CN112041338A

CN112041338A - 嗜酸性粒细胞病症的基因疗法

Info

Publication number: CN112041338A
Application number: CN201880090512.8A
Authority: CN
Inventors: R·G·克雷斯托; O·E·帕格维齐; K·斯泰尔斯
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-12-04
Also published as: AU2018394940A1; WO2019133818A8; IL275613A; EP3732194A1; CA3087063A1; WO2019133818A1; JP2021508719A; US20200330608A1; KR20200105494A; JP2023179525A; KR20240132386A; BR112020012830A2

Abstract

提供了用于哺乳动物嗜酸性粒细胞增多症的组合物和方法。在一个实施方式中，组合物是病毒基因治疗载体，且单剂量的所述载体降低哺乳动物中增加的嗜酸性粒细胞的数量。

Description

嗜酸性粒细胞病症的基因疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年12月29日提交的美国申请号62/612,005的优先权，其全部内容在此参考并入本申请。

背景技术

嗜酸性粒细胞是高度特化的骨髓来源的粒细胞，其在对抗寄生虫和其他病原体中发挥作用(Young等，2006)。在正常个体中，嗜酸性粒细胞占白细胞的<5％，其绝对计数为300-500个细胞/μl(Young等，2006；Bridgen等，1997；Gotlieb等，2015；Rothenberg等，2006)。嗜酸性粒细胞通常在循环中存在8-12小时，在组织中存活8-12天(Young等，2006)，并且胞质颗粒中携带多种细胞毒素介质，包括主要碱性蛋白、阳离子蛋白、过氧化物酶和神经毒素，以及能够释放活性氧、脂质介质、破坏性酶和多种细胞因子(Rothenberg等，2006；Bandiera-Melo等，2002；Hogan等，2008；Horuichi等，1997；Kato等，2005；Lacy,2005；Park等，2010；Saito等，2004；Song等，2009；Song等，2009；Trulson等，2007)。如果嗜酸性粒细胞大量侵入组织，则其会引起严重的器官损伤和功能障碍(Rothenberg等，2006；Bandiera-Melo等，2002；Hogan等，2008；Horuichi等，1997；Kato等，2005；Lacy,2005；Saito等，2004；Song等，2009；Song等，2009；Trulson等，2007；Zimmermann等，2008；Bolus等，2015；Gleiche等，1986；Morgan等，2005；Slifman等，1986；Venge等，1999；Zheutlin等，1984)。有多种原发性和继发性嗜酸性粒细胞疾病，其特征是血液嗜酸性粒细胞水平持续升高，嗜酸性粒细胞侵入器官以及相关器官损伤(Curtis等，2016；Falchi等，2015；Gotlib等，2012；Helbing等，2012；Reiter等，2017；Roufosse等，2012；Tefferi等，2006；Valent等，2012)。

发明内容

本公开内容涉及治疗嗜酸性粒细胞病症(例如，癌症，如白血病，包括但不限于非特指型慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL-NOS))的体内基因疗法，这种致命性病症体现了无有效疗法的未满足的医疗需求。CEL-NOS是成人慢性嗜酸性粒细胞白血病的一种亚型，其血液中嗜酸性粒细胞持续升高>1.5x10³/μL，原因不明，其特征是嗜酸性粒细胞浸润的器官的功能异常。CEL-NOS对任何疗法均无应答。由于发病机制未知，因此针对CEL-NOS的最直接疗法是抑制血液中嗜酸性粒细胞的数量，从而抑制嗜酸性粒细胞的组织侵袭和器官功能障碍。在一个实施方式中，提供了一种用于嗜酸性粒细胞病症(如CEL-NOS)的基因疗法，其采用编码抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体的腺相关病毒(AAV)载体。在一个实施方式中，所述AAV是AAVrh.10mAnti-Eos(LEXm03)，一种静脉内施用的血清型rh.10AAV载体，其可对诸如肝细胞(liver hepatocytes)等细胞进行基因修饰以表达和分泌，例如，小鼠特异性抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体，其可诱导小鼠嗜酸性粒细胞凋亡。为评价LEXm03的作用，利用另一种AAV载体(AAVrh.10mIL5)制备了CEL-NOS小鼠模型，其中通过静脉内施用该载体，以对肝脏进行基因修饰从而持续分泌高水平小鼠白介素-5(IL5)，继而刺激骨髓持续产生高水平的血液嗜酸性粒细胞(>100,000个嗜酸性粒细胞/μL)，伴随组织嗜酸性粒细胞浸润并最终死亡。数据表明，LEXm03在体外和体内诱导嗜酸性粒细胞凋亡，并显着降低CEL-NOS小鼠模型中的血液嗜酸性粒细胞水平。尽管CEL-NOS并不常见，但如本文所公开的，LEXm03策略适用于很多嗜酸性粒细胞增多性病症。而且，该策略可以与其他诱导嗜酸性粒细胞凋亡的抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体一起使用。使用静脉内施用载体(如LEXm03)来遗传修饰细胞(如肝细胞)，以分泌抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体，这可以显着抑制血液嗜酸性粒细胞水平，同时减少嗜酸性粒细胞的组织浸润并降低发病率和死亡率。

在一个实施方式中，本公开内容提供了一种在哺乳动物中预防、抑制或治疗嗜酸性粒细胞增多性疾病或病症的方法。该方法包括以预防、抑制或治疗哺乳动物中的嗜酸性粒细胞增多性病症的一种或多种症状的有效量向哺乳动物施用包含表达载体的组合物，所述表达载体编码结合嗜酸性粒细胞或结合能增加嗜酸性粒细胞数目或提高其成熟速率的分子的抗体。在一个实施方式中，哺乳动物是人。在一个实施方式中，疾病是癌症。在一个实施方式中，表达载体是质粒。在一个实施方式中，表达载体是病毒(例如，腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒)的一部分。在一个实施方式中，组合物包含含有表达载体的腺相关病毒。在一个实施方式中，AAV是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10。在一个实施方式中，抗体是嵌合的、scFv、人源化或全人源抗体。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与由SEQ ID NO:1或2编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，或具有与SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51中的任一个具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，或具有在SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51的可变区或CDR中的任何序列的组合。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与SEQ IDNO:1编码的多肽或与含有SEQ ID No.9-22、33、36-37、39、42或45-48中的任一个的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，并且具有IgG恒定区。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与SEQ ID NO:2编码的多肽或与含有SEQ ID No.22-32、34-35、38、40-41、43-44或49-51中的任一个的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，并且具有λ轻链恒定区。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与SEQ ID NO:2编码的多肽或与含有SEQ ID No.22-32、34-35、38、40-41、43-44或49-51中的任一个的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，并且具有κ轻链恒定区。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与包含SEQ ID NO:5、6或8或SEQ ID NO:5、6或8的任何组合的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与SEQ ID NO:5、6或8编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，并且具有IgG恒定区。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与SEQ ID NO:5、6或8编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，并且具有λ轻链恒定区。在一个实施方式中，表达载体编码的抗体具有与SEQ IDNO:5、6或8编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，并且具有κ轻链恒定区。在一个实施方式中，组合物是全身施用的。在一个实施方式中，多肽在SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51之一中的框架区、一个或多个CDR或者这两者中具有1、2、3、4或5个取代(例如，保守性或非保守性取代)或其组合。

在一个实施方式中，提供了一种抑制或治疗哺乳动物中的嗜酸性粒细胞增多性疾病或病症(例如，抑制或治疗嗜酸性粒细胞增多性疾病或病症的一种或多种症状)的方法。该方法包括以抑制或治疗哺乳动物中的嗜酸性粒细胞增多性疾病或病症的有效量向哺乳动物施用包含病毒表达载体的组合物，所述病毒表达载体包含编码抗体的开放阅读框，所述抗体结合嗜酸性粒细胞上的配体或结合当存在于所述哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。在一个实施方式中，哺乳动物是人。在一个实施方式中，疾病是癌症、哮喘、食道炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、感染性疾病、变应性或特应性疾病、胃肠炎、肝胆疾病、脑膜炎、心脏病症、泌尿生殖系统病症、免疫缺陷、内分泌病症、肺部病症、皮肤病、类风湿性关节炎或血管炎。在一个实施方式中，癌症是白血病。在一个实施方式中，所施用的量(例如，单剂量)降低哺乳动物中的嗜酸性粒细胞的数量但不将其消除。在一个实施方式中，所施用的量降低具有嗜酸性粒细胞增多性疾病的一个或多个组织中的嗜酸性粒细胞的数量。在一个实施方式中，所述量有效地降低哺乳动物中的嗜酸性粒细胞的百分比至少0.01％、0.05％、0.l％、0.5％、1％、5％、10％、30％、50％、60％、70％、80％或高达90％。在一个实施方式中，病毒表达载体是腺相关病毒载体或腺病毒载体。在一个实施方式中，AAV是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10。在一个实施方式中，抗体是嵌合的、scFv、单一重链、人源化或全人源抗体。在一个实施方式中，抗体结合嗜酸性粒细胞上的配体，例如包含糖类的配体。在一个实施方式中，配体是唾液酸粘附蛋白家族成员，例如唾液酸结合Ig样凝集素8。在一个实施方式中，病毒表达载体编码抗体，所述抗体包含含有与由SEQ ID NO:1或2编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽或含有与SEQID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽，或其组合。在一个实施方式中，病毒表达载体编码具有IgG恒定区的抗体。在一个实施方式中，病毒表达载体编码包含具有λ轻链恒定区的多肽的抗体。在一个实施方式中，病毒表达载体编码包含具有κ轻链恒定区的多肽的抗体。在一个实施方式中，组合物是全身施用的。在一个实施方式中，组合物是静脉内施用的。在一个实施方式中，组合物是向中枢神经系统或颅内施用的。在一个实施方式中，抗体是由内源性病毒启动子表达的。在一个实施方式中，内源性启动子被修饰为可诱导的。在一个实施方式中，抗体是由在病毒载体中的外源性启动子表达的，所述外源性启动子与开放阅读框可操作地连接。在一个实施方式中，抗体是由外源性启动子表达的。在一个实施方式中，外源性启动子是可诱导的。在一个实施方式中，启动子可被四环素、强力霉素、米诺环素(参见例如，Rodriguez-Garcia等人的文章中的四环素诱导型启动子，Nucl.Acids Res,33:e87(2005))、长春新碱、利福平、阿霉素或5-氮杂胞苷(例如，Mdr-1启动子)、具有对启动子序列或启动子上游的序列具有特异性的配体结合结构域和DNA结合结构域的融合蛋白、丙戊酸、吗啡(例如，酪氨酸羟化酶启动子)或喹诺酮(例如，骨桥蛋白启动子)诱导。在一个实施方式中，病毒表达载体还包含自杀基因。在一个实施方式中，载体的表达被降低或消除，该降低或消除是通过使用编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)的基因并施用更昔洛韦，使用编码胞嘧啶脱氨酶的基因和任选地与尿嘧啶磷酸核糖基转移酶联用并施用5-氟胞嘧啶，使用编码硝基还原酶的基因并施用5-(氮杂环丙基-1-基)-2,4-二硝基苯甲酰胺。其他系统包括水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-tk)、尿核苷磷酸化酶(PNP)、羧肽酶A、羧肽酶G2、亚麻苦苷酶、β-巴拉糖苷酶或肝细胞色素P450-2B1。

还提供了一种分离的重组病毒，其包含编码针对嗜酸性粒细胞的抗体的表达载体。在一个实施方式中，抗体具有与由SEQ ID NO:1或2或者这两者编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，或者具有与包含SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51中至少一者的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，或者其组合。或者提供了包含有效量的重组病毒的药物组合物。在一个实施方式中，病毒是重组腺相关病毒(AAV)。在一个实施方式中，组合物中或者所施用的一系列剂量中的AAV的量为约1x 10¹⁰至1x10²⁰个基因组拷贝，例如约1x 10¹²至1x 10¹⁵个、约1x 10¹⁴至1x 10¹⁶个、约1x 10¹⁶至1x 10¹⁸个或者约1x 10¹⁵至1x 10¹⁹个基因组拷贝。

