetics. 166,895-899(2004))。另外，作為對照，使用不具有轉位子序列之抗人流行性感冒M2抗體表現載體。
將上述表現載體導入至馴化為懸浮培養之CHO-K1細胞(美國典型培養物保藏中心目錄編號：CCL-61)或HEK293細胞(Invitrogen公司FreeStyle 293F細胞)中，將獲得對環己醯亞胺之耐性克隆之頻率進行比較。
將各細胞(4×106個)懸浮於400 μL之PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝液)中，利用電穿孔法，將抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體(10 μg)及Tol2轉位酶表現載體(25 μg)在保持為環狀DNA之形態下一同導入至各細胞中。再者，對於Tol2轉位酶表現載體，為使其暫時性地表現Tol2轉位酶，而在保持為環狀DNA之形態下導入，以防止將其組入於宿主染色體中。
另外，作為對照，係將抗人流行性感冒M2抗體表現載體(10 μg)，依據利用標準之電穿孔之基因導入法，藉由限制酶而形成為直鏈狀後，再導入至各細胞中。
電穿孔係使用電穿孔儀(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司製造))，於電壓300 V、電容500 μF、室溫之條件下，使用間隙(gap)寬度為4 mm之光析槽(cuvette)(Bio-Rad公司製造)而進行。
利用電穿孔而進行基因導入後，將各細胞播種於3片96孔板中，CHO細胞使用SAFC Biosciences公司之EX-CELL 325-PF培養基，HEK293細胞使用freeStyle-293培養基(Invitrogen公司)，於CO2培養箱內培養3日。
繼而，自基因導入後4日後之培養基更換開始，加入3μg/mL之環己醯亞胺於環己醯亞胺存在下進行培養，且每1週更換1次培養基，培養3週。
培養3週後，對確認到耐環己醯亞胺性群落之孔數進行計數。將其結果示於表1及表2。
如表1所示，當於懸浮性之CHO-K1細胞中，導入抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體或抗人流行性感冒M2抗體表現載體時，導入有抗人流行性感冒M2抗體表現載體之細胞與其他細胞株同樣，未能自其獲得耐環己醯亞胺性之形質轉換體，但自導入有抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體之細胞高頻率地獲得了耐環己醯亞胺性之形質轉換體。
另一方面，如表2所示，於HEK293細胞中導入抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體或抗人流行性感冒M2抗體表現載體之任一種表現載體，均未獲得耐環己醯亞胺性之形質轉換體。
由該等結果可知，於懸浮性之哺乳動物細胞中，可將插入在一對轉位子序列間的編碼目標蛋白質之基因及耐環己醯亞胺性基因效率良好地導入至宿主細胞之染色體內。
(3)　懸浮性CHO細胞及黏附性CHO細胞中之抗體生產之研究
為研究懸浮性CHO細胞或黏附性CHO細胞中之抗體生產效率，而研究各細胞株中之抗體之產生量。作為懸浮性CHO細胞，係使用馴化為懸浮培養之懸浮性CHO-K1細胞。另外，作為黏附性CHO細胞，係使用懸浮培養馴化前之黏附性CHO-K1細胞。
於懸浮性CHO-K1細胞及黏附性CHO-K1細胞中，分別利用電穿孔法導入抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體(10 μg)及Tol2轉位酶表現載體(25 μg)。然後，將懸浮性CHO-K1細胞及黏附性CHO-K1細胞各播種於3片96孔板中。
懸浮性CHO-K1細胞係使用懸浮細胞用培養基(SAFC Biosciences公司之EX-CELL 325-PF)，黏附性CHO-K1細胞係使用添加有10%血清之α-MEM培養基(Invitrogen公司)。將各細胞於CO2培養箱內培養3日，自電穿孔後4日後之培養基更換開始，於3 μg/mL之環己醯亞胺存在下培養3週。此時，每1週更換1次培養基。
將懸浮性CHO-K1細胞之1×106個細胞播種於6孔板中，於CO2培養箱內振盪培養3日，使用培養上清液，藉由HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)測定抗人流行性感冒M2抗體之蛋白質量。
黏附性CHO-K1細胞於6孔板中達到融合後(2×106個)更換培養基，靜置培養3日，然後使用培養上清液，藉由HPLC測定抗體蛋白質量。
培養上清液中之抗體濃度之測定係依據FEMS Yeast Res.,7,(2007),1307-1316中記載之方法而進行。結果示於圖4A及圖4B。
如圖4A所示，使用馴化為懸浮培養之CHO-K1細胞，可大量獲得顯示極高之抗體表現量之細胞。另一方面，如圖4B所示，使用黏附性之CHO-K1細胞，僅可獲得顯示HPLC之檢測極限(5 μg/mL)以下之表現量之細胞。
由該等結果發現，為使用轉位子載體而表現目標蛋白質，而於使用懸浮性之哺乳動物細胞時可高效地表現目標蛋白質。
