KR20190038583A - 알데히드 데히드로게나제 결핍의 치료를 위한 유전자 요법 - Google Patents

알데히드 데히드로게나제 결핍의 치료를 위한 유전자 요법 Download PDF

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KR20190038583A
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Abstract

인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 상기 벡터를 포함하는 조성물 및 알데히드 데히드로게나제 결핍을 치료하기 위해, 또는 알데히드 데히드로게나제 결핍을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 벡터를 사용하는 방법.

Description

알데히드 데히드로게나제 결핍의 치료를 위한 유전자 요법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 특허 출원은 2016년 7월 26일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/367,012호의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 참고로 통합되어 있다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
전체로서 본 명세서에 참조로 통합되어 있는 것은 컴퓨터-판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록으로, 본 명세서와 함께 제출되어 다음과 같이 확인된다: 2016년 7월 26일에 생성된, "725826_ST25.TXT"라는 파일명의 13,873 바이트 ASCII (텍스트) 파일 1개.
알데히드 데히드로게나제 (Aldehyde dehydrogenases: ALDHs)는 내인성 및 외인성 출처의 알데히드의 대사작용에서 중요한 역할을 하는 효소의 상과 (superfamily)에 속한다. 생리학적 및 독성학적 기능을 갖는 19개의 기능적 ALDH 유전자가 인간 게놈에서 확인되었다 (Edenberg HJ, Alcohol Res Health 2007, 30(1): 5-13; Steinmetz　CG et al., Structure 1997, 15: 5(5):701-11). 아세트알데히드를 산화시키는 중요 효소인 알데히드 데히드로게나제 2 (Aldehyde dehydrogenase 2: ALDH2)는 알콜 대사작용에서 중요하다. 인간 ALDH2의 유전자 다형성 (genetic polymorphisms)은 다양한 민족 그룹에서 잘 연구되어 왔다 (Eriksson CJ, Alcohol Clin Exp Res 2001, 15S-32S; Yoshida et al., Proc . Natl . Acad. Sci 1984, 81(1): 258-261). 가장 관련이 있는 ALDH2 변이체는 ALDH2 * 2　대립유전자 (allele)이고, 이는 동아시아인의 대략 35-45%에서 발견되었다 (Yoshida et al., Proc . Natl . Acad . Sci 1984, 81(1): 258-261; Li H et al., Ann Hum Genet 2009, 73: 335-345). 전세계 인구의 대략 5억6천만명 (8%)은 ALDH2 * 2가 가장 흔한 인간 효소 결핍을 만드는 이 돌연변이를 가지고 있고, 이는 다른 잘-알려져 있는 인간 효소병증 (enzymopathies) 및 헤모글로빈 장애 (hemoglobin disorders)를 능가한다 (Brooks PJ et al.,　PLoS Med　2009, 6(3): e50; Chen CH et al., Physiol Rev　2014, 94(1):1-34). 다양한 연구로 ALDH2 기능이상을 호흡소화관 암, 심혈관 질환, 당뇨병 및 신경변성 질환을 포함하는 다수의 인간 질환과 관련시켰다 (Mandel S et al.,　Ann NY Acad Sci 　2005, 1053: 356-375; Kamino K et al., Biochem. Biophys . Res. Commun 2000, 273:192-96; Wang B et al., J. Neurol . Sci 2008, 268:172-75; Murata C et al., Alcohol. Clin . Exp Res 2000, 24:5S-11S; Xu F et al., Hypertens . Res 2010, 33:49-55; Yokoyama A et al., Cancer Epidemiol . Biomarkers Prev 1996, 5:99-102; Oze I et al., Jpn . J. Clin . Oncol 2011, 41:677-92; Takagi S et al., Hypertens . Res 2002, 25:677-81; Jo SA et al., Clin. Chim . Acta 2007, 382:43-47; Xu F et al., J. Cell. Mol . Med 2011, 15:1955-62; Takeuchi F et al., Eur . J. Hum. Genet 2012, 20:333-40; Wang Q et al., DNA Cell Biol 2013, 32:393-99; Asakage T et al.,　Carcinogenesis 2007, 28: 865-874; Ding JH, et al., World J Gastroenterol 2009,　15: 2395-2400; Cui R et al., Gastroenterology 2009, 137:1768-75; Li Y et al.,　J Clin Invest 2006,　116: 506-511; Chen Z et al., Proc Natl Acad Sci　2005, 102: 12159-12164; Mackenzie IS et al., Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol 2005, 25:1891-95; Kato N et al., Nat Genet　2011, 43: 531-538; Chen CH et al., Cardiovasc Res 2010, 88(1):51-7).
동아시아인에서 흔히 관찰되는 알콜 음료 섭취 후에 안면 홍조, 두통, 구역, 어지럼, 및 두근거림을 특징으로 하는 알콜 홍조 증후군 (alcohol flushing syndrome)은 감소된 ALDH2 활성의 결과로 나타나는 아세트알데히드 축적에 의해 유발된다 (Eriksson et al., Clin . Exp . Res., 2001 15S-32S). ALDH2*2　개체에서 이러한 에탄올-유도된 증후군 (ethanol-induced syndrome)은 ALDH2　유전자의 엑손 12에서 G-to-A 점 돌연변이 (point mutation)에 의해 유발된다. 상기 돌연변이는 인간 ALDH2 단백질 중에 위치 487에서 글루탐산의 리신으로의 치환 (E487K)을 초래한다 (Yoshida et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 1984, 81(1): 258-261). 상기 ALDH2　유전자에서 일반적인 E478K (글루탐산에서 리신으로) 유전자 다형성은 그의 아세트알데히드 대사작용 용량의 실질적인 감소를 초래할 수 있다 (Yoshida et al., Proc . Natl . Acad . Sci 1984, 81(1): 258-261; Baan R et al., Lancet Oncol.　2007, 8(4): 292-293). 이형접합 (heterozygous) 개체는 야생형의 효소 활성의 50% 미만이고, 및 ALDH2*2 동형접합 (homozygotes)은 야생형 활성의 <1-4%를 갖는다 (Farres et al., J. Biol . Chem ., 1994, 269(19): 13854-13860).
아시아인의 홍조 반응뿐만 아니라, ALDH2 효소 결핍과, 구강암, 인두암, 후두암 및 식도암을 포함하는 상부 호흡소화관 암 사이에 결정적인 연관성이 있다 (Asakage T et al.,　Carcinogenesis 2007, 28: 865-874; Ding JH, et al., World J Gastroenterol 2009,　15: 2395-2400; Hashibe M et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev　2006, 15(4): 696-703). ALDH2-결핍된 개체는 완전 활성인 ALDH2를 갖는 개체보다 알콜 섭취로부터 식도암 (구체적으로, 편평세포 암종)의 위험이 훨씬 높다 (Yokoyama A et al., Cancer Epidemiol . Biomarkers Prev 1996, 5:99-102; Oze I et al., Jpn . J. Clin . Oncol 2011, 41:677-92; Ding JH, et al., World J Gastroenterol 2009,　15: 2395-2400; Cui R et al., Gastroenterology 2009, 137:1768-75; Hashibe M et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev　2006, 15(4): 696-703). 이러한 암에 대한 위험은 음주 및 흡연의 조합으로 유의하게 높아진다 (Lee CH et al.,　Int J Cancer 2009,　125: 1134-1142; Morita M et al., Int J Clin Oncol 2010,　15: 126-134). ALDH2는 호흡소화관 악성 종양에 관여하는 가장 흔한 유전자 다형성이고 및 ALDH2*2 보유인자 (carriers)가 식도암을 가진 가장어린 환자에 있었다. 알콜과 비알콜 ALDH2*2 보유인자 음주자는 그들 각각의 야생형 ALDH2 대조군과 비교하여 식도암 위험이 7 내지 12배 증가한다 (Yokoyama A et al., Cancer Epidemiol . Biomarkers Prev 1996, 5:99-102). 담배 연기는 또한 아세트알데히드의 출처이고, 및 흡연과 과음을 병행하는 ALDH2 * 2　유전자형을 갖는 개체는 암 위험이 가장 높았다 (Lee CH et al.,　Int J Cancer 2009,　125: 1134-1142; Morita M et al., Int J Clin Oncol 2010,　15: 126-134). 같은 양의 에탄올이 제공되었을 때, 아세트알데히드 농도는 비흡연자보다 흡연자에서 2배 더 높다. 또한, 흡연과 에탄올 노출이 동시에 발생하면, 흡연자는 비흡연자와 비교하여 타액에서 아세트알데히드 농도가 7배 더 높았다 (Salaspuro V et al., Int J Cancer　2004, 111: 480-483). ALDH2 * 2　유전자형을 보유하는 피험체에서 과량의 에탄올 섭취와 흡연은 가장 잘 알려져 있는 암 위험 중 하나에 기여하였고 (50.1의 승산비 (odds ratio)) 또한 비흡연자, 비음주자 야생형 ALDH2 피험체와 비교하여 최대 25세 더 일찍 암종이 발생할 수 있다 (45세 대 70세) (Brooks PJ et al., PLoS Med　2009, 6(3): e50; Lee CH et al.,　Int J Cancer 2009,　125: 1134-1142; Morita M et al., Int J Clin Oncol 2010,　15: 126-134).
