EA018966B1

EA018966B1 - Способ усиления иммунореактивности

Info

Publication number: EA018966B1
Application number: EA201000974A
Authority: EA
Inventors: Готфрид Байер; Ханс Лойбнер; Манфред Шустер; Гюнтер Ламетшвандтнер; Доминик Вольф
Original assignee: Медицинише Университет Иннсбрук; Апейрон Биолоджикс Аг
Priority date: 2007-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2013-12-30
Also published as: CN103898051A; ES2665928T3; CN101918544B; DK2220214T3; US8809288B2; JP6175103B2; CA2708343A1; PL2220214T3; JP2011507806A; WO2009073905A3; JP6118491B2; CY1120136T1; EA201000974A1; AU2008336276A1; BRPI0821003A2; HRP20180558T1; US20100260808A1; AU2008336276B2; WO2009073905A2; AU2008336276C1

Abstract

Изобретение касается способа усиления in vitro или ex vivo иммунореактивности клеток иммунной системы, контактировавших с антигеном, который включает снижение или ингибирование функции Cbl-b в данных клетках, при этом иммунореактивность клеток к антигену возрастает.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к способам модулирования иммунного ответа клеток.

Предшествующий уровень техники

Активная иммунизация впервые сделала возможной комплексную борьбу против наиболее угрожающих инфекционных болезней, а в некоторых случаях даже их полное искоренение во всем мире, используя недорогой и очень эффективный эндогенный защитный механизм. Поэтому предпринимались и будут предприниматься усилия для развития профилактических и терапевтических методов вакцинации против различных заболеваний. Тем не менее, эффективная иммунизация требует индукции иммунного ответа, что приводит к возникновению защитного иммунитета. Однако при отсутствии иммуногенности антигена, используемого для иммунизации, требуемый эффект не возникает. Были разработаны очень интересные композиции специфических антигенов для профилактики и лечения малярии, ВИЧ, гриппа или раковых заболеваний, если взять только несколько известных примеров. Несмотря на это, такие способы лечения не были успешными, например, из-за отсутствия иммуногенности антигена, используемого для иммунизации. Кроме того, даже широкоприменяемые вакцины вызывают проблемы недостаточной иммуногенности, как то вакцины против гепатита В, которые фактически создают защитный титр иммунного ответа только приблизительно у 80% вакцинированных. Г лавная причина отсутствия реактивности иммунной системы состоит в том, что эти антигены не распознаются как чужеродные. У млекопитающих главным образом Т-клетки решают, будет ли структура, презентированная антигенпрезентирующими клетками (АПК), распознаваться как эндогенная или чужеродная. Для индукции иммунного ответа необходимы по сути два отдельных сигнала независимо друг от друга. Этот механизм должен предотвращать чрезмерную реакцию иммунной системы. Первая предпосылка заключается в узнавании Т -клеточным рецептором антигена, представленного АПК. Если это не произойдет, то никакая дальнейшая реакция не возникнет. Кроме того, для индукции иммунного ответа совершенно необходимо, чтобы взаимодействие между рецептором СИ28 на поверхности Т-клетки и В7, экспрессированным на АПК, происходило только тогда, когда последний классифицирует антигенную структуру как опасную. При вакцинации антигеном, обладающим лишь минимальной иммуногенностью, не происходит костимуляция посредством взаимодействия В7 и СИ28, что впоследствии приводит не к развитию иммунного ответа, а, наоборот, к развитию толерантности на уровне Т-клеток. Тем не менее, было показано, что необходимость в костимуляции можно обойти путем отключения фермента ЕЗ-убиквитинлигазы СЫ-Ь. Этот фермент является решающим элементом переключения при контроле иммунореактивности (СЫаид с1 а1.,