另外，根據實施例1~3之結果可知，本發明之方法使用馴化為懸浮培養的懸浮性之哺乳動物細胞而高效率地製作高效地表現外源基因之生產細胞，可用作生產目標蛋白質之新穎的方法。
[實施例4]
抗人流行性感冒M2抗體表現Tol1轉位子載體之製作
與實施例1同樣地，蛋白質表現用質體載體係使用含有包含插入在一對Tol1轉位子序列間的任意之人類抗體基因及耐化學藥劑性標記基因之哺乳動物細胞用基因表現盒的質體。
所使用之基因之DNA係依據已知之序列資訊人工進行化學合成，或者製作其兩端序列之引子，以適當之DNA源作為模板進行PCR而獲得。為進行後續之基因操作，於引子端部附加限制酶切割部位。
轉位子序列係使用以序列表之序列編號13表示之非自主性Tol1轉位子之鹼基序列(國際公開第2008/072540號)中的第1位至第200位鹼基序列(Tol1-L序列)(序列編號14)、及第1351位至第1855位鹼基序列(Tol1-R序列)(序列編號15)。
藉由以下方法，製作分別包含一對轉位子序列之合成DNA片段。製作包含於Tol1-R序列之5'末端及3'末端兩端連結有限制酶NruI之識別序列的鹼基序列之DNA片段。另外，製作包含於Tol1-L序列之5'末端連結有限制酶FseI之識別序列，於3'末端連結有限制酶AscI之識別序列的鹼基序列之DNA片段。
繼而，將所製作之包含Tol1-R序列及Tol1-L序列之DNA片段插入至N5LG1_M2_Z3載體中。於N5LG1_M2_Z3載體的包含抗體基因表現盒及耐性標記基因表現盒之基因片段的5'末端側所存在之限制酶NruI位點，插入包含Tol1-R序列之DNA片段，於3'末端側所存在之限制酶FseI及AscI位點，插入包含Tol1-L序列之DNA片段。
進而，於CMV促進子/啟動子之控制下，將連接有對環己醯亞胺具有耐性之基因(人脂質體蛋白質L36a之54位之脯胺酸變異成麩胺酸所得之基因)(序列編號7)的耐環己醯亞胺性基因表現盒，插入至連結有Tol1轉位子序列之N5LG1_M2_Z3載體之FseI識別部位，而構建抗人流行性感冒M2抗體Tol1轉位子表現載體(圖5)。
[實施例5] Tol1轉位酶表現載體之製作
轉位酶係使用獨立於目標抗體之表現載體的表現載體而表現。亦即，於CMV促進子/啟動子之控制下，將連接有包含以序列表之序列編號16表示之鹼基序列的對來自於青鱂魚之Tol1轉位酶編碼之DNA片段的Tol1轉位酶基因表現盒，插入至pBluescriptII SK(+)(Stratagene公司製造)中，用作表現載體pTol1ase(圖6)。
[實施例6] (1)　生產抗體之CHO細胞之製作
作為表現載體，使用實施例4及實施例5之抗人流行性感冒M2抗體表現Tol1轉位子載體(以下，簡記為Tol1轉位子載體)及Tol1轉位酶表現載體pTol1ase。另外，細胞係使用以與實施例3(1)同樣之方式馴化為懸浮培養之CHO-K1細胞。
將上述表現載體導入至馴化為懸浮培養之CHO-K1細胞中，測定對環己醯亞胺之耐性克隆之獲得頻率。將馴化為懸浮培養之CHO-K1細胞(4×106個)懸浮於400 μL之PBS中，藉由電穿孔法，將抗人流行性感冒M2抗體表現Tol1轉位子載體(10 μg)及Tol1轉位酶表現載體(50 μg)在保持為環狀DNA之形態下一同導入至細胞中。對於Tol1轉位酶表現載體，為使其暫時性地表現Tol1轉位酶，而在保持為環狀DNA之形態下導入，以防止將其組入於宿主染色體中。
電穿孔係使用電穿孔儀(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司製造))，於電壓300 V、靜電電容500 μF、室溫之條件下，使用間隙(gap)寬度為4 mm之光析槽(Bio-Rad公司製造)而進行。
利用電穿孔而進行基因導入後，將各細胞播種於2片96孔板中，CHO細胞使用EX-CELL 325-PF培養基(SAFC Biosciences公司)，於CO2培養箱內培養3日。繼而，自基因導入後4日後之培養基更換開始，加入3 μg/mL之環己醯亞胺，於環己醯亞胺存在下進行培養，且每1週更換1次培養基，培養3週。
培養3週後，對確認到耐環己醯亞胺性群落之孔數進行計數。將其結果示於表3。於表3中，實驗1~3分別表示進行3次基因導入後之結果。
如表3所示，當於懸浮性之CHO-K1細胞中導入抗人流行性感冒M2抗體表現Tol1轉位子載體時，與導入抗人流行性感冒M2抗體表現Tol2轉位子載體之實施例3同樣，可高頻率地獲得耐環己醯亞胺性之形質轉換體。
根據該結果可知，於懸浮性之哺乳動物細胞中，即便使用Tol1轉位子，亦可將插入在2個轉位子序列間的抗體基因及耐環己醯亞胺性基因效率良好地導入至宿主細胞之染色體內。
(2)　懸浮性CHO細胞中之抗體生產之研究
使用Tol1轉位子，研究懸浮性CHO細胞中之抗體生產效率。於馴化為懸浮培養之懸浮性CHO-K1細胞中，利用電穿孔法而導入抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體(10 μg)及Tol1轉位酶表現載體(50 μg)。
然後，分別播種於2片96孔板中，使用懸浮細胞用培養基EX-CELL 325-PF，於CO2培養箱內培養3日。自電穿孔後4日後之培養基更換開始，於3 μg/mL之環己醯亞胺存在下培養3週。此時，每1週更換1次培養基。
