ES2697535T9 - Procedimiento para la producción de proteína - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la producción de proteína.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión, integrando el fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero con el fin de obtener una célula de mamífero apta para expresar la proteína de interés, y cultivar en suspensión la célula de mamífero, y una célula de mamífero apta para expresar la proteína de interés.
Antecedentes de la técnica
La producción de proteínas exógenas mediante técnicas de ADN recombinante se utiliza en diversas industrias, tales como la industria farmacéutica y la industria alimentaria. En la mayoría de casos, la producción de proteínas recombinantes se lleva a cabo mediante la introducción de un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína de interés en un hospedador, tal como Escherichia coli, una levadura, una célula de insecto, una célula vegetal y una célula animal, seleccionando un transformante en el que se integra el vector de expresión en el cromosoma, y cultivando además la estirpe celular bajo condiciones de cultivo apropiadas.
Sin embargo, con el fin de desarrollar un hospedador que pueda producir una proteína exógena eficientemente, resulta necesario seleccionar una célula hospedadora con buena productividad para cada proteína de interés, por lo que se desea una innovación técnica adicional de las técnicas de producción de proteína exógena para el hospedador individual.
En los sistemas bacterianos, tales como Escherichia coli y los sistemas de levadura, diferentes de las células animales, las modificaciones postraduccionales, tales como las modificaciones de cadena sacárida, resultan difíciles de conseguir en muchos casos y, de esta manera, causan un problema durante la producción de una proteína que presente su actividad.
Debido a que la proteína producida se somete a una modificación postraduccional, tal como la fosforilación y la adición de cadenas sacáridas en el sistema de insecto, este sistema presenta el mérito de que puede expresarse la proteína con su actividad fisiológica original. Sin embargo, debido a que la estructura de la cadena sacárida de la proteína secretada es diferente de la de las células derivadas de mamífero, la antigenicidad y similares se convierten en un problema al aplicar la proteína al uso farmacéutico.
Además, debido a que se utiliza un virus recombinante en el sistema de célula de insecto al introducir un gen exógeno, existe el problema de que se requiere la inactivación y contención del virus desde el punto de vista de la seguridad.
En el sistema de célula animal, pueden llevarse a cabo modificaciones postraduccionales, tales como fosforilación, adición de cadena sacárida y plegamiento, en proteínas derivadas de animales superiores, incluyendo el ser humano, de una manera más similar a las producidas en el cuerpo vivo. Dichas modificaciones postraduccionales precisas resultan necesarias para recrear la actividad fisiológica que posee originalmente una proteína en su proteína recombinante, y habitualmente se aplica un sistema de producción de proteína en el que se utiliza una célula de mamífero como hospedador a productos farmacéuticos y similares que requieren dicha actividad fisiológica.
Sin embargo, un sistema de expresión de proteína en el que se utiliza una célula de mamífero como hospedador presenta generalmente una baja productividad y también causa en muchos casos un problema de estabilidad de los genes introducidos. La mejora de la productividad de una proteína mediante la utilización de una célula de mamífero en cultivo como hospedador no sólo resulta muy importante para producir medicamentos para el tratamiento, agentes diagnósticos y similares, sino que también presenta una gran contribución a la investigación y desarrollo de los mismos. De esta manera, resulta urgente desarrollar un sistema de expresión génica que posibilite la fácil obtención de una estirpe celular de alta productividad utilizando una célula de mamífero en cultivo, en particular una célula de ovario de hámster chino (célula CHO) como hospedador.
Un transposón es un elemento genético transponible que puede transferirse de un locus a otro locus en el cromosoma. Un transposón es una herramienta potente de estudio de la biología y genética molecular y se utiliza con un propósito, tal como la mutagénesis, la captura de genes y la preparación de individuos transgénicos, en insectos o nemátodos (por ejemplo, Drosophila melanogaster o Caenorhabditis elegans) y plantas. Sin embargo, se ha retrasado el desarrollo de dicha técnica para los animales vertebrados, incluyendo las células de mamífero.
Sin embargo, en los últimos años se ha informado de transposones que presentan actividades también en animales vertebrados, y algunos de ellos se ha demostrado que presentan una actividad en células de mamífero, tales como células derivadas de ratón y ser humano. Entre los ejemplos típicos se incluyen los transposones Tol1 (referencia de patente n° 1) y Tol2 (referencia no de patente n° 1 y referencia no de patente n° 13) clonados a partir de pez medaka (ciprinodóntido), 'Sleeping Beauty' reconstruido a partir de un transposón no autónomo existente en el genoma de un pez Onchorhynchus (referencia no de patente n° 2), el transposón artificial 'Frog prince' (referencia no de patente n° 3), que se deriva de la rana y un transposón piggyBac (referencia no de patente n° 4), que se deriva de un insecto.
Estos transposones de ADN se han utilizado para mutagénesis, captura de genes, preparación de individuos transgénicos, expresión de proteínas resistentes a fármaco y similares, como herramienta de transferencia génica para producir un nuevo fenotipo en un genoma de una célula de mamífero (referencias no de patente n° 5 a n° 12).
En el caso de los insectos, se ha estudiado un procedimiento en el que se introduce un gen exógeno en el cromosoma del gusano de la seda utilizando el transposón PiggyBac derivado de un insecto lepidóptero para expresar la proteína codificada por dicho gen exógeno y se ha dado a conocer un procedimiento de producción de proteína que utiliza las técnicas anteriormente indicadas (referencia de patente n° 2).
Sin embargo, debido a que la proteína de interés expresada no presenta un nivel de expresión suficiente y se produce en todo el cuerpo del gusano de seda, causa un problema económico debido a la necesidad de una técnica avanzada de purificación para recuperar la proteína exógena expresada en una forma altamente purificada a partir de líquido corporal que incluye una gran cantidad de proteínas contaminadas.
Además, se conoce un ejemplo en el que se expresa una proteína relacionada con la resistencia a G418 en una célula de mamífero mediante la utilización del transposón derivado de medaka Tol2 (referencia no de patente n° 2)
Se ha identificado una secuencia en cis mínima y una secuencia altamente repetitiva en la región subterminal del transposón Tol2 que resultan esenciales para la transposición (referencia no de patente n° 14).
Una técnica para seleccionar células en las que se ha transferido un gen en un estado estable mediante la utilización de un nuevo gen de resistencia a fármaco como marcador estable y una técnica para obtener células en las que se expresa un gen a nivel elevado se dan a conocer en la referencia de patente n° 3.
Listado de referencias
Literatura de patentes
Referencia de patente n° 1 WO2008/072540
Referencia de patente n° 2 Solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 2001-532188 Referencia de patente n° 3 Solicitud publicada de patente japonesa n° 2002-262879
Literatura no de patentes
Referencia no de patente n° 1 Nature 383, 30 (1996)
Referencia no de patente n° 2 Cell 91, 501-510 (1997)
Referencia no de patente n° 3 Nucleic Acids Res, 31, 6873-6881 (2003)
Referencia no de patente n° 4 Insect Mol.Biol.5, 141-151 (1996)
Referencia no de patente n° 5 Genetics.166, 895-899 (2004)
Referencia no de patente n° 6 PLoS Genet, 2, e169 (2006)
Referencia no de patente n° 7 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10769-10773 (1998)
Referencia no de patente n° 8 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6759-6764 (2001)
Referencia no de patente n° 9 Nature 436, 221- 6 (2005)
Referencia no de patente n° 10 Nucleic Acids Res., 31,6873-6881 (2003)
Referencia no de patente n° 11 Nucleic Acids Res., 35, e87 (2007)
Referencia no de patente n° 12 Proc Natl. Acad. Sci. USA, 103, 15008-15013 (2006)
Referencia no de patente n° 13 Genome Biology, 8 suppl I, S7.1-S7.10 (2007)
Referencia no de patente n° 14 Genetics 174, 639-649 (2006)
Sumario de la invención
Problema técnico
Con el fin de producir y analizar una proteína de interés, resulta necesario seleccionar una estirpe celular que exprese establemente y a nivel elevado una proteína de interés utilizando una célula en cultivo derivada de mamífero, aunque la preparación y el cultivo de la célula que produce la proteína de interés requiere esfuerzo y tiempo considerables.