1. С11П. 1пус51 (2007) άοί: 10.1172/1С129472). Однако и в отсутствие СЬ1-Ь почти лишенные иммуногенности вводимые вещества могут приводить к индукции сильного иммунного ответа. Более того, деффектные по СЬ1-Ь мыши (нокаут по гомозиготному гену) жизнеспособны, а их иммунная система способна эффективно распознавать индуцированные аутологично опухоли и вырабатывать литический иммунный ответ, главным образом, на основе Т-клеток СИ8+ (Боекет с1 а1., ДЕМ (2007) йо1:10.1084/1ет.20061699). Однако полное удаление этого фермента, как было описано, тоже приводит к повышению аутоиммунности после иммунизации суперантигенами. Боекет и др. смогли таким образом показать, что СЬ1-Ь как негативный регулятор отвечает за иммунореактивность Т-клеток.

Также для СЬ1-Ь была описана технология ниРНК (небольшой интерферирующей РНК, κίΡΝΑ) для подавления экспрессии конкретного гена, но с меньшей эффективностью. И8 2007/0087988 касается способа регулирования НРК1, экспрессия которого может быть увеличена путем усиления экспрессии СЬ1-Ь и наоборот (например, путем ингибирования ниРНК СЬ1-Ь).

В И8 2007/00543355 описаны пептиды СЬ1-Ь и ассоциированные с СЬ1-Ь белки, в частности РО8Н, и их применение для лечения связанных с СЬ1-Ь заболеваний.

\УО 2004/078130 А2 касается композиций для лечения связанных с РО8Н заболеваний, как то вирусных заболеваний, рака и неврологических заболеваний. РО8Н можно получить вместе со множеством связанных с ним белков, включая СЬ1-Ь.

И8 2006/0292119 Α1 касается способов усиления иммунного ответа клеток иммунной системы путем ингибирования отрицательных регуляторов в клетках. Такие отрицательные регуляторы выбирают из числа белков, связанных с молекулярной стабильностью, например, посредством убиквитинирования, дезубиквитинирования и сумоилирования, а также факторов транскрипции, ингибирующих экспрессию ингибиторов ΝΡΚΒ. или супрессоров транскрипции генов-мишеней ΝΡΚΒ.

Тем не менее, использование медиаторов СЬ1-Ь для применения в медицинской практике не было описано. Поэтому одной из целей настоящего изобретения является обеспечение способа модулирования иммунореактивности, пригодного для практического применения.

Сущность изобретения

Таким образом, настоящее изобретение касается способа усиления ίη νίΐτο или ех νίνο иммунореактивности клеток иммунной системы, подвергавшихся контакту с антигеном, который включает подавление или ингибирование функции СЬ1-Ь в этих клетках, тем самым усиливая иммунореактивность клеток к антигену.

Ген СЬ1-Ь и его продукты подробно описаны в соответствующих работах (Ишбепе И. Нк.3144 и Нк.381921). Последовательности СЬ1-Ь опубликованы в базе данных СепВапк, к примеру, под номерами

- 1 018966 доступа ΝΜ_008279 и ΝΡ_009112. Антитела к СЫ-Ь, ниРНК и антисмысловые ингибиторы доступны коммерчески. В И8 2007/0054355 раскрыты некоторые ниРНК, пригодные для снижения или ингибирования экспрессии СЬ1-Ь и тем самым функции СЬ1-Ь, например, состоящие из смеси нуклеотидов РНК/ДНК и длиной примерно в 20 оснований.

Чтобы противодействовать риску гиперреакции иммунной системы, которая может привести, к примеру, к индукции аутоиммунной реактивности, ингибирование/нокаут функций СЬ1-Ь в Т-клетках может осуществляться только в строго определенный период времени. Поэтому при адьювантной терапевтической вакцинации необходимо контролируемое подавление СЬ1-Ь только в течение ограниченного периода времени, чтобы поддержать развитие иммунного ответа, специфичного к данному иммунизационному антигену, но предотвратить аутоиммунную болезнь, быстро восстанавливая нормальное иммунологическое состояние. Поэтому в соответствии с настоящим изобретением только определенная выборка выделенных клеток иммунной системы подвергается обработке ίη νίΐτο или ех νίνο, а затем возвращается пациенту. Таким образом, данный подход к эффективному подавлению СЬ1-Ь ίη νίΐτο или ех νίνο является необходимым условием усиления иммунореактивности.

