MXPA06002402A - Vectores de vaa para terapia del gen in vivo de artritis reumatoide - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo de terapia del gen basada en virus adeno-asociados (VAA), en particular, terapia del gen in vivo de artritis reumatoide (AR). La invención proporciona viriones de VAA recombinante siendo altamente eficientes en el suministro de genes que codifican proteínas terapéuticas para las articulaciones artríticas, y métodos para usar tales viriones en la terapia del gen in vivo.

Description

VECTORES DE VAA PARA TERAPIA DEL GEN IN VIVO DE ARTRITIS REUMATOIDE Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de terapia del gen basado en el virus adeno-asociado (VAA) , en particular, terapia del gen in vivo, de artritis reumatoide (AR) . La invención proporciona viriones de VAA recombinantes siendo altamente eficientes en el suministro de genes que codifican proteínas terapéuticas, tales como proteínas anti-inflamatorias o proteínas que inhiben la actividad del NF-?B a las articulaciones, y métodos para usar tales viriones en terapia del gen in vivo o ex vivo.

Antecedentes de la Invención La artritis reumatoide (AR) es un trastorno destructivo progresivo que se dirige principalmente a las articulaciones, y está caracterizado por la hiperproliferación del tejido sinovial y la infiltración de células derivadas de la sangre, que resultan en la erosión progresiva del cartílago y hueso. La incidencia de AR ha sido reportada por ser de alrededor de 30 por 100,000 de la población, y puede afectar cualquier grupo de edad desde niños hasta los mayores. El predominio de la enfermedad es aproximadamente 1 por ciento alrededor del mundo. De este modo, existen aproximadamente 150,000 pacientes con AR solamente en los Países Bajos. El inicio máximo es entre las edades de 30 y 55 y, debido a las tasas consistentemente altas en mujeres, el predominio de AR en mujeres de más de 65 años es hasta 5 por ciento. La AR está asociada con un alto grado de pérdida económica, morbidez y mortalidad temprana. Como un ejemplo, casi 80 por ciento de pacientes en un centro, fueron severamente incapacitados después de 20 años de seguimiento; un tercio adicional había muerto. Pacientes con AR que requieren cuidados hospitalarios, tienen al menos una mortalidad creciente al doble, cuando se compara con los normales, y la AR más severa está asociada con tasas de mortalidad superiores. La mortalidad en exceso en AR severa ha sido comparada con aquella de la enfermedad de la arteria coronaria de tres vasos o etapa IV de la enfermedad de Hodgkins. Una apreciación de los mecanismos patogénicos de AR y los escasos resultados con terapia convencional, ha conducido al reciente concepto de tratamiento agresivo de enfermedad temprana o recientemente diagnosticada, para suprimir el comienzo de la inflamación y prevenir la lesión de articulaciones. La terapia de fármaco es el apoyo principal del tratamiento para todos los pacientes, excepto para aquellos en remisión clínica. Tal terapia debe ser instituida con las metas de tratar a cada paciente suficientemente para inducir una remisión y prevenir la pérdida adicional de tejidos de las articulaciones o función en actividades diarias. Además de la terapia convencional con fármacos anti-reumáticos que modifican la enfermedad, nuevos procedimientos dirigidos al bloqueo del TNF-a han entrado exitosamente a la clínica. También es ahora posible alcanzar 20% de mejoramiento en aproximadamente 70% de pacientes con AR usando este procedimiento. La mayoría de estos 20% de respondedores del American College of Rheumatology (ACR) (por sus siglas en inglés, Colegio Americano de Reumatología (ACR) ) , sin embargo, todavía tendrán algunas articulaciones activamente inflamadas. Aproximadamente 30% de los pacientes no responderán al bloqueo del TNF-a con respecto a la actividad de la artritis . Los corticoesteroides intra-articulares son un apoyo principal importante del tratamiento de sinovitis sintomática en pacientes con AR. Especialmente cuando existe actividad de artritis aislada bajo terapia antireumática sistémica, como puede ocurrir en muchos pacientes, existe una indicación para el tratamiento local. Sin embargo, no todos los pacientes responderán al uso de corticoesteroides y su uso es limitado por los efectos colaterales.

La patología de AR se extiende a través de la articulación sinovial. Contrario a la naturaleza celular del fluido sinovial normal, el fluido sinovial de AR es enriquecido predominantemente con neutrófilos, pero también están presentes macrófagos, linfocitos-T y células dendríticas (Tak, P.P. Examination of the synovíum and synovial fluid. In: Firestein GS, Panayi GS, ollheim FA, editores. Rheumatoid arthritis. Frontiers in pathogenesis and treatment. New York: Oxford University Press, Inc., 2000:55-68) . El incremento en la capacidad celular es mayormente obvio en la membrana sinovial, la cual llega a infiltrarse por células reclutadas de la sangre. La capa de revestimiento de la articulación se incrementa desde 1-2 células hasta 6-8 células de espesor y consiste principalmente de macrófagos íntimos activados y sinoviocitos similares a fibroblastos. Las alteraciones en la biología normal de sinoviocitos son importantes en el desarrollo y mantenimiento de los procesos patológicos asociados con AR, incluyendo invasión y destrucción del cartílago articular y hueso. Además de la producción de mediadores solubles tales como elastasa y colagenasa, los sinoviocitos median este proceso patofisiológico por la expresión de proteínas de la superficie celular, las cuales están involucradas en el reclutamiento y activación de linfocitos y macrófagos dentro del sinovio reumatoide. Los sinoviocitos son fácilmente alcanzados vía el espacio intra-articular, son de vida relativamente larga, y de este modo, representan un objetivo ideal para estrategias de terapia del gen (Chernajovsky, Y. et al., 1998, Drug Aging 12:29-41; Robbins, P.D. et al., 1998, Springer Semin. I munopathol, 20:197-209). Además, la naturaleza localizada de las articulaciones hace a la terapia del gen in vivo muy atractiva. Muchas interacciones celulares y moleculares en el sinovio reumatoide se mantienen y modulan por las citosinas. Un hallazgo consistente en AR ha sido la abundancia de citosinas proinflamatorias derivadas de fibroblastos y macrófagos tales como IL-1, TNFa, e IL-18 en el sinovio reumatoide. Los inhibidores IL-1 y TNFa que se originan naturalmente, el antagonista del receptor IL-1 (IL-1RA) y los receptores p55 y p75 del TNF soluble, son producidos en paralelo con sus contrapartes. Para IL-18, se purifica una proteína de enlace a IL-18. Las terapias que proporcionan exceso de inhibidores de citosina recombinante, pueden cambiar el balance en AR hacia un estado anti-inflamatorio. La eficacia clínica de procedimientos dirigidos a anti-TNF-a y anti-IL-1, enfatiza que ciertas citosinas son objetivos apropiados para terapia del gen. Otro procedimiento podría ser la sobreexpresión dirigida de proteínas anti-inflamatorias biológicamente activas (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 e IFN-ß) por sinoviocitos para inhibir la cascada inflamatoria (Boyle, D.L. et al., 1999, Gene Ther. 6:1911-1918). El NF-JtB es claramente uno de los reguladores más importantes de expresión de gen pro-inflamatorio (Tak., P. P. and Firestein, G.S., 2001, J. Clin. Invest. 107(1) :7- 11) . La síntesis de citosinas, tales como TNF-a, IL-lß, IL- 6 e IL-8, está mediada por el NF-JB, como es la expresión de Cox-2. Aupperle et al. (1999, J. Immunol. 163:427-433) recientemente estudió el papel de IKK en sinoviocitos similares al fibroblasto primario, aislados del sinovio de pacientes con AR y osteoartritis. En ambos grupos, la proteína IKK inmunoreactiva es abundante en estas células, y el IKK-a e IKK-ß, están constitutivamente expresados al nivel del ARNm. La función del IKK en estas células puede ser mayormente mejorada por el TNF-a e IL-1, conduciendo a la degradación del I?B-a endógeno y translocación nuclear del NF- B. La activación de esta trayectoria y la inducción consecuente de la expresión de IL-6, IL-8, ICAM-1 y colagenasa-1, depende específicamente del IKK-ß (Aupperle, K. R. et al., 1999, J. Immunol . 163:427-433). De este modo, la transfección con constructos adenovirales que codifica a un mutante negativo dominante de IKK-ß, previene la translocación nuclear del NF-?B mediada por el TNF-a y la expresión del gen pro-inflamatorio en sinoviocitos, mientras el mutante del IKK-a negativo no tiene efecto (Aupperle, K. R. et al., 1999, J. Immunol. 163:427-433). Modelos animales de artritis reumatoide soportan la noción que la activación del NF-?B juega un papel patogénico ín vivo. Por ejemplo, el enlace del NF-?B sinovial incrementado, precede el desarrollo de implicación de articulación clínica en artritis inducida por colágeno de murino y gradualmente se incrementa durante la evolución de la enfermedad (Han, Z. N., et al. 1998, Autoimmunity 28:197-208). Mucha de esta actividad de enlace parece ser debido al p50, el cual ha sido implicado, en la transcripción de colagenasa-3 y podría contribuir, junto con el AP-1 localmente activado, a la resorpción de matriz extracelular. La activación del NF-?B sinovial también ocurre dentro de algunos días después de la inmunización en artritis adyuvante en ratas (Tsao, P. . et al. 1997, Clin. Immunol. Im unopathol . 83:173-178). La activación selectiva del NF-?B en ratas normales por transferencia intra-articular de un gen de IKK-ß funcional, conduce a inflamación sinovial y signos clínicos de artritis (Tak, P. P. et al., 2001, Arthritis Rheum. 4 (8) : 1897-907) . Contrariamente, se observó la reducción de la translocación nuclear del NF- B y sinovitis clínica en artritis adyuvante en ratas, después de una inyección intra-articular (i.a.) con un constructo de IKK-ß adenoviral negativo dominante (Tak., P.P. et al., 2001, Arthritis Rheum. 44(8) : 1897-907) . El papel central de la inflamación del NF-?B también se ha mostrado en ratas con artritis inducida por la pared celular estreptococal (Miagkov, A. V. et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95:13859-13864) y en ratones con artritis inducida por colágeno (CÍA) (Gerlag, D.M. et al., 2000, J. Immunol . 165:1652-1658; Han, Z. N. et al., 1998, Autoimmunity 28:197-208). Por lo tanto, varias estrategias dirigidas para incrementar la producción local de proteínas anti- inflamatorias o dirigidas a la inhibición de la actividad del NF-?B en el compartimiento sinovial por terapia del gen in vivo, mantiene gran promesa para el tratamiento de AR. Para permitir la producción local sostenida de dosis efectivas de proteínas terapéuticas en la articulación, en particular en el sinovio reumatoide, necesita desarrollarse un sistema eficiente de suministro del gen. Existe un intervalo de diferentes vectores virales y no virales, tales como vectores adenovirales, vectores de virus adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores del virus del herpes, liposomas, ADN, vacunación y similares (véase Vervoordeldonk M.J.B.M y Tak P.P. 2001, Best Practice & Research Clinical Rheumatology Vol. 15 (5): 771- 778). A la fecha, se han probado principalmente vectores adenovirales como vectores para suministro del gen. Sin embargo, su naturaleza episo al limita la duración de la expresión del gen, haciéndolos no muy adecuados para el tratamiento de artritis, en donde se requiere la expresión de término largo. Otra desventaja de los vectores adenovirales es la presencia de proteínas virales, los cuales pueden provocar una respuesta inmune en los hospederos. Los vectores virales adeno-asociados (VAA) , por otro lado, han sido mostrados (en algunos tejidos) por integrarse en el genoma de la célula objetivo (Hirata et al. 2000, J. of Virology 74:4612-4620), permitiendo la expresión del transgen de término largo en células transducidas . El virus adeno-asociado es un parvovirus de ADN dependiente del auxiliador, el cual no está asociado con enfermedades en humanos o mamíferos (para revisión véase Berns and Bohensky, 1987, Advances in Virus Research, Acade ic Press Inc., 32:243-307). Los vectores VAA recombinantes han sido mostrados por permitir transfectar un intervalo de diferentes tipos celulares, tales como células hematopoyéticas, células epiteliales respiratorias y neuronas. Sin embargo, para muchos tipos celulares (tales como por ejemplo, células sinoviales, pero también muchas otras) , no permanece claro si o no pueden ser transfectadas en todas o eficientemente por los vectores de VAA. Pan et al . (J. of Virology 1999, Vol 73, 4:3410-3417) ha permitido transfectar sinoviocitos de rata que muestran síntomas de artritis inducida por lipopolisacáridos usando vectores de VAAr, pero encontró que la expresión del transgen se disminuye cuando desciende la inflamación. Sin embargo, la literatura reporta ampliamente resultados divergentes a partir de experimentos que intentan el suministro del gen in vivo en articulaciones con vectores basados en VAA (Ghivizanni et al., 2000, Drug Discov. Today 6:259-267). Un factor de complicación es que los serotipos de VAA difieren en tropismo celular. El documento WO99/61601 por ejemplo, muestra que los vectores a base de VAA5 transducen ciertos tipos celulares (células epiteliales de vías respiratorias cultivadas, células del músculo estriado cultivadas y células endoteliales de la vena umbilical humana cultivada), a una eficiencia superior que el VAA2. Por otro lado, los VAA5 fueron mucho más ineficientes en transducir células eos cultivadas, 293, HeLa, células IB3 y líneas de células MCF7, mientras tanto VAA2 y VAA5 mostraron escasas eficiencias de transducción para líneas de células NHI 3T3, skbr3 y t-47D. Debido a la disponibilidad de los sistemas de suministro de gen viral y no-viral, a la fecha, no existen sistemas de vectores adecuados para el suministro efectivo de genes (que codifican proteínas terapéuticas) al sinovio reumatoide de sujetos que sufren de artritis reumatoide.

