BR112020012830A2 - terapia genética para distúrbios eosinofílicos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para eosinofilia em um mamífero. Em uma modalidade, a composição é um vetor de terapia genética viral, e uma única dose do vetor reduz os números aumentados de eosinófilos em um mamífero.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIA GENÉTICA PARA DISTÚRBIOS EOSINOFÍLICOS".

[0001] Referência cruzada a pedidos relacionados

[0002] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pe- dido Norte-americano No. 62/612,005, depositado em 29 de dezembro de 2017, cuja divulgação é incorporada a título de referência no presente documento.

[0003] ANTECEDENTES

[0004] Eosinófilos são células granulocíticas derivadas de medula óssea altamente especializadas que têm um papel no combate de pa- rasitas e outros patógenos (Young et al., 2006). Em indivíduos normais, os eosinófilos representam <5% dos glóbulos brancos, com uma conta- gem absoluta de 300-500/μl (Young et al., 2006; Bridgen et al., 1997; Gotlieb et al., 2015; Rothenberg et al., 2006). Os eosinófilos normal- mente persistem na circulação por 8-12 h, sobrevivem nos tecidos por 8-12 dias (Young et al., 2006), e carregam uma variedade de mediado- res citotóxicos nos grânulos citoplasmáticos, incluindo proteína básica principal, proteína catiônica, peroxidase e neurotoxina, e podem liberar espécies reativas de oxigênio, mediadores lipídicos, enzimas destruti- vas e uma variedade de citoquinas (Rothenberg et al., 2006; Bandiera- Melo et al., 2002; Hogan et al., 2008; Horuichi et al., 1997; Kato et al., 2005; Lacy, 2005; Park et al., 2010; Saito et al., 2004; Song et al., 2009; Song et al.,2009; Trulson et al., 2007). Se os eosinófilos invadem tecidos em números suficientes, eles são capazes de causar danos aos órgãos e disfunção significativa (Rothenberg et al., 2006; Bandiera-Melo et al., 2002; Hogan et al., 2008; Horuichi et al., 1997; Kato et al., 2005; Lacy, 2005; Saito et al., 2004; Song et al., 2009; Song et al.,2009; Trulson et al., 2007; Zimmermann et al., 2008; Bolus et al., 2015; Gleiche t al., 1986; Morgan et al., 2005; Slifman et al., 1986; Venge et al., 1999; Zheu- tlin et al., 1984). Existe uma variedade de distúrbios hipereosinofílicos primários e secundários caracterizados pela elevação crônica dos níveis de eosinófilos no sangue, invasão de órgãos com eosinófilos, e danos associados aos órgãos (Curtis et al., 2016; Falchi et al., 2015; Gotlib et al., 2012; Helbing et al., 2012; Reiter et al. 2017; Roufosse et al., 2012; Tefferi et al, 2006; Valent et al., 2012).

[0005] Sumário

[0006] A presente divulgação se refere a terapia genética in vivo para tratar distúrbios eosinofílicos, por exemplo, cânceres tais como leu- cemias incluindo porém sem se limitar a leucemia eosinofílica crônica - não especificada (CEL-NOS), um distúrbio maligno fatal que representa uma necessidade médica não atendida sem terapia eficaz. CEL-NOS, uma leucemia eosinofílica crônica do subtipo adulto com elevação per- sistente de eosinófilos no sangue >1.5x103/μL de causa desconhecida, é caracterizada pela disfunção de órgãos infiltrados com eosinófilos. CEL-NOS não responde a qualquer terapia. Uma vez que a patogênese é desconhecida, a terapia mais direta para CEL-NOS é suprimir o nú- mero de eosinófilos no sangue, suprimindo assim a invasão de eosinó- filos no tecido e a disfunção dos órgãos. Em uma modalidade, uma te- rapia genética para distúrbios eosinofílicos tal como CEL-NOS é provida a qual usa um vetor viral adenoassociado (AAV) que codifica um mono- clonal Anti-Eosinófilo. Em uma modalidade, o AAV é AAVrh.10mAnti- Eos (LEXm03), um vetor de sorotipo rh.10 AAV administrado de forma intravenosa a células geneticamente modificadas tais como hepatócitos hepáticos para expressar e secretar em uma modalidade, um monoclo- nal Anti-Eosinófilo específico de murinos que induz a apoptose eosino- fílica em murinos. Para avaliar a eficácia de LEXm03, um modelo de camundongo CEL-NOS foi preparado usando um outro vetor AAV (AA- Vrh.10mIL5) administrado de forma intravenosa para modificar geneti- camente o fígado para secretar persistentemente altos níveis de inter- leucina-5 de murino (IL5), que por sua vez, estimula a medula óssea a gerar persistentemente altos níveis de eosinófilos no sangue (>100,000 eosinófilos/μL), com infiltração eosinofílica no tecido e eventualmente morte. Os dados demonstram que LEXm03 induz a apoptose de eosi- nófilos in vitro e in vivo, e reduz acentuadamente os níveis de eosinófilos no sangue no modelo de CEL-NOS no camundongo. Ainda que CEL- NOS seja incomum, existem muitos distúrbios hipereosinofílicos para os quais a estratégia de LEXm03 é aplicável conforme divulgado no pre- sente documento. Além do mais, a estratégia pode ser usada com ou- tros monoclonais Anti-Eosinófilos que induzem a apoptose eosinofílica. O uso da administração intravenosa de vetores tais como LEXm03 para modificar geneticamente as células tais como hepatócitos para secretar o anticorpo monoclonal Anti-Eosinófilo permite a supressão significativa de níveis de eosinófilos no sangue, com invasão reduzida de eosinófilos no tecido e reduzida morbidez e mortalidade.

[0007] Em uma modalidade, a divulgação provê um método de pre- venção, inibição ou tratamento de uma doença ou distúrbio hipereosi- nofílico em um mamífero. O método inclui administrar ao mamífero uma composição compreendendo um vetor de expressão que codifica um anticorpo que liga eosinófilos ou liga uma molécula que aumenta o nú- mero de eosinófilos ou aumenta a taxa de maturação dos mesmos, em uma quantidade eficaz para prevenir, inibir ou tratar um ou mais sinto- mas do distúrbio hipereosinofílico no mamífero. Em uma modalidade, o mamífero é um humano. Em uma modalidade, a doença é câncer. Em uma modalidade, o vetor de expressão é um plasmídeo. Em uma mo- dalidade, o vetor de expressão é parte de um vírus, por exemplo, um adenovírus, lentivírus, retrovírus ou vírus adenoassociado . Em uma mo- dalidade, a composição compreende um vírus adenoassociado compre- endendo o vetor de expressão. Em uma modalidade, o AAV é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh10. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico, scFv, humani- zado ou totalmente humano.

Em uma modalidade, o vetor de expressão codifica um anticorpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:1 ou 2, ou uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido com qualquer uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51, ou qualquer combinação de sequências na região variável ou CDRs das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40- 41, 43-44 ou 46-51. Em uma modalidade, o vetor de expressão codifica um anticorpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:1, ou a um polipeptídeo tendo qualquer uma das SEQ ID Nos. 9- 22, 33, 36-37, 39, 42 ou 45-48, e tem uma região constante de IgG.

Em uma modalidade, o vetor de expressão codifica um anticorpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:2, ou a um polipeptídeo tendo qualquer uma das SEQ ID Nos. 22-32, 34-35, 38, 40- 41, 43-44 ou 49-51, e tem uma região constante de cadeia leve lambda.

Em uma modalidade, o vetor de expressão codifica um anticorpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:2, ou a um polipeptídeo tendo qualquer uma das SEQ ID Nos. 22-32, 34-35, 38, 40- 41, 43-44 ou 49-51, e tem uma região constante de cadeia leve kappa.

Em uma modalidade, o vetor de expressão codifica um anticorpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade da sequência de aminoácido com um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:5, 6 ou 8, ou qualquer combinação das SEQ ID NO:5, 6 ou 8. Em uma modali- dade, o vetor de expressão codifica um anticorpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:5, 6 ou 8, e tem uma re- gião constante de IgG. Em uma modalidade, o vetor de expressão codi- fica um anticorpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identi- dade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:5, 6 ou 8, e tem uma região constante de cadeia leve lambda. Em uma modalidade, o vetor de expressão codifica um anti- corpo com uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:5, 6 ou 8, e tem uma região constante de cadeia leve kappa. Em uma modalidade, a composição é administrada sistemicamente. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, por exemplo, substituições conservadoras ou não conservadoras, ou uma combinação das mesmas, em uma sequência framework, uma ou mais CDRs, ou ambas, em uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51.

[0008] Em uma modalidade, um método de inibição ou tratamento de uma doença ou distúrbio hipereosinofílico, por exemplo, inibição ou tratamento de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio hipere- osinofílico, em um mamífero é provido. O método inclui administrar ao mamífero uma composição compreendendo um vetor de expressão viral que compreende uma faze de leitura aberta codificando um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos, em uma quantidade eficaz para inibir ou tratar a doença ou distúrbio hipereosi- nofílico no mamífero. Em uma modalidade, o mamífero é um humano. Em uma modalidade, a doença é câncer, asma, esofagite, eosinofilia pulmonar tropical, uma doença alérgica ou atópica, gastroenterite, uma doença hepatobiliar, meningite, uma doença cardíaca, um distúrbio ge- nitourinário, uma imunodeficiência, um distúrbio endocrinológico, um distúrbio pulmonar, uma doença de pele, artrite reumatoide ou vasculite.

Em uma modalidade, o câncer é leucemia.

Em uma modalidade, a quan- tidade administrada, por exemplo, uma dose única, reduz o número, mas não elimina eosinófilos no mamífero.

Em uma modalidade, a quan- tidade administrada reduz o número de eosinófilos em um ou mais teci- dos com hipereosinofilia.

Em uma modalidade, a quantidade é eficaz para reduzir o percentual de eosinófilos no mamífero em pelo menos 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%; 1%; 5%; 10%; 30%; 50%; 60%; 70%; 80% ou até 90%. Em uma modalidade, o vetor de expressão viral é um vetor de vírus adenoassociado ou um vetor de adenovírus.

Em uma modali- dade, o AAV é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh10. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico, scFv, de cadeia pesada única, humanizado ou totalmente humano.

Em uma modalidade, o anticorpo liga um ligante em eosinófi- los, por exemplo, um ligante compreendendo um carboidrato.

Em uma modalidade, o ligante é um membro da família de sialoadesão, por exemplo, uma lectina 8 do tipo Ig de ligação ao ácido siálico.

Em uma modalidade, o vetor de expressão viral codifica um anticorpo compreen- dendo um polipeptídeo compreendendo uma sequência tendo pelo me- nos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptí- deo codificado pela SEQ ID NO:1 ou 2, ou um polipeptídeo compreen- dendo uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a se- quência de aminoácido às SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46- 51, ou uma combinação das mesmas.

Em uma modalidade, o vetor de expressão viral codifica um anticorpo com uma região constante de IgG.

Em uma modalidade, o vetor de expressão viral codifica um anticorpo compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma região constante de cadeia leve lambda.

Em uma modalidade, o vetor de expressão co- difica um anticorpo compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma região constante de cadeia leve kappa.

Em uma modalidade, a composição é administrada sistemicamente.

Em uma modalidade, a composição é administrada de forma intravenosa.

Em uma modalidade, a composição é administrada ao sistema nervoso central ou de forma intracraniana.

Em uma modalidade, o anticorpo é expressado a partir de um promotor viral endógeno.

Em uma modalidade, o promotor endó- geno é modificado para ser induzível.

Em uma modalidade, o anticorpo é expressado a partir de um promotor endógeno no vetor de expressão viral que é operacionalmente ligado à fase de leitura aberta.

Em uma modalidade, o anticorpo é expressado a partir de um promotor endó- geno.

Em uma modalidade, o promotor endógeno é induzível.

Em uma modalidade, o promotor é induzível com tetraciclina, doxiciclina, minoci- clina (vide, por exemplo, promotores induzíveis por tetraciclina em Ro- driguez-Garcia et al., Nucl.

Acids Res, 33:e87 (2005)), vincristina, rifa- mipicina, doxirrubicina, ou 5-aza citidina, por exemplo, um promotor Mdr-1, proteínas de fusão que têm um domínio de ligação ao ligante e um domínio de ligação ao DNA específico para uma sequência promo- tora ou sequências a montante do promotor, ácido valproico, morfina (por exemplo, um promotor de tirosina hidroxilase), ou quinolona (por exemplo, um promotor de osteopontina). Em uma modalidade, o vetor de expressão viral ainda compreende um gene suicida.

Em uma moda- lidade, a expressão a partir do vetor é diminuída ou eliminada usando um gene que codifica timidina quinase do vírus do herpes simplex (HSV- tk) e a administração de ganciclovir, um gene que codifica citosina de- saminase opcionalmente em combinação com uracil fosforibosiltransfe- rase e a administração de 5-fluorocitosina, um gene que codifica nitro- redutase e a administração de 5-(azaridin-1-il)-2,4-dinitrobenzamida.

Outros sistemas incluem timidina quinase do vírus Varicella-Zoster (VZV-tk), purina nucleosídeo fosforilase (PNP), carboxipeptidase A, car- boxipeptidase G2, linamarase, beta-balatosidase, ou citocromo hepático P450-2B1.

[0009] Também é provido um vírus recombinante isolado compre- endendo um vetor de expressão que codifica um anticorpo direcionado contra eosinófilos. Em uma modalidade, o anticorpo tem uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:1 ou 2, ou ambas, ou tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8- 32, 40-41, 43-44 ou 46-51, ou uma combinação das mesmas, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do ví- rus recombinante. Em uma modalidade, o vírus é um vírus adenoasso- ciado recombinante (AAV). Em uma modalidade, a quantidade de AAV na composição, ou em uma série de doses que é administrada, é de cerca de 1 x 1010 a 1 x 1020 cópias do genoma, por exemplo, cerca de 1 x 1012 a 1 x 1015, cerca de 1 x 1014 a 1 x 1016, cerca de 1 x 1016 a 1 x 1018 ou cerca de 1 x 1015 a 1 x 1019 cópias de genoma.

[0010] Em uma modalidade, alvos exemplificadores para anticorpos úteis nas composições e métodos incluem, porém não se limitam a IL- 2, IL-3, IL-4. IL-5, IL-10, IL-12, GM-CSF, IL-13, IL-16, IL-25, IL-27, IL-28, VEGF, angiopoietina-1, PDGF, FGF, TGF-β1, TGF-β2, IFN-α, IFN-γ, RANTES (CCL5), MCP-3 (CCL7), MCP-4 (CCL13), eotaxina (CCL11), eotaxina-2 (CCL24), eotaxina-3 (CCL26), SDF-1 (CXCL12), PAF, fator complementar C3a ou C5a, VIP, fator de sialoadesão ou GC, ou um receptor do mesmo incluindo mas sem se limitar aos receptores do fator de sialoadesão tais como Siglec 8, receptor R do tipo Toll ou CD33. Em uma modalidade, o monoclonal Anti-Eosinófilo é direcionado contra Si- glec-8 humano, um receptor de superfície celular expressado em eosi- nófilos humanos, o qual é um membro da família de lectina do tipo Ig de ligação ao ácido siálico relacionado a CD33. A ligação de Siglec-8 com o monoclonal leva à apoptose do eosinófilo e in vivo à depuração do eosinófilo.

[0011] É ainda provida uma formulação farmacêutica compreen- dendo um AAV isolado recombinante compreendendo um vetor de ex- pressão que codifica um anticorpo direcionado contra eosinófilos, em que o anticorpo tem uma sequência tendo pelo menos 80% de identi- dade com a sequência de aminoácido com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:1 ou 2, ou ambas, ou tem pelo menos 80% de identi- dade sequencial do aminoácido com um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51, ou uma combinação das mesmas. A formulação pode ser usada para inibir ou tratar câncer, por exemplo, cânceres eosinofílicos, ou outras doen- ças hipereosinofílicas.

[0012] Também está provida uma formulação farmacêutica compre- endendo uma quantidade de um lentivírus isolado recombinante, retro- vírus, adenovírus ou AAV compreendendo um vetor de expressão com- preendendo uma fase de leitura aberta que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja pre- sença em um mamífero, aumenta o número de eosinófilos, eficazes para diminuir o número de eosinófilos em um mamífero. Em uma moda- lidade, o anticorpo compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:1 ou 2 ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade sequencial do aminoácido com um polipeptídeo compreen- dendo uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51. Em uma modalidade, o anticorpo liga Siglec-8, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-9, IL- 9R, IL-13, IL-13R, IL-17, IL-17R, IL-33, IL-33R, CD30, CD52, CCR3, IgE Fc, RADCP ou TNF-alfa. Em uma modalidade, a formulação farmacêu- tica é formulada para liberação intravenosa.