在一个实施方式中，在组合物和方法中使用的抗体的示例性靶点包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、GM-CSF、IL-13、IL-16、IL-25、IL-27、IL-28、VEGF、血管生成素-1、PDGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IFN-α、IFN-γ、RANTES(CCL5)、MCP-3(CCL7)、MCP-4(CCL13)、嗜酸性粒细胞趋化因子(CCL11)、嗜酸性粒细胞趋化因子-2(CCL24)、嗜酸性粒细胞趋化因子-3(CCL26)、SDF-1(CXCL12)、PAF、补体因子C3a或C5a、VIP、唾液酸粘附蛋白因子、或GC或其受体，包括但不限于唾液酸粘附蛋白因子受体Siglec 8、Toll样R受体或CD33。在一个实施方式中，抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体针对人类嗜酸性粒细胞表达的细胞表面受体人Siglec-8，后者是CD33相关唾液酸结合Ig样凝集素家族的成员。Siglec-8与单克隆抗体的连接会导致嗜酸性粒细胞凋亡，并在体内导致嗜酸性粒细胞清除。

还提供了一种药物制剂，其包含分离的重组AAV，所述重组AAV包含编码针对嗜酸性粒细胞的抗体的表达载体，其中所述抗体具有与由SEQ ID NO:1或2或者这两者编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，或者具有与包含SEQ ID No:3-6、8-32、40-41、43-44或46-51中至少一者的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列，或者其组合。可以使用该制剂抑制或治疗癌症(例如，嗜酸性粒细胞性癌症)或其他嗜酸性粒细胞增多症。

还提供了一种药物制剂，其包含一定量的含有表达载体的分离的重组慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或AAV，所述表达载体包含编码抗体的开放阅读框，所述抗体结合嗜酸性粒细胞上的配体或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子，所述量有效地减少哺乳动物中嗜酸性粒细胞的数量。在一个实施方式中，抗体包含含有与由SEQ IDNO:1或2编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽，或含有与包含SEQ IDNo.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51之一的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽。在一个实施方式中，抗体结合Siglec-8、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-9、IL-9R、IL-13、IL-13R、IL-17、IL-17R、IL-33、IL-33R、CD30、CD52、CCR3、IgE Fc、RADCP或TNF-α。在一个实施方式中，将药物制剂配制用于静脉内递送。

附图说明

图1A-F：CEL-NOS小鼠模型的制备。该模型基于通过静脉内途径向野生型Balb/C小鼠施用表达小鼠白介素5(IL-5)的AAVrh.10基因治疗载体，IL-5是诱导骨髓产生嗜酸性粒细胞的主要细胞因子。A)AAVrh.10mIL-5载体的示意图。B)CEL-NOS小鼠模型的示意图。C)静脉内施用AAVrh.10mIL-5后8周时的血清IL5水平。D)血液涂片，天然Balb/C小鼠。E)血液涂片，AAVrh.10mIL5施用后10周，显示嗜酸性粒细胞增多。F)静脉内施用2.5x10¹⁰ gcAAVrh.10mIL-5后长达10周的绝对血液嗜酸性粒细胞计数，显示出持续较高的血液嗜酸性粒细胞负荷。

图2：CEL-NOS的血液涂片。

图3A-D：CEL-NOS小鼠模型(Balb/c)。使用AAVrh.10mIL-5感染6-8周龄的雄性Balb/c小鼠(n＝4只/组)，然后评价小鼠IL-5水平、血液嗜酸性粒细胞增多情况和嗜酸性粒细胞器官浸润情况。A)施用后8周时，小鼠血清IL-5水平。B)绝对嗜酸性粒细胞计数。C)血液涂片，PBS小鼠。D)血液涂片，AAVrh.10mIL-5感染小鼠，感染后两周。.

图4A-F：CEL-NOS小鼠模型(H&E Balb/c)。A)天然，肺。B)AAVrh.10mIL-5感染的肺。C)天然，肝脏。D)AAVrh.10mIL-5，肝脏。E)天然，心脏。F)AAVrh.10mIL-5，心脏。

图5A-B：AAVrh.10mAnti-Eos在野生型小鼠(Balb/c)中的表达。向6-8周龄Balb/c小鼠(4只雄性和4只雌性)静脉内(IV)施用AAVrh.10mAnti-Eos(10¹¹gc)，并评价血清IgG2b水平。A)AAVrh.10mAnti-Eos的体内表达。B)体外有效性表明载体产物可诱导小鼠嗜酸性粒细胞凋亡。显示了小鼠嗜酸性粒细胞乳凝集素(凋亡标记物)染色的流式细胞术评估结果。

图6：在CEL-NOS小鼠模型(Balb/c)中的AAVrh.10mAnti-Eos疗法。

图7A-D：AAVrh.10mAnti-Eos减少CEL-NOS小鼠模型(Balb/c)中的嗜酸性粒细胞的数量。A)治疗后10周的血液绝对嗜酸性粒细胞计数。B)由AAVrh.10mAnti-Eos介导的体内嗜酸性粒细胞凋亡。C-D)血液涂片。C)对照，AAVrh.10mIL-5(2.5x 10¹⁰gc)，在第10周时。D)AAVrh.10mAnti-Eos(10¹¹gc)，在第10周时。

图8：AAVrh.10mAnti-Eos降低CEL-NOS小鼠模型(Balb/c)中的死亡率。单独AAVrh.10mIL-5的中位生存期为184天，而AAVrh.10mAnti-Eos的为347天。

图9A-B：CEL-NOS的小鼠模型(Balb/c(A)和NSG(B))。

图10A-D：CEL-NOS小鼠模型(NSG)。A)使用AAVrh.10mIL-5感染6-8周龄的雄性Balb/c小鼠(n＝5只/组)，然后评价小鼠IL-5水平和血液嗜酸性粒细胞增多情况。B)绝对嗜酸性粒细胞计数。C)血液涂片，PBS小鼠。D)血液涂片，AAVrh.10mIL-5感染小鼠，感染后两周。

图11A-B：在免疫缺陷小鼠(NSG)中AAVrh.10mIL-5的表达。A)使用AAVrh.10mIL-5感染6-8周龄NSG小鼠(n＝5只/组)，然后评价小鼠IL-5水平(B)。

图12：在CEL-NOS小鼠模型(NSG)中的AAVrh.10mAnti-Eos疗法。

图13A-B：AAVrh.10mAnti-Eos在NSG小鼠中的表达。A)6-8周龄NSG小鼠接受10¹¹gcAAVrh.10mAnti-Eos，评价0-12周血清IgG2b水平。A)体内表达。B)体外凋亡。

图14A-B：AAVrh.10mAnti-Eos减少CEL-NOS小鼠模型(NSG雌性)中的嗜酸性粒细胞的数量。A)模型。B)绝对嗜酸性粒细胞计数。

图15A-B：AAVrh.10mAnti-Eos减少CEL-NOS小鼠模型(NSG雄性)中的嗜酸性粒细胞的数量。A)模型。B)绝对嗜酸性粒细胞计数。

图16A-B：AAVrh.10mAnti-Eos减少CEL-NOS小鼠模型(雄性NSG)中的嗜酸性粒细胞的数量。A)对照血液涂片。B)AAVrh.10mAnti-Eos治疗的血液涂片。

图17A-B：AAVrh.10mAnti-Eos降低CEL-NOS小鼠模型(NSG雄性)中的死亡率。A)模型。B)生存曲线。

具体实施方式

在下面的描述中，参考形成所述描述的一部分的附图，并且在附图中通过图示的方式示出了可以实践的特定实施方式。详细描述这些实施方式以使本领域技术人员能够实施本发明，并且应当理解，在不脱离本发明范围的情况下，可以利用其他实施方式并且可以进行逻辑改变。因此，以下示例性实施方式的描述不应被认为是限制性的，并且本发明的范围由权利要求书限定。

定义

“载体”是指包含多核苷酸或与多核苷酸缔合的大分子或大分子的缔合，并且可用于介导多核苷酸在体外或体内向细胞的递送。示例性载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载剂。待递送的多核苷酸，有时称为“靶多核苷酸”或“转基因”，可以包含基因治疗中的目标编码序列(如编码治疗性目标蛋白质的基因)、疫苗研发中的目标编码序列(如表达适于在哺乳动物中激发免疫应答的蛋白、多肽或肽的多核苷酸)和/或选择性或可检测的标记物。

如在本文中所使用的，“转导(Transduction)”、“转染”、“转化”或“转导(transducing)”是指将外源性多核苷酸引入宿主细胞中导致多核苷酸(例如，转基因)在细胞中表达的过程的术语，其中包括使用重组病毒将外源性多核苷酸引入宿主细胞。细胞中多核苷酸的转导、转染或转化可以通过本领域众所周知的方法来确定，包括但不限于蛋白表达(包括稳态水平)，例如通过ELISA、流式细胞术和Western印迹，通过异源杂交测定测量DNA和RNA，例如Northern印迹、Southern印迹和凝胶位移迁移率测定。用于引入外源性多核苷酸的方法包括众所周知的技术，如病毒感染或转染、脂质转染、转化和电穿孔，以及其他非病毒基因递送技术。引入的多核苷酸可以稳定或瞬时保持在宿主细胞中。

“基因递送”是指将外源性多核苷酸引入细胞以进行基因治疗，可以包括靶向、结合、摄取、转运、定位、复制子整合和表达。

“基因疗法”是指将外源多核苷酸引入细胞，其可以包括靶向、结合、摄取、转运、定位和复制子整合，但是不同于并且不暗示该基因的后续表达。

“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。

“感染性”病毒或病毒颗粒是包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒，它能够被递送至对于病毒物种是营养型的细胞中。该术语不一定表示病毒具有任何复制能力。

术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的或加帽的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在修饰，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。如在本文中所使用的，术语多核苷酸可以互换地指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本文描述的本发明的多核苷酸的任何实施方式既包括双链形式，也包括已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。

“分离的”多核苷酸(例如，质粒、病毒、多肽或其他物质)指物质的制品，其不含至少一些其他组分，而这些组分在该物质或类似物质天然存在或最初制备时也可能是存在的。因此，例如，可以通过使用纯化技术从源混合物中富集物质来制备分离的物质。分离的核酸、肽或多肽以与自然界发现的形式不同的形式或背景存在。例如，给定的DNA序列(例如，基因)存在于宿主细胞染色体上并接近相邻的基因；RNA序列(如编码特定蛋白的特定mRNA序列)与编码多种蛋白的多种其他mRNA以混合物的形式存在于细胞中。分离的核酸分子可以以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸分子表达蛋白质时，该分子将至少包含有义链或编码链(即，该分子可以是单链的)，但也可以同时包含有义链和反义链(即，该分子可以是双链的)。可以基于绝对值测量富集情况，如每体积溶液的重量，也可以相对于源混合物中存在的第二种可能干扰的物质进行富集。可以预见到实施方式具有增加的富集。因此，例如，2倍富集、10倍富集、100倍富集或1000倍富集。

“转录调控序列”指控制与其可操纵地连接的基因或编码序列的转录的基因组区域。使用的转录调控序列通常包括至少一个转录启动子，并且还可以包括一个或多个转录增强子和/或终止子。

“可操作地连接”是指两个或更多个组分的排布，其中如此描述的组分处于允许其以协调方式起作用的关系。举例来说，如果转录调控序列(TRS)或启动子促进编码序列的转录，则转录调控序列或启动子是可操作地连接至编码序列。可操作地连接的TRS通常与编码序列顺式连接，但不一定直接与其相邻。

“异源的”是指同与之比较的实体相比，在基因型上不同的实体衍生而来的。例如，通过基因工程技术引入到不同细胞类型中的多核苷酸是异源多核苷酸(并且在表达时可以编码异源多肽)。类似地，从其天然编码序列中移出并可操作地连接至不同编码序列的转录调控元件(如启动子)是异源转录调控元件。

“终止子”是指趋于减少或阻止通读(read-through)转录的多核苷酸序列(即，其减少或阻止源自终止子一侧的转录继续延伸至终止子的另一侧)。转录被破坏的程度通常是终止子序列的碱基序列和/或长度的函数。特别地，如在很多分子生物学系统中众所周知的，特定DNA序列，通常称为“转录终止序列”是趋向于破坏由RNA聚合酶介导的通读转录的特定序列，其大概是通过使RNA聚合酶分子停止和/或脱离正在转录的DNA。这种序列特异性终止子的典型实例包括聚腺苷酸化(“polyA”)序列，例如SV40 polyA。除了此类序列特异性终止子或代替此类序列特异性终止子以外，在启动子和编码区之间插入相对较长的DNA序列也往往会破坏编码区的转录，其通常与插入序列的长度成比例。这种作用可能是由于RNA聚合酶分子总是有某种趋势从待转录的DNA上脱离，并且在到达编码区之前增加待经过的序列长度通常会增加编码区的转录完成之前或者可能甚至转录开始之前发生脱离的可能性。因此，终止子可以仅从一个方向(“单向”终止子)或从两个方向(“双向”终止子)阻止转录，并且其可以由序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或者这两者组成。多种此类终止子序列是本领域公知的；下面提供的是在本公开内容的上下文中的此类序列的示例性用途。