Existe por lo tanto, una necesidad para generar un sistema adecuado de suministro de gen in vivo y ex vivo al sinovio, para permitir tratamiento efectivo. La presente invención proporciona tal sistema de suministro de gen.

Sumario de la Invención La presente invención proporciona en una modalidad, un método para suministrar una molécula de ácido nucleico a una célula sinovial reumatoide in vivo, el método comprende las etapas de (a) proporcionar un virión de VAA recombinante (VAAr) que comprende proteínas cápsidas de VAA serotipo 5 ó VAA serotipo 2, en donde el virión del VAAr comprende un vector de VAArX, el vector de VAArX comprende un elemento de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico; y (b) llevar el virión de VAAr en contacto con la célula sinovial, con ello, la transducción del vector del VAArX resulta en la expresión de la secuencia de ácido nucleico en las células sinoviales transducidas . En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar articulaciones reumatoides usando los viriones de VAAr de la invención. El método preferiblemente comprende las etapas de (a) establecer diagnósticos de artritis reumatoide de una articulación; (b) transducir las células sinoviales reumatoides de la articulación usando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y viriones de VAAr que comprenden proteínas cápsidas de VAA serotipo 5 ó VAA serotipo 2, en donde los viriones del VAAr comprenden un vector de VAArX que comprende una secuencia de nucleótido que codifica al menos, una proteína terapéutica (o péptido) y, (c) , opcionalmente repetir la etapa (b) después de un cierto periodo de tiempo. En una modalidad alternativa del tratamiento, el método comprende transducir células sinoviales reumatoides ex vivo, usando un virión de VAAr de la invención, opcionalmente seleccionando las células transducidas, administrar las células transducidas a una articulación reumatoide de un sujeto, y opcionalmente repetir la administración después de un cierto periodo de tiempo. En otra modalidad de la invención, se proporciona un virión de VAA recombinante, por medio del cual el virión comprende proteínas cápsidas de VAA serotipo 5 ó VAA serotipo 2, por medio del cual el virión de VAAr comprende un receptor de VAArX, en donde el vector VAArX comprende un elemento de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica efectiva contra la artritis reumatoide.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Teñido X-Gal (5-bromo-4-cloro-3- indolil-ß-D-galactopiranosidasa) (resulta de análisis de imágenes digitales cuantificadas) de teñido in situ directo de secciones congeladas de articulaciones de rata transducidas con VAArl, VAAr2, VAAr3 , VAAr4, VAAr5, un vector de control y adenovirus que expresan el gen para LacZ. Figura 2: Tejido in situ directo de X-gal (azul) de secciones congeladas de articulaciones de rata inyectadas con VAArl hasta VAAr5. Figura 3 : Mapa físico de plásmido pVDll que contiene un vector VAAr2 en el cual, un cásete de expresión que contiene las secuencias codificantes LacZ de E. coli accionadas por el promotor CMV, son flanqueadas por secuencias ITR del VAA2. Figura 4 : Expresión beta-gal en tejido sinovial de rata, 1, 2, 3 y 4 semanas después de la inyección intraarticular de VAAr2 y 5, cuantificado por análisis de imágenes digitales. Figura 5: Desarrollo de anticuerpos de neutralización en suero después de la inyección intraarticular de VAAr2 ó VAAr5. Figuras 6a y 6b: El VAAr5 media la transferencia del gen a sinoviocitos similares a fibroblastos humanos (FLS) in vitro. FLS humano aislados de biopsias sinoviales de pacientes con AR fueron transducidos con VAA5.GFP. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron fijadas con microscopio fluorescente. La figura 6a son: células fluorescentes, La figura 6b es: fotografía de contraste de fase.