[0013] Breve Descrição das Figuras

[0014] Figuras 1A-F. Geração de um modelo murino de CEL-NOS.

O modelo é baseado na administração a camundongos Balb/C do tipo selvagem pela via intravenosa de um vetor de terapia genética AA- Vrh.10 expressando interleucina 5 (IL-5) de murino, a citoquina primária que induz a medula óssea a gerar eosinófilos. A) Esquema do vetor AA- Vrh.10mIL-5. B) Esquema do modelo de camundongo de CEL-NOS. C) níveis séricos de IL5 8 semanas depois da administração intravenosa de AAVrh.10mIL-5. D) Esfregaço de sangue, camundongos Balb/C pu- ros. E) Esfregaço de sangue, 10 semanas depois da administração de AAVrh.10mIL5 demonstrando hipereosinofilia. F) contagem absoluta de eosinófilos no sangue de até 10 semanas em seguida à administração intravenosa de 2,5x1010 gc AAVrh.10mIL-5 mostrando uma carga alta, persistente de eosinófilos no sangue.

[0015] Figura 2. CEL-NOS no esfregaço de sangue.

[0016] Figuras 3A-D. Modelo murino (Balb/c) de CEL-NOS. AA- Vrh.10mIL-5 foi usado para infectar camundongos Balb/c machos (n=4/grupo) na idade de 6-8 semanas, depois da qual os níveis de IL-5 no murino, eosinofilia no sangue e infiltração no órgão por eosinófilos foram avaliados. A) níveis séricos de IL-5 no murino em 8 semanas de- pois da administração. B) contagem absoluta de eosinófilos. C) Esfre- gaço de sangue, camundongo PBS. D) Esfregaço de sangue AA- Vrh.10mIL-5 camundongo infectado 2 semanas pós-infecção.

[0017] Figuras 4A-F. Modelo murino (H&E Balb/c) de CEL-NOS. A) puros, pulmão. B) AAVrh.10mIL-5infectado, pulmão. C) puros, fígado. D) AAVrh.10mIL-5, fígado. E) puros, coração. F) AAVrh.10mIL-5, cora- ção.

[0018] Figuras 5A-B. Expressão de AAVrh.10mAnti-Eos em camun- dongos (Balb/c) do tipo selvagem. AAVrh.10mAnti-Eos (1011 gc, IV) foi administrado a camundongos Balb/c de 6/8 semanas (4 machos e 4 fê- meas) e níveis séricos de IgG2b avaliados. A) Expressão in vivo de AA-

Vrh.10mAnti-Eos. B) Eficácia in vitro demonstrando a indução da apop- tose dos eosinófilos no murino pelo produto do vetor. É mostrada a ava- liação da citometria de fluxo da marcação da lactaderina (marcador de apoptose) dos eosinófilos de camundongo.

[0019] Figura 6. terapia AAVrh.10mAnti-Eos no modelo de CEL- NOS do murino (Balb/c).

[0020] Figuras 7A-D. AAVrh.10mAnti-Eos Reduz os números de eo- sinófilo no modelo murino (Balb/c) de CEL-NOS. A) contagem absoluta de eosinófilos no sangue 10 semanas depois da terapia. B) Apoptose dos eosinófilos in vivo mediada por AAVrh.10mAnti-Eos. C-D). Esfrega- ços de sangue. C) Controle, AAVrh.10mIL-5 (2,5 x 1010 gc), em 10 se- manas. D) AAVrh.10mAnti-Eos (1011 gc) em 10 semanas.

[0021] Figura 8. AAVrh.10mAnti-Eos reduz a mortalidade em mo- delo murino (Balb/c) de CEL-NOS. sobrevivência média AAVrh.10mIL- 5 sozinha, 184 dias, enquanto para AAVrh.10mAnti-Eos foi de 347 dias.

[0022] Figuras 9A-B. modelos murinos de CEL-NOS (Balb/c (A) e NSG (B)).

[0023] Figuras 10A-D. modelo murino (NSG) de CEL-NOS. A) AA- Vrh.10mIL-5 foi usado para infectar camundongos Balb/c machos (n=5/grupo) na idade de 6-8 semanas, depois da qual os níveis de IL-5 em murino e eosinofilia no sangue foram avaliados. B) contagem abso- luta de eosinófilos. C) Esfregaço de sangue, camundongo PBS. D) Es- fregaço de sangue AAVrh.10mIL-5 infectou camundongo 2 semanas pós-infecção.

[0024] Figuras 11A-B. Expressão de AAVrh.10mIL-5 em camundon- gos imunodeficientes (NSG). A) AAVrh.10mIL-5 foi usado para infectar camundongos NSG (n=5/grupo) na idade de 6-8 semanas, depois da qual os níveis de IL-5 em murino (B) foram avaliados.

[0025] Figura 12. Terapia AAVrh.10mAnti-Eos no modelo murino (NSG) de CEL-NOS.

[0026] Figuras 13A-B. Expressão de AAVrh.10mAnti-Eos em ca- mundongos NSG. A) camundongos NSG com 6-8 semanas de idade receberam 1011 gc de AAVrh.10mAnti-Eos e os níveis séricos de IgG2b foram avaliados a partir de 0-12 semana. A) Expressão in vivo. B) Apo- ptose in vitro.

[0027] Figuras 14A-B. AAVrh.10mAnti-Eos Reduz os números de eosinófilos no modelo murino de CEL-NOS (fêmeas NSG). A) Modelo. B) Contagens absolutas de eosinófilos.

[0028] Figuras 15A-B. AAVrh.10mAnti-Eos Reduz os números de eosinófilos no modelo murino de CEL-NOS (machos NSG). A) Modelo. B) Contagens absolutas de eosinófilos.

[0029] Figuras 16A-B. AAVrh.10mAnti-Eos Reduz os números de eosinófilos no modelo murino de CEL-NOS (Machos NSG). A) esfregaço de sangue do controle. B) AAVrh.10mAnti-Eos tratou esfregaço de san- gue.

[0030] Figuras 17A-B. AAVrh.10mAnti-Eos Reduz a mortalidade no modelo murino de CEL-NOS (machos NSG). A) Modelo. B) gráficos de sobrevivência.

[0031] Descrição detalhada

[0032] Na descrição que segue, a referência é feita aos desenhos anexos que formam uma parte dos mesmos, e na qual são mostradas a título de ilustração modalidades específicas que podem ser praticadas. Essas modalidades são descritas em detalhes para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem a invenção, e deve ser compreendido que outras modalidades podem ser utilizadas e que as mudanças lógi- cas podem ser feitas sem partir do escopo da presente invenção. A des- crição que segue das modalidades exemplificadoras não deve, portanto, ser tomada em um sentido limitado, e o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas.

[0033] Definições

[0034] Um “vetor” se refere a uma macromolécula ou associação de macromoléculas que compreendem ou se associam com um polinucle- otídeo, e que podem ser usadas para mediar a liberação do polinucleo- tídeo a uma célula, seja in vitro ou in vivo. Os vetores ilustrativos in- cluem, por exemplo, plasmídeos, vetores virais, lipossomos e outros ve- ículos de liberação genética. o polinucleotídeo a ser liberado, algumas vezes referido como um “polinucleotídeo alvo” ou “transgene” pode com- preender uma sequência codificadora de interesse em terapia genética (tal como um gene codificando uma proteína de interesse terapêutico), uma sequência codificadora de interesse no desenvolvimento da vacina (tal como um polinucleotídeo expressando uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo adequado para elicitar uma resposta imune em um mamí- fero), e/ou um marcador selecionável ou detectável.

[0035] “Transdução”, “transfecção”, “transformação” ou “transduzir” conforme usados no presente documento, são termos que se referem a um processo para a introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo, por exemplo, o transgene na célula, e inclui o uso de vírus recombinante para introduzir o polinucleotídeo exógeno na célula hospedeira. Transdução, transfec- ção ou transformação de um polinucleotídeo em uma célula podem ser determinados por métodos bem conhecidos na técnica incluindo, porém sem se limitar à expressão da proteína (incluindo níveis de estado esta- cionário), por exemplo, através de ELISA, citometria de fluxo e Western blot, medição de DNA e RNA por ensaios de heterologização, por exem- plo, Northern blots, Southern blots e ensaios de mobilidade de troca de gel. Os métodos usados para a introdução do polinucleotídeo exógeno incluem técnicas bem conhecidas tais como infecção ou transfecção vi- ral, lipofecção, transformação e eletroporação, assim como outras téc- nicas de liberação genética não viral. O polinucleotídeo introduzido pode ser estavelmente ou transitoriamente mantido na célula hospedeira.

[0036] “Liberação genética” se refere à introdução de um polinucle- otídeo exógeno em uma célula para terapia genética, e pode ainda abranger direcionamento, ligação, captação, transporte, localização, in- tegração e expressão de replicon.

[0037] “Terapia genética” se refere à introdução de um polinucleotí- deo exógeno em uma célula que pode abranger direcionamento, liga- ção, captação, transporte, localização e integração de replicon, mas é distinta e não implica expressão subsequente do gene.

[0038] “Expressão genética” ou “expressão” se refere ao processo de transcrição, tradução e modificação pós-translacional genética.

[0039] Um vírus ou partícula viral “infecciosa” é uma que compre- ende um componente polinucleotídico que é capaz de liberar em uma célula para a qual a espécie viral é trófica. O termo não necessariamente implica qualquer capacidade de replicação do vírus.

[0040] O termo “polinucleotídeo” se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, incluindo desoxirribonucleo- tídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Um polinucleotí- deo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotí- deos metilados ou capeados e análogos de nucleotídeos, e podem ser interrompidos por componentes não nucleotídicos. Caso presentes, as modificações à estrutura nucleotídica podem ser transmitidas antes ou depois da união do polímero. O termo polinucleotídeo, conforme usado no presente documento, se refere de forma intercambiável a moléculas de filamento duplo e único. A menos que especificado ou requerido de outra forma, qualquer modalidade da invenção descrita no presente do- cumento que é um polinucleotídeo abrange ambas a forma de filamento duplo e cada uma das duas formas de filamento único complementares conhecidas ou previstas por tornar a forma de filamento duplo.

[0041] Um polinucleotídeo “isolado”, por exemplo, plasmídeo, vírus, polipeptídeo ou outra substância se refere à preparação da substância livre de pelo menos alguns dos outros componentes que também podem estar presentes onde a substância ou uma substância similar ocorrem naturalmente ou é inicialmente preparada a partir dela. Sendo assim, por exemplo, uma substância isolada pode ser preparada ao se usar uma técnica de purificação para enriquecê-la a partir de uma mistura inicial. O ácido nucleico isolado, peptídeo ou polipeptídeo está presente em uma forma ou configuração que é diferente daquela na qual é en- contrada na natureza. Por exemplo, uma dada sequência de DNA (por exemplo, um gene) é encontrada no cromossomo da célula hospedeira em proximidade com os genes vizinhos; as sequências de RNA, tais como uma sequência de mRNA específica que codifica uma proteína específica, são encontradas na célula como uma mistura com vários ou- tros mRNAs que codificam uma série de proteínas. A molécula de ácido nucleico isolado pode estar presente de forma com filamento único ou filamento duplo. Quando uma molécula de ácido nucleico isolado deve ser utilizada para expressar uma proteína, a molécula conterá no mí- nimo o filamento senso ou codificador (isto é, a molécula pode ser de filamento único), mas pode conter ambos os filamentos senso e antis- senso (isto é, a molécula pode ser de filamento duplo). O enriqueci- mento pode ser medido em uma base absoluta, tal como peso por vo- lume de solução, ou ele pode ser medido em relação a uma segunda substância potencialmente interferente presente na mistura inicial. É previsto o aumento dos enriquecimentos das modalidades. Sendo as- sim, por exemplo, um aumento de 2 vezes, um aumento de 10 vezes, um aumento de 100 vezes ou um aumento de 1000 vezes.

[0042] Uma “sequência reguladora transcricional” se refere a uma região genômica que controla a transcrição de um gene ou sequência codificadora à qual ela é operacionalmente ligada. As sequências regu- ladoras transcricionais de uso geralmente incluem pelo menos um pro-

motor transcricional e também podem incluir um ou mais intensificado- res e/ou terminadores de transcrição.

[0043] “Operacionalmente ligado” se refere a um arranjo de dois ou mais componentes, em que os componentes assim descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem de uma maneira coorde- nada. A título de ilustração, uma sequência reguladora transcricional ou um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se o TRS ou promotor promover transcrição da sequência codificadora. Um TRS operacionalmente ligado é geralmente unido em cis com a se- quência codificadora, mas não necessariamente está diretamente adja- cente a ele.

[0044] “Heterólogo” significa derivado de uma entidade genetica- mente distinta da entidade à qual ele é comparado. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido pelas técnicas de engenharia genética em um tipo diferente de célula é um polinucleotídeo heterólogo (e, quando expressado, pode codificar um polipeptídeo heterólogo). De forma simi- lar, um elemento regulador transcricional tal como um promotor que é removido da sua sequência codificadora nativa e operacionalmente li- gado a uma sequência codificadora diferente é um elemento regulador transcricional heterólogo.

[0045] Um “terminador” se refere a uma sequência polinucleotídica que tende a diminuir ou impedir a transcrição de leitura (isto é, ele dimi- nui ou impede que a transcrição se origine em uma lateral do terminador continuando ao longo da outra lateral do terminador). O grau no qual a transcrição é interrompida é tipicamente uma função da sequência de base e/ou o comprimento da sequência terminadora. Em particular, como é bem conhecido em vários sistemas biológicos moleculares, as sequências de DNA específicas, geralmente referidas como “sequên- cias de terminação transcricional” são sequências específicas que ten-

dem a interromper a transcrição de leitura por RNA polimerase, presu- midamente fazendo com que a molécula de RNA polimerase pare e/ou se desligue do DNA sendo transcrito. O exemplo típico dos referidos terminadores específicos de sequência incluem sequências de poliade- nilação (“polyA”), por exemplo, SV40 poliA. Além de ou no lugar dos referidos terminadores específicos de sequência, as inserções de se- quências de DNA relativamente longas entre um promotor e uma região codificadora também tende a interromper a transcrição da região codifi- cadora, geralmente em proporção ao comprimento da sequência inter- veniente. Este efeito presumidamente aparece já que sempre há alguma tendência para uma molécula de RNA polimerase em se tornar desli- gada do DNA sendo transcrito, e aumentar o comprimento da sequência a ser atravessada antes de alcançar a região codificadora que geral- mente aumentaria a probabilidade de que o desligamento ocorreria an- tes que a transcrição da região codificadora estivesse completada ou possivelmente ainda iniciada. Os terminadores podem assim impedir a transcrição a partir de apenas uma direção (terminadores “unidirecio- nais”) ou a partir de ambas as direções (terminadores “bidirecionais”), e podem ser compreendidos de sequências de terminação específicas de sequência ou terminadores não específicos de sequência ou ambos. Uma variedade das referidas sequências terminadoras é conhecida na técnica; e usos ilustrativos das referidas sequências dentro do contexto da presente divulgação são providos abaixo.

[0046] “Células hospedeiras”, “linhagens celulares”, “culturas celu- lares”, “linhagem celular acondicionadora” e outros referidos termos de- notam células eucarióticas superiores, tais como células de mamífero incluindo células humanas, úteis na presente divulgação, por exemplo, para produzir vírus recombinante ou polipeptídeo de fusão recombi- nante. Essas células incluem a progênie da célula original que foi trans- duzida. Compreende-se que a progênie de uma célula única pode não necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento genômico) à célula parental original.

[0047] “Recombinante” conforme aplicado a um polinucleotídeo sig- nifica que o polinucleotídeo é o produto de várias combinações de eta- pas de clonagem, restrição e/ou ligação, e outros procedimentos que resultam em um construto que é distinto a partir de um polinucleotídeo encontrado na natureza. Um vírus recombinante é uma partícula viral compreendendo um polinucleotídeo recombinante. Os termos respecti- vamente incluem réplicas do construto do polinucleotídeo original e a progênie do construto do vírus original.

[0048] Um “elemento de controle” ou “sequência de controle” é uma sequência nucleotídica envolvida em uma interação de moléculas que contribui para a regulação funcional de um polinucleotídeo, incluindo re- plicação, duplicação, transcrição, divisão, tradução ou degradação do polinucleotídeo. A regulação pode afetar a frequência, velocidade ou es- pecificidade do processo, e pode ser intensificadora ou inibidora em na- tureza. Os elementos de controle conhecidos na técnica incluem, por exemplo, sequências reguladoras transcricionais tais como promotores e intensificadores. Um promotor é uma região de DNA capaz sob certas condições de ligar RNA polimerase e iniciar transcrição de uma região codificadora geralmente localizada a jusante (na direção 3') a partir do promotor. Os promotores incluem promotores de AAV, por exemplo, promotores de P5, P19, P40 e AAV ITR, assim como promotores hete- rólogos.