“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”、“包装细胞系”和其他此类术语表示可用于本公开内容中的高等真核细胞(如哺乳动物细胞，包括人细胞)以例如生产重组病毒或重组融合多肽。这些细胞包括被转导的原始细胞的后代。应当理解的是，单个细胞的后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组互补物上)。

应用于多核苷酸的“重组”是指多核苷酸是克隆、限制性和/或连接步骤，以及导致形成不同于自然界中存在的多核苷酸的构建体的其他程序的各种组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的后代。

“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能调控，包括多核苷酸的复制、重复(duplication)、转录、剪接、翻译或降解。调控可能影响过程的频率、速度或特异性，并且本质上可以是增强的或抑制性的。控制元件是本领域公知的，包括例如转录调控序列，如启动子和增强子。启动子是在一定条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(沿3’方向)的编码区转录的DNA区域。启动子包括AAV启动子，例如P5、P19、P40和AAV ITR启动子，以及异源启动子。

“表达载体”是包含编码目标基因产物的区域的载体，并用于实现基因产物在预期的靶细胞中表达。表达载体还包含与编码区可操纵地连接的控制元件，以促进在靶标中的蛋白表达。有时将控制元件和与其可操作地连接以表达的一个或多个基因的组合称为“表达盒”，很多表达盒是本领域公知和可获得的，或者能够容易地由可以从本领域获得的组分所构建。

术语“多肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该术语还涵盖了已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、乙酰化、膦酰化、脂质化或与标记组分缀合。

当与细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸关联使用时，术语“外源的”指已通过人工或天然方式引入细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸。外源核酸可以来自不同生物体或细胞，或者可以是生物体或细胞中天然存在的核酸的一个或多个其他拷贝。作为非限制性实例，外源核酸处于染色体的位置与天然细胞中对应的位置不同，或其侧翼具有与天然发现的核酸序列不同的核酸序列，例如表达盒，其可将一个基因的启动子与用于不同基因的产生基因产物的开放阅读框架连接。

本文使用的“转化的”或“转基因的”包括任何通过存在至少一个重组DNA序列而改变或增强的宿主细胞或细胞系。通常通过用质粒表达载体中的DNA序列(作为分离的线性DNA序列)转染或用重组病毒载体感染来产生宿主细胞。

术语“序列同源性”指两条核酸序列之间的碱基匹配比例或两条氨基酸序列之间的氨基酸匹配比例。当序列同源性表示为百分比(例如，50％)时，该百分比表示与其他序列比较的所选序列长度上的匹配比例。允许空位(两条序列中的任何一条)以最大化匹配；空位长度通常为15个碱基或以下，优选为6个碱基或以下，更优选为2个碱基或以下。当使用寡核苷酸作为探针或处理时，靶核酸和寡核苷酸序列之间的序列同源性在20个可能的寡核苷酸碱基对匹配中通常有不少于17个靶碱基匹配(85％)；在10个可能的碱基对匹配中有不少于9个匹配(90％)，或在20个可能的碱基对匹配中有不少于19个匹配(95％)。

如果在其序列之间具有部分或完全同一性，则两条氨基酸序列是同源的。例如，85％的同源性是指当两条序列比对以获得最大匹配时，85％的氨基酸是相同的。允许空位(两条序列中的任何一条)以最大化匹配；空位长度优选为5个或以下，更优选为2个或以下。或者，如果使用具有突变数据矩阵和空位罚分为6或更高的ALIGN程序获得的比对评分大于5(以标准差为单位)，则如本文使用的本术语，两条蛋白序列(或从其衍生的长度至少为30个氨基酸的多肽序列)是同源的。如果当使用ALIGN程序进行最佳比对时，其氨基酸大于或等于50％相同，则两条序列或其部分的同源性更高。

本文使用的术语“对应于”是指多核苷酸序列在结构上与参照多核苷酸序列的全部或部分相关，或者多肽序列在结构上与参照多肽序列的全部或部分(例如，一个或多个框架序列或CDR序列)相关，例如其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。相比之下，本文使用的术语“与……互补”是指互补序列与参照多核苷酸序列全部或部分同源。为了进行说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参照序列“TATAC”，并且与参照序列“GTATA”互补。

术语“序列同一性”指在比较窗口中的两条多核苷酸序列是相同的(即，基于逐个核苷酸)。术语“序列同一性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定在两条序列中均出现的相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置数来以产生匹配位置数来计算的，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，然后将结果乘以100，以得出序列同一性百分比。如本文中所使用的，术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中在至少20个核苷酸位置的比较窗口中(通常窗口为至少20-50个核苷酸)，与参照序列相比，多核苷酸包含具有至少85％的序列同一性、优选至少90至95％的序列同一性、更通常至少99％的序列同一性的序列，其中序列同一性百分比是通过将参照序列与多核苷酸序列进行比较来计算的，多核苷酸序列可以包含在比较窗口内总计占参照序列20％或更少的缺失或添加。

“保守的”氨基酸取代是，例如，天冬氨酸-谷氨酸作为极性酸性氨基酸；赖氨酸/精氨酸/组氨酸作为极性碱性氨基酸；亮氨酸/异亮氨酸/蛋氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸作为非极性或疏水性氨基酸；丝氨酸/苏氨酸作为极性或不带电荷的亲水性氨基酸。保守的氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有酰胺基侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预期将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸，将天冬氨酸替换为谷氨酸，将苏氨酸替换为丝氨酸，或者类似地将氨基酸替换为结构相关的氨基酸将不会对所得多肽的性质造成重大影响。氨基酸改变是否导致功能性多肽可以容易地通过测定多肽的比活性来确定。天然存在的残基根据共同的侧链性质分成以下几类：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳香性：trp、tyr、phe。

本公开内容还设想了具有非保守性取代的多肽。非保守性取代需要将上述类别之一的成员交换为另一类别。

“核酸序列”旨在涵盖DNA或RNA的聚合物，即多核苷酸，其可以是单链的或双链的并且其可以含有非天然的或改变的核苷酸。本申请使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任意长度的核苷酸聚合形式，既可以是核糖核苷酸(RNA)也可以是脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。所述术语包括等同物形式的由核苷酸类似物制得的RNA或DNA类似物，以及经修饰的多核苷酸，例如但不限于，甲基化的和/或封端的多核苷酸。

编码多肽的核酸序列，所述多肽形成针对嗜酸性粒细胞或增加嗜酸性粒细胞数量的分子的抗体

本领域普通技术人员将理解，抗体由四条多肽链组成：重链(H)多肽的两个相同拷贝和轻链(L)多肽的两个拷贝。每条重链含有一个N末端可变区(V_H)和三个C末端恒定区(CH1、CH2和CH3)，每条轻链含有一个N末端可变区(V_L)和一个C末端恒定区(C_L)。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。编码抗体(该抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子，即“抗嗜酸性粒细胞抗体”)的核酸序列可以包含一条或多条核酸序列，每条序列编码抗嗜酸性粒细胞抗体的一个或多个重链和/或轻链多肽。在这方面，编码所述抗嗜酸性粒细胞抗体的核酸序列可以包含编码抗嗜酸性粒细胞抗体的两条重链多肽和两条轻链多肽的单一核酸序列。或者，编码所述抗嗜酸性粒细胞抗体的核酸序列可以包含编码抗嗜酸性粒细胞抗体的两条重链多肽的第一核酸序列，和编码抗嗜酸性粒细胞抗体的两条轻链多肽的第二核酸序列。在又一个实施方式中，编码所述抗嗜酸性粒细胞抗体的核酸序列可以包含编码抗嗜酸性粒细胞抗体的第一重链多肽的第一核酸序列、编码抗嗜酸性粒细胞抗体的第二重链多肽的第二核酸序列、编码抗嗜酸性粒细胞抗体的第一轻链多肽的第三核酸序列和编码抗嗜酸性粒细胞抗体的第二轻链多肽的第四核酸序列。

在另一个实施方式中，编码抗体(该抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子)的核酸序列编码抗嗜酸性粒细胞抗体的抗原结合片段(也称为“抗体片段”)。术语“抗原结合片段”指抗体的一个或多个片段，其保留了特异性结合抗原(例如，嗜酸性粒细胞)的能力。抗原结合片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，其是由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是一个二价片段，包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段；和(iii)Fv片段，其是由抗体单一臂的V_L和V_H结构域组成。在一个实施方式中，编码抗体(该抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子)的核酸序列可以包含编码抗嗜酸性粒细胞抗体的Fab片段的核酸序列。

抗体或其抗原结合片段可以通过任何方式获得，包括通过体外来源(例如，杂交瘤或重组产生抗体的细胞系)和体内来源(例如，啮齿动物)获得。产生抗体的方法是本领域公知的，例如描述于下述中：

和Milstein,Eur.J. Immunol.,5:511(1976)；Harlow和Lane(eds.),Antibodies: A Laboratory Manual,CSH Press(1988)；和C.A.Janeway等，(eds.),Immunobiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York,NY(2001)。在某些实施方式中，可以使用转基因动物(例如，小鼠)产生人源抗体或嵌合抗体，其中一个或多个内源性免疫球蛋白基因被一个或多个人免疫球蛋白基因替代。其中的内源性抗体基因被人抗体基因有效替代的转基因小鼠的实例包括但不限于HUMAB-MOUSE^TM、Kirin TC MOUSE^TM和KM-MOUSE^TM(参见例如，Lonberg,Nat.Biotechnol.,23(9):1117(2005)，和Lonberg,Handb. Exp.Pharmacol.,181:69(2008))。

可以使用本领域公知的方法产生编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列，其中所述的抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。例如，可以使用标准重组DNA方法重组生产核酸序列、多肽和蛋白(参见例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY,2001；和Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994)。另外，合成生产的编码抗体的核酸序列可以是从诸如细菌、昆虫或哺乳动物(例如，大鼠、人等)的来源分离和/或纯化的，其中所述的抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。分离和纯化的方法是本领域熟知的。或者，本文所述的核酸序列可以商业合成。在这方面，核酸序列可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。

可以通过从可得的产生抗体的杂交瘤细胞中提取RNA来鉴定编码抗体的核酸序列，其中所述的抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。cDNA是通过轻链和重链的逆转录和PCR扩增产生的，并且使用cDNA末端快速扩增(RACE)策略结合针对恒定结构域中保守区域的特异性引物进行。

还可以通过本领域公知的方法将编码抗体的核酸序列全部或部分人源化，其中所述的抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。例如，可以通过将编码抗体的小鼠Fc区DNA替换为编码人Fc区的cDNA的DNA来产生抗体嵌合体。

分子的Fab部分也可以通过将与人类不同的Fab序列的非CDR部分替换为合适的特定氨基酸，来选择性地改变这部分的DNA，从而使其人源化。

或者，可以通过将适宜的CDR编码区段插入人抗体“支架”中来实现人源化。

通过去除RNA不稳定性元件，可以优化所得抗体DNA序列以获得其在哺乳动物细胞中的高表达水平，这是本领域公知的。

在一个实施方式中，可以在单一启动子(例如，使用在重链和轻链之间的2A(Chysel)自切割序列)的控制下表达编码形成抗体(例如，形成具有两条轻链和两条重链的抗体、scFV、嵌合抗体、单重链等)的多肽的核酸序列，其中所述的抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。2A序列在蛋白翻译过程中会自我切割，并在上游蛋白的C末端留下一个短氨基酸尾。可以将弗林蛋白酶切割识别位点添加到2A序列和上游基因之间，以确保去除剩余的氨基酸。可以通过DNA测序以及通过使用western分析和ELISA测定的抗体特异性结合来鉴定表达正确插入物的质粒。

在一个实施方式中，编码形成抗体的多肽的核酸序列可以可操纵地连接至异源信号肽，例如，来自IL-2、IL-6、CD5、胰蛋白酶原、血清白蛋白、催乳素、弹性蛋白、胰凝乳蛋白酶、IL-2、胰蛋白酶原-2或阿瓦斯汀(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(SEQ ID NO:60)或MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:61))的信号肽或来自另一免疫球蛋白(例如参见，在Haryadi等，PloS One,10:e0116878(2015)中的表1，其通过引用并入本文)的信号肽，或者来自免疫球蛋白的同源信号肽，所述免疫球蛋白在单一启动子的控制下表达，或轻链和重链可以由不同启动子表达且可以具有相同或不同的信号肽，其中所述的抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。可以通过DNA测序以及通过使用western分析和ELISA测定的抗体特异性结合来鉴定表达正确插入物的质粒。