Además, aunque se conoce la expresión de una proteína de interés en una célula de mamífero mediante la utilización de una secuencia de transposón, no se conoce la preparación de una célula que pueda expresar a nivel elevado una proteína de interés y de esta manera pueda utilizarse como sistema de producción de la proteína mediante la utilización de una secuencia de transposón, un procedimiento de preparación de una célula de mamífero que pueda producir a nivel elevado una proteína de interés mediante la utilización de una secuencia de transposón y un procedimiento de producción de una proteína mediante la utilización de la célula.
Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha necesitado expresar una proteína de interés en una cantidad elevada mediante el establecimiento de un sistema de producción de proteína que pueda producir a nivel elevado una proteína de interés mediante la utilización de una célula de mamífero en cultivo de manera eficiente y en un corto tiempo. De esta manera, los objetivos de la invención son proporcionar una célula capaz de expresar a nivel elevado una proteína de interés que pueda establecerse de manera eficiente y un procedimiento para producir la proteína de interés mediante la utilización de la célula.
Solución a los problemas
Con el fin de resolver los problemas anteriormente mencionados, en el contexto de la presente invención se han llevado a cabo unos estudios exhaustivos y se ha descubierto como resultado que puede prepararse de manera eficiente una célula de mamífero capaz de expresar a nivel elevado una proteína de interés mediante la introducción de un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable y secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión, y la integración del fragmento génico insertado entre un par (dos) de las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero. Además, se ha descubierto que la proteína de interés puede producirse de manera eficiente mediante la utilización de la célula y de esta manera se ha llevado a cabo la invención.
Descripción detallada de la invención
Específicamente, la invención es tal como como se expone a continuación:
1. Un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 mostradas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 mostradas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3, en una célula de CHO en suspensión capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero; introducir un vector de expresión (b) que comprende un ADN codificante de una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y posee actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma al interior de la célula de CHO; integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO para obtener una de dichas células de CHO capaz de expresar la proteína de interés, y cultivar en suspensión la célula de CHO.
2. Un procedimiento descrito en el ítem 1 anteriormente mencionado, para producir una proteína de interés, que comprende:
(A) introducir simultáneamente los vectores de expresión (a) y (b) en la célula de CHO,
(B) expresar transitoriamente la transposasa a partir del vector de expresión introducido en la etapa (A) para integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO con el fin de obtener una célula de CHO en suspensión capaz de expresar la proteína de interés, y
(C) cultivar en suspensión la célula de CHO en suspensión capaz de expresar la proteína de interés obtenida en la etapa (B) para producir la proteína de interés.
3. Un procedimiento para obtener una célula de CHO en suspensión capaz de expresar una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 mostradas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 mostradas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3, en una célula de CHO en suspensión capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero; introducir un vector de expresión (b) que comprende un ADN codificante de una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y posee actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma al interior de la célula de CHO; e integrar el fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón, en un cromosoma de la célula de CHO.
4. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 3 anteriormente mencionados, en el que la célula de CHO es por lo menos una seleccionada de CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-2.
5. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 4 anteriormente mencionados, en el que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a cicloheximida.
6. El procedimiento descrito en el ítem 5 anteriormente mencionado, en el que el gen de resistencia a cicloheximida es un gen codificante de un mutante de la proteína ribosómica humana L36a.
7. El procedimiento descrito en el ítem 6 anteriormente mencionado, en el que el mutante es un mutante en el que la prolina en la posición 54 de la proteína ribosómica humana L36a se sustituye por otro aminoácido.
8. El procedimiento descrito en el ítem 7 anteriormente mencionado, en el que el otro aminoácido es la glutamina.
9. Una célula de CHO en suspensión capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero y de producir una proteína de interés, en la que la célula comprende un vector de expresión (a) que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 mostradas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 mostradas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3 y un vector de expresión (b) que comprende un ADN codificante de una transposasa (una transferasa) que reconoce las secuencias de transposón y posee actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma para integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en el cromosoma de la célula de CHO.
10. La célula descrita en el ítem 9 anteriormente mencionado, en la que la célula de CHO es por lo menos una seleccionada de CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S;
11. La célula descrita en el ítem 9 o 10 anteriormente mencionada, en la que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a la cicloheximida.
12. La célula descrita en el ítem 11 anteriormente mencionado, en el que el gen de resistencia a cicloheximida es un gen codificante de un mutante de la proteína ribosómica humana L36a.
13. El procedimiento descrito en el ítem 12 anteriormente mencionado, en el que el mutante es un mutante en el que la prolina en la posición 54 de la proteína ribosómica humana L36a se sustituye por otro aminoácido.
14. La célula descrita en el ítem 13 anteriormente mencionado, en el que el otro aminoácido es la glutamina, y 15. Utilización de un vector de expresión de proteína (a) que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 mostradas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 mostradas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3 y un vector de expresión (b) que comprende un ADN codificante de una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y posee actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma para integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en el cromosoma de una célula de CHO en suspensión capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero.
Efectos ventajosos de la invención
Según el procedimiento de producción de proteína de la invención, puede producirse eficientemente una proteína de interés mediante la utilización de una célula de mamífero. Además, puede utilizarse la célula de la invención como célula de producción de proteína para producir una proteína recombinante con una eficiencia elevada.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 representa una ilustración esquemática de un vector transposón para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humana. Tol2-L representa un transposón de lado izquierdo de Tol2 (SEC ID n° 2), Tol2-R representa un transposón de lado derecho de Tol2 (SEC ID n° 3); CMV representa un promotor del CMV; poli A representa un sitio de poliadenilación; Hc representa un ADNc de cadena H de anticuerpo humano; Lc representa un ADNc de cadena L de anticuerpo humano, y CHX-r representa un gen de resistencia a cicloheximida.
[Figura 2] La figura 2 representa una ilustración esquemática de un vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana. CMV representa un promotor del CMV; poli A representa un sitio de poliadenilación; Hc representa un ADNc de cadena H de anticuerpo humano; Lc representa un ADNc de cadena L de anticuerpo humano y CHX-r representa un gen de resistencia a cicloheximida.
[Figura 3] La figura 3 representa una ilustración esquemática de un vector de expresión de transposasa Tol2. CAGGS representa un promotor CAGGS; poli A representa un sitio de poliadenilación y ADNc de TPasa representa el ADNc de una transposasa Tol2.
[Figura 4A] La figura 4A representa el resultado del examen del nivel de expresión de un anticuerpo anti-M2 de influenza humana en una célula de CHO-K1 en suspensión al utilizar un vector transposón Tol2 para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humana. La ordenada muestra el nivel producido de anticuerpo (|jg/ml) y la abscisa muestra el número de clones transgénicos de la célula de CHO-K1 en suspensión.
[Figura 4B] La figura 4B representa el resultado del examen del nivel de expresión de un anticuerpo anti-M2 de influenza humana en una célula de CHO-K1 adhesiva al utilizar un vector transposón Tol2 para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humana. La ordenada muestra el nivel producido de anticuerpo (jg/ml) y la abscisa muestra el número de clones transgénicos de la célula de CHO-K1 adhesiva.
[Figura 5] La figura 5 representa una ilustración esquemática de un vector transposón Tol1 para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humana. Tol1-L representa un transposón de lado izquierdo de Tol1 (SEC ID n° 14), Tol1-R representa un transposón de lado derecho de Tol2 (SEC ID n° l5); CMV representa un promotor del CMV; poli A representa un sitio de poliadenilación; Hc representa un ADNc de cadena H de anticuerpo humano; Lc representa un ADNc de cadena L de anticuerpo humano, y CHX-r representa un gen de resistencia a cicloheximida.
[Figura 6] La figura 6 representa una ilustración esquemática de un vector de expresión de transposasa Tol1. CAGGS representa un promotor CAGGS; poli A representa un sitio de poliadenilación y ADNc de TPasa representa el ADNc de una transposasa Tol1.
[Figura 7] La figura 7 representa el resultado del examen del nivel de expresión de un anticuerpo anti-M2 de influenza humana en una célula de CHO-K1 en suspensión al utilizar un vector transposón Tol1 para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humana. La ordenada muestra el nivel producido de anticuerpo (jg/ml) y la abscisa muestra el número de clones transgénicos de la célula de CHO-K1 en suspensión.