[0049] Um “vetor de expressão” é um vetor compreendendo uma região que codifica um produto genético de interesse, e é usado para efetivar a expressão do produto genético em uma célula alvo pretendida. Um vetor de expressão também compreende elementos de controle operacionalmente ligados à região de codificação para facilitar a expres- são da proteína no alvo. A combinação de elementos de controle e um gene ou genes aos quais eles são operacionalmente ligados para ex- pressão é algumas vezes referido como um “cassete de expressão”, um grande número é conhecido e disponível na técnica ou pode ser facil- mente construído a partir de componentes que estão disponíveis na téc- nica.

[0050] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados aqui de forma intercambiável para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, acetilação, fosfonilação, lipidação, ou conjuga- ção com um componente marcador.

[0051] O termo "exógeno" quando usado em relação a uma prote- ína, gene, ácido nucleico ou polinucleotídeo em uma célula ou orga- nismo se refere a uma proteína, gene, ácido nucleico ou polinucleotídeo que foi introduzida na célula ou organismo por meios artificiais ou natu- rais. Um ácido nucleico exógeno pode ser de um organismo ou célula diferente, ou pode ser uma ou mais cópias adicionais de um ácido nu- cleico que ocorre naturalmente dentro do organismo ou célula. Por meio de um exemplo não limitante, um ácido nucleico exógeno está em um local cromossômico diferente daquele de células naturais, ou é flanque- ado de outra forma por uma sequência de ácido nucleico diferente da- quela encontrada na natureza, por exemplo, um cassete de expressão que liga um promotor a partir de um gene a uma fase de leitura aberta para um produto genético a partir de um gene diferente.

[0052] "Transformado" ou "transgênico" é usado no presente docu- mento para incluir qualquer célula hospedeira ou linhagem celular, que foi alterada ou aumentada pela presença de pelo menos uma sequência de DNA recombinante. As células hospedeiras são tipicamente produzi- das por transfecção com uma sequência de DNA em um vetor de ex- pressão de plasmídeo, como uma sequência de DNA linear isolada, ou infecção com um vetor viral recombinante.

[0053] O termo “homologia sequencial” significa a proporção das compatibilidades de base entre duas sequências de ácido nucleico ou a proporção de compatibilidades de aminoácido entre duas sequências de aminoácido. Quando a homologia sequencial é expressada como uma porcentagem, por exemplo, 50%, a porcentagem denota a propor- ção de compatibilidades sobre o comprimento de uma sequência sele- cionada que é comparada a uma outra sequência. Gaps (em qualquer uma das duas sequências) são permitidos para maximizar a compatibi- lidade; os comprimentos dos gaps de 15 bases ou menos são geral- mente usados, 6 bases ou menos são preferidas com 2 bases ou menos mais preferidas. Quando se usam oligonucleotídeos como sondas ou tratamentos, a homologia sequencial entre o ácido nucleico alvo e a se- quência oligonucleotídica é geralmente de não menos do que 17 com- patibilidades de base alvo das 20 possíveis compatibilidade de pares de base nucleotídica (85%); não menos do que 9 compatibilidades das 10 de compatibilidades de pares de base possíveis (90%), ou não menos do que 19 compatibilidades das 20 de compatibilidades de pares de base possíveis (95%).

[0054] Duas sequências de aminoácido são homólogas caso haja uma identidade parcial ou completa entre as suas sequências. Por exemplo, 85% de homologia significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências são alinhadas para compatibili- dade máxima. Gaps (em qualquer uma das duas sequências sendo compatíveis) são permitidos na maximização da compatibilidade; os comprimentos do gap de 5 ou menos são preferidos com 2 ou menos sendo mais preferidos. Alternadamente, duas sequências de proteína (ou sequências de polipeptídeo derivadas delas de pelo menos 30 ami- noácidos de comprimento) são homólogas, como este termo é usado no presente documento, caso elas tenham uma classificação de alinha- mento de mais do que 5 (em unidades de desvio padrão) usando o pro- grama ALIGN com a matriz dos dados de mutação e uma penalização de gap de 6 ou maior. As duas sequências ou partes das mesmas são mais homólogas se os seus aminoácidos forem maiores do que ou iguais a 50% idênticos quando opcionalmente alinhadas usando o pro- grama ALIGN.

[0055] O termo “corresponde a” é usado no presente documento para significar que a sequência polinucleotídica está estruturalmente re- lacionada a todas ou a uma porção de uma sequência polinucleotídica de referência, ou que uma sequência polipeptídica é estruturalmente re- lacionada a todas ou uma porção das (por exemplo, sequência(s) fra- mework ou sequência(s) CDR uma sequência polipeptídica de referên- cia, por exemplo, elas têm pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, identidade sequencial. Em oposição, o termo “complementar a” é usado no presente docu- mento para significar que a sequência complementar é homóloga a to- das ou uma porção de uma sequência polinucleotídica de referência. Para ilustração, a sequência nucleotídica “TATAC” corresponde a uma sequência de referência “TATAC” e é complementar a uma sequência de referência “GTATA”.

[0056] O termo “identidade sequencial” significa que duas sequên- cias polinucleotídicas são idênticas (isto é, em uma base nucleotídeo por nucleotídeo) sobre a janela de comparação. O termo “porcentagem de identidade sequencial” significa que duas sequências polinucleotídi- cas são idênticas (isto é, na base nucleotídeo por nucleotídeo) sobre a janela de comparação. O termo “porcentagem de identidade sequencial” é calculado pela comparação de duas sequências opcionalmente ali- nhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de po- sições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T,

C, G, U ou I) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tama- nho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para render a por- centagem de identidade sequencial. Os termos “identidade substancial” conforme usado no presente documento denotam uma característica da sequência polinucleotídica, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 85 por cento de identidade sequencial, preferivelmente pelo menos 90 a 95 por cento de identidade sequencial, mais frequentemente pelo menos 99 por cento de identidade sequencial conforme comparado com uma sequência de referência sobre uma ja- nela de comparação de pelo menos 20 posições nucleotídicas, frequen- temente sobre uma janela de pelo menos 20-50 nucleotídeos, em que a porcentagem de identidade sequencial é calculada pela comparação da sequência de referência à sequência polinucleotídica que pode incluir deleções ou adições que totalizam 20 por cento da ou menos da se- quência de referência sobre a janela de comparação.

[0057] Substituições “conservadoras” de aminoácidos são, por exemplo, ácido aspártico-glutâmico como aminoácidos acídicos pola- res; lisina/arginina/histidina como aminoácidos básicos polares; leu- cina/isoleucina/metionina/valina/alanina/glicina/prolina como aminoáci- dos não polares ou hidrofóbicos; serina/treonina como aminoácidos hi- drofílicos polares ou não carregados. A substituição conservadora de aminoácidos também inclui agrupamentos com base em cadeias late- rais. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais ali- fáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de ami- noácidos tendo cadeias laterais alifáticas-hidroxila é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é as- paragina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Por exemplo, é razoável esperar que a substituição de uma leucina com isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito prin- cipal sobre as propriedades do polipeptídeo resultante. Se uma mu- dança de aminoácidos resulta em um polipeptídeo funcional pode ser prontamente determinada testando-se a atividade específica do polipep- tídeo. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicos: nor- leucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) acídicos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos; trp, tyr, phe.

[0058] A divulgação também contempla polipeptídeos com substi- tuições não conservadoras. As substituições não conservadoras acar- retam a troca de um elemento de uma das classes descritas acima para outra.

[0059] A “sequência de ácido nucleico” que pretende abranger um polímero de DNA ou RNA, isto é, um polinucleotídeo, que pode ser de filamento simples ou de filamento duplo e que pode conter nucleotídeos não naturais ou alterados. Os termos “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” conforme usado no presente documento se referem a uma forma poli- mérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotí- deos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA). Esses termos se referem à estrutura primária da molécula, e assim incluem DNA de filamento du- plo e DNA de filamento único, e RNA de filamento duplo e único. Os termos incluem, como equivalentes, análogos seja de RNA ou DNA fei- tos de análogos de nucleotídeo e polinucleotídeos modificados tais como, embora não limitados a, polinucleotídeos metilados e/ou capea- dos.

[0060] A sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que forma um anticorpo direcionado contra eosinófilos ou uma molécula que aumenta o número de eosinófilos

[0061] Um versado na técnica compreenderá que um anticorpo con- siste de quatro polipeptídeos: duas cópias idênticas de um polipeptídeo de cadeia pesada (H) e duas cópias de um polipeptídeo de cadeia leve (L). Cada uma das cadeias pesadas contém uma região variável (VH) N-terminal (VH) e três regiões constantes (CH1, CH2 e CH3) C-termi- nais, e cada cadeia leve contém uma região variável (VL) N-terminal e uma região constante (CL) C-terminal. As regiões variáveis de cada par de cadeias leve e pesada formam o sítio de ligação de antígeno de um anticorpo. A sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja pre- sença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos (um anticorpo “Anti-Eosinófilo”) pode compreender uma ou mais sequências de ácido nucleico, cada uma delas codifica um ou mais dos polipeptídeos de ca- deia pesada e/ou polipeptídeos de cadeia leve de um anticorpo Anti- Eosinófilo. A esse respeito, a sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos pode compreender uma única sequência de ácido nucleico que codifica os dois polipeptídeos de cadeia pesada e os dois polipeptídeos de ca- deia leve de um anticorpo Anti-Eosinófilo. Alternadamente, a sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, au- menta o número de eosinófilos pode compreende uma primeira sequên- cia de ácido nucleico que codifica ambos os polipeptídeos de cadeia pesada de um anticorpo Anti-Eosinófilo, e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica ambos os polipeptídeos de cadeia leve de um anticorpo Anti-Eosinófilo. Em ainda uma outra modalidade, a se- quência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no ma- mífero, aumenta o número de eosinófilos pode compreender uma pri- meira sequência de ácido nucleico codificando um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada de um anticorpo Anti-Eosinófilo, uma segunda se- quência de ácido nucleico codificando um segundo polipeptídeo de ca- deia pesada de um anticorpo Anti-Eosinófilo, uma terceira sequência de ácido nucleico codificando um primeiro polipeptídeo de cadeia leve de um anticorpo Anti-Eosinófilo, e uma quarta sequência de ácido nucleico codificando um segundo polipeptídeo de cadeia leve de um anticorpo Anti-Eosinófilo.

[0062] Em uma outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos que codificam um fragmento de ligação ao antígeno (também referido como um “fragmento de anticorpo”) de um anticorpo Anti-Eosi- nófilo. O termo “fragmento de ligação ao antígeno” se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de especifi- camente se ligar a um antígeno (por exemplo, eosinófilo). Os exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem porém não se limitam a (i) um fragmento Fab, que é um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, que é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; e (iii) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de uma única ramificação de um anticorpo. Em uma modalidade, A sequência de ácido nucleico que codifica um anti- corpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos pode compreender a sequência de ácido nucleico codificando um fragmento Fab de um anticorpo Anti-Eosinófilo.

[0063] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser obtido por qualquer meio, incluindo fontes in vitro (por exemplo, um hibridoma ou uma linhagem celular produzindo um anti- corpo de forma recombinante) e fontes in vivo (por exemplo, roedores). Os métodos para geração de anticorpos são conhecidos na técnica e estão descritos em, por exemplo, Köhler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5:511 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); e C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Em certas modalidades, um anticorpo humano ou um anticorpo quimérico podem ser gerados usando um animal transgênico (por exemplo, um camundongo) em que um ou mais genes de imunoglobulina endógenos são substituídos com um ou mais genes de imunoglobulina humana. Exemplos de camundon- gos transgênicos em que os genes de anticorpo endógeno são efetiva- mente substituídos com genes de anticorpo humano incluem, porém não se limitam ao HUMAB-MOUSE™, o Kirin TC MOUSE™, e o KM- MOUSE™ (vide, por exemplo, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9):1117 (2005), e Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181:69 (2008)).

[0064] A sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja pre- sença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser gerado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências de ácido nucleico, po- lipeptídeos e proteínas podem ser produzidos de forma recombinante usando metodologia de DNA recombinante padrão (vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994). Além disso, uma sequência de ácido nucleico produzida sinteticamente que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos, ou um fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, pode ser isolada e/ou purificada a partir de uma fonte, tal como uma bactéria, um inseto ou um mamífero, por exem- plo, um rato, um humano, etc. Os métodos de isolamento e purificação são bem conhecidos na técnica. Alternadamente, as sequências de ácido nucleico descritas no presente documento podem ser comercial- mente sintetizadas. A este respeito, a sequência de ácido nucleico pode ser sintética, recombinante, isolada e/ou purificada.

[0065] A sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja pre- sença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos pode ser identifi- cado por extração de RNA do anticorpo disponível que produz células de hibridoma. O cDNA é produzido por transcrição inversa e amplifica- ção por PCR das cadeias leve e pesada e é realizado utilizando-se uma estratégia de amplificação rápida das extremidades de cDNA (RACE) em combinação com iniciadores específicos para regiões conservadas nos domínios constantes.

[0066] A sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja pre- sença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos também pode ser totalmente ou parcialmente humanizada por meios conhecidos na téc- nica. Por exemplo, uma quimera de anticorpo pode ser criada pela subs- tituição de DNA que codifica a região Fc de camundongo do anticorpo com aquela da codificação de cDNA para o humano.

[0067] A porção Fab da molécula também pode ser humanizada al- terando seletivamente o DNA de porções não-CDR da sequência Fab que diferem daquelas em seres humanos através da troca das sequên- cias para os aminoácidos individuais apropriados.

[0068] Alternadamente, a humanização pode ser conseguida pela inserção dos segmentos de codificação CDR apropriados em uma “es- trutura” de anticorpo humano.

[0069] As sequências de DNA de anticorpo resultantes podem ser otimizadas para altos níveis de expressão em células de mamíferos através da remoção de elementos de instabilidade de RNA, conforme é conhecido na técnica.

[0070] Em uma modalidade, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que forma um anticorpo, por exemplo, forma um anticorpo tendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, um scFV, um anticorpo quimérico, uma cadeia pesada simples e similares, que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos, pode ser ex- pressada sob o controle de um promotor único, por exemplo, utilizando uma sequência auto-clivável 2A (Chysel) entre cadeias pesada e leve. A sequência 2A se auto-cliva durante a tradução da proteína e deixa uma cauda curta de aminoácidos no terminal C da proteína a montante. Um sítio de reconhecimento de clivagem de Furina pode ser adicionado entre a sequência 2A e o gene a montante para assegurar a remoção dos aminoácidos restantes. Os plasmídeos que expressam os insertos corretos podem ser identificados por sequenciamento de DNA e por li- gação específica de anticorpos usando análise western e ensaios ELISA.

[0071] Em uma modalidade, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que forma um anticorpo se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, au- menta o número de eosinófilos, pode ser operacionalmente ligada a um peptídeo de sinal heterólogo, por exemplo, um peptídeo de sinal a partir de IL-2, IL-6, CD5, tripsinogênio, albumina do soro, prolactina, elastina, quimotripsina, IL-2, tripsinogênio-2, ou avastina (MKYLLPTAAAGLLL- LAAQPAMA (SEQ ID NO:60) ou MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:61)) ou um peptídeo de sinal a partir de uma outra imunoglobulina (por exemplo, vide tabela 1 em Haryadi et al., PloS One, 10:e0116878 (2015), que é incorporada a título de referência no presente documento) ou um peptídeo de sinal homólogo a partir de uma imunoglobulina, ex- pressado sob o controle de um único promotor, ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada pode ser expressada a partir de promotores dife- rentes e pode ter os mesmos ou diferentes peptídeos de sinal. Os plas- mídeos que expressam os insertos corretos podem ser identificados por sequenciamento de DNA e por ligação específica de anticorpos usando análise western e ensaios ELISA.

[0072] Terapias à base de Anti-Eosinófilos

[0073] Os eosinófilos são células granulocíticas derivadas da me- dula óssea. Seu desenvolvimento é regulado por interleucina-5 (IL-5). Eosinófilos têm um papel para combater patógenos parasitas e na pa- togênese de distúrbios alérgicos e asmáticos. Elas persistem na circu- lação por cerca de 8 a 12 horas e sobrevivem nos tecidos por cerca de 8 a 12 dias. Em um mamífero normal, eosinófilos são < 5% de leucócitos sanguíneos (300-500/µl). Eles podem liberar uma variedade de media- dores citotóxicos a partir de grânulos citoplasmáticos.