Descripción Detallada de la Invención A. Definiciones Generales "Gen" o "secuencia codificante", se refiere a una región de ADN o ARN (la región transcrita) , la cual "codifica" una proteína particular. Una secuencia codificante es transcrita (ADN) y traducida (ARN) en un polipéptido, cuando se coloca bajo el control de una región regulatoria apropiada, tal como un promotor. Un gen puede comprender varios fragmentos operablemente ligados, tales como un promotor, una secuencia líder al 5 una secuencia codificante y una secuencia no traducida al 3 ' , que comprende un sitio de poliadenilación. Un gen quimérico o recombinante es un gen que no se encuentra normalmente en la naturaleza, tal como un gen en el cual por ejemplo, el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o toda la región de ADN transcrita. "Expresión de un gen", se refiere al proceso en donde un gen es transcrito en un ARN y/o traducido en una proteína activa. Como se usa en este documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, localizados corriente arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de enlace para la polimerasa de ARN dependiente del ADN, los sitios de iniciación de transcripción y cualquiera de otras secuencias de ADN, que incluyen, pero no se limitan a los sitios de enlace al factor de transcripción, sitios de enlace de proteína activadora y represora y cualquiera de otras secuencias de nucleótidos conocidas por uno de habilidades en la técnica, para actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de los tejidos bajo la mayoría de condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es fisiológicamente o de desarrollo regulado. Un promotor "específico del tejido" es solamente activo en tipos específicos de tejidos o células. Como se usa en este documento, el término "operablemente ligado" , se refiere a dos o más ácidos nucleicos o elementos de secuencias de ácido nucleico que están físicamente ligados en tal forma que están en relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor está operablemente ligado a una secuencia codificante si el promotor es capaz de iniciar o de otro modo, controlar/regular la transcripción y/o expresión de una secuencia codificante, en tal caso, la secuencia codificante debe ser entendida por estar "bajo el control" del promotor. De manera general, cuando dos secuencias de ácido nucleico están operablemente ligadas, estarán en la misma orientación y usualmente también en la misma estructura lectora. Usualmente también serán esencialmente contiguas, aunque esto no se puede requerir. Los términos "secuencia señal" , "péptido señal" , y "líder secretor" , son usados intercambiablemente y se refieren a una extensión continua corta de aminoácidos (usualmente de aproximadamente 15-60 aminoácidos) , usualmente presentes en el término amino de polipéptidos secretados y ligados a la membrana y que dirigen su suministro a las varias ubicaciones fuera del citosol . De este modo, las señales objetivo o de selección, específicas, las cuales incluyen secuencias señal, pueden dirigir el suministro de polipéptidos en el núcleo, ER, mitocondrias, perixosomas, etc. Las secuencias señal usualmente contienen un núcleo hidrofóbico de aproximadamente 4-15 aminoácidos, los cuales son a menudo inmediatamente precedidos por un aminoácido básico. Al extremo carboxilo-terminal del péptido señal, existe un par de aminoácidos no cargados, pequeños, separados por un aminoácido único de intervención, que define el sitio de desdoblamiento del péptido señal, von Heijne, G. (1990) J. Membrane Biol. 115:195-201. Debido a su estructura total y similitudes funcionales, los péptidos señal nativos, no tienen una secuencia consenso. "Suministro de gen" o "transferencia de gen", se refieren a métodos para la introducción confiable de ADN recombinante o extraño en las células hospederas . El ADN transferido puede permanecer no integrado o preferiblemente se integra en el genoma de la célula hospedera. El suministro del gen puede tomar lugar por ejemplo, por transducción, usando vectores virales, o por transformación de células, usando métodos conocidos, tales como electroporación, bombardeo celular y similares. "Vector" se refiere de manera general, a constructos de ácido nucleico adecuados para clonación y expresión de secuencias de nucleótidos. El término vector puede también algunas veces, referirse a vehículos de transporte que comprenden el vector, tales como virus o viriones, los cuales son capaces de transferir el vector dentro y entre las células hospederas. "Vector de VAAr" como se usa en este documento, se refiere a un vector recombinantes derivado de un serotipo de virus adenoasociado, tal como VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y otros. Los vectores de VAAr tienen uno o preferiblemente todos los genes del VAA de tipo nativo suprimidos, pero todavía comprenden secuencias de ácido nucleico de ITR funcionales. Las secuencias de ITR funcionales son necesarias para la replicación, rescate y empaquetado de viriones de VAA. Las secuencias de ITR pueden ser secuencias de tipo nativa o secuencias sustancialmente idénticas (como se define abajo) o pueden ser alteradas por ejemplo, en inserción, mutación, supresión o sustitución de nucleótidos, tan pronto como permanezcan funcionales . "Vector de VAAr" como se usa en este documento, se refiere a un vector de VAA recombinante que comprende las secuencias de ácido nucleico de ITR de cualquiera de los serotipos de VAA, o secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente idénticas a las secuencias de ITR de tipo nativo del serotipo de VAA particular, tan pronto como permanezcan funcionales. Las secuencias de nucleótidos de elección, son insertadas entre las secuencias de ITR del VAA, por ejemplo, constructos de expresión que comprenden un elemento regulatorio de expresión operablemente ligado a una secuencia codificante y una secuencia de terminación al 3 A El término "vector de VAArX" como se usa en este documento, se refiere a un vector de VAA recombinante que comprende las secuencias de ácido nucleico de ITR del serotipo de VAAX, o secuencias de ácido nucleico siendo sustancialmente idénticas a las secuencias de ITR de tipo nativo del serotipo de VAAX, tan pronto como permanezcan funcionales. El término "vector de VAAr5" o "vector de VAAr2" son de este modo, usados para indicar un vector de VAAr5 o VAAr2 que comprende respectivamente, las secuencias de ácido nucleico de ITR del VAA serotipo 5 ó serotipo 2, o secuencias de ácido nucleico sustancialmente idénticas a estos. "Virión de VAA" , se refiere a una partícula de virus completa, tales como por ejemplo, una partícula de virión de VAA de tipo nativo, la cual comprende ADN de genoma de hebra única, empaquetado en proteínas cápsidas de VAA. La molécula de ácido nucleico de hebra única es ya sea de hebra sentido o hebra antisentido, ambas hebras son igualmente infecciosas. Un "virión de VAAr" se refiere a una partícula de virus de VAA recombinante, es decir, una partícula la cual es infecciosa pero de replicación defectiva. Está compuesto de una cubierta de proteína de VAA y comprende un vector de VAAr. En el contexto de la presente invención, la cubierta de proteína puede ser de un serotipo diferente que el vector de VAAr. Un virión de VAA de la invención puede de este modo, estar compuesto de una cubierta de proteína, es decir, cápsida icosahédrica, la cual comprende proteínas cápsidas (VP1, VP2 y/p VP3) de un serotipo de VAA, por ejemplo, VAA serotipo 5, mientras el vector de VAAr contenido en tal virión de VAA5, puede ser de cualquiera de los vectores de VAArX descritos anteriormente, que incluyen un vector de VAAr5. Un "virión de VAArS" comprende además, proteínas cápsidas del VAA serotipo 5, mientras por ejemplo, un virión de VAAr2 comprende proteínas cápsidas del VAA de serotipo 2, por medio del cual, cualquiera puede comprender cualquiera de los receptores de VAArX de la invención. "Funciones auxiliadoras de VAA" , se refieren de manera general, a las funciones de VAA correspondientes requeridas para replicación del VAAr y el empaquetado proporcionado al virión de VAAr o vector de VAAr in trans. Las funciones auxiliadoras del VAA complementan las funciones del VAA las cuales están perdidas en el vector de VAAr, pero carecen del ITR del VAA (las cuales se proporcionan por el vector del VAAr) . Las funciones auxiliadoras del VAA incluyen la dos principales ORF de VAA, es decir, la región codificante rep y la región codificante cap o secuencias de las mismas sustancialmente idénticas funcionales. Las regiones Rep y Cap son bien conocidas en la técnica, véase por ejemplo, Chiorini et al. (1999, J. of Virology, Vol 73 (2) : 1309-1319) o documento US 5,139,941, incorporados en este documento por referencia. Las funciones auxiliadoras del VAA pueden ser suministradas en un constructo auxiliador de VAA. La introducción del constructo auxiliador en las células hospederas, puede ocurrir por ejemplo, por transformación o transducción previo a o concurrentemente con la introducción del vector de VAAr. Los constructos auxiliadores del VAA de la invención, pueden de este modo, ser elegidos de manera tal que produzcan la combinación deseada de serotipos para las proteínas cápsidas del virión de VAAr, por un lado y para la replicación del vector de VAArX y empaquetado por el otro lado. El "virus auxiliador de VAA" proporciona funciones adicionales requeridas para la replicación y empaquetado del VAA. Los virus auxiliadores . de VAA adecuados incluyen adenovirus, virus del herpes simple (tal como HSV tipos 1 y 2) y virus de vaccinia. Las funciones adicionales proporcionadas por el virus auxiliador pueden también ser introducidas en las células hospederas vía vectores, como se describe en el documento US 6,531,456, incorporado en este documento por referencia. Un "transgen" es definido en este documento, como un gen que ha sido recientemente introducido en una célula, es decir, un gen que no se origina normalmente en la célula. El transgen puede comprender secuencias, que son nativas a la célula, secuencias que no se originan naturalmente en la célula y pueden comprender combinaciones de las mismas. Un transgen puede contener secuencias codificantes para una o más proteínas que pueden estar operablemente ligadas a secuencias regulatorias apropiadas para expresión de las secuencias codificantes en la célula. Preferiblemente, el transgen está integrado en el genoma de la célula hospedera. "Transducción" se refiere al suministro de una molécula de ADN en una célula hospedera recipiente por un virión de VAA. Por ejemplo, la transducción de una célula objetivo por un virión de VAAr de la invención, conduce a la transferencia del vector de VAArX contenida en tal virión en la célula transducida. "Célula hospedera" o "célula objetivo", se refiere a la célula en la cual toma lugar el suministro de ADN, tal como los sinoviocitos de un sujeto. Los viriones de VAA son capaces de transducir células tanto en división como sin división. "Sujetos" significan cualquier elemento de las clases de mamíferos, que incluyen sin limitación humanos, primates no humanos, animales de granja, animales domésticos y animales de laboratorio. El término "intra-articular" se refiere al interior de una articulación, por ejemplo, rodilla, codo, hombro, tobillo, muñeca, etc. De este modo, una inyección intra-articular es una inyección en el espacio entre los huesos de una articulación. En la rodilla, "intraarticular" se refiere al espacio entre el fémur y la tibia" detrás y circundando la rótula. El término "sustancial identidad" , significa que dos péptidos o dos secuencias de nucleótidos, cuando se alinean óptimamente, tal como por programas GAP o BESTFIT, usando parámetros de defecto, portan al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99 por ciento de identidad de secuencia) . GAP usa la alineación global Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias sobre su longitud completa, maximizando el número de igualaciones y minimizan el número de hendiduras .

De manera general, los parámetros de defecto GAP son usados, con una penalización de creación en hendidura = 50 (nucleótidos) /8 (proteínas) y penalización de extensión en hendidura = 3 (nucleótidos) /2 (proteínas) . Para nucleótidos, la matriz de registro de defecto usada es nwsgapdna y para proteínas la matriz de registro de defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992) . El término "que comprende" es interpretado por especificar la presencia de las partes, etapas o componentes declarados, pero no excluye la presencia de una o más partes, etapas o componentes adicionales. Una secuencia de ácido nucleico que comprende la región X, puede además, comprender regiones adicionales, es decir, la región X puede ser incluida en una región de ácido nucleico más grande.

B. Modalidades de la invención VAA es un virus de ADN no desarrollado, el cual requiere un virus auxiliador para replicarse. Los vectores de VAA recombinantes tienen un número de ventajas importantes sobre otros vectores, como son, no patogénicos en humanos, inmunológicamente inertes y permiten la expresión del gen de término largo in vivo. Su capacidad para mediar la expresión de genes terapéuticamente relevantes está ahora bien establecida en varios modelos experimentales de artritis. Aunque un número incrementado de serotipos de VAA ha sido identificado, todos los estudios hasta ahora han sido realizados con el serotipo 2 (VAA2) . Serotipos diferentes tienen diferentes proteínas de cubiertas de viriones y, como una consecuencia, varían en su tropismo. Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente, que los viriones de VAA de diferentes serotipos, varían considerablemente en su eficiencia de transducción cuando se usan como vectores de VAA para suministro in vivo de genes a las articulaciones artríticas, en particular al sinovio. Cuando se comparan eficiencias de transducción de viriones recombinantes que comprenden vectores de VAAr basados en cinco diferentes serotipos de VAA (VAA1 a VAA5) , que codifican la fosfatasa alcalina secretada de murino de genes reporteros (mSEAP) o beta-galactosidasa de E. coli (beta-Gal) , en dos modelos animales diferentes de artritis (ratón y rata) , se encontró sorprendentemente que la transferencia del gen in vivo fue lejanamente más eficiente con viriones de VAA5 que con los viriones basados en los serotipos de VAAl hasta VAA4. Los inventores han permitido de este modo, proporcionar un sistema de suministro de gen eficiente a las células sinoviales . La invención además describe métodos terapéuticos para el tratamiento de artritis reumatoide, en particular, el tratamiento de articulación reumatoide, basado en la terapia del gen in vivo del sinovio reumatoide. Es una modalidad de la invención, proporcionar métodos para suministrar localmente moléculas de ácido nucleico a articulaciones artríticas, en particular al sinovio reumatoide. En particular, los métodos proporcionados permiten la transducción eficiente de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas terapéuticas en células y tejidos sinoviales reumatoides en una cantidad terapéuticamente efectiva y por un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo. Los métodos de la invención proporcionan expresión de alto nivel sostenido, mejorada (término largo) de proteínas terapéuticas en células objetivo. Sin limitar el ámbito de la invención, especialmente la alta eficiencia de transducción del VAAr5, y a una extensión menor los viriones de VAA2, en combinación con los vectores de VAAr de la invención, los cuales permiten el suministro eficiente del gen in vivo. Aunque viriones de VAAr que comprenden proteínas cápsidas de tanto VAA serotipo 5 como 2, pueden ser usados ventajosamente en la presente invención, los viriones de VAAr que comprenden proteínas cápsidas del VAA serotipo 5 (viriones de VAAr5) , son de este modo, mayormente preferidos para uso en los métodos y composiciones de la invención. Los métodos de la invención comprenden las etapas de (a) proporcionar un virión de VAA recombinante (VAAr) que comprende proteínas cápsidas de VAA serotipo 5 ó VAA serotipo 2, en donde el virión de VAAr comprende un vector de VAArX, el vector de VAArX comprende un elemento de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico; y (b) llevar el virión de VAAr en contacto con la célula sinovial, por medio de la cual la transducción del vector de VAArX resulta en la expresión de la secuencia de ácido nucleico en las células sinoviales transducidas. Preferiblemente en el método, la secuencia de ácido nucleico es suministrada a la célula sinovial in vivo, por administración local del virión de VAAr a una articulación reumatoide de un sujeto. Preferiblemente, la administración del virión de VAAr es por inyección en la articulación, más preferiblemente por inyección en el compartimiento sinovial. Alternativamente, en el método, el virión de VAAr se lleva en contacto con células sinoviales o cultivos celulares que comprenden células sinoviales ex vivo, y por medio de las cuales, opcionalmente las células transducidas son seleccionadas. El método alternativo puede comprender además, la etapa de administrar las células transducidas a una articulación reumatoide de un sujeto, por medio de la cual, preferiblemente la administración de las células transducidas es por inyección en la articulación, preferiblemente por inyección en el compartimiento sinovial. Preferiblemente en estos métodos, la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula sinovial transducida in vivo o ex vivo, resulta en una reducción de los síntomas de artritis de la articulación. El virión de VAA recombinante, que incluye uno de los vectores de VAArX, se produce usando métodos conocidos en la técnica, como se describe en Pan et al (J. of Virology 1999, Vol 73 (4) :3410-3417) y Clark et al . (Human Gene Therapy, 1999, 10:1031-1039), incorporados en este documento por referencia. En breve, los métodos involucran de manera general (a) la introducción del vector de VAAr en una célula hospedera, (b) la introducción de un constructo auxiliador de VAA en la célula hospedera, en donde el constructo auxiliador comprende las funciones virales perdidas del vector de VAAr y (c) introducir un virus auxiliador en las células hospederas. Todas las funciones para replicación de virión de VAAr y empaquetado necesarios para estar presentes, logran la replicación y empaquetado del vector de VAAr en viriones del VAAr. La introducción en la célula hospedera puede llevarse a cabo usando técnicas virológicas estándares y pueden ser simultáneamente o secuencialmente. Finalmente, las células hospederas son cultivadas para producir viriones de VAAr y son purificadas usando técnicas estándares tales como gradientes CsCl (Xiao et al . , 1996, J. Virol. 70:8098-8108). La actividad del virus auxiliador residual puede ser inactivada usando métodos conocidos, tales como por ejemplo, inactivación por calor. El virión de VAAr purificado está entonces listo para uso en los métodos. Tituladores altos de más de 1012 partículas por ml y alta pureza, se pueden lograr (libre de auxiliadores detectables y virus de tipo nativo) (Clark et al . supra and Flotte et al . , 1995, Gene Ther. 2:29-37). El vector de VAArX comprende al menos, las secuencias de nucleótido de las regiones de repetición terminal invertida (ITR) de uno de los serotipos de VAA, o secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a estas, y al menos una secuencia de nucleótido que codifica una proteína terapéutica (bajo el control de un elemento regulador adecuado) insertado entre los dos ITR. El genoma completo de VAA5 y otros serotipos de VAA han sido secuenciados (Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No. 2, pl309-1319) y la secuencia de nucleótido está disponible en GenBank (Acceso No. AF085716) . Las secuencias de nucleótidos ITR de VAA5 son de este modo, fácilmente disponibles para una persona experta. Pueden ser ya sea, clonadas o elaboradas por síntesis química como se conoce en la técnica, usando por ejemplo, un sintetizador de oligonucleótido como se proporciona por ejemplo, por Applied Biosystems Inc. (Fosters, CA, USA) o por técnicas estándares de biología molecular. Los ITR pueden ser clonados a partir del genoma viral de VAA o escindidos de un vector que comprende el ITR de VAA. Las secuencias de nucleótidos de ITR pueden ser ya sea ligados a cualquier extremo de la secuencia de nucleótido que codifica a una o más proteínas terapéuticas usando técnicas estándares de biología molecular, o la secuencia de VAA de tipo nativo entre los ITR puede ser reemplazada con la secuencia de nucleótido deseada.