La invención se refiere a un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión, integrando el fragmento génico insertado entre un par (dos) de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero con el fin de obtener una célula de mamífero apta para expresar dicha proteína de interés, y cultivar en suspensión la célula de mamífero. Entre los ejemplos del procedimiento para producir una proteína de interés de la presente invención se incluye un procedimiento, que comprende las etapas (A) a (C) a continuación:
(A) una etapa de introducción simultánea de los vectores de expresión siguientes, (a) y (b), en una célula de mamífero en suspensión:
(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, (b) un vector de expresión que comprende un ADN codificante de una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y posee actividad de transferencia de un fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón al interior de un cromosoma,
(B) una etapa de expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión introducido en la etapa (A) para integrar el fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero con el fin de obtener una célula de mamífero en suspensión capaz de expresar la proteína de interés, y
(C)una etapa de cultivo en suspensión de la célula de mamífero en suspensión capaz de expresar la proteína de interés obtenida en la etapa (B) para producir la proteína de interés.
Además, la presente invención se refiere a una célula de mamífero en suspensión capaz de producir una proteína de interés, en la que se introduce un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, para integrar el fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón en un cromosoma.
Además, la presente invención se refiere a una célula de mamífero en suspensión capaz de producir una proteína de interés, en la que un vector de expresión (a) que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, y un vector de expresión (b) que comprende un ADN codificante de una transposasa (una transferasa) que reconoce las secuencias de transposón y posee actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón a un cromosoma para integrar el fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón dentro del cromosoma.
El término "transposón" en la presente memoria es un elemento genético transponible y se refiere a una unidad génica que se desplaza en un cromosoma o de un cromosoma a otro cromosoma (transposición) manteniendo una determinada estructura.
El transposón comprende una unidad génica de secuencias de transposón repetidas (también denominadas secuencias repetidas invertidas (secuencias IR) o secuencias repetidas invertidas terminales (secuencias IRT)) que se sitúan en la misma dirección o en la dirección inversa en ambos extremos de la unidad génica, y una secuencia de nucleótidos codificante de una transposasa que reconoce la secuencia de transposón para transferir un gen presente entre las secuencias de transposón.
La transposasa traducida a partir del transposón puede transferir un ADN mediante el reconocimiento de secuencias de transposón de ambos extremos del transposón, extrayendo mediante corte el fragmento de ADN insertado entre un par de las secuencias de transposón e insertando el fragmento en el sitio que debe transferirse.
La expresión "secuencia de transposón" en la presente memoria se refiere a la secuencia de nucleótidos de un transposón reconocido por una transposasa y presenta el mismo significado que la secuencia IR o la secuencia IRT. Un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos puede comprender una fracción repetida imperfecta con la condición de que pueda transferirse (insertarse en otra posición en el genoma) mediante la actividad de una transposasa, y comprende una secuencia de transposón específica de la transposasa.
Como secuencia de transposón que debe utilizarse en la invención, se utiliza una secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones de tipo ADN naturales o artificiales que pueden ser reconocidos por una transposasa y ser transpuestos a células de mamíferos.
La secuencia de nucleótidos derivada de un transposón de tipo ADN es un par de secuencias de nucleótidos derivados del transposón1 o transposón2 derivado del pez medaka.
Las secuencias de nucleótidos de los transposones Tol2 y Tol1 derivados del pez medaka se muestran en SEC ID n° 6 y SEC ID n° 13, respectivamente.
Entre los ejemplos de una secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol2 se incluyen la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 2.229 y la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 4.148 y 4.682 en la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 mostrada en la SEC ID n° 6 del Listado de secuencias. Como secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol2, se utiliza la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1 y 200 (SEC ID n° 2) (en adelante denominada "secuencia Tol2-L") y la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 2.285 y 2.788 (SEC ID n° 3) (en adelante denominada "secuencia Tol2-R") en la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 mostrada en la SEC ID n° 1 del Listado de secuencias.
Entre los ejemplos de una secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol1 se incluyen la secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1 y 157 y la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1.748 y 1.855 en la secuencia de nucleótidos del transposón Tol1 mostrada en la SEC ID n° 13 del Listado de secuencias.
Como secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol1, se utiliza la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1 y 200 (SEC ID n° 14) (en adelante denominada "secuencia Tol1-L") y la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1.351 y 1.855 (SEC ID n° 15) (en adelante denominada "secuencia Tol1-R") en la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 mostrada en la SEC ID n° 1 del Listado de secuencias.
Entre los ejemplos de la secuencia de transposón se incluyen las secuencias de transposón las reacciones de transferencia de las cuales se controlan mediante la utilización de una secuencia parcial de una secuencia de transposón derivada del transposón anteriormente mencionado, mediante el ajuste de la longitud de la secuencia de nucleótidos y mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos debido a adición, eliminación o sustitución.
Con respecto al control de la reacción de transferencia de un transposón, la reacción de transferencia puede acelerarse o suprimirse mediante la aceleración o supresión, respectivamente, del reconocimiento de la secuencia de transposón por parte de una transposasa.
El término "transposasa" en la presente memoria se refiere a un enzima que reconoce las secuencias de nucleótidos que presentan secuencias de transposón y transfieren un ADN presente entre las secuencias de nucleótidos al interior de un cromosoma o del cromosoma a otro cromosoma.
Entre los ejemplos de la transposasa se incluyen Tol1 y Tol2, que se deriva del pez medaka, 'Sleeping Beauty' reconstruido a partir de un transposón no autónomo presente en el genoma de un pez Onchorhynchus, el transposón artificial 'Frog prince', que se deriva de la rana, y el transposón PiggyBac, que se deriva de un insecto.
Como transposasa, puede utilizarse un enzima nativo, y puede utilizarse cualquier transposasa en la que una parte de sus aminoácidos han sido sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos, con la condición de que se mantenga la misma actividad de transferencia de la transposasa. Mediante el control de la actividad enzimática de la transposasa, puede controlarse la reacción de transferencia del ADN existente entre las secuencias de transposón.
Con el fin de analizar si posee o no una actividad de transferencia similar a la de la transposasa, puede medirse mediante el sistema de análisis de 2 componentes dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 235575/2003.
A título ilustrativo, puede analizarse si un elemento Tol2 no autónomo puede transferirse e insertarse o no en un cromosoma de célula de mamífero por la actividad de una transposasa, mediante la utilización separada de un plásmido que comprende un transposón Tol2 con deleción de transposasa Tol2 (transposón no autónomo derivado de Tol2) y un plásmido que comprende la transposasa Tol2.
La expresión "transposón no autónomo" en la presente memoria se refiere a un transposón que ha perdido una transposasa presente dentro del transposón y que, por lo tanto, no puede llevarse a cabo su transferencia autónoma. El transposón no autónomo puede transferir el ADN insertado entre las secuencias de transposón del transposón no autónomo al cromosoma de la célula hospedadora en el caso de que se permita que una proteína transposasa, un ARNm codificante de la proteína transposasa o a un ADN codificante de la proteína transposasa se encuentren presentes simultáneamente en la célula.
El gen de transposasa se refiere a un gen codificante de una transposasa. Con el fin de mejorar su eficiencia de expresión en una célula de mamífero, una secuencia que ajusta un espacio entre la secuencia de consenso de Kozak (Kozak M., Nucleic Acids Res. 12:857-872, 1984) o una secuencia de unión ribosómica, la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio, de distancia apropiada (por ejemplo, de 6 a 18 bases), puede conectarse a un sitio situado cadena arriba del codón de inicio de traducción ATG del gen.
Según el procedimiento de la invención, con el fin de integrar un fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de nterés y un gen marcador seleccionable en un vector de expresión en el cromosoma de una célula hospedadora, se introduce en la célula hospedadora un vector de expresión que comprende el fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable y secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, y se permite que actúa una transposasa sobre las secuencias de transposón comprendidas en el vector de expresión que se ha introducido en la célula. Con el fin de permitir que una transposasa actúe sobre las secuencias de transposón comprendidas en el vector de expresión que se ha introducido en la célula, la transposasa puede inyectarse en la célula, o puede introducirse un vector de expresión que comprende un ADN codificante de la transposasa en la célula hospedadora junto con un vector de expresión que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable. Además, mediante la introducción de un ARN codificante de un gen de transposasa en la célula hospedadora, puede expresarse la transposasa en la célula.
El vector de expresión no se encuentra particularmente limitado. Puede utilizarse cualquier vector de expresión mediante la selección opcional de entre los vectores de expresión conocidos por el experto en la materia, según la célula hospedadora en la que se introduce un vector de expresión que comprende un gen de transposasa, y similares.