[0074] A contagem normal de eosinófilos no sangue periférico varia de 50 a 500 × 109/l. A eosinofilia no sangue pode ser dividida em eosi- nofilia leve (até 1500 × 109/l) e eosinofilia marcada (>1500 × 109/l). Na ‘HE tecidual’ existem números substanciais de eosinófilos que são ob- servados no BM e em órgãos linfáticos assim como nos revestimentos mucosos do trato intestinal, especialmente o estômago, intestino del- gado e cólon. Na maioria dos outros tecidos e órgãos, entretanto, mesmo números baixos de eosinófilos podem ser considerados como

"eosinofilia". HE tecidual é caracterizada por um aumento acentuado lo- cal em eosinófilos e/ou deposição marcada de proteínas derivadas de eosinófilos, tais como MBP. Com base nas condições e etiologia acom- panhantes, várias formas variantes de HE existem: uma forma heredi- tária (familiar) (HEF), HE de significância indeterminada (clínica) (HEUS), HE (HEN) (neoplásica) primária onde as eosinófilos são consi- derados como sendo células clonais e secundárias (reativas) HE (HER) onde os eosinófilos são considerados como sendo células não-clonais expandidas (e ativadas) por um processo reativo. Raramente, HER é desencadeada por um processo clonal tal como linfoma de Hodgkin ou adenocarcinoma de pulmão.

[0075] CEL-NOS é um subtipo de leucemia eosinofílica crônica adulta de causa desconhecida. O mesmo é caracterizado por uma ele- vação persistente de eosinófilos de sangue (>1.5x103/µl) que resulta em disfunção de órgãos infiltrados com eosinófilos. Os sintomas de CEL- NOS incluem porém não se limitam a tosse, fraqueza, diarreia, hepato- esplenomegalia, insuficiência cardíaca e pulmonar. Os indivíduos com CEL-NOS não respondem à terapia e têm um tempo de sobrevivência médio a partir do diagnóstico de 2 anos.

[0076] Uma abordagem à base de terapia genética para hipereosi- nofilia inclui, em uma modalidade, o uso de vetores virais, por exemplo, uma administração única de um vetor de AAV, codificação para um an- ticorpo monoclonal Anti-Eosinófilo (por exemplo, AAVrh.10mAnti-Eos), para prover expressão sustentada do monoclonal Anti-Eosinófilo, redu- ção dos níveis de eosinófilos no sangue e tecidos in vivo e redução da mortalidade. Conforme descrito abaixo no presente documento, um mo- delo de camundongo de CEL-NOS foi gerado usando um vetor AAV co- dificando para IL-5 de murino, expressando níveis sustentados de IL-5 resultando em estimulação persistente da medula óssea para gerar eo- sinófilos. Uma terapia genética à base do vetor AAV foi preparada, por exemplo, AAVrh.10mAnti-Eos), um vetor AAV codificando para anti-Si- glec-F, um anticorpo monoclonal IgG2b de rato específico para uma le- ctina semelhante à imunoglobulina da superfície da célula eosinofílica. Como descrito aqui, os camundongos Balb/c foram administrados com AAVrh.10mIL-5 e AAVrh.10mAnti-Eos simultaneamente no dia 0. Para contornar a imunidade preexistente ao vector, camundongos NOD-scid IL2 Rgammanull (NSG) imunodeficientes foram usados. Os camundon- gos NSG injetados com AAVrh.10mIL-5 no dia 0. No dia 28 (depois do estabelecimento do fenótipo), AAVrh.10mAnti-Eos foi injetado. Além disso, modelos de camundongos de CEL-NOS foram gerados com ca- racterísticas associadas com CEL-NOS em humanos. O fenótipo foi in- dependente da imunidade adquirida. A administração em uma vez de AAVrh.10mAnti-Eos aos camundongos com CEL-NOS resultou em ní- veis sustentados de anti-Siglec-F e proveu supressão a longo prazo dos eosinófilos no sangue nos camundongos afetados. Sendo assim, AA- Vrh.10mAnti-Eos suprimiu os números de eosinófilos e reduziu a mor- talidade no modelo de camundongo CEL-NOS.

[0077] A estratégia de proteção da persistência crônica de altos ní- veis de eosinófilos é aplicável a outros distúrbios hipereosinofílicos, por exemplo, aqueles sem outras opções de tratamento.

[0078] Vetores da terapia genética

[0079] A divulgação provê um vetor da terapia genética compreen- dendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo mo- noclonal que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molé- cula, cuja presença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos. A divulgação ainda provê um método de produção de uma resposta imune contra eosinófilos em um mamífero, cujo método compreende a admi- nistração ao mamífero do vetor de terapia genética acima descrito. Vá- rios aspectos do vetor da terapia genética e método são discutidos abaixo. Embora cada parâmetro seja discutido separadamente, o vetor da terapia genética e o método compreendem combinações dos parâ- metros estabelecidos abaixo para evocar proteção contra uma patologia associada com eosinófilos. Consequentemente, qualquer combinação de parâmetros pode ser usada de acordo com o vetor da terapia gené- tica e o método.

[0080] Um “vetor de terapia genética” é assim qualquer molécula ou composição que tem a capacidade de carregar uma sequência de ácido nucleico heteróloga em uma célula hospedeira adequada onde a síntese da proteína codifica acontece. Tipicamente, um vetor de terapia gené- tica é uma molécula de ácido nucleico que foi engenheirada, usando técnicas de DNA recombinante que são conhecidas na técnica, para in- corporar a sequência de ácido nucleico heteróloga. De forma desejável, o vetor da terapia genética é compreendido de DNA. Exemplos de ve- tores de terapia genética à base do DNA adequado incluem plasmídeos e vetores virais. No entanto, os vetores de terapia genética que não são baseados em ácidos nucleicos, tais como lipossomos, também são co- nhecidos e usados na técnica. O vetor da terapia genética pode ser ba- seado em um único tipo de ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo) ou molécula de ácido não-nucleico (por exemplo, um lipídio ou um polí- mero). O vetor da terapia genética pode ser integrado no genoma da célula hospedeira, ou pode estar presente na célula hospedeira na forma de um epissomo.

[0081] Os vetores de liberação genética dentro do escopo da divul- gação incluem, porém não se limitam a, ácido nucleico isolado, por exemplo, vetores à base de plasmídeo que podem ser mantidos de forma extra-cromossômica e vetores virais, por exemplo adenovírus re- combinante, retrovírus, lentivírus, vírus do herpes, poxvírus, papiloma- vírus ou vírus adenoassociado , incluindo vetores virais e não virais que estão presentes em lipossomos, por exemplo, lipossomos neutros ou catiônicos, tais como lipossomos DOSPA/DOPE, DOGS/DOPE ou li- possomos DMRIE/DOPE, e/ou associados com outras moléculas tais como complexos de DNA- anticorpo anti-DNA – lipídio catiônico (DOTMA/DOPE). Os vetores de liberação genética virais exemplificado- res são descritos abaixo. Os vetores de liberação genética podem ser administrados através de qualquer via incluindo, mas não se limitando a, administração intracraniana, intratecal, intramuscular, bucal, retal, in- travenosa ou intracoronária, e a transferência para as células pode ser melhorada utilizando a eletroporação e/ou iontoforese, e/ou estrutura- ção tal como matriz extracelular ou hidrogéis, por exemplo, um adesivo com hidrogel.

[0082] Em uma modalidade, o vetor da terapia genética é um vetor viral. Os vetores virais adequados incluem, por exemplo, vetores retro- virais, vetores lentivirais, vetores à base de vírus do herpes simplex (HSV), vetores à base de parvovírus, por exemplo, vetores à base de vírus adenoassociado (AAV), vetores quiméricos AAV-adenovirais e ve- tores à base de adenovírus. Estes vetores virais podem ser preparados utilizando-se técnicas de DNA recombinante padrão descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publis- hing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994).

[0083] Vetores retrovirais

[0084] Os vetores retrovirais exibem várias características distinti- vas incluindo a sua capacidade de se integrarem de forma estável e precisa no genoma do hospedeiro provendo expressão a longo prazo do transgene. Estes vetores podem ser manipulados ex vivo para elimi- nar partículas de gene infecciosos para minimizar o risco de infecção sistémica e transmissão de paciente-para-paciente. Vetores retrovirais pseudotipados podem alterar tropismo de células hospedeiras.

[0085] Lentivírus

[0086] Lentivírus são derivados de uma família de retrovírus que in- cluem vírus da imunodeficiência humana e vírus da imunodeficiência fe- lina. Entretanto, ao contrário dos retrovírus que infectam somente as células de divisão, os lentivírus podem infectar ambas as células de di- visão e de não divisão. Por exemplo, vetores lentivirais com base no genoma do vírus da imunodeficiência humana são capazes de transdu- ção eficiente de miócitos cardíacos in vivo. Embora os lentivírus tenham um tropismo específico, a pseudotipagem do envelope viral com vírus da estomatite vesicular produz vírus com uma faixa mais ampla (Schnepp et al., Meth. Mol. Med., 69:427 (2002)).

[0087] Vetores adenovirais

[0088] Os vetores adenovirais podem ser tornados ineficazes para replicação por deleção dos genes precoces (E1A e E1B) responsáveis pela expressão gênica viral do genoma e são mantidos estavelmente nas células hospedeiras em uma forma extracromossômica. Estes ve- tores têm a capacidade de transfectar tanto células replicantes como células não replicantes e, em particular, estes vetores têm mostrado in- fectar miócitos cardíacos in vivo, por exemplo, injeção ou perfusão di- reta. Os vetores adenovirais demonstraram resultar em expressão tran- siente de genes terapêuticos in vivo, chegando ao pico em 7 dias e du- rando aproximadamente 4 semanas. A duração da expressão do trans- gene pode ser melhorada em sistemas utilizando promotores específi- cos neurais. Além disso, os vetores adenovirais podem ser produzidos em títulos muito altos, permitindo a terapia genética eficiente com pe- quenos volumes de vírus.

[0089] Vetores virais adenoassociados

[0090] Os vírus recombinantes adenoassociados (rAAV) são deri- vados de parvovírus não patogênicos, evocam essencialmente ne-

nhuma resposta imunológica celular, e produzem a expressão de trans- gene que dura meses na maioria dos sistemas. Além disso, como ade- novírus, vetores virais adenoassociados também têm a capacidade de infectar células replicantes e não replicantes e acredita-se que sejam não patogênicos para seres humanos. Além disso, eles parecem pro- missores para a terapia genética cardíaca sustentada (Hoshijima et al,. Nat. Med., 8:864 (2002); Lynch et al., Circ. Res., 80:197 (1997)).

[0091] Vetores do DNA plasmidial

[0092] DNA plasmidial é frequentemente referido como "DNA puro" para indicar a ausência de um sistema de acondicionamento mais ela- borado. A injeção direta de DNA plasmidial em células do miocárdio in vivo foi executada. Os vetores baseados em plasmídeos são relativa- mente não imunogênicos e não patogênicos, com o potencial de se in- tegrarem de forma estável no genoma celular, resultando na expressão genética a longo prazo em células pós-mitóticas in vivo. Por exemplo, a expressão de fatores de angiogênese secretados depois da injeção muscular de DNA plasmidial, apesar de níveis relativamente baixos da expressão de transgene focal, demonstrou efeitos biológicos significati- vos em modelos animais e parece promissora clinicamente (Isner, Na- ture, 415:234 (2002)). Além disso, o DNA plasmidial é rapidamente de- gradado na corrente sanguínea; assim, a mudança da expressão de transgene nos sistemas orgânicos distantes é insignificante. O DNA plasmidial pode ser liberado em células como parte de um complexo macromolecular, por exemplo, um complexo de lipossomos ou DNA- proteína, e a liberação pode ser intensificada usando técnicas incluindo eletroporação.

[0093] Vetores de AAV exemplificadores

[0094] Em uma modalidade, a divulgação provê um vetor viral ade- noassociado (AAV) que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de uma sequência de ácido nucleico codificando um anticorpo que se liga a um eosinófilo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Quando o vetor AAV consiste essencialmente de uma sequên- cia de ácido nucleico codificando um anticorpo que se liga a um eosinó- filo, componentes adicionais podem ser incluídos de forma que não afe- tem materialmente o vetor AAV (por exemplo, elementos genéticos tais como sequências poli(A) ou sítios de enzimas de restrição que facilitam a manipulação do vetor in vitro). Quando o vetor AAV consiste de uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja pre- sença no mamífero, aumenta o número de eosinófilos, o vetor AAV não compreende qualquer componente adicional (isto é, componentes que não são endógenos a AAV e não são necessários para efetuar a ex- pressão da sequência de ácido nucleico para assim prover o anticorpo).

[0095] Vírus adenoassociados são um membro da família Parvoviri- dae e compreendem um genoma de DNA linear, de filamento único de menos do que cerca de 5,000 nucleotídeos. AAV requer coinfecção com um vírus auxiliar (isto é, um adenovírus ou um vírus do herpes), ou ex- pressão de genes auxiliares, para replicação eficiente. Os vetores de AAV usados para a administração de ácidos nucleicos terapêuticos tipi- camente têm aproximadamente 96% do genoma parental eliminado, tal que somente as repetições terminais (ITRs), que contêm sinais de reco- nhecimento para replicação e acondicionamento de DNA. Isto elimina efeitos colaterais imunológicos ou tóxicos devido à expressão de genes virais. Além disso, a liberação de proteínas AAV específicas para pro- duzir células permite a integração do vetor AAV compreendendo AAV ITRs em uma região específica do genoma celular, caso desejado (vide, por exemplo, Patentes Norte-americanas 6,342,390 e 6,821,511). As células hospedeiras compreendendo um genoma AAV integrado não mostram nenhuma mudança no crescimento ou morfologia celular (vide, por exemplo, Patente Norte-americana 4,797,368).

[0096] Os AAV ITRs flanqueiam as únicas sequências nucleotídicas codificadoras para a replicação de proteínas não estruturais (Rep) e as proteínas capsidiais estruturais (Cap) (também conhecidas como prote- ínas viriônicas (VPs)). Os 145 nucleotídeos terminais são auto-comple- mentares e são organizadas de modo que um duplex intramolecular energeticamente estável que forma um Grampo em formato de T pode ser formado. Estas estruturas de grampo funcionam como origem para replicação de DNA virai servindo como iniciadores para o complexo de DNA polimerase celular. Os genes Rep codificam as proteínas Rep Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40. Rep78 e Rep68 são transcritas a partir do promotor p5, e Rep 52 e Rep40 são transcritas a partir do promotor p19. As proteínas Rep78 e Rep68 são proteínas de ligação ao DNA multifuncionais que realizam as funções da helicase e nicase durante a replicação produtiva para permitir a resolução do terminal AAV (vide, por exemplo, Im et al., Cell, 61:447 (1990)). Essas proteínas também regu- lam a transcrição a partir de promotores AAV endógenos e promotores dentro dos vírus auxiliares (vide, por exemplo, Pereira et al., J. Virol., 71:1079 (1997)). As outras proteínas Rep modificam a função de Rep78 e Rep68. Os genes cap codificam as proteínas capsidiais VP1, VP2 e VP3. Os genes cap são transcritos a partir do promotor p40.

[0097] O vetor AAV pode ser gerado usando algum sorotipo de AAV conhecido na técnica. Vários sorotipos de AAV e variantes de 100 AAV foram isolados de estoques de adenovírus ou de tecidos de primatas humanos ou não humanos (revistos em, por exemplo, Wu et al., Mole- cular Therapy, 14(3): 316 (2006)). Em geral, os sorotipos de AAV têm sequências genômicas de homologia significativa nos níveis de sequên- cia de ácido nucleico e sequência de aminoácido, de forma que os so- rotipos diferentes tenham uma configuração idêntica de funções genéti- cas, produzam vírions que são essencialmente fisicamente e funcional- mente equivalentes, e repliquem e se juntem através de mecanismos praticamente idênticos. Os sorotipos de AAV 1-5 e 7-9 são definidos como sorotipos “verdadeiros”, pelo fato de que eles não reagem de forma cruzada com a neutralização de soros específicos para todos os outros sorotipos existentes e caracterizados. Em contraste, os sorotipos de AAV 6, 10 (também referidos como Rh10) e 11 são considerados sorotipos “variantes” já que eles não aderem à definição de um sorotipo “verdadeiro”. O sorotipo 2 de AAV (AAV2) foi usado extensivamente para aplicações de terapia genética devido a sua falta de patogenici- dade, ampla gama de infectividade, e capacidade de estabelecer uma expressão de transgene a longo prazo (vide, por exemplo, Carter, Hum. Gene Ther., 16:541 (2005); e Wu et al., supra). As sequências do ge- noma de vários sorotipos de AAV e comparações dos mêsmos são di- vulgadas em, por exemplo, números de acesso GenBank U89790, J01901, AF043303 e AF085716; Chiorini et al., J. Virol., 71:6823 (1997); Srivastava et al., J. Virol., 45:555 (1983); Chiorini et al., J. Virol., 73:1309 (1999); Rutledge et al., J. Virol., 72:309 (1998); e Wu et al., J. Virol., 74:8635 (2000)).