Preferiblemente, el vector de VAAr no comprende alguna secuencia de nucleótido que codifica proteínas virales, tales como los genes rep (replicación) o cap (cápsidas) de VAA. El vector de VAAr puede además comprender un marcador o gen reportero, tal como un gen por ejemplo, que codifica un gen de resistencia al antibiótico, una proteína fluorescente (por ejemplo, gfp) o un gen que codifica un producto químicamente, enzimáticamente o de otro modo detectable y/o seleccionable (por ejemplo, lacZ, aph, etc.), conocido en la técnica. El vector de VAAr además comprende una secuencia promotora operablemente ligada a la secuencia de nucleótido que codifica una proteína terapéutica. Las secuencias promotoras adecuadas son promotores los cuales confieren expresión en células del sinovio reumatoide, tal como en macrófagos íntimos y/o en sinoviocitos similares al fibroblasto y/o otras células sinoviales tales como, pero no limitadas a células T. Promotores adecuados son por ejemplo, los promotores de genes conocidos por ser expresados en células sinoviales, tales como el promotor del CMV (citomegalovirus) , el promotor del gen IL-6 o el promotor SV40 y otros, como se determina fácilmente por una persona experta. Una secuencia no traducida al 3' adecuada, puede también estar operablemente ligada a la secuencia de nucleótido que codifica la proteína terapéutica. Las regiones no traducidas al 3' adecuadas, pueden ser aquellas naturalmente asociadas con la secuencia de nucleótido o pueden ser derivadas de genes diferentes, tales como por ejemplo, la secuencia de la región no traducida al 3' de la hormona de crecimiento bovino (poliA BGH) . El tamaño total de la molécula de ADN insertada en el vector de VAAr entre las regiones ITR es generalmente más pequeño de 5 kilobases (kb) en tamaño. También se contempla que el vector de VAAr comprenda secuencias de nucleótidos que codifican dos proteínas terapéuticas (por ejemplo, proteínas terapéuticas que tienen un efecto sinergístico) . Estas pueden ya sea comprender un promotor adecuado y una región no traducida al 3' adecuada cada una, o pueden estar ligadas por un elemento IRES (sitios de entrada al ribosoma interno) , proporcionando un transcripto bicistrónico bajo control de un promotor adecuado. Los elementos IRES adecuados se describen en por ejemplo, Hsieh et al. (1995, Biochemical Biophys. Res. Commun. 214:910-917). Opcionalmente, las secuencias de nucleótidos adicionales puede ser operablemente ligadas a la(s) secuencia (s) de nucleótidos que codifican la proteína terapéutica, tal como secuencias de nucleótidos que codifican péptidos señal (por ejemplo, para transporte objetivo del péptido al espacio extracelular) , señales de localización nuclear, incrementadores de la expresión, y similares. Una "proteína terapéutica" como se usa en este documento, se refiere a una proteína, la cual tiene un efecto terapéutico en artritis reumatoide cuando se administra localmente a la articulación reumatoide (en particular al sinovio) , en una cantidad efectiva (o dosificación) . Las proteínas terapéuticas adecuadas son por ejemplo, inhibidores de citosina tales como interieucina-1 (IL-1, March et al., 1985 Nature 315:641-647) o inhibidores del TNFa, antagonistas del receptor de citosina tales como por ejemplo, el antagonista IL-Ra del receptor de interieucina-1 (Cominelli et al. 1994, J. Biol. Chem. 269 (9) -.6962-6971) , proteínas de enlace a la citosina tales como proteína de enlace IL-18 (Im et al. 2002, J. Interferon Cytokine Res. 22 (3) :321-328) o receptores de citosina solubles tales como el receptor p55 ó p75 del sTNFa (Croxford et al., 2000, J. of I munology 164:2276-2718) o el receptor IL-1 soluble. También adecuadas son secuencias que codifican los anticuerpos del TNF-alfa, como se conoce en la técnica, por ejemplo, en el documento US 6,277,969, y secuencias que codifican las secuencias de interferencia de ARN o antisentido para TNF-alfa, conocidas en la técnica per se, por ejemplo, en el documento US 6,046,319. También adecuadas son proteínas con actividades anti-inflamatorias, tales como IL-4, IL-10, IL-13, IFN-ß o VIP (Vasoactive intestinal peptide; Delago, 2003 Trends Immunol. 24:221-24). Además, el dn-IKK-ß (cinasa I?-B negativa dominante) , el cual inhibe la activación del NF- KB, es una proteína adecuada a ser usada. Una lista de proteínas adecuadas se proporciona en Vervoordeldonk and Tak, 2001 (supra) : aI -RA = antagonista del receptor de interleucina-I; I -IsR = receptor IL-I soluble; TNFsR= receptor del factor necrosis del tumor soluble; vI -10= I -10 viral; IFN-ß = interferona beta; TGF- ß = factor de crecimiento de transformación ß; dn-IKK-ß = I?B negativo dominante-cinasa ß; NF-?B = factor nuclear KB; FADD = proteína de dominio de muerte asociada.