基于抗嗜酸性粒细胞的疗法

嗜酸性粒细胞是骨髓来源的粒细胞。其发育受白介素5(IL-5)的调控。嗜酸性粒细胞在对抗寄生虫病原体以及过敏性和哮喘性疾病的发病机制中具有作用。嗜酸性粒细胞在循环中存在8-12小时并在组织中存活8-12天。在正常哺乳动物中，嗜酸性粒细胞占血液白细胞的<5％(300-500个/μl)。其可以从细胞质颗粒中释放出多种细胞毒性介质。

外周血中正常嗜酸性粒细胞计数的范围从50至500×10⁹个/l。血液嗜酸性粒细胞增多可分为轻度嗜酸性粒细胞增多(最高1500×10⁹/l)和显著嗜酸性粒细胞增多(>1500×10⁹/l)。在“组织HE”中，在BM、淋巴器官以及肠道的粘膜内层(尤其是胃、小肠和结肠)中观察到大量的嗜酸性粒细胞。但是，在大多数其他组织和器官中，即使很少数量的嗜酸性粒细胞也可被视为“嗜酸性粒细胞增多”。组织HE的特征是嗜酸性粒细胞局部的显著增加和/或嗜酸性粒细胞衍生蛋白(如MBP)显著沉积。根据潜在病况和病因，存在几种HE变体形式：遗传(家族)形式(HEF)、具有不确定(临床)意义的HE(HEUS)、原发性(肿瘤性)HE(HEN)(其中认为嗜酸性粒细胞是克隆细胞)和继发性(反应性)HE(HER)(其中认为嗜酸性粒细胞是通过反应性过程扩增(和活化)的非克隆细胞)。罕见地，HER是由克隆过程触发的，如霍奇金氏淋巴瘤或肺腺癌。

CEL-NOS是原因不明的成人慢性嗜酸性粒细胞白血病的一种亚型。其特征是血液中嗜酸性粒细胞持续升高(>1.5x10³/μl)，这会导致嗜酸性粒细胞浸润的器官的功能异常。CEL-NOS的症状包括但不限于咳嗽、虚弱、腹泻、肝脾肿大、心脏和肺功能障碍。患有CEL-NOS的个体对治疗无应答，诊断后的中位生存期为2年。

在一个实施方式中，基于基因疗法的治疗嗜酸性粒细胞增多症的方法包括使用病毒载体，例如单次施用编码抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体的AAV载体(例如，AAVrh.10mAnti-Eos)，以提供抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体的持续表达，降低体内血液和组织嗜酸性粒细胞水平和降低死亡率。如下文所述，使用编码小鼠IL-5的AAV载体产生CEL-NOS的小鼠模型，其表达持续高水平的IL-5，导致持续刺激骨髓以产生嗜酸性粒细胞。制备了基于AAV的基因治疗载体(例如，AAVrh.10mAnti-Eos)，这是一种编码抗-Siglec-F的AAV载体，该抗体是特异性针对嗜酸性粒细胞表面免疫球蛋白样凝集素的大鼠IgG2b单克隆抗体。如本文所公开的，在第0天向Balb/c小鼠同时施用AAVrh.10mIL-5和AAVrh.10mAnti-Eos。为了避免对载体预先存在的免疫，使用了免疫缺陷的NOD-scid IL2 Rgamma^null(NSG)小鼠。在第0天，使用AAVrh.10mIL-5注射NSG小鼠。在第28天(表型建立后)，注射AAVrh.10mAnti-Eos。此外，产生了具有人类CEL-NOS相关特征的CEL-NOS小鼠模型。该表型独立于获得性免疫。一次向CEL-NOS小鼠施用AAVrh.10mAnti-Eos导致持续的抗Siglec-F水平，并长期抑制受累小鼠血液中的嗜酸性粒细胞。因此，在CEL-NOS小鼠模型中，AAVrh.10mAnti-Eos减少嗜酸性粒细胞的数量并降低死亡率。

防止高水平嗜酸性粒细胞长期持续存在的策略适用于其他嗜酸性粒细胞增多性疾病，例如那些没有其他治疗选择的疾病。

基因治疗载体

本公开内容提供了一种基因治疗载体，其包含编码单克隆抗体的核酸序列，所述抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。本公开内容还提供了一种在哺乳动物中针对嗜酸性粒细胞产生免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物施用上文所述的基因治疗载体。基因治疗载体和方法的各个方面在下面讨论。尽管每个参数分开讨论，但是基因治疗载体和方法包括以下参数的组合，以引起针对嗜酸性粒细胞相关病理学的保护。因此，可以根据基因治疗载体和方法使用参数的任何组合。

因此，“基因治疗载体”是具有将异源核酸序列携带到适宜宿主细胞中的能力的任何分子或组合物，在该宿主细胞中发生了编码蛋白的合成。通常，基因治疗载体是使用本领域公知的重组DNA技术进行工程化以掺入异源核酸序列的核酸分子。理想地，基因治疗载体包括DNA。适宜的基于DNA的基因治疗载体的实例包括质粒和病毒载体。然而，不基于核酸的基因治疗载体(如脂质体)也是本领域公知和使用的。基因治疗载体可以基于单一类型的核酸(例如，质粒)或非核酸分子(例如，脂质或聚合物)。基因治疗载体可以整合到宿主细胞基因组中，或者可以以游离基因的形式存在于宿主细胞中。

在本公开内容范围内的基因递送载体包括但不限于分离的核酸(例如，可以在染色体外维持的基于质粒的载体)和病毒载体(例如，重组腺病毒、逆转录病毒、慢病度、疱疹病毒、痘病毒、乳头瘤病毒或腺相关病毒)，包括存在于脂质体中的病毒和非病毒载体，例如中性或阳离子脂质体，如DOSPA/DOPE、DOGS/DOPE或DMRIE/DOPE脂质体，和/或与其他分子结合，如DNA-抗DNA抗体-阳离子脂质(DOTMA/DOPE)复合物。示例性的病毒基因递送载体将在后续描述。基因递送载体可以通过任何途径施用，包括但不限于颅内、鞘内、肌内、颊部、直肠、静脉内或冠状动脉内施用，并且可以使用电穿孔和/或离子电渗疗法和/或支架(如细胞外基质或水凝胶，例如水凝胶贴片)来增强向细胞的转移。

在一个实施方式中，基因治疗载体是病毒载体。适宜的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体、基于细小病毒的载体，例如基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体。可以使用例如Sambrook等，Molecular Cloning,a Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(2001)，和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,New York,N.Y.(1994)中所述的标准重组DNA技术制备这些病毒载体。

逆转录病毒载体

逆转录病毒载体表现出几个独特的特征，包括其稳定而精确地整合到宿主基因组中的能力，从而提供长期的转基因表达。可对这些载体进行离体操作，以消除感染性基因颗粒，从而最大程度的降低全身性感染和患者间传播的风险。假型逆转录病毒载体可以改变宿主细胞的嗜性。

慢病毒

慢病毒衍生自逆转录病毒家族，包括人类免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒。但是，与仅感染分裂细胞的逆转录病毒不同，慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞。例如，基于人类免疫缺陷病毒基因组的慢病毒载体能够在体内有效地转导心肌细胞。尽管慢病毒具有特定的嗜性，但用水泡性口炎病毒假型化病毒包膜可产生范围更广的病毒(Schnepp等，Meth.Mol.Med.,69:427(2002))。

腺病毒载体

通过从基因组中删除负责病毒基因表达的早期(E1A和E1B)基因，可以使腺病毒载体无法复制，并以染色体外形式稳定地维持在宿主细胞中。这些载体具有转染复制性细胞和非复制性细胞的能力，并且特别地，这些载体已显示出在体内(例如，定向注射或灌注后)能有效感染心肌细胞。已显示，腺病毒载体可导致体内治疗基因的瞬时表达，在7天达到峰值，并持续约4周。在利用神经特异性启动子的系统中，转基因表达的持续时间可以得到改善。另外，可以以非常高的滴度产生腺病毒载体，从而可以用少量病毒进行有效的基因治疗。

腺相关病毒载体

重组腺相关病毒(rAAV)衍生自非致病性细小病毒，在大多数系统中基本上不会引起细胞免疫应答，并能持续数月表达转基因。此外，像腺病毒一样，腺相关病毒载体也具有感染复制性和非复制性细胞的能力，并且被认为对人类没有致病性。而且，其对于持续性心脏基因治疗似乎很有希望(Hoshijima等，Nat.Med.,8:864(2002)；Lynch等，Circ.Res.,80:197(1997))。

质粒DNA载体

通常将质粒DNA称为“裸DNA”，以表示其无更复杂的包装系统。已完成了在体内将质粒DNA直接注射至心肌细胞。基于质粒的载体是相对非免疫原性和非致病性的，具有稳定整合到细胞基因组中的潜力，从而导致在体内有丝分裂后的细胞中长期基因表达。例如，尽管局灶转基因表达水平较低，肌肉注射质粒DNA后分泌的血管生成因子的表达已在动物模型中显示出显著的生物学作用，并且在临床上似乎很有前景(Isner,Nature,415:234(2002))。此外，质粒DNA在血流中迅速降解；因此，转基因在远器官系统中表达的机会可忽略不计。质粒DNA可以作为大分子复合物(例如，脂质体或DNA-蛋白复合物)的一部分递送至细胞，并且可以使用包括电穿孔在内的技术增强递送。

示例性AAV载体

在一个实施方式中，本公开内容提供了一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码结合嗜酸性粒细胞的抗体或其抗原结合片段的核酸序列、基本上由其组成或者由其组成。当AAV载体基本上由编码结合嗜酸性粒细胞的抗体的核酸序列组成时，可以包含不会实质性影响AAV载体的其他成分(例如，遗传元件，例如便于在体外操作载体的poly(A)序列或限制性酶切位点)。当AAV载体由编码单克隆抗体(该抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子)的核酸序列组成时，AAV载体不包含任何其他成分(即，不是AAV内源的和对实现核酸序列表达从而提供抗体来说是不必要的成分)。

腺相关病毒是细小病毒科(Parvoviridae)的成员，并且包含少于约5,000个核苷酸的线性单链DNA基因组。AAV需要与辅助病毒(即，腺病毒或疱疹病毒)共同感染，或需要辅助基因的表达以进行有效复制。用于施用治疗性核酸的AAV载体通常具有约96％的亲本基因组缺失，使得仅保留含有用于DNA复制和包装的识别信号的末端重复(ITR)。这消除了由于病毒基因表达所引起的免疫或毒副作用。另外，如果需要，递送特异性AAV蛋白至生产细胞能使包含AAV ITR的AAV载体被整合至细胞基因组的特定区域中(参见例如，美国专利号6,342,390和6,821,511)。包含整合的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态学上没有变化(参见例如，美国专利号4,797,368)。

AAV ITR侧接非结构性复制(Rep)蛋白和结构衣壳(Cap)蛋白(也称为病毒体蛋白(VP))的独特编码核苷酸序列。末端145个核苷酸是自身互补的并且有序排列(organized)，从而可以形成能量上稳定的呈T形发夹的分子内双链体。这些发夹结构通过作为细胞DNA聚合酶复合物的引物而起到病毒DNA复制起点的作用。Rep基因编码Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68自p5启动子转录，而Rep52和Rep40自p19启动子转录。Rep78和Rep68蛋白是多功能DNA结合蛋白，其在生产性复制期间执行解旋酶和切口酶功能以允许AAV末端解析(参见例如，Im等，Cell,61:447(1990))。这些蛋白质还调节来自内源性AAV启动子和辅助病毒内的启动子的转录(参见例如，Pereira等，J.Virol.,71:1079(1997))。其他Rep蛋白修饰Rep78和Rep68的功能。Cap基因编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。Cap基因自p40启动子转录。

AAV载体可以使用本领域已知的任何AAV血清型来产生。已经从腺病毒原种或者从人或非人灵长类动物组织中分离了若干种AAV血清型和超过100种AAV变体(综述于例如Wu等，Molecular Therapy,14(3):316(2006))。通常，AAV血清型具有在核酸序列和氨基酸序列水平上显著同源的基因组序列，使得不同血清型具有相同的一组遗传功能，产生在物理和功能上基本等同的病毒颗粒，并通过实际上相同的机制复制和组装。AAV血清型1-5和7-9被定义为“真”血清型，因为它们不与针对所有其他现有的并已被表征的血清型的中和血清有效地发生交叉反应。相比之下，AAV血清型6、10(也称为Rh10)和11被认为是“变体”血清型，因为它们不符合“真”血清型的定义。AAV血清型2(AAV2)由于无致病性、广泛的感染性和能建立长期转基因表达而广泛用于基因治疗应用(参见例如，Carter,Hum.GeneTher.,16:541(2005)；和Wu等，同上)。各种AAV血清型的基因组序列及其比对公开于例如GenBank登录号U89790、J01901、AF043303和AF085716；Chiorini等，J.Virol.,71:6823(1997)；Srivastava等，J.Virol.,45:555(1983)；Chiorini等，J.Virol.,73:1309(1999)；Rutledge等，J.Virol.,72:309(1998)；和Wu等，J.Virol.,74:8635(2000))。