Функция СЬ1-Ь предпочтительно снижается или ингибируется путем снижения или ингибирования экспрессии СЬ1-Ь. Термины снижение или ингибирование относятся к снижению функции (и/или экспрессии) СЬ1-Ь по сравнению с неизмененной естественной функцией вплоть до полного её ингибирования. Функция (и/или экспрессия) предпочтительно снижается по меньшей мере на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95%.

В предпочтительных воплощениях функция СЬ1-Ь предпочтительно снижается или ингибируется кратковременно. Иными словами, функция снижается только временно, как указано выше, а впоследствии может восстановиться, например, при израсходовании или деградации таких ингибиторов, как ниРНК СЬ1-Ь, либо посредством неогенеза или клетками с неповрежденным СЬ1-Ь (ίη νίνο). Кратковременное снижение СЬ1-Ь в иммунных клетках может осуществляться и многократно, например, до достижения терапевтического эффекта.

Экспрессия СЬ1-Ь предпочтительно подавляется или ингибируется с помощью антисмысловой РНК или ниРНК СЬ1-Ь. С этой целью применяются короткие последовательности ДНК и/или РНК, комплементарные части последовательности мРНК мишени (СЬ1-Ь), так что они при этом гибридизируются с ними и инактивируют их. Длина этих последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 оснований вплоть до полной длины последовательности мишени, предпочтительно вплоть до 2502, 2000, 1500, 1000, 500 или 300 оснований. Предпочтительно используют последовательности 8ЕЦ Ш 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и/или 8.

Функцию СЬ1-Ь также можно понизить или ингибировать с помощью множества других известных компонентов, как то с помощью антагонистов и ингибиторов СЬ1-Ь, в частности аптамеров или интрамеров. Любые антагонисты или ингибиторы, которые подавляют действие и/или функцию СЬ1-Ь, могут использоваться в соответствии с изобретением для усиления иммунореактивности клеток. Антагонисты или ингибиторы предпочтительно используются для получения фармацевтического средства для усиления по изобретению иммунореактивности клеток иммунной системы ίη νίΐτο, ех νίνο или даже ίη νίνο. Это позволяет лечить заболевания с угнетенной или неэффективной иммунной системой, в частности рак, а также усиливать иммунный ответ на (вакцинационные) антигены, которые могут контактировать с клетками иммунной системы ίη νίνο или ех νίνο.

Настоящее изобретение также касается способа снижения иммунореактивности клеток иммунной системы, который включает понижение или ингибирование функции с-СЬ1 в этих клетках с тем, чтобы понизить иммунореактивность их к антигену предпочтительно путем кратковременного снижения или ингибирования, в частности с помощью антисмысловой РНК или ниРНК с-СЬ1. Для усиления иммунореактивности вовсе не нужно одновременно подавлять с-СЬ1 вместе с СЬ1-Ь. Как показано в примерах, подавление с-СЬ1 вместо этого вызывает отмену эффектов, достигнутых ингибированием СЬ1-Ь. Следовательно, СЬ1-Ь и с-СЬ1 обладают противоположными функциями. с-СЬ1 также выполняет ранее неизвестную функцию тонкой регуляции реактивности Т-клеток, при этом его подавление приводит к повышению иммунотолерантности. Поэтому снижение или ингибирование функции с-СЬ1 подходит для иммуносупрессии и поэтому делает возможным его применение, к примеру, при воспалении или аллергии. Поскольку величина и направленность снижения зависят от степени подавления или ингибирования СЬ1Ь и/или с-СЬ1 (аналогично СЬ1-Ь, как описано в данном тексте), функции обоих факторов могут понижаться в комбинации. Для усиления иммунореактивности снижение СЬ1-Ь должно превосходить снижение с-СЬ1 и наоборот. Антисмысловая или ниРНК с-СЬ1 может иметь такие же линии последовательностей, как и описанные выше для СЬ1-Ь. Предпочтительно используются последовательности 8ЕЦ Ш 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и/или 16.