Las secuencias de nucleótido que codifican estas proteínas están fácilmente disponibles para una persona experta. Las secuencias (tanto nucleótidos como proteínas) , peden por ejemplo, encontrarse en la base de datos, tal como GenBank, SwissProt, y otras, y clones que comprenden las secuencias, se pueden obtener principalmente de depositarios tales como el American Type Culture Collection (ATCC) . En una modalidad preferida, las secuencias de nucleótidos son de origen humano, pero pueden también originarse de otras especies . Pueden ser secuencias de ADNc o ADN genómico. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas terapéuticas abarcan secuencias sintéticas que se originan naturalmente o de novo, así como también secuencias de nucleótido que codifican fragmentos terapéuticamente activos, formas mutadas o polipéptidos modificados (referidos como "variantes") . Las variantes pueden ser fácilmente generadas y probadas para la retención de funcionalidad usando métodos conocidos en la técnica, tales como, pero no limitados a sustituciones o supresiones de aminoácido, síntesis química de novo de péptidos o técnicas de mutagénesis o de lanzadera de gen, técnicas de hibridación. Las variantes del , péptido terapéutico incluyen péptidos con secuencias de aminoácido con al menos 80, 90, 95 ó 99% de "identidad de secuencia sustancial" a la proteína que se origina naturalmente, la cual retiene su efectividad terapéutica, es decir, la habilidad para reducir o abolir los síntomas de artritis reumatoide en sujetos. Los vectores de VAAr de la invención pueden además de una secuencia de nucleótido, codificar una proteína terapéutica que comprende una segunda secuencia de nucleótido o adicional que codifica una proteína que proporciona un mecanismo a prueba de fallas que permite curar a un sujeto a partir del vector de VAAr o de células transducidas junto con éstas, si se considera necesario. Tal secuencia de nucléótido, a menudo referida como un gen suicida, codifica una proteína que es capaz de convertir un profármaco en una sustancia tóxica que es capaz de eliminar las células transgénicas en las cuales la proteína es expresada. Ejemplos adecuados de tales genes suicidas incluyen por ejemplo, el gen desaminasa de citosina de E. coli , o uno de los genes de timidina cinasa del Virus del Herpes simple, citomegalovirus y virus Zóster de la Varicela, en tal caso, el ganciclovir puede ser usado como profármaco para eliminar las células transgénicas IL-10 en el sujeto (véase por ejemplo, Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31:844-849) . La administración ocurre preferiblemente por vectores de VAAr como se describe en otra parte en este documento. Un "efecto terapéutico" en artritis reumatoide y en particular en el sinovio reumatoide, se refiere a un decremento en los síntomas típicos, tales como un decremento en la inflamación del tejido sinovial y/o decremento en el cartílago y/o destrucción ósea de la articulación. Un decremento puede también significar una disminución lenta en el progreso del desarrollo de síntomas o una completa desaparición de síntomas. Los síntomas y de este modo, también un decremento en los síntomas, pueden ser valorados usando una variedad de métodos, a una extensión mayor los mismos métodos como se usan en el diagnóstico de artritis reumatoide, incluyen examinación clínica y pruebas de laboratorio de rutina. Tales métodos incluyen métodos tanto macroscópicos como microscópicos, así como también métodos moleculares, rayos X, bioquímicos, inmunohistoquímicos y otros. Los métodos pueden involucrar análisis de la articulación completa (por ejemplo, rayos X) , o de partes de las mismas, tal como fluido sinovial extraído o biopsias de tejido sinovial. Fluido sinovial reumatoide, el cual está en contacto directo con el sinovio y el cartílago particular, tiene un valor de alto diagnóstico y es fácilmente accesible por aspiración (véase Tak P.P., Rheumatoide Arthritis 2000:55-68, supra) . La cantidad terapéuticamente efectiva necesaria para lograr un efecto terapéutico puede variar, dependiendo del sujeto a ser tratado (por ejemplo, mamífero no humano o humano), la(s) proteína(s) terapéuticas codificadas (que incluyen la resistencia y especificidad del promotor, el sitio de integración, etc.), y en la etapa de desarrollo y severidad de la artritis reumatoide de la articulación. Existe una gran variación de la inflamación sinovial entre individuos, articulaciones y aún dentro de articulaciones (Tak et al. 1997, Arthritis Rheum. 40:217-255). Del mismo modo, el periodo de tiempo terapéuticamente efectivo (el tiempo tomado hasta que un efecto terapéutico llega a ser detectable) , puede variar entre individuos y entre articulaciones y dependiendo en el transgen. También, el tratamiento puede tener que ser repetido en últimas etapas para efectividad. Una persona experta puede fácilmente determinar la cantidad terapéuticamente efectiva por ensayo de rutina y error mediante por ejemplo, esquemas de curvas de respuesta de dosis. Una administración de al menos 103 hasta 105 viriones de VAAr, preferiblemente al menos 107 ó 108 viriones, más preferiblemente 109 a 1011 viriones o más, será una dosis adecuada. Preferiblemente, el vector de VAAr es adecuadamente integrado en el genoma de la célula transducida y proporciona expresión de largo término (al menos 4-8 semanas, preferiblemente al menos 8-12 semanas, más preferiblemente al menos 6 meses o vida larga) de la proteína terapéutica. La administración local (contraria a sistémica) a la articulación artrítica se refiere en particular, a la administración local in vivo o ex vivo de los viriones de VAAr al sinovio reumatoide, y en particular a sinoviocitos. La administración in vivo como se usa en este documento, se refiere a la administración directa de los viriones de VAAr a la articulación del sujeto, por ejemplo, mediante inyección intra-articular. La administración ex vivo se refiere al aislamiento de las células reumatoides del sujeto, seguidas por la administración de los viriones de VAAr a las células cultivadas, aisladas. Las células transducidas que expresan la proteína terapéutica, son entonces administradas al sujeto, mediante por ejemplo, inyección, reimplante o reinfusión de las células nuevamente en la articulación del sujeto. La administración local puede ser repetida después un número de veces o mensualmente si es necesario. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para suministrar una molécula de ácido nucleico a las células sinoviales reumatoides ex vivo, el método comprende las etapas de (a) proporcionar un virión de VAA recombinante (VAAr) que comprende proteínas cápsidas de VAA serotipo 2 o más preferiblemente, VAA serotipo 5, en donde el virión de VAAr comprende un vector VAArX, el vector de VAArX comprende un elemento de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico; (b) administrar el virión de VAAr a células sinoviales, o cultivos celulares que comprenden células sinoviales, por medio de las cuales la transducción resulta en la expresión de la molécula de ácido nucleico en las células transducidas; (c) opcionalmente, seleccionar las células transducidas; y (d) administrar las células transducidas o células que comprenden las células transducidas a la articulación reumatoide de un sujeto. La selección o enriquecimiento de las células transducidas previo a la re-administración a la articulación a partir de la cual se originan las células, se puede hacer usando métodos conocidos. El sujeto a partir del cual se obtiene la célula o cultivos celulares en la etapa (b) , no necesita ser el mismo sujeto al cual las células transducidas son re-administradas en la etapa (d) , es decir, las células pueden ser autólogas (a partir del mismo sujeto) o no autólogas (a partir de un sujeto diferente) . Los viriones de VAAr5 de la invención pueden también ser formulados en composiciones farmacéuticas, de manera que en lugar de administrar los viriones de VAAr directamente en la articulación, la composición farmacéutica es administrada localmente in vivo, por ejemplo, por inyección o microinyección. La composición farmacéutica comprende suficientes viriones de VAAr y excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales, tales como, pero no limitados a agua, salina, glicerol o etanol. La sustancia adicional puede estar presente, tal como emulsificadores, agentes humectantes, amortiguadores y similares . En una modalidad de la invención, se proporciona un método para tratar articulaciones reumatoides usando los viriones de VAAr de la invención. El método preferiblemente comprende las etapas de (a) establecer diagnosis de artritis reumatoide de una articulación; (b) transducir células sinoviales reumatoides de la articulación usando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y viriones de VAAr, en donde los viriones de VAAr comprenden un vector de VAArX que comprende una secuencia de nucleótido que codifica al menos una proteína terapéutica (o péptido) y, (c) opcionalmente repetir la etapa (b) después de un cierto periodo de tiempo. En el método de tratamiento, la transducción de las células sinoviales, pueden ser ya sea in vivo o ex vivo. En caso de transducción ex vivo, las células traducidas y (re) administradas pueden ser ya sea antologas o no autólogas. En un tratamiento alternativo, el método comprende transducir células sinoviales reumatoides ex vivo usando un virión de VAAr como se define anteriormente, opcionalmente seleccionar las células transducidas, administrar las células transducidas a una articulación reumatoide de un sujeto, y opcionalmente repetir la administración después de un cierto periodo de tiempo. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de un virión como se define anteriormente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una articulación reumatoide. Preferiblemente, el tratamiento comprende transducir las células sinoviales reumatoides de la articulación in vivo usando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y el virión de VAAr como se define anteriormente, y opcionalmente repetir la transducción después de un cierto periodo de tiempo. De forma alternativa, el tratamiento comprende transducir células sinoviales reumatoides ex vivo usando el virión de VAAr, opcionalmente seleccionar las células transducidas, administrar las células transducidas a una articulación reumatoide de un sujeto, y opcionalmente repetir la administración después de un cierto periodo de tiempo. El "sinovio" o "tejido sinovial" o "células sinoviales" como se usa en este documento, se refiere al revestimiento celular que cubre las superficies no cartilaginosas de las articulaciones sinoviales, como se describe adicionalmente en Tak (2000, Examination of the synovio and synovial fluid: in: Firestein GS, Panyani GS, Wollheim FA editores. Rheumatoid Arthritis. New York: Oxford Univ. Press, Inc. 55-68) e incorpora en este documento por referencia. El sinovio consiste de la capa de revestimiento íntimo (o capa de revestimiento sinovial) y el sub-revestimiento sinovial (sub-sinovio) , el cual se une con la cápsula de la articulación. La capa de revestimiento íntima comprende macrófagos íntimos (o sinoviocitos similares a macrófagos o sinoviocitos de tipo A) y sinoviocitos similares a fibroblastos (o sinoviocitos de tipo B) . El término "sinovio reumatoide" o "células sinoviales reumatoides" o "tejido sinovial reumatoide", se refiere al sinovio inflamado de las articulaciones de un sujeto que sufre de artritis reumatoide. El sinovio reumatoide se caracteriza por hiperplasia de revestimiento íntimo y por acumulación de células T, células de plasma, macrófagos, células B, células eliminadoras o asesinas naturales y células dendríticas en el sub-revestimiento sinovial . Estas células acumuladas están comprendidas en la definición de células sinoviales reumatoides. En otra modalidad de la invención, se refiere a un virión de VAAr que comprende proteínas cápsidas de VAA serotipo 5 o VAA serotipo 2, con ello el virión de VAAr comprende un vector de VAArX, en donde el vector comprende un elemento de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica efectiva contra la artritis reumatoide. Más preferiblemente, el virión de VAAr es un virión de VAAr5, que comprende proteínas cápsidas de VAA5, y en donde el vector de VAArX es un vector de VAAr5 o VAAr2, de los cuales el vector de VAAr2 es más preferido. La secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica efectiva contra la artritis reumatoide es preferiblemente como se describe anteriormente y el vector puede además comprender un gen suicida como se describe anteriormente. En otra modalidad de la invención, se proporciona un virión de VAAr5 que comprende un vector de VAArX, en donde el vector de VAArX comprende un elemento regulador de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica efectiva contra la artritis reumatoide, y en donde el virión de VAAr5 tiene una eficacia de transducción para células sinoviales, la cual es superior que aquella de los viriones de VAAr2. La eficacia de transducción es preferiblemente al menos aproximadamente dos veces superior, más preferiblemente al menos aproximadamente 2.5 veces tan alta, o aún aproximadamente 3 veces tan alta. La, eficacia de transducción puede ser probada in vivo o in vitro (células sinoviales cultivadas) , . transduciendo las células y valorando la transducción usando métodos estándares. La eficacia de transducción puede ser valorada por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos. Preferiblemente un gen marcador o reportero detectable está presente en los vectores de VAAr cuando se valora la eficacia de transducción. También se contemplan kits que comprenden uno o más de los componentes requeridos para llevar a cabo los métodos de la invención, tales como por ejemplo, un kit que comprende uno o más vectores de VAArX, viriones de VAAr, protocolos, reactivos y similares. A menos que se declare de otra forma, la práctica de la presente invención empleará métodos convencionales estándares de biología molecular, virología, microbiología o bioquímica. Tales técnicas se describen en Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, en Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al . (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA y en Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edición, Academic Press (UK) , Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor) , Nucleic Acid Hybridization (Hames y Higgins, eds . ) , CRC Handbook of Parvoviruses vol I y Jl (P. Tijessen edt.), Fundamental Virology 2da. Edición, vol . I y II (Fields y Knipe eds.), todos incorporados en este documento por referencia. Los siguientes Ejemplos no limitantes describen la identificación de los métodos y vectores de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 - producción de viriones de VAA recombinantes Se producen viriones de VAArl a VAAr5 esencialmente como se describe por Grimm et al. (2002; Methods 28: 146-157) , con referencia particular al método resumido en la Tabla 2 y Figura 2 de este documento (se nota que la referencia 21 en Grimm et al., 2002, supra, ahora se ha publicado como Grimm et al., 2003, Mol. Therapy !_'• 839-850) . Se usaron para la producción de los viriones de VAAr, el así llamado método de dos plásmidos descritos en este documentos de Grimm et al . Plásmidos de expresión y auxiliadores son básicamente como se describen en estos dos documentos por Grimm et al. (2002, 2003, supra) , con ello el plásmido auxiliador contiene la estructura viral que incluye las proteínas cápsidas que determinan el serotipo del virión. Un plásmido de expresión particular usando en la presente invención es pVDll, en el cual un cásete de expresión lacZ es flanqueado por el VAA2ITR. El pVDll se construye partiendo de pTRUF-2, el cual se describe por Zolotukhin et al. (1996, J. Virol. 70: 4646-4654) y en el cual el elemento de regulación post- transcripcional del virus de la hepatitis de oodchuck (por sus siglas en inglés PRE) , se inserta para mejorar la expresión del gen reportero (Xu et al., 2003, Biochim Biophys Acta. 11; 1621: 266-71) y en el cual el gen reportero GFP fue reemplazado por el gen lacZ de E. coli como gen reportero. Como un ejemplo, la producción de los viriones de VAA5 que contienen pVDll fue como sigue: 293 células que crecieron en botellas redondas fueron transfectadas con plásmido auxiliador del VAA pDP5 y el plásmido pVDll usando el método de fosfato de calcio (véase, por ejemplo Sambrook y Russell, 2001, supra, para transfección de fosfato de calcio) . Las células se cosecharon después de 3 días. Las células se sometieron a lisis y los viriones se purificaron del lisado celular usando gradientes de iodixanol como se describe por Zolotukhin et al. (1999, Gene Ther. 6 : 973-85). El iodixanol fue subsecuentemente removido y los viriones se concentraron adicionalmente usando diafiltración. El mismo procedimiento se usó para la producción de viriones de VAA-1, -2, -3 y -4 usando los plásmidos auxiliadores que determinan el serotipo apropiado como se describe en Grimm et al. (2002, supra) .