AAV rep和ITR序列在大多数AAV血清型中特别保守。例如，据报道，AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4和AAV6的Rep78蛋白约具有89-93％的同一性(参见Bantel-Schaal等，J.Virol.,73(2):939(1999))。已报道AAV血清型2、3A、3B和6在基因组水平上具有约82％的总核苷酸序列同一性(Bantel-Schaal等，同上)。此外，已知许多AAV血清型的rep序列和ITR在哺乳动物细胞产生AAV颗粒期间有效地交叉互补(即，功能上取代)来自其他血清型的相应序列。

通常，在不同AAV血清型之间，确定AAV颗粒的细胞嗜性的cap蛋白以及相关cap蛋白编码序列比Rep基因保守性低得多。鉴于Rep和ITR序列交叉互补其他血清型的相应序列的能力，AAV载体可以包含血清型的混合物，从而成为“嵌合”或“假型”AAV载体。嵌合AAV载体通常包含源自两种或更多种(例如，2、3、4种等)不同AAV血清型的AAV衣壳蛋白。相比之下，假型AAV载体包含一种AAV血清型的一种或多种ITR，但包装于另一种AAV血清型的衣壳中。嵌合和假型AAV载体进一步描述于例如美国专利号6,723,551；Flotte,Mol.Ther.,13(1):1(2006)；Gao等，J.Virol.,78:6381(2004)；Gao等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA,99:11854(2002)；De等，Mol. Ther.,13:67(2006)；和Gao等，Mol. Ther.,13:77(2006)中。

在一个实施方式中，使用感染人的AAV(例如，AAV2)产生AAV载体。或者，使用感染非人类灵长类例如大猩猩(例如，黑猩猩)、旧世界猴(例如，恒河猴)和新世界猴(例如，狨猴)的AAV产生AAV载体。在一个实施方式中，使用感染人的AAV假型包装的感染非人灵长类的AAV产生AAV载体。此类假型AAV载体的实例公开于例如Cearley等，Molecular Therapy,13:528(2006)中。在一个实施方式中，可以产生这样的AAV载体：其包含来自感染恒河猴的AAV的衣壳蛋白，并且被AAV2反向末端重复(ITR)假型包装。在一个特定的实施方式中，AAV载体包含来自感染恒河猴的AAV10的衣壳蛋白(也称为“AAVrh.10”)，并被AAV2的ITR假型包装(参见例如，Watanabe等，Gene Ther.,17(8):1042(2010)；和Mao等，Hum. Gene Therapy,22:1525(2011))。

除了编码针对嗜酸性粒细胞的抗体或其抗原结合片段的核酸序列以外，AAV载体可以包含表达控制序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等，其提供了核酸序列在宿主细胞中的表达。示例性的表达控制序列是本领域公知的，并且在例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,CA.(1990)中进行了描述。

来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型、诱导型和抑制型启动子在本领域中是众所周知的。启动子的代表性来源包括例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并且来自这些来源的合适的启动子是容易获得的，或者可以基于公共可获得的序列(例如，来自诸如ATCC的保藏所以及其他商业或个人来源)而合成得到。启动子可以是单向的(即，以一个方向启动转录)或双向的(即，以3’或5’方向启动转录)。启动子的非限制性实例包括例如T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子和RSV启动子。诱导型启动子包括例如Tet系统(美国专利号5,464,758和5,814,618)、蜕皮激素诱导型系统(No等，Proc.Natl. Acad. Sci.,93:3346(1996))、T-REX^TM系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)、LACSWITCH^TM系统(Stratagene,San Diego,CA)和Cre-ERT他莫昔芬(tamoxifen)诱导型重组酶系统(Indra等，Nuc. Acid. Res.,27:4324(1999)；Nuc. Acid. Res.,28:e99(2000)；美国专利号7,112,715；Kramer&Fussenegger,Methods Mol. Biol.,308:123(2005))。

如本文使用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于距核酸序列编码区数千个碱基处，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的变化。来自各种不同来源的大量增强子是本领域所众所周知的，并且可以以克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内(例如，来自诸如ATCC的保藏所以及其它商业或个体来源)获得。许多包含启动子(例如，常用的CMV启动子)的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。在一个实施方式中，编码针对嗜酸性粒细胞的抗体或其抗原结合片段的核酸序列与CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子可操作地连接(也称为“CAG启动子”)(参见例如，Niwa等，Gene,108:193(1991)；Daly等，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.,96:2296(1999)；和Sondhi等，Mol. Ther.,15:481(2007))。

通常，AAV载体是使用已良好表征的质粒生产的。例如，用一种转基因特异性质粒和另一种包含腺病毒辅助基因以及AAV rep和cap基因(根据需要对AAVrh.10、8或9具有特异性)的质粒转染人胚肾293T细胞。72小时后，收集细胞并通过5次冻融循环使载体从细胞中释放。随后离心并用苯甲酸酯酶处理以去除细胞碎片和未衣壳化的DNA。可以将碘克沙醇梯度和离子交换柱用于进一步纯化每个AAV载体。接下来，将纯化的载体通过体积排阻离心离心柱(size exclusion centrifuge spin column)浓缩至所需浓度。最后，进行缓冲液交换以形成(例如)配制于1x磷酸盐缓冲液中的最终载体产物。可以通过

实时PCR测量病毒滴度和通过SDS-PAGE测量病毒纯度。

药物组合物和递送

本公开内容提供了包含、基本由或由前述基因治疗载体和药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)运载体组成的组合物。当组合物基本上由基因治疗载体和药学上可接受的运载体组成时，可以包含不会实质上影响组合物的另外组分(例如，佐剂、缓冲剂、稳定剂、抗炎剂、增溶剂、防腐剂等)。当组合物由基因治疗载体和药学上可接受的运载体组成时，该组合物不包含任何另外的组分。在本发明的背景下可以使用任何合适的运载体，并且此类运载体在本领域中是众所周知的。运载体的选择将部分地由组合物可施用的特定部位和用于施用组合物的具体方法来确定。除了本文所述的基因治疗载体外，组合物任选地可以是无菌的。可以将组合物冷冻或冻干以便储存，并在使用之前在合适的无菌运载体中重构。组合物可根据例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)所述的常规技术来产生。

适用于组合物的制剂包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂，以及水性和非水性无菌混悬液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以以存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如，安瓿和小瓶)中，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在即用前加入无菌液体运载体(例如，水)。即时溶液和混悬液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。在一个实施方式中，运载体是缓冲盐溶液。在一个实施方式中，将基因治疗载体配制成组合物形式施用，以保护基因治疗载体在施用之前免受损害。例如，可以配制组合物以减少基因治疗载体在用于制备、存储或施用载体的装置(例如，玻璃器皿、注射器或针头)上的损失。可以配制组合物以降低基因治疗载体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，组合物优选包含药学上可接受的液体运载体，例如上述的那些，和选自聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其组合的稳定剂。使用此类组合物将延长基因治疗载体的保质期、促进施用、并增加本发明方法的效率。含有基因治疗载体的组合物的制剂进一步描述于例如Wright等，Curr.Opin.DrugDiscov.Devel.,6(2):174-178(2003)和Wright等，Molecular Therapy,12:171-178(2005)中。

组合物也可以经配制以增强转导效率。此外，本领域普通技术人员将会理解，基因治疗载体可以与其他治疗剂或生物活性剂一起存在于组合物中。例如，控制炎症的因子例如布洛芬或类固醇可以是组合物的一部分，以减少与体内施用基因治疗载体相关的肿胀和炎症。可以施用免疫系统刺激剂或佐剂(例如，白介素、脂多糖和双链RNA)以增强或修饰抗嗜酸性粒细胞免疫应答。可使用抗菌素(即杀菌剂和杀真菌剂)来治疗现有感染和/或降低未来感染的风险，例如与基因治疗过程相关的感染。

通过在可生物降解的聚合物(如聚乳酸-聚乙醇酸)中形成主体化合物的微囊基质来制备可注射的贮库形式(depot form)。取决于药物与聚合物的比例以及所用的特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物包封在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射长效制剂(depot injectable formulation)。

在某些实施方式中，制剂包含选自下组的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、丙烯酸和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乙烯基聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸聚合物、聚酐、聚原酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯、及其共混物、混合物或共聚物。

可以在允许控释或缓释(controlled or sustained release)的装置之中或之上施用所述组合物，所述装置为例如海绵、生物相容性网状物、机械储器或机械植入物。植入物(参见例如，美国专利号5,443,505)、装置(参见例如，美国专利号4,863,457)，例如可植入装置(例如，包含聚合物组合物的机械储器或植入物或装置)，特别适用于施用基因治疗载体。所述组合物还可以以缓释制剂的形式进行施用(参见例如，美国专利号5,378,475)，所述缓释制剂包含，例如，凝胶泡沫、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多磷酸酯(例如，双-2-羟乙基-对苯二甲酸酯(BHET))和/或聚乳酸-乙醇酸。

包含基因治疗载体的组合物的递送可以是使用本领域公知的装置进行的脑内的(包括但不限于实质内、脑室内或脑池内)、鞘内的(包括但不限于腰椎或小脑延髓池)或全身性的，包括但不限于静脉内，或其任何组合的递送。也可以通过外科手术植入的植入装置来进行递送。

施用给所述哺乳动物的组合物中基因治疗载体的剂量取决于多种因素，包括所述哺乳动物的大小(质量)、任何副作用的程度、特定的给药途径等。在一个实施方式中，所述方法包括施用“治疗有效量”的包含本申请描述的基因治疗载体的组合物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内能有效实现想要的治疗结果的量。治疗有效量可以根据诸如嗜酸性粒细胞相关的病理程度、个体的年龄、性别和体重，以及所述基因治疗载体在所述个体中引发所需应答的能力等因素而变化。为了实现特定的治疗效应所需的组合物中的基因治疗载体剂量通常以以下单位进行施用：载体基因组拷贝数/每细胞(gc/细胞)或载体基因组拷贝数/每千克体重(gc/kg)。基于这些以及本领域熟知的其他因素，本领域普通技术人员可以容易地确定用以治疗具有特定疾病或病症的患者的合适的基因治疗载体剂量范围。治疗有效量可以在1x 10¹⁰个基因组拷贝数至1x 10¹³个基因组拷贝数之间。治疗有效量可以在1x 10¹¹个基因组拷贝数至1x 10¹⁴个基因组拷贝数之间。治疗有效量可以在1x 10¹²个基因组拷贝数至1x 10¹⁵个基因组拷贝数之间。治疗有效量可以在1x 10¹³个基因组拷贝数至1x 10¹⁶个基因组拷贝数之间。

在一个实施方式中，组合物一次施用于哺乳动物。据信，单次施用组合物将导致抗嗜酸性粒细胞抗体在哺乳动物中的持续表达，且副作用最小。然而，在某些情况下，在治疗期间多次施用组合物以确保细胞充分暴露于组合物可能是合适的。例如，在治疗期间可以向哺乳动物施用2次或更多次(例如，2、3、4、5、6、6、8、9或10次或更多次)组合物。

本公开内容提供了药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的基因治疗载体，所述基因治疗载体包含编码抗体的核酸序列，所述抗体结合至嗜酸性粒细胞上的配体，或结合当存在于哺乳动物中会增加如上所述的嗜酸性粒细胞数量的分子。