그러므로, ALDH2 활성을 증가시키고 또한 ALDH2 결핍과 관련된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개발할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 장점 및 다른 장점은 본원에 제공된 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 벡터를 포함하는 조성물 및 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍을 치료하기 위해, 또는 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 그의 임의의 증상을 치료 또는 예방하기 위해 상기 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.
도 1a는 AAVrh.10hC1EI 벡터의 개략도이고, 이는 AAV2 반전된 말단 반복부 (inverted terminal repeats: ITR), 이입 신호 (encapsidation signal) (Ψ), CMV 인핸서/닭 베타-액틴 (CAG) 프로모터, 최적화된 인간 ALDH2 (hALDH2) cDNA, 적혈구응집소 (hemagglutinin: HA) 태그, 및 토끼 β-글로불린 폴리아데닐화 신호를 나타낸다.
도 1b는 HEK 293T 세포에서 AAV-hALDH2 플라스미드에 의해 코딩된 hALDH2의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 (Western blot) 이미지이다.
도 1c는 HEK 293T-orf6 세포에서 AAVrh.10hALDH2 벡터에 의해 코딩된 hALDH2의 hALDH2 테트라머 형성을 나타내는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 2a는 C57Bl/6 마우스 (n=4/그룹)에게 AAVrh.10hALDH2 벡터의 단회 정맥내 투여 후에 hALDH2의 장기간 인 비보 (in vivo) mRNA 발현을 나타내는 그래프이다.
도 2b는 C57Bl/6 마우스 (n=4/그룹)에게 AAVrh.10hALDH2 벡터의 단회 정맥내 투여 후에 hALDH2의 장기간 인 비보 단백질 발현을 나타내는 그래프이다.
도 3은 AAVrh.10hALDH2에 의한 ALDH2*2 마우스의 치료의 효과를 나타낸다. 동형접합 ALDH2*2 마우스 (n=2, 1 M/1F / 그룹)에게 1011 gc AAVrh.10-hALDH2 또는 1011 gc AAVrh.10-GFP (요법 대조군 없음)를 정맥내로 투여하였다. 벡터 투여하고 2주 후에, 마우스를 위관 영양 (intragastric gavage)에 의해 수중 에탄올 4　g/kg으로 챌린지하고, 발란스 빔 (balance beam)에서 낙하 (falling) 전 시간의 양 (최대 60초)을 에탄올 챌린지 이전 및 이후 24시간에 측정하였다. 각 점은 개별 마우스를 나타낸다.
본 발명은 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터가 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터로 필수적으로 구성되는 경우, 상기 벡터에 실질적으로 (materially) 영향을 미치지 않는 추가 성분을 포함할 수 있다 (예컨대, 인 비트로 (in vitro)에서 벡터의 조작을 용이하게 하는 폴리(A) 서열 또는 제한효소 부위와 같은 유전자 요소). 상기 벡터가 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터로 구성되는 경우, 상기 벡터는 임의의 추가 성분을 포함하지 않는다 (즉, 상기 벡터에 내인성인 것이 아니고, 단백질을 제공하기 위해 핵산 서열의 발현을 수행하는데 필요한 것이 아닌 성분).
본 발명의 벡터는 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열과 함께 당해 분야에 알려져 있는 임의의 유전자 전달 벡터를 포함할 수 있거나, 이로 필수적으로 구성될 수 있거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 그러한 벡터의 예로는 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated viral: AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 플라스미드를 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 벡터는 AAV 벡터이다.
아데노-관련 바이러스는 파르보비리데 (Parvoviridae) 과의 구성원이며, 약 5,000개 미만의 뉴클레오티드의 선형의 단일-가닥 DNA 게놈을 포함한다. AAV는 효율적인 복제를 위해, 헬퍼 바이러스 (즉, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)와의 공동-감염 또는 헬퍼 유전자의 발현을 필요로 한다. 치료 핵산의 투여에 사용되는 AAV 벡터는 통상적으로, DNA 복제 및 패키징을 위한 인식 신호를 포함하는, 반전된 말단 반복부 (ITRs)만이 잔존하도록, 모체 게놈의 대략 96 %가 결실되어 있다. 이는 바이러스 유전자의 발현으로 인해 면역학적 또는 독성 부작용을 제거한다. 또한, 생산 세포에 특정 AAV 단백질을 전달하는 것은, 원한다면, AAV ITRs을 포함하는 AAV 벡터를 상기 세포 게놈의 특정 영역에 통합시킬 수 있게 한다 (예컨대, 미국 특허 제6,342,390호 및 제6,821,511호 참조). 통합된 AAV 게놈을 포함하는 숙주 세포는 세포 성장 또는 형태에 있어 변화를 나타내지 않는다 (예를 들어, 미국 특허 제4,797,368호 참조).
상기 AAV ITRs은 비-구조적 복제 (Rep) 단백질 및 구조적 캡시드 (Cap) 단백질 (비리온 단백질 (Virion protein: VP)로도 알려짐)에 대한 독특한 코딩 뉴클레오티드 서열 옆에 배치되어 있다. 말단 145개의 뉴클레오티드는 자기-보완적이며 T-형 헤어핀을 형성할 수도 있는 에너지적으로 안정한 분자내 이합체 (intramolecular duplex)가 형성될 수 있도록 조직되어 있다. 이러한 헤어핀 구조는 세포 DNA 폴리머라제 복합체에 의해 프라이머 역할을 수행함으로써 바이러스 DNA 복제의 기점으로 기능한다. 상기 Rep 유전자는 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 코딩한다. Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되고, Rep52 및 Rep40은 p19 프로모터로부터 전사된다. Rep78 및 Rep68 단백질은 AAV 말단의 분해를 허용하기 위한 생산적인 복제 중에 헬리카제 (helicase) 및 니카제 (nickase) 기능을 수행하는 다기능 DNA 결합 단백질이다 (예컨대, Im et al., Cell, 61: 447-57 (1990) 참조). 이들 단백질은 또한 내인성 AAV 프로모터 및 헬퍼 바이러스 내의 프로모터로부터의 전사를 조절한다 (예컨대, Pereira et al., J. Virol ., 71: 1079-1088 (1997) 참조). 다른 Rep 단백질은 Rep78 및 Rep68의 기능을 변형시킨다. 캡 유전자는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 캡 유전자는 p40 프로모터로부터 전사된다.