Con el fin de producir una proteína constituida de dos o más polipéptidos mediante el procedimiento de la invención, el ADN puede integrarse en el cromosoma de la célula mediante la integración de un ADN codificante de dos o más polipéptidos en el mismo o diferentes vectores de expresión, seguido de la introducción de los vectores de expresión en una célula hospedadora.
La transposasa puede insertarse en un vector de expresión para expresarla junto con la proteína de interés, o puede insertarse en un vector diferente del vector de expresión. Puede permitirse que la transposasa actúe transitoriamente o puede permitirse que actúe continuamente, aunque resulta preferente permitir que la transposasa actúe transitoriamente con el fin de preparar una célula para la producción estable.
Como procedimiento para permitir que la transposasa actúe transitoriamente, entre los ejemplos se incluye un procedimiento que comprende preparar un vector de expresión que comprende un ADN codificante de la transposasa y un vector de expresión que comprende un a Dn codificante de una proteína de interés, seguido de la introducción de ambos plásmidos de expresión simultáneamente en una célula hospedadora.
La expresión "vector de expresión" en la presente memoria se refiere a un vector de expresión que se utilizará para la introducción en una célula de mamífero con el fin de expresar una proteína de interés. El vector de expresión utilizado en la invención presenta una estructura en la que se encuentran presentes por lo menos un par de secuencias de transposón a ambos lados de un casete de expresión.
La expresión "casete de expresión" en la presente memoria se refiere a una secuencia de nucleótidos que presenta una región de control de la expresión génica necesaria para expresar una proteína de interés y una secuencia codificante de la proteína de interés. Entre los ejemplos de la región de control de la expresión génica se incluyen un intensificador, un promotor y un terminador. El casete de expresión puede contener un gen marcador seleccionable.
Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula animal. Entre los ejemplos se incluyen un promotor de gen IE (temprano inmediato,) del citomegalovirus (CMV), el promotor temprano del SV40, un promotor de retrovirus, un promotor metalotioneína, un promotor de choque térmico, el promotor SRa, el virus de la leucemia murina de Moloney, un intensificador y similares. Además, puede utilizarse un intensificador del gen IE del CMV humano junto con el promotor.
La expresión "gen marcador seleccionable" se refiere a otro gen marcador que puede utilizarse para distinguir una célula en la que se ha introducido un vector plásmido respecto de una célula que no presenta el vector. Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable se incluyen un gen de resistencia a fármaco (un gen de resistencia a neomicina, un gen DHFR, un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a blasticidina, un gen de resistencia a higromicina y un gen de resistencia a cicloheximida (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 262879/2002), genes marcadores de fluorescencia y bioluminiscencia (tal como la proteína fluorescente verde, GFP) y similares.
En la invención, marcador seleccionable preferente es un gen de resistencia a fármaco y un marcador seleccionable particularmente preferente es un gen de resistencia a cicloheximida. Además, mediante la realización de una modificación génica del gen marcador seleccionable, también puede modificarse el rendimiento de resistencia a fármaco y el rendimiento de luminiscencia de la proteína marcadora seleccionable. La cicloheximida (en adelante en ocasiones denominada CHX) es un inhibidor de la síntesis de proteínas y como ejemplos de la utilización del gen de resistencia a CHX como gen marcador seleccionable, se conocen los casos de células de levadura (Kondo K., J. Bacteriol. 177(24):7171-7177, 1995) y de células animales (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 262879/2002).
En el caso de las células animales, se ha encontrado que la resistencia a la cicloheximida la proporciona un transformante que expresa una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 7 del Listado de secuencias, en la que la prolina en la posición 54 de la subunidad L36a de la proteína ribosómica humana codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 5 del Listado de secuencias se ha sustituido por glutamina.
El procedimiento para introducir el vector de expresión de proteínas anteriormente mencionado que comprende una secuencia de transposón, un vector plásmido que expresa una transposasa y ARN no se encuentra particularmente limitado. Entre los ejemplos se incluyen la transfección con fosfato de calcio, la electroporación, un procedimiento de liposomas, un procedimiento de pistola génica y similares.
Entre los ejemplos del procedimiento para introducir directamente una transposasa en la forma de una proteína se incluyen la microinyección o la endocitosis para la introducción en una célula. La transferencia génica puede llevarse a cabo mediante el procedimiento descrito en la obra Shin Idenshi Kogaku Handbook (New Genetic Engineering Handbook), editado por Masami Muramatsu y Tadashi Yamamoto, publicado por Yodo-sha, ISBN 9784897063737.
La célula hospedadora es una célula de mamífero en suspensión. La célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino, célula de CHO (Journal of Experimental Medicine 108:945, 1958; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 601275, 1968); Genetics 55:513, 1968); Chromosoma 41:129, 1973); Methods in Cell Science 18:115, 1996); Radiation Research 148:260, 1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. 60:1275, 1968); Cell 6:121, 1975); Molecular Cell Genetics, apéndice I y II (páginas 883 a 900). Entre los ejemplos de la célula de CHO se incluyen CHO/DG44, CHO-K1 (ATCC n° CCL-61), DUKXB11 (ATCC n° CCL-9096), Pro-5 (ATCC n° CCL-1781), c Ho -S (Life Technologies, n° de cat. 11619), Pro-3 y sub-cepas de célula de CHO.
Además, la célula hospedadora anteriormente mencionada también puede utilizarse en el procedimiento de producción de proteínas de la invención mediante su modificación de manera que resulte adecuado para la producción de proteínas, mediante la modificación del ADN cromosómico, la introducción de un gen exógeno, y similares.
Además, con el fin de controlar la estructura de la cadena sacárida unida a una proteína de interés que debe producirse, Lec13, que adquiere resistencia a lectinas [Somatic Cell and Molecular Genetics 12:55, 1986] y una célula de CHO de la que se ha eliminado el gen de a1,6-fucosyltransferasa (documentos n° WO2005/35586 y n° WO2002/31140) también pueden utilizarse como la célula hospedadora.
La proteína de interés puede ser cualquier proteína con la condición de que pueda expresarse mediante el procedimiento de la invención. Específicamente, entre los ejemplos se incluyen una proteína sérica humana, una hormona peptídica, un factor de crecimiento, una citoquina, un factor de coagulación sanguínea, una proteína del sistema de fibrinolisis, un anticuerpo y fragmentos parciales de diversas proteínas, y similares.
Entre los ejemplos preferidos de la proteína de interés se incluyen un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano; proteína de fusión Fc y proteína unida a albúmina, y un fragmento de los mismos.
Una actividad efectora de un anticuerpo monoclonal obtenido mediante el procedimiento de la presente invención puede controlarse mediante diversos procedimientos. Por ejemplo, son procedimientos conocidos un procedimiento para controlar una cantidad de fucosa (en adelante denominada "fucosa nuclear") que está unida a N-acetilglucosamina (GlcNAc) mediante enlace a-1,6 en un extremo reductor de una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo que está unida a asparagina (Asn) en la posición 297 de una región Fc de un anticuerpo (documentos n° WO2005/035586, n° WO2002/31140 y n° WO00/61739), un procedimiento para controlar una actividad efectora de un anticuerpo monoclonal mediante la modificación de uno o más grupos aminoácidos de una región Fc del anticuerpo, y similares. La actividad efectora del anticuerpo monoclonal producido mediante el procedimiento de la presente invención puede controlarse mediante la utilización de cualquiera de los procedimientos.
La "actividad efectora" se refiere a una actividad dependiente de anticuerpos que resulta inducida mediante una región Fc de un anticuerpo. Como actividad efectora, se conoce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCc ), la citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC), la fagocitosis dependiente de anticuerpos (actividad ADP) por células fagocíticas, tales como macrófagos o células dendríticas, y similares.
Además, mediante el control del contenido de fucosa nuclear de una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo de la región Fc de un anticuerpo monoclonal, puede incrementarse o reducirse una actividad efectora del anticuerpo.
Como procedimiento para reducir el contenido de fucosa que está unida a una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo a Fc del anticuerpo, puede obtenerse un anticuerpo al que no está unido fucosa, mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula de CHO que es deficiente en un gen codificante de a1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que no está unido fucosa posee una elevada actividad ADCC.
Por otra parte, como procedimiento para incrementar el contenido de fucosa que está unida a una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo a a Fc de un anticuerpo, puede obtenerse un anticuerpo al que está unido fucosa, mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula hospedadora en la que se ha introducido un gen codificante de a1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que está unido fucosa posee una actividad ADCC más baja que el anticuerpo al que no está unido fucosa.
