WO2013063876A1 - 一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心elisa试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心elisa试剂盒及其制备方法 Download PDF

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WO2013063876A1
WO2013063876A1 PCT/CN2012/070303 CN2012070303W WO2013063876A1 WO 2013063876 A1 WO2013063876 A1 WO 2013063876A1 CN 2012070303 W CN2012070303 W CN 2012070303W WO 2013063876 A1 WO2013063876 A1 WO 2013063876A1
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antibody
spc
lung cancer
well
small cell
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PCT/CN2012/070303
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潘世扬
黄珮珺
王芳
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Pan Shiyang
Huang Peijun
Wang Fang
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung

Definitions

  • the invention belongs to the field of biological sample detection, and relates to a double antibody sandwich ELISA kit for detecting non-small cell lung cancer and a preparation method thereof. Background technique
  • Lung cancer is one of the most malignant tumors with the highest morbidity and mortality in humans. More than 1.5 million lung cancers occur worldwide each year, 80% of which are non-small cell lung cancer (NSCLC).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • Non-small cell lung cancer including squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and large cell carcinoma, has slower cell growth and division and a relatively late diffusion and metastasis compared with small cell carcinoma.
  • the 5-year survival rate of lung cancer is still less than 15%.
  • Another object of the present invention is to provide a method of preparing the ELISA kit.
  • a double antibody sandwich ELISA kit for detecting non-small cell lung cancer comprising the following components:
  • the double antibody sandwich ELISA kit for detecting non-small cell lung cancer preferably comprises the following composition: anti-human non-small cell lung cancer monoclonal antibody NJ001-1 5 secreted by a hybridoma cell line with the accession number CCTCC NO: C201172 -10 ⁇ , anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody-coated plate, horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG 5-10 ⁇ , antibody dilution 1% PBS 40-50 mL, Washing solution 40-50 mL, stop solution 2 MH 2 S0 4 8-10 mL, TMB substrate coloring solution A, B solution 8-10 mL each, positive control: SPC-Al lysate 400-600 ⁇ , negative control : Human AB serum or fetal bovine serum 400-600 ⁇ L and blank control: 1% PBS 1-2 mL.
  • the anti-human non-small cell lung cancer cell secreted by the hybridoma cell line with the accession number of CCTCC NO: C201172 The concentration of the cloned antibody NJ001-1 was 200 mg/L.
  • the anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody was prepared by the following method: First immunization of New Zealand rabbits with lxlO 8 SPC-A1 cells, followed by booster immunization once every other week, the immunization dose was 3x10 8 Cells, blood samples were collected from the ear vein before each immunization, and serum antibody titers were detected by indirect ELISA. After the antibody titer was greater than or equal to 1:300 000, the abdominal aorta was bled, and the rabbit blood was placed at 37 °C for 1 h. Then transfer to 4 °C overnight, and after the blood is fully contracted, the serum is quickly separated and centrifuged at 3 000 r/min for 30 min at 4 °C. The supernatant is collected and purified by Protein A affinity chromatography. The price is 1:150 000-1:170 000.
  • the anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody-coated plate was prepared by the following method: The purified anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody was diluted to a target concentration of 0.63 with a carbonate coating buffer of pH 9.6. ⁇ glmU Mix the diluted antibody solution into microwells, 100 ⁇ ! well, overnight at 4 °C; wash the plate 3 times; add 3% BSA blocking solution, 300 ⁇ ! well, overnight at 4 °C; 3 times.
  • the pH 9.6 carbonate coating buffer Na 2 C0 3 1.59 g, NaHC0 3 2.93 g, add ddH 2 0 to 1 L, and finally adjust the pH to 9.6 with 10 M NaOH, and mix.
  • the lotion formulation is: 2.0 g NaCl; 0.2 g KH 2 P0 4 ; 2.9 g Na 2 HP0 4 '12H 2 0; 0.2 g KC1; 0.2 g NaN 3 ; 40 mL ddH 2 0; 0.5 mL Tween- 20, add ddH 2 0 to 1 L before use;
  • SPC-A1 lysate preparation method SPC-A1 is placed in a six-well plate at a concentration of 1 X 10 6 /mL; after the cells are covered with the bottom of the hole Discard the culture solution, add 2% PBS in 4% C pre-cooled, 2 mIJ well; add 150 ⁇ of lysate to each well and place on the shaker; after 30 min, scrape the adherent cells with a pipette tip and collect The lysate was centrifuged in a 1.5 mL EP tube at 13 000 g for 10 min; the supernatant was removed and stored at -20
  • the preparation method of the double antibody sandwich ELISA kit for detecting non-small cell lung cancer comprises the following steps:
  • the supernatant was collected and purified by Protein A affinity chromatography.
  • the purified titer was 1 : 150 000-1: 170 000, concentration 14.77 g/mL;
  • Anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody-coated plate the purified anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody was diluted to a target concentration of 0.63 g/mL with a carbonate coating buffer of pH 9.6; Mix well with good liquid and add to the wells, 100 ⁇ ! well, overnight at 4 °C; wash plate 3 times, 200 ⁇ ! well; add 3% BSA blocking solution, 300 ⁇ ! well, overnight at 4 °C; Plate 3 times, 200 L / hole; -20 ° C preservation;
  • Kit assembly The anti-human non-small cell lung cancer monoclonal antibody NJ001-1 5-10 ⁇ L secreted by the hybrid cell line deposited under the accession number CCTCC NO: C201172, anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody package 1 plate of enzyme plate, horseradish peroxidase labeled goat anti-mouse IgG 5-10 ⁇ , antibody dilution 1% PBS 40-50 mL, lotion 40-50 mL, stop solution 2M H 2 SO 4 8-10 mL, TMB substrate coloring solution A, B solution 8-10 mL each, positive control: SPC-A1 lysate 400-600 ⁇ L, negative control: human AB serum or fetal bovine serum 400-600 ⁇ L and blank Control: 1% PBS 1-2 mL assembled into a kit.
  • the pH 9.6 carbonate coating buffer Na 2 C0 3 1.59 g, NaHC0 3 2.93 g, add ddH 2 0 to 1 L, and finally adjust the pH to 9.6 with 10 M NaOH, and mix.
  • the invention successfully prepares the monoclonal antibody NJ001-1 which can specifically recognize non-small cell lung cancer, and firstly confirms that the expression level of NJ001-1 related target antigen in the serum of lung adenocarcinoma patients is significantly higher than that of healthy physical examination by Western blot. Then, the New Zealand rabbit was immunized and purified to obtain a high titer anti-SPC-A1 polyclonal antibody, and the polyclonal antibody and NJ001-1 monoclonal antibody were combined to establish a double antibody sandwich ELISA kit, and finally the kit was used for a large number of clinical samples. Conduct testing and analysis.
  • A: 2, 3, and 6 are serum samples from three healthy subjects, 4 and 5 are serum samples from two lung adenocarcinoma patients, and 1 is SPC-A1 cell lysate (positive control);
  • B 1 is a patient with lung adenocarcinoma
  • 2 is a healthy physical examination
  • 3 is a positive control.
  • Figure 4 is a checkerboard method to determine the optimal working concentration of coated antibody and NJ001-1. Preservation information for raw materials
  • Hybridoma cell line NM001-1 was deposited with the China Center for Type Culture Collection on August 31, 2011. The deposit address is Wuhan, China, Wuhan University, and the deposit number is CCTCC NO: C201172o Actually fc ⁇ :
  • human lung cancer cell lines SPC-A1, A549, NCI-H460, NCI-H520, human hepatoma cell line HepG2, human breast cancer cell line ZR-75-30, human Colon cancer cell line Colo205 and human embryonic lung fibroblast cell line WI-38 were purchased from the Chinese Academy of Sciences cell bank; SP2/0 mouse myeloma cell line was preserved in our laboratory; female BALB 6-8 weeks old and 8-10 weeks old /c mice were purchased from Shanghai Slack Laboratory Animals.