본 발명의 AAV 벡터는 당업계에 알려져 있는 임의의 AAV 혈청형 (serotype)을 사용하여 생성될 수 있다. 몇몇 AAV 혈청형 및 100개 이상의 AAV 변이체가 아데노바이러스 스톡 또는 인간 또는 비인간 영장류 조직으로부터 단리되었다 (예컨대, Wu et al., Molecular Therapy, 14(3): 316-327 (2006)에서 검토됨). 일반적으로, 상기 AAV 혈청형은 핵산 서열 및 아미노산 서열 수준에서 현저한 상동성을 갖는 게놈 서열을 가지므로, 상이한 혈청형도 유전적 기능의 동일한 세트를 가지며, 본질적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온을 생성하고, 또한 실제로 동일한 기전에 의해 복제되고 조립된다. AAV 혈청형 1-5 및 7-9는 모든 다른 기존의 특징화된 혈청형에 있어 특이적인 중화 혈청과 효율적으로 교차-반응하지 않는다는 점에서 "진정한 (true)" 혈청형으로 정의된다. 대조적으로, AAV 혈청형 6, 10 (Rh10 이라고도 언급됨), 및 11은 "진정한" 혈청형의 정의를 따르지 않으므로 "변이 (variant)" 혈청형으로 간주된다. AAV 혈청형 2 (AAV2)는 그의 병원성의 부재, 광범위한 감염성, 및 장기적인 이식유전자 발현을 확립할 수 있는 능력으로 인해 유전자 요법 적용에 광범위하게 사용되어 왔다 (예컨대, Carter, B.J., Hum. Gene Ther., 16: 541-550 (2005); and Wu et al., supra 참조). 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 그의 비교 (comparison)는 예를 들어, GenBank Accession numbers U89790, J01901, AF043303, and AF085716; Chiorini et al., J. Virol ., 71: 6823-33 (1997); Srivastava et al., J. Virol ., 45: 555-64 (1983); Chiorini et al., J. Virol ., 73: 1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Virol ., 72: 309-319 (1998); and Wu et al., J. Virol., 74: 8635-47 (2000))에 개시되어 있다.
AAV rep 및 ITR 서열은 대부분의 AAV 혈청형에 걸쳐 특히 보존되어 있다. 예를 들어, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4 및 AAV6의 Rep78 단백질은 보고된 바에 따르면 약 89-93% 동일하다 (Bantel-Schaal et al., J. Virol ., 73(2): 939-947 (1999) 참조). AAV 혈청형 2, 3A, 3B, 및 6은 게놈 수준에서 약 82%의 총 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유하는 것으로 보고되었다 (Bantel-Schaal et al., supra). 게다가, 많은 AAV 혈청형의 rep 서열 및 ITRs은 포유동물 세포에서 AAV 입자의 생산 동안 다른 혈청형으로부터의 상응하는 서열을 효율적으로 교차-보완 (즉, 기능적 치환)하는 것으로 알려져 있다.
일반적으로, AAV 입자의 세포 향성 (cellular tropism)을 결정하는 캡 단백질, 및 관련 캡 단백질-코딩 서열은 상이한 AAV 혈청형에 걸쳐 Rep 유전자보다 유의하게 덜 보존되어 있다. 다른 혈청형의 상응하는 서열을 상호-보완하는 Rep 및 ITR 서열의 능력의 관점에서 볼 때, 상기 AAV 벡터는 혈청형의 혼합물을 포함할 수 있고, 따라서 "키메라 (chimeric)" 또는 "위형화된 (pseudotyped)" AAV 벡터가 될 수 있다. 키메라 AAV 벡터는 통상적으로 둘 이상의 (예컨대, 2, 3, 4 등) 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 대조적으로, 위형화된 AAV 벡터는 다른 AAV 혈청형의 캡시드에 패키징된 하나의 AAV 혈청형의 하나 이상의 ITR을 포함한다. 키메라 및 위형화된 AAV 벡터는 추가적으로 예를 들어, 미국 특허 제6,723,551호; Flotte, Mol . Ther ., 13(1): 1-2 (2006); Gao et al., J. Virol ., 78: 6381-6388 (2004); Gao et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 99: 11854-11859 (2002); De et al., Mol . Ther ., 13: 67-76 (2006); and Gao et al., Mol . Ther ., 13: 77-87 (2006)에 개시되어 있다.
일 구체예에서, 상기 AAV 벡터는 인간을 감염시키는 AAV (예컨대, AAV2)를 사용하여 생성된다. 바람직한 일 구체예에서, 인간을 감염시키는 AAV 벡터는 AAV8 또는 AAV9이다. 대안으로서, 상기 AAV 벡터는, 가령, 예를 들어, 유인원 (great apes) (예컨대, 침팬지), 구세계 원숭이 (Old World monkeys) (예컨대, 원숭이 (macaques)), 및 신세계 원숭이 (New World monkeys) (예컨대, 마모셋 (marmoset))와 같은 비인간 영장류를 감염시키는 AAV를 사용하여 생성된다. 바람직하게는, 상기 AAV 벡터는 인간을 감염시키는 AAV로 위형화된 비-인간 영장류를 감염시키는 AAV를 사용하여 생성된다. 그러한 위형화된 AAV 벡터의 예로는, 예컨대, Cearley et al., Molecular Therapy, 13: 528-537 (2006)에 개시되어 있다. 일 구체예에서, AAV 벡터는 AAV2 반전된 말단 반복부 (ITRs)로 위형화된 붉은털 원숭이 (rhesus macaque)로부터 단리된 AAV로부터의 캡시드 단백질을 포함하는 것을 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV2 ITRs로 위형화된 붉은털 원숭이를 감염시키는 AAV10 ("AAVrh.10"으로도 언급됨)으로부터의 캡시드 단백질을 포함할 수 있다 (예컨대, Watanabe et al., Gene Ther ., 17(8): 1042-1051 (2010); and Mao et al., Hum. Gene Therapy, 22: 1525-1535 (2011) 참조). 다른 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 비-자연 발생하는 AAV 벡터이다.
본 발명의 벡터는 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. DNA 영역은 기능적으로 서로 관련되어 있을 때 "작동 가능하게 연결되어 (operably linked)" 있다. 프로모터는 상기 서열의 전사를 조절하는 경우라면 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결되어 (operably linked)" 있다.
"프로모터 (promoter)"는 특정 유전자의 전사를 개시하는 DNA 영역이다. 다양한 상이한 출처로부터의 다수의 프로모터가 당분야에 잘 알려져 있다. 프로모터의 대표적인 출처는 예를 들어, 바이러스, 포유동물, 곤충, 식물, 효모 및 박테리아를 포함하며, 이들 출처로부터의 적절한 프로모터는, 예를 들어, ATCC와 같은 기탁기관은 물론 기타 상업적 또는 개별적 출처로부터, 공개적으로 입수할 수 있는 서열을 기반으로 하여 용이하게 입수 가능하거나 또는 합성으로 만들어질 수 있다. 프로모터는 단방향 (즉, 한 방향으로 전사 개시) 또는 양방향 (즉, 3' 또는 5' 방향으로 전사 개시)일 수 있다. 선택적으로, 상기 프로모터는 또한 인핸서 요소 (예컨대, 인핸서를 포함하는 키메라 프로모터)를 포함할 수 있다.
상기 벡터는 또한 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "인핸서 요소 (enhancer element)" (간단히 "인핸서"라고도 함)는 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다. 인핸서는 핵산 서열의 코딩 영역으로부터 수 킬로베이스 떨어져 위치할 수 있으며, 또한 조절 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴 또는 DNA 구조의 변화를 중재할 수 있다. 다양한 상이한 출처로부터의 다수의 인핸서가 당 분야에 잘 알려져 있고, 복제된 폴리뉴클레오티드 그대로 (as) 또는 그 내에 포함되게 (within) 얻을 수 있다 (예컨대, ATCC와 같은 기탁기관 및 기타 상업적 또는 개별적 출처). 상기 벡터는 프로모터로부터 분리되거나 또는 상기 프로모터의 일부로서 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 인핸서 요소와 조합된 프로모터는 당 분야에서 "키메라 프로모터"로 알려져 있다. 인핸서는 코딩 서열의 상류, 내부 또는 하류에 위치할 수 있다 (예컨대, Niwa et al., Gene, 108: 193-199 (1991); Daly et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 96: 2296-2300 (1999); and Sondhi et al., Mol . Ther ., 15: 481-491 (2007) 참조).