[0098] As sequências AAV rep e ITR são particularmente conserva- das através da maioria dos sorotipos de AAV. Por exemplo, as proteínas Rep78 de AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4 e AAV6 são reportadamente cerca de 89-93% idênticas (vide Bantel-Schaal et al., J. Virol., 73(2):939 (1999)). Reportou-se que os sorotipos de AAV 2, 3A, 3B, e 6 comparti- lham cerca de 82% da identidade sequencial nucleotídica total do nível no genoma (Bantel-Schaal et al., supra). Além do mais, as sequências rep e ITRs de muitos sorotipos de AAV são conhecidas por eficiente- mente complementar de forma cruzada (por exemplo, funcionalmente substituir) as sequências correspondentes a partir de outros sorotipos durante a produção de partículas de AAV em células de mamíferos.

[0099] Em geral, as proteínas cap, que determinam a tropicidade celular da partícula de AAV, e as sequências de codificação de proteína cap relacionadas, são significativamente menos conservadas do que os genes rep através de diferentes sorotipos de AAV. Em vista da capaci- dade Rep e sequências ITR em complementar de forma cruzada as se- quências correspondentes de outros sorotipos, o vetor AAV pode com- preender uma mistura de sorotipos e assim ser um vetor AAV “quimé- rico” ou “pseudotipado”. Um vetor AAV quimérico tipicamente compre- ende proteínas capsidiais AAV derivadas de dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, etc.) diferentes sorotipos de AAV. Em contraste, um vetor AAV pseudotipado compreende um ou mais ITRs de um sorotipo de AAV acondicionado em um capsídeo de um outro sorotipo de AAV. Os veto- res AAV quiméricos e pseudotipados são adicionalmente descritos em, por exemplo, Patente Norte-americana No. 6,723,551; Flotte, Mol. Ther., 13(1):1 (2006); Gao et al., J. Virol., 78:6381 (2004); Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:11854 (2002); De et al., Mol. Ther., 13:67 (2006); e Gao et al., Mol. Ther., 13:77 (2006).

[0100] Em uma modalidade, o vetor AAV é gerado usando um AAV que infecta humanos (por exemplo, AAV2). Alternadamente, o vetor AAV é gerado usando um AAV que infecta primatas não humanos, tais como, por exemplo, os grandes macacos (por exemplo, chimpanzés), macacos do velho mundo (por exemplo, macacos), e macacos do novo mundo (por exemplo, saguis). Em uma modalidade, o vetor AAV é ge- rado usando um AAV que infecta um primata não humano pseudotipado com um AAV que infecta humanos. Exemplos dos referidos vetores AAV pseudotipados são divulgados em, por exemplo, Cearley et al., Molecu- lar Therapy, 13:528 (2006). Em uma modalidade, um vetor AAV pode ser gerado o qual compreende uma proteína capsidial a partir de um AAV que infecta macacos rhesus pseudotipados com repetições termi- nais invertidas (ITRs) de AAV2. Em uma modalidade específica, o vetor AAV compreende uma proteína capsidial a partir de AAV10 (também referida como “AAVrh.10”), que infecta macacos rhesus pseudotipados com ITRs de AAV2 (vide, por exemplo, Watanabe et al., Gene Ther., 17(8):1042 (2010); e Mao et al., Hum. Gene Therapy, 22:1525 (2011)).

[0101] Além da sequência de ácido nucleico codificando um anti- corpo contra eosinófilos, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o vetor AAV vector pode compreender sequências de controle de expressão, tais como promotores, intensificadores, sinais de polia- denilação, terminadores de transcrição, sítios de entrada de ribossomos internos (IRES) e semelhantes, que proveem a expressão da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira. As sequências de controle de expressão exemplificadoras são conhecidas na técnica e descritas em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990).

[0102] Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, induzíveis e reprimíveis, a partir de uma variedade de di- ferentes fontes, são bem conhecidos na técnica. Fontes representativas de promotores incluem por exemplo, vírus, mamífero, inseto, planta, le- vedura e bactérias, e promotores adequados destas fontes são pronta- mente disponíveis, ou podem ser feitas sinteticamente, com base em sequências publicamente disponíveis, por exemplo, a partir dos deposi- tórios tais como ATCC assim como outras fontes comerciais ou indivi- duais. Os promotores podem ser unidirecionais (isto é, iniciar a transcri- ção em uma direção) ou bidirecionais (isto é, iniciar a transcrição seja na direção 3’ ou 5’). Os exemplos não limitantes de promotores incluem, por exemplo, o sistema de expressão bacteriana T7, sistema de expres- são bacteriana pBAD (araA), o promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor SV40 e o promotor RSV. Os promotores induzíveis incluem, por exemplo, o sistema Tet (Patentes Norte-americanas Nos. 5,464,758 e 5,814,618), o sistema induzível Ecdysone (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:3346 (1996)), o sistema T-REXTM (Invitrogen, Carlsbad, CA), sistema LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA), e o sistema de recombinase induzível por Cre-ERT tamoxifeno (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27:4324 (1999); Nuc. Acid. Res., 28:e99 (2000); U.S. Patent No. 7,112,715; e Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308:123 (2005)).

[0103] O termo “intensificador” conforme usado no presente docu- mento, se refere a uma sequência de DNA que aumenta a transcrição de, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico à qual ela é operaci- onalmente ligada. Os intensificadores podem estar localizados muitas kilobases longe da região codificadora da sequência de ácido nucleico e pode mediar a ligação de fatores reguladores, padrões de metilação do DNA, ou alterações na estrutura de DNA. Um grande número de in- tensificadores a partir de uma variedade de fontes diferentes é bem co- nhecido na técnica e está disponível como ou dentro de polinucleotídeos clonados (a partir de, por exemplo, depositórios tais como o ATCC as- sim como outras fontes comerciais ou individuais). Vários polinucleotí- deos compreendendo promotores (tal como o promotor CMV comu- mente usado) também compreendem sequências intensificadoras. Os intensificadores podem estar localizados a montante, dentro ou a mon- tante das sequências codificadoras. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico codificando um anticorpo contra eosinófilos, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é operacionalmente ligado a um intensificador de CMV/promotor de beta-actina de galinha (tam- bém referido como um “promotor CAG”) (vide, por exemplo, Niwa et al., Gene, 108:193 (1991); Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:2296 (1999); e Sondhi et al., Mol. Ther., 15:481 (2007)).

[0104] Tipicamente os vetores AAV são produzidos usando plasmí- deos bem caracterizados. Por exemplo, células 293T renais embrioná- rias humanas são transfectadas com um dos plasmídeos específicos do transgene e um outro plasmídeo contendo o auxiliar do adenovírus e genes AAV rep e cap (específicos para AAVrh.10, 8 ou 9 conforme ne- cessário). Depois de 72 horas, as células são coletadas e o vetor é libe- rado das células por cinco ciclos de congelamento/descongelamento. A centrifugação e tratamento com benzonase subsequentes remove os resíduos celulares e DNA não capsidado. Os gradientes de iodixanol e colunas de troca iônica podem ser usados para adicionalmente purificar cada vetor AAV. A seguir, o vetor purificado é concentrado por uma co- luna de centrífuga de exclusão por tamanho até a concentração neces- sária. Finalmente, o tampão é trocado para criar os produtos do vetor finais formulados (por exemplo) em 1x de tampão fosfato salino. Os tí- tulos virais podem ser medidos por PCR em tempo real TaqMan® e a pureza viral pode ser avaliada por SDS-PAGE.

[0105] Composições farmacêuticas e liberação

[0106] A divulgação provê uma composição compreendendo, con- sistindo essencialmente de, ou consistindo do vetor da terapia genética descrito acima e um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fisiologicamente aceitável). Quando a composição consiste essencial- mente do vetor da terapia genética e um veículo farmaceuticamente aceitável, componentes adicionais podem ser incluídos de forma que não afetem materialmente a composição (por exemplo, adjuvantes, tam- pões, estabilizantes, agentes anti-inflamatórios, solubilizantes, conser- vantes, etc.). Quando a composição consiste do vetor da terapia gené- tica e do veículo farmaceuticamente aceitável, a composição não com- preende componentes adicionais. Qualquer veículo adequado pode ser usado dentro do contexto da divulgação, e os referidos veículos são bem conhecidos na técnica. A escolha do veículo será determinada, em parte, pelo sítio específico ao qual a composição pode ser administrada e o método específico usado para administrar a composição. A compo- sição opcionalmente pode ser estéril com a exceção do vetor da terapia genética descrito no presente documento. A composição pode ser con- gelada ou liofilizada para armazenagem e reconstituída em um veículo estéril antes do uso. As composições podem ser geradas de acordo com técnicas convencionais descritas em, por exemplo, Remington: The Sci- ence and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wil- kins, Philadelphia, PA (2001).

[0107] As formulações adequadas para a composição incluem so- luções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que po- dem conter antioxidantes, tampões e bacteriostatos, e suspensões es- téreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes vedados de dose unitária ou múltiplas doses, tais como ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) que necessita apenas da adição de veículo líquido estéril, por exemplo, água, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões extem- porâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, e comprimidos dos tipos anteriormente descritos. Em uma modalidade, o veículo é uma solução tampão salina. Em uma modalidade, o vetor da terapia genética é administrado em uma composição formulada para proteger o vetor da terapia genética de danos antes da administração. Por exemplo, a composição pode ser formulada para reduzir a perda do vetor da terapia genética em dispositivos usados para preparar, arma- zenar ou administrar o vetor de terapia genética, tal como objetos de vidro, seringas ou agulhas. A composição pode ser formulada para di- minuir a sensibilidade à luz e/ou sensibilidade à temperatura do vetor de terapia genética. Para esta finalidade, a composição pode compreender um veículo líquido farmaceuticamente aceitável, tal como, por exemplo, aquele descrito acima, e um agente estabilizador selecionado a partir do grupo consistindo de polissorbato 80, L-arginina, polivinilpirrolidona,

trehalose e combinações dos mesmos. O uso de uma referida compo- sição estenderá a vida de prateleira do vetor de terapia genética, facili- tará a administração e aumentará a eficiência do método. As formula- ções para as composições contendo o vetor da terapia genética são adicionalmente descritas em, por exemplo, Wright et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 6(2): 174-178 (2003) e Wright et al., Molecular Therapy, 12: 171-178 (2005))

[0108] A composição também pode ser formulada para aumentar a eficiência da transdução. Além disso, um versado na técnica entenderá que o vetor da terapia genética pode estar presente em uma composi- ção com outros agentes terapêuticos ou biologicamente ativos. Por exemplo, os fatores que controlam a inflamação, tais como ibuprofeno ou esteroides, podem fazer parte da composição para reduzir o edema e a inflamação associados com a administração in vivo do vetor de te- rapia genética. Os estimulantes ou adjuvantes do sistema imune, por exemplo, interleucinas, lipopolissacarídeo, e RNA de filamento duplo, podem ser administrados para aumentar ou modificar a resposta imune Anti-Eosinófilo. Os antibióticos, isto é, microbicidas e fungicidas, podem estar presentes para tratar infecção existente e/ou reduzir o risco de in- fecção futura, tal como infecção associada com os procedimentos da terapia genética.

[0109] As formas injetáveis depot são feitas pela formação de ma- trizes microencapsuladas dos compostos em questão em polímeros bio- degradáveis, tais como polilactídeo-poliglicolida. Dependendo da pro- porção de fármaco para polímero, e da natureza do polímero específico usado, a taxa de liberação de fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(ani- dridos). As formulações injetáveis depot também são preparadas ao se capturar o fármaco em lipossomos ou microemulsões que são compatí- veis com o tecido corporal.

[0110] Em certas modalidades, uma formulação compreende um polímero biocompatível selecionado do grupo que consiste em poliami- das, policarbonatos, polialquilenos, polímeros de ésteres acrílicos e me- tacrílicos, polímeros polivinílicos, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliure- tanos e seus copolímeros, celuloses, polipropileno, polietilenos, polies- tireno, polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, polianidrido, poli(orto)ésteres, ácido poli(bútico), ácido poli(valérico), poli(lactida-co- caprolactona), polissacarídeos, proteínas, ácidos polihialurônicos, poli- cianoacrilatos, e combinações, misturas, ou copolímeros dos mesmos.

[0111] A composição pode ser administrada em ou sobre um dispo- sitivo que permite uma liberação controlada ou sustentada, tal como uma esponja, uma rede biocompatível, um reservatório mecânico, ou um implante mecânico. Implantes (vide, por exemplo, Patente Norte- americana No. 5,443,505), dispositivos (vide, por exemplo, Patente Norte-americana No. 4,863,457), tal como um dispositivo implantável, por exemplo, um reservatório mecânico ou um implante ou um disposi- tivo compreendido de uma composição polimérica, são particularmente úteis para administração do vetor de terapia genética. A composição também pode ser administrada na forma de formulações de liberação sustentada (vide, por exemplo, Patente Norte-americana No. 5,378,475) compreendendo, por exemplo, espuma de gel, ácido hialuronico, gela- tina, sulfato de condroitina, um polifosfoéster, tal como bis-2-hidroxietil- tereftalato (BHET) e/ou um ácido poliláctico-glicólico.

[0112] A liberação das composições compreendendo os vetores de terapia genética podem ser intracerebrais (incluindo, porém sem se li- mitar a intraparenquimais, intraventriculares ou intracisternais), intrate- cais (incluindo porém sem se limitar a lombar ou cisterna magna), ou sistêmica, incluindo porém sem se limitar a intravenosa, ou qualquer combinação das mesmas, usando dispositivos conhecidos na técnica.

A liberação também pode ser através de implante cirúrgico de um dis- positivo implantado.

[0113] A dose do vetor da terapia genética na administração da composição ao mamífero dependerá de um número de fatores, incluindo o tamanho (massa) do mamífero, a extensão de quaisquer efeitos cola- terais, a via de administração particular e similares. Em uma modali- dade, o método compreende administrar a “quantidade terapeutica- mente eficaz” da composição compreendendo do vetor da terapia gené- tica descrito no presente documento. Uma “quantidade terapeutica- mente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter um resultado terapêutico de- sejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores tais como a extensão da patologia associada a eosinófilos, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do vetor da terapia genética para elicitar uma resposta desejada no indivíduo. A dose do vetor da terapia genética na composição necessária para alcançar um efeito terapêutico específico é tipicamente administrada em umidades das cópias do vetor de genoma por célula (gc/célula) ou cópias do vetor de genoma/por kilograma de peso corporal (gc/kg). Um versado na téc- nica pode prontamente determinar uma faixa de dose do vetor da terapia genética apropriada para tratar um paciente que tem uma doença ou distúrbio específico, com base nesses e outros fatores que são bem co- nhecidos na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz pode estar entre 1 x 1010 cópias de genoma a 1 x 1013 cópias de genoma. A quan- tidade terapeuticamente eficaz pode estar entre 1 x 1011 cópias de ge- noma a 1 x 1014 cópias de genoma. A quantidade terapeuticamente efi- caz pode estar entre 1 x 1012 cópias de genoma a 1 x 1015 cópias de genoma. A quantidade terapeuticamente eficaz pode estar entre 1 x 1013 cópias de genoma a 1 x 1016 cópias de genoma.

[0114] Em uma modalidade, a composição é administrada uma vez ao mamífero. Acredita-se que uma única administração da composição resultará em expressão persistente do anticorpo Anti-Eosinófilo no ma- mífero com efeitos colaterais mínimos. No entanto, em certos casos, pode ser apropriado administrar a composição múltiplas vezes durante um período terapêutico para assegurar exposição suficiente de células à composição. Por exemplo, a composição pode ser administrada ao mamífero duas ou mais vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 8, 9 ou 10 ou mais vezes) durante um período terapêutico.

[0115] A presente divulgação provê composições farmaceutica- mente aceitáveis que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor da terapia genética compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença no mamífero, au- menta o número de eosinófilos conforme descrito acima.