适于抗嗜酸性粒细胞基因治疗的疾病和病症

本文所述的基因治疗载体可用于预防、抑制或治疗内在性或外在性嗜酸性粒细胞病症，例如通常是由于嗜酸性粒细胞谱系中的基因突变导致的那些病症或由于来源于T细胞或肿瘤细胞的嗜酸性粒细胞因子产生导致的那些病症。外在性疾病或病症包括但不限于T细胞介导的嗜酸性粒细胞增多症，例如过敏性疾病，包括变应性鼻结膜炎、支气管哮喘和特应性皮炎，药物超敏反应，例如伴嗜酸性粒细胞增多和全身性症状的药疹(DRESS)、史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)，急性细菌或病毒感染，例如呼吸道合胞病毒(RSV)、蠕虫寄生虫感染以及曲霉病和球孢子菌病，自身免疫性疾病，例如原发性胆汁性肝硬化、全身性硬化症、皮肌炎、系统性狼疮和干燥综合征。皮肤病况(如类天疱疮、天疱疮、表皮溶解和自身免疫性黄体酮皮炎)、免疫缺陷、移植物抗宿主病、肥大细胞增多症、嗜酸性食管炎、嗜酸性胃炎和胃肠炎、嗜酸性结肠炎；肺嗜酸性粒细胞增多症，例如单纯性肺嗜酸性粒细胞增多症、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、急性嗜酸性粒细胞性肺炎、过敏性支气管肺曲菌病以及与Churg-Strauss综合征和高嗜酸性粒细胞综合征相关的肺嗜酸性粒细胞增多；T细胞来源的肿瘤是与嗜酸性粒细胞增多相关的。包括塞泽里(Sézary)综合征、T细胞淋巴母细胞淋巴瘤和T细胞白血病/淋巴瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生、B细胞肿瘤的这些也与嗜酸性粒细胞增多有关。事实上，特征性Reed-Sternberg细胞存在于霍奇金氏淋巴瘤中；以及已描述嗜酸性粒细胞的淋巴增生形式是由于产生IL-5的CD4⁺Th2样淋巴细胞的克隆扩增。

在一个实施方式中，与内在性嗜酸性粒细胞因子的产生相关的疾病或病症包括但不限于慢性嗜酸性粒细胞白血病、伴嗜酸性粒细胞增多的慢性髓性白血病、与真性红细胞增多相关的骨髓增生性病症、或原发性血小板增多症、未发现染色体重排的特发性嗜酸性粒细胞增多综合征。其他病症包括但不限于X连锁嗜酸性粒细胞综合征、家族性嗜酸性粒细胞增多症和发作性血管性水肿伴嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性脂膜炎、木村氏病、和血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性筋膜炎、韦尔斯氏综合症或嗜酸性蜂窝织炎、嗜酸性脓疱性毛囊炎和皮肤复发性坏死性嗜酸性血管炎。

在一个实施方式中，疾病或病症是感染性疾病，例如寄生虫感染(如蠕虫感染)或真菌感染(如球孢子感染和变应性支气管肺曲菌病)，或导致疥疮或蝇蛆病的侵染、过敏或特应性疾病，例如与药物超敏反应相关、肠胃炎、食管炎、肝胆疾病、脑膜炎、心脏病症、泌尿生殖系统病症、免疫缺陷、内分泌病症、肺部病症、皮肤病、类风湿性关节炎、血管炎或癌症，例如嗜酸性粒细胞增多综合征。在一个实施方式中，疾病或病症是感染性疾病，例如寄生虫感染、真菌感染(例如，变应性支气管肺曲菌病或球孢子菌病)，血液系统或肿瘤性病症，例如嗜酸性粒细胞增多综合征(HES)，包括慢性嗜酸性粒细胞性白血病、白血病(例如，急性髓性白血病，最常见是B细胞ALL)、淋巴瘤(例如，霍奇金氏、T细胞和B细胞淋巴瘤)、CML、AML、ASM、MDS、JAK2 V617F，PDGFRA、PDGRFB或FGFR1异常的骨髓肿瘤，或腺癌相关的肿瘤，鳞癌，大细胞肺癌，膀胱移行细胞癌或全身性肥大细胞增多症，免疫性病症，如原发性免疫缺陷疾病(例如，高IgE综合征、欧门氏综合征、Dock8缺乏症、IPEX或Zap70缺乏症)或移植物抗宿主病，内分泌病症，例如肾上腺皮质功能低下，或与辐射相关的嗜酸性粒细胞增多，动脉粥样硬化性病症或结节病。与嗜酸性粒细胞增多相关的蠕虫感染包括但不限于血管性类圆线虫病、蛔虫病、华支睾吸虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫感染、淋巴丝虫病、布鲁格丝虫属、无策线虫、罗阿丝虫(Loa loa)、奥氏曼森线虫(Mansonella ozzardi)、常现曼森氏线虫(Mansonella perstans)、链尾丝虫(Mansonella streptocerca)、盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、颚口线虫病、钩虫病、后睾吸虫病、肺吸虫病、血吸虫病、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、间插血吸虫(Schistosomaintercalatum)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)、湄公血吸虫(Schistosoma mekongi)、类圆线虫病、旋毛虫病、内脏幼虫移行症、犬蛔虫(Toxocara canis)；T catis或Baylisascaris procyonis。

可以用本文所述的基因治疗载体预防、抑制或治疗的伴器官受累和外周嗜酸性粒细胞显著增多的疾病或病症包括但不限于皮肤和皮下疾病，例如发作性血管性水肿伴嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性蜂窝细胞炎(威尔氏综合征)、嗜酸性脂膜炎、血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多症(和木村氏病)、嗜酸性脓疱性皮炎或皮肤坏死性嗜酸性粒细胞性血管病、肺部疾病，例如药物和毒素引起的嗜酸性粒细胞性肺病、与蠕虫相关的疾病(洛夫勒氏综合征；热带肺嗜酸性粒细胞增多症)、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、急性嗜酸性粒细胞性肺炎、Churg-Strauss综合征或其他脉管炎，胃肠道疾病，例如嗜酸性胃肠道病症(EGID)，包括但不限于嗜酸性食管炎(EE)和嗜酸性肠胃炎(EG)、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、嗜酸性胆管炎或嗜酸性胆囊炎，神经系统疾病，包括但不限于嗜酸性粒细胞性脑膜炎、脑室腹膜分流术、CNS受累的白血病或淋巴瘤(霍奇金氏病)、非甾体抗炎药、抗生素、造影剂、风湿性疾病、Churg-Strauss综合征、嗜酸性粒细胞-肌痛综合征，心脏疾病，包括但不限于过敏性心肌炎或Churg-Strauss综合征，或者泌尿生殖系统疾病，例如药物诱导的间质性肾炎或嗜酸性膀胱炎。

在一个实施方式中，疾病或病症是感染性疾病，包括但不限于蠕虫寄生虫，肠道球虫贝氏等孢子球虫(Isospora belli)，脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)，人肉孢子虫(Sarcocystis hominis)，体表寄生虫例如疥疮，蝇幼虫(蝇蛆病)，HIV，真菌例如球孢子菌病和曲霉病感染。

在一个实施方式中，疾病或病症是特应性/过敏疾病，例如过敏性鼻炎、非过敏性鼻炎伴嗜酸性粒细胞增多症(NARES或BENAR)或哮喘(过敏性和非过敏性)。

在一个实施方式中，疾病或病症是与药物相关的外周血嗜酸性粒细胞增多症，例如与奎宁、青霉素、头孢菌素、喹诺酮、NSAID、磺胺类药物、硝基呋喃妥因、四环素、半合成青霉素、胺碘酮、硝基呋喃妥因、甲氨蝶呤、SSRI或SNRI头孢菌素(例如，头孢噻肟、头孢西丁、头孢哌酮或头孢曲松)、柳氮磺吡啶、乙内酰脲、卡马西平、d-青霉胺、别嘌呤醇、氢氯噻嗪、环孢素、雷尼替丁、GM-CSF、IL-2、苯妥英、别嘌呤醇、阿司匹林、奈韦拉平或柳氮磺胺吡啶相关。

在一个实施方式中，疾病或病症是血液系统/肿瘤性疾病，包括但不限于淋巴样恶性肿瘤，例如霍奇金氏病，原发性皮肤T细胞淋巴瘤或Sezary综合征，实体瘤，例如淋巴瘤，大细胞非角化宫颈癌，大细胞未分化肺癌，肺、阴道、阴茎、皮肤或鼻咽的鳞癌，胃、大肠或子宫体的腺癌，膀胱移行细胞癌或肥大细胞增多症。

在一个实施方式中，疾病或病症是免疫缺陷，例如Omenn综合征、高IgE(Job)综合征)、Dock8缺乏症、IPEX或Zap70缺乏症或移植物抗宿主病(GVHD)，例如同种异体干细胞移植后的GVHD。

在一个实施方式中，疾病或病症是内分泌疾病或病症，例如由艾迪生氏病中内源性肾上腺糖皮质激素丧失、肾上腺出血或垂体功能低下所致。

在一个实施方式中，疾病或病症是与胆固醇栓塞相关的，是与放疗相关的嗜酸性、多态性和瘙痒性丘疹(EPPER)、结节病、炎性肠病或与免疫调节异常相关的其他病症。

在一个实施方式中，疾病或病症是器官受累的嗜酸性粒细胞增多症，例如皮肤和皮下组织疾病，如特应性和水疱性疾病，例如特应性皮炎水疱性疾病，如大疱性天疱疮、寻常性天疱疮、疱疹样皮炎、妊娠疱疹，以结节、嗜酸性粒细胞增多、风湿、皮炎和肿胀为特征的病症(NERDS)，嗜酸性脂膜炎，例如接触性皮炎，嗜酸性蜂窝织炎，节肢动物叮咬，弓蛔虫病，结节性多动脉炎，注射性肉芽肿，狼疮性脂膜炎，恶性肿瘤，糖尿病，慢性复发性腮腺炎，发作性血管性水肿伴嗜酸性粒细胞增多症，木村氏病，血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多症，嗜酸性粒细胞性筋膜炎，韦氏综合征(嗜酸性粒细胞性纤维炎)或嗜酸性脓疱性毛囊炎。

其他器官受累的嗜酸性粒细胞增多症包括肺部疾病或病症，例如慢性嗜酸性粒细胞性肺炎或急性嗜酸性粒细胞性肺炎；胃肠道疾病，例如嗜酸性胃肠道疾病(EGID)，如嗜酸性食管炎(EoE)或嗜酸性胃肠炎；肝胆疾病，如原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、嗜酸性胆管炎或嗜酸性胆囊炎；神经系统疾病，包括嗜酸性粒细胞性脑膜炎，例如由范围从真菌到蠕虫的中枢神经系统感染(例如，球孢子菌病或广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)感染)，以及对NSAID或抗生素的药物不良反应引起的；风湿性疾病，如皮肌炎、类风湿性关节炎、系统性硬化症或干燥综合征、嗜酸性粒细胞-肌痛综合征或毒油综合征、血管炎，例如Churg-Strauss综合征(CSS)、皮肤坏死性血管炎、血栓闭塞性脉管炎伴颞动脉炎嗜酸性粒细胞增多症；导致心内膜心肌损伤心脏疾病，其伴超敏反应性心肌炎发生，与GM-CSF或IL-2施用、长期药物诱导的嗜酸性粒细胞增多或寄生虫感染相关的伴嗜酸性粒细胞增多的嗜酸性粒细胞白血病、肉瘤、癌或淋巴瘤；泌尿生殖系统疾病，包括通常是由半合成青霉素、头孢菌素、NSAID、别嘌呤醇、利福平和环丙沙星药物诱导的伴嗜酸性粒细胞增多的间质性肾炎，频发血尿、排尿困难或耻骨上疼痛。

表1提供了与嗜酸性粒细胞增多相关的示例性疾病或病症。

表1

示例性抗体

基因治疗载体可编码一种或多种抗体序列，其包括但不限于下列抗体的序列：抗-IL-5或IL-5R抗体(例如，美泊利单抗、瑞利珠单抗、贝那利珠单抗(benralizumab)或MEDI-563)、抗-CD52抗体(例如，阿仑单抗)、抗-IL-4R抗体、抗-CCR3抗体、抗-IL-13或IL-13R抗体、抗-CD30抗体、抗-IL-17或IL-17R抗体、抗-RADCP抗体(参见US 20030099995)、抗-IgE抗体(例如，奥马珠单抗)、抗-CD52抗体、抗-IL-4抗体、抗-IL-33或IL-33R抗体、抗-IL-9或IL-9R抗体、抗-TNF-α抗体(例如，英夫利昔单抗)、抗-嗜酸性粒细胞趋化因子抗体、或抗-唾液酸粘附蛋白因子或抗-唾液酸粘附蛋白因子受体抗体。

示例性抗体序列(例如，可变区序列)包括但不限于下述抗体：包含与由SEQ IDNo.1或2之一编码的多肽具有至少80％、82％、84％、85％、87％、89％、90％、92％、94％、95％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的序列的多肽，或包含与SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51中任一项具有至少80％、82％、84％、85％、87％、89％、90％、92％、94％、95％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的序列的多肽，例如在SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51之一中的框架区，一个或多个CDR，或两者中(参见下文)。