  • the cell culture method involved in the following examples is as follows: The cells are respectively grown in DMEM or RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum, penicillin and streptomycin, respectively, 37 V, 5% C0. 2 Culture in a constant temperature incubator. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained from healthy blood donors and isolated using conventional lymphocyte separation fluid.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Sample preparation 2 mL of venous blood was collected from the blood collection tube of serum separation gel, centrifuged at room temperature 3 000 r/min for 10 min, and the supernatant serum was transferred, and then centrifuged at 4 °C, 16 OOOxg for 10 min to absorb the upper cell-free serum. Pack 200 ⁇ each tube and store at -70 °C. The above operation was completed within 2 hours after the specimen was collected.
  • mice Female BALB/c mice were immunized 3 times with 2x10 6 SPC-A1 cells/intraperitoneal injection for 2 weeks. The mice were subjected to internal hemorrhage before each immunization, and the serum antibody titer of the mice was detected by indirect cell ELISA. When the serum antibody titer of the immunized mice reached the maximum and no longer increased, the mouse spleen cells were fused for fusion. d boost the immunization once.
  • mice 8-8 weeks old female BALB/c mice were injected intraperitoneally with 0.5 mL paraffin oil. After 10 days, the well-grown hybridoma cells NM001-1 (CCTCC NO: C201172) were injected intraperitoneally for about / 6 /only, 1-2 weeks. After ascites was aspirated, after 37 °C, at 4 °C overnight, the ascites was centrifuged the next day, purified by Protein G affinity chromatography column to obtain purified monoclonal antibody NJ001-1; antibody ratio of glycerol to water Dissolve in a 1:1 liquid with a final concentration of 200 mg/L.
  • the monoclonal antibody Ig subclass Purify the mAb with PBS 1:10 000 and follow the instructions in the assay kit.
  • the monoclonal antibody NJ001-1 is subclass IgG and the light chain is ⁇ chain.
  • the purified monoclonal antibody NJ001-1 was diluted with PBS, and each was added to a 96-well plate coated with SPCA1 cells, and the OD 45Q value was determined by indirect cell ELISA. The maximum dilution of the monoclonal antibody that can react with the coated cells is its potency.
  • the monoclonal antibody NJ001-1 has a titer of 4x10 6 for the preparation of the kit of the present invention.
  • the serum of 3 patients with lung adenocarcinoma and 2 healthy subjects were randomly selected, and albumin and IgG in serum were removed by Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit, and the samples were concentrated by cold ice ketone method.
  • the concentrated sample was loaded onto 12% SDS-PAGE gel for protein separation, and then the protein was transferred to a PVDF membrane and sealed with 5% skim milk at room temperature. Closed for 2 h, and then incubated with NJ001-1 monoclonal antibody diluted 1:1000 and 1:400 diluted GAPDH antibody 4 shaker overnight, and the membrane was removed and rinsed 3 times with lxTBST, and 1:3 000 diluted goat anti-mouse was added.
  • the second antibody was incubated for 2 h at room temperature shaker, and washed with LxTBST for 3 times for ECL color development.
  • the expression level of NJ001-1-related target antigen in serum of patients with lung adenocarcinoma was significantly higher than that of healthy subjects, as shown in Fig. 2A, and the results of grayscale analysis are shown in Fig. 2B.
  • Example 3 Preparation of anti-SPC-A1 polyclonal antibody
  • New Zealand rabbits were injected with ear veins with lxlO 8 SPC-A1 cells, and then boosted once every other week, the immunization dose was 3 ⁇ 10 8 cells.
  • Blood was collected from the ear vein before each immunization, and indirect ELISA (supplemented with SPC-A1 cells at a concentration of lxlO 5 cells/well, the pre-immune serum and the collected serum were separately scaled from 1:5 000.
  • the serum antibody titer was determined by horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG as a secondary antibody and OD 45 () more than 2.1 times the serum maximum dilution of the negative control well as the serum titer).
  • the abdominal aorta is bled.
  • the rabbit blood is placed at 37 ° C for 1 h, and then transferred to 4 ° C overnight. After the blood is fully contracted, the serum is rapidly separated and at 4 °. After centrifugation at C, 3 000 r/min for 30 min, the supernatant was collected and purified by Protein A affinity chromatography. After purification, the titer was 1:160 000, see Figure 3, and the concentration was 14.77 g/mL.
  • Example 4 Determination of the optimal working concentration of coated antibody and primary antibody
  • the working concentration of the coated antibody and the primary antibody was determined by a checkerboard titration experiment.
  • the coated antibody (anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody, 14.77 mg/mL) was diluted to 2.50, 1.25, 0.63 and 0.31 g/mL coated with a coating buffer (pH 9.6), 100 per well, 4 °C overnight; wash the plate 3 times with the washing solution; 3% BSA per well 300 ⁇ , block overnight at 4 °C, obtain anti-SPC-A1 polyclonal antibody coated ELISA plate; wash the plate with the washing solution, add Serum, 50 ⁇ per well, incubate at 37 °C for 2 h, wash the plate 5 times; use primary antibody (monoclonal antibody NJ001-1, 200 mg/L) with 1% PBS (antibody dilution) for 1:3 1000, 1:4 000, 1:5 000 and 1:6 000 dilution, 100 ⁇ L per well, incubate at 37 ° C for 1
  • the OD value was read using a Model 550 enzyme-linked enzyme analyzer (Bio-Rad) at a reading wavelength of 450 nm.
  • Positive, negative and blank controls were SPC-A1 lysate, human AB serum or fetal bovine serum and 1% PBS o.
  • the concentration of the antibody and primary antibody is the optimal working concentration. The results showed that when the concentration of the coated antibody was 0.63 g/mL, and the dilution resistance was 1:4,000, the target antigen could be bound as much as possible, and the P/N value was the largest (9.8), as shown in Fig. 4.
  • the preparation method of each reagent involved in the above method :
  • TMB substrate color developing solution purchased from Shanghai Kehua Company
  • washing solution 2.0 g NaCl; 0.2 g KH 2 P0 4 ; 2.9 g Na 2 HP0 4 -12H 2 0; 0.2 g KC1; 0.2 g NaN 3 ; 40 mL ddH 2 O; 0.5 mL Tween-20, before use Add dd3 ⁇ 40 to 1 L.
  • SPC-A1 was placed in a six-well plate (concentration of lxlO 6 / mL); After the cells were covered with the bottom of the well, the culture solution was discarded, and pre-cooled with 1% PBS at 4 °C. Two times, 2 mIJ wells; 150 ⁇ of lysate was added to each well and placed on an oscillator; after 30 min, adherent cells were scraped with a pipette tip, and the lysate was collected in a 1.5 mL EP tube and centrifuged at 13 000 g for 10 min. ; Leave the supernatant and store at -20 °C after dispensing.
  • Antibody dilution 1% PBS 8 g NaCl; 2.2 g KC1; 1.44 g Na 2 HP0 4 ; 0.24 g KH 2 P0 4 ; add ddH 2 0 to 800 mL.
  • Carbonate coating buffer pH 9.6 Na 2 C0 3 1.59 g , NaHC03 2.93 g, add distilled water to 1 L, and finally adjust the pH to 9.6 with 10 M NaOH, and mix well.