본 발명의 벡터의 프로모터는 키메라 프로모터를 포함하는, 당 분야에 알려져 있는 임의의 프로모터를 포함할 수 있거나, 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 이러한 프로모터 부류의 예로는 구성적으로 활성인 (constitutively active) 프로모터 (예컨대, 인간 베타-액틴, 닭 베타-액틴, 거대세포바이러스 (cytomegalovirus, CMV), 및 SV40), 세포 타입 특이적 프로모터 (예컨대, CD19 유전자 프로모터, CaMKIIa 및 UAS), 또는 유도성 프로모터 (예컨대, 테트 (Tet) 시스템 (미국 특허 제5,464,758호 및 제5,814,618호), 엑디손 (Ecdysone) 유도성 시스템 (No et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 93: 3346-3351 (1996)), T-REX ™ 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, CA), Cre-ERT 타목시펜 (Cre-ERT tamoxifen) 유도성 레콤비나제 시스템 (Indra et al., Nuc . Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc . Acid. Res., 28: e99 (2000); 미국 특허 제7,112,715호; and Kramer & Fussenegger, Methods Mol . Biol ., 308: 123-144 (2005)), 및 LACSWITCH™ 시스템 (Stratagene, San Diego, CA)를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 세포-타입 특이적 프로모터이다. 프로모터의 한 예로는 닭 β-액틴 프로모터이다. 상기 "닭-β-액틴 프로모터" ("CAG 프로모터"라고도 함)는 CMV 즉시/초기 (immediate/early) 인핸서, 닭 베타-액틴-프로모터 및 제1 엑손 스플라이스 공여체, 및 토끼 베타 글로빈 스플라이스 수용체를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열은 닭 β-액틴 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
"핵산 서열 (nucleic acid sequence)"은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고 비-천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체, 즉, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 (RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 중 임의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 분자의 1차 구조를 지칭하며, 따라서 이중- 및 단일-가닥 DNA, 및 이중- 및 단일-가닥 RNA를 포함한다. 상기 용어는, 등가물로서, 뉴클레오티드 유사체 (analogs) 및 이에 한정되는 것은 아니지만 메틸화 및/또는 캡핑된 (capped) 폴리뉴클레오티드를 통한 변형된 폴리뉴클레오티드로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함한다.
상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열은 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 바람직하게 인간 알데히드 데히드로게나제 2 (ALDH2)를 코딩하고, 이는 최적화된 코돈일 수 있다. 코돈 최적화 기술은 당 분야에 알려져 있다. 상기 핵산 서열은 또한 ALDH2와 같은 활성인 단백질과 상기 활성인 단백질의 특성 (예컨대, 효능, 가용성, 또는 반감기)를 향상시키는 단백질인 제2 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 상기 제2 모이어티의 예는 당분야에 알려져 있고, 예를 들어 면역글로불린의 Fc 도메인 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
알데히드 데히드로게나제는 내인성 및 외인성 출처 모두의 알데히드의 대사작용에서 역할을 하는 효소의 패밀리이다. 알데히드 데히드로게나제 2 (ALDH2)는 아세트알데히드를 산화시키고 알콜 대사작용에 관여한다. 인간 ALDH2 유전자는 크로모좀 12q24에 위치하고 13개의 코딩 엑손을 포함하는 길이 44 킬로베이스 쌍이다. ALDH2는 517개의 아미노산 전구체 단백질로 합성되고 상기에서 n-말단에서 17개의 아미노산은 미토콘드리아에 대해 전구체 단백질을 표적으로 하는 미토콘드리아 국소화 서열 (mitochondrial localization sequence)로 기능한다. 상기 17개 아미노산의 미토콘드리아 국소화 서열은 미토콘드리아에서 절단되어 500개 아미노산의 성숙한 ALDH2 단백질 모노머가 남고 이는 다른 모노머와 조합하여 미토콘드리아에서 동일한 56 kDa 서브유닛의 테트라머를 형성한다. ALDH2 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 예로는, 예를 들어, 서열번호: 1 (성숙한 500 aa 단백질); 서열번호: 2 (성숙한 500 aa 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열); 서열번호: 3) (신호 서열을 포함하는 미성숙한 (immature) 517 aa 단백질; 또한 GenBank NP_000681.2 및 AAA51693.1) 및 서열번호: 4 (신호 서열을 포함하는 미성숙한 517 aa 단백질을 코딩하는 핵산; 또한 GenBank NM_000690.3 및 AH002599.2)를 포함하고, 상기 핵산 서열은 더 최적화된 코돈일 수 있다.
인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열 및 이를 포함하는 벡터는 당 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열, 폴리펩티드, 및 단백질은 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여 재조합으로 생산될 수 있다 (예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994 참조). 또한, 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는, 합성으로 생산된 핵산 서열은 박테리아, 곤충 또는 포유동물, 예를 들어, 쥐, 인간 등의 출처로부터 단리 및/또는 정제될 수 있다. 단리 및 정제 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 대안으로서, 본원에 개시된 핵산 서열은 상업적으로 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 핵산 서열은 합성, 재조합, 단리 및/또는 정제된 것일 수 있다. 상기 서열은 mRNA 안정성의 증가 및 돌연변이체 mRNA에 의한 트란스-저해의 가능성을 감소시키기 위해 추가로 최적화될 수 있다.
인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터뿐만 아니라, 상기 벡터는 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결인자, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 5' 및 3' 비번역된 영역, 인트론 등과 같은 부가적인 발현 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 숙주 세포에서 핵산 서열의 발현을 제공한다. 예시적인 발현 조절 서열이 당 분야에 알려져 있고, 예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990)에 개시되어 있다.
상기 벡터는 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 존재할 때, 이는 상기 코딩된 신호 펩티드와 알데히드 데히드로게나제가 서로 연결되도록 상기 프로모터 서열의 하류에 위치할 것이다. 상기 벡터는 미토콘드리아 막을 통해 운반하는데 적합한 임의의 신호 펩티드를 코딩할 수 있고 (미토콘드리아 국소화 서열), 여기서 상기 신호 펩티드는 절단되어 성숙한 단백질을 제공한다. 상기 신호 펩티드는 포지티브 대전되어 있어야 하고 또한 나선 (helix)을 형성한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 신호 펩티드는 미토콘드리아 국소화 서열이다. 상기 미토콘드리아 국소화 서열은 예를 들어 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 전술한 벡터 및 약학적으로 허용가능한 (예컨대, 생리학적으로 허용가능한) 담체를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 조성물을 제공한다. 상기 조성물이 본 발명의 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체로 필수적으로 구성되는 경우, 상기 조성물에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 성분 (예를 들어, 아쥬반트, 완충제, 안정제, 항염증제, 가용화제, 보존제 등)을 포함할 수 있다. 상기 조성물이 본 발명의 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체로 구성되는 경우, 상기 조성물은 명시된 성분을 제외한 임의의 추가 성분을 포함하지 않는다. 임의의 적합한 담체가 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있으며, 그러한 담체는 당 분야에 잘 알려져 있다. 담체의 선택은 조성물이 투여될 수 있는 특정 부위 및 상기 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해, 부분적으로, 결정될 것이다. 상기 조성물은 본원에 개시된 벡터를 제외하고 선택적으로 무균상태일 수 있다. 상기 조성물은 저장을 위해 동결 또는 동결건조될 수 있고, 사용하기 전에 적합한 무균 담체에서 재구성될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)에 개시된 종래의 방법에 따라 생성될 수 있다.
상기 조성물에 적합한 제형은 산화방지제, 완충액 및 박테리아 증식 억제제 (bacteriostats)를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 용액, 등장성 멸균 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 상기 제형은 앰풀 및 바이알과 같은, 단위-투여형 또는 다중-투여형 밀봉 용기로 제공될 수 있으며, 또한 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어, 물의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조 (동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 용액 및 현탁액은 전술한 종류의 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 담체는 완충된 식염수 용액 (saline solution)이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 투여 전에 본 발명의 벡터를 손상으로부터 보호하고 전달 효율을 증강시키기 위해 제형화된 조성물로 투여된다. 예를 들어, 상기 조성물은 유리 제품, 주사기, 또는 바늘과 같은 장치로, 벡터를 제조, 저장 또는 투여하는데 사용되는 장치에서 벡터의 손실을 감소시키도록 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 상기 벡터의 광 민감성 및/또는 온도 민감성을 감소시키도록 제형화될 수 있다. 이를 위해, 상기 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 액체 담체, 예를 들어, 전술한 것들 및 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로스 (trehalose) 및 그의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 안정화 제제를 포함한다. 이러한 조성물의 사용은 벡터의 저장 수명을 연장시키고, 투여를 용이하게 하며, 본 발명의 방법의 효율을 증가시킬 것이다. 벡터-함유 조성물에 대한 제형은 예를 들어, Wright et al., Curr . Opin . Drug Discov . Devel., 6(2): 174-178 (2003) and Wright et al., Molecular Therapy, 12: 171-178 (2005))에 더 개시되어 있다.