將懸浮性CHO-K1細胞之1×106個細胞播種於6孔板中，於CO2培養箱內振盪培養3日，使用培養上清液，藉由HPLC測定抗人流行性感冒M2抗體之蛋白質量。
培養上清液中之抗體濃度之測定係依據FEMS Yeast Res.,7,(2007),1307-1316中記載之方法而進行。結果示於圖7。
如圖7所示，使用Tol1轉位子之情形時，亦可大量獲得顯示極高之抗體表現量之細胞。由該結果可知，於使用來自於Tol1轉位子之鹼基序列作為轉位子序列之情形時，亦可與使用來自於Tol2轉位子之鹼基序列之情形同樣地獲得高效地表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞。
以上，藉由特定之態樣而詳細說明本發明，但業者明白在不脫離本發明之意圖及範圍的情況下可進行各種變更及變形。再者，本申請案係基於2009年6月11日申請之日本專利申請案(日本專利特願2009-140626號)及2009年6月11日申請之美國臨時申請案(61/186,138號)，並將其全文藉由引用而援用於此。
產業上之可利用性
利用本發明之蛋白質之生產方法，可使用懸浮性之哺乳動物細胞效率良好地生產目標蛋白質。本發明之細胞可用作用以生產基因重組蛋白質之蛋白質生產細胞。
序列表自由內容
序列編號1-人工序列之說明：非自主性Tol2轉位子之鹼基序列
序列編號2-人工序列之說明：Tol2-L序列
序列編號3-人工序列之說明：Tol2-R序列
序列編號7-人工序列之說明：耐環己醯亞胺性基因之鹼基序列
序列編號8-人工序列之說明：耐環己醯亞胺性基因編碼之蛋白質之胺基酸序列
序列編號9-人工序列之說明：編碼M2Z3抗體H鏈之鹼基序列
序列編號10-人工序列之說明：M2Z3抗體H鏈之胺基酸序列
序列編號11-人工序列之說明：編碼M2Z3抗體L鏈之鹼基序列
序列編號12-人工序列之說明：M2Z3抗體L鏈之胺基酸序列
序列編號13-人工序列之說明：非自主性Tol1轉位子之鹼基序列
序列編號14-人工序列之說明：Tol1-L序列
序列編號15-人工序列之說明：Tol1-R序列
<110>　大學共同利用機關法人資訊、系統研究機構
<120>　蛋白質之生產方法
<130>　W069874
<140>　099119233
<141>　2010/06/11
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<151>　2009-06-11;2009-06-11
<160>　17
<170>　PatentIn第3.3版
<210>　1
<211>　2788
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：非自主性To12轉位子
<400>　1
<210>　2
<211>　200
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：Tol2-L轉位子序列
<400>　2
<210>　3
<211>　504
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：Tol2-R轉位子序列
<400>　3
<210>　4
<211>　2156
<212>　DNA
<213>　青鱂魚
<220>
<221>　CDS
<222>　(85)..(2034)
<400>　4
<210>　5
<211>　649
<212>　PRT
<213>　青鱂魚
<400>　5
<210>　6
<211>　4682
<212>　DNA
<213>　青鱂魚
<400>　6
<210>　7
<211>　321
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：耐環己醯亞胺性基因
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(321)
<400>　7
<210>　8
<211>　106
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<223>　合成構建
<400>　8
<210>　9
<211>　1404
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　M2Z3重鏈
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1404)
<400>　9
<210>　10
<211>　467
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<223>　合成構建
<400>　10
<210>　11
<211>　708
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　M2Z3輕鏈
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(708)
<400>　11
<210>　12
<211>　235
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<223>　合成構建
<400>　12
<210>　13
<211>　1855