  • a double antibody sandwich ELISA kit for detecting non-small cell lung cancer comprising the following components: The anti-human non-small cell lung cancer monoclonal antibody NJ001-1 5 secreted by the hybridoma cell line prepared under the accession number CCTCC NO: C201172 ⁇ L, anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody-coated 96-well microtiter plate, horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG 5 ⁇ L, wash solution 40 mL, stop solution 2 MH 2 S0 4 8 mL, TMB bottom 8 mL of each of the chromogenic solutions A and B, positive control: SPC-A1 lysate 500 ⁇ , negative control: human sputum serum or fetal bovine serum 500 and blank control: 1% PBS 1 mL, antibody dilution 1% PBS 50 mL.
  • Stop solution, TMB substrate color developing solution purchased from Shanghai Kehua Biological Engineering Co., Ltd.
  • the anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody-coated plate was prepared by the following method: The purified anti-SPC-A1 rabbit polyclonal antibody was diluted to a target concentration of 0.63 with a carbonate coating buffer of pH 9.6. g/mL; Mix the diluted antibody solution into microwells, 100 ⁇ ! well, overnight at 4 °C; wash plate 3 times, 200 ⁇ ! well; add 3% BSA blocking solution, 300 ⁇ ! well, 4 °C overnight; wash plate 3 times, 200 ⁇ ! well; store at -20 °C.
  • the kit prepared in Example 5 stored at -20 ° C was taken out from the refrigerator, and the serum to be tested, the positive control (SPC-A1 lysate), and the negative control (human AB serum or fetal bovine serum) were placed on ice to melt; Remove the coated ELISA plate and recover the relevant reagents To room temperature; After the serum is thawed, invert and mix, centrifuge; take the serum supernatant to be added to the microwell, add positive control, negative control, blank control each 50 ⁇ / well; incubate at 37 °C for 2h, remove the ELISA Plate wash plate 5 times, 200 ⁇ !
  • the results of double antibody sandwich ELISA showed that the positive rates of lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, small cell lung cancer and benign lung disease were 63.1% (123/195), 47.8 (33/69), 20.5, respectively. %(8/39) and 12.0%(6/50) were significantly higher than healthy ones, and the positive rate of P non-small cell lung cancer group (lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma) was significantly higher than that of small cell lung cancer group (59.1%). Vs 20.5%, P ⁇ 0.05) and benign lung disease (59.1% vs 12.0%, P ⁇ 0.05).
  • the positive rate of lung adenocarcinoma in non-small cell lung cancer group was significantly higher than that in lung squamous cell carcinoma group (63.1% vs 47.8%, P ⁇ 0.05).
  • 124 had clear pathological stage, of which early group
  • the positive rates of ( ⁇ / ⁇ ) and late group (IIMV) were 63.3% (19/30) and 79.8 (75/94), respectively, and the results showed that the method was highly detectable in early lung adenocarcinoma cases.
  • the rate helps early diagnosis of lung adenocarcinoma.
  • Small cell lung cancer group 39 8 (20.5) * ⁇ 31 (79.5) pulmonary benign disease group 50 6 (12.0) * ⁇ 44 (88.0) healthy control group 500 22 (4.4) * ⁇ . ⁇ 478 (95.6) Note: *Compared with the positive rate of lung adenocarcinoma group, ⁇ 0.05; ⁇ Compared with the positive rate of lung squamous cell carcinoma group, ⁇ 0.05; ⁇ and small cell lung cancer group positive rate comparison, ⁇ 0.05; Compared with the positive rate of benign lung disease group, ⁇ 0.05 Example 7
  • the samples were subjected to simultaneous detection of serum CEA, NSE and CYFRA21-1 by a chemiluminescence method sensitive to the ELISA method, and compared with the double antibody sandwich ELISA method based on the double antibody sandwich ELISA kit of the present invention.
  • Sensitivity The positive rate of double antibody sandwich ELISA based on the double antibody sandwich ELISA kit of the present invention in non-small cell lung cancer was 59.1% (156/264), which was significantly higher than CEA, NSE and B.
  • the positive rate of CYFRA21-1 (41.3%, 17.4%, and 37.1%), the detection of NJ001-1 related target antigen by the kit of the present invention is more sensitive than the detection of the corresponding target antigen by CEA, NSE and CYFRA21-1. ;
  • the positive rate of double antibody sandwich ELISA based on the double antibody sandwich ELISA kit of the present invention for small cell lung cancer patients, benign lung diseases patients and healthy physical examinations was 20.5%, 12.0% and 4.4%, respectively.
  • the CEA positive rate was 25.6%, 14.0% and 5.8%
  • the positive rate of NSE was 56.4%, 18.0% and 9.8%
  • the positive rate of CYFRA21-1 The detection of NJ001-1 related target antigen by the kit is 23.1%, 16.0% and 6.4%), so the detection of the target antigen of NJ001-1 is better than that of CEA, NSE and CYFRA21-1.
  • Table 3 ELISA detection of NJ001-1 related target antigen and chemiluminescence detection of three tumor markers positive rate positive rate
  • lung adenocarcinoma the positive rate of NJ001-1-related target antigen in serum of 195 patients with lung adenocarcinoma was 63.1%, which was significantly higher than that in the double antibody sandwich ELISA kit according to the double antibody sandwich ELISA kit of the present invention. Electrochemiluminescence method (CEA 45.1%, NSE 15.9, Hekou CYFRA21-1 33.8%), ⁇ ⁇ 0.05.
  • the positive rate of 266 patients with non-small cell lung cancer detected by electrochemiluminescence combined with CEA, NSE, and CYFRA21-1 was 59.5% (157/264);
  • the double antibody sandwich ELISA kit of the double antibody sandwich ELISA kit of the invention can detect the NJ001-1 related target antigen single detection, and can achieve a nearly positive detection rate of 59.1% (156/264). 6.
  • the serum of 10 patients with non-small cell lung cancer was mixed and tested continuously for 20 times by the double antibody sandwich ELISA kit prepared in Example 5. Another test was performed once a day for 20 days. The results showed that the batch was The CV% between batches was 2.24% and 2.52%, respectively, both within the allowable error range (CV% ⁇ 2.5% in batch, CV% ⁇ 3.3% in batch), so the method has high precision and good repeatability.
  • Stability The double antibody sandwich ELISA kit prepared in Example 5 was stored at -20 °C for 30 days, 90 days, and 270 days, respectively, and then high-level samples (mixed serum of 10 non-small cell lung cancer patients) and low levels. Samples (mixed serum from 10 healthy subjects) were tested at high levels of samples. % is 1.83%, low level sample. % is 2.11%, both are less than 3.3%, indicating that the kit has good stability.