또한, 당업자라면 본 발명의 벡터가 다른 치료제 또는 생물학적-활성 제제와 함께 조성물 내에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 이부프로펜이나 스테로이드와 같은 염증을 조절하는 인자는, 벡터의 인 비보 투여와 관련된 부종 및 염증을 줄이기 위해 조성물의 일부가 될 수 있다. 항생제, 즉, 살미생물제 및 살진균제는 존재하는 감염을 치료하고 및/또는 유전자 전달 절차와 관련된 감염과 같은 장래의 감염 위험을 감소시키기 위해 존재할 수 있다.
본 발명은 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍, 구체적으로 ALDH2 결핍을 치료하거나, 또는 알데히드 데히드로게나제 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 그의 임의의 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 개시된 벡터를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 핵산이 발현되어 알데히드 데히드로게나제 단백질을 생산하고, 이로써 상기 알데히드 데히드로게나제 결핍을 치료하고 및/또는 상기 질환 또는 그와 관련된 증상을 치료 또는 예방한다.
상기 포유동물은 알데히드 데히드로게나제가 결핍된 임의의 포유동물, 예컨대 야생형 단백질과 비교하여 단백질의 부재, 비-기능적 단백질, 또는 기능이 감소된 단백질을 초래하는 알데히드 데히드로게나제 단백질을 코딩하는 유전자에서 돌연변이를 갖는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간, 구체적으로 인간 ALDH2가 결핍된 인간일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 인간은 ALDH2*2 대립유전자에 대해 이형접합 또는 동형접합이다 (즉, 인간 ALDH2 단백질 중에 위치 487에서 글루탐산의 리신으로의 치환 (E487K), 또는 미성숙한 서열 중에 위치 504에서 글루탐산의 리신으로의 치환 (E504K) (Yoshida et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 1984, 81(1): 258-261)).
일부 구체예에서, 상기 방법은 알데히드 데히드로게나제 단백질을 코딩하는 유전자에서 기능 손실 돌연변이를 확인하여 치료를 위해 환자를 선택하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 방법은, 예를 들면, ALDH2를 코딩하는 아미노산 또는 핵산 서열을 분석하고 및 성숙한 500개 아미노산의 인간 ALDH2 단백질 중 잔기 487 (또는 517개 아미노산의 전구체 ALDH2 단백질 중에 해당하는 아미노산 504)이 글루타민 또는 일부 다른 아미노산 (예컨대, 리신) 인지를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 성숙한 ALDH2 단백질의 잔기 487 (또는 전구체 ALDH2 단백질의 잔기 504)에서 아미노산이 글루타민이 아닌 경우 (즉, 임의의 다른 아미노산, 구체적으로 리신으로 돌연변이되었을 때) ALDH2 결핍을 갖는 피험체 (및 치료를 위한 적합한 후보체)가 선택된다.
상기 포유동물은 알데히드 데히드로게나제 결핍, 구체적으로 ALDH2 결핍을 특징으로 하는 증상 또는 질환을 앓을 수 있거나, 또는 예를 들어, 알데히드 데히드로게나제 결핍을 갖는 결과로 이러한 증상 또는 질환으로 발전할 위험이 높을 수 있다. 알데히드 데히드로게나제 결핍과 관련된 질환의 예로는 에탄올 독성, 상부 호흡/소화관 암 (예컨대, 구강암, 인두암, 후두암 및 식도암), 골다공증, 방사선 피부염, 편평 세포 암종, 판코니 빈혈 (fanconi anemia), 당뇨 합병증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 고혈압, 심장부정맥, 심근경색증 (myocardial infarction), 및 니트로글리세린 불내증 (nitroglycerin intolerance)을 포함한다. 알데히드 데히드로게나제 결핍, 구체적으로 ALDH2 결핍의 증상은, 상기 질환과 통상적으로 관련된 임의의 증상을 포함할 수 있다. 예를 들면, ALDH2 결핍의 증상은 알콜 섭취 후에 간 및/또는 혈중 아세트알데히드의 축적뿐만 아니라 안면 홍조, 두통, 구역, 어지럼, 및/또는 두근거림이 있다.
알데히드 데히드로게나제의 결핍을 치료하는 것은 알데히드 데히드로게나제 활성 또는 단백질 수준을 임의의 양만큼 증가시키는 것을 포함한다. 알데히드 데히드로게나제의 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 그의 증상을 치료하는 것은 상기 질환에 의해 초래되는 임의의 생리학적 반응 또는 증상의 진행을 임의의 정도로 완화 또는 감속시키는 것을 포함한다. 알데히드 데히드로게나제의 결핍에 의한 질환 또는 그의 증상을 예방하는 것은 상기 질환에 의해 초래된 임의의 생리학적 반응 또는 증상의 발생을 임의의 양만큼 지연시키는 것을 포함한다.
임의의 투여 경로를 사용하여 상기 조성물을 포유동물에게 전달할 수 있다. 실제로, 하나 초과의 경로가 상기 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로는 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 근육내 주사를 통해 투여된다. 조성물의 투여는 체강 내에 적용 또는 주입되거나, 피부를 통해 흡수되거나 (예를 들어, 경피 패치를 통해), 흡입되거나, 섭취되거나, 국소적으로 조직에 적용되거나, 또는 예를 들어, 정맥내, 복강내, 구강내, 피내, 피하, 또는 동맥내 투여를 통해 비경구로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 스폰지, 생체적합성 메쉬워크 (biocompatible meshwork), 기계적 저장소 (mechanical reservoir) 또는 기계적 이식체 (mechanical implant)와 같이 조절되거나 또는 지속된 방출을 허용하는 장치내 또는 장치상에서 투여될 수 있다. 이식체 (예컨대, 미국 특허 제5,443,505호 참조), 장치 (예컨대, 미국 특허 제4,863,457호 참조), 예를 들어, 기계적 저장소 또는 이식체 또는 중합체 조성물로 이루어진 장치와 같은 이식가능한 장치는 상기 AAV 벡터의 투여에 특히 유용하다. 상기 조성물은 지속-방출 제제 (예를 들어, 미국 특허 제5,378,475호 참조)의 형태로 또한 투여될 수 있는데, 예를 들면, 겔폼 (gel foam), 히알루론산, 젤라틴, 콘드로이틴 술페이트, 폴리포스포에스테르, 예를 들어, 비스-2-히드록시에틸-테레프탈레이트 (bis-2-hydroxyethyl-terephthalate: BHET) 및/또는 폴리락틱-글리콜릭 산을 포함한다.
포유동물에게 투여되는 조성물 중의 벡터의 투여량은 포유동물의 크기 (질량), 임의의 부작용의 정도, 특정 투여 경로 등을 포함하는 다수의 요인에 좌우될 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 본원에 개시된 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물의 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"을 투여하는 것을 포함한다. "치료적으로 유효한 양"은 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 필요한 시간의 기간동안 효과적인 양을 지칭한다. 상기 치료적으로 유효한 양은 개체의 알레르겐 감수성 정도, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 벡터의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. "예방적으로 유효한 양 (prophylactically effective amount)"은 원하는 예방적 결과 (예컨대, ALDH2 결핍으로 유도된 에탄올 독성 또는 상부 호흡/소화관 암의 예방)를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 필요한 시간의 기간동안 효과적인 양을 지칭한다.
알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 벡터는 세포를 조성물에 충분히 노출시키기 위해, 치료 또는 예방적 치료 기간 동안 여러 번 투여하고 및/또는 다수의 투여 경로, 예컨대 근육내 및 피하를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 치료 또는 예방적 치료 기간 동안 포유동물에게 2회 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 또는 그 이상) 투여될 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 양상에 따르면, 본원에 개시된 벡터 (또는 상기 벡터를 포함하는 조성물)의 단회 투여로 포유동물에서 치료적 또는 예방적 수준으로 알데히드 데히드로게나제의 연장된 발현을 제공하는데 충분하다. 바람직하게, 상기 치료적 수준이, 상기 벡터 또는 이를 포함하는 조성물의 투여 후에, 약 30일 또는 초과 (예컨대, 약 45일 또는 초과, 약 60일 또는 초과, 약 75일 또는 초과, 약 90일 또는 초과, 약 4개월 또는 초과, 약 6개월 또는 초과, 약 10개월 또는 초과, 또는 심지어 약 12개월 또는 초과) 동안 상기 포유동물에서 발현된다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 벡터를 포유동물에 약 30일 이내에서 1회 이하, 약 45일 이내에서 1회 이하, 약 60일 이내에서 1회 이하, 약 75일 이내에서 1회 이하, 또는 심지어 약 90일 이내에서 1회 이하 (예컨대, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 10개월, 또는 약 12개월 이내에서 1회 이하)로 투여하는 것을 포함한다.
