PT1664315E - Vectores aav para tratamento genético in vivo de artrite reumatóide - Google Patents

Description

Descrição

VECTORES AAV PARA TRATAMENTO GENÉTICO IN VIVO DE ARTRITE REUMATÓIDE

Campo da invenção A presente descrição refere-se ao campo de tratamento genético com base em vírus adeno-associados (AAV), em particular, tratamento genético in vivo de artrite reumatóide (AR) . A descrição providencia viriões recombinantes AAV que são altamente eficazes na administração de genes que codificam proteínas terapêuticas, tais como proteínas anti-inflamatórias ou proteínas que inibem a actividade NF-κΒ, nas articulações, e métodos para uso de tais viriões em terapia genética in vivo e ex vivo.

Antecedentes da invenção A artrite reumatóide (AR) é uma doença destrutiva progressiva que afecta principalmente as articulações e é caracterizada pela hiperproliferação de tecido sinovial e a infiltração de células derivadas de sangue resultando na erosão progressiva da cartilagem e do osso. Foi indicado que a incidência de AR é cerca de 30 em cada 100 000 na população, e esta pode afectar qualquer grupo etário, desde crianças a idosos. A prevalência da doença é aproximadamente 1 por cento a nível mundial. Assim, existem aproximadamente 150 000 pacientes com AR, apenas nos Países Baixos. O pico de surgimento encontra-se entre as idades de 30 e 55 e, devido aos índices consistentemente mais altos em mulheres, a prevalência de AR em mulheres acima dos 65 anos de idade é de até 5 por cento. 1/55 A AR é associada a um alto grau de perda económica, morbidez e mortalidade precoce. Como exemplo, quase 80 por cento de pacientes num centro foram seriamente afectados depois de 20 anos de seguimento; um terço adicional morreu. Os pacientes com AR que requerem cuidado hospitalar aumentaram, pelo menos, duas vezes a mortalidade quando comparado com pessoas normais, e a AR mais grave está associada a índices de mortalidade mais altos. O excesso de mortalidade na AR grave foi comparado com arteriopatia coronária dos três vasos ou doença de Hodgkin de fase IV.

Uma apreciação dos mecanismos patogénicos de AR e os maus resultados com o tratamento convencional levaram ao conceito recente de tratamento agressivo de doença precoce ou recém-diagnosticada para suprimir a inflamação em curso e prevenir feridas na articulação. O tratamento com medicamentos é o suporte principal de tratamento para todos os pacientes, excepto aqueles em remissão clínica. Tal tratamento deveria ser instituído com o objectivo de tratar suficientemente cada doente para induzir uma remissão e prevenção de outras perdas de tecidos de articulações ou função em actividades diárias. Adicionalmente ao tratamento convencional com medicamentos anti-reumáticos que modificam a doença, foram introduzidos novos métodos com o objectivo de bloquear TNF-α na prática. É agora possível alcançar 20% de melhoria em aproximadamente 70% de pacientes com AR usando este método. A maioria destes 20% de pacientes da American College of Rheumatology (ACR); no entanto, ainda terão algumas articulações activamente inflamadas. Aproximadamente, 30% dos pacientes não responderá ao bloqueio de TNF-α relativamente à actividade da artrite. 2/55 intra-articulares

Os corticosteróides intra-articulares são um suporte principal importante do tratamento de sinovite sintomática em pacientes com AR. Especialmente quando existe actividade de artrite isolada sob tratamento sistémico anti-reumático, como pode ocorrer na maioria dos pacientes, existe uma indicação para tratamento local. No entanto, nem todos os pacientes respondem ao uso de corticosteróides e o seu uso é limitado pelos efeitos secundários. A patologia de AR estende-se em toda a articulação sinovial. Em contraste com a natureza acelular do líquido sinovial normal, o líquido sinovial da AR é enriquecido predominantemente com neutrófilos, mas também estão presentes macrófagos, linfócitos T e células dendríticas (Tak, P.P. Examination of the synovium and synovial fluid. Em: Firestein GS, Panayi GS, Wollheim FA, editors. Rheumatoid arthritis. Frontiers in pathogenesis and treatment. New York: Oxford University Press, Inc., 2000: 55-68). O aumento na celularidade é mais óbvio na membrana sinovial, a qual se torna infiltrada por células recrutadas do sangue. A camada de revestimento da articulação aumenta de 1-2 células a 6-8 células de espessura e consiste principalmente em macrófagos intimos activados e sinoviócitos tipo fibroblasto. As alterações na biologia normal de sinoviócitos são importantes no desenvolvimento e manutenção do processo patológico associado a AR, incluindo invasão e destruição de cartilagem articular e do osso. Adicionalmente à produção de mediadores solúveis, tais como elastase e colagenase, os sinoviócitos mediam este processo patofisiológico pela expressão de proteínas de superfície celular, que estão envolvidas no recrutamento e activação de linfócitos e macrófagos na membrana sinovial reumatóide. Os sinoviócitos podem-se alcançar facilmente via o espaço intra-articular, têm uma longevidade relativamente longa, e 3/55 representam deste modo um objectivo ideal para estratégias de terapia genética (Chernajovsky, Y. et al., 1998, Drug Aging 12:29-41 Robbins, P. D. et al., 1998, Springer Semin. Immunopathol. 20:197-209).

Além disso, a natureza localizada da conexão torna o tratamento genético in vivo muito atractivo. Muitas interacções moleculares e celulares na membrana sinovial reumatóide são mantidas e moduladas por citocina. Um resultado consistente na AR foi a abundância de citocinas pró-inflamatórias derivadas de macrófagos e fibroblastos tais como IL-1, TNFa, e IL-18 na membrana sinovial reumatóide. Os inibidores de origem natural IL-1 e TNFa, antagonista receptor de IL-1 (IL-1RA) e os receptores solúveis TNFa p55 e p75 são produzidos em paralelo com as suas cópias. Para IL-18, uma proteína de ligação IL-18 é purificada. As terapias que providenciam excesso de inibidores de citocina recombinantes podem desviar o equilíbrio na AR para um estado anti-inflamatório. A eficácia clínica de métodos dirigidos a anti-TNF-α e anti-IL-1 destaca que certas citocinas são alvos adequados para tratamento genético. Outro método poderia ser a sobreexpressão dirigida de proteínas anti-inflamatórias biologicamente activas (por exemplo, IL-4 IL-10 IL-13, e IFN-β) por sinoviócitos para inibir a cascata inflamatória (Boyle, D. L. et al., 1999, Gene Ther. 6:1911-1918). O NF-κΒ é claramente um dos reguladores de expressão de gene pró-inflamatório mais importante (Tak, P. P. and Firestein, G. S., 2001, J. Clin. Invest. 107(1): 7-11). Synthesis of cytokines, such as TNF-a, IL-Ιβ, IL-6, and IL-8 is mediated by NF-κΒ, as is the expression of Cox-2. Aupperle et al. (1999, J. Immunol. 163: 427-433) estudou recentemente a função de IKK em sinoviócitos tipo 4/55 fibroblastos primários isolados de membranas sinoviais de pacientes com AR e osteoartrite. Em ambos os grupos, a proteína imunoreactiva IKK é abundante nestas células, e IKK-oí e IKK- β são constitutivamente expressas no nível ARNm. A função IKK nestas células pode ser muito melhorada por TNF-oí e IL-1, conduzindo à degradação do ΙκΒ-α endógeno e translocação nuclear de NF-κΒ. A activação desta via e a indução consequente de IL-6, IL-8, ICAM-1, e expressão de colagenase-1, depende especificamente de ΙΚΚ-β (Aupperle, K. R. et al., 1999, J. Immunol. 163: 427-433) . Assim, a transfecção com construções adenovirais que codificam um IKK- β dominante negativo mutante impede a translocação nuclear NF-κΒ mediada por TNF-α e expressão genética pró-inflamatória em sinoviócitos, ao passo que IKK-α dominante negativo mutante não tem nenhum efeito (Aupperle, K. R. et al. , 1999, J. Immunol. 163: 427-433).

Os modelos animais de artrite inflamatória sustentam a noção de que a activação de NF-κΒ desempenha uma função patogénica in vivo. Por exemplo, a união sinovial de NF-κΒ aumentada precede ao desenvolvimento de implicação clínica da articulação na artrite induzida por colagénio nos murinos e aumenta gradualmente durante a evolução da doença (Han, Z. N., et al. 1998, Autoimmunity 28: 197-208). Muita desta actividade de união parece dever-se a p50, que foi implicado na transcrição de colagenase-3 e poderia contribuir, com AP-1 localmente activado, para a reabsorção de matriz extracelular. A activação sinovial NF-κΒ também ocorre no prazo de alguns dias depois da imunização na artrite adjuvante no rato (Tsao, P. W. et al. 1997, Clin. Immunol. Immunopathol. 83: 173-178). A activação selectiva de NF-κΒ em ratos normais por transferência intra-articular de um gene ΙΚΚ-β funcional, leva a inflamação sinovial e sinais clínicos de artrite (Tak, P. P. et al., 2001, 5/55

Arthritis Rheum. 44(8): 1897-907). Por outro lado, a redução de translocação nuclear e sinovite clínica de NF-kB foi observada na artrite adjuvante em ratos após uma injecção intra-articular com um construção ΙΚΚ-β adenoviral negativo dominante (Tak, P. P. et al., 2001, Arthritis Rheum. 44(8): 1897-907). O papel central de NF-κΒ na inflamação também foi mostrado em ratos com artrite induzida pela parede de célula estreptococal (Miagkov, A. V. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 13859-13864) e em ratos com artrite induzida por colagénio (CIA) (Gerlag, D. M. et al., 2000, J. Immunol. 165: 1652-1658; Han, Z. N. et al. 1998, Autoimmunity 28:197-208).

Portanto, várias estratégias com o objectivo de aumentar a produção local de proteínas anti-inflamatórias ou com o objectivo de inibir a actividade NF-κΒ no compartimento sinovial por tratamento genético in vivo é uma grande promessa para o tratamento de AR.

Para permitir a produção local sustentada de doses eficazes de proteínas terapêuticas na articulação, em particular na membrana sinovial reumatóide, é necessário desenvolver um sistema de entrega de gene eficaz. Existe um intervalo de diferentes vectores não víricos e víricos, tais como vectores adenovirais, vectores de vírus adeno-associados, vectores retrovirais, vectores de vírus de herpes, lipossomas, vacinação de ADN e afins (ver Vervoordeldonk M.J.B.M e Tak P.P. 2001, Best Practice & Research Clinicai Rheumatology Vol.15 (5): 771-788). Até à data, os vectores principalmente adenovirais foram avaliados como vectores para administração de gene. No entanto, a sua natureza epissómica limita a duração da expressão genética, tornando-os assim não muito adequados para o tratamento da artrite, onde é necessária a expressão genética a longo 6/55 prazo. Outra desvantagem de vectores adenovirais é a presença de proteínas virais, que podem suscitar uma resposta imunitária no hospedeiro.