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Abstract

本发明公开了一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法。该试剂盒，包含如下组成：保藏号为CCTCCNO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，抗体稀释液：1%PBS，洗液，终止液2MH2SO4，TMB底物显色液，阳性对照：SPC-A1裂解液，阴性对照：人AB血清或胎牛血清和空白对照1%PBS。与现有检测方法比较，该试剂盒用于非小细胞肺癌的检测具有最好的敏感性（59.1%）和特异性（4.4%），同时具有较好的精密度和稳定性。

Description

一种用于检测 4^小细 J»癌的双抗体夹心 ELISA试剂^ ¾其制备
技术领域
本发明属于生物样品检测领域， 涉及一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试 剂盒及其制备方法。 背景技术
肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，全球每年肺癌发生超过 150 万例,其中 80%为非小细胞肺癌 （NSCLC)。 非小细胞型肺癌， 包括鳞癌、 腺癌、 大细胞癌， 与小细胞癌 相比其癌细胞生长分裂较慢， 扩散转移相对较晚。尽管诊治技术日新月异， 肺癌的 5年生存率 仍不到 15%。 要提高肺癌患者的生存率， 早期诊断尤其重要。 单克隆抗体具有高度特异性，在 肿瘤诊断和治疗方面都成为当前的研究热点。 发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒。
本发明的另一目的是提供该 ELISA试剂盒的制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 包含如下组成：
保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1 , 抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的 96孔酶标板， 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG， 抗体稀释液： 1 PBS, 洗液， 终止液 2 M H2S04， TMB底物显色液， 阳性对照： SPC-A1裂解液， 阴性对 照： 人 AB血清或胎牛血清和空白对照： 1% PBS。
所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 优选包含如下组成： 保藏号为 CCTCC NO: C201172 的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1 5-10 μί，抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板 1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 5-10 μΙ^， 抗体稀释液为 1% PBS 40-50 mL， 洗液 40-50 mL， 终止液 2 M H2S04 8-10 mL， TMB 底物显色液 A、 B液各 8-10 mL， 阳性对照： SPC-Al裂解液 400-600 μί， 阴性对照： 人 AB 血清或胎牛血清 400-600 μL和空白对照： 1% PBS 1-2 mL。
其中，所述的保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单 克隆抗体 NJ001-1浓度为 200 mg/L。
所述的抗 SPC-A1兔多克隆抗体的通过如下方法制备： 首次免疫用 lxlO8个 SPC-A1细胞 对新西兰兔进行耳缘静脉注射， 其后隔一周加强免疫一次， 免疫剂量为 3xl08个细胞， 每次免 疫前均进行耳缘静脉采血， 间接 ELISA法检测血清抗体效价， 待抗体滴度达大于或等于 1:300 000后进行腹主动脉放血， 将兔血 37 °C放置 l h， 再转入 4 °C过夜， 待血液充分收縮后迅速分 离血清， 并于 4 °C， 3 000 r/min离心 30 min， 收集上清， 利用 Protein A亲和层析法进行纯化， 纯化后效价为 1:150 000-1:170 000。
所述的抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备： 用 pH9.6的碳酸盐包被 缓冲液将纯化后抗 SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度 0.63 ^glmU 将稀释好的抗体溶液混 匀后加入微孔中， 100 μ! 孔， 4 °C过夜； 洗板 3次； 加入 3% BSA封闭液， 300 μ! 孔， 4 °C过 夜； 洗板 3次。
所述的 pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液： Na2C03 1.59 g， NaHC03 2.93 g， 加 ddH20至 1 L， 最 后用 10 M NaOH调节 pH至 9.6， 混匀。
所述的洗液配方为： 2.0 g NaCl; 0.2 g KH2P04; 2.9 g Na2HP04'12H20; 0.2 g KC1; 0.2 g NaN3; 40 mL ddH20; 0.5 mL吐温 -20，临用前加 ddH20至 1 L; SPC-A1裂解液制备方法为：将 SPC-A1 铺于六孔板中， 浓度为 1 X 106个 /mL; 待细胞铺满孔底后， 弃培养液， 加 4 °C预冷 1% PBS洗 两遍， 2 mIJ孔； 每孔加入裂解液 150 μί， 置于震荡器上； 30 min后， 用枪头刮取贴壁细胞， 收集裂解液于 1.5 mL EP管中， 13 000g离心 lO min; 留取上清， 分装后 -20°C保存。
所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒的制备方法， 包含如下步骤：
( 1 )单克隆抗体 NJ001-1的制备： 取 8-10周龄雌性 BALB/c小鼠腹腔注射 0.5 mL石蜡油， 10 d后分别腹腔注射生长良好的保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞 NM001-1 1 X 106/ 只， 1-2周后抽吸腹水， 37 °C表 h后， 4 °C过夜， 次日将腹水离心， 经 Protein G亲和层析柱纯 化， 得到纯化的单克隆抗体 NJ001-1 , 抗体经甘油与水比例为 1:1的液体进行溶解， 终浓度为 200 mg/L;
(2) 抗 SPC-A1兔多克隆抗体的制备： 首次免疫用 lxlO8个 SPC-A1细胞对新西兰兔进行耳 缘静脉注射， 其后隔一周加强免疫一次， 免疫剂量为 3xl08个细胞， 每次免疫前均进行耳缘静 脉采血， 间接 ELISA法检测血清抗体效价， 待抗体滴度达大于或等于 1:300 000后进行腹主动 脉放血， 将兔血 37°C放置 l h， 再转入 4 °C过夜， 待血液充分收縮后迅速分离血清， 并于 4°C， 3 000 r/min离心 30 min， 收集上清， 利用 Protein A亲和层析法进行纯化， 纯化后效价为 1:150 000-1:170 000， 浓度为 14.77 g/mL; ( 3 )抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被酶标板：用 pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗 SPC-A1 兔多克隆抗体稀释成目的浓度 0.63 g/mL; 将稀释好的液体充分混匀后加入微孔中， 100 μ! 孔， 4 °C过夜； 洗板 3次， 200 μ! 孔； 加入 3% BSA封闭液， 300 μ! 孔， 4 °C过夜； 洗板 3次， 200 L /孔； -20°C保存;
(4) 洗液、 SPC-A1裂解液、 1% PBS的配制： 洗液： 2.0 g NaCl; 0.2 g KH2P04; 2.9 g Na2HP 04 12H20; 0.2 g KC1; 0.2 g NaN3; 40 mL ddH20; 0.5 mL吐温 -20， 临用前加 ddH20至 1 L; SPC-A1裂解液制备方法：将 SPC-A1铺于六孔板中，浓度为 lxlO6个 /mL;待细胞铺满孔底后， 弃培养液， 加 4 °C预冷 1% PBS洗两遍， 2 mIJ孔； 每孔加入裂解液 150 μί， 置于震荡器上； 30 min后， 用枪头刮取贴壁细胞， 收集裂解液于 1.5 mL EP管中， 13 000 g离心 10 min; 留取 上清， 分装后 -20 °C保存；