특정 치료적 또는 예방적 효과를 달성하기 위해 필요한 조성물 중에 벡터의 투여량은 통상적으로 세포 당 벡터 게놈 카피 (gc/세포) 또는 체중 kg 당 벡터 게놈 카피 (gc/kg)의 단위로 투여된다. 당업자는 당 분야에 잘 알려져 있는 이들 및 다른 요인에 기반하여 특정 면역 반응을 갖는 환자를 치료하기 위한 적절한 벡터 투여량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 AAV 벡터를 생산하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서 상기 방법은, 세포로의 벡터 복제를 위해 필요한 AAV 혈청형으로부터 유래된 AAV Rep 단백질, 상기 생산된 AAV 벡터의 혈청형을 정의하는 AAV 바이러스 구조적 단백질 VP1, 2, 및 3, 및 E2, E4, 및 VA RNA의 아데노바이러스 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드와 함께 AAV-ALDH2 벡터를 공동-감염시키는 것을 포함한다. 상기 AAV Rep 단백질 및 상기 AAV 구조적 단백질의 아미노산 서열은 당 분야에 알려져 있는 임의의 AAV로부터 유래될 수 있다. 바람직한 일 구체예에서 상기 AAV Rep 단백질은 AAV2로부터 유래되고 및 상기 AAV 구조적 단백질은 AAVrh.10으로부터 유래된다. 벡터 및 플라스미드로 형질감염되는 세포는 당 분야에 알려져 있는 임의의 세포일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서 상기 세포는 부착 세포 (adherent cell)이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 상기 세포는 인간 배아 신장 (human embryonic kidney: HEK) 293 세포이다. 대안의 일 구체예에서 본 발명의 AAV 벡터는 바큘로바이러스 시스템 (baculovirus system)에서 생산된다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하지만, 물론, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
본 실시예는 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터의 개발을 입증한다.
발현 카세트는 인간 ALDH2 cDNA 서열에 작동 가능하게 연결된 AAV2 반전된 말단 반복부 (ITR), 이입 신호(ψ), 거대세포바이러스 (CMV) 인핸서 닭-β-액틴 프로모터 (CAG 프로모터) 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호로 구성된다 (도 1a). 상기 ALDH2 cDNA 서열은 마우스 ALDH2 단백질로부터 ALDH2 cDNA를 구별하기 위해 c-말단 적혈구응집소 (HA) 태그를 갖는 것으로 구성된다. 상기 ALDH2 cDNA는 증가된 mRNA 안정성 및 돌연변이체 mRNA에 의한 트란스-저해 가능성을 감소시키기 위해 최적화되었다. ALDH2 cDNA는 인간-편향 코돈을 사용하고 또한 mRNA 불안정 요소; 낮은 (<30 %) 또는 농후 (> 80 %) GC 영역; 코딩 영역 내의 번역 개시 서열; 및 잠재적 스플라이싱 신호를 제거하여 서열-최적화되었다. 최적화된 ALDH2 cDNA는 최적의 코자크 컨센서스 (Kozak consensus)로 합성되었다.
최적화된 전장 (full-length) ALDH2 cDNA 서열이 합성되었고 CAG 프로모터의 제어 하에 pAAV 플라스미드에 클로닝되었다. AAV-hALDH2 플라스미드는 인간 배아 신장 293T 세포 (HEK 293T; American Type Culture Collection)에 상기 pAAV 플라스미드와 벡터 복제에 필요한 AAV2로부터 유래된 AAV Rep 단백질, 상기 생산된 AAV 벡터의 혈청형을 정의하는 AAVrh.10 바이러스 구조적 (Cap) 단백질 VP1, 2 및 3; 및 E2, E4 및 VA RNA의 아데노바이러스 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드와 함께 공동-형질감염시킴으로써 생산되었다. 상기 AAV-hALDH2-HA 벡터 ("AAVrh.10hALDH2"로 지칭됨)는 요오딕산올 구배 (iodixanol gradient) 및 QHP 음이온 교환 크로마토그래피로 정제되었다. 벡터 게놈 역가는 정량적 TaqMan 실-시간 PCR 분석에 의해 결정되었다. 무관한 단백질을 코딩하는 벡터를 특정 발현 연구를 위한 대조군으로 사용하였다.
인간 ALDH2 단백질의 AAVr.10hALDH2 지시된 발현을 인 비트로에서 평가하기 위해, HEK 293T 세포를 AAV-hALDH2 플라스미드로 형질 감염시키거나 또는 모의로 형질 감염시켰고, 72시간 후에 상등액을 수거하였다. 상등액 중에 인간 ALDH2 발현은 SDS-PAGE 및 항-HA 항체에 의한 웨스턴 분석에 의해 평가되었다. 도 1b에 개시된 바와 같이, 인간 ALDH2는 세포 배양 상등액에서 검출되었다. 본 실시예의 결과는 AAV 벡터로부터 ALDH2의 발현을 나타낸다.
인간 ALDH2 단백질의 AAVrh.10hALDH2 지시된 발현으로부터 ALDH2 테트라머 형성을 인 비트로에서 평가하기 위해, HEK 293T 세포를 AAVrh.10hALDH2 벡터 또는 대조군 AAVrh.10-hα1AT 벡터로 감염시켰고, 72시간 후에 상등액을 수거하였다. 상등액 중에 인간 ALDH2 테트라머 형성은 SDS-PAGE 및 항-HA 항체에 의한 웨스턴 분석에 의해 평가되었다. 도 1c에 개시된 바와 같이, 인간 ALDH2의 테트라머가 세포 배양 상등액에서 검출되었다. 본 실시예의 결과는 AAV 벡터로부터 ALDH2의 발현으로 ALDH2 테트라머의 형성을 유도하는 것을 나타낸다.
실시예 2
본 실시예는 인간 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터의 장기간 인 비보 발현을 입증한다.
AAVrh.10hALDH2 벡터에 의한 단회 치료 후에 인간 ALDH2의 장기간 인 비보 혈청 발현을 평가하기 위해, C57Bl/6 수컷 및 암컷 마우스에게 AAVrh.10hALDH2 벡터, AAVrh.10-hα1AT 벡터 (대조군 벡터), 또는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) (n=4/그룹)를 약 100 μl 부피 중에 1011 게놈 카피 (gc)로 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 벡터를 투여하고 2주 후에, 총 RNA 및 단백질을 간 균질물로부터 단리하였고 및 hALDH2 mRNA 발현은 qPCR에 의해 분석되었고 및 단백질 발현은 항-HA 항체를 사용하는 웨스턴에 의해 분석되었다.
도 2a 및 2b에 개시된 바와 같이, 높은 수준의 hALDH2 mRNA (총 RNA의 μg 당 6.58 ± 2.2 x 104 (수컷) 및 1.25 ± 5.4 x 104 (암컷) mRNA 카피) 및 높은 수준의 hALDH2 단백질이 AAVrh.10hALDH2가 투여된 동물에서 검출되었다.
상기 데이터는 ALDH2의 AAV-벡터 매개된 발현은 단회 투여로부터 장기간 ALDH2 발현을 제공하는 것을 입증하였다.
실시예 3
본 실시예는 ALDH2 결핍의 마우스 모델에서 AAVrh.10hALDH2를 투여하여 에탄올-관련된 독성으로부터의 보호를 입증하였다.