Os vectores víricos adeno-associados (AAV), por outro lado, demonstraram (em alguns tecidos) integrar-se no genoma da célula alvo (Hirata et al. 2000, J. of Virology 74:4612-4620), permitindo a expressão transgénica a longo prazo em células transduzidas. O vírus adeno-associado é um parvovírus ADN dependente de um vírus auxiliar, que não está associado à doença em seres humanos ou mamíferos (para revisão ver Berns and Bohensky, 1987, Advances in Vírus Research, Academic Press Inc, 32: 243-307). Os vectores de AAV recombinantes demonstraram ser capazes de transfectar um intervalo de diferentes tipos de células, tais como células hematopoiéticas, células respiratórias epiteliais e neurónios. No entanto, para muitos tipos de células (tais como, por exemplo, células sinoviais, mas também muitas outras) não é claro se podem ou não transfectadas, de todo ou eficazmente, pelos vectores AAV. Pan et al. (J. of Virology 1999, Vol 73, 4: 3410-3417) foram capazes de transfectar sinoviócitos de rato que apresentam sintomas de artrite induzida por lipopolissacárideos usando vectores rAAV, mas descobriram que a expressão transgénica diminui quando a inflamação reduziu. Além disso, a literatura indica resultados amplamente divergentes de experiências que tentam a administração de genes in vivo em articulações com vectores baseados em AAV (Ghivizanni et al. 2000, Drug Discov. Today 6:259-267).

Um factor de complicação é que os serótipos AAV diferem em tropismo celular. 0 documento WO99/61601, por exemplo, mostra que vectores com base em AAV5 transduziram certos tipos de células (células epiteliais das vias respiratórias 7/55 cultivadas, células de músculo estriado cultivadas e células endoteliais da veia umbilical humanas cultivadas) numa eficiência mais elevada que AAV2. Por outro lado, AAV5 foi muito mais ineficiente na transdução de células COS cultivadas, células 293, HeLa, IB3 e linhas celulares MCF7, enquanto AAV2 e AAV5 mostraram pouca eficiência de transdução para NIH 3T3, skbr3 e linhas celulares t-47D. 0 documento WOOO/73481 descreve um vector derivado de rAAV2 que codifica um polipeptídeo de fusão, compreendendo um domínio extracelular de um receptor TNFa e o domínio (Fc) constante de uma molécula IgGl e, opcionalmente, um antagonista de IL-1. Os vectores são unidos numa partícula de vírus com proteínas do capsídeo do AAV2 e são injectados nas articulações num modelo de rato de artrite, levando a uma redução na inflamação da articulação.

Apesar da disponibilidade dos sistemas acima de administração de gene não vírico e vírico, não existe, até à data, nenhum sistema de vector adequado para a administração eficaz de genes (que codificam proteínas terapêuticas) à membrana sinovial reumatóide de sujeitos que sofrem de artrite reumatóide. Contudo, permanece uma necessidade de gerar um sistema de administração de gene in vivo e ex vivo adequado à sinovial para permitir um tratamento eficaz. A presente invenção proporciona tal sistema de administração de gene.

Sumário da invenção A invenção providencia um virião rAAV que compreende proteínas capsídicas de AAV serótipo 5, com o qual o virião rAAV compreende um vector rAAV2 que compreende um elemento de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos 8/55 nucleicos que codifica uma proteína terapêutica eficaz contra a artrite reumatóide.

Estes viriões rAAV, uma célula sinovial transduzida com os mesmos e/ou composições farmacêuticas que compreendem os ditos viriões ou as ditas células destinam-se para uso no tratamento da artrite reumatóide, como se descreve nas reivindicações em anexo.

Numa forma de realização alternativa, a invenção providencia métodos para transduzir células sinoviais reumatóides ex vivo usando um virião rAAV como descrito anteriormente, opcionalmente seleccionando as células transduzidas.

Noutra forma de realização, esta descrição refere-se a um virião recombinante AAV que compreende proteínas capsídicas de AAV serótipo 5 ou AAV serótipo 2, em que o virião rAAV compreende um vector rAAVX, onde o vector rAAVX compreende um elemento de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica eficaz contra a artrite reumatóide.

Descrição das figuras

Figura 1

Coloração X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D- galactopiranosidase) (resultados de análise de imagem quantificada digital) de coloração directa in situ de secções congeladas de articulações de rato, tratadas transduzidas com rAAVl, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, um vector de controlo e adenovírus expressando o gene para LacZ. 9/55

Figura 2

Coloração directa in situ de X-Gal (azul) de secções congeladas de articulações de rato injectadas com rAAVl a rAAV2.

Figura 3

Mapa físico de plasmídeo pVDll com um vector rAAV2, onde uma cassete de expressão que contém as sequências de codificação E. coli LacZ accionadas pelo promotor CMV são acompanhadas pelas sequências AAV2 ITR.

Figura 4

Expressão beta-gal no tecido sinovial de rato 1, 2, 3 e 4 semanas depois da injecção i.a de rAAV 2 e 5, quantificada por análise de imagem digital.

Figura 5

Desenvolvimento de anticorpos de neutralizaçao no soro depois da injecção intra-articular de rAAV2 ou rAAV5.

Figura 6 0 rAAV 5 media a transferência de gene para sinoviócitos humanos tipo fibroblasto (FLS) in vitro. Os FLS humanos isolados de biopsias sinoviais de pacientes com AR foram transduzidos com AAV5.GFP. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram fixadas por microscopia fluorescente. A: células fluorescentes, B: fotografia de contraste de fase. 10/55

Descrição detalhada da invenção A. Definições gerais "Gene" ou "sequência codificadora" refere-se a uma região ADN ou ARN (a região transcrita) que "codifica" uma proteína particular. Uma sequência codificante é transcrita (ADN) e traduzida (ARN) num polipeptídeo quando se coloca sob o controlo de uma região reguladora apropriada, tal como um promotor. Um gene pode compreender diferentes fragmentos operativamente unidos, tais como um promotor, uma sequência líder 5', uma sequência codificante e uma sequência não traduzida 3', compreendendo um sítio de poliadenilação. Um gene recombinante ou quimérico é um gene normalmente não encontrado na natureza, tal como um gene onde, por exemplo, o promotor não está associado na natureza com parte ou toda a região de ADN transcrita. "Expressão de um gene" refere-se ao processo onde um gene é transcrito num ARN e/ou traduzido numa proteína activa.

Como utilizado neste caso, o termo "promotor" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizado a montante relativamente à direcção de transcrição do sítio de iniciação de transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de união para polimerase de ARN dependente de ADN, sítios de iniciação de transcrição e qualquer outra sequência de ADN, incluindo, mas não limitado a, sítios de união de factores de transcrição, sítios de união de proteína activadores e repressores, e qualquer outra sequência de nucleótidos conhecida por um especialista na técnica para actuar directa ou indirectamente para regular a quantidade de transcrição do promotor. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é activo na maioria dos tecidos sob a maioria 11/55 das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor "induzivel" é um promotor que é regulado em termos fisiológicos ou de desenvolvimento. Um promotor "especifico de tecido" só é activo em tipos específicos de tecidos ou células.

Como se utiliza neste caso, o termo "operativamente unido" refere-se a dois ou mais ácidos nucleicos ou elementos de sequência de aminoácidos que são fisicamente unidos para que estejam numa relação funcional entre si. Por exemplo, um promotor é operativamente unido a uma sequência codificante se o promotor for capaz de iniciar, ou de outra forma controlar/regular a transcrição e/ou expressão de uma sequência codificante, em cujo caso a sequência codificante deveria ser entendida como estando "sob controlo" do promotor. Geralmente, quando duas sequências de ácidos nucleicos são operativamente unidas, estas estarão na mesma orientação e normalmente também na mesma cadeia de leitura. Normalmente, também são essencialmente contíguas, ainda que isto possa não ser necessário.

Os termos, "sequência de sinal" "péptido sinal" e "líder secretor" são usados de forma permutável e referem-se a uma extensão curta contínua (em geral, aproximadamente, 15-60 aminoácidos), de aminoácidos normalmente presentes no amino-terminal de polipéptidos unidos de membrana e segregados, e que dirigem a sua administração a vários locais exteriores ao citosol. Assim, os sinais específicos de selecção ou orientação, que incluem sequências de sinal, podem dirigir a administração de polipéptidos para o núcleo, ER, mitocôndria, peroxissomas, etc. As sequências de sinal contêm normalmente um núcleo hidrofóbico de aproximadamente 4-15 aminoácidos, que é frequentemente precedido imediatamente por um aminoácido básico. Na 12/55 extremidade carboxi-terminal do peptídeo sinal existe um par de pequenos aminoácidos sem carga, separados por um único aminoácido de intervenção que define o local de cisão do peptideo sinal (von Heijne, G. (1990) J. Membrane Biol. 115: 195-201). Apesar da sua estrutura geral e semelhanças funcionais, os peptídeos sinal nativos não têm uma sequência de consenso. "Entrega de gene" ou "transferência de gene" refere-se a métodos para introdução fiável de ADN exógeno ou recombinante em células hospedeiras. 0 ADN transferido pode permanecer não integrado ou integrado preferencialmente no genoma da célula hospedeira. A entrega de gene pode acontecer, por exemplo, por transdução, usando vectores viricos, ou por transformação de células, usando métodos conhecidos, tais como electroporação, bombardeamento celular e afins. "Vector" refere-se geralmente a constructos de ácidos nucleicos adequadas para clonagem e expressão de sequências nucleotidicas. O termo vector pode também por vezes referir-se a veículos de transporte compreendendo o vector, tal como vírus ou viriões, os quais são capazes de transferir o vector em e entre células hospedeiras. "Vector rAAV", como utilizado neste caso, refere-se a um vector recombinante derivado de um serótipo de vírus adeno-associado, tal como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 e outros. Os vectores rAAV têm um ou, preferencialmente, todos os genes AAV do tipo selvagem eliminados, mas ainda compreendem sequências de ácidos nucleicos funcionais ITR. As sequências funcionais ITR são necessárias para a replicação, resgate e união de viriões AAV. As sequências ITR podem ser sequências do tipo selvagem ou sequências 13/55 substancialmente idênticas (como se define de seguida) ou podem ser alteradas por, por exemplo, inserção, mutação, eliminação ou substituição de nucleótidos, enquanto estas permanecem funcionais. "Vector rAAV", como se utiliza neste caso, refere-se a um vector recombinante AAV, compreendendo as sequências de ácidos nucleicos ITR de qualquer um dos serótipos AAV, ou sequências de ácidos nucleicos que são substancialmente idênticas às sequências ITR do tipo selvagem do serótipo particular AAV, enquanto estas permanecem funcionais. As sequências de nucleótidos de eleição são inseridas entre as sequências ITR AAV, por exemplo, construções de expressão compreendendo um elemento regulador de expressão, operativamente unido a uma sequência codificante e uma sequência de terminação 3'. 0 termo "vector rAAVX", como se utiliza neste caso, refere-se a um vector recombinante AAV compreendendo as sequências de ácidos nucleicos ITR do serótipo AAVX, ou sequências de ácidos nucleicos que são substancialmente idênticas às sequências do serótipo AAVX ITR do tipo selvagem, enquanto estas permanecem funcionais. 0 termo "vector rAAV2" ou "vector AAV5" é assim usado para indicar um vector rAAV2 ou rAAV2 compreendendo respectivamente as sequências de ácidos nucleicos ITR de AAV serótipo 5 ou serótipo 2, ou sequências de ácidos nucleicos substancialmente idênticas a estes. "Virião AAV" refere-se a uma partícula de vírus completa, tal como, por exemplo, uma partícula de virião AAV do tipo selvagem, que compreende ADN de genoma de cadeia simples em proteínas capsídicas AAV. A molécula de ácido nucleico de cadeia simples é cadeia sentido ou cadeia anti-sentido, enquanto ambas as cadeias são igualmente infecciosas. Um "virião rAAV" refere-se a uma partícula de vírus 14/55 recombinante AAV, ou seja, uma partícula que é infecciosa mas de replicação defeituosa. É composto por um revestimento de proteína de AAV e compreende um vector rAAV. No contexto da presente invenção, o revestimento de proteína pode ser de um serótipo diferente ao do vector rAAV. Um virião AAV da invenção pode assim ser composto por um revestimento de proteína, ou seja, o capsídeo icosaédrico, que compreende proteínas capsídicas (VP1, VP2, e/ou VP3) de um serótipo AAV, por exemplo, AAV serótipo 5, ao passo que o vector rAAV, contido nesse virião AAV5 pode ser qualquer um dos vectores rAAVX anteriormente descritos, incluindo um vector AAV5. Um "virião AAV5" compreende assim proteínas capsídicas de AAV serótipo 5, enquanto, por exemplo, um virião rAAV2 compreende proteínas de cápside de serótipo AAV 2, em que cada um pode compreender qualquer um dos vectores rAAVX da invenção. "Funções auxiliares de AAV" referem-se geralmente às funções AAV correspondentes requeridas para replicação de rAAV e união fornecidas ao virião rAAV ou vector rAAV em in trans. As funções auxiliares AAV complementam as funções AAV que faltam no vector rAAV, mas carecem de ITR AAV (que são providas pelo vector rAAV). As funções auxiliares AAV incluem as duas maiores ORF de AAV, a saber, a região de codificação rep e a região de codificação cap ou sequências funcionais substancialmente idênticas das mesmas. As regiões Rep e Cap são bem conhecidas na técnica, ver, por exemplo, Chiorini et al. (1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319) ou documento US 5,139,941, aqui incorporados como referência. As funções auxiliares AAV podem ser providas num constructo auxiliar AAV. A introdução do constructo auxiliar na célula hospedeira pode ocorrer, por exemplo, por transformação ou transdução antes de ou simultaneamente com a introdução do vector rAAV. Os 15/55 constructos auxiliares AAV da invenção podem assim ser escolhidas para que estas produzam a combinação desejada de serótipos para as proteínas da cápsíde do virião rAAV, por um lado, e para a replicação do vector rAAVX e união, por outro lado. "Vírus auxiliar de AAV" proporciona funções adicionais requeridas para replicação de AAV e união. Vírus auxiliares adequados AAV incluem adenovírus, vírus herpes simples (tal como tipos HSV 1 e 2) e vírus de vaccinia. As funções adicionais providas pelo vírus auxiliar podem também ser introduzidas na célula hospedeira via vectores, como se descreve no documento US 6,531,456, incorporado aqui como referência.