1%膨 S: 8 g NaCl; 2.2 g KC1; 1.44 g Na2HP04; 0.24 g KH2P04; 加 ddH20至 800 mL;
( 5 ) 试剂盒组装： 上述制备的保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非 小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1 5-10 μL,抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板 1块，辣根过 氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 5-10 μί， 抗体稀释液为 1% PBS 40-50 mL， 洗液 40-50 mL， 终止液 2M H2SO4 8-10 mL, TMB底物显色液 A、 B液各 8-10 mL， 阳性对照： SPC-A1裂解液 400-600 μL,阴性对照：人 AB血清或胎牛血清 400-600 μL和空白对照： 1% PBS 1-2 mL组装成试剂盒。
所述的 pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液： Na2C03 1.59 g， NaHC03 2.93 g， 加 ddH20至 1 L， 最 后用 10 M NaOH调节 pH至 9.6， 混匀。
本发明的有益效果：
本发明在成功制备了能特异性识别非小细胞肺癌的单抗 NJ001-1 的基础上， 首先通过 Western blot证实了肺腺癌患者血清中 NJ001-1相关靶抗原的表达水平明显高于健康体检者； 然后免疫新西兰兔制备并纯化得到高效价的抗 SPC-A1的多克隆抗体， 联合该多抗和 NJ001-1 单抗建立双抗体夹心 ELISA试剂盒， 最后利用该试剂盒对大量的临床样本进行检测和分析。 结果显示， 该试剂盒用于非小细胞肺癌的检测具有很好的特异性、精密度和稳定性， 有望在临 床检测中发挥重要作用。 目前市面上无国家 FSDA批准的非小细胞肺癌抗原 ELISA检测试剂 盒， 采用现有电化学发光方法检测非小细胞肺癌， 与本 ELISA检测方法比较， 更敏感的化学 发光法进行检测，结果显示本发明试剂盒用于非小细胞肺癌的检测时敏感度和特异性均优于化 学发光法。 附图说明 图 1间接细胞 ELISA法分析单抗 NJ001-1与多种肿瘤细胞及非肿瘤细胞的反应性。 图 2血清中 NJ001-1相关靶抗原的蛋白免疫印迹结果及灰度分析；
A: 2、 3和 6为三位健康体检者的血清样本， 4和 5为两位肺腺癌患者的血清样本， 1为 SPC-A1 细胞裂解液 （阳性对照）；
B: 1为肺腺癌患者， 2为健康体检者， 3为阳性对照。
图 3抗 SPC-A1多克隆抗体的效价检测。
图 4棋盘法确定包被抗体和 NJ001-1的最佳工作浓度。 生 料样品的保藏信息
杂交瘤细胞株 NM001-1于 2011年 8月 31日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址 为中国武汉， 武汉大学， 保藏号为 CCTCC NO: C201172o 具体实fc^:
1、 以下实施例中所涉及的细胞及主要试剂： 人肺癌细胞系 SPC-A1、 A549、 NCI-H460、 NCI-H520, 人肝癌细胞系 HepG2， 人乳腺癌细胞系 ZR-75-30, 人结肠癌细胞系 Colo205及人 胚肺成纤维细胞系 WI-38购自中国科学院细胞库； SP2/0小鼠骨髓瘤细胞系由本实验室保存； 6-8周龄和 8-10周龄雌性 BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。 RPMI 1640、 DMEM、 胎牛血清、 0.25% 胰蛋白酶、 聚乙二醇、 次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷 （HT)、 氨基喋呤次黄嘌呤胸 腺嘧啶核苷 （HAT)、 人 AB血清和石蜡油购自美国 Gibco Invitrogen公司； FITC标记的羊抗 鼠 IgG及可溶型单组分 TMB底物溶液购自北京天根公司； 小鼠 Ig 亚型测定试剂盒购自美国 Santa Cruz公司； Western blot显色剂购自美国 Cell Signaling公司； 肺炎性假瘤组织、 肺癌组 织及乳腺癌组织由江苏省人民医院病理科提供； Model 550型酶标仪购自 Bio-Rad公司。 2.5Kg 的雄性新西兰兔购自上海斯莱克实验动物公司。 BSA购自 Biosharp公司； GAPDH抗体购自碧 云天公司； 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 购自中杉金桥公司； Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit购自默克公司。
2、 以下实施例中所涉及的细胞培养方法为： 上述细胞分别生长于含 10%胎牛血清、 青霉素和 链霉素各 100 U/mL的 DMEM或 RPMI1640培养液中， 37 V、 5% C02恒温培养箱中培养。 人外周血单个核细胞 （PBMC) 获自健康献血者， 采用常规淋巴细胞分离液分离。
3、标本收集 2007年 10月至 2011年 6月病理科确诊的肺癌患者 303例，其中 195例为肺腺癌， 作为实施例 6-8中的肺腺癌组， 69例为肺鳞癌， 作为实施例 6-8中的肺鳞癌， 肺腺癌组和肺鳞 癌组合并作为非小细胞肺癌组； 39例为小细胞肺癌， 作为实施例 6-8中的小细胞肺癌组； 同时 收集 50例肺良性疾病患者， 作为实施例 6-8中的肺良性疾病组和 500例健康体检者作为实施 例 6-8中的健康体检组。 临床病理参数见表 1， 随访至 2011年 10月。
表 1 不同组别的临床病理参数
Figure imgf000007_0001
4、 标本处理用血清分离胶真空采血管采集静脉血 2 mL， 先室温 3 000 r/min离心 10 min， 转 移上层血清，再于 4 °C、 16 OOOxg离心 10 min, 吸取上层无细胞血清分装每管 200 μί，置 -70°C 保存。 上述操作于标本采集后 2 h内完成。
5、 统计学分析 采用 SPSS 16.0 统计学软件对数据进行统计分析。 定性资料的组间比较采用 Fisher's 确切概率法， P < 0.05时具有统计学意义。 实施例 1单抗制备
1.1 动物免疫 取 6-8周雌性 BALB/c小鼠，每只用 2xl06 SPC-A1细胞 /次腹腔注射免疫 3次， 每次间隔 2周。每次免疫前均进行小鼠内眦采血， 间接细胞 ELISA法检测小鼠血清抗体效价， 待免疫小鼠血清抗体滴度达到最大并不再升高时取鼠脾细胞进行融合， 融合前 3 d加强免疫 1 次。
1.2 间接细胞 ELISA试验 接种 SPC-A1细胞 105/孔于 96孔板上， 至细胞生长融合达 80%， 95%乙醇固定， PBS 洗 3次， 0.2% Triton-X-100 M 20 min, 再用 50 g/L BSA 37 °C封闭 2 h， 依次加入不同稀释度的免疫小鼠血清 100 μL, 37 °C温育 1 h，再经 PBS洗 3次后，加入 1 : 1 000 稀释的 HRP标记的羊抗鼠 IgG 100 μL, 37 °C温育 45 min, 经 PBS洗涤后， 加入 TMB显色液， 37 °C温育 10 min后终止反应， 用酶标仪测定 450 nm时吸光度 （OD) 值， 以未免疫小鼠血清 ( 1： 1 000) 作为阴性对照。
1.3 细胞融合 取免疫小鼠脾脏研磨制成细胞悬液， 与处于对数生长期的骨髓瘤细胞 SP2/0进 行融合 （姚晓玲， 柳晓燕， 吴强， 等. 人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯化 [J].中国免 疫学杂志， 2006, 22(12):1140- 1145. )， 首次融合 480孔， 融合 1 周后出现细胞克隆， 有 330孔 生长杂交瘤细胞， 融合率约为 70%。 按照 1.2中的方法进行间接细胞 ELISA试验筛选阳性杂 交瘤细胞 （将 1.2间接细胞 ELISA试验中的免疫小鼠血清替换为杂交瘤细胞培养上清）， 进行 转种和 3 次有限稀释法亚克隆， 采获得稳定分泌抗 SPC-A1单抗且阳性最强的杂交瘤细胞株 NM001 将杂交瘤细胞株 NM001-1于 2011年 8月 31 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为武汉， 武汉大学， 保藏号为 CCTCC NO:
1.4单抗腹水的制备及纯化
取 8-10周龄雌性 BALB/c小鼠腹腔注射 0.5 mL石蜡油， 10 d后分别腹腔注射生长良好的 杂交瘤细胞 NM001-1 (CCTCC NO: C201172)约 ΙχΙΟ6/只， 1-2周后抽吸腹水， 37 °C炎 h后， 4 °C过夜，次日分别将腹水离心，经 Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体 NJ001-1； 抗体经甘油与水比例为 1:1的液体进行溶解， 终浓度为 200 mg/L。
1.5 单抗的鉴定
1.5.1单抗 Ig亚类的鉴定： 纯化单抗用 PBS 1:10 000稀释， 按照测定试剂盒说明书操作。 单抗 NJ001-1的亚类均为 IgG， 轻链为 κ链。
1.5.2单抗效价的测定： 分别将纯化的单抗 NJ001-1用 PBS倍比稀释， 分别取 100 加入包被 有 SPCA1细胞的 96孔板中， 用间接细胞 ELISA法测定 OD45Q值， 能与包被细胞发生免疫反 应的单抗最大稀释度即为其效价。单克隆抗体 NJ001-1效价为 4xl06，用于本发明试剂盒的制备。 1.5.3单抗特异性的鉴定： 用纯化的单抗 NJ001-1与上述 8种肿瘤细胞 （人肺癌细胞系： 肺腺 癌 SPC-A1和 A549, 大细胞肺癌： NCI-H460, 肺鳞癌： NCI-H520, 人肝癌细胞系： HepG2， 人乳腺癌细胞系： ZR-75-30, 人结肠癌细胞系： Colo205 与人胚肺成纤维细胞系： WI-38) 及 健康人 PBMC分别做间接细胞 ELISA分析， 观察有无阳性反应。 结果显示， 单抗 NJ001-1仅 对肺癌细胞 （SPCA1、 A549、 NCI- H520 NCI- H460) 抗原具有较强反应， 对其他肿瘤细胞 ( HepG2、 Colo 205、 ZR-75- 30)抗原、 正常人胚肺细胞（ WI- 38)抗原及健康人 PBMC均无反应 (见图 Do 实施例 2蛋白免疫印迹 （Western blot)
随机选择 3 例肺腺癌患者和 2 例健康体检者的血清， 通过 Proteo Extract Albumin/IgG Removal试剂盒除去血清中的白蛋白和 IgG， 经冷冰酮法对样本进行浓縮。 将浓縮后的样本加 样至 12%的 SDS-PAGE胶进行蛋白分离， 后将蛋白转移至 PVDF膜， 用 5%的脱脂牛奶室温封 闭 2 h，再分别以 1:1 000稀释的 NJ001-1单抗和 1:400稀释的 GAPDH抗体 4 摇床孵育过夜， 取出膜用 lxTBST漂洗 3次， 加入 1:3 000稀释的羊抗鼠二抗室温摇床孵育 2 h， lxTBST漂洗 3次后进行 ECL显色。肺腺癌患者血清中 NJ001-1相关靶抗原的表达水平显著高于健康体检者， 见图 2A， 灰度分析结果见图 2B。 实施例 3抗 SPC-A1多克隆抗体的制备
首次免疫用 lxlO8个 SPC-A1细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一 次， 免疫剂量为 3xl08个细胞。 每次免疫前均进行耳缘静脉采血， 间接 ELISA法 (以 SPC-A1 细胞铺板， 浓度为 lxlO5个 /孔， 将免疫前血清和该次采集的血清从 1:5 000开始分别进行倍比 稀释后加样， 以辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG作为二抗， 以 OD45()大于 2.1倍阴性对照孔的 血清最高稀释倍数作为血清的效价)检测血清抗体效价。待抗体滴度达大于或等于 1:300 000后 进行腹主动脉放血，将兔血 37 °C放置 1 h，再转入 4 °C过夜，待血液充分收縮后迅速分离血清， 并于 4 °C， 3 000 r/min离心 30 min， 收集上清， 利用 Protein A亲和层析法进行纯化， 纯化后 效价为 1:160 000, 见图 3， 浓度为 14.77 g/mL。 实施例 4包被抗体和一抗最佳工作浓度的确定
用棋盘滴定实验确定包被抗体和一抗的工作浓度。 用包被缓冲液 (pH 9.6)将包被抗体 (抗 SPC-A1兔多抗， 14.77 mg/mL)稀释成 2.50、 1.25、 0.63及 0.31 g/mL包被酶标板， 100 每 孔， 4 °C过夜； 用洗液洗板 3次； 3% BSA每孔 300 μί， 4 °C封闭过夜， 得到抗 SPC-A1多克 隆抗体包被的酶标板； 用洗液洗板同上， 加入待检血清， 50 μί每孔， 37 °C孵育 2 h， 洗板 5 次；将一抗 (单克隆抗体 NJ001-1 , 200 mg/L)分别用 1% PBS (抗体稀释液）进行 1:3 000、 1:4 000、 1:5 000和 1:6 000的稀释，每孔加入 100 μL, 37°C孵育 1 h; 洗板 5次； 辣根过氧化物酶标记羊 抗鼠 IgG， 用 1% PBS (抗体稀释液）稀释至 1:3 000， 每孔加 100 μί， 37°C孵育 30 min， 用洗 液洗板 5次； 每孔加入新鲜配制的 TMB底物显色液 100 (空白孔除外）， 室温避光显色 10 min， 以 2 M H2S04的终止液终止反应。 用 Model550型酶联仪 （Bio-Rad公司） 读取 OD值， 读数波长 450nm。阳性、阴性和空白对照分别为 SPC-A1裂解液，人 AB血清或胎牛血清和 1% PBS o 选择阳性孔 OD45Q值 /阴性孔 OD45Q值 （P/N值） 最大孔所对应的包被抗体和一抗的浓度 为最佳工作浓度。 结果显示： 当包被抗体的浓度为 0.63 g/mL,—抗稀释度为 1:4 000时， 可保 证尽可能多地结合靶抗原， 同时 P/N值最大 （9.8 ) ， 见图 4。 上述方法中涉及的各试剂的配制方法：
终止液、 TMB底物显色液： 购自上海科华公司
洗液： 2.0 g NaCl; 0.2 g KH2P04; 2.9 g Na2HP04-12H20; 0.2 g KC1; 0.2 g NaN3; 40 mL ddH2O; 0.5 mL吐温 -20， 临用前加 dd¾0至 1 L。
SPC-A1裂解液制备方法： 将 SPC-A1铺于六孔板中 （浓度为 lxlO6个 /mL); 待细胞铺满孔底 后， 弃培养液， 加 4 °C预冷 1% PBS洗两遍， 2 mIJ孔； 每孔加入裂解液 150 μί， 置于震荡器 上； 30 min后， 用枪头刮取贴壁细胞， 收集裂解液于 1.5 mL EP管中， 13 000 g离心 10 min; 留取上清， 分装后 -20°C保存。
抗体稀释液 1% PBS : 8 g NaCl; 2.2 g KC1; 1.44 g Na2HP04; 0.24 g KH2P04;加 ddH20至 800mL。 pH9.6的碳酸盐包被缓冲液： Na2C03 1.59 g , NaHC03 2.93 g， 加蒸馏水至 1 L， 最后用 10 M NaOH调节 pH至 9.6， 充分混匀。 实施例 5
用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 包含如下组分： 上述制备的保藏号 为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1 5 μL, 抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的 96孔酶标板， 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 5 μL, 洗液 40 mL, 终止液 2 M H2S04 8 mL， TMB底物显色液 A、 B液各 8 mL， 阳性对照： SPC-A1裂解液 500 μί， 阴性对照： 人 ΑΒ血清或胎牛血清 500 和空白对照： 1% PBS 1 mL, 抗体稀释液 为 1% PBS 50 mL。
试剂盒中使用的单抗、 多抗以及各试剂的制备方法见实施例 1、 3、 4。 终止液、 TMB底 物显色液： 购自上海科华生物工程股份有限公司。
所述的抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备： 用 pH9.6的碳酸盐包被 缓冲液将纯化后抗 SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度 0.63 g/mL; 将稀释好的抗体溶液混 匀后加入微孔中， 100 μ! 孔， 4°C过夜； 洗板 3次， 200 μ! 孔； 加入 3% BSA封闭液， 300 μ! 孔， 4 °C过夜； 洗板 3次， 200 μ! 孔； -20 °C保存。 实施例 6