[0116] Doenças e distúrbios favoráveis à terapia genética Anti-Eo- sinofílica

[0117] Os vetores de terapia genética descritos aqui podem ser usa- dos para prevenir, inibir ou tratar distúrbios eosinofílicos intrínsecos ou extrínsecos, por exemplo, aqueles que são geralmente o resultado de mutações genéticas na linhagem eosinofílica ou aquelas devido à pro- dução de fatores eosinopoiéticos derivados de células T ou células tu- morais. As doenças extrínsecas ou intrínsecas incluem porém não se limitam a eosinofilias mediadas pela célula T, por exemplo, doenças alérgicas incluindo rinoconjuntivite alérgica, asma brônquica e dermatite atópica, hipersensibilidade ao fármaco, por exemplo, eczema relativo ao fármaco com eosinofilia e sintomas sistêmicos (DRESS), síndrome Ste- vens-Johnson (SJS), e necrólise epidérmica tóxica (TEN), infecções bacterianas ou virais agudas, por exemplo, vírus sincicial respiratório (RSV), infecções parasitárias helmínticas e aspergilose e coccidiomi-

cose, doenças autoimunes, por exemplo, cirrose biliar primária, escle- rose sistémica, dermatomiosite, lúpus sistêmico, e síndrome de Sjögren. Condições dermatológicas tais como penfigoide, pênfigo, epidermiólise, e dermatite autoimune à progesterona, imunodeficiência, doença do en- xerto versus hospedeiro, mastocitose, esofagite eosinofílica, gastrite eo- sinofílica e gastroenterite, colite eosinofílica; eosinofilia pulmonar, por exemplo, eosinofilia pulmonar simples, pneumonia eosinofílica crónica, pneumonia eosinofílica aguda, aspergilose alérgica e eosinofilia pulmo- nar associada com síndrome de Churg-Strauss e síndrome hipereosi- nofílica; tumores derivados da célula T foram associados com eosinofi- lia. Estes incluem síndrome de Sézary, linfoma linfoblástico de células T e leucemia/linfoma de células T, histiocitose de células Langerhans, tumores de célula B também foram associados com eosinofilia. Assim, as células Reed-Sternberg características presentes no linfoma de Ho- dgkin; e uma forma linfoproliferativa de eosinofilia foi descrita devido a expansões clonais de linfócitos do tipo CD4+ Th2 elaborando IL-5.

[0118] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio está associado com produção intrínseca de fatores eosinopoiéticos incluindo, porém sem se limitar a leucemia eosinofílica crônica, leucemia mieloide crônica com eosinofilia, distúrbios mieloproliferativos associados com policitenia vera, ou trombocitemia essencial, síndrome hipereosinofílica idiopática na qual nenhum rearranjo cromossômico foi encontrado. Outros distúr- bios incluem porém não se limitam à síndrome hipereosinofílica ligada com X, hipereosinofilia familiar e angioedema episódico com eosinofilia, paniculite eosinofílica, doença de Kimura e hiperplasia angiolinfoide com eosinofilia, fascite eosinofílica, síndrome de Wells ou celulite eosi- nofílica, foliculite pustular eosinofílica, e vasculite eosinofílica cutânea necrosante recorrente.

[0119] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa, por exemplo, infecções parasíticas, tais como a infecção por helminto ou infecções fúngicas, tais como infecção por Coccidiomyces e aspergilose broncopulmonar alérgica, ou infestações que resultam em escabiose ou miíase, uma doença alérgica ou atópica, por exemplo, as- sociada com hipersensibilidades a fármacos, gastroenterite, esofagite, doença hepatobiliar, meningite, um distúrbio cardíaco, um distúrbio ge- nitourinário, uma imunodeficiência, um distúrbio endocrinológico, um distúrbio pulmonar, uma doença da pele, artrite reumatoide, vasculite, ou câncer, por exemplo, síndrome hipereosinofílica.

Em uma modali- dade, a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa, por exemplo, uma infecção parasítica, uma infecção fúngica (por exemplo, aspergilose alérgica broncopulmonar ou Coccidiomicose), distúrbio hematológico ou neoplásico, por exemplo, síndromes hipereosinofílicas (HES) incluindo leucemia eosinofílica crônica, leucemia (por exemplo, leucemias mielo- genosas agudas mais comumente, ALL de células B), linfomas (por exemplo, linfomas de Hodgkin, linfomas de células T e B), CML, AML, ASM, MDS, JAK2 V617F, neoplasia mieloide com anormalidades em PDGFRA, PDGRFB ou FGFR1, ou adenocarcinomas associados tumo- rais, carcinomas escamosos, carcinoma pulmonar de células grandes, carcinoma de células transicionais da bexiga, ou mastocitose sistêmica, distúrbios imunológicos tais como doenças da imunodeficiência primária (por exemplo, síndrome de hiperIgE, síndrome de Omenn, deficiência de Dock8, IPEX, ou deficiência de Zap70) ou doença do enxerto-versus- hospedeiro, um distúrbio endocrinológico, por exemplo, hipoadrena- lismo, ou eosinolia associada com irradiação, distúrbios ateroembólicos ou sarcoidose.

Infecções helmintos associadas com eosinofilia incluem porém não se limitam a angioestrongiloidíase, ascaridíase, clonorquí- ease, fascioliase, fasciolopsíase, infecções filariais, filariose linfática, Brugia, Wuchereria, Loa loa, Mansonella ozzardi, Mansonella perstans, Mansonella streptocerca, Onchocerca volvulus, eosinofilia pulmonar tro- pical, gnatostomíase, ancilostomíase, opistorquíase, paragonimíase,

esquistossomose, Schistosoma haematobium, Schistosoma intercala- tum, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma me- kongi, estrongiloidíase, triquinose, larva migrans visceral, Toxocara ca- nis; T catis, ou Baylisascaris procyonis.

[0120] Doenças ou distúrbios com envolvimento restrito ao órgão e eosinofilia periférica marcada que podem ser prevenidos, inibidos ou tratados com vetor da terapia genética descritos no presente documento incluem, porém não se limitam a doenças de pele e doenças subcutâ- neas, por exemplo, angioedema episódico com eosinofilia, celulite eosi- nofílica (síndrome de Well), paniculite eosinofílica, hiperplasia angiolin- foide com eosinofilia (e doença de Kimura), dermatite pustular eosinofí- lica ou vasculite eosinofílica necrosante cutânea, doenças pulmonares, por exemplo, doenças pulmonares eosinofílicas associadas a fármacos e toxinas, associadas a helmintos (síndrome de Loeffler; eosinofilia pul- monar tropical), pneumonia eosinofílica crônica, pneumonia eosinofílica aguda, síndrome de Churg-Strauss ou outras vasculites, doenças gas- trointestinais, por exemplo, distúrbios gastrointestinais eosinofílicos (EGIDs) incluindo porém sem se limitar a esofagite eosinofílica (EE) e gastroenterite eosinofílica (EG), cirrose biliar primária, colangite escle- rosante, colangite eosinofílica, ou colecistite eosinofílica, doenças neu- rológicas incluindo porém sem se limitar a meningite eosinofílica, deri- vação ventroperitoneal, leucemia ou linfoma com envolvimento do SNC (Hodgkin), fármacos anti-inflamatórios não-esteroides, antibióticos, agentes de contraste, doenças dermatológicas, síndrome de Churg- Strauss, síndrome de eosinofilia-mialgia, doenças cardíacas incluindo porém sem se limitar a miocardite por hipersensibilidade ou síndrome de Churg-Strauss, ou doença genitourinária, por exemplo, nefrite inters- ticial induzida por fármacos ou cistite eosinofílica.

[0121] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa incluindo porém sem se limitar a infecções com helmintos

(vermes) parasíticos, coccídio intestinal Isospora belli, Dientamoeba fra- gilis, Sarcocystis hominis, ectoparasitas, por exemplo, escabiose, larvas da mosca (miíase), HIV, fungos, por exemplo, coccidiomiocose e asper- gilose.

[0122] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é uma doença atópica/alérgica, por exemplo, rinite alérgica, rinite não alérgica com sín- drome eosinofílica (NARES ou BENAR), ou asma (tanto alérgica quanto não alérgica).

[0123] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é eosinofilia do sangue periférico associada à medicação, por exemplo, associado a quinina, penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, NSAIDs, sulfas, nitrofu- ratoína, tetraciclinas, penicilinas semissintéticas, amiodoarona, nitrofu- rantina, metotrexato, cefalosporinas SSRIs ou SNRIs (por exemplo, ce- fotaxima, cefoxitina, cefoperazona, ou cefotriaxona), sulfasalazina, hi- dantoina, carbamazepina, d-penicilamina, alopurinol, hidroclorotiazida, ciclosporina, ranitidina, GM-CSF, IL-2, fenintoína, alopurinol, aspirina, nevaripina ou sulfasalazina.

[0124] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é uma doença hematológica/neoplásica incluindo porém sem se limitar a malignidades linfoides, por exemplo, doença de Hodgkin, linfoma primário e cutâneo de células T ou síndrome Sezary, tumores sólidos, por exemplo, linfo- mas, tumores cervicais não queratinizante de célula grande, carcinomas de pulmão não diferenciados de células grandes, carcinomas escamo- sos dos pulmões, vagina, pênis, pele ou nasofaringe, adenocarcinomas do estômago, intestino grosso ou corpo uterino, ou carcinoma de célula transitória da bexiga ou mastocitose.

[0125] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é uma imunode- ficiência, por exemplo, síndrome de Omenn, síndrome de Job hiper IgE, deficiência de Dock8, IPEX, ou deficiência de Zap70 ou doença de en- xerto-hospedeiro (GVHD), por exemplo, em seguida ao transplante das células tronco alogeneicas.

[0126] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio endócrino, por exemplo, como um resultado de perda de adrenoglucocorticosteroides endógenos na doença de Addison, hemor- ragia adrenal ou hipopituitarismo.

[0127] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é associado com embolização por colesterol, erupção eosinofílica, polimórfica e prurítica associada com radioterapia (EPPER), sarcoidose, doença intestinal in- flamatória ou outros distúrbios associados com a desregulação imune.

[0128] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é hipereosinofilia com envolvimento restrito a órgãos, por exemplo, doença de pele e do- ença do tecido subcutâneo tais como doenças atópicas e doenças bo- lhosas, por exemplo, doenças bolhosas como dermatite atópica, tais como penfigoide bolhoso, pênfigo vulgar, dermatite herpetiforme, her- pes gestacional, distúrbio caracterizado pela associação de nódulos, eosinofilia, reumatismo, dermatite e edema (NERDS), paniculite eosino- fílica, por exemplo, dermatite de contato, celulite eosinofílica, picadas de artrópodes, toxocaríase, poliarterite nodosa, granuloma de injeção, paniculite lúpica, malignidade, diabetes, parotite crônica recorrente, an- gioedema episódico com eosinofilia, doença de Kimura, hiperplasia an- giolinfoide com eosinofilia, fascite eosinofílica, síndrome de Wells (celu- lite eosinofílica) ou foliculite pustular eosinofílica.

[0129] Outras hipereosinofilias com envolvimento restrito de órgãos incluem doenças ou distúrbios pulmonares, por exemplo, pneumonia eosinofílica crônica ou pneumonia eosinofílica aguda; doença gastroin- testinal, por exemplo, doenças gastrointestinais eosinofílicas (EGID) tais como esofagite eosinofílica (EoE) ou gastroenterite eosinofílica; doen- ças hepatobiliares tais como cirrose biliar primária, colangite esclero- sante, colangite eosinofílica ou colecistite eosinofílica; doença neuroló- gica incluindo meningite eosinofílica, por exemplo, devido a infecções no sistema nervoso central, que variam de fúngicas a helmínticas (por exemplo coccidioidomicose ou infecção por Angiostrongylus cantonen- sis), assim como reações colaterais aos NSAIDs ou antibióticos; doen- ças reumatológicas tais como dermatomiosite, artrite reumatoide, escle- rose sistêmica, ou síndrome de Sjögren, síndrome de eosinofilia-mialgia ou síndrome oleosa tóxica, vasculite, por exemplo, síndrome de Churg- Strauss (CSS), vasculite necrosante cutânea, tromboangiite obliterans com eosinofilia da arterite temporal; doenças cardíacas que resultam em dano ao endomiocárdio que pode ocorrer com miocardite por hiper- sensibilidade, com eosinofilias associadas com leucemia eosinofílica, sarcomas, carcinomas ou linfomas, com GM-CSF ou administração de IL-2, com eosinofilia prolongada induzida por fármacos ou com infec- ções parasíticas; doenças genitourinárias incluindo nefrite intersticial com eosinofilia é tipicamente induzida por fármacos como penicilinas semissintéticas, cefalosporinas, NSAIDs, alopurinol, rifampina e cipro- floxacina. Frequência, hematuria, disuria ou dor suprapúbica.

[0130] A tabela 1 provê doenças ou distúrbios exemplares associa- dos com eosinofilia.

[0131] Tabela 1 Condição Descrição Doenças infecciosas Condições parasíticas Estrongiloidíase, fasciolose hepática, doença hidática, filariose, es- quistossomose Infecções fúngicas Aspergilose alérgica broncopulmonar, coccidiomicose Infestações Escabiose, miíase Doenças alérgicas ou atópicas Distúrbios atópicos Asma, urticária, rinite alérgica Hipersensibilidade ao fármaco ou eosinofilia associada à me- Aspirina, cefalosporina, penicilina, nitrofurantoína, iodetos, sulfona- dicação midas Gastrointestinais/hepáticas esofagite eosinofílica Gastroenterite eosinofílica Doenças hepatobiliares Hepatite eosinofílica, cirrose primária biliar, colangite esclerosante, colecistite eosinofílica Distúrbios hematológicos e neoplásicos Síndromes hipereosinofílicas (HES) Incluindo leucemia eosinofílica crônica Leucemia leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leuce- mia mielogenosa crônica, leucemias de células T e B Linfomas Linfoma de Hodgkin, linfomas de células T e B Neoplasia de células tronco síndrome mielodisplástica, neoplasia mieloproliferativa

Condição Descrição Associados a tumor (tumores sólidos/malignidade) Adenocarcinomas, carcinomas escamosos, carcinomas de células grandes, carcinoma de célula transicional da bexiga, mastocitose sistêmica Neurológicos meningite eosinofílica Cardíacos Miocardite por hipersensibilidade Leucemia eosinofílica, sarcoma, carcinoma, linfoma Genitourinários nefrite intersticial, cistite eosinofílica Imunológicos Doenças de imunodeficiência primária: síndrome de HiperIgE, síndrome de Omenn, deficiência de Dock 8, IPEX, deficiência de Zap 70 Outros Doença do enxerto-versus-hospedeiro, distúrbios endocrinológicos Hipoadrenalismo Hemorragia adrenal, perda de adrenoglucocorticosteroides endóge- nos, hipopituitarismo Distúrbios pulmonares pneumonia eosinofílica crônica/aguda asma eosinofílica Doenças de pele Pênfigo, dermatite herpetiforme Eritema multiforme, angioedema episódico com eosinofilia, paniculite eosinofílica, doença de Kimura, fascite eosinofílica, síndrome de Wells, foliculite pustular eosinofílica Reumatológicos/Vasculite Artrite reumatoide, fascite eosinofílica, angiite alérgica, sín- drome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Churg-Strauss, Outros Irradiação, distúrbios ateroembólicos, sarcoidose, distúrbios inflamatórios crônicos, por exemplo, IBD

[0132] Anticorpos exemplificadores

[0133] O vetor da terapia genética pode codificar uma ou mais se- quências de anticorpo incluindo porém sem se limitar a uma sequência para um anticorpo anti-IL-5 ou IL-5R, por exemplo, mepolizumabe, res- lizumabe, benralizumabe, ou MEDI-563, anticorpo anti-CD52, por exem- plo, alemtuzumabe, anticorpo anti-IL-4R, anticorpo anti-CCR3, anti- corpo anti-IL-13 ou IL-13R, anticorpo anti-CD30, anticorpo anti-IL-17 ou anticorpo IL-17R, anticorpo anti-RADCP (vide US 20030099995), anti- corpo anti-IgE, por exemplo, omalizumabe, anticorpo anti-CD52, anti- corpos anti-IL-4, anticorpo anti-IL-33 ou IL-33R, anticorpo anti-IL-9 ou IL-9R, anticorpo anti-TNF-alfa, por exemplo, infliximabe, anticorpo anti- eotaxina ou fator de anti-sialoadesão ou anticorpo receptor do fator de anti-sialoadesão.

[0134] As sequências de anticorpo exemplificadoras, por exemplo, sequências de região variável incluem porém não se limitam a anticor- pos compreendendo um polipeptídeo compreendendo sequências tendo pelo menos 80%, 82%, 84%, 85%, 87%, 89%, 90%, 92%, 94%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado por uma das SEQ ID No. 1 ou 2, ou um polipeptídeo compreendendo sequências tendo pelo menos 80%, 82%, 84%, 85%, 87%, 89%, 90%, 92%, 94%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial do aminoácido a qualquer uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51, por exemplo, em regiões framework uma ou mais CDRs, ou ambas, em uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40- 41, 43-44 ou 46-51 (vide abaixo).