Um "transgene" é aqui definido como um gene que foi introduzido recentemente numa célula, ou seja, um gene que normalmente não ocorre na célula. 0 transgene pode compreender sequências que são nativas à célula, sequências que naturalmente não ocorrem na célula e pode compreender combinações de ambos. Um transgene pode conter codificação de sequências para uma ou mais proteínas que podem estar operativamente unidas a sequências reguladoras apropriadas para expressão das sequências de codificação na célula. Preferencialmente, o transgene está integrado no genoma da célula hospedeira. "Transdução" refere-se à administração de uma molécula de ADN numa célula hospedeira receptora por um virião AAV. Por exemplo, a transdução de uma célula alvo por um virião rAAV da invenção conduz à transferência do vector rAAVX contida neste virião na célula transduzida. "Célula hospedeira" ou "célula alvo" refere-se à célula na qual a administração de ADN se desenvolve, tal como os sinoviócitos de um sujeito. 16/55

Os virioes AAV são capazes de transduzir ambas as células de divisão e de não divisão. "Sujeitos" significa qualquer membro da classe dos mamíferos, incluindo, sem limitação, seres humanos, primatas não humanos, animais de quinta, animais domésticos e animais de laboratório. 0 termo "intra-articular" refere-se ao interior de uma articulação, por ex., joelho, cotovelo, ombro, tornozelo, pulso, etc. Assim, uma injecção intra-articular é uma injecção no espaço entre os ossos de uma articulação. No joelho, "intra-articular" refere-se ao espaço entre o fémur e a tíbia, atrás e em redor da rótula. 0 termo "identidade substancial" significa que dois peptídeos ou duas sequências de nucleótidos, quando estão alinhados optimamente, tal como pelo programa GAP ou BESTFIT usando parâmetros predeterminados, proporcionam pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 90 por cento de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95 por cento de identidade de sequência ou mais (por exemplo, 99 por cento de identidade de sequência) . GAP usa o algoritmo de alinhamento global Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências ao longo do seu comprimento total, maximizando o número de coincidências e minimizando o número de espaços. Geralmente, os parâmetros GAP predeterminados são usados, com uma penalização de criação do espaço = 50 (nucleótidos) / 8 (proteínas) e penalização de extensão do espaço = 3 (nucleótidos) / 2 (proteínas). Para os nucleótidos, a matriz de pontuação predeterminada usada é nwsgapdna, e para proteínas, a matriz de pontuação predeterminada é Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992). 17/55 deve ser 0 termo "compreendendo" deve ser interpretado como especificando a presença das partes declaradas, passos ou componentes, mas não exclui a presença de uma ou mais partes adicionais, passos ou componentes. Uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo a região X, pode assim compreender regiões adicionais, ou seja, a região X pode ser incorporada numa região de ácido nucleico maior. B. Formas de realização da invenção 0 AAV é um virus de ADN não revestido, que requer um virus auxiliar para replicar. Os vectores recombinantes AAV têm várias vantagens importantes relativamente a outros vectores, uma vez que não são patogénicos em seres humanos, imunologicamente inertes e permitem a expressão genética in vivo a longo prazo. A sua capacidade para mediar a expressão de genes terapeuticamente pertinentes é agora bem estabelecida em diferentes modelos experimentais de artrite. Ainda que um número cada vez maior de serótipos AAV foi identificado, todos os estudos até ao momento foram realizados com serótipo 2 (AAV2). Os diferentes serótipos têm diferentes proteínas de revestimento de viriões e, como consequência, variam no seu tropismo.

Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que os viriões AAV de diferentes serótipos variam consideravelmente na sua eficiência de transdução quando usados como vectores AAV para administração de genes in vivo às articulações artríticas, em particular, à sinovial. Quando se comparam os rendimentos de transdução de viriões recombinantes compreendendo vectores rAAV baseados em cinco serótipos AAV diferentes (AAV1 a AAV), codificando a fosfatase alcalina segregada murina de genes repórter 18/55 (mSEAP) ou beta-galactosídase de E. coli (beta-Gal), em dois diferentes modelos de animais de artrite (rato e camundongo) , foi surpreendentemente descoberto que a transferência de gene in vivo era muito mais eficaz com viriões AAV5 do que com os viriões baseados em serótipos A AVI a AAV4. Os inventores foram assim capazes de providenciar um sistema de administração de gene eficaz para células sinoviais. Assim, a invenção descreve métodos terapêuticos para o tratamento de artrite reumatóide, em particular, o tratamento de articulação reumatóide, com base em tratamento genético in vivo da membrana sinovial reumatóide. É uma forma de realização da invenção proporcionar usos nos quais as moléculas de ácido nucleico são administradas localmente a articulações artríticas, em particular, à membrana sinovial reumatóide. Em particular, os usos proporcionados permitem a transdução eficaz de proteínas terapêuticas de codificação de moléculas de ácido nucleico em células reumatóides sinoviais e tecidos numa quantidade terapeuticamente eficaz e durante um período de tempo terapeuticamente eficaz. Os usos da invenção proporcionam uma expressão de nível elevado, melhorada e contínua (a longo prazo) de proteínas terapêuticas nas células alvo. Sem limitar o alcance da descrição, é especialmente elevada a eficiência de transdução do rAAV5, e a uma extensão inferior os viriões AAV2, em combinação com os vectores rAAV da invenção, que possibilita a administração eficaz de gene vivo. Ainda que os viriões rAAV, compreendendo proteínas da cápside de ambos os serótipos AAV 5 e 2, possam ser usados vantajosamente na presente divulgação, os viriões rAAV que compreendem as proteínas da cápside de AAV serótipo 5 (viriões rAAV5) são assim as utilizações mais preferidas para usar de acordo com a invenção. 19/55