从冰箱中取出 -20°C保存的实施例 5制备的试剂盒，待测血清、阳性对照（SPC-A1裂解液） 及阴性对照 （人 AB血清或胎牛血清）， 置于冰上融解； 取出已包被 ELISA板及相关试剂恢复 至室温； 待血清融解后， 颠倒混匀， 离心； 取待测血清上清 50 加入微孔中， 同时加入阳性 对照、 阴性对照、 空白对照各 50 μί/孔； 37 °C孵育 2h， 取出 ELISA板用洗液洗板 5次， 200 μ! 孔， 每次 2 min; 用抗体稀释液 1% PBS按 1:4000稀释一抗 NJ001-1, 100 μ! 孔加入微孔; 37 °C孵育 1 h， 洗板同前； 用抗体稀释液 1% PBS按照 1:3000稀释二抗辣根过氧化物酶标记 羊抗鼠 IgG， 100 μ! 孔加入微孔； 37 °C孵育 30 min, 洗板同前； 将 TMB底物显色液 A、 B按 1:1混合， 100 μ! 孔加入微孔中（空白对照孔不加底物），室温避光 10min，加入终止液， 50 μυ 孔； Model 550型酶联仪检测 OD45Q值。
双抗体夹心 ELISA法检测结果显示（表 2)肺腺癌、肺鳞癌、 小细胞肺癌和肺良性疾病组 的检测阳性率分别为 63.1%(123/195)， 47.8 (33/69), 20.5%(8/39)和 12.0%(6/50)均显著高于健 康体检组 ， P 非小细胞肺癌组 （肺腺癌和肺鳞癌） 的阳性率显著高于小细胞肺 癌组 (59.1% vs 20.5%， P< 0.05)和肺良性疾病组 (59.1% vs 12.0%， P<0.05)。 另外， 非小细胞 肺癌中肺腺癌组的阳性率显著高于肺鳞癌组（63.1% vs 47.8%， P<0.05 195例肺腺癌患者中 已明确病理分期的为 124例，其中早期组 (Ι/Π)和晚期组 (IIMV)的阳性率分别达 63.3%(19/30) 和 79.8 (75/94), 结果表明， 本方法在早期肺腺癌病例中即有较高的检出率， 有助于肺腺癌的早 期诊断。
表 2 双抗体夹心 ELISA法检测各组的阳性率
组别 例数 阳性 （％) 阴性 （％) 非小细胞肺癌组 264 156 (59.1) 108 (40.1) 肺腺癌组 195 123 (63.1) 72 (36.9)
肺鳞癌组 69 33 (47.8) * 36 (52.2)
小细胞肺癌组 39 8 (20.5) *△ 31 (79.5) 肺良性疾病组 50 6 (12.0) *Δ 44 (88.0) 健康对照组 500 22 (4.4) *△。□ 478 (95.6) 注： *与肺腺癌组阳性率比较， Ρ<0.05; △与肺鳞癌组阳性率比较， Ρ<0.05; 〇与小细胞肺 癌组阳性率比较， Ρ<0.05; 口与肺良性疾病组阳性率比较， Ρ<0.05 实施例 7
通过较 ELISA方法敏感的化学发光法对样本进行血清 CEA、 NSE和 CYFRA21-1的同步 检测， 与基于本发明双抗体夹心 ELISA试剂盒的双抗体夹心 ELISA方法进行比较。 1. 敏感性：表 3中基于本发明双抗体夹心 ELISA试剂盒的双抗体夹心 ELISA法对非小细 胞肺癌患者的检测阳性率为 59.1% ( 156/264) ， 显著高于 CEA、 NSE禾 B CYFRA21-1的阳性 率 (41.3%、 17.4%和 37.1%)， 故本发明试剂盒对 NJ001-1相关靶抗原的检测较 CEA、 NSE禾口 CYFRA21-1检测相应靶抗原具有更高的敏感性；
2. 特异性：基于本发明双抗体夹心 ELISA试剂盒的双抗体夹心 ELISA法对小细胞肺癌患 者， 肺良性疾病患者和健康体检者的检测阳性率分别为 20.5%、 12.0%和 4.4%， 均明显低于 CEA、 NSE禾卩 CYFRA21-1的阳性率 (其中 CEA阳性率为 25.6%、 14.0%和 5.8%， NSE的阳 性率为 56.4%、 18.0%禾卩 9.8%， CYFRA21-1的阳性率为 23.1%、 16.0%禾卩 6.4% ) ， 故该试剂盒 对 NJ001-1相关靶抗原的检测较 CEA、NSE和 CYFRA21-1检测相应靶抗原具有更好的特异性。 表 3 各组别中 ELISA法检测 NJ001-1相关靶抗原与化学发光法检测三种肿瘤标志物的阳性率 阳性率
非小细胞肺癌组小细胞肺癌组 肺良性疾病组 健康体检组 (n=264) (n=39) (n=50) (n=500) l.CEA 41.3%* 25.6% 14.0% 5.8%
2.NSE 17.4%* 56.4%° 18.0% 9.8 Δ
3.CYFRA21-1 37.1%* 23.1% 16.0% 6.4%
4.NJ001-1相关靶抗原 59.1% 20.5% 12.0% 4.4% 注： *与 NJ001-1相关靶抗原比较， P < 0.05 ; 〇与 NJ001-1相关靶抗原比较， Ρ < 0·05 ; Δ与 NJ001-1相关靶抗原比较， Ρ < 0.05 ;
3. 对于肺腺癌：表 4中基于本发明双抗体夹心 ELISA试剂盒的双抗体夹心 ELISA法检测 195 例肺腺癌患者血清中 NJ001-1相关靶抗原的阳性率为 63.1%， 显著高于电化学发光方法 （CEA 45.1% , NSE 15.9 , 禾口 CYFRA21-1 33.8%)， Ρ < 0·05。
4. 对于肺鳞癌： 与上述结果相似， 表 4中基于本发明双抗体夹心 ELISA试剂盒的双抗体夹 心 ELISA法检测 69例肺腺癌患者血清中 NJ001-1相关靶抗原的阳性率为 47.8%， 明显高于电化学 发光方法 （CEA 30.4%， NSE 21.7¾^BCYFRA21-1 46.4%)。
5. 对于三项联合检测： 采用电化学发光方法联合 CEA， NSE, 和 CYFRA21-1三项指标检 测 264例非小细胞肺癌患者血清的阳性率为 59.5% ( 157/264) ； 而仅采用基于本发明双抗体夹 心 ELISA试剂盒的双抗体夹心 ELISA法检测 NJ001-1相关靶抗原单项检测即可达到近乎相同阳 性检出率 59.1% ( 156/264) 。 6. 对于四项联合检测： 在三项联合检测基础上加入本发明检测， 即四项联合 （NJ001-1相 关靶抗原、 CEA、 NSE和 CYFRA21-1) 在肺腺癌及肺鳞癌患者血清中的阳性检出率分别为 85.1%, 75.4%, 显著高于三项联合（CEA、 NSE和 CYFRA21-1) 的阳性检出率 60.5%， 56.6%, 大幅度地提高 （约提高 20%左右） 非小细胞肺癌的阳性检出率， 见表 4。 表 4 肺腺癌和肺鳞癌组中单项和联合检测 NJ001-1相关靶抗原及三种肿瘤标志物的阳性率 阳性率
肺腺癌组 肺鳞癌组
(n=195) (n=69)
1.CEA 45.1%° 30.4%
2.NSE 15.9%° 21.7 D
3.CYFRA21-1 33.8%° 46.4%
4.NJ001-1相关靶抗原 63.1% 47.8%
5.三项联合 （CEA+ NSE+CYFRA21-1) 60.5%* 56.5 Δ
6.四项联合 （CEA+NSE+CYFRA21-1+
85.1% 75.4%
NJ001-1相关靶抗原）
注： *与四项联合组比较， Ρ<0.01; 〇表示与 NJ001-1 相关靶抗原比较， Ρ<0.05; △表示与 四项联合组比较， Ρ<0.05; □表示与 NJ001-1相关靶抗原比较， Ρ<0.05. 实施例 8
精密度： 混合 10份非小细胞肺癌患者的血清， 利用实施例 5制备的双抗体夹心 ELISA试剂 盒对其连续检测 20次， 另外每天检测 1次， 连续检测 20天， 结果显示， 批内和批间的 CV%分别 为 2.24%和 2.52%， 均在允许误差范围内 （批内 CV%<2.5%， 批间 CV%<3.3%) ， 故该法精密 度高， 重复性较好。 稳定性：将实施例 5制备的双抗体夹心 ELISA试剂盒置于 -20 °C分别保存 30d、90d和 270d， 再分别对高水平样本 （10份非小细胞肺癌患者的混合血清） 和低水平样本 （10份健康体检者 的混合血清)进行检测， 高水平样本的。 ％为 1.83%， 低水平样本的。 ％为 2.11%， 均小于 3.3%, 说明该试剂盒具有良好的稳定性。

Claims

权利要求书
1、 一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于包含如下组成： 保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1 , 抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的 96孔酶标板， 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG， 抗体稀释液： 1 PBS , 洗液， 终止液 2 M H2S04， TMB底物显色液， 阳性对照： SPC-A1裂解液， 阴性对 照： 人 AB血清或胎牛血清和空白对照： 1% PBS。