Ejemplo 2 - suministro de gen in vivo a ratas y ratones A. Ratas Se inyectaron viriones de VAArl a VAAr5 que contienen el vector pVDll (u otros vectores de VAArl a VAAr5, no mostrados), que comprenden el gen codificado por beta-galactosidasa, en las articulaciones del tobillo derecho de ratas con adyuvante de artritis (AA) en el día 12 después de la inmunización del adyuvante. Las articulaciones se colectaron después de 2 semanas y se analizaron por expresión beta-galactosidasa por teñido in- situ directo de secciones congeladas (Fig. 2) , cuantificadas por análisis de imagen digital (Fig. 1) , y RT-RCP. Dos semanas después de la inyección de vectores de VAA-beta-Gal, se valoró el número de células que expresa beta-galactosidasa en tejido sinovial. En articulaciones artríticas inyectadas con viriones de VAAr5, un número elevado de células expresó beta-galactosidasa (111, 441 IOD/mm2) , mientras en las articulaciones artríticas inyectadas con viriones de VAAr2, únicamente se cuantificaron 38,212 IOD/mm2 células (Fig. 1) . No se observó teñido del antecedente anterior de expresión por vectores derivados de serotipos de VAA1, VAA3 y VAA4. La expresión del transgen se confirmó analizando las articulaciones por RCP semi-cuantitativa (datos no mostrados) . B . Ratones En artritis inducida por colágeno en ratones (CÍA) , viriones de VAAr que comprenden vectores de VAArl, VAAr2 y VAAr5 que contienen el gen mSEAP, fueron localmente inyectados en la articulación de la rodilla izquierda 32 días después de la inducción de artritis. Se analizó la expresión del transgen se analizó por RT-RCP en varios órganos por biodistribución, y por Elisa en suero y medios de cultivo acondicionados por los tejidos de articulación en diferentes puntos de tiempo. En ratones CÍA, los viriones de VAAr también proporcionaron una eficiencia de transducción muy alta. La expresión del transgen fue detectable en suero y rótulas, una semana después de la inyección a las articulaciones, incrementada con el tiempo y estabilizada por al menos un mes (5.31 ± 1.59 y 1.94 ± 1.97 ng/ml, respectivamente) . No se encontró expresión detectable para vectores basados en serotipos de VAA1 y VAA2.

Conclusiones Sorprendentemente, se encontró que la eficacia de transducción de diferentes vectores basados en viriones del serotipo de VAA en modelos experimentales de artritis reumatoide, varió considerablemente, variando desde ser completamente inefectivo hasta tener una eficiencia de transducción muy alta (para vectores contenidos en viriones de VAA5) . Los ejemplos claramente demuestran que la transferencia del gen in vivo con viriones de VAA5 son más remotamente eficientes que con los otros serotipos y que el virión de VAAr5 es particularmente adecuado para terapia de gen in vivo de artritis reumatoide.

Ejemplo 3 - artritis inducida por colágeno en ratones Materiales y Métodos: Vectores de VAA-2/2 y VAA-2/5 recombinante lia producción de pseudotipos de VAAr (genoma de VAA recombinante basado en ITR de tipo 2, empaquetado en cápsidos VAAl, VAA2 ó VAA5) se logró por transfecciones temporales como se describe por Alien, J.M. (Mol Ther, 2001, 1, 88), con las siguientes modificaciones. Se transfectaron células 293 de riñon embriónico humano con el plásmido pXX6 del auxiliador de adenovirus, el plásmido pGG2-CMV-muSEAP del vector pVAA2, los cuales codifican por una forma secretada de la fosfatasa alcalina de murino bajo el control transcripcional del promotor IE CMV y el plásmido de empaquetado de VAA apropiado, el cual expresa los genes rep y cap. El plásmido empaquetado es pACG2.1 para VAAr2 y pLT-RC02 para VAAr-1/2, en donde el gen rep de VAA2 es fusionado con el gen cap de VAAl (una donación de riñon de R. Mulligan) . El plásmido empaquetado es dividió en dos para la producción de VAAr-2/5 (pMTRep2 que codifica las proteínas Rep de VAA2, una donación de riñon de D. Miller y pVAA5svori que expresa las proteínas Cap y Rep de VAA5, una donación de riñon de J. Chiorino, que requiere una etapa de transfección cuádruple. Se purificaron vectores recombinantes por gradiente de ultracentrifugación CsCL2 doble, seguido por diálisis extensiva contra PBS estéril. Se cuantificaron partículas físicas por hibridación de manchado de punto contra un intervalo de plásmido estándar. Los tituladores se expresaron como genoma viral por ml (gv/ml) . Los tituladores de VAAr-2/l-mSEAP, VAAr-2/2-mSEAP y VAAr-2/5-mSEAP, fueron respectivamente 1.6 x 1012, 2.9 x 1012 y 2.7 x 1011 gv/ml. Los plásmidos de VAAr-2/2 y -2/5 que expresan el transgen ß-Gal bajo el promotor CMV, fueron flanqueados por los IRT de VAA-2 y encapsidados respectivamente en un cubierta de VAA-2 ó VAA-5. Se produjeron partículas virales por doble transfección en células 293 como se describe previamente por Grimm, D. (Hum Gene Ther, 1998, 9, 2745), purificadas respectivamente usando una columna de heparina de iodixinol o un gradiente CsCI doble, y se dializaron contra PBS por el Núcleo del Vector del Hospital Universitario de Nantes. Los tituladores fueron determinados por manchado de punto y expresados como genoma de vector por ml (gv/ml) . Fueron respectivamente, 1.8 x 1011 y 3 x 1012 gv/ml para VAAr-2/2 y -2/5.

Estudios Animales Ratones DBA/1 machos (Harían France) , se criaron en estas instalaciones y se usaron a la edad de 8-10 semanas. Se indujeron con artritis inducida por colágeno (CÍA) por inyección intradérmica en la base de la cola con 100 µl de solución de colágeno a 1 µg/µl en el día 0. Se diluyó colágeno tipo II de bovino (bCII) a 2 mg/ml (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Francia), con ácido acético 50 mM, y se emulsificó con un volumen igual del adyuvante completo Freund (Pierce, Benzons, Francia) antes del uso. Al día 21, los animales se reforzaron con una inyección intradérmica de 100 µl de solución bCII emulsificada con un volumen igual del adyuvante incompleto Freund (Pierce, Benzons, Francia) antes del uso. Después de la inducción de artritis, se midió el grosor de las patas durante un tiempo con un micrómetro Mitutoyo (Sigma) . Al día 28, los ratones fueron sincronizados con inyección intra-peritoneal de 40 µg de LPS (Sigma) . Cuando los signos clínicos de artritis aparecieron, los ratones fueron anestesiados por inyección intra-peritoneal de una solución de cetamina (30 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) . La piel arriba de la rodilla se afeitó, y se inyectaron intra-articularmente, dosis indicadas de serotipos de VAA en 5 µl de NaCl al 0.9% en la articulación de la rodilla izquierda, usando una jeringa Hamilton con una aguja de calibre 30 (NH-BIO, Massy, Francia) . Al día de sacrificio, se colectaron las articulaciones de la rodilla completa y se congelaron en nitrógeno líquido para una cuantificación in situ de teñido ß-gal en secciones congeladas. En experimentos que usan el gen reportero mSEAP, se tomaron muestras de sangre a varios tiempos antes y después de la inyección del vector, y se almacenaron a -20°C hasta el experimento. Al día del sacrificio, se colectaron las rótulas derecha e izquierda y se incubaron 24 horas en RPMI (200 µl) . Los sobrenadantes fueron almacenados a -20°C y las rótulas se almacenaron en nitrógeno líquido hasta el experimento.

Teñido in situ para expresión del transgen ß-galactosidasa. Las rótulas fueron colocadas en temperatura de corte óptima (OCT) , se mezclaron e inmediatamente se congelaron en hielo seco. Las muestras se cortaron en criostato y las secciones de tejido se fijaron en 1.25% de glutaraldehído por 10 minutos, se enjuagaron 3 veces en PBS, se colocaron durante la noche a 37°C en solución X-Gal . Las laminillas entonces se lavaron 3 veces en PBS y tiñeron por conteo con HE.

Cuantificación de muSeAP del suero Se colectaron muestras de sangre en los puntos de tiempo indicados después de la administración del vector. La detección quimioluminiscente permitió la cuantificación de la actividad enzimática. Brevemente, las muestras fueron centrifugadas por 5 minutos a 2500 g para colectar suero, se calentaron los fosfatos alcalinos endógenos inactivados por 5 minutos a 65°C y se midió el muSeAP resistente al calor por la adición del amortiguador de reacción y el sustrato quimioluminiscente CPSD de conformidad con las instrucciones del fabricante (Tropix) . La quimioluminiscencia se cuantificó en un luminómetro (Mediators Diagnostika) . Los niveles de expresión son expresados como ng de muSeAP por ml de suero de conformidad con la curva estándar de fosfatasa alcalina placental humana purificada.

Resultados Suministro intra- articular de serotipos de VAAr en articulaciones de ratones. Para comparar la eficiencia de la transducción de serotipos de VAA en las articulaciones, se suministraron partículas 5 x 108 de VAA-2/1, VAA-2/2 y VAA-2/5 que expresan ß-gal o mSEAP por inyección directa en las articulaciones de ratones DBA/l, después del comienzo de la artritis. Las rótulas se colectaron a 4 semanas por teñido X-gal e inmunohistoquímico, o por detección quimioluminiscente de mSEAP en medio de cultivo acondicionado por los tejidos de la articulación. Se detectó la expresión LacZ significante en las articulaciones de ratones inyectados con tanto VAA-2/2 como VAA-2/5-LacZ, 4 semanas después de la inyección de los vectores, con una eficiencia de transducción significante superior, observada con VAA-2/5. No debe observarse teñido en secciones congeladas de rótulas de rodillas inyectadas con VAA-l/5 o en la rodilla sin inyección contra-lateral. El patrón de expresión es similar a aquel previamente reportado, a pesar que se observó teñido medio en el tejido de revestimiento sinovial, el teñido intenso se relevó en el saco suprarotular. El teñido se cuantificó por análisis de imagen digital y mostró que la eficiencia de la transducción de VAA-2/5-LacZ es 3 veces más alta que VAA-2/2-LacZ. Cuando se usa un gen reportero secretado tal como el mSEAP, la expresión del transgen local es 2 veces más alta con VAA-2/5 que con VAA-2/1 o VAA-2/2 y se incrementada en las articulaciones artríticas, comparada con los ratones no artríticos. Así, el cápsido de VAA del serotipo 5 parece más eficiente para transducir tejidos intra-articulares que los serotipos 1 ó 2.

Respuesta de la Dosis de VAA-2/5 Después se proporcionaron dosis incrementadas de VAA-2/2 o VAA-2/5 que expresan ß-gal o mSEAP (5 x 108, 1.5 x 109 y 5 x 109 partículas), para determinar si la mejor eficiencia observada con el VAA-2/5 fue aún verdadera usando dosis superiores en articulaciones artríticas. Cuatro semanas después del suministro del gen, se colectaron las rótulas por teñido X-gal y detección inmunohistoquímica, o quimioluminiscente de mSEAP en medio de cultivo acondicionado por los tejidos de la articulación y en suero. Dosis incrementadas de VAA-2/5 resultan en niveles incrementados de expresión LacZ en la articulación de ratones . Cuando se usa mSEAP como gen reportero, la secreción del transgen local fue 2.6 veces superior con partículas inyectadas 3 veces más, mientras que no se modificó con otros cápsidos probados. No es sorprendente, que el transgen secretado deba también ser detectado en suero y se observe el mismo intervalo de incremento en niveles de expresión usando dosis incrementadas de virus. La dosis más alta del vector de VAA-2/5-mSEAP probado fue limitada por el titulador de la preparación viral y el volumen máximo que podría ser inyectado en articulaciones de ratones (5 µl) . Es probable que dosis más altas de VAA-2/5 (> 5 x 109 partículas) puedan resultar en niveles aún mayores de expresión del transgen por articulaciones artríticas.