Además, mediante la modificación de uno o más residuos aminoácidos en una región Fc de un anticuerpo, puede incrementarse o reducirse la actividad ADCC o la actividad CDC. Por ejemplo, la actividad CDC de un anticuerpo puede incrementarse mediante la utilización de la secuencia de aminoácidos de la región Fc descrita en el documento n° US2007/0148165.
Además, la actividad ADCC o la actividad CDC de un anticuerpo puede incrementarse o reducirse mediante la modificación del aminoácido tal como se indica en las patentes US n° 6.737.056, n° 7.297.775 o n° 7.317.091. La expresión "célula de mamífero en suspensión" en la presente invención se refiere a una célula que no se adhiere a un anclaje de cultivo celular de recubrimiento que facilita la adhesión de células en el cultivo, tal como microperlas, un recipiente de cultivo para el cultivo de tejidos (también denominado recipiente de cultivo tisular o de cultivo de adhesión, y similares) y similares, y puede sobrevivir y crecer mediante la suspensión en el líquido de cultivo.
En el caso de que la célula no se adhiera al anclaje de cultivo celular, puede sobrevivir y crecer en estado de célula individual en el líquido de cultivo o sobrevivir y crecer en estado de masa celular formada mediante aglutinación de dos o más células.
Además, como célula de mamífero en suspensión para la utilización en la presente invención, una célula que pueda sobrevivir y crecer en un medio sin suero que no contiene suero de feto bovino (en adelante denominado FCS) y similares, mientras está en suspensión en el líquido de cultivo sin adherirse al anclaje de cultivo celular, resulta preferible, y una célula de mamífero que pueda sobrevivir y crecer en suspensión en un medio sin proteínas que no contiene proteína resulta más preferible.
Como recipiente de cultivo para el cultivo tisular, puede ser cualquier recipiente de cultivo, tal como un matraz, una placa Petri y similares, con la condición de que se aplique en el mismo un recubrimiento para el cultivo de adhesión. Específicamente, por ejemplo, si es o no una célula de mamífero en suspensión puede confirmarse mediante la utilización de un matraz de cultivo tisular disponible comercialmente (fabricado por Greiner), un matraz de cultivo de adhesión (fabricado por Sumitomo Bakelite) y similares.
Como célula de mamífero en suspensión para la utilización en la presente invención, puede ser una célula de CHO preparada mediante la adaptación adicional de una célula de CHO que originalmente presentaba la propiedad de crecimiento en suspensión, al cultivo en suspensión, o una célula de CHO en suspensión preparada mediante la adaptación de una célula de CHO adhesiva a las condiciones del cultivo en suspensión. Entre los ejemplos de célula que originalmente presentaba la propiedad de crecimiento en suspensión se incluye la célula de c HO-S (fabricada por Invitrogen) y similares.
La "célula de mamífero en suspensión preparada mediante adaptación de una célula de mamífero adhesiva a las condiciones del cultivo en suspensión" anteriormente mencionada puede prepararse mediante el procedimiento descrito en Mol. Biotechnol. l5(3):249-57, 2000, o mediante el procedimiento mostrado a continuación, y puede prepararse estableciendo una célula que muestra una propiedad de crecimiento en suspensión y una propiedad de supervivencia similares a las presentes antes de la adaptación al cultivo en suspensión o superiores a las presentes antes de la adaptación al cultivo en suspensión (J. Biotechnol. 130(3):289-90, 2007).
La expresión "similar a las presentes antes de la adaptación al cultivo en suspensión" se refiere a que la proporción de supervivencia, la tasa de proliferación (tiempo de duplicación) y similares, de la célula adaptada al cultivo en suspensión son sustancialmente similares a las de la célula antes de la adaptación al cultivo en suspensión.
Entre los ejemplos del procedimiento para adaptar una célula de mamífero en suspensión a las condiciones de cultivo en suspensión según la presente invención se incluye el procedimiento siguiente. El contenido en suero de un medio que contiene suero se reduce a 1/10 y se repite el subcultivo a una concentración celular relativamente elevada. Al alcanzar el nivel de supervivencia y proliferación de la célula de mamífero, se reduce adicionalmente el contenido de suero y se repite el subcultivo. Mediante este procedimiento, puede prepararse una célula de mamífero en suspensión que puede sobrevivir y proliferar bajo condiciones sin suero.
Además, también puede prepararse una célula de mamífero en suspensión mediante un procedimiento que comprende el cultivo con la adición de un tensioactivo no iónico apropiado, tal como Pluronic-F68 o similar, al líquido de cultivo.
En la presente invención, como propiedad que posee la célula de mamífero en suspensión, al cultivar en suspensión 2x105 células/ml, la concentración celular después del cultivo durante 3 o 4 días preferentemente de 5x105 células/ml o superior, más preferentemente de 8x105 células/ml o superior, particularmente preferentemente de 1x106 células/ml o superior, lo más preferentemente de 1,5x106 células/ml o superior.
Además, el tiempo de duplicación de la célula de mamífero en suspensión de la presente invención preferentemente es de 48 horas o inferior, más preferentemente de 24 horas o inferior, particularmente preferentemente de 18 horas o inferior, lo más preferentemente de 11 horas o inferior.
Entre los ejemplos del medio para el cultivo en suspensión se incluye medio disponible comercialmente, tal como medio CD-CHO (fabricado por Invitrogen), medio EX-CELL 3 2 5 - P f (fabricado por SAFC Biosciences), medio SFM4CHO (fabricado por HyClone) y similares. Además, también puede obtenerse mezclando sacáridos, aminoácidos y ácidos similares que resultan necesarios para el cultivo de células de mamífero.
La célula de mamífero en suspensión puede cultivarse utilizando un recipiente de cultivo que pueda utilizarse para el cultivo en suspensión bajo condiciones de cultivo capaces de cultivo en suspensión. Entre los ejemplos del recipiente de cultivo se incluyen una placa de 96 pocillos para el cultivo celular (fabricada por Corning), un matraz T (fabricado por Becton Dickinson), un matraz Erlenmeyer (fabricado por Corning) y similares.
Con respecto a las condiciones de cultivo, por ejemplo, puede cultivarse estáticamente en una atmósfera de 5% CO2 a una temperatura de cultivo de 37°C. También puede utilizarse un equipo de cultivo de agitación, tal como un equipo de cultivo para la utilización exclusiva en cultivo en suspensión, Wave Bioreactor (fabricado por GE Healthcare Bioscience).
Con respecto a las condiciones de cultivo en suspensión de una célula de mamífero en suspensión utilizando el equipo Wave Bioreactor, la célula puede cultivarse mediante el procedimiento descrito en la página de Internet de GE Healthcare Bioscience http://www.gelifesciences.co.jp/tech-support/manual/pdf/cellcult/wave-03-16.pdf. Además del cultivo de agitación, también puede utilizarse el cultivo mediante un equipo de agitación por rotación, tal como un biorreactor. El cultivo con un biorreactor puede llevarse a cabo mediante el procedimiento descrito en Cytotechnology 52: 199-207, 2006, y similares.
En la presente invención, al utilizar una estirpe celular diferente de las células de mamífero en suspensión, puede utilizarse cualquier estirpe celular con la condición de que sea una línea de célula de mamífero adaptada al cultivo en suspensión mediante el procedimiento anteriormente mencionado y sea una estirpe celular que pueda utilizarse en el procedimiento de producción de proteína de la presente invención.
La purificación de la proteína de interés producida por la célula de mamífero en suspensión se lleva a cabo mediante la separación de la proteína de interés respecto de impurezas diferentes de la proteína de interés en un líquido de cultivo u homogeneizado celular que contiene la proteína de interés. Entre los ejemplos del procedimiento de separación se incluyen la centrifugación, la diálisis, la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía de columna, un filtro y similares. La separación puede llevarse a cabo basándose en la diferencia de propiedades físico-químicas de la proteína de interés y las impurezas y basándose en la diferencia en su afinidad para el portador de la columna.
El procedimiento para purificar la proteína de interés puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en Protein Experimentation Note (el primer volumen) - Extraction, Separation and Expression of Recombinant Protein (traducción de un libro de texto escrito en japonés) (editado por Masato Okada y Kaori Miyazaki, publicado por Yodo-sha, ISBN 9784897069180).