As utilizações aqui descritas compreendem os passos de proporcionar um virião recombinante AAV (rAAV), compreendendo proteínas da cápside de AAV serótipo 5 ou AAV serótipo 2, onde o virião rAAV compreende um vector rAAVX, o vector rAAVX compreendendo um elemento de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos nucleicos. 0 virião rAAV deve ser posto em contacto com a célula sinovial, pela qual a transdução do vector rAAVX produz a expressão da sequência de ácidos nucleicos nas células sinoviais transduzidas. Preferencialmente, nas utilizações aqui descritas, a sequência de ácidos nucleicos deve ser libertada na célula sinovial in vivo, por administração local do virião rAAV a uma articulação reumatóide de um sujeito. Preferencialmente, a administração do virião rAAV é por injecção na articulação, mais preferencialmente por injecção no compartimento sinovial. Alternativamente, nas utilizações aqui descritas, o virião rAAV é colocado em contacto com as células sinoviais ou cultivos de células, compreendendo células sinoviais ex vivo, e em que opcionalmente as células transduzidas são seleccionadas. 0 uso alternativo pode compreender, além disso, um passo onde as células transduzidas devem ser administradas a uma articulação reumatóide de um sujeito, em que, preferencialmente, a administração das células transduzidas é realizada por injecção na articulação, preferencialmente por injecção no compartimento sinovial. Preferencialmente nestas utilizações, a expressão da sequência de ácidos nucleicos na célula sinovial transduzida in vivo ou ex vivo produz uma redução dos sintomas de artrite da articulação. 0 virião recombinante AAV, incluindo um dos vectores rAAVX, é produzido usando métodos conhecidos na técnica, como descrito em Pan et al. (J. of Virology 1999, Vol 20/55 73(4):3410-3417) e Clark et al. (Human Gene Therapy, 1999, 10: 1031-1039), aqui incorporados como referência. Em resumo, os métodos geralmente implicam (a) a introdução do vector rAAV numa célula hospedeira, (b) a introdução de um constructo auxiliar AAV na célula hospedeira, onde o constructo auxiliar compreende as funções víricas que faltam do vector rAAV e (c) introdução de um virus auxiliar na célula hospedeira. Todas as funções para replicação do virião rAAV e união necessitam de estar presentes, para conseguir a replicação e união do vector rAAV em viriões rAAV. A introdução na célula hospedeira pode ocorrer usando técnicas virológicas padrão e pode ser de forma simultânea ou sequencial. Finalmente, as células hospedeiras são cultivadas produzindo viriões rAAV e são purificadas usando as técnicas padrão, tais como gradientes CsCl (Xiao et al. 1996, J. Virol. 70: 8098-8108). A actividade do virus auxiliar residual pode ser inactivada usando métodos conhecidos, tais como, por exemplo, inactivação térmica. O virião purificado rAAV está então preparado para ser usado nos métodos. As titulações elevadas superiores a 1012 partículas por ml e pureza alta (livre de auxiliar detectável e vírus do tipo selvagem) podem ser conseguidas (Clark et al. supra and Flotte et al. 1995, Gene Ther. 2: 29-37). O vector rAAVX compreende, pelo menos, as sequências de nucleótidos das regiões de repetição terminais invertidas (ITR) de um dos serótipos AAV, ou sequências de nucleótidos substancialmente idênticas a estas, e pelo menos uma sequência de nucleótido que codifica uma proteína terapêutica (sob controlo de um elemento regulador adequado) inserida entre as duas ITR. 21/55 0 genoma completo de AAV5 e outros serótipos AAV foram sequenciados (Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No.2; pl309-1319) e a sequência de nucleótido está disponível em GenBank (N° de acesso AF085716). As sequências de nucleótidos ITR de AAV 5 estão assim facilmente disponíveis para um técnico especializado. Podem ser clonados ou feitos por síntese química como conhecido na técnica, usando, por exemplo, um sintetizador oligonucleótideo como provido, por exemplo, por Applied Biosystems Inc. (Fosters, CA, EUA) ou por técnicas de biologia molecular padrão. As ITR podem ser clonadas do genoma vírico AAV ou cortadas de um vector que compreende as ITR AAV. As sequências de nucleótidos ITR podem ser ligadas ao final da sequência nucleotídica, codificando uma ou mais proteínas terapêuticas usando técnicas de biologia molecular padrão, ou a sequência AAV do tipo selvagem entre as ITR pode ser substituída com a sequência de nucleótidos desejada.

Preferencialmente, o vector rAAV não compreende qualquer proteína virai de codificação de sequências de nucleótidos, tal como genes rep (replicação) ou cap (cápside) de AAV. 0 vector rAAV pode compreender, além disso, um marcador ou gene indicador, tal como um gene, por exemplo, que codifica um gene de resistência antibiótica, uma proteína fluorescente (por exemplo gfp) ou um gene que codifica um produto quimicamente, enzimaticamente ou de outra forma um produto detectável e/ou seleccionável (por exemplo lacZ, aph, etc.) conhecido na técnica. 0 vector rAAV compreende, além disso, uma sequência do promotor operativamente unida à sequência de nucleótidos que codifica uma proteína terapêutica. As sequências promotoras adequadas são promotores que conferem expressão 22/55 nas células da sinovial reumatóide, tal como em macrófagos íntimos e/ou em sinoviócitos tipo fibroblastos e/ou outras células sinoviais tais como, mas não limitadas a, células T. Os promotores adequados são, por exemplo, os promotores de genes conhecidos por serem expressos em células sinoviais, tais como o promotor CMV (citomegalovírus), o promotor do gene IL-6 ou o promotor SV40, e outros, como facilmente determinado por um técnico especializado.

Uma sequência 3' não traduzida adequada pode também ser operativamente unida à sequência de nucleótidos que codifica a proteína terapêutica. As regiões 3' adequadas não traduzidas podem ser aquelas naturalmente associadas à sequência de nucleótidos ou podem-se derivar de diferentes genes, tal como, por exemplo, a sequência de região não traduzida 3' de hormonas de crescimento bovino (BGH polyA). 0 tamanho total da molécula de ADN inserida no vector rAAV entre as regiões ITR é geralmente mais pequeno que 5 kilobases (kb) em tamanho. Também se prevê que o vector rAAV compreenda sequências de nucleótido que codificam duas proteínas terapêuticas (por exemplo, proteínas terapêuticas com um efeito sinergético). Estas podem bem compreender um promotor adequado e uma região 3' não traduzida adequada cada, ou podem-se unir por um elemento IRES (locais internos de entrada de ribossomas, proporcionando um transcrito bicistrónico sob controlo de um único promotor). Os elementos de IRES adequados são descritos em, por exemplo, Hsieh et al. (1995, Biochemical Biophys. Res. Commun. 214:910-917).

Opcionalmente, as sequências de nucleótidos adicionais podem aderir operativamente à(s) sequência(s) de nucleótido que codifica(m) a proteína terapêutica, tal como sequências 23/55 de nucleótidos que codificam peptídeos de sinal (por exemplo, para transporte objectivo do peptideo ao espaço extracelular), sinais de localização nucleares, potenciadores de expressão, e afins.

Uma "proteína terapêutica", como se utiliza neste caso, refere-se a uma proteína, que tem um efeito terapêutico na artrite reumatóide quando se administra localmente à articulação reumatóide (em particular, à sinovial), numa quantidade eficaz (ou dosagem). As proteínas terapêuticas adequadas são, por exemplo, inibidores de citocina, tais como interleucina-1 (March et al, 1985, Nature 315:641-647) ou inibidores de TNFa, antagonistas de receptores de citocina tais como, por exemplo, o antagonista receptor de interleucina-1 IL-ra (Cominelli et al. 1994, J. Biol. Chem. 269(9): 6962-6971), proteínas de união de citocina tais como proteína de união IL-18 (Im et al. 2002, J. Interferon Cytokine Res. 22(3): 321-328) ou receptores de citocina solúveis tais como receptor de sTNFa p55 ou p75 (Croxford et al., 2000, J. of Immunology 164: 2776-2718) ou o receptor solúvel IL-1. Também adequadas são as sequências que codificam alfa-anticorpos de TNF, como se conhecem na técnica, por exemplo, no documento US 6,277,969 e sequências que codificam sequências anti-sentido ou de ARN de interferência para TNF alfa, conhecidas na técnica per se, por exemplo, no documento US 6,046,319. Também adequadas são as proteínas com actividade anti-inflamatória, tais como IL-4 IL-10 IL-13, IFN-β ou VIP (Vasoactive intestinal peptide; Delgado, 2003, Trends Immunol. 24: 221-4). Além disso, o dn-ΙΚΚ-β (quinase IkB dominante negativa), que inibe a activação de NF-κΒ, é uma proteína adequada para ser usada. Uma lista de proteínas adequadas é provida em Vervoordeldonk and Tak, 2001 (supra): 24/55

Produto de genea Comentários IL—IRA, IL-IsR, TNFsR bloqueia actividade IL- I/TNF, melhora sintomas inflamatórios, impede progressão de doença e destruição de articulação IL-4; (v)IL-10; IL-13, IFN-β Anti-inflamatório, opõe a produção e efeitos de citocinas pró- inflamatórias; inibe actividade Th-I TGF-β imunossupressor Oligonucleotídeos chamariz impede união de factores de transcrição aos genes alvo Dn-ΙΚΚ-β inibe activação de NF-κΒ FasL, FADD, quinase timidina de herpes (seguido de ganciclovir) indução de apoptose CTLA-4 inibe co-estimulação de linfócitos a IL-RA = antagonista receptor de interleucina-l; IL-IsR = solúvel receptor IL-I; TNFsR = receptor do factor de necrose de tumor solúvel; vIL-10 = IL-10 virai; IFN-β = beta de interferão; TGF-β = factor de crescimento de transformação β; dn-ΙΚΚ-β = ΙκΒ-quinase dominante negativa β; NF-κΒ = factor nuclear kB; FADD = proteína de domínio de morte associado a Fas.

As sequências de nucleótidos que codificam estas proteínas estão facilmente disponíveis para um técnico especializado. 25/55

As sequências (ambos nucleótido e proteína) podem, por exemplo, encontrar-se em bases de dados, tais como GenBank, SwissProt, e outras, e clones que compreendem as sequências podem principalmente ser obtidos de depositários tais como a American Type Culture Collection (ATCC). Numa forma de realização preferida, as sequências de nucleótidos são de origem humana, mas estas podem também derivar de outras espécies. Estas podem ser sequências de ADNc ou de ADN genómico. As sequências de nucleótidos que codificam proteínas terapêuticas compreendem sequências de origem natural ou de novo sintéticas, assim como sequências de nucleótidos que codificam fragmentos terapeuticamente activos, formas mutadas ou polipéptidos modificados (referidos como "variantes"). As variantes podem gerar-se facilmente e serem avaliadas em termos de retenção de funcionalidade, usando métodos conhecidos na técnica, tais como, mas não limitados a, substituições ou eliminações de aminoácidos, síntese química de peptídeos de novo ou de mutagénese, ou técnicas de transposições genéticas, técnicas de hibridação. As variantes dos peptídeos terapêuticos incluem peptídeos com sequências de aminoácidos com, pelo menos 80, 90, 95 ou 99% de "identidade de sequência substancial" à proteína de origem natural, que retêm a sua eficácia terapêutica, ou seja, a capacidade para reduzir ou suprimir os sintomas de artrite reumatóide em sujeitos.

Os vectores rAAV da presente descrição podem, além de uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína terapêutica, compreender uma segunda ou mais sequências de nucleótidos que codificam uma proteína que proporciona um mecanismo de segurança que permite curar um sujeito a partir do vector rAAV ou de células transduzidas com as mesmas, se for necessário. Tal sequência de nucleótidos, 26/55 frequentemente referida como um gene suicida, codifica uma proteína que é capaz de converter um pró-fármaco numa substância tóxica que é capaz de matar as células transgénicas nas quais a proteína é expressa. Exemplos adequados de tais genes suicidas incluem, por exemplo, o gene deaminase de citosina de E. coli ou um dos genes quinase timidina do vírus herpes simples, citomegalovírus e vírus de varicela-Zoster, em cujo caso o ganciclovir pode ser utilizado como pró-fármaco para matar as células transgénicas IL-10 no sujeito (ver, por exemplo, Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849). A administração ocorre preferencialmente por vectores rAAV como descrito noutra parte deste documento. Um "efeito terapêutico" na artrite reumatóide e, em particular, na sinovial reumatóide, refere-se a uma redução nos sintomas típicos, tal como uma redução na inflamação do tecido sinovial e/ou uma redução na cartilagem e/ou destruição do osso da articulação. Uma redução pode também significar uma desaceleração na progressão do desenvolvimento de sintomas ou a um desaparecimento completo dos sintomas. Os sintomas, e assim também uma redução nos sintomas, podem ser avaliados usando uma variedade de métodos, em grande parte os mesmos métodos como usados no diagnóstico da artrite reumatóide, incluindo exame clínico e provas de laboratório de rotina. Tais métodos incluem ambos os métodos microscópicos e macroscópicos, assim como métodos moleculares, raios-x, bioquímicos, imunohistoquímicos e outros. Os métodos podem implicar a análise de toda a articulação (por exemplo, raios-x), ou de partes da mesma, tal como o líquido sinovial extraído ou biopsias de tecido sinovial. 0 líquido sinovial reumatóide, que está em contacto directo com a sinovial e a cartilagem articular, tem um elevado valor de diagnóstico e é facilmente 27/55