AAVrh.10hALDH2 벡터로부터 발현된 ALDH2의 인 비보 활성을 평가하기 위해서, 인간 ALDH2*2 대립유전자에 대해 동등한 E487K 돌연변이를 갖는 ALDH2*2 마우스 (Zambelli et al., Sci Trans Med ., 6:251ra118 (2014); Jin et al., PNAS , 112: 9088-9093 (2015))에게 1011 게놈 카피 (gc)로 AAVrh.10hALDH2의 단회 정맥내 주사 또는 1011 게놈 카피로 AAVrh.10-GFP (대조군)의 단회 정맥내 주사로 투여하였다 (n=2, 1수컷/1암컷/그룹).
벡터를 투여하고 2주 후에, 마우스를 위관 영양에 의해 에탄올 (4 g/kg)로 챌린지하였다. 챌린지하고 6시간 후에, 마우스는 높은 혈중 알콜 함량을 나타내었고 24시간까지 바닥에 근접하게 감소되었다 (데이터가 개시되지 않음). 발란스 빔 테스트 (balance beam test)에 의해 챌린지 후 24시간 (낙하까지의 시간)에서 거동을 평가하였다 (Carter et al., Current Protocols Neuroscience, Chapter 8:Unit 8 (2001)).
도 3에 개시된 바와 같이, AAVrh.10hALDH2 처리된 수컷 및 암컷 마우스는 전체 할당된 시간 (즉, 60초) 동안 빔 상에 남아있는 반면에, 대조군 벡터가 투여된 마우스는 보다 일찍 빔에서 떨어졌다.
상기 데이터는 AAVrh.10hALDH2 벡터로부터 발현된 ALDH2가 인 비보에서 활성이 있고, 에탄올-관련된 독성에 대해 보호할 수 있다는 것을 입증하였다.
본원에서 인용된 모든 문헌, 출판물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 문헌은 각각의 문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조에 의하여 통합되도록 지시된 것처럼 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의하여 통합되며, 본 명세서에서 그 전체가 개시된다.
용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 "적어도 하나" 및 유사한 지시자의 사용은, 본 발명을 설명하는 맥락에서 (구체적으로 이하의 청구항과 관련하여) 본원에서 달리 명시되거나 문맥에 분명히 모순되지 않는 한 단수와 복수를 모두 지칭한다. 하나 이상의 항목의 리스트가 뒤에 오는 "적어도 하나"라는 용어의 사용 (예를 들어, "A 및 B 중 적어도 하나")은 본원에서 달리 명시되거나 문맥에 분명히 모순되지 않는 한 열거된 항목들로부터 선택된 하나의 항목 (A 또는 B) 또는 열거한 항목들 중 두 개 또는 그 이상의 조합 (A 및 B)을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는 (comprising)", "갖는 (having)", "포괄하는 (including)" 및 "함유하는 (containing)"은 다른 언급이 없는 한 열린-끝의 용어 (즉, "포함하지만, 이에 국한되지 않는"을 의미함)로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위를 열거한 것은 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법의 역할만을 하도록 의도된 것이며, 각각의 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본 명세서에 개시된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 명백하게 부인되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 임의의 (any) 및 모든 (all) 예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "와 같은 (such as)")의 사용은 달리 주장되지 않은 이상 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 바람직한 구체예는 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 방식을 포함하여 본 명세서에 개시된다. 상기 바람직한 구체예의 변형은 전술한 설명을 읽음으로써 당업자에게 자명해질 수 있다. 발명자는 숙련된 당업자가 그러한 변형을 적절하게 사용할 것을 기대하며, 발명자는 본 발명이 본원에서 구체적으로 개시된 것과 다르게도 실시될 것으로 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률에 의해 허용되는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 개시된 주제의 모든 변경 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 달리 지시되거나 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 상기-언급된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Cornell University Adverum Biotechnologies <120> GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF ALDEHYDE DEHYDROGENASE DEFICIENCY <130> 725826 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic mature 500 aa protein <400> 1 Ser Ala Ala Ala Thr Gln Ala Val Pro Ala Pro Asn Gln Gln Pro Glu 1 5 10 15 Val Phe Cys Asn Gln Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp Ala Val 20 25 30 Ser Arg Lys Thr Phe Pro Thr Val Asn Pro Ser Thr Gly Glu Val Ile 35 40 45 Cys Gln Val Ala Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala Val Lys 50 55 60 Ala Ala Arg Ala Ala Phe Gln Leu Gly Ser Pro Trp Arg Arg Met Asp 65 70 75 80 Ala Ser His Arg Gly Arg Leu Leu Asn Arg Leu Ala Asp Leu Ile Glu 85 90 95 Arg Asp Arg Thr Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Asn Gly Lys 100 105 110 Pro Tyr Val Ile Ser Tyr Leu Val Asp Leu Asp Met Val Leu Lys Cys 115 120 125 Leu Arg Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Asp Lys Tyr His Gly Lys Thr Ile 130 135 140 Pro Ile Asp Gly Asp Phe Phe Ser Tyr 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Gln Glu Gly Ala Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Gly Gly Gly Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Phe Ile Gln Pro Thr 370 375 380 Val Phe Gly Asp Val Gln Asp Gly Met Thr Ile Ala Lys Glu Glu Ile 385 390 395 400 Phe Gly Pro Val Met Gln Ile Leu Lys Phe Lys Thr Ile Glu Glu Val 405 410 415 Val Gly Arg Ala Asn Asn Ser Thr Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Val Phe 420 425 430 Thr Lys Asp Leu Asp Lys Ala Asn Tyr Leu Ser Gln Ala Leu Gln Ala 435 440 445 Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Asp Val Phe Gly Ala Gln Ser Pro 450 455 460 Phe Gly Gly Tyr Lys Met Ser Gly Ser Gly Arg Glu Leu Gly Glu Tyr 465 470 475 480 Gly Leu Gln Ala Tyr Thr Glu Val Lys Thr Val Thr Val Lys Val Pro 485 490 495 Gln Lys Asn Ser 500 <210> 2 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence encoding mature 500 aa protein <400> 2 tcagccgccg ccacccaggc cgtgcctgcc cccaaccagc agcccgaggt cttctgcaac 60 cagattttca taaacaatga atggcacgat gccgtcagca ggaaaacatt ccccaccgtc 120 aatccgtcca ctggagaggt catctgtcag gtagctgaag gggacaagga agatgtggac 180 aaggcagtga aggccgcccg ggccgccttc cagctgggct caccttggcg ccgcatggac 240 gcatcacaca ggggccggct gctgaaccgc ctggccgatc tgatcgagcg ggaccggacc 300 tacctggcgg ccttggagac cctggacaat ggcaagccct atgtcatctc ctacctggtg 360 gatttggaca tggtcctcaa atgtctccgg tattatgccg gctgggctga taagtaccac 420 gggaaaacca tccccattga cggagacttc ttcagctaca cacgccatga acctgtgggg 480 gtgtgcgggc agatcattcc gtggaatttc ccgctcctga tgcaagcatg gaagctgggc 540 ccagccttgg caactggaaa cgtggttgtg atgaaggtag ctgagcagac acccctcacc 600 gccctctatg tggccaacct gatcaaggag gctggctttc cccctggtgt ggtcaacatt 660 gtgcctggat ttggccccac ggctggggcc gccattgcct cccatgagga tgtggacaaa 720 gtggcattca caggctccac tgagattggc cgcgtaatcc aggttgctgc tgggagcagc 780 aacctcaaga gagtgacctt ggagctgggg gggaagagcc ccaacatcat catgtcagat 840 gccgatatgg attgggccgt ggaacaggcc cacttcgccc tgttcttcaa ccagggccag 900 tgctgctgtg ccggctcccg gaccttcgtg caggaggaca tctatgatga gtttgtggag 960 cggagcgttg cccgggccaa gtctcgggtg gtcgggaacc cctttgatag caagaccgag 1020 caggggccgc aggtggatga aactcagttt aagaagatcc tcggctacat caacacgggg 1080 aagcaagagg gggcgaagct gctgtgtggt gggggcattg ctgctgaccg tggttacttc 1140 atccagccca ctgtgtttgg agatgtgcag gatggcatga ccatcgccaa ggaggagatc 1200 ttcgggccag tgatgcagat cctgaagttc aagaccatag aggaggttgt tgggagagcc 1260 aacaattcca cgtacgggct ggccgcagct gtcttcacaa aggatttgga caaggccaat 1320 tacctgtccc aggccctcca ggcgggcact gtgtgggtca actgctatga tgtgtttgga 1380 gcccagtcac cctttggtgg ctacaagatg tcggggagtg gccgggagtt gggcgagtac 1440 gggctgcagg catacactga agtgaaaact gtcacagtca aagtgcctca gaagaactca 1500 taa 1503 <210> 3 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic immature 517 aa protein including signal sequence <400> 3 Met Leu Arg Ala Ala Ala Arg Phe Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ala Ala Thr Gln Ala Val Pro Ala Pro Asn Gln Gln Pro 20 25 30 Glu Val Phe Cys Asn Gln Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp Ala 35 40 45 Val Ser Arg Lys Thr Phe Pro Thr Val Asn Pro Ser Thr Gly Glu Val 50 55 60 Ile Cys Gln Val Ala Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala Val 65 70 