La presente invención se ha descrito anteriormente mostrando unas formas de realización preferidas de la misma en aras de una fácil comprensión. En adelante, la presente invención se describe adicionalmente basándose específicamente en ejemplos, aunque las explicaciones anteriormente mencionadas y los ejemplos a continuación se proporcionan únicamente a título de ejemplo no limitativo. De acuerdo con lo anterior, el alcance de la invención no se encuentra limitado a las formas de realización y ejemplos que se describen específicamente en la presente memoria, sino que se encuentra limitada exclusivamente por las reivindicaciones. Se llevaron a cabo diversas técnicas experimentales relacionadas con la recombinación genéticas descritas en adelante en la presente memoria, tales como la clonación y similares, de acuerdo con las técnicas de ingeniería genética descritas en Molecular Cloning, 2a edición, editado por J. Sambrook, E.F. Frisch y T. Maniatis, y Current Protocols in Molecular Biology, editado por Frederick M. Ausubel et al., publicado por Current Protocols, y similares.
Ejemplos
[Ejemplo 1]
Preparación de vector transposón para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana
Se utilizó un plásmido que contiene un casete de expresión génica para células de mamífero que comprende un gen de anticuerpo humano arbitrario y un gen marcador de resistencia a fármaco insertado entre un par de secuencias de transposón Tol2 a modo de vector plásmido para la expresión de proteína.
Cada ADN de los genes utilizados se sintetizó química y artificialmente basándose en una secuencia de nucleótidos conocida u obtenida mediante preparación de los cebadores para las dos secuencias terminales y llevando a cabo una PCR utilizando una fuente de ADN apropiada como molde. Con el fin de llevar a cabo la manipulación génica posteriormente, se añadió un sitio de restricción para un enzima de restricción al extremo del cebador.
Entre las secuencias de nucleótidos del transposón Tol2 no autónomo dadas a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 235575/2003 (SEC ID n° 1), se utilizó la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1 y 200 (secuencia Tol2-L) (SEC ID n° 2) y la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 2.285 y 2.788 (secuencia Tol2-R) (SEC ID n° 3).
Cada fragmento de ADN sintético que comprende un par de secuencias de transposón (fabricadas por Takara Bio Inc.) se preparó mediante el procedimiento siguiente. Se preparó un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos en el que estaba unida una secuencia de reconocimiento del enzima de restricción NruI tanto al extremo 5'-terminal como al extremo 3'-terminal de la secuencia Tol2-R. A continuación, se preparó un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos en la que se había unido una secuencia de reconocimiento del enzima de restricción Fsel al extremo 5'-terminal de la secuencia Tol2-L y se unió un enzima de restricción AscI al extremo 3'-terminal del mismo.
Seguidamente, los fragmentos de ADN preparados de esta manera que comprendían la secuencia Tol2-R y la secuencia Tol2-L se insertaron en el vector de expresión N5LG1-M2-Z3 (documento n° WO2006/061723) que comprendía una secuencia de nucleótidos codificante de una secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-M2 de influenza humana Z3G1.
El vector N5LG1-M2-Z3 (documento n° WO2006/061723) en el que se había insertado una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 8) codificante de la cadena H del anticuerpo anti-M2 de influenza humana Z3G1 (ATCC n° de depósito PTA-5968, depositado el 13 de marzo de 2004, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) y una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 10 y SEC ID n° 11) codificante de la cadena L (SEC ID n° 9) del mismo se insertaron bajo el control del intensificador/promotor del CMV como casete de expresión génica de anticuerpo.
El fragmento de ADN que comprendía la secuencia Tol2-R se insertó en el sitio NruI de enzima de restricción del vector N5LG1-M2-Z3, en el lado 5'-terminal de un fragmento génico que comprendía el casete de expresión génica del anticuerpo y un gen marcador de resistencia. A continuación, se insertó el fragmento de a Dn que comprendía la secuencia Tol2-L en los sitios de enzima de restricción Fsel y AscI en el lado 3'-terminal.
Además, se construyó un vector transposón para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humana (figura 1) mediante la inserción de un casete de expresión génica de resistencia a cicloheximida conectado con una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 5) codificante de un gen de resistencia a cicloheximida (un gen en el que la prolina en la posición 54 de la proteína ribosómica humana L36a ha sido sustituida por glutamina) en el sitio de reconocimiento Fsel del vector N5LG1-M2-Z3 conectado con la secuencia del transposón Tol2, bajo el control del intensificador/promotor de CMV.
Por otra parte, un vector que no contenía secuencias de transposón se denominó vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana y se utilizó como el vector de control (figura 2).
[Ejemplo 2]
Preparación de vector de expresión de transposasa
La transposasa se expresó utilizando un vector de expresión independiente del vector de expresión del anticuerpo de interés. Es decir, se insertó un gen que era codificante de una transposasa Tol2 derivada de pez medaka (SEC ID n° 4) cadena abajo del promotor CAGGS de un vector pCAGGS (Gene 108:193-200, 1991) y se utilizó como el vector de expresión (figura 3).
[Ejemplo 3]
(1) Preparación de célula de CHO en suspensión
Una célula de CHO adhesiva que había sido cultivada utilizando un medio a-MEM (fabricado por Invitrogen) que contenía 10% de suero (FCS) se desprendió y recuperó mediante tratamiento con tripsina y se cultivó bajo agitación a 37°C en un incubador con 5% de CO2 utilizando un medio a-MEM fresco que contenía 10% de FCS. Varios días después, se confirmó el crecimiento de estas células y seguidamente se llevó a cabo el cultivo bajo agitación mediante la siembra de las mismas en un medio a-MEM que contenía 5% de FCS a una concentración de 2x105 células/ml.
Varios días después, se llevó a cabo de manera similar la inoculación utilizando el medio a-MEM que contenía 5% de FCS. Finalmente, se preparó una célula adaptada al cultivo en suspensión mediante repetición del subcultivo y cultivo bajo agitación utilizando medio a-MEM sin suero y se confirmó que las células presentaban la misma capacidad de crecimiento que en el caso del cultivo en presencia de suero.
(2) Preparación de célula de CHO productora de anticuerpo
El vector transposón para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana preparado en los Ejemplos 1 y 2 (en adelante denominado vector transposón) y el vector de expresión de transposasa Tol2 pCAGGS-T2TP (figura 3; Kawakami K. y Noda T., Genetics 166:895-899, 2004) se utilizaron como vectores de expresión. Además, como el control se utilizó el vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana que no presentaba secuencias de transposón.
Mediante la introducción de los vectores de expresión anteriormente mencionados en la célula de CHO-K1 adaptada al cultivo en suspensión (American Type Culture Collection n° de cat. CCL-61) o la célula HEK293 (célula FreeStyle 293F, fabricada por Invitrogen), se compararon las frecuencias de obtención de clones resistentes a cicloheximida.
Se suspendió cada célula (4x106 células) en 400 pl de PBS y el vector transposón para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana (10 pg) y el vector de expresión de transposaa Tol2 (25 pg) directamente en forma de ADN circular mediante electroporación. En este aspecto, con el fin de expresar la transposasa Tol2 transitoriamente, el vector de expresión de la transposasa Tol2 se introdujo directamente en forma de ADN circular con el fin de evitar su integración en el cromosoma del hospedador.
Además, como control, se linealizó el vector de expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza humana (10 pg) con un enzima de restricción y después se introdujo en cada célula, de acuerdo con el procedimiento estándar de transferencia génica mediante electroporación.
La electroporación se llevó a cabo utilizando una cubeta de 4 mm de anchura de hueco (fabricada por Bio-Rad), utilizando un electroporador (Gene Pulser Xcell System (fabricado por Bio-Rad)) bajo las condiciones de 300 V de voltaje, 500 pF de capacidad electrostática y a temperatura ambiente.
Tras la transfección mediante electroporación, se sembró cada célula en tres placas de 96 pocillos y se cultivó en un incubador de CO2 durante 3 días utilizando el medio EX-CELL 325-PF fabricado por sAfC Biosciences para la célula de CHO y el medio FreeStyle-293 (fabricado por Invitrogen) para la célula HEK293.
A continuación, desde el día de intercambio de medio el 4° día de la transfección, se añadieron 3 pg/ml de cicloheximida al medio de manera que se cultivaron las células en presencia de cicloheximida, seguido del cultivo durante 3 semanas, llevando a cabo simultáneamente el intercambio de medio cada semana.
Tras cultivar durante 3 semanas, se realizó el recuento del número de pocillos en los que se encontraron colonias resistentes a cicloheximida. Se muestran los resultados en las Tablas 1 y 2.