Rheumatoid acessível para aspiraçao (ver Tak P.P., Arthritis 2000:55-68, supra). A quantidade terapeuticamente eficaz necessária para conseguir um efeito terapêutico pode variar, dependendo do sujeito tratado (por exemplo, mamífero não humano ou humano), a(s) proteína(s) terapêutica(s) codificada(s) (incluindo a resistência e especificidade do promotor, o local de integração, etc.) e da fase de desenvolvimento e gravidade da artrite reumatóide da articulação. Existe uma grande variação de inflamação sinovial entre pessoas, articulações e inclusive dentro das articulações (Tak et al. 1997, Arthritis Rheum. 40: 217-225). Deste modo, o período terapeuticamente eficaz de tempo (o tempo que demora até que um efeito terapêutico se torne detectável) pode variar entre as pessoas e entre as articulações, e dependendo do transgene. Além disso, o tratamento pode ter de ser repetido posteriormente para eficácia. Um técnico especializado pode facilmente determinar a quantidade terapeuticamente eficaz por sondagem de rotina e por, por exemplo, definir de curvas de resposta às doses. Uma administração de, pelo menos, 103 a 105 viriões rAAV, preferencialmente, pelo menos 107 ou 108 viriões, mais preferencialmente, 109 a 1011 viriões ou mais, será uma dose adequada.

Preferencialmente, o vector rAAV está estavelmente integrado no genoma da célula transduzida e proporciona expressão a longo prazo (pelo menos 4-8 semanas, preferencialmente pelo menos 8-12 semanas, mais preferencialmente pelo menos 6 meses ou durante toda a vida) da proteína terapêutica. 28/55 A administração local (de forma oposta à sistémica) na articulação artrítica refere-se, em particular, à administração local dos viriões rAAV in vivo ou ex vivo na sinovial reumatóide, e em particular, em sinoviócitos. A administração in vivo, como se utiliza neste caso, refere-se à administração directa dos viriões rAAV na articulação do sujeito, por exemplo, por injecção intra-articular. A administração ex vivo refere-se ao isolamento das células reumatóides do sujeito, após a administração dos viriões rAAV nas células isoladas cultivadas. As células transduzidas que expressam a proteína terapêutica são então administradas ao sujeito, por, por exemplo, injecção, reimplantação ou reinfusão das células, novamente na articulação do sujeito. A administração local pode repetir-se após um número de semanas ou meses, se necessário.

Noutra forma de realização, a presente descrição providencia um método para administrar uma molécula de ácido nucleico a células reumatóides sinoviais ex vivo, o método que inclui as etapas de (a) proporcionar um virião recombinante AAV (rAAV) compreendendo proteínas de cápside de AAV serótipo 2, ou mais preferencialmente AAV serótipo 5, onde o virião rAAV compreende um vector rAAVX, o vector rAAVX compreendendo um elemento de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos nucleicos; (b) administrar o virião rAAV a células sinoviais, ou cultivos de células, compreendendo células sinoviais, onde a transdução resulta na expressão da molécula de ácido nucleico nas células transduzidas; (C) opcionalmente, seleccionando as células transduzidas. As células transduzidas ou células que compreendem as células transduzidas devem ser administradas na articulação reumatóide de um sujeito. 29/55 A selecção ou enriquecimento das células transduzidas antes da readministração na articulação de onde as células originaram, pode ser feita usando métodos conhecidos. 0 sujeito a partir do qual as células ou cultivos de células foram obtidos na fase (b) não necessita de ser o mesmo sujeito ao qual as células transduzidas são readministradas na fase (d) , ou seja, as células podem ser autólogas (do mesmo sujeito) ou não autólogas (de sujeitos diferentes).

Os viriões rAAV5 da invenção podem também ser formulados em composições farmacêuticas, de modo a que em vez de administrar os viriões rAAV directamente na articulação, a composição farmacêutica é administra localmente in vivo, por exemplo, por injecção ou microinjecção. A composição farmacêutica compreende viriões rAAV suficientes e excipientes adicionais aceites na indústria farmacêutica, tais como, mas não limitado a, água, solução salina, glicerol ou etanol. Podem estar presentes substâncias adicionais, tais como emulsionantes, agentes de humidificação, soluçoes-tampão e afins. A invenção providencia um virião rAAV que compreende proteínas de cápside de AAV serótipo 5, onde o virião rAAV compreende um vector rAAV2, que compreende um elemento de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica eficaz contra a artrite reumatóide.

Estes viriões rAAV, uma célula sinovial transduzida com estes e/ou composições farmacêuticas que compreendem os ditos viriões ou ditas células destinam-se ao uso no tratamento da artrite reumatóide, como se descreve nas reivindicações anexas. 30/55

Os viriões rAAV, anteriormente descritos, podem também ser administrados in vitro a células sinoviais ou cultivos de células; as células transduzidas são então seleccionadas opcionalmente.

Por outro lado, a invenção refere-se ao uso de um virião, tal como definido anteriormente, para a produção de um medicamento para o tratamento de uma articulação reumatóide, como descrito nas reivindicações anexas. A "membrana sinovial", "tecido sinovial" ou "células sinoviais", como se utiliza neste caso, referem-se ao revestimento celular que reveste as superfícies não cartilaginosas das articulações sinoviais, como descrito em Tak (2000, Examination of the synovium and synovial fluid. Em: Firestein GS, Panyani GS, Wollheim FA editors. Rheumatoid Arthritis. New York: Oxford Univ. Press, Inc. 55-68) .

Uma membrana sinovial consiste no estrato de revestimento íntimo (ou estrato de revestimento sinovial) e a sublimação da membrana sinovial (subsinovial), que está incorporado na cápsula da articulação. O estrato de revestimento íntimo compreende macrófagos íntimos (ou sinoviócitos tipo macrófago ou sinoviócitos tipo A) e sinoviócitos tipo fibroblastos (ou sinoviócitos tipo B). Os termos "sinovial reumatóide", "células sinoviais reumatóides" ou "tecido sinovial reumatóide" referem-se à sinovial inflamada das articulações de um sujeito que sofre de artrite reumatóide. A sinovial reumatóide é caracterizada pela hiperplasia do revestimento íntimo e por acumulação das células T, células de plasma, macrófagos, células B, células exterminadoras naturais e células dendríticas no sub-revestimento 31/55 sinovial. Estas células acumuladas estão compreendidas na definição de células reumatóides sinoviais.

Noutra forma de realização, a descrição refere-se a um virião rAAV que compreende proteínas de cápside de AAV serótipo 5 ou AAV serótipo 2, pelo que o virião rAAV compreende um vector rAAVX, onde o vector rAAVX compreende um elemento de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica eficaz contra a artrite reumatóide. Mais preferencialmente, o virião rAAV é um virião rAAV5, compreendendo proteínas de cápside AAV5, e onde o vector rAAVX é um vector rAAV5 ou rAAV2, dos quais um vector rAAV2 é mais preferido. A sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica eficaz contra a artrite reumatóide é preferencialmente como descrito anteriormente e o vector pode compreender, além disso, um gene suicida como descrito anteriormente.

Noutra forma de realização desta descrição, um virião rAAV5 que compreende um vector rAAVX é provido, onde o vector rAAVX compreende um elemento regulador de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica eficaz contra a artrite reumatóide, e onde o virião rAAV5 tem uma eficácia de transdução para células sinoviais que é superior à dos viriões rAAV2. A eficácia de transdução é preferencialmente, pelo menos, cerca do dobro, mais preferencialmente, pelo menos aproximadamente 2,5 vezes mais, ou inclusive aproximadamente 3 vezes mais. A eficiência de transdução pode ser testada in vivo ou in vitro (células sinoviais cultivadas), transduzindo as células e avaliando a transdução usando métodos padrão. A eficácia da transdução pode ser avaliada, por exemplo, como 32/55 se mostra nos exemplos. Preferencialmente, um indicador detectável ou gene marcador está presente nos vectores rAAV ao avaliar a eficácia da transdução.

Também aqui se descreve acessórios que compreendem um ou mais dos componentes requeridos para a realização dos métodos da invenção, tal como, por exemplo, um equipamento que compreende um ou mais vectores rAAVX, viriões rAAV, protocolos, reagentes e afins. A menos que se indique de outra forma, a prática da invenção empregará métodos convencionais padrão da biologia molecular, virologia, microbiologia ou bioquímica. Tais técnicas são descritas em Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular

Biology, Current Protocols, USA and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK), Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor), Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds. ) , CRC Handbook of Parvovir uses vol I and II (P. Tij essem edt.), Fundamental Virology 2nd Edition, vol. I and II (Fields and Knipe eds.)

Os seguintes Exemplos não limitativos descrevem a identificação dos métodos e vectores da invenção.

Exemplos

Exemplo 1 - produção de viriões AAV recombinantes Os viriões rAAVl a rAAV5 foram produzidos essencialmente como descrito por Grimm et al. (2002; Methods 28: 146-157), com particular referência ao método como resumido na tabela 33/55 2 e figura 2 deste documento (note-se que a referência 21 em Grimm et al., 2002, supra, foi publicada agora como Grimm et al., 2003, Mol. Therapy 7: 839-850). Para a produção dos viriões rAAV, o denominado método de dois plasmideos descrito nestes documentos de Grimm et al., foi usado. Os plasmideos auxiliares e de expressão foram basicamente como se descreve nestes dois documentos por Grimm et al. (2002, 2003 supra), onde o plasmideo auxiliar contém o esqueleto virico que inclui as proteínas de cápside que determinam o serótipo do virião. Um plasmideo de expressão particular usado na presente invenção é pVDll, onde uma cassete de expressão LacZ é flanqueada por AAV2 ITR. 0 pVDll foi construído começando a partir de pTRUF-2, que é descrito por Zolotukhin et al. (1996, J. Virol. 70: 4646-4654) e onde o elemento de regulação pós-transcricional do vírus de hepatite da marmota da América (WPRE) foi inserido para melhorar a expressão do gene indicador (Xu et al., 2003, Biochim Biophys Acta. 11, 1621:266-71) e no qual o gene indicador de GFP foi substituído pelo gene lacZ de E. coli como gene indicador.

Como exemplo, a produção de viriões AAV5 com pVDll foi da seguinte forma: 293 células cultivadas nas garrafas giratórias foram transfectadas com plasmideo auxiliar pDP5 AAV e plasmideo pVDll usando o método de fosfato de cálcio (ver, por exemplo, Sambrook and Russell, 2001, supra, para transfecçao de fosfato de cálcio). As células foram recolhidas após 3 dias. As células foram lisadas e os viriões foram purificados do lisado celular usando gradientes de iodixanol, como descrito por Zolotukhin et al. (1999, Gene Ther. 6: 973-85). O iodixanol foi posteriormente retirado e os viriões foram ainda mais 34/55 concentrados usando diafiltração. 0 mesmo procedimento foi usado para a produção de viriões AAV-1 -2 -3, e -4 usando os plasmideos auxiliares de determinação de serótipo adequado como descrito em Grimm et al. (2002, supra).