Cinéticas de expresión para VAA- 2/5 Entonces se investigó si la eficiencia más alta de VAA-2/5 comparada con VAA-2/2 para transducción fue debida a la expresión más lenta del transgen. Así, se inyectó 1.5 x 109 partículas de VAA-2/1, VAA-2/2 y VAA-2/5 expresando un mSEAP de gen reportero secretado en las articulaciones de ratones DBA/l artríticos y las muestras de sangre se colectaron en los puntos de tiempo indicados. En animales inyectados con VAA-2/5-mSEAP, la expresión del transgen gradualmente incrementó 7 días después de la administración para alcanzar un nivel máximo a 3 semanas. Al contrario, los VAA-2/1 y VAA-2/2 fueron semanalmente detectados a la semana 3 y 4 respectivamente. En un segundo experimento, se mostró que la expresión del transgen permanece estable por al menos 19 semanas usando VAA-2/5-mSEAP, mientras el VAA-2/l-mSEAP da una expresión temporal del transgen durante 6 semanas, y el VAA-2/2-mSEAP no mostró expresión detectable del transgen sistémico.

Ejemplo 4 - artritis inducida por adyuvantes en ratas Materiales y Métodos Construcción de VAA recombinante Todos los constructos de VAAr se derivaron de VAA2 y se accionaron por el promotor de citomegalovirus (CMV) . El VAA recombinante se produjo por la co- transfección de células 293 HEK con un plásmido empaquetado (pDG para VAA2 y pDGl, pDG3, pDG4 y pDG5 para VAAl, VAA3, VAA4 y VAA5, respectivamente) y un plásmido de vector (pVDll) por el método de fosfato de calcio. Los plásmidos empaquetados contienen todos los elementos que trans- actuantes: genes Cap, genes Rep y genes auxiliadores adenovirales. El plásmido del vector contiene todos los elementos cis-actuantes: promotor ITRs, transgen y CMV. Las células fueron sembradas a una densidad de 3x1O4 células/cm2 por cuatro días antes de la transfección en botellas circulares de 850 cm2 y se hicieron crecer en 50 ml de Medio de Águila Modificado por Dulbecco (por sus siglas en inglés DMEM) con glutamax-I (Invitrogen) , Suero de Bovino Fetal al 10% (v/v) (FBS) (JRH) , 60 U/ml de Penicilina/Estreptomicina (PS) (Invitrogen) a 37°C. Antes de la transfección, el medio se reemplazó con Medio Dulbecco Modificado por Iscove (por sus siglas en inglés IMDM; Invitrogen) y a 16 horas después de la transfección, el medio se reemplazó con 50 ml de DMEM/FBS/PS fresco. A las 72 horas después de la transfección, las células se cosecharon en 10 ml de 50 mM de Tris-HCl a pH 8.5, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, Tritón X-100 al 0.1% (v/v).

Finalmente, se agregó benzonasa (Merck) al lisado a una concentración final de 75 U/ml . Los lisados celulares crudos además fueron purificados con gradientes de iodixanol. Los gradientes de la etapa de iodixanol se hicieron en tubos Beckman Quid sellados (25 x 89 mm, Beckman) . Los gradientes de la etapa de cargaron colocando una pipeta pasteur en el tubo. De la superficie al fondo: 15 ml de lisado celular crudo, 9 ml de iodixanol al 15% + 1M de NaCl en PBS-MK (PBS + 1 mM de MgCl2 + 2.5 mM KCl), 6 ml de iodixanol al 25% en PBS-MK, 5 ml de iodixanol al 40% en PBS-MK, 5 ml de iodixanol puro al 60%. Después de esto, el tubo se sello y se centrifugó por 1 hora a 69.000 rpm a 16°C. Después de la centrifugación, se extrajo la etapa de iodixanol al 40% de los gradientes. La solución de virus que contiene iodixanol al 40% se diluyó 10 veces con PBS-MK y se concentró a aproximadamente 2 ml con dispositivos centricon (YM-100, Millipore) . Se alcanzaron tituladores base que varían de entre ÍO^-IO12 copias genómicas (GC)/ml.

Transferencia de gen local Se obtuvieron ratas Lewis macho libres de patógenos (150-200 g) de Harían Sprague Dawley Inc. (Horst, Países Bajos) , y se mantuvieron en las instalaciones centrales de animales. Todas las ratas fueron inmunizadas en la base de la cola con 1 mg de ?fycoJacfceríum tuberculosis H37RA (Difco, Detroit, MI) en 0.1 ml de aceite mineral al día 0. Se observan usualmente patas hinchadas para el día 10-12 y se midieron diariamente por pletismometría de desplazamiento de agua. Se inyectaron las articulaciones del tobillo derecho al día 12 después de la inmunización en animales anestesiados con isoflurano. La piel fue preparada con etanol y se inyectaron VAArl hasta 5 que contiene el gen para LacZ (además reverenciado como VAArl hasta 5) anterolateralmente en la articulación del tobillo derecho en un volumen total de 50 µl de salina usando una aguja de calibre 31 en una jeringa de vidrio. Los animales fueron inyectados con 6.1 x 1010 GC (n=6/grupo) . El adenovirus que contiene LacZ (ajustado a 6.1 x 1010 GC/animal) sirvió como un control positivo, mientras que la salina se usó como control negativo. Se sacrificaron las ratas inyectadas con VAA y salina, dos semanas después de la inyección intra-articular por inhalación de C02, se sacrificaron las ratas inyectadas con adenovirus dos días después de la inyección. Las muestras de suero se tomaron por sangrado de la vena cava. Para investigar la expresión del transgen a diferentes puntos de tiempo, se realizó un segundo experimento usando un lote diferente de VAAr. Los animales recibieron una inyección i.a. de 1.14x1010 CG de VAAr2 o VAAr5 y se sacrificaron como se describe a la semana una, dos, tres y cuatro después de la inyección (n=3) . Las muestras de suero se obtuvieron de todos los grupos por sangrado de la cola antes de la inyección de VAA y por la punción de la vena cava durante el sacrificio.

Detección de productos de transgen Teñido in situ de Beta gal Las articulaciones se descalcificaron usando EDTA y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Secciones de diez µm se cortaron y montaron en laminillas de vidrio. La detección de ß-galactosidasa (ß-gal) se realizó por teñido X-gal. Brevemente, el tejido se fijó en glutaraldehído al 0.25%/paraformaldehído al 4% por 10 minutos a 4°C. Después de esto, las muestras se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron en solución de teñido que contiene 1 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactosida) , 2 mM de MgCl2, 5 mM de K3Fe(CN)6, 5 mM de K4Fe(CN)6, y tritón x-100 en PBS al 0.1% durante la noche a 37°C. Después de lavar con PBS, las secciones se tiñeron por conteo con rojo nuclear. Las secciones fueron analizadas por análisis de imagen digital para determinar células positivas ß-gal.

Análisis de imagen digital Cinco campos seleccionados de forma aleatoria dentro de cada sección, fueron elegidos digitalizando la cantidad de señal positiva. Estas imágenes se adquirieron en un microscopio Olympus (Olympus, Tokio, Japón), capturadas usando una cámara de video de Charged Coupled Device (Sony, Tokio, Japón) y se digitalizaron con una tarjeta digitalizadora de video en color de 16 bits multimedia PV100. En las imágenes a color resultantes, el área de teñido positivo y la densidad óptica media (MOD) , fueron medidas por un programa macro. La MOD es proporcional a la concentración celular de proteína. La densidad óptica integrada (IOD) es igual a la MOD multiplicada por el área de teñido positivo.

Detección por RCP en tiempo real de LacZ Articulaciones de rodilla (cortadas de la piel) y órganos, fueron congelados rápidamente en nitrógeno líquido, pulverizados usando 1 ml de un Reactivo TRIzol mortal y homogenizado (GibcoBRL Life Technologies) usando un homogenizador de tejido. El ARN total se aisló de la fase acuosa y se extrajo el ADN genómico (ADNg) de la fase fenol-cloroformo de conformidad con las instrucciones del fabricante. El ADNg se almacenó por análisis Q-PCR. Se disolvió el ADN en DEPC-agua y se cuantificó por espectrofotometría. Se sintetizó el ADNc usando 1 µg de ARN y 0.5 µg de Oligo (dT) (GibcoBRL), 5X Primero-Amortiguador de hebra, 0.1 M de DTT, mezcla de dNTP (10 M cada uno) y 1 µl de Superscript II RT (Invitrogen) . Para RT-RCP, 10 µl de la solución de AD?c se amplificó usando 25 µl de AccuPrime SuperMix I (Invitrogen Life technologies) , 215 mL del cebador LacZl (delantero, 5' -GCA-TCG-AGC-TGG-GTA-ATA-AGC- GTT-GGC-AAT-3' ) y 215 mM del cebador LacZ (inverso, 5'-GAC- ACC-AGA-CCA-ACT-GGT-AAT-GGT-AGC-GAC-3' ) en un volumen total de 50 µl. La amplificación entonces se realizó en un termociclador (MJ Research, Inc.) como sigue: 3 minutos a 95°C seguido por 35 ciclos de 94°C por 1 minuto, 58°C por 90 segundos y 72°C por 1 minutos, respectivamente, seguido por una fase de extensión final a 72°C por 10 minutos. Los productos de RCP se analizaron por electroforesis de gel de agarosa estándar en gel de agarosa al 0.9% que contiene bromuro de etidio para visualización asistida por UV del producto de 622 bp.

Detección de copias genómicas virales por RCP cuantitativa Para determinar el titulador viral en términos de copias genómicas (partículas virales completas) , las muestras de VAA fueron primero diluidas 10 veces en PBS. Subsecuentemente, 5 µl de estas diluciones se agregaron por duplicado a 45 µl de 0.25 mg/ml de AD?sel, PBS. Las mezclas fueron incubadas por 20 minutos a 37°C, después de lo cual se agregaron 75 µl de 2.75 mg/ml de proteinasa K, 8.6 mM de Tris-HCl a pH 8.0, 86 mM de NaCl, 8.6 mM de EDTA, SDS al 0.43% (v/v) . Después de la incubación por 60 minutos a 37 °C, se agregó, 115 µl 14 µg/ml de poliA, amortiguador de lisis ARN SV (Promega) por cavidad. Las muestras fueron incubadas con 10 µl de suspensión MagneSil BLUE (Promega) y el ADN viral se aisló usando el Dispositivo de Separación Magnética MagnaBot 96 (Promega) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las diluciones del ADN viral purificado o el ADNg aislado de las articulaciones y órganos, fueron agregadas a la mezcla de RCP (0.5 µM de cebador delantero CMV (5?ATGGGCGGTAGGCGTGTA3' ) (Invitrogen), 0.5 µM de cebador inverso (5?GGCGATCTGACGGTTCACTAA3 ' ) (Invitrogen) , y amortiguador de mezcla maestra RCP verde SYBR (Applied Biosystems) . Se usaron estándares de ADN en diluciones seriales 10 veces de copias 10E+1 a 10E+8 de pVD23. Las reacciones por RCP se realizaron usando el sistema de detección de secuencia SDS7000 Abi prism (Applied biosystems) .