[0135] Anti-Siglec-F

[0136] ATGGCTGTCCTGGTGCTGTTGCTCTGCCTGCTGACA- TTTCCAAGCTGTGTCCTGTCCCAGG-

TGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGTCTGGTGCAGCCCTCACAG ACTTTGTCTCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTAGCCAGC- TATCATGTAAGCTGGG- TTCGCCAGCCTCCAGGAAAAGGTCTGGAGTGGATGGGACTAATAT GGACTGGTGGAAGCACAACATATAATTCACTTCTCAAATCCCGAC- TGAGCATCAGCAGGGA- CACCTCCAAGAGCCAAGTTTTCCTAAAGATGAACAGTCTGCAAACT GAAGACACAGCCACTTACTACTGTGCCAGAGTTGGGGGAGGGAA- TAGTGCGCTATAC-

TTTGATTATTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO:1)

[0137] GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTG- CATCTCTGGGAGAAACTGTCAC-

CATCGAATGTCGAGCAAGTGAGGACATTTACACCGGTTTAGCATG GTATCACCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAACTCCTGATCTATAA- TGCAAATAGCTTGCAG- TCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACACA GTATTCTCTCAAGATAAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTCGCAAG- TTATTTCTGTCAACAG-

TATTACAATTATCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAG ATCAAACGG (SEQ ID NO:2)

[0138] SEQ ID Nos. 3-4 são como seguem:

[0139] Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr Gly Ala His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO:5)

[0140] Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys (SEQ ID NO:6)

[0141] Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly (SEQ ID NO:7)

[0142] Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu65 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO:8)

[0143] Sequências de anticorpo anti-Siglec na tabela 2, por exem- plo, SEQ ID Nos. 9-32, 40-41, 4-44 ou 46-51, que podem incluir sequên- cias de cadeia pesada ou leve a partir de qualquer uma das SEQ ID

Nos. 7, 33-39, 42 ou 45, incluindo anticorpos que são específicos para qualquer uma das SEQ ID Nos.52-59.

[0144] QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVR- QPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYN-

SALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSM EYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 9)

[0145] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 10)

[0146] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWLGVIWAGGSTNYN-

SALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11)

[0147] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 12)

[0148] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWLSVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 13)

[0149] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 14)

[0150] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYN-

SALMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSM EYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 15)

[0151] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYN-

SALMSRFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16)

[0152] QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYGAHWIR- QPPGKGLEWIGVIWAGGSTNYN-

SALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGSSPYYYSM EYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17)

[0153] QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTIYGAHWVR- QPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYN-

SALMSRLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDGSSPYYYSM EYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18)

[0154] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYG MEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 19)

[0155] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 20)

[0156] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 21)

[0157] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 22)

[0158] QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPG-

TSPKLWIYSTSNLASGV-

PVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLE IK (SEQ ID NO: 23)

[0159] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 24)

[0160] EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLWIYSTSNLASGVPAR-

FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 25)

[0161] EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 26)

[0162] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLWIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 27)

[0163] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGVPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 28)

[0164] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 2)

[0165] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK

(SEQ ID NO: 30)

[0166] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 31)

[0167] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 32)

[0168] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 33)

[0169] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 34)

[0170] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQK- PGQAPRLLIYSTSNLASGIPAR-

FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 35)

[0171] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA-

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESN-

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 36)

[0172] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA-

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSQEDPEVQFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESN-

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 37)

[0173] RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN- FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 38)

[0174] QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVR- QPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYN-

SALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSM EYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLG- CLVKGYFPEPVTVTWNSGS- LSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKV DKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVV- DISKDD- PEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNG KEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKD- KVSLTCMITDFFPEDI-

TVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNT FTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG (SEQ ID NO: 39)

[0175] EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPG- TSPKLWIYSTSNLASGV-

PVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLE IKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID- GSERQNGVLNSWTD-

QDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN EC (SEQ ID NO: 40)

[0176] QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPG- TSPKLWIYSTSNLASGV-

PVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLE IKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID- GSERQNGVLNSWTD-

QDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN EC (SEQ ID NO: 41)

[0177] QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVR-

QPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYN- SALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSM EYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 42)

[0178] EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPG- TSPKLWIYSTSNLASGV-

PVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD- NALQSGNSQESVTE-

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 43)

[0179] QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPG- TSPKLWIYSTSNLASGV-

PVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD- NALQSGNSQESVTE-

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 44)

[0180] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVR- QAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYN-

SALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYS MEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSQED- PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 45)

[0181] (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração Chothia)

[0182] EVQVVESGGDLVKSGGSLKLSCAASGFPFSSYAMSWVR-

QTPDKRLEWVAIISSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQM SSLKSEDTAMYYCARHETAQAAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 46)

[0183] (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração Chothia)

[0184] EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIK- DYYMYWVKQRPEQGLEWIGRIAPED-

GDTEYAPKFQGKATVTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTEGNY YGSSILDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 47)

[0185] (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração Chothia)

[0186] QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFRSSW- MNWVKQRPGKGLE-

WIGQIYPGDDYTNYNGKFKGKVTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSAV YFCARLGPYGPFADWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 48)

[0187] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS-

SSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLAYGVPAR-

FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 49)

[0188] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQK- PDGTVKLLIYFTSRLHSGVPS-

RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 50)

[0189] QIVLTQSPAIVSASPGEKVTMTCSAS- SSVSYMYWYQQRPGSSPRLLIYDTSSLASGV-

PVRFSGSGSGTSYSLTISRIESEDAANYYCQQWNSDPYTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO: 51)

[0190] MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQD- GWTDSDPVHGYWFRAG-

DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRP (SEQ ID NO: 52)

[0191] DILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGAS- VSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHG- TSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVS (SEQ ID NO: 53)

[0192] YPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLR- LVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPS-

RSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTG TSRPVSQVTLAAVGG (SEQ ID NO: 54)

[0193] MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQD- GWTDSDPVHGYWFRAG-

DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPIEGRS- DKTHTCPPCPAPELL- GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL- PAPIEKTISKA-

KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 55)

[0194] MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQD- GWTDSDPVHGYWFRAG-

DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILG- TLESGHSRNLTCSV- PWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTC QVTLPGTGVTTTSTVRLDVSIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGG- PSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE- PQVYTLPPSREEMTKN-

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 56)

[0195] MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQD- GWTDSDPVHGYWFRAG-

DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILG- TLESGHSRNLTCSV- PWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTC QVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSS- LSVLEGQSLRLVCA- VNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRA QNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSD- KTHTCPPCPAPELLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA- PIEKTISKAKGQPRE-

PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT- QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 57)

[0196] MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPK- DDWTYSDPVHGYWFRAGDRPYQEA-

PVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSNDCSLSINDARKGDEGSYF FRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTALTQRPDILIQGTLES- GHPRNLTCSV- PWACEQRMPPMISWIGTSVSSLGPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQ VTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPPWNLTVTVFQGDDTASTALGNGSS- LSVLEGQSLRLVCAV- DSNPPARLSWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAE NPRGSQHISLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGGIEGRSD- KTHTCPPCPAPELLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA- PIEKTISKAKGQPRE-

PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT- QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 58)

[0197] MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPK- DDWTYSDPVHGYWFRAGDRPYQEA-

PVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSNDCSLSINDARKGDEGSYF FRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTALTQRPDILIQGTLES- GHPRNLTCSV- PWACEQRMPPMISWIGTSVSSLGPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQ VTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPPWNLTVTVFQGDDTASTALGNGSS- LSVLEGQSLRLVCAV-

DSNPPARLSWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAE NPRGSQHISLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGG(SEQ ID NO: 59)

[0198] Indivíduos

[0199] O indivíduo pode ser qualquer animal, incluindo um animal humano e não humano. Animais não humanos incluem todos os verte- brados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis, embora mamíferos sejam previstos como indivíduos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas e cavalos. O indivíduo pode também ser gado, tal como, gado, suíno, ovelha, aves domésticas, e cavalos, ou animais de estimação, tais como cães e ga- tos.

[0200] Em uma modalidade, os indivíduos incluem indivíduos hu- manos sofrendo de ou em risco de doenças e distúrbios médicos aqui descritos. O indivíduo é geralmente diagnosticado com a condição pelos versados na técnica, tal como um profissional médico.

[0201] Os métodos aqui descritos podem ser usados para indiví- duos de qualquer espécie, gênero, sexo, idade, população étnica, ou genótipo. Consequentemente, o sujeito de o termo inclui homens e mu- lheres, e inclui pessoas idosas, indivíduos na transição de adulto-para- idoso, indivíduos com idade de transição de pré-adultos-para-adultos, e pré-adultos, incluindo adolescentes, crianças e bebês.

[0202] Exemplos de populações étnicas humanas incluem Cauca- sianos, Asiáticos, Hispânicos, Africanos, Norte-Americanos de origem Africana, Norte-americanos Nativos, Semitas e populações das ilhas do Pacífico. Os métodos podem ser mais apropriados para algumas popu- lações étnicas tais como caucasianos, especialmente populações no Norte Europeu, assim como populações Asiáticas.

[0203] O termo indivíduo também inclui pessoas de qualquer genó- tipo ou fenótipo contanto que elas estejam em necessidade de trata- mento, conforme descrito acima. Além disso, o indivíduo pode ter o ge- nótipo ou fenótipo para qualquer cor do cabelo, cor do olho, cor da pele ou qualquer combinação dos mesmos. O termo indivíduo inclui um indi- víduo de qualquer altura de corpo, peso corporal, ou qualquer tamanho ou forma de órgão ou parte de corpo.

[0204] A invenção será descrita pelos exemplos não limitantes a se- guir.

[0205] Exemplo 1

[0206] Um sorotipo rh.10 AAV codificando para anti-Siglec F, um monoclonal à base de murino, anti-murino específico de eosinófilo (Song et al., 2009; Zimmermann et al., 2008; Bochner et al., 2009) foi preparado. Um vetor idêntico com a sequência monoclonal Anti-Eosinó- filo de murino anti-SiglecF substituída pela sequência para anti-Siglec8, um monoclonal, humanizado, humano específico de eosinófilo (Croker et al., 2007; Varki et al., 2006; Natku et al., 2003) também é preparado. Para avaliar a eficácia de LEXm03, foi usado um modelo de camun- dongo no qual AAVrh.10mIL5, um outro Vetor AAV, é administrado de forma intravenosa para modificar geneticamente o fígado para expres- sar de forma persistente e secretar altos níveis de interleucina 5 (IL5) do murino que, por sua vez, estimula a medula óssea para gerar de forma persistente altos níveis sanguíneos de eosinófilos (>100,000 eo- sinófilos/μL3), com invasão de tecido com eosinófilos e eventualmente morte. Os dados demonstram que LEXm03 induz a apoptose de eosi- nófilos in vitro e in vivo, e acentuadamente diminui os níveis de eosinó- filos no sangue no modelo de camundongo de CEL-NOS (vide Figura 5). Um resultado desta terapia é a supressão permanente e completa de eosinófilos. Isto foi observado em relatórios de casos humanos e pode ser administrado clinicamente (Franklin et al., 1981).

[0207] CEL-NOS é incomum, representando aproximadamente 1% dos casos de casos de hipereosinofilia crônica (Reuter et al. 2017), e assim é um distúrbio órfão raro. Para exemplo dos distúrbios hereditá- rios órfãos raros, existem várias razões para desenvolver uma terapia eficaz para o CEL-NOS. Primeiramente, CEL-NOS é um distúrbio fatal sem terapia disponível. Como é raro, não há terapia eficaz, e o fenótipo (hipereosinofilia) é facilmente medido, um pequeno teste de eficácia (se- guindo estudos iniciais de segurança) deve ser suficiente para o regis- tro. Segundo, como com os distúrbios hereditários raros, se eficaz, o valor de preço nas várias centenas de milhares de dólares deve ser pos- sível. Terceiro, o rAAV é uma estratégia de plataforma para uma varie- dade de distúrbios hipereosinofílicos muito mais comuns.

[0208] CEL-NOS é um distúrbio maligno fatal que representa uma necessidade médica não atendida sem uma terapia eficaz. Tentativas com terapias tais como inibidores de tirosina quinase, hidroxiureia, in- terferon- ou corticosteroides tiveram todos problemas (Gotlieb et al., 2015; Helbing et al., 2012). Uma vez que a patogênese de CEL-NOS é desconhecida, e a perda de função de órgão e morte eventual é direta- mente ligada a altos níveis de eosinófilos sanguíneos e as consequen- tes invasões de eosinófilos em tecidos, a estratégia lógica para o trata- mento De CEL-NOS É suprimir os números de eosinófilos sanguíneos em uma base persistente. A presente estratégia para desenvolver uma terapia eficaz para CEL-NOS é uma abordagem com terapia genética, usando um vetor da terapia genética adenoassociado para modificar ge- neticamente hepatócitos de fígado para expressar e secretar um anti- corpo monoclonal que se ligará a eosinófilos, iniciando a apoptose. Pri- meiro, independente dos mecanismos subjacentes à hipereosinofilia que caracteriza o CEL-NOS, a estratégia tem o objetivo diretamente na hipereosinofilia, a causa da invasão do órgão por eosinófilo e, portanto,

supressão da toxicidade do órgão que leva à disfunção do órgão e even- tualmente a morte. Segundo, em contraste com a administração do pró- prio monoclonal que é associada com altos picos e pontos baixos, e requer a administração a cada 2 a 4 semanas, dependendo da meia- vida monoclonal, a expressão gênica mediada por AAV do monoclonal pelo fígado irá fornecer, com uma única administração, níveis persisten- tes de altos títulos do monoclonal terapêutico. Terceiro, enquanto CEL- NOS é uma forma relativamente rara de hipereosinofilia, a estratégia para CEL-NOS representa uma estratégia de plataforma desenvolvida inicialmente para um distúrbio fatal, atualmente não tratável, que tem um alto risco de perfil de segurança. Se seguro e eficaz para CEL-NOS, a terapia pode ser desenvolvida para outras síndromes hipereosinofíli- cas mais comuns incluindo leucemias eosinofílicas causadas por rear- ranjo genético e uma variedade de distúrbios hipereosinofílicos não ma- lignos tais como vasculite eosinofílica e outros distúrbios autoimunes, síndrome hipereosinofílica, eosinofilia pulmonar tropical e distúrbios ató- picos incluindo esofagite eosinofílica e asma.

[0209] Os dados incluem: (1) geração e caracterização de LEXm03 (o vetor terapêutico usado no sistema murino) e AAVrh.10mIL-5 (o vetor de interleucina-5 de murino usado para gerar o modelo murino de CEL- NOS; Figuras 1 e 3); (2) caracterização do modelo murino de CEL-NOS (Figuras 3 e 4); e (3) eficácia de LEXm03 no modelo camundongo de CEL-NOS (Figuras 7-8).

[0210] Estudos de variação de dose demonstram que LEXm03 in- duz a apoptose de eosinófilos em murinos. O monoclonal Anti-Eosinófilo gerado in vitro e in vivo por LEXm03 é avaliado quanto à indução da apoptose de eosinófilos. No contexto de que o vetor LEXm03 foi gerado e mostrou funcionar in vitro e in vivo, e todos os ensaios são estabele- cidos, as doses de LEXm03 para efetivamente induzir a apoptose dos eosinófilos de murino in vitro e in vivo são determinadas. Para a avalia- ção in vivo, os estudos de variação de dose como uma função das doses crescentes de AAVrh.10mIL5 no modelo murino de CEL-NOS são ava- liados como uma função das doses crescentes de LEXm03, usando o ensaio do fluxo de lactaderina.

[0211] Tabela 2. Avaliação da variação de dose da capacidade de LEXm03 induzir a apoptose de eosinófilos no modelo murino de CEL-

NOS Modelo CEL-NOS LEXm03 ou AAVrh.10mIL5 (gc) controle (gc) # animais Tempo do ensaio (semanas)2 108, 109, 1010 109, 1010, 1011 n=5/condição 4, 8 1

[0212] O AAVrh.10mIL-5 e LEXm03 são administrados de forma intravenosa na ponta da cauda nos camundongos BALB/c ao mesmo tempo. Diferentes doses de AAVrh.10mIL5 serão usadas para induzir diferentes níveis de eosinofilia no sangue. Para cada dose de AAVrh.10mIL5, 3 doses de LEXm03 são testadas, por exemplo, 9 com- binações diferentes. Em cada pareamento dos 2 vetores n=5 camun- dongos serão avaliados, cada em 2 momentos (semanas 4 e 8)

[0213] Ensaio de citometria de fluxo de lactaderina, vide Figura 5.

[0214] Usando LEXm03, expandir os estudos de eficácia de murino preliminar demonstram que a administração intravenosa de quantidades variáveis de dose de LEXm03 geneticamente modificam hepatócitos para secretar o anticorpo monoclonal Anti-Eosinófilo suficiente para su- primir de forma significativa os níveis de eosinófilos no sangue no mo- delo murino AAVrh.10mIL5 de CEL-NOS com invasão diminuída de eo- sinófilos no tecido e morbidez e mortalidade reduzidas.