Exemplo 2 - administração de gene in vivo a ratos e camundongos A. Ratos

Os viriões rAAVl a rAAV2, contendo vector pVDll (ou outros vectores rAAVl a rAAV5, não mostrados), compreendendo a codificação de gene para beta-galactosidase foram injectados nas articulações do tornozelo direito dos ratos com artrite adjuvante (AA) no dia 12, após a imunização adjuvante. As articulações foram recolhidas após 2 semanas e analisadas para expressão de beta-galactosidase por coloração directa in situ de secções congeladas (figura 2), quantificadas por análise de imagem digital (figura 1), e RT-PCR.

Duas semanas após a injecção dos vectores AAV-beta-GAL, o número de beta-galactosidase de expressão de células no tecido sinovial foi avaliado. Nas articulações artríticas injectadas com viriões rAAV2, um elevado número de células expressou beta-galactosidase (111,441 IOD/mm2) , enquanto nas articulações artríticas injectadas com viriões rAAV2 apenas células 38,212 IOD/mm2 foram contadas (figura 1). Não foi observada qualquer coloração de fundo para vectores derivados de serótipos AAV1, AAV3 e AAV4. A expressão do transgene foi confirmada por análise das articulações por PCR semi-quantitativa (dados não mostrados). B. Camundongos 35/55

Os viriões rAAV de artrite induzida por colagénio (CIA) de camundongo que compreende vectores rAAVl, rAAV2 e rAAV5 com o gene mSEAP foram localmente injectados na articulação do joelho esquerdo 32 dias após a indução de artrite. A expressão do transgene foi analisada por RT-PCR em vários órgãos para biodistribuição e por Elisa em soros e meio de cultura condicionado pelos tecidos de articulação em pontos de tempo diferentes.

Nos camundongos CIA, os viriões rAAV5 também providenciaram uma eficiência de transdução muito elevada. A expressão de transgene foi detectável em soros e rótulas uma semana após a injecção na articulação, aumentando ao longo do tempo e estabilizando durante pelo menos um mês (5,31 ± 1,59 e 1,94 ± 1,97 ng/ml, respectivamente). Nenhuma expressão detectável foi encontrada para vectores baseados em serótipos AAVl e AAV2.

Conclusões

Surpreendentemente, foi descoberto que a eficácia de transdução dos vectores baseados em diferentes viriões de serótipo AAV em modelos experimentais de artrite reumatóide variou consideravelmente, variando desde ser completamente ineficaz até ter uma alta eficiência de transdução (para vectores contidos em viriões AAV5). Os exemplos demonstram claramente que a transferência in vivo de gene com viriões AAV5 foi muito mais eficaz do que com os outros serótipos e que o virião rAAV5 é particularmente adequado para tratamento genético in vivo da artrite reumatóide.

Exemplo 3 - artrite induzida por colagénio em camundongos 36/55

Materiais e Métodos:

Vectores AAV-2/2 e AAV-2/5 recombinantes. A produção de rAAV pseudotipado (genoma AAV recombinante com base em ITR tipo 2 unidos em cápside AAV1, AAV2 ou AAV5) foi conseguida por transfecção transitória como descrito por Allen, J.M et al. (Mol Ther, 2000,1, 88) com as seguintes modificações. 293 células embriónicas humanas do rim foram transfectadas com o plasmideo auxiliar de adenovirus ρΧΧβ, o vector pAAV2 de plasmideo pGG2-CMV-muSEAP, que codifica para uma forma segregada da fosfatase alcalina murina, sob o controlo transcripcional do promotor IE CMV e o plasmideo de união de AVV apropriado, que expressam os genes de rep e cap. Os plasmideos de união são pACG2.1 para rAAV2 e pLT-RC02 para rAAV-1/2 onde o gene AAV2 rep se funde com o gene cap AAV1 (uma oferta generosa de R. Mulligan). O plasmideo de união foi dividido em dois para a produção de rAAV 2/5 (proteínas Rep AAV2 que codificam pMTRep2, uma oferta generosa de D. Miller e proteínas Rep e Cap AAV5 expressas por pAAV5svori, uma oferta generosa de J. Chiorini, requerendo um passo de transfecção quádrupla. Os vectores recombinantes foram purificados por gradiente de ultracentrifugação de duplo CsC12, seguido por diálise extensiva contra PBS estéril. As partículas físicas foram quantificadas por hibridação dot blot contra um intervalo de plasmideo padrão. As titulações são expressas como genoma vírico por ml (vg/ml). As titulações rAAV 2/1-mSEAP, rAAV-2/5-mSEAP e rAAV-2/2-mSEAP foram respectivamente 1,6 x 1012, 2,7 x 1011 e 2,9 x 1012 vg/ml. Os plasmideos rAAV-2/2 e -2/5 que expressam o transgene β-Gal sob o promotor CMV foram flanqueados pelo AAV-2 ITR e encapsulados respectivamente num revestimento AAV-2 ou AAV-5. As partículas víricas foram produzidas por 37/55 transfecção dupla em 293 células, tal e como se descreve anteriormente por Grimm, D. (Hum Gene Ther, 1998,9, 2745), purificadas respectivamente usando uma coluna heparina de iodixanol ou um gradiente CsCl duplo, e dialisadas contra PBS pelo Vector Core do Hospital Universitário de Nantes. A titulações rAAV foram determinadas por dot blot e expressas como genoma de vector por ml (vg/ml) . Estas foram respectivamente 1,8 x 1011 e 3 x 1012 vg/ml para rAAV-2/2 e -2/5.

Estudos em animais

Os camundongos machos DBA/1 (Harlan France) foram criados nas nossas instalações e usados com a idade de 8-10 semanas. A artrite induzida por colagénio (CIA) foi induzida por injecção intradérmica na base da cauda com 100 μΐ de solução de colagénio a 1 pg/μΐ no dia 0. O colagénio bovino tipo II (bCII) foi diluído em 2 mg/ml (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, França) 50 mM de ácido acético, e emulsionado com um volume igual de adjuvante completo de Freund (Pierce, Bezons, França) antes do uso. No dia 21, os animais foram estimulados com uma injecção intradérmica de 100 μΐ de solução bCII emulsionada com um volume igual de adjuvante incompleto de Freund (Pierce, Bezons, França) antes do uso. Após a indução da artrite, a espessura da pata foi medida ao longo do tempo com um micrómetro Mitutoyo (sigma). No dia 28, os camundongos foram sincronizados com injecção intraperitoneal de 40 pg (sigma) LPS. Quando surgiram os sinais clínicos da artrite, os camundongos foram anestesiados por injecção intraperitoneal de uma solução de quetamina (30 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg). A pele sobre o joelho foi rapada, e as doses indicadas de serótipo AAV foram injectadas intra-articularmente em 5 μΐ de 0,9% de NaCl na articulação do 38/55 joelho esquerdo, usando uma seringa de Hamilton com uma agulha de calibre 30 (NH-BIO, Massy, França) . No dia do sacrifício, as articulações do joelho completas foram recolhidas e congeladas em nitrogénio líquido para quantificação in situ de coloração β-gal em secções congeladas. Nas experiências que usam o gene indicador mSEAP, foram colhidas amostras de sangue em vários momentos antes e após a injecção de vector, e armazenadas a - 20 °C até serem testadas. No dia do sacrifício, a rótula esquerda e direita foram recolhidas e incubadas 24h em RPMI (200 μΐ) . Os sobrenadantes foram armazenados a -20 °C e as rótulas foram armazenadas em nitrogénio líquido até serem testadas.

Coloração in situ para expressão de transgene de β-galactosidase

As rótulas foram colocadas à temperatura de corte óptima (OCT) e imediatamente congeladas em gelo seco. As amostras foram cortadas num crióstato e as secções de tecido foram fixadas em 1,25% de glutaraldeído durante 10 min, enxaguadas 3 vezes em PBS, colocadas durante toda a noite a 37 °C na solução X-Gal. As lâminas foram então lavadas 3 vezes em PBS e contra tingidos com HE.

Quantificação de muSeAP no soro.

Foram recolhidas amostras de sangue nos pontos de tempo indicados após a administração do vector. A detecção quimioluminiscente permitiu a quantificação da actividade enzimática. Em resumo, as amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 2500g para recolher soros, os fosfatos endógenos alcalinos foram inactivados por calor durante 5 min a 65 °C e o muSeAP resistente ao calor foi medido pela 39/55 adição de solução-tampão de reacção e substrato quimioluminiscente CPSD segundo as instruções do fabricante (Tropix). A quimioluminescência foi quantificada num luminómetro (Mediators Diagnostika). Os níveis de expressão são expressados como ng de muSeAP por ml de soro segundo uma curva padrão de fosfatase alcalina de placenta humana purificada.

Resultados

Administração intra-articular de serótipos rAAV em articulações de camundongos.

Para comparar a eficiência de transdução de serótipos AAV nas articulações, administramos 5 x 108 partículas de AAV-2/1, AAV-2/2 e AAV2-2/5 expressando β-gal ou mSEAP por injecção directa nas articulações de camundongos DBA/1 após o surgimento da artrite. As rótulas foram recolhidas às 4 semanas para coloração X-gal e imunohistoquímica, ou para detecção quimioluminiscente de mSEAP no meio de cultivo agregado pelos tecidos da articulação.

Foi detectada expressão significativa de LacZ nas articulações de camundongos injectados com AAV-2/2 e AAV-2/5-LacZ, 4 semanas após a injecção dos vectores, com uma eficiência de transdução significativamente mais elevada, observada com AAV-2/5. Não foi observada qualquer coloração em secções congeladas das rótulas de joelhos injectados com AAV-1/5 ou no joelho contralateral não injectado. O modelo de expressão foi similar ao que previamente se indicou, ainda que tenha sido observada uma coloração moderada no tecido de revestimento sinovial, a coloração intensa foi revelada na bolsa suprapatelar. A coloração foi quantificada por análise de imagem digital e mostrou que a 40/55 eficiência de transdução de AAV-2/5-LacZ foi 3 vezes superior a AAV-2/2-LacZ. Ao utilizar um gene indicador segregado, tal como o mSEAP, a expressão de transgene local foi 2 vezes mais elevada com AAV-2/5 do que com AAV-2/1 ou AAV2-2/2 e aumentou nas articulações artríticas, comparado com camundongos não artríticos. Assim, a cápside AAV de serótipo 5 parece mais eficaz para transduzir tecidos intra-articulares do que os serótipos 1 ou 2.