ÍTabla 11
Tabla 1. Comparación de los números de células resistentes a cicloheximida (células CHO)
Vector transposón Vector convencional
Ensayo 1 155 / 288 0 / 288
Ensayo 2 100 / 288 0 / 288
Ensayo 3 94 / 288 0 / 288
ÍTabla 21
Tabla 2. Comparación de los números de células resistentes a cicloheximida (células HEK293)
Vector transposón Vector convencional
Ensayo 1 0 / 288 0 / 288
Ensayo 2 0 / 288 0 / 288
Ensayo 3 0 / 288 0 / 288
Tal como se muestra en la Tabla 1, cada vector transposón de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana o vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana se introdujo en la célula de CHO-K1 en suspensión. Como resultado, no se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida de la célula introducida con el vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana como en el caso de las otras estirpes celulares, pero se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida de la célula en la que se había introducido vector transposón para expresar anticuerpo anti-M2 de influenza humana con una frecuencia elevada.
Por otra parte, tal como se muestra en la Tabla 2, no se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida al introducir el vector transposón para expresar anticuerpo anti-M2 de influenza humana y vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana en la célula HEK293.
Basándose en estos resultados, se encontró que el gen codificante de proteína y el gen de resistencia a cicloheximida que se habían insertados entre un par de secuencias de transposón eran eficientemente introducidos en el cromosoma de la célula hospedadora, es decir, una célula de mamífero en suspensión.
(3) Examen de la producción de anticuerpo por la célula de CHO en suspensión y la célula de CHO adhesiva Con el fin de examinar la eficiencia de la producción de anticuerpo por una célula de CHO en suspensión o una célula de CHO adhesiva, se examinaron las cantidades de los anticuerpos producidos por las estirpes celulares respectivas. Como célula de CHO en suspensión, se utilizó la célula de CHO-K1 en suspensión adaptada al cultivo en suspensión. Además, como célula de CHO adhesiva, se utilizó la célula de CHO-K1 adhesiva antes de la adaptación al cultivo en suspensión.
Se introdujo el vector transposón de expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza humana (10 |jg) y el vector de expresión de transposasa Tol2 (25 jg ) en la célula de CHO-K1 en suspensión y en la célula de CHO-K1 adhesiva, respectivamente, mediante electroporación. Después, se sembró la célula de CHO-K1 en suspensión y la célula de CHO-K1 adhesiva en tres placas de 96 pocillos para cada célula.
Se utilizó un medio para las células en suspensión (EX-CELL 325-PF, fabricado por SAFC Biosciences) para la célula de CHO-K1 en suspensión, y el medio a-MEM que contenía 10% de suero se utilizó para la célula de CHO-K1 adhesiva. Se cultivó cada célula en un incubador de CO2 durante 3 días. Desde el día de intercambio de medio el 4° día de la transfección, se añadieron al medio 3 jg/ml de cicloheximida de manera que las células se cultivasen en presencia de cicloheximida y se cultivaron adicionalmente las células durante 3 semanas. En este caso, se llevó a cabo el intercambio de medios cada semana.
Para la célula de CHO-K1 en suspensión, se sembraron 1x106 células en una placa de 6 pocillos y se cultivaron bajo agitación en un incubador de CO2 durante 3 días y se midió la cantidad de proteína anticuerpo anti-M2 de influenza humana mediante HPLC utilizando el sobrenadante del cultivo.
Para la célula de CHO-K1 adhesiva, se llevó a cabo el intercambio de medios tras alcanzar las células la confluencia en una placa de 6 pocillos (2x106 células) y 3 días después del cultivo estático, se midió la cantidad de proteína anticuerpo mediante HPLC utilizando el sobrenadante del cultivo.
Se midió la concentración del anticuerpo en el sobrenadante de cultivo siguiendo el procedimiento descrito en Yeast Res. 7:1307-1316, 2007. Se muestran los resultados en las figuras 4A y 4B.
Tal como se muestra en la figura 4A, se obtuvo un gran número de células que mostraba un nivel de expresión de anticuerpo marcadamente elevado al utilizar la célula de CHO-K1 adaptada al cultivo en suspensión. Por otra parte, tal como se muestra en la figura 4B, sólo se obtuvieron células que mostraban un nivel de expresión en el límite de detección de la HPLC (5 jg/ml) o inferior al utilizar la célula de CHO-K1 adhesiva.
Basándose en estos resultados, se encontró que, para la expresión de una proteína de interés utilizando un vector transposón, la proteína de interés puede expresarse a un nivel elevado al utilizar una célula de mamífero en suspensión.
Además, se descubre a partir de los resultados de los Ejemplos 1 a 3 que el procedimiento de la invención puede utilizarse como nuevo procedimiento para producir una proteína de interés mediante la preparación eficiente de una célula productora que puede expresar a nivel elevado un gen exógeno utilizando una célula de mamífero en suspensión adaptada al cultivo en suspensión.
[Ejemplo 4]
Preparación de vector transposón Tol1 para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana
De la misma manera que en el Ejemplo 1, se utilizó como vector plásmido de expresión de proteína un plásmido que contenía un casete de expresión génica para las células de mamífero, que comprendía un gen de anticuerpo humano arbitrario y un gen marcador de resistencia a fármaco insertado entre un par de secuencias de transposón Tol1.
Cada ADN de los genes utilizados se sintetizó química y artificialmente basándose en una información de secuencia conocida u obtenida mediante preparación de los cebadores para las dos secuencias terminales y llevando a cabo una PCR utilizando una fuente de ADN apropiada como molde. Para la manipulación génica que debía llevarse a cabo posteriormente, se añadió un sitio cortado por un enzima de restricción al extremo del cebador.
Entre las secuencias de nucleótidos de transposón Tol1 no autónomo mostradas en la SEC ID n° 13 del Listado de secuencias (documento n° WO2008/072540), se utilizó la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1 y 200 (secuencias Tol1-L) (SEC ID n° 14) y la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1.351 y 1.855 (secuencia Tol1-R) (SEC ID n° 15) como las secuencias de transposón.
Cada uno de los fragmentos de ADN sintético que comprendía cada par de secuencias de transposón se preparó mediante el procedimiento siguiente. Se preparó un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos en el que estaba conectada una secuencia de reconocimiento del enzima de restricción NruI tanto con el extremo 5'-terminal como con el extremo 3'-terminal de la secuencia Tol1-R. A continuación, un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos en la que estaba conectada una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción Fsel con el extremo 5'-terminal de la secuencia de Tol1-L y un sitio de enzima de restricción AscI que estaba conectado con el extremo 3'-terminal del mismo.
A continuación, los fragmentos de ADN preparados de esta manera que comprendían la secuencia de Tol1-R y la secuencia de Tol1-L se insertaron en el vector de expresión N5LG1-M2-Z3. El fragmento de ADN que comprendía la secuencia de Tol1-R se insertó en el sitio del enzima de restricción NruI del vector N5LG1-M2-Z3, presente en el lado 5'-terminal de un fragmento génico que comprendía el casete de expresión génica del anticuerpo y un gen marcador de resistencia, y el fragmento de ADN que comprendía la secuencia de Tol1-L se insertó en los sitios de los enzimas de restricción Fsel y AscI presentes en el lado 3'-terminal.
Además, se construyó un vector transposón Tol1 para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humana (figura 5) mediante la inserción de un casete de expresión génica de resistencia a cicloheximida conectado con un gen de resistencia a cicloheximida (un gen en el que la prolina en la posición 54 de la proteína ribosómica humana L36a se ha mutado a glutamina) en el sitio de reconocimiento Fsel del vector N5LG1-M2-Z3 conectado con la secuencia del transposón Tol1, bajo el control del intensificador/promotor de CMV.
[Ejemplo 5]
Preparación de vector de expresión de transposasa Tol1
La transposasa se expresó utilizando un vector de expresión independiente del vector de expresión del anticuerpo de interés. Es decir, un casete de expresión génica de la transposasa Tol1 conectado con un fragmento de ADN codificante de una transposasa Tol1 derivada de pez medaka que contenía la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 16 del Listado de secuencias se insertó en pBluescriptlI SK (+) (fabricado por Stratagene) bajo el control del intensificador/promotor de CMV y se utilizó como vector de expresión pTol1-asa (figura 6).