[0215] Métodos detalhados

[0216] LEXm03 (AAVrh.10mAnti-Eos). O vetor é compreendido do capsídeo rh.10 derivado de primata não humano pseudotipado com re- petições terminais invertidas de AAV2 circundando o cassete de expres- são anti-Siglec-F. O cassete de expressão consiste do intensificador do citomegalovírus (CMV), promotor de β-actina da galinha (promotor CAG), a sequência de cDNA anti-Siglec-F (clone 9C7, rat IgG2b) e sinal de poliadenilação β-globina de coelho. A sequência de CDNA anti-Si- glec-F foi otimizada quanto à estabilidade aumentada de mRNA e para reduzir a possibilidade de trans-inibição pelo mRNA mutante usando có- dons influenciados por camundongo e a remoção dos elementos de ins- tabilidade do mRNA, regiões GC baixa (<30%) ou ricas (>80%), sequên- cias de iniciação de tradução dentro da região de codificação e poten- ciais sinais de divisão. A sequência de cDNA anti-Siglec-F de compri- mento total otimizado foi sintetizada e clonada no plasmídeo pAAV sob controle do promotor CAG. O vetor AAVrh.10m.Anti-Eos foi produzido pela co-transfecção em células 293T renais embrionárias humanas (HEK 293T; American Type Culture Collection) do plasmídeo pAAV junto com um plasmídeo que carrega as proteínas AAV Rep derivadas de AAV2 necessário para replicação do vetor, as proteínas (Cap) estru- turais virais AAVrh.10 VP1, 2 e 3 (que definem o sorotipo do vetor rh.10 AAV produzido) e as funções auxiliares do adenovírus de E2, E4 e VA RNA. O vetor AAVrh.10m.Anti-Eos foi purificado pelo gradiente iodixa- nol e a cromatografia por troca aniônica QHP conforme descrito anteri- ormente. Os títulos de genoma do vetor foram determinados por análise quantitativa de PCR em Tempo real de TaqMan. Um vetor que codifica um anticorpo anti-anthraz protetor (controle AAVrh.10mIgG) foi usado como controle para os estudos in vivo.

[0217] AAVrh.10mIL-5. A sequência da IL-5 de murino foi obtida do Genbank (NM_010558.1). O vetor AAVrh.10mIL-5 é compreendido do capsídeo rh.10 derivado de primata não humano pseudotipado com re- petições terminais invertidas de AAV2 circundando o cassete de expres- são de IL-5 de murino. O cassete de expressão consiste do intensifica- dor do citomegalovírus (CMV), promotor de β-actina da galinha (promo-

tor CAG), a sequência de cDNA de IL-5 e sinal de poliadenilação β-glo- bina de coelho. A sequência de cDNA de mIL-5 foi otimizada quanto à estabilidade aumentada de mRNA e para reduzir a possibilidade de trans-inibição pelo mRNA mutante usando códons influenciados por ca- mundongo e a remoção dos elementos de instabilidade do mRNA, regi- ões GC baixa (<30%) ou ricas (>80%), sequências de iniciação de tra- dução dentro da região de codificação e potenciais sinais de divisão. A sequência de cDNA de mIL-5 otimizada de comprimento total foi sinte- tizada e clonada no plasmídeo pAAV sob o controle do promotor CAG. O vetor AAVrh.10mIL-5 foi produzido pela cotransfecção em células 293T renais embrionárias humanas conforme descrito para LEXm03.

[0218] Expressão in vivo de AAVrh.10m.anti-SiglecF em camundon- gos BALB/C. Para avaliar a expressão direcionada a LEXm03 de Anti- Eos in vivo, camundongos Balb/C machos e fêmeas, com idades de 6 a 8 semanas, foram injetados (de forma intravenosa em 100 μL) com uma dose única de AAVrh.10m.Anti-Eos (vide Tabela 2 para doses), ou con- trole AAVrh.10mIgG e 100 μl de controle PBS. O sangue (100 μL) foi coletado da veia da cauda e deixado coagular, 23°C, seguido de centri- fugação a 5,000 RPM por 10 min para coletar soro. Anti-SiglecF foi me- dido na semana 0 e os períodos de tempo durante o curso de 8 semanas por ELISA (Abcam), conduzida pelo protocolo do fabricante.

[0219] Modelo de IL-5 de camundongo. A fim de derivar de forma rápida e robusta um modelo de camundongo de CEL-NOS para testar a eficácia do vetor, IL-5 de murino foi superexpressada a partir de um ve- tor AAVrh.10 (AAVrh.10m.IL-5). Depois da administração intravenosa de doses crescentes de AAVrh.10mIL-5 (108, 109, 1010 gc), os níveis de mIL-5 no soro foram altamente elevados de uma forma dependente de dose quando medidos por ELISA (Abcam).

[0220] Ensaio de lactaderina. Os glóbulos brancos (WBC) isolados de camundongos concomitantemente tratados com AAVrh.10mIL-5

(2.5x1010 gc) ± LEXm03 ou AAVrh.10mIgGcontrol (1011 gc) foram mar- cados com anti-CCR3 para identificar eosinófilos e incubados com lac- taderina, que se liga a fosfatidilserina exposta, para identificar células nos estágios precoces de apoptose e analisadas por citometria de fluxo.

[0221] Contagens de eosinófilos. As contagens absolutas de eosi- nófilos no sangue periférico foram monitoradas a cada 2 semanas usando o contador celular do sistema de hematologia ADVI e esfrega- ços de sangue marcados com hematoxilina e eosina.

[0222] Sobrevivência. Os camundongos foram observados diaria- mente após a injeção do vetor quanto a sinais de deterioração na saúde. Se julgados moribundos (agitação severa, respiração dificultada, chi- ado, cianose e sem atividade depois do estímulo; todos sem recupera- ção), os camundongos foram sacrificados, e a data de morte foi regis- trada.

[0223] Dano/função do órgão. Os níveis sanguíneos de biomarca- dores de danos dos órgãos foram avaliados após a coleta de sangue por punção cardíaca no momento do sacrifício. As amostras foram cen- trifugadas (15 min, 4°C, 500 g) e o soro coletado. Os seguintes parâme- tros bioquímicos foram medidos no soro como marcadores de dano ou disfunção de órgãos múltiplos: aspartato aminotransferase de fígado no soro (AST); nitrogênio ureico no sangue - rins (BUN); isoenzima MB cre- atina quinase – cardíaca (CK-MB); endocan no soro - endotelial (ELISA, mouse Endocan DuoSet, R&D Systems); inflamação sistêmica – fator alfa de necrose tumoral (TNF-α).

[0224] Infiltração de eosinófilos em tecidos (imunofluorescência). Os órgãos coletados dos camundongos foram imediatamente colocados em solução Carnoy (60% de EtOH, 30% de clorofórmio e 10% de ácido acético) por 2 horas, seguido por 100% de EtOH por 1h, e 70% de EtOH para armazenagem a longo prazo. Inserção de parafina no órgão e mon- tagem de histologia/lâminas realizada por Histoserv (Germantown, MD).

As lâminas foram desparafinizadas com Histoclear (Fisher-Scientific), reidratadas e colocadas em banho de vapor a 88°C, 20min para recu- peração do antígeno. Os cortes dos tecidos foram então bloqueados com tampão Super Block (Thermo Fisher Scientific) em 4°C por 1 h se- guido pela incubação com anticorpo primário, Ab policlonal de MBP de coelho anticamundongo (Mybiosource), 20 μg/ml em 3% de FBS, 0,1% de saponina em PBS, a 4°C de um dia para o outro. Os cortes do tecido foram então incubados com Ab secundário, IgG de asno anti-coelho – Alexa fluor 647, (Invitrogen) 6 μg/ml em 3% de FBS, 0,1% de saponina em PBS, a 4°C, por 1 h. Os cortes do tecido foram então montados com reagente anti-desbotamento ProLong Gold com DAPI (Thermo Fisher Scientific) e avaliados através de microscopia de fluorescência usando um microscópio de fluorescência Zeiss Axiovert 200M.

[0225] Estatística. Os 2 estudos têm n = 5 camundongos/por sub- grupo de parâmetro de ensaio; este número fornece potência estatística para o estudo de eficácia com a possibilidade de um resultado discre- pante, dando uma chance razoável de que efeitos substanciais possam ser vistos. Por exemplo, se declararmos que uma única variável seja a medição de resultado, podemos mostrar que o uso de n = 5 por grupo dá uma boa chance de observar os efeitos do tratamento. Se declarar- mos que o coeficiente de variação de medição é de 60% para ambos os grupos, então n = 5/grupo fornece a capacidade de ver uma diferença de 3,2 vezes no escore médio entre 2 grupos com p<0,05 em 95% de potência. Todos os dados serão apresentados como meios ± erro pa- drão da média (SEM) a menos que de outra forma declarado. As dife- renças entre os grupos serão analisadas usando-se o teste t de duas caudas de Student.).

[0226] Exemplo II

[0227] Eosinófilos são células granulocíticas derivadas de medula óssea altamente especializadas que desempenham um papel no com- bate de parasitas e outros patógenos. Em indivíduos normais, as eosi- nófilos representam <5% de glóbulos brancos, persistem na circulação de 8 -12 horas, e sobrevivem em tecidos por 8 -12 dias. Se os eosinófi- los invadirem tecidos em números suficientes, eles causam dano e dis- função do órgão devido à liberação de mediadores citotóxicos.

[0228] A leucemia eosinofílica crônica - não especificada (CEL- NOS) é um distúrbio fatal do qual não há terapia eficaz. Uma terapia para CEL-NOS bem como outros distúrbios eosinofílicos é descrita aqui, que usa um vetor de terapia genética de vírus adenoassociado para mo- dificar geneticamente as células em um mamífero, por exemplo, no fí- gado, para gerar níveis persistentes de um anticorpo monoclonal Anti- Eosinófilo que induz morte celular programada de eosinófilos.

[0229] CEL-NOS é um subtipo de leucemia eosinofílica crônica com elevação persistente de eosinófilos de sangue >1,5x103/μL, associado com mieloblastos aumentados na medula negativos para cromossomo Filadélfia, BCR-ABL, rearranjos da fusão de PD6FRB, FIP1L1-PDG- FRA, PDGF2A ou PGFR1, outras neoplasias mieloproliferativas de anormalidade citogenética clonal. A patogênese é desconhecida. Ela ti- picamente afeta indivíduos com uma idade mediana de 62 anos, carac- terizada por disfunção de órgãos associados com invasão de eosinófi- los, perda de peso, tosse, fraqueza, diarreia, esplenomegalia, hepato- megalia, insuficiência cardíaca e pulmonar e sobrevivência de cerca de 2 anos. CEL-NOS não responde a inibidores da tirosina quinase, hidro- xiurea, interferon- ou corticosteroides.

[0230] Uma vez que a patogênese de CEL-NOS é desconhecida, a terapia mais direta é suprimir o número de eosinófilos no sangue, supri- mindo assim a invasão do tecido eosinofílico e a disfunção do órgão. A eficácia da terapia genética para um distúrbio eosinofílico exemplifica- dor, por exemplo, CEL-NOS, usando um vetor de vírus adenoassociado

(AAV) que codifica um monoclonal Anti-Eosinófilo foi determinada. AA- Vrh.10mAnti-Eos (LEXm03) foi administrado de forma intravenosa para modificar geneticamente as células, por exemplo, hepatócitos do fígado, para expressar e secretar um monoclonal Anti-Eosinófilo específico de murino, por exemplo, tendo uma sequência codificada pela SEQ ID NO: 1 ou 2, ou ambas, o qual induz a apoptose eosinofílica do murino. LEXh03 codifica um monoclonal Anti-Eosinófilo humanizado específico para eosinófilos humanos, por exemplo, tendo uma sequência codifi- cada pela SEQ ID NO:5, 6 ou 8, ou uma combinação das mesmas. Ou- tras sequências de anticorpo podem ser usadas, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51, ou sequências tendo pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, de identidade sequencial do aminoácido a esta, por exemplo, em sequên- cias framework ou uma ou mais CDRs das mesmas. Em uma modali- dade, o anticorpo tem sequências de região variável com pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial do aminoácido com as SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51, incluindo as sequências com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições relativas às SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51, em uma ou mais sequên- cias framework ou uma ou mais CDRs, ou qualquer combinação das mesmas.

[0231] Para avaliar a eficácia de LEXm03, foi preparado um modelo de camundongo CEL-NOS utilizando outro Vetor AAV (AAVrh.10mIL5) administrado de forma intravenosa para modificar geneticamente o fí- gado para expressar e secretar persistentemente altos níveis de inter- leucina-5 (IL5) de murino, que, por sua vez, estimula a medula óssea para gerar persistentemente altos níveis sanguíneos de eosinófilos (>100,000 eosinófilos/μL), com invasão de tecido por eosinófilos e even- tualmente morte. Os dados demonstram que LEXm03 induz a apoptose de eosinófilos in vitro e in vivo, e acentuadamente diminui os níveis de eosinófilos no sangue.

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[0267] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são in- corporados no presente documento a título de referência. Embora no relatório precedente esta invenção tenha sido descrita em relação a cer- tas modalidades preferidas da mesma, e muitos detalhes foram estabe- lecidos para fins de ilustração, será evidente para aqueles versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que cer- tos detalhes descritos no presente documento podem variar considera- velmente sem partir dos princípios básicos da invenção.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de inibição ou tratamento de uma doença ou dis- túrbio hipereosinofílico em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao mamífero uma composição compreen- dendo um vetor de expressão viral compreendendo uma fase de leitura aberta que codifica um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, a presença da qual no mamífero, aumenta o número de eosinófilos, em uma quantidade eficaz para inibir ou tratar a doença ou distúrbio hipereosinofílico no mamífero.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a doença é câncer, asma, esofagite, eosinofilia pulmonar tropical, uma doença alérgica ou atópica, gastroenterite, uma doença hepatobiliar, meningite, uma doença cardíaca, um distúrbio ge- nitourinário, uma imunodeficiência, um distúrbio endocrinológico, um distúrbio pulmonar, uma doença de pele, artrite reumatoide ou vasculite.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a quantidade é eficaz para diminuir o percentual de eosinófilos no mamífero em pelo menos 1%, 5%, 10%, 30%, 50% ou até 90%.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão viral é um vetor de vírus adenoassociado , vetor de lentivírus, vetor de retrovírus ou um vetor de adenovírus.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que AAV é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh10.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimé- rico, humanizado, scFv, Fv, Fabʹ, moléculas de cadeia única contendo um VL, domínio de ligação ao antígeno de VH e um ou dois domínios constantes, ou anticorpo totalmente humano.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga um ligante em eo- sinófilos.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um carboidrato.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracte- rizado pelo fato de que o ligante é um membro da família de sialoade- são.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga ácido siálico que liga lectina 8 do tipo Ig.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão viral codifica um anticorpo compreendendo um polipeptídeo que compreende uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:1 ou 2 e op- cionalmente um polipeptídeo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade sequencial do aminoácido com a SEQ ID NO:3 ou 4, ou uma combinação dos mesmos.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão codifica um anticorpo compreendendo um polipeptídeo que compreende uma se- quência tendo pelo menos 80% de identidade sequencial do aminoácido com um polipeptídeo compreendendo as SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51, ou qualquer combinação das mesmas.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão viral codifica um anticorpo com uma região constante de IgG.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão viral codifica um anticorpo compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma re- gião constante de cadeia leve lambda.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão viral codifica um anticorpo compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma re- gião constante de cadeia leve kappa.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada sis- temicamente.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada de forma intravenosa.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ao sistema nervoso central ou de forma intracraniana.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é expressado a partir de um promotor viral endógeno.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o promotor endógeno é modificado para ser induzível.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é expressado a partir de um promotor endógeno no vetor de expressão viral que é operacio- nalmente ligado à fase de leitura aberta.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o promotor é induzível.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão viral ainda compreende um gene suicida.

26. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade de um lentivírus, retrovírus, adenovírus isolado recombinante ou AAV compreendendo um vetor de expressão que compreende uma fase de leitura aberta codificando um anticorpo que se liga a um ligante em eosinófilos ou que liga uma molécula, cuja presença em um mamífero, aumenta o número de eosinófilos, eficaz para diminuir o número de eosinófilos em um mamífero.

27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende um polipep- tídeo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80% de identi- dade com a sequência de aminoácido a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:1 ou 2 ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade sequencial do aminoácido a um polipeptídeo compreendendo uma das SEQ ID Nos. 3-6, 8-32, 40-41, 43-44 ou 46-51.

28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o anticorpo liga Siglec-8, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-9, IL-9R, IL-13, IL-13R, IL-17, IL-17R, IL-33, IL-33R, CD30, CD52, CCR3, IgE Fc, RADCP ou TNF-alfa.

29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que é formulada para liberação intravenosa.