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　非自主性Tol1轉位子
<400>　13
<210>　14
<211>　200
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　Tol1-L轉位子序列
<400>　14
<210>　15
<211>　505
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　Tol1-R轉位子序列
<400>　15
<210>　16
<211>　2745
<212>　DNA
<213>　青鱂魚
<220>
<221>　CDS
<222>　(30)..(2585)
<400>　16
<210>　17
<211>　851
<212>　PRT
<213>　青鱂魚
<400>　17
CAGGS．．．CAGGS啟動子
CHX-r．．．耐環己醯亞胺性基因
CMV．．．CMV啟動子
Hc．．．人類抗體H鏈cDNA
Lc．．．人類抗體L鏈cDNA
poly A．．．多聚腺苷酸化位點
Tol1-L．．．左末端Tol1轉位子
Tol1-R．．．右末端Tol1轉位子
Tol2-L．．．左末端Tol2轉位子
Tol2-R．．．右末端Tol2轉位子
圖1表示抗人流行性感冒M2抗體表現轉位子載體之示意圖。Tol2-L表示左末端(left end)Tol2轉位子(序列編號2)，Tol2-R表示右末端(right end)Tol2轉位子(序列編號3)，CMV表示CMV啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點(polyadenylation site)，Hc表示人類抗體H鏈cDNA(complementary DNA，互補DNA)，Lc表示人類抗體L鏈cDNA，CHX-r表示耐環己醯亞胺性基因；
圖2表示抗人流行性感冒M2抗體表現載體之示意圖。CMV表示CMV啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點，Hc表示人類抗體H鏈cDNA，Lc表示人類抗體L鏈cDNA，CHX-r表示耐環己醯亞胺性基因；
圖3表示Tol2轉位酶表現載體之示意圖。CAGGS表示CAGGS啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點，TPase cDNA表示Tol2轉位酶cDNA；
圖4A表示使用抗人流行性感冒M2抗體表現Tol2轉位子載體時，懸浮性之CHO-K1細胞中抗人流行性感冒M2抗體之表現量的研究結果。縱軸表示抗體產生量(μg/mL)，橫軸表示懸浮性之CHO-K1細胞之基因導入克隆編號；
圖4B表示使用抗人流行性感冒M2抗體表現Tol2轉位子載體時，黏附性之CHO-K1細胞中抗人流行性感冒M2抗體之表現量的研究結果。縱軸表示抗體產生量(μg/mL)，橫軸表示黏附性之CHO-K1細胞之基因導入克隆編號；
圖5表示抗人流行性感冒M2抗體表現Tol1轉位子載體之示意圖。Tol1-L表示左末端Tol1轉位子(序列編號14)，Tol1-R表示右末端Tol1轉位子(序列編號15)，CMV表示CMV啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點，Hc表示人類抗體H鏈cDNA，Lc表示人類抗體L鏈cDNA，CHX-r表示耐環己醯亞胺性基因；
圖6表示Tol1轉位酶表現載體之示意圖。CAGGS表示CAGGS啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點，TPase cDNA表示Tol1轉位酶cDNA；及
圖7表示使用抗人流行性感冒M2抗體表現Tol1轉位子載體時，懸浮性之CHO-K1細胞中抗人流行性感冒M2抗體之表現量的研究結果。縱軸表示抗體產生量(μg/mL)，橫軸表示懸浮性之CHO細胞之基因導入克隆編號。
CHX-r．．．耐環己醯亞胺性基因
CMV．．．CMV啟動子
Hc．．．人類抗體H鏈cDNA
Lc．．．人類抗體L鏈cDNA
poly A．．．多聚腺苷酸化位點
Tol2-L．．．左末端Tol2轉位子
Tol2-R．．．右末端Tol2轉位子

Claims (19)

  1. 一種目標蛋白質之生產方法，其係將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體導入至可於無血清培養下生存及增殖之懸浮性之哺乳動物細胞中，並將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於該哺乳動物細胞之染色體中而獲得表現該目標蛋白質之哺乳動物細胞，且對該哺乳動物細胞進行懸浮培養，從而生產該目標蛋白質；其中懸浮性之哺乳動物細胞係將CHO細胞馴化為懸浮培養所得的懸浮性之CHO細胞；且其中該等轉位子序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