Resposta a doses de AAV-2/5

De seguida, administrámos doses cada vez maiores de AAV2-2/2 ou AAV-2/5 que expressam β-gal ou mSEAP (5 x 108, 1,5 x 109 e 5 x 109 partículas) para determinar se a melhor eficiência observada com AAV2-2/5 era verdadeira usando doses mais elevadas nas articulações artríticas. Quatro semanas após a administração de gene, as rótulas foram recolhidas para coloração X-gal e imunohistoquímica, ou detecção quimioluminiscente de mSEAP no meio de cultivo agregado pelos tecidos de articulação e em soros. As doses cada vez maiores de AAV-2/5 resultaram em níveis mais elevados de expressão LacZ na articulação de camundongos. Quando se utiliza mSEAP como gene indicador, a secreção do transgene local foi 2,6 vezes mais elevada com 3 vezes mais partículas injectadas, apesar de não ser modificada com outras cápsides testadas. Não surpreendentemente, o transgene segregado poderia também ser detectado em soros e o mesmo intervalo de aumento em níveis de expressão foi observado usando doses cada vez maiores de vírus. As doses mais elevadas do vector AAV-2/5-mSEAP testado foram limitadas pela graduação da preparação vírica e o volume máximo que poderia ser injectado em articulações de camundongos (5 μΐ). É possível que as doses mais elevadas de AAV-2/5 (> 5 x 109 partículas) possam resultar em níveis 41/55 ainda mais elevados de expressão de transgene por articulações artríticas.

Cinética da expressão para AAV-2/5

Depois investigámos se a eficiência máxima de AAV-2/5, comparada com AAV-2/2 para transdução, foi devido a uma expressão de transgene mais lenta. Assim, injectámos 1,5 x 109 partículas de AAV-2/1, AAV-2/2 e AAV-2/5 que expressam um gene indicador segregado mSEAP nas articulações artríticas dos camundongos DBA/1 e recolhemos amostras de sangue nos pontos de tempo indicados. Em animais injectados com AAV-2/5-mSEAP, a expressão de transgene aumentou gradualmente a partir dos 7 dias após administração para alcançar um nível máximo a 3 semanas. Pelo contrário, o AAV-2/1 e AAV-2/2-mSEAP foram debilmente detectados a 3 e 4 semanas, respectivamente. Numa segunda experiência, mostramos que a expressão de transgene manteve-se estável durante, pelo menos, 19 semanas usando AAV-2/5-mSEAP, enquanto AAV-2/1-mSEAP resultou numa expressão transitória do transgene ao longo de 6 semanas, e AAV-2/2-mSEAP não mostrou nenhuma expressão de transgene sistémica detectável.

Exemplo 4 - artrite induzida por adjuvante em ratos

Materiais e Métodos

Construção de AAV recombinante

Todas as construções rAAV foram derivadas de AAV2 e accionadas pelo promotor citomegalovírus (CMV). O AAV recombinante foi produzido por co-transfecção de 293 células HEK com um plasmídeo de união (pDG para AAV2 e 42/55 pDPl, pDP3, pDP4 e pDP5 para AAV1, AAV3, AAV4 e AAV5, respectivamente) e um plasmídeo de vector (pVDll) pelo método de fosfato de cálcio. Os plasmídeos de união continham todos os elementos que actuam em trans: genes Cap, genes Rep e genes adenovirais auxiliares. 0 plasmídeo de vector continha todos os elementos que actuam em cis: ITR, transgene e promotor CMV.

As células foram cultivadas a uma densidade de 3xl04 células/cm2 quatro dias antes da transfecção em frascos rotativos com 850 cm2 e foram cultivadas em 50 ml de Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM) com glutamax-I (Invitrogen), 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) (JRH), 60 U/ml de penicilina/estreptomicina (PS) (Invitrogen) a 37 °C. Antes da transfecção, o meio foi substituído com Iscove's Modified Dulbecco's Médium (IMAM; Invitrogen) e a 16h após a transfecção, o meio foi substituído com 50 ml de DMEM/FBS/PS recente. Às 72h após a transfecção, as células foram recolhidas em 10 ml 50 mM de Tris-HCl pH 8,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, 0,1 % (v/v) Triton X-100. Finalmente, foi adicionada benzonase (Merck) ao lisado, a uma concentração final de 75 U/ml.

Os lisados de célula brutos foram, além disso, purificados com gradientes de iodixanol. Os gradientes escalonados de iodixanol foram feitos em tubos Beckman Quick-seal (25x89 mm, Beckman). Os gradientes escalonados foram carregados colocando uma pipeta de Pasteurs no tubo. De cima para baixo: 15 ml de lisado de célula bruto, 9 ml de iodixanol a 15% + 1M de NaCl em PBS-MK (PBS + 1 mM de MgCl2 +2,5 mM de KC1) , 6 ml de iodixanol a 25% em PBS-MK, 5 ml de iodixanol a 40% em PBS-MK, 5 ml de iodixanol puro a 60%. De seguida, o tubo foi selado e centrifugado durante 1 hora a 69 000 r.p.m. a 16 °C. Depois da centrifugação, a fase de 43/55 iodixanol a 40%, a partir dos gradientes, foi extraído. O iodixanol a 40% com solução vírica foi diluído 10 vezes com PBS-MK e concentrado a aproximadamente 2 ml com dispositivos centricon (YM-100, Millipore). Foram alcançadas as titulações de matéria-prima que variam entre 1011-1012 cópias genómicas (GC)/ml.

Transferência de gene local

Foram obtidos ratos Lewis machos sem patogéneos (150-200g) da Harlan Sprague Dawley Inc. (Horst, Países Baixos) e foram mantidos nas nossas instalações de animais centrais. Todos os ratos foram imunizados na base da cauda com 1 mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco, Detriot, MI) em 0,1 ml de óleo mineral no dia 0. Foi observado, normalmente, o inchaço da pata ao dia 10-12, e foi medido diário por pletismometria de deslocação de água. As articulações do tornozelo direito foram injectadas no dia 12 após a imunização em animais anestesiados com isoflurano. A pele foi preparada com etanol e rAAVl a 5 com o gene para LacZ (indicado adicionalmente para rAAVl a 5) e injectado ântero-lateralmente na articulação do tornozelo direito num volume total de 50 μΐ de solução salina usando agulha de calibre 31 numa seringa de vidro. Os animais foram injectados com 6,1 xlO10 de GC' s (n=6/grupo) . O adenovírus com LacZ (ajustado a 6,1 xlO10 GC/animal) serviu como um controlo positivo, ao passo que a solução salina foi usada como controlo negativo. Os ratos injectados com AAV e solução salina foram sacrificados duas semanas após a injecção intra-articular por inalação de CO2, os ratos injectados com adenovírus foram sacrificados dois dias após a injecção. Foram recolhidas amostras de soro através de hemorragia da veia cava. 44/55

Para investigar a expressão de transgene em pontos de tempo diferentes, uma segunda experiência foi realizada usando um lote diferente de rAAV. Os animais receberam uma injecção i.a. de 1,14 xlO10 de GC AAV2 ou rAAV5 e foram sacrificados como descrito uma, duas, três e quatro semanas após injecção (n=3). As amostras de soro foram obtidas de todos grupos por hemorragia da cauda antes da injecção AAV e por punção da veia cava durante o sacrifício.

Detecção de produtos de transgene

Coloração de Beta gal in situ

As articulações foram descalcifiçadas usando EDTA e foram congeladas rapidamente em nitrogénio líquido. Foram cortadas secções de dez pm e foram colocadas em lâminas de vidro. A detecção de β-galactosidase (β-gal) foi realizada por coloração X-gal. Em resumo, o tecido foi fixado em 0,25% de glutaraldeído/4% paraformaldeído durante 10 min a 4 °C. De seguida, as amostras foram lavadas duas vezes com PBS e coloridas com solução de coloração com 1 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil^-d-galactoside), 2 mM de

MgCl2, 5 mM de K3Fe(CN)6, 5 mM de K4Fe(CN)6, e 0,1% de

Triton x-100 em PBS durante toda a noite a 37 °C. Após a lavagem com PBS, as secções foram contra tingidas com vermelho nuclear. As secções foram analisadas por análise de imagem digital para células β-gal positivas.

Análise de imagem digital

Cinco campos seleccionados de forma aleatória em cada secção foram escolhidos para digitalizar a quantidade de sinal positivo. Estas imagens foram adquiridas num microscópio Olympus (Olympus, Tóquio, Japão), capturadas 45/55 usando uma câmara de vídeo Charged Coupled Device (Sony, Tóquio, Japão) e digitalizadas com uma placa de digitalização de vídeo a cor de 16 bit multimédia PV100. Nas imagens de cor resultantes, a área de coloração positiva e a densidade óptica média (MOD) foram medidas por um programa macro. 0 MOD é proporcional à concentração celular de proteína. A densidade óptica integrada (IOD) é igual à MOD multiplicada pela área de coloração positiva.

Detecção PCR em tempo-real de LacZ

As articulações do tornozelo (sem pele) e órgãos foram congelados rapidamente em nitrogénio líquido, pulverizados usando um mortal, e homogeneizados em 1 ml de reagente TRIzol (GibcoBRL Life Technologies) usando um homogeneizador de tecido. 0 ARN total foi isolado da fase aquosa e o ADN genómico (ADNg) foi extraído da fase de fenol-clorofórmio segundo as instruções do fabricante. 0 gDNA foi armazenado para análise Q-PCR. 0 ARN foi dissolvido em DEPC-água e quantificado por espectrofotometria. 0 ADNc foi sintetizado usando 1 yg de ARN e 0,5 yg de Oligo(dT) (GibcoBRL), 5X First-Strandbuffer, 0,1 M de DTT, mistura dNTP (10 mM cada) e 1 yl de Superscript II RT (Invitrogen). Para RT-PCR, 10 yl de solução de cDNA foram amplificados usando 25 yl de AccuPrime SuperMix I (Invitrogen Life Technologies), 215 mM do accionador LacZl (adiante, 5'- GCA-TCG-AGC-TGG-GTA-ATA-AGC-GTT-GGC-AAT-3') e 215 mM do accionador LacZ2 (inverso, 5'-GAC-ACC-AGA-CCA-ACT-GGT-AAT-GGT-AGC-GAC-3') num volume total de 50 yl. A amplificação foi de seguida realizada num termociclador (MJ Research, Inc.) da seguinte forma: 3 min a 95 °C continuo de 35 ciclos de 94 °C durante 1 min., 58 °C durante 90 seg. e 72 °C durante 1 min, respectivamente, seguido por uma fase de extensão final a 72 °C durante 10 46/55 minutos. Os produtos PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose padrão num gel de agarose 0,9% com brometo de etidio para visualização assistida de UV do produto de 622 pares de bases.