2、根据权利要求 1所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于包 含如下组成：
保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1 5-10 μί，抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板 1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 5-10 μί， 抗体稀释液 1% PBS 40-50 mL， 洗液 40-50 mL， 终止液 2 M H2S04 8-10 mL， TMB底物显色 液八、 B液各 8-10 mL， 阳性对照： SPC-A1裂解液 400-600 μί， 阴性对照： 人 ΑΒ血清或胎牛 血清 400-600 μL和空白对照： 1% PBS 1-2 mL。
3、根据权利要求 2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于所 述的保藏号为 CCTCC NO: C201172 的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1浓度为 200 mg/L, 使用时稀释度为 1:4 000。
4、根据权利要求 2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于所 述的抗 SPC-A1兔多克隆抗体的通过如下方法制备： 首次免疫用 lxlO8个 SPC-A1细胞对新西 兰兔进行耳缘静脉注射， 其后隔一周加强免疫一次， 免疫剂量为 3xl08个细胞， 每次免疫前均 进行耳缘静脉采血， 间接 ELISA法检测血清抗体效价， 待抗体滴度达大于或等于 1:300 000后 进行腹主动脉放血，将兔血 37 °C放置 1 h，再转入 4 °C过夜，待血液充分收縮后迅速分离血清， 并于 4 °C， 3000 r/min离心 30 min， 收集上清， 利用 Protein A亲和层析法进行纯化， 纯化后效 价为 1:150 000-170 000。
5、根据权利要求 4所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于所 述的抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用 pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液 将纯化后抗 SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度 0.63 g/mL; 将稀释好的抗体溶液混匀后加 入微孔中， 100 μ! 孔， 4 °C过夜； 洗板 3次； 加入 3% BSA封闭液， 300 μ! 孔， 4 °C过夜； 洗 板 3次。
6、根据权利要求 5所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于所 述的 pH9.6的碳酸盐包被缓冲液： Na2C03 1.59 g， NaHC03 2.93 g， 加 ddH20至 1 L， 最后用 10 MNaOH调节 pH至 9.6， 混匀。
7、根据权利要求 2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒， 其特征在于所 述的洗液配方为： 2.0 g NaCl; 0.2 g KH2P04; 2.9 g Na2HP0412H20; 0.2 g KC1; 0.2gNaN3; 40 mLddH20; 0.5 mL吐温 -20，临用前加 ddH20至 1 L; SPC-A1裂解液制备方法为：将 SPC-A1 铺于六孔板中， 浓度为 lxlO6个 /mL; 待细胞铺满孔底后， 弃培养液， 加 4°C预冷 1%PBS洗 两遍， 2mIJ孔； 每孔加入裂解液 150 μί， 置于震荡器上； 30min后， 用枪头刮取贴壁细胞， 收集裂解液于 1.5mLEP管中， 13000 g离心 10 min; 留取上清， 分装后 -20°C保存。
8、权利要求 1所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒的制备方法， 其特征 在于包含如下步骤：
(1)单克隆抗体 NJ001-1的制备： 取 8-10周龄雌性 BALB/c小鼠腹腔注射 0.5mL石蜡油， 10 d后分别腹腔注射生长良好的保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞 NM001-1 lxlO6/ 只， 1-2周后抽吸腹水， 37 °C lh后， 4°C过夜， 次日将腹水离心， 经 Protein G亲和层析柱纯 化， 得到纯化的单克隆抗体 NJ001-1, 抗体经甘油与水比例为 1:1的液体进行溶解， 终浓度为 200 mg/L;
(2) 抗 SPC-A1兔多克隆抗体的制备： 首次免疫用 lxlO8个 SPC-A1细胞对新西兰兔进行耳 缘静脉注射， 其后隔一周加强免疫一次， 免疫剂量为 3xl08个细胞， 每次免疫前均进行耳缘静 脉采血， 间接 ELISA法检测血清抗体效价， 待抗体滴度达大于或等于 1:300000后进行腹主动 脉放血，将兔血 37 °C放置 1 h，再转入 4 °C过夜，待血液充分收縮后迅速分离血清， 并于 4 °C， 3000 r/min离心 30 min， 收集上清， 利用 Protein A亲和层析法进行纯化， 纯化后效价为 1:150 000-1:170000， 浓度为 14.77 g/mL;
(3)抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被酶标板： 用 pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗 SPC-A1 兔多克隆抗体稀释成目的浓度 0.63 g/mL; 将稀释好的液体充分混匀后加入微孔中， 100 μ! 孔， 4°C过夜； 洗板 3次， 200 μ! 孔； 加入 3%BSA封闭液， 300 μ! 孔， 4 °C过夜； 洗板 3次， 200 μ! 孔； -20°C保存；
(4) 洗液、 SPC-A1裂解液、 1%PBS的配制：
洗液： 2.0gNaCl; 0.2 g KH2P04; 2.9 g Na2HP04-12H20; 0.2 g KC1; 0.2gNaN3; 40mLddH2O; 0.5 mL吐温 -20， 临用前加 dd¾0至 1 L;
SPC-A1裂解液制备方法：将 SPC-A1铺于六孔板中，浓度为 lxlO6个 /mL;待细胞铺满孔底后， 弃培养液， 加 4°C预冷 1%PBS洗两遍， 2mL/孔； 每孔加入裂解液 150 μί， 置于震荡器上； 30 min后， 用枪头刮取贴壁细胞， 收集裂解液于 1.5mLEP管中， 13000 g离心 10 min; 留取 上清， 分装后 -20°C保存；
1% PBS: 8 g NaCl; 2.2 g KC1; 1.44 g Na2HP04; 0.24 g KH2P04; 加 ddH20至 800 mL;
(5) 试剂盒组装： 上述制备的保藏号为 CCTCC NO: C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非 小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1 5-10 μL,抗 SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板 1块，辣根过 氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 5-10 μί, 抗体稀释液 1% PBS 50 mL, 洗液 40-50 mL， 终止液 2 M H2S04 8-10 mL, TMB底物显色液 A、 B液各 8-10 mL,阳性对照： SPC-A1裂解液 400-600 μL, 阴性对照： 人 AB血清或胎牛血清 400-600 μL和空白对照： 1%PBS 1-2 mL组装成试剂盒。
9、根据权利要求 8所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒的制备方法， 其 特征在于所述的 pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液： Na2C03 1.59 g， NaHC03 2.93 g，加 ddH20至 1 L， 最后用 10 M NaOH调节 pH至 9.6， 混匀。
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