75 80 Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Gln Leu Gly Ser Pro Trp Arg Arg Met 85 90 95 Asp Ala Ser His Arg Gly Arg Leu Leu Asn Arg Leu Ala Asp Leu Ile 100 105 110 Glu Arg Asp Arg Thr Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Asn Gly 115 120 125 Lys Pro Tyr Val Ile Ser Tyr Leu Val Asp Leu Asp Met Val Leu Lys 130 135 140 Cys Leu Arg Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Asp Lys Tyr His Gly Lys Thr 145 150 155 160 Ile Pro Ile Asp Gly Asp Phe Phe Ser Tyr Thr Arg His Glu Pro Val 165 170 175 Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Gln 180 185 190 Ala Trp Lys Leu Gly Pro Ala Leu Ala Thr Gly Asn Val Val Val Met 195 200 205 Lys Val Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala Leu Tyr Val Ala Asn Leu 210 215 220 Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly 225 230 235 240 Phe Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ser His Glu Asp Val Asp 245 250 255 Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Ile Gly Arg Val Ile Gln Val 260 265 270 Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly 275 280 285 Lys Ser Pro Asn Ile Ile Met Ser Asp Ala Asp Met Asp Trp Ala Val 290 295 300 Glu Gln Ala His Phe Ala Leu Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys Cys 305 310 315 320 Ala Gly Ser Arg Thr Phe Val Gln Glu Asp Ile Tyr Asp Glu Phe Val 325 330 335 Glu Arg Ser Val Ala Arg Ala Lys Ser Arg Val Val Gly Asn Pro Phe 340 345 350 Asp Ser Lys Thr Glu Gln Gly Pro Gln Val Asp Glu Thr Gln Phe Lys 355 360 365 Lys Ile Leu Gly Tyr Ile Asn Thr Gly Lys Gln Glu Gly Ala Lys Leu 370 375 380 Leu Cys Gly Gly Gly Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Phe Ile Gln Pro 385 390 395 400 Thr Val Phe Gly Asp Val Gln Asp Gly Met Thr Ile Ala Lys Glu Glu 405 410 415 Ile Phe Gly Pro Val Met Gln Ile Leu Lys Phe Lys Thr Ile Glu Glu 420 425 430 Val Val Gly Arg Ala Asn Asn Ser Thr Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Val 435 440 445 Phe Thr Lys Asp Leu Asp Lys Ala Asn Tyr Leu Ser Gln Ala Leu Gln 450 455 460 Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Asp Val Phe Gly Ala Gln Ser 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cccgctcctg atgcaagcat ggaagctggg cccagccttg 600 gcaactggaa acgtggttgt gatgaaggta gctgagcaga cacccctcac cgccctctat 660 gtggccaacc tgatcaagga ggctggcttt ccccctggtg tggtcaacat tgtgcctgga 720 tttggcccca cggctggggc cgccattgcc tcccatgagg atgtggacaa agtggcattc 780 acaggctcca ctgagattgg ccgcgtaatc caggttgctg ctgggagcag caacctcaag 840 agagtgacct tggagctggg ggggaagagc cccaacatca tcatgtcaga tgccgatatg 900 gattgggccg tggaacaggc ccacttcgcc ctgttcttca accagggcca gtgctgctgt 960 gccggctccc ggaccttcgt gcaggaggac atctatgatg agtttgtgga gcggagcgtt 1020 gcccgggcca agtctcgggt ggtcgggaac ccctttgata gcaagaccga gcaggggccg 1080 caggtggatg aaactcagtt taagaagatc ctcggctaca tcaacacggg gaagcaagag 1140 ggggcgaagc tgctgtgtgg tgggggcatt gctgctgacc gtggttactt catccagccc 1200 actgtgtttg gagatgtgca ggatggcatg accatcgcca aggaggagat cttcgggcca 1260 gtgatgcaga tcctgaagtt caagaccata gaggaggttg ttgggagagc caacaattcc 1320 acgtacgggc tggccgcagc tgtcttcaca aaggatttgg acaaggccaa ttacctgtcc 1380 caggccctcc aggcgggcac tgtgtgggtc aactgctatg atgtgtttgg agcccagtca 1440 ccctttggtg gctacaagat gtcggggagt ggccgggagt tgggcgagta cgggctgcag 1500 gcatacactg aagtgaaaac tgtcacagtc aaagtgcctc agaagaactc ataa 1554 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Signal peptide by itself <400> 5 Met Leu Arg Ala Ala Ala Arg Phe Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Leu 1 5 10 15 Leu

Claims (25)

  1. 인간 알데히드 데히드로게나제 (human aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus: AAV), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 및 플라스미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 벡터.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 벡터는 AAV 벡터인 것인 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 AAV 벡터는 비-인간 아데노-관련 바이러스 (non-human adeno-associated virus)인 것인 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 비-인간 아데노-관련 바이러스는 붉은털 원숭이 (rhesus macaque) 아데노-관련 바이러스인 것인 벡터.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 붉은털 원숭이 아데노-관련 바이러스는 아데노-관련 바이러스 혈청형 (serotype) rh.10인 것인 벡터.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터는 구성적으로 (constitutively) 활성인 프로모터인 것인 벡터.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터는 세포 타입 특이적 프로모터인 것인 벡터.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인 것인 벡터.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 구성적으로 활성인 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 (chicken beta-actin promoter)인 것인 벡터.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 알데히드 데히드로게나제는 인간 알데히드 데히드로게나제 2 (ALDH2)인 것인 벡터.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 인간 알데히드 데히드로게나제 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 미토콘드리아 국소화 서열 (mitochondrial localization sequence)을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 것인 벡터.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 서열번호: 1을 코딩하는 것인 벡터.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 벡터는 서열번호: 3을 코딩하는 것인 벡터.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  16. 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍을 치료하거나, 또는 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 그의 임의의 증상을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 벡터를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 포유동물은 ALDH2*2 대립유전자 (allele)에 대해 이형접합 (heterozygous) 또는 동형접합 (homozygous)인 것인 방법.
  19. 청구항 16 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 알데히드 데히드로게나제의 결핍을 특징으로 하는 질환으로, 에탄올 독성, 상부 호흡/소화관 암, 골다공증, 편평 세포 암종, 판코니 빈혈 (fanconi anemia), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 고혈압, 심장부정맥, 심근경색증, 및 니트로글리세린 불내증 (nitroglycerin intolerance)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 질환을 앓고 있는 것인 방법.
  20. 청구항 16 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 포유동물에게 약 30일 이내에서 1회 이하로 투여되는 것인 방법.
  21. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 구강내, 근육내, 경피, 정맥내, 동맥내, 피하, 피내 (intradermal), 또는 복강내 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  22. 청구항 16 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 분석하고, 및 상기 포유동물에서 ALDH2 단백질의 잔기 487이 글루타민이 아닌 경우 치료를 위해 포유동물을 선택하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 피험체는 잔기 487의 아미노산이 리신일 때 치료를 위해 선택되는 것인 방법.
  24. 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍을 치료하기 위한, 또는 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 그의 임의의 증상을 치료 또는 예방하기 위한, 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 벡터, 또는 청구항 15의 조성물.
  25. 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍의 치료용, 또는 포유동물에서 알데히드 데히드로게나제 결핍을 특징으로 하는 질환 또는 그의 임의의 증상의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한, 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 벡터, 또는 청구항 15의 조성물의 용도.
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