抗-Siglec-F

ATGGCTGTCCTGGTGCTGTTGCTCTGCCTGCTGACATTTCCAAGCTGTGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGTCTGGTGCAGCCCTCACAGACTTTGTCTCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTAGCCAGCTATCATGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAAGGTCTGGAGTGGATGGGACTAATATGGACTGGTGGAAGCACAACATATAATTCACTTCTCAAATCCCGACTGAGCATCAGCAGGGACACCTCCAAGAGCCAAGTTTTCCTAAAGATGAACAGTCTGCAAACTGAAGACACAGCCACTTACTACTGTGCCAGAGTTGGGGGAGGGAATAGTGCGCTATACTTTGATTATTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1)

GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCACCATCGAATGTCGAGCAAGTGAGGACATTTACACCGGTTTAGCATGGTATCACCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAACTCCTGATCTATAATGCAAATAGCTTGCAGTCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACACAGTATTCTCTCAAGATAAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTCGCAAGTTATTTCTGTCAACAGTATTACAATTATCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGG(SEQ ID NO:2)

SEQ ID No.3-4如下所示：

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr Gly Ala His TrpVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Trp Ala Gly GlySer Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn SerLys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Asp Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ser Met Glu Tyr Trp Gly GlnGly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO:5)

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe GlnGln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala SerGly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr IleSer Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser TyrPro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys(SEQ ID NO:6)

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 SerThr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu ProVal Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro AlaVal Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser SerSer Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr LysVal Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro CysPro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro LysAsp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val SerHis Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser ValLeu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val SerAsn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln ProArg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn GlnVal Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu TrpGlu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp SerAsp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln GlnGly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GlnLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly(SEQ ID NO:7)

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu GlnLeu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg GluAla Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu SerVal Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr LeuSer Lys Ala Asp Tyr Glu65 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln GlyLeu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys(SEQ ID NO:8)

在表2中的抗-Siglec抗体序列，例如，SEQ ID No.9-32、40-41、4-44或46-51，其可以包含来自SEQ ID No.7、33-39、42或45中任一项所示的重链或轻链序列，包括对SEQ IDNo.52-59中任一项具有特异性的抗体。

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:9)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTT VTVSS(SEQ ID NO:10)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:12)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWLSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:14)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:15)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:16)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYGAHWIRQPPGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:18)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYGMEYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:19)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:20)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:21)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:22)

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:23)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:24)

EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:25)

EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:26)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:27)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:28)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:2)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:30)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:31)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGPGTKLDIK(SEQ ID NO:32)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:33)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:34)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:35)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:36)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:37)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:38)

QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG(SEQID NO:39)

EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:40)

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO:41)

QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:42)

EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:43)

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:44)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:45)

(带下划线的残基包含根据Chothia编号的CDR H1和H2)

EVQVVESGGDLVKSGGSLKLSCAASGFPFSSYAMSWVRQTPDKRLEWVAIISSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQM SSLKSEDTAMYYCARHETAQAAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:46)

(带下划线的残基包含根据Chothia编号的CDR H1和H2)

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYMYWVKQRPEQGLEWIGRIAPEDGDTEYAPKFQGKATVTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTEGNYYGSSILDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:47)

(带下划线的残基包含根据Chothia编号的CDR H1和H2)

QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFRSSWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGDDYTNYNGKFKGKVTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARLGPYGPFADWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:48)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLAYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:49)

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQKPDGTVKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:50)

QIVLTQSPAIVSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQRPGSSPRLLIYDTSSLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRIESEDAANYYCQQWNSDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:51)

MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRP(SEQID NO:52)

DILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVS(SEQ ID NO:53)

YPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGG(SEQ ID NO:54)

MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:55)

MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:56)

MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:57)

MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPKDDWTYSDPVHGYWFRAGDRPYQEAPVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSNDCSLSINDARKGDEGSYFFRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTALTQRPDILIQGTLESGHPRNLTCSVPWACEQRMPPMISWIGTSVSSLGPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPPWNLTVTVFQGDDTASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAENPRGSQHISLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:58)

MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPKDDWTYSDPVHGYWFRAGDRPYQEAPVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSNDCSLSINDARKGDEGSYFFRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTALTQRPDILIQGTLESGHPRNLTCSVPWACEQRMPPMISWIGTSVSSLGPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPPWNLTVTVFQGDDTASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAENPRGSQHISLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGG(SEQ ID NO:59)

对象

对象可以是任何动物，包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、奶牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，但哺乳动物被设想为对象，如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、奶牛和马。对象还可以是牲畜(如牛、猪、绵羊、家禽和马)或宠物(如犬和猫)。

在一个实施方式中，对象包括患有或处于本文所述的医学疾病和病况风险中的人类对象。通常由本领域技术人员(如执业医师)将对象诊断为患有该病况。

本文所述方法可以用于任何物种、性别、年龄、种族群体或基因型的对象。因此，术语对象包括男性和女性，并且其包括老年人、从老年人到成人过渡年龄的对象、成人、从成人到成人前期过渡年龄的对象以及成人前期，包括青少年、儿童和婴儿。

人类种族群体的实例包括高加索人、亚裔、西班牙裔、非洲裔、非洲美国人、美洲原住民、闪米特人和太平洋岛民。该方法可能更适于一些种族人群，如高加索人(特别是北欧人群)以及亚裔人群。

术语对象还包括如本文所述的任何基因型或表型的对象，只要其需要治疗即可。此外，对象可以具有任何头发颜色、眼睛颜色、皮肤颜色或其任何组合的基因型或表型。术语对象包括任何身高、体重或者任何器官或身体部位尺寸或形状的对象。

将通过下述非限制性实施例描述本发明。

实施例1

制备了编码抗-Siglec F的rh.10AAV血清型，这是一种基于小鼠的抗-小鼠嗜酸性粒细胞特异性单克隆抗体(Song等，2009；Zimmermann等，2008；Bochner等，2009)。还制备了使用抗-Siglec8的序列替代抗-SiglecF小鼠抗-嗜酸性粒细胞单克隆抗体序列的相同载体，抗-Siglec8是一种人源化的人嗜酸性粒细胞特异性单克隆抗体(Croker等，2007；Varki等，2006；Natku等，2003)。为评价LEXm03的作用，使用了一种小鼠模型，在该小鼠模型中静脉内施用了另一种AAV载体AAVrh.10mIL5，该载体遗传修饰肝脏以持续表达和分泌高水平的小鼠白介素5(IL5)，从而刺激骨髓持续产生较高的血液嗜酸性粒细胞水平(>100,000个嗜酸性粒细胞/μL³)，伴随嗜酸性粒细胞侵袭组织并最终死亡。数据表明，LEXm03在体外和体内均可诱导嗜酸性粒细胞凋亡，并显著降低CEL-NOS小鼠模型中的血液嗜酸性粒细胞水平(见图5)。这种疗法的一个结果是永久性完全抑制嗜酸性粒细胞。在人类病例报告中已观察到了这一点，可以在临床上对其进行管理(Franklin等，1981)。

CEL-NOS并不常见，约占慢性嗜酸性粒细胞增多症病例的1％(Reuter等，2017)，因此是一种罕见的孤儿疾病。以罕见的孤儿遗传性疾病为例，有几个为CEL-NOS开发有效疗法的理由。首先，CEL-NOS是一种致命病症，没有可用的治疗方法。由于很少见，没有有效的治疗方法，且表型(嗜酸性粒细胞增多)很容易测量，因而进行小规模有效性试验(初始安全性研究之后)应足以供注册之用。其次，与罕见的遗传性疾病一样，如果有效，几十万美元的定价应该是可行的。第三，rAAV是治疗多种更常见的嗜酸性粒细胞增多性疾病的平台策略。

CEL-NOS是一种致命的恶性疾病，体现了没有有效治疗的尚未满足的医疗需求。诸如酪氨酸激酶抑制剂、羟基脲、干扰素-α或皮质类固醇等疗法的尝试均告失败(Gotlieb等，2015；Helbing等，2012)。由于CEL-NOS的发病机制尚不清楚，并且器官功能丧失和最终死亡与血液中嗜酸性粒细胞水平升高以及随之而来的嗜酸性粒细胞侵入组织直接相关，因而治疗CEL-NOS的合理策略是持续不断的抑制血液中嗜酸性粒细胞的数量。当前开发针对CEL-NOS的有效疗法的策略是一种基因疗法，其使用腺相关基因治疗载体遗传修饰肝细胞以表达和分泌将结合嗜酸性粒细胞的单克隆抗体，从而引发细胞凋亡。首先，独立于表征CEL-NOS嗜酸性粒细胞增多的基本机制，该策略直接针对嗜酸性粒细胞增多，这是嗜酸性粒细胞侵入器官的原因，并因此抑制导致器官功能障碍和最终死亡的器官毒性。其次，与施用单克隆抗体本身(其与峰值和谷值相关，并且根据单克隆抗体的半衰期不同需要每2至4周施用一次)不同的是，单次施用后，在肝脏中AAV介导的单克隆抗体的基因表达将提供持续的较高效价水平的治疗性单克隆抗体。第三，尽管CEL-NOS是嗜酸粒细胞增多症的一种相对罕见的形式，但是针对CEL-NOS的策略代表了针对致命的、当前无法治愈的、对安全性特征具有较高风险的病症而最初开发的平台策略。如果对CEL-NOS安全有效，则该疗法可开发用于其他更常见的嗜酸性粒细胞增多综合征，包括由基因重排导致的嗜酸性粒细胞性白血病和多种非恶性嗜酸性粒细胞增多性疾病如嗜酸性粒细胞性血管炎，和其他自身免疫性病症、嗜酸性粒细胞增多综合征、热带肺嗜酸性粒细胞增多症以及特应性病症，包括嗜酸性食管炎和哮喘。

数据包括：(1)LEXm03(在小鼠系统中使用的治疗性载体)和AAVrh.10mIL-5(用于产生小鼠CEL-NOS模型的小鼠白介素-5载体；图1和3)的制备和表征；(2)小鼠CEL-NOS模型的表征(图3和4)；和(3)在小鼠CEL-NOS模型中LEXm03的效力(图7-8)。

剂量范围研究表明LEXm03诱导小鼠嗜酸性粒细胞凋亡。评估了LEXm03在体外和体内产生的抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体对嗜酸性粒细胞凋亡的诱导作用。在已经产生了LEXm03载体并显示其在体外和体内起作用，以及建立了所有测定法的背景下，确定在体外和体内有效诱导小鼠嗜酸性粒细胞凋亡的LEXm03剂量。对于体内评估，使用流式乳凝集素测定，以增加剂量的LEXm03作为函数，评价了在CEL-NOS小鼠模型中以增加剂量的AAVrh.10mIL5作为函数的剂量范围研究。

表2：在CEL-NOS小鼠模型中LEXm03诱导嗜酸性粒细胞凋亡能力的剂量范围评估

在同一时间，通过尾静脉向BALB/c小鼠静脉内施用The AAVrh.10mIL-5和LEXm03。用不同剂量的AAVrh.10mIL5诱导不同的血液嗜酸性粒细胞水平。对于每个AAVrh.10mIL5剂量，检测了3个剂量的LEXm03，例如9个不同的组合。在每个2种载体的配对中，将在2个时间点(4和8周)评价n＝5只小鼠。

流式细胞术乳凝集素测定，见图5。

使用LEXm03，扩大初步小鼠有效性研究，研究表明，静脉内施用剂量范围研究的量的LEXm03可对肝细胞进行基因修饰，从而分泌在CEL-NOS的AAVrh.10mIL5小鼠模型中足以显著抑制血液嗜酸性粒细胞水平的抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体，其减少了嗜酸性粒细胞的组织浸润并降低了发病率和死亡率。

详细方法

LEXm03(AAVrh.10mAnti-Eos)。该载体包含非人类灵长类动物来源的rh.10衣壳，该衣壳被包绕抗-Siglec-F表达盒的AAV2反向末端重复序列假型化。该表达盒由带有巨细胞病毒(CMV)增强子的鸡-β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)、抗-Siglec-F cDNA序列(克隆9C7，大鼠IgG2b)和家兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号组成。抗Siglec-F cDNA序列被优化，以提高mRNA的稳定性并减少被小鼠偏向密码子的突变型mRNA反式抑制的可能性，同时除去mRNA不稳定元件、低(<30％)或高(>80％)GC区、在编码区中的翻译起始序列和潜在剪接信号。在CAG启动子控制下，合成优化的全长抗-Siglec-F cDNA序列并克隆进入pAAV质粒。通过将pAAV质粒与携带载体复制所需的来自AAV2的AAV Rep蛋白、AAVrh.10病毒结构(Cap)蛋白VP1、2和3(其定义了产生的rh.10AAV载体的血清型)以及具有腺病毒辅助功能的E2、E4和VARNA的质粒共转染进入人胚肾293T细胞(HEK 293T；美国模式培养物保藏中心)中生产AAVrh.10m.anti-Eos载体。通过如前所述的碘克沙醇梯度和QHP阴离子交换色谱纯化AAVrh.10m.anti-Eos载体。通过定量TaqMan实时PCR分析确定载体基因组滴度。将编码抗炭疽保护性抗原抗体的载体(AAVrh.10mIgG对照)作为体内研究的对照。