  2. 一種目標蛋白質之生產方法，其特徵在於包含以下之步驟(A)~(C)：(A)以下之表現載體(a)及(b)同時導入至可於無血清培養下生存及增殖之懸浮性之哺乳動物細胞中之步驟：(a)包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的表現載體；(b)含對具有識別轉位子序列且使插入在一對轉位子序列間的基因片段轉移至染色體中之活性的轉位酶編碼之DNA的表現載體；(B)由步驟(A)中所導入之表現載體(b)使轉位酶暫時性地表現，將插入在一對轉位子序列間的上述基因片段組入於上述哺乳動物細胞之染色體中，獲得表現目標蛋白 質之懸浮性之哺乳動物細胞之步驟；及(C)步驟(B)中所獲得的表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞進行懸浮培養，而生產目標蛋白質之步驟；其中懸浮性之哺乳動物細胞係將CHO細胞馴化為懸浮培養所得的懸浮性之CHO細胞；且其中該等轉位子序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
  3. 一種獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞之方法，其係將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體導入至可於無血清培養下生存及增殖之懸浮性之哺乳動物細胞中，並將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於該哺乳動物細胞之染色體中，從而獲得表現該目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞；其中懸浮性之哺乳動物細胞係將CHO細胞馴化為懸浮培養所得的懸浮性之CHO細胞；且其中該等轉位子序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中CHO細胞係選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中的至少一種。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中選擇標記基因係耐環己醯亞胺性基因。
  6. 如請求項5之方法，其中耐環己醯亞胺性基因係編碼人 脂質體蛋白質L36a之變異體之基因。
  7. 如請求項6之方法，其中變異體係人脂質體蛋白質L36a之54位之脯胺酸被置換為其他胺基酸所得的變異體。
  8. 如請求項7之方法，其中其他胺基酸為麩胺酸。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中一對來自於Tol2轉位子之鹼基序列係包含以序列編號2表示之鹼基序列之鹼基序列及以序列編號3表示之鹼基序列。
  10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列係以序列編號14表示之鹼基序列及以序列編號15表示之鹼基序列。
  11. 一種懸浮性之哺乳動物細胞，其導入有於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的蛋白質表現載體，將插入在一對轉位子序列間的該基因片段組入於染色體中，且生產該目標蛋白質；其中該細胞係可於無血清培養下生存及增殖之細胞，且係將CHO細胞馴化為懸浮培養所得的懸浮性之CHO細胞；且其中該等轉位子序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
  12. 一種懸浮性之哺乳動物細胞，其藉由將於包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段之兩端含有轉位子序列的表現載體(a)、及包含對具有識別該轉位子序列且使插入在一對轉位子序列間的基因片段轉移至染色 體中之活性的轉位酶(轉移酶)編碼之DNA的表現載體(b)同時導入，而將插入在該一對轉位子序列間的該基因片段組入於染色體中，且生產該目標蛋白質；其中該細胞係可於無血清培養下生存及增殖之細胞，且係將CHO細胞馴化為懸浮培養所得的懸浮性之CHO細胞；且其中該等轉位子序列係一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列或來自於Tol2轉位子之鹼基序列。
  13. 如請求項11或12之細胞，其中CHO細胞係選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中的至少一種。
  14. 如請求項11或12之細胞，其中選擇標記基因係耐環己醯亞胺性基因。
  15. 如請求項14之細胞，其中耐環己醯亞胺性基因係編碼人脂質體蛋白質L36a之變異體之基因。
  16. 如請求項15之細胞，其中變異體係人脂質體蛋白質L36a之54位之脯胺酸被置換為其他胺基酸所得的變異體。
  17. 如請求項16之細胞，其中其他胺基酸為麩胺酸。
  18. 如請求項11或12之細胞，其中一對來自於Tol2轉位子之鹼基序列係以序列編號2表示之鹼基序列及以序列編號3表示之鹼基序列。
  19. 如請求項11或12之細胞，其中一對來自於Tol1轉位子之鹼基序列係以序列編號14表示之鹼基序列及以序列編號15表示之鹼基序列。
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