[Ejemplo 6]
(1) Preparación de célula de CHO productora de anticuerpo
El vector transposón Tol1 para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana (en adelante denominado vector transposón Tol1) y el vector de expresión de transposasa Tol1 pTol1-asa de los Ejemplos 4 y 5 se utilizaron como los vectores de expresión. Además, la célula de CHO-K1 preparada mediante la adaptación al cultivo en suspensión de la misma manera que en el Ejemplo 3(1) se utilizó como la célula.
Los vectores de expresión anteriormente mencionados se introdujeron en la célula de CHO-K1 adaptada al cultivo en suspensión y se midió la frecuencia de obtención de clones resistentes a cicloheximida. La célula de CHO-K1 adaptada al cultivo en suspensión (4x106 células) se suspendió en 400 pl de PBS y el vector transposón Tol1 para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana (10 pg) y el vector de expresión de la transposasa Tol1 (50 pg) se cotransfectaron directamente en forma de ADN circular mediante electroporación. Con el fin de llevar a cabo la expresión transitoria de la transposasa Tol1, el vector de expresión de la transposasa Tol1 se introdujo directamente en forma de ADN circular con el fin de evitar la integración en el cromosoma del hospedador.
La electroporación se llevó a cabo utilizando una cubeta de 4 mm de anchura de hueco (fabricada por Bio-Rad), utilizando un electroporador (Gene Pulser Xcell System (fabricado por Bio-Rad)) bajo las condiciones de 300 V de voltaje, 500 pF de capacidad electrostática y a temperatura ambiente.
Después de la transfección mediante electroporación, se sembró cada célula en dos placas de 96 pocilios y se cultivaron en un incubador de CO2 durante 3 días utilizando el medio EX-CELl 325-PF (fabricado por sAfC Biosciences) para la célula de CHO. A continuación, desde el día de intercambio de medio el 4° día de la transfección, se añadieron 3 pg/ml de cicloheximida al medio de manera que se cultivaron las células en presencia de cicloheximida, seguido del cultivo durante 3 semanas, llevando a cabo simultáneamente el intercambio de medio cada semana.
Tras cultivar durante 3 semanas, se realizó el recuento del número de pocillos en los que se encontraron colonias resistentes a cicloheximida. Se muestran los resultados en la Tabla 3. Cada uno de los ensayos 1 a 3 en la Tabla 3 muestra el resultado de llevar a cabo la transferencia génica en tres ocasiones.
ÍTabla 31
Vector transposón Tol1
Ensayo 1 133/ 192
Ensayo 2 67 / 192
Ensayo 3 122/ 192
Tal como se muestra en la Tabla 3, al introducir el vector transposón Tol1 para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana en la célula de CHO-K1 en suspensión, se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida a una frecuencia elevada de manera similar al Ejemplo 3, en el que se había introducido el vector transposón Tol2 para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana.
Se encontró, basándose en estos resultados, que el gen de anticuerpo y el gen de resistencia a cicloheximida insertados entre un par de secuencias de transposón se transducían eficientemente al interior del cromosoma de la célula hospedadora, es decir, la célula de mamífero en suspensión también en el caso de la utilización del transposón Tol1
(2) Examen de la producción de anticuerpo por la célula de CHO-K1 en suspensión
Se examinó la eficiencia de la producción de anticuerpo de la célula de CHO-K1 en suspensión utilizando la célula de CHO-K1 en suspensión. El vector transposón para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana (10 pg) y el vector de expresión de transposasa Tol1 (50 pg) se introdujeron mediante electroporación en la célula de CHO-K1 en suspensión adaptada al cultivo en suspensión.
Después, se sembraron las células en dos placas de 96 pocillos respectivas y se cultivaron durante 3 días en un incubador de CO2 utilizando el medio de cultivo en suspensión EX-CELl 325-PF. A partir del intercambio de medio el 4° día posterior a la electroporación, se cultivaron las células durante 3 semanas en presencia de 3 pg/ml de cicloheximida. En este caso, se llevó a cabo el intercambio de medios cada semana.
Para la célula de CHO-K1 en suspensión, se sembraron 1x106 células en una placa de 6 pocillos y se cultivaron bajo agitación en un incubador de CO2 durante 3 días y se midió la cantidad de proteína anticuerpo anti-M2 de influenza humana mediante HPLC utilizando el sobrenadante del cultivo.
Se midió la concentración del anticuerpo en el sobrenadante de cultivo siguiendo el procedimiento descrito en Yeast Res. 7:1307-1316, 2007. Se muestran los resultados en la figura 7.
Tal como se muestra en la figura 7, se obtuvo un gran número de células que mostraban un nivel de expresión de anticuerpo marcadamente elevado en el caso de que se utilizase también el transposón Tol1. A partir de este resultado se encontró que, de manera similar al caso de la utilización de la secuencia de nucleótidos derivada del transposón Tol2, también podía obtenerse una célula de mamífero en suspensión capaz de expresar a nivel elevado la proteína de interés al utilizar una secuencia de nucleótidos derivada del transposón Tol1 como la secuencia de transposón.
La presente solicitud se basa en la solicitud japonesa n° 2009-140626, presentada el 11 de junio de 2009 y en la solicitud provisional de patente US n° 61/186.138, presentada el 11 de junio de 2009.
Aplicabilidad industrial
Mediante el procedimiento para producir la proteína de la presente invención, puede producirse eficientemente una proteína de interés utilizando una célula de mamífero en suspensión. La célula de la presente invención puede utilizarse como célula productora de proteína para la producción de una proteína recombinante.
Texto libre del listado de secuencias
SEC ID n° 1. Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de transposón Tol2 no autónomo

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión de proteína (a) que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 representadas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 representadas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3, en una célula de CHO en suspensión apta para sobrevivir y proliferar en un medio sin suero; introducir un vector de expresión (b) que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta una actividad de transferir un fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma en la célula de CHO; integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO para obtener dicha célula de CHO apta para expresar la proteína de interés; y cultivar en suspensión la célula de CHO.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende:
(A) introducir simultáneamente los vectores de expresión (a) y (b) en la célula de CHO,
(B) expresar de manera transitoria la transposasa a partir del vector de expresión introducido en la etapa (A) para integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO para obtener dicha célula de CHO en suspensión apta para expresar la proteína de interés, y
(C) cultivar en suspensión la célula de CHO en suspensión apta para expresar la proteína de interés obtenida en la etapa (B) para producir la proteína de interés.
3. Procedimiento para obtener una célula de CHO en suspensión apta para expresar una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 representadas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 representadas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3, en una célula de CHO en suspensión apta para sobrevivir y proliferar en un medio sin suero; introducir un vector de expresión (b) que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta una actividad de transferir un fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma en la célula de CHO; e integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón, en un cromosoma de la célula de CHO.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula de CHO es por lo menos una seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a cicloheximida.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a cicloheximida es un gen que codifica un mutante de la proteína ribosómica humana L36a.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el mutante es un mutante en el que la prolina en la posición 54 de la proteína ribosómica humana L36a se sustituye con otro aminoácido.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el otro aminoácido es la glutamina.
9. Célula de CHO en suspensión apta para sobrevivir y proliferar en un medio sin suero y para producir una proteína de interés, comprendiendo dicha célula un vector de expresión (a) que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 representadas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 representadas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3 y un vector de expresión (b) que comprende un ADN que codifica una transposasa (una transferasa) que reconoce las secuencias de transposón y presenta una actividad de transferir el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma para integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO.
10. Célula según la reivindicación 9, en la que la célula de CHO es por lo menos una seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.
11. Célula según la reivindicación 9 o 10, en la que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a cicloheximida.
12. Célula según la reivindicación 11, en la que el gen de resistencia a cicloheximida es un gen que codifica un mutante de la proteína ribosómica humana L36a.
13. Célula según la reivindicación 12, en la que el mutante es un mutante en el que la prolina en la posición 54 de la proteína ribosómica humana L36a se sustituye con otro aminoácido.
14. Célula según la reivindicación 13, en la que el otro aminoácido es la glutamina.
15. Utilización de un vector de expresión de proteína (a) que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y, en ambos extremos del fragmento génico, un par de secuencias de transposón que son las secuencias de nucleótidos de Tol1 representadas en SEC ID n° 14 y SEC ID n° 15 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 representadas en SEC ID n° 2 y SEC ID n° 3 y un vector de expresión (b) que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta una actividad de transferir un fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma, para integrar el fragmento génico insertado entre las secuencias de transposón en un cromosoma de una célula de CHO en suspensión apta para sobrevivir y proliferar en un medio sin suero.
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