AAVrh.10mIL-5。小鼠IL-5的序列获自Genbank(NM_010558.1)。AAVrh.10mIL-5载体包含非人类灵长类动物来源的rh.10衣壳，该衣壳被包绕小鼠IL-5表达盒的AAV2反向末端重复序列假型化。该表达盒由带有巨细胞病毒(CMV)增强子的鸡-β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)、IL-5cDNA序列和家兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号组成。抗mIL-5cDNA序列被优化，以提高mRNA的稳定性并减少被小鼠偏向密码子的突变型mRNA反式抑制的可能性，同时除去mRNA不稳定元件低、(<30％)或高(>80％)GC区、在编码区中的翻译起始序列和潜在剪接信号。在CAG启动子控制下，合成优化的全长mIL-5cDNA序列并克隆进入pAAV质粒。如针对LEXm03所述，通过共转染进入人胚肾293T细胞生产AAVrh.10mIL-5载体。

BALB/C小鼠中AAVrh.10m.anti-SiglecF的体内表达。为评估LEXm03在体内针对抗-Eos的表达情况，注射给予(静脉注射100μL)6至8周龄雌性Balb/C小鼠一剂AAVrh.10m.anti-Eos(剂量见表2)或者AAVrh.10mIgG对照和100μl PBS对照。从尾静脉收集血液(100μL)，在23℃下凝血，然后以5,000RPM离心10分钟以收集血清。在0周以及在8周过程中的时间点，根据生产厂商提供的方案进行ELISA(Abcam)以测量抗-SiglecF。

IL-5小鼠模型。为了快速、可靠地制备CEL-NOS小鼠模型以检测载体的有效性，由AAVrh.10载体(AAVrh.10m.IL-5)过表达小鼠IL-5。通过ELISA(Abcam)测量，静脉内施用增加剂量的AAVrh.10mIL-5(10⁸、10⁹、10¹⁰gc)后，血清中的mIL-5水平以剂量依赖性的方式升高。

乳凝集素测定。使用抗-CCR3对从同时给予AAVrh.10mIL-5(2.5x10¹⁰ gc)±LEXm03或AAVrh.10mIgG对照(10¹¹gc)的小鼠中分离的白细胞(WBC)进行染色，以鉴定嗜酸性粒细胞，并与乳凝集素进行孵育(其结合暴露的磷脂酰丝氨酸)以鉴定早期凋亡细胞并通过流式细胞术进行分析。

嗜酸性粒细胞计数。每2周监测一次外周血液绝对嗜酸性粒细胞计数，其中使用ADVIA血液系统细胞计数仪并使用苏木素和伊红对血液涂片染色。

存活情况。注射载体后，每天观察小鼠的健康状况恶化迹象。如果认为小鼠处于濒死状态(剧烈摇动、呼吸困难、喘息、发绀和刺激后无活动；全部无法恢复)，则将其处死并记录死亡日期。

器官损伤/功能。处死时，通过心脏穿刺收集血液后，评估器官损伤生物标志物的血液水平。将样品离心(15分钟，4℃，500g)并收集血清。测量血清中以下生化参数，作为多器官损伤或功能障碍的标志物：肝脏-血清天冬氨酸转移酶(AST)；肾脏-血液尿素氮(BUN)；心脏-肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)；内皮-血清内皮细胞特异性分子(ELISA，小鼠内皮细胞特异性分子DuoSet,R&D Systems)；全身性炎症-肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。

组织中的嗜酸性粒细胞浸润情况(免疫荧光)。将收集的小鼠器官立即置于Carnoy溶液(60％EtOH、30％氯仿和10％乙酸)中2小时，然后置于100％EtOH 1小时和70％EtOH中进行长期保存。对器官进行石蜡包埋并使用Histoserv(Germantown,MD)进行组织切片。用Histoclear(Fisher-Scientific)将玻片脱蜡，再水化并置于88℃的蒸汽浴中20分钟以修复抗原。然后，使用超级封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific)在4℃下封闭组织切片1小时，随后使用一抗(家兔抗-小鼠MBP多克隆Ab(Mybiosource))在4℃下孵育过夜，其中一抗在含3％FBS、0.1％皂苷的PBS中为20μg/ml。随后，使用二抗(驴抗-家兔IgG-Alexa fluor647(Invitrogen))在4℃下孵育组织切片1小时，其中二抗在含3％FBS、0.1％皂苷的PBS中为6μg/ml。随后，使用含DAPI(Thermo Fisher Scientific)的ProLong Gold防褪色试剂将组织切片封片，并使用Zeiss Axiovert 200M荧光显微镜通过荧光显微镜进行评价。

统计学。两项具有n＝5只小鼠/测定参数亚组的研究；这个数量为有效性研究提供了统计学把握度，其能够得出异常结果，同时有合理的机会看到显著的作用。例如，如果我们断言一个变量作为结局测量指标，则我们可以证明每组使用n＝5可以使我们有很好的机会观察治疗作用。如果我们断言两组测量结果变异系数均为60％，则n＝5/组可提供在95％把握度下p<0.05的两组平均得分差异3.2倍的能力。除非另有说明，否则所有数据均以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。将使用双侧Student t检验分析组间差异。

实施例2

嗜酸性粒细胞是高度专化的骨髓来源的粒细胞，在对抗寄生虫和其他病原体中发挥作用。在正常个体中，嗜酸性粒细胞占白细胞的<5％，其在循环中持续8-12小时，并在组织中存活8-12天。如果嗜酸性粒细胞侵入组织的数量足够多，则由于其释放细胞毒性介质而引起器官损伤和功能障碍。

慢性嗜酸性粒细胞白血病非特指型(CEL-NOS)是一种致命性病症，尚无有效的治疗方法。本文描述了用于CEL-NOS以及其他嗜酸性粒细胞疾病的疗法，其采用腺相关病毒基因治疗载体以遗传修饰哺乳动物(例如肝脏)中的细胞，以产生持久水平的抗嗜酸性粒细胞抗体，其诱导嗜酸性粒细胞的程序性细胞死亡。

CEL-NOS是一种慢性嗜酸性粒细胞白血病的亚型，其中血液嗜酸性粒细胞持续升高>1.5x10³/μL，与费城染色体阴性的骨髓成纤维细胞增多、BCR-ABL、PD6FRB重排、FIP1L1-PDGFRA融合、PDGF2A或PGFR1、其他克隆细胞遗传异常骨髓增生性肿瘤相关。发病机制是未知的。其通常影响中位年龄为62岁的个体，其特征是与嗜酸性粒细胞浸润相关的器官功能障碍、体重减轻、咳嗽、腹泻、脾肿大、肝肿大、心脏和肺部功能障碍，以及生存期为约2年。CEL-NOS对酪氨酸激酶抑制剂、羟基脲、干扰素-α或皮质类固醇均无反应。

由于CEL-NOS的发病机理尚不清楚，因而最直接的疗法是抑制血液中嗜酸性粒细胞的数量，从而抑制嗜酸性粒细胞的组织侵袭和器官功能障碍。确定了使用编码抗嗜酸性粒细胞单克隆抗体的腺相关病毒(AAV)载体对示例性嗜酸性粒细胞疾病(例如CEL-NOS)进行基因治疗的有效性。静脉内施用AAVrh.10mAnti-Eos(LEXm03)以遗传修饰细胞(例如，肝细胞)，以表达和分泌小鼠特异性嗜酸性粒细胞单克隆抗体(例如，具有由SEQ ID NO:1或2或者这两者编码的序列)，以诱导小鼠嗜酸性粒细胞凋亡。LEXh03编码对人嗜酸性粒细胞具有特异性的人源化抗-嗜酸性粒细胞单克隆抗体，例如具有由SEQ ID NO:5、6或8或其组合编码的序列。可以使用其他抗体序列，例如SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51中的任何一个，或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的序列，例如在其框架序列或一个或多个CDR中。在一个实施方式中，所述抗体具有与SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的可变区序列，其在一个或多个框架序列或一个或多个CDR中包括相对于SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51的1、2、3、4或5个取代，或其任何组合。

为评估LEXm03的作用，使用另一种AAV载体(AAVrh.10mIL5)制备了CEL-NOS小鼠模型，该AAV载体经静脉内施用以遗传修饰肝脏，以使其表达并持续分泌高水平的小鼠白介素(IL5)，从而其刺激骨髓持续产生高水平的血液嗜酸性粒细胞(>100,000个嗜酸性粒细胞/μL)，伴随组织被嗜酸性粒细胞侵袭并最终导致死亡。数据表明LEXm03在体外和体内诱导嗜酸性粒细胞凋亡，并且显著降低血液嗜酸性粒细胞的水平。

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所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本申请。尽管前述说明书中已经依据本发明的某些优选实施方式描述了本发明，并且出于说明的目的已经阐述了很多细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，本发明易于受其他实施方式的影响，且在不脱离本发明基本原理的情况下，可以对本申请所述的某些细节进行相当大的改变。

Claims

1.一种抑制或治疗哺乳动物中的嗜酸性粒细胞增多性疾病或病症的方法，所述方法包括：以抑制或治疗所述哺乳动物中的所述嗜酸性粒细胞增多性疾病或病症的有效量向所述哺乳动物施用包含病毒表达载体的组合物，所述病毒表达载体包含编码抗体的开放阅读框，所述抗体结合嗜酸性粒细胞上的配体或结合当存在于所述哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述疾病是癌症、哮喘、食道炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、感染性疾病、变应性或特应性疾病、胃肠炎、肝胆疾病、脑膜炎、心脏病症、泌尿生殖系统病症、免疫缺陷、内分泌病症、肺部病症、皮肤病、类风湿性关节炎或血管炎。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症是白血病。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述量有效地降低所述哺乳动物中的嗜酸性粒细胞的百分比至少1％、5％、10％、30％、50％或高达90％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述病毒表达载体是腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述AAV是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗体是嵌合的，人源化的，scFv，Fv，Fab’，含有一个V_L、一个V_H抗原结合结构域和一个或两个恒定结构域的单链分子或全人抗体。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗体结合嗜酸性粒细胞上的配体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述配体包含碳水化合物。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述配体是唾液酸粘附素家族成员。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述抗体结合唾液酸结合Ig样凝集素8。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述病毒表达载体编码抗体，所述抗体包含含有与由SEQ ID NO:1或2编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽和任选地含有与SEQ ID NO:3或4具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽，或其组合。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述表达载体编码抗体，所述抗体包含含有与包含SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽，或其任何组合。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述病毒表达载体编码具有IgG恒定区的抗体。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述病毒表达载体编码抗体，所述抗体包含含有λ轻链恒定区的多肽。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述表达载体编码抗体，所述抗体包含含有κ轻链恒定区的多肽。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述组合物是全身施用的。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述组合物是静脉内施用的。

20.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述组合物是向中枢神经系统或颅内施用的。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述抗体是由内源性病毒启动子表达的。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述内源性启动子被修饰为可诱导的。

23.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述抗体是由在所述病毒载体中的外源性启动子表达的，所述外源性启动子与所述开放阅读框可操作地连接。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述启动子是可诱导的。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述病毒表达载体还包含自杀基因。

26.一种药物制剂，所述药物制剂包含一定量的含有表达载体的分离的重组慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或AAV，所述表达载体包含编码抗体的开放阅读框，所述抗体结合嗜酸性粒细胞上的配体或结合当存在于哺乳动物中会增加嗜酸性粒细胞数量的分子，所述量有效地减少哺乳动物中嗜酸性粒细胞的数量。

27.根据权利要求26所述的药物制剂，其中所述抗体包含含有与由SEQ ID NO:1或2编码的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽或含有与包含SEQ ID No.3-6、8-32、40-41、43-44或46-51之一的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性的序列的多肽。

28.根据权利要求26所述的药物制剂，其中所述抗体结合Siglec-8、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-9、IL-9R、IL-13、IL-13R、IL-17、IL-17R、IL-33、IL-33R、CD30、CD52、CCR3、IgEFc、RADCP或TNF-α。

29.根据权利要求26、27或28所述的药物制剂，所述药物制剂被配制成用于静脉内递送。