Detecção de cópias viricas genómicas por PCR quantitativo

Para determinar a titulação vírica em termos de cópias genómicas (partículas completas viricas), as amostras AAV foram diluídas primeiro 10 vezes em PBS. Posteriormente, 5 μΐ destas diluições foram agregadas em duplicado a 45 μΐ de 0,25 mg/ml de ADNasel, PBS. As misturas foram incubadas durante 20 min a 37 °C, após os quais 75 II 2, 75 mg/ml de proteinase K, 8,6 mM de Tris-HCl pH 8,0, 86 mM de NaCl, 8,6 mM de EDTA, 0,43 % (p/v) SDS foi adicionado. Após a incubação durante 60 min a 37 °C, 115 μΐ 14 pg/ml de polyA, solução tampão SV ARN (Promega) foram adicionados por poço. As amostras foram incubadas em 10 μΐ de suspensão de MagneSil BLUE (Promega) e o ADN vírico foi isolado usando o dispositivo de separação magnética MagnaBot 96 (Promega) segundo as instruções do fornecedor. As diluições do ADN vírico purificado ou o isolado ADNg das articulações e órgãos foram adicionadas a mistura PCR (0,5 μΜ de accionador directo CMV (5'AATGGGCGGTAGGCGTGTA3')

(Invitrogen) , 0,5 μΜ de accionador inverso CMV (5'AGGCGATCTGACGGTTCACTAA3') (Invitrogen), e solução-tampão de mistura mestra PCR SYBR verde (Applied Biosystems). Os padrões de ADN usados foram diluições em série de 10 vezes de 10E+1 a 10E+8 cópias de pVD23. As reacções de PCR foram realizadas usando o sistema de detecção de sequência Abi prism SDS7000 (Applied Biosystems).

Determinação de anticorpos de neutralização contra rAAV no soro 47/55

Foram analisadas as titulações de anticorpos neutralizantes por valorização da capacidade de anticorpo em soro para inibir a transdução de AAV em células COS. Várias diluições de soro (1:200 a 1:5200) foram pré-incubadas com rAAV a 37 °C durante 1 hora e de seguida adicionadas a 80% de células confluentes. De seguida, os cultivos de células foram incubados com AAV na presença de soro durante 20 horas e a expressão LacZ foi medida por coloração X-gal. A titulação de anticorpos foi representada pela diluição máxima que não resultou em nenhuma inibição de expressão de β-gal em comparação com células incubadas só com AAV.

Cultivo de células de FLS humano

Foi realizada a artroscopia através de orifício pequeno (artroscópio de 2,7 mm, Storz, Tuttlingen, Alemanha) sob anestesia local em pacientes com AR confirmada.

As biopsias obtidas foram dispersas enzimaticamente. Em resumo, a membrana sinovial foi esmiuçado e incubado com 1 mg/ml de colagenase do tipo VIII (sigma) em DMEM sem soro (Gibco) durante 3h a 37 °C. de seguida, as células foram lavadas extensivamente e cultivadas em DMEM / 10% de soro de vitelo fetal (FCS) numa atmosfera humedecida 5% de CO2. As células foram deixadas a aderir durante toda a noite e as células não aderentes foram retiradas. O FLS aderente foi cultivado em FCS DMEM/10% e dividido em 1:3 a 80-90% de confluência. Os FLS humanos foram usados da passagem 3 para 10.

Transdução de gene in vitro em FLS 48/55

Os FLS foram colocados em placas de 96 poços (Falcon) a 8 x 103/poço. Após a incubação durante 10 horas, 8 x 107 GCs de rAAV2 e rAAV5 com os genes para LacZ ou proteína verde fluorescente (GFP) foram adicionados a cada poço no meio com 10%. As células foram cultivadas durante 48 horas e a expressão de gene marcador foi analisada por coloração enzimática ou microscopia fluorescente. Três filas celulares independentes de FLS foram usadas para estas experiências.

Resultados

Eficiência comparativa de cinco serótipos AAV

Para comparar a eficiência de transdução de serótipos AAV nas articulações, rAAVl a rAAV5 foram injectados nas articulações do tornozelo direito dos ratos no dia 12 após imunização adjuvante. As articulações foram recolhidas duas semanas após a injecção e tingidas in situ para expressão β-gal. A expressão de transgene foi quantificada por análise de imagem digital. A expressão mais abundante de β-gal foi observada em articulações artríticas injectadas com rAAV5. Surpreendentemente, a transdução AAV resultou numa penetração superior no tecido sinovial em comparação com o adenovírus, mostrando a expressão β-gal apenas no revestimento. No contralateral não injectado e articulações de controlo, não foi observada qualquer coloração. Usando a análise de imagem digital, o número máximo de células que expressam β-gal no tecido sinovial foi detectado em articulações artríticas injectadas com AAV5, seguido por uma expressão muito inferior usando AAV 2 (111441 e 38212 IOD/mm2, respectivamente). Não foi observada expressão acima da coloração de fundo para os serótipos 1, 3 e 4. 49/55

Duração da expressão de transgene

Para estudar a expressão de transgene ao longo do tempo, rAAV2 e rAAV5 foram injectados em articulações artríticas de ratos e foram sacrificados uma, duas, três e quatro semanas após a injecção do vector. Ambos os serótipos demonstraram uma expressão significativa durante até quatro semanas, o que já estava presente uma semana após a injecção. No entanto, rAAV5 mostrou anteriormente e em todos os pontos de tempo uma expressão de β-gal mais alta como quantificada por análise de imagem digital (figura 4). As articulações injectadas foram rapidamente congeladas e foram marcadas as criosecções in situ para actividade beta-gal. A quantidade da coloração azul por secção foi analisada por análise de imagem digital e expressada como acumulada 100/mm2 (IOD: densidade óptica integrada). Isto foi confirmado por análise Q-PCR. Uma quantidade mais elevada de cópias genómicas foi detectada em todos os pontos de tempo depois da injecção de rAAV5 em comparação com a tabela 1 de articulações injectadas com AAV2:

Tabela 1: Detecção de cópias víricas genómicas em articulações injectadas após injecção i.a. de AAV2 ou AAV5. 0 ADN genómico foi isolado de articulações de tornozelo trituradas 1, 2, 3 e 4 semanas após injecção de AAV. 0 qPCR foi realizado com accionadores específicos para o promotor CMV. Valores expressos como GC/pg gDNA ± desvio padrão. AAV 2 AAV 5 Semana 1 6,45E+04 ±2,12E+03 1,42E+07 ±3,39E+03 Semana 2 1,83E+03 ±5,87E+02 1,37E+06 ±5,17E+03

Semana 3 <10 cópias 4,37E+06 ±2,25E+03 50/55

Semana 4 <10 cópias 2,24E+05 ±1.49E+03

Para detectar a transcrição de LacZ nas articulações, foi efectuada uma análise RT-PCR usando accionadores específicos. Descobrimos que a transcrição do transgene em articulações injectadas com rAAV5 em todos os pontos de tempo mostra diferenças mínimas na intensidade, ao passo que a quantidade de ARNm LacZ esteve abaixo do limite de detecção do nosso ensaio nas articulações injectadas de rAAV2.

Formação de anticorpos rAAV

Para detectar uma resposta imunitária humoral possível contra as proteínas de cápside de rAAV, após a injecção local intra-articular, realizámos um ensaio específico como descrito na secção de métodos. A presença de anticorpos de neutralização antes e após a injecção de rAAV foi determinada no soro dos ratos injectados com rAAV2 e 5. Os resultados são mostrados na figura 5. Os ratos artríticos foram injectados com 1,14 xlO10 de GC' s rAAV2 (a) ou rAAV2 (b) nas articulações do tornozelo direito. As amostras de soro foram obtidas 1, 2, 3 e 4 semanas após a injecção. Foram calculadas titulações como a diluição máxima que não mostra nenhuma inibição de células X-gal positivas em comparação com os poços incubados apenas com rAAV LacZ.

Antes da injecção, nenhum dos anticorpos foi encontrado em qualquer uma das mostras. Uma semana após a injecção, os anticorpos neutralizantes foram detectados, alcançando um máximo às 2 semanas e lentamente diminuindo após 3 semanas. Ainda que esta tendência seja observada para ambos os serótipos, a injecção de rAAV2 induz claramente titulações 51/55 de anticorpos neutralizantes mais elevadas no soro do que o rAAV5, mostrando apenas níveis ligeiramente acima do natural. De forma importante, não foi encontrada nenhuma reactividade cruzada para os dois serótipos.

Exemplo 5 - Transdução de FLS humano com rAAV2 e AAV5

Tendo sido mostrado que rAAV2 e 5 são capazes de transfectar a membrana sinovial de rato, queríamos investigar o potencial de ambos os serótipos para transduzir FLS humano primário obtido de pacientes com AR. Para este efeito, usámos vectores de rAAV que expressam LacZ ou GFP. A expressão do transgene foi visualizada após 48 horas por coloração enzimática de β-gal ou microscopia fluorescente. Ambos os serótipos foram capazes de transduzir FLS humano, com rAAV5 mostrando uma expressão mais elevada em todas as experiências. Na figura 6, é mostrada uma experiência exemplificativa.

Lisboa, 20 de Julho de 2012 52/55

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e o EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição

wo 9961601 • US 6531456 B wo 0073481 A • US 6277969 B us 5139941 A • us 6046319 A

Literatura citada na descrição que não é Pedido de Patente

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Claims (12)

1. Reivindicações 1. Virião rAAV que compreende proteínas da cápside de AAV serótipo 5, em que o virião rAAV compreende um vector rAAV2, o qual compreende um elemento de expressão operativamente unido a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica eficaz contra a artrite reumatóide.
2. 2. Virião rAAV de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de ácidos nucleicos codifica uma proteína terapêutica seleccionada do grupo que consiste em: inibidor de IL-1, inibidor de TNFcx, antagonista do receptor de IL-1, proteína de ligação de IL-18, receptor de sTNFa p55 ou sTNFa p75 dn-IKK-13; IL-4 IL-10 IL-13, IFN-β e VIP, e variantes destes tendo, pelo menos, 80% de identidade de sequência.
3. 3. Método in vitro para administração de virião rAAV da técnica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em células sinoviais ou culturas de células compreendendo células sinoviais ex vivo, em que as células transduzidas são opcionalmente seleccionadas.
4. 4. Célula sinovial transduzida passível de ser obtida pelo método de acordo com a reivindicação 3.
5. 5. Composição farmaceuticamente aceitável, compreendendo um virião recombinante AAV, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou uma célula sinovial transduzida, como definida na reivindicação 4, compreendendo ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. 1/3
6. 6. Virião rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a célula transduzida de acordo com a reivindicação 4, ou a composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 5 como um medicamento.
7. 7. Virião rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a célula transduzida de acordo com reivindicação 4, ou a composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 5, para uso no tratamento da artrite reumatóide.
8. 8. Utilização de a) o virião rAAV de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou b) célula transduzida de acordo com a reivindicação 4, ou c) composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 5, para a produção de um medicamento para o tratamento da artrite reumatóide.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8a), em que o medicamento é adequado para administração numa célula sinovial in vivo, por administração local do virião rAAV numa articulação reumatóide de um sujeito.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 8 b) ou 9, em que o medicamento é adequado para injecção na articulação, preferencialmente por injecção no compartimento sinovial.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que a expressão da sequência de ácidos nucleicos na célula sinovial transduzida produz uma redução dos sintomas da artrite da articulação. 2/3
12. 12. Utilização de acordo reivindicações 8 a 11, em medicamento é repetida após tempo. Lisboa, 20 de Julho de 2012 com qualquer uma das que a administração do um determinado período de 3/3