Determinación de anticuerpos neutralizantes contra el VAAr en suero Se analizaron los tituladores de anticuerpos neutralizantes valorando la capacidad del anticuerpo de suero para inhibir la transducción de VAA en células COS. Varias diluciones de suero (1:200 a 1:5200) se pre- incubaron con VAAr a 37°C por 1 hora y después se agregaron a 80% de células confluentes. Después de esto, los cultivos celulares fueron incubados con VAA en la presencia de suero por 20 horas y la expresión LacZ se midió por teñido X-gal. El titulador de anticuerpo fue representado por la dilución más alta la cual no dio la inhibición de la expresión ß- gal, comparada con células incubadas con VAA solo.

Cultivos Celulares de FLS humano Se realizó la artroscopia de perforación pequeña (artroscopo de 2.7 mm, Storz, Tuttlingen, Alemania) bajo anestesia local en pacientes con AR establecida. Las biopsias obtenidas son enzimáticamente dispersadas. Brevemente, el sinovio se pico e incubó con 1 mg/ml de colagenasa tipo II (Sigma) en suero libre de DMEM (Gibco) por 3 horas a 37°C. Después de esto, las células fueron extensivamente lavadas y cultivadas en DMEM/suero de bovino fetal al 10% (FCS) en una atmósfera humidificada de C02 al 5%. Las células se dejaron adherir durante la noche y las células no adherentes fueron removidas. Se hizo crecer FLS adherente en DMEM/FCS al 10% y se dividió 1:3 a 80-90% de confluencia. El FLS humano se usó de los pasos 3 a 10.

Transducción del gen in vitro en FLS El FLS se colocó en placas en discos de 96 cavidades (Falcon) a 8 x 103/cavidad. Después de la incubación por 10 horas, se agregó 8 x 107 CG de VAAr2 y VAAr5 que contiene los genes para proteína fluorescente verde (GFP) o LacZ a cada cavidad, en medio que contiene 10%. Las células fueron cultivadas por 48 horas y la expresión del gen marcador se evaluó por teñido enzimático o microscopio fluorescente. Tres líneas celulares de FLS independiente fueron usadas para estos experimentos.

Resultados Eficiencia comparativa de cinco serotipos de VAA Para comparar la eficiencia de transducción de serotipos de VAA en las articulaciones, se inyectaron VAArl a VAAr5 en las articulaciones del tobillo derecho de ratas, al día 12 después de la inmunización del adyuvante. Las articulaciones se colectaron dos semanas después de la inyección y se tiñeron in situ por la expresión ß-gal. La expresión del transgen se cuantificó por análisis de imagen digital. Se observó la expresión ß-Gal más abundante en articulaciones artríticas inyectadas con VAAr5. Notablemente, la transducción de VAA resultó en una penetración mayor en el tejido sinovial, comparada al adenovirus, que muestra la expresión ß-gal justo en el revestimiento. No se podría observar teñido en las articulaciones de control y no inyectadas contralaterales . Usando análisis de imagen digital, se detectó el número más alto de células que expresan ß-Gal en tejido sinovial en articulaciones artríticas inyectadas con VAA5, seguido por una expresión muy inferior usando VAA2 (111441 y 38212 IOD/mm2, respectivamente) . No se observó teñido del antecedente anterior de expresión para el serotipo i, 3 y 4.

Duración de la expresión del transgen Para estudiar la expresión del transgen durante un tiempo, se inyectaron VAAr2 y VAAr5 en articulaciones artríticas de ratas y se sacrificaron una, dos, tres y cuatro semanas después de la inyección del vector. Ambos serotipos demuestran una expresión significante por hasta cuatro semanas, los cuales ya se presentan una semana después de la inyección. Sin embargo, el VAAr5 se mostró primero y en todos los puntos de tiempo una expresión ß-gal superior, como se cuantifica por el análisis de imagen digital (Fig. 4) . Las articulaciones inyectadas se congelaron rápidamente y las criosecciones se tiñeron in situ por actividad ß-gal. La cantidad de teñido azul por sección se analizó por análisis de imagen digital y se expresó como IOD/mm2 acumulado (IOD: Densidad Óptica Integrada) . Esto se confirmó por análisis Q-RCP. Se detectó una cantidad superior de copias genómicas en todos los puntos de tiempo después de la inyección de VAAr5, comparada con las articulaciones inyectadas con VAAr2.

Tabla 1 Tabla 1: Detección de copias genómicas virales en articulaciones inyectadas después de inyección i.a., de VAA2 ó AW5. El ADN genómico se aisló de articulaciones del tobillo trituradas 1, 2, 3 y 4 semanas después de la inyección de VAA. Se realizó qRCP con cebadores específicos para el promotor CMV. Los valores se expresaron como GC/µg de ADNg ± stdev. Para detectar la transcripción LacZ ' en las articulaciones, se llevó a cabo el análisis RT-RCP usando cebadores específicos. La transcripción encontrada del transgen en articulaciones inyectadas con VAAr5 en todos los puntos de tiempo, mostró diferencias mínimas en intensidad, mientras que la cantidad de ARNm de LacZ fue debajo del límite de detección del ensayo en las articulaciones inyectadas con VAAr2.

Formación de anticuerpos de VAAr Para detectar una posible respuesta inmune humoral contra las proteínas cápsidas de VAAr, después de la inyección antra-articular local, se realizó un ensayo específico como se describe en la sección de Métodos. La presencia de anticuerpos neutralizantes antes y después de la inyección de VAAr, se determinó en el suero de ratas inyectadas con VAAr2 y 5. Los resultados se muestran en la figura 5. Se inyectaron ratas artríticas con 1.14 x 1010 de VAAr2 (A) o VAAr5 (B) de GC en las articulaciones del tobillo derecho. Las muestras de suero se obtuvieron 1, 2, 3 y 4 semanas después de la inyección. Los tituladores se calcularon como la dilución más alta la cual no muestra inhibición de células positivas X-gal, comparada a cavidades incubadas con VAArLacZ solo. Antes de la inyección, no se encontraron anticuerpos en cualquiera de las muestras. Una semana después de la inyección, se detectaron anticuerpos neutralizantes, alcanzando el máximo a 2 semanas y disminuyendo lentamente después de 3 semanas. Aunque esta tendencia se observó para ambos serotipos, la inyección de VAAr2 claramente induce tituladores de anticuerpos neutralizantes superiores en el suero después de VAAr5, mostrando únicamente niveles ligeramente abajo del antecedente. De forma importante, no se encontró reactividad cruzada para los dos serotipos.

Ejemplo 5 - Transducción de FLS humano con VAAr2 y VAAr5 Habiendo mostrado que el VAAr2 y 5 son capaces de transfectar el sinovio de rata, se desea investigar el potencial de ambos serotipos para transducir el FLS humano primario obtenido de pacientes con AR. Para este propósito, se usaron vectores de VAAr ya sea que expresan LacZ o GFP. Se visualizó la expresión del transgen después de 48 horas por teñido ß-gal enzimático o microscopio fluorescente. Ambos serotipos son capaces de transducir el FLS humano con VAArS, mostrando una expresión superior en todos los experimentos . En la figura 6, se muestra un experimento representativo.

Claims (17)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
2. Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
3. REIVINDICACIONES 1. Un método para suministrar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica a una célula sinovial, caracterizado porque el método comprende las etapas de: a) proporcionar un virión de VAA recombinante (VAAr) que comprende proteínas cápsidas de VAA serotipo 5, en donde el virión de VAAr comprende un vector de VAArX, el vector de VAArX comprende un elemento de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico; y b) poner en contacto el virión de VAAr con la célula sinovial, con ello, la transducción del vector VAArX resulta en la expresión de la secuencia de ácido nucleico en las células sinoviales transducidas. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico se suministra a la célula sinovial in vivo, por administración local del virión de VAAr a una articulación reumatoide de un sujeto. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la administración del virión de VAAr es por inyección en la articulación, preferiblemente por inyección en el compartimiento sinovial .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virión de VAAr se lleva en contacto con células sinoviales o cultivos celulares que comprenden células ex vivo, y con ello, opcionalmente se seleccionan las células transducidas.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el método además comprende la etapa de administrar las células transducidas a una articulación reumatoide de un sujeto.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la administración de células transducidas es por inyección en la articulación, preferiblemente por inyección en el compartimiento sinovial .
7. 7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-3 y 5-6, caracterizado porque la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula sinovial transducida, resulta en una reducción de síntomas de artritis de la articulación.
8. 8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína terapéutica seleccionada de uno o más de los siguientes: inhibidor IL- 1, inhibidor del TNFa, antagonista del receptor de IL-1, proteína de enlace a IL-18, receptor p55 ó p75 del sTNFa, dn-IKK-ß, IL-4, IL-10, IL-13, IFN-ß y VIP.
9. 9. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el vector de VAArX es un vector de VAAr5 ó VAAr2.
10. 10. Un virión de VAAr, caracterizado porque comprende proteínas cápsidas del VAA serotipo 5 ó VAA de serotipo 2, por medio del cual, el virión de VAAr comprende un vector de VAArX, en donde el vector de VAArX comprende un elemento de expresión operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica efectiva contra la artritis reumatoide.
11. 11. El virión de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el virión de VAAr es un virión de VAAr5 y en donde el vector de VAArX es un vector de VAAr5 ó VAAr2.
12. 12. Un virión de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína terapéutica seleccionada de uno o más de los siguientes: inhibidor IL-1, inhibidor del TNFa, antagonista del receptor de IL-1, proteína de enlace a IL-18, receptor p55 ó p75 del sTNFa, dn-IKK-ß, IL-4, IL-10, IL-13, IFN-ß y VIP.
13. 13. Un método para tratar una articulación reumatoide, caracterizado porque el método comprende transducir células sinoviales reumatoides de la articulación in vivo, usando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un virión de VAAr como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, y, opcionalmente, repetir la transducción después de un cierto periodo de tiempo.
14. 14. Un método para tratar una articulación reumatoide, caracterizado porque el método comprende transducir células sinoviales reumatoides ex vivo, usando un virión de VAAr como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, y opcionalmente seleccionar las células transducidas, administrando las células transducidas a una articulación reumatoide de un sujeto, y opcionalmente repetir la administración después de un cierto periodo de tiempo.
15. 15. Uso de un virión como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una articulación reumatoide.
16. 16. Un uso de conformidad con la reivindicación 15, por medio del cual el tratamiento comprende transducir células sinoviales reumatoides de la articulación in vivo, usando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un virión de VAAr como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, y opcionalmente repetir la transducción después de un cierto periodo de tiempo.
17. 17. Uso de conformidad con la reivindicación 14, por medio del cual el tratamiento comprende transducir células sinoviales reumatoides ex vivo, usando un virión de VAAr como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, opcionalmente seleccionar las células transducidas, administrando las células transducidas a una articulación reumatoide de un sujeto, y opcionalmente repetir la administración después de un cierto periodo de tiempo.