В специальных воплощениях предпочтительно применяются клетки, которые захватили антиген и предпочтительно презентируют фрагмент антигена или, что еще лучше, распознают фрагмент антигена в контексте НЬА, и при этом активировались.

В предпочтительных воплощениях клетки для применения по изобретению представляют собой антигенпрезентирующие клетки, мононуклеары периферической крови (РВМСк), Т-лимфоциты, В

- 2 018966 лимфоциты, моноциты, макрофаги и/или дендритные клетки, в частности Т-лимфоциты, Т-лимфоциты СИ8+, Т-лимфоциты СЭ4+. в частности ТЫ, Т112. ТЫ7, регуляторные Т-клетки (Тгедк) или цитотоксические Т-клетки (СТЬ), клетки ΝΚ или ΝΚ/Т. Подобным же образом можно использовать лимфоциты СИ3/СИ19-минус в целом, из которых особенно предпочтительную группу составляют ΝΚ-клетки. Антиген предпочтительно уже захвачен клетками, и они его презентируют, предпочтительно фрагмент антигена. Для терапии особенно предпочтительна комбинация РВМСк и Т-клеток, чтобы индуцировать особенно сильную антиген-специфичную реакцию. В других воплощениях, в частности для общего усиления иммунореактивности (например, при лечении иммунной недостаточности), достаточно одних лишь различных Т-клеток для достижения широкого эффекта. Усиление иммунореактивности в соответствии с изобретением предпочтительно опосредуется этими клетками, в частности клетками СЭ8 или СЭ4, а также клетками ΝΚ и/или ΝΚΈ

Для трансфекции клеток, в частности Т-клеток или ΝΚ-клеток, ингибитором СЫ-Ь типа ниРНК СЬ1Ь или конструкцией с нокаутом по СЬ1-Ь предпочтительно применяется злектропорация. Для этой цели, т.е. для ингибирования СЬ1-Ь, можно применять любые среды, пригодные для трансфекции. Одним из примеров такой среды является Орбтет (О1Ьео, #31985-047).

Кроме того, для усиления иммунного ответа клеток их также можно обрабатывать, т.е. стимулировать иммуностимулирующими веществами, например иммуностимулирующим цитокином или лигандом других иммуностимулирующих рецепторов (типа ТЬК.8, т.е. То11-подобных рецепторов) либо антителами к поверхностным молекулам, предпочтительно СПЗ и/или СИ28.

Ингибирование СЬ1-Ь также может применяться как составная часть вакцинации, реализуемой дендритными клетками, предпочтительно противораковой вакцинации.

В качестве альтернативы и/или в дополнение клетки, ингибирующие ίη νίίτο совместное культивирование СЬ1-Ь-ингибированных клеток и дендритных клеток, полученных от пациента и предпочтительно насыщенных антигенами (клеток) опухоли, поскольку в целях изобретения также можно использовать совместное культивирование.

Вакцинация в настоящем изобретении не должна пониматься в абсолютном смысле - т.е. как введение иммуногена, ведущее к абсолютной защите иммунной системой, а скорее как иммунологическое введение для усиления защиты иммунной системой и/или активации иммунной системы, в частности клеток иммунной системы, против антигена вакцины.

В одном предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения ингибиторов или антагонистов СЬ1-Ь для изготовления фармацевтической композиции для усиления иммунореактивности к антигену у пациента и/или усиления иммунореактивности в чистом виде, которое включает выделение клеток иммунной системы пациента, усиление иммунореактивности ίη νίίτο или ех νίνο с помощью ингибиторов или антагонистов СЬ1-Ь и реимплантацию клеток пациенту, при этом иммунореактивность возрастает путем снижения или ингибирования функции СЬ1-Ь в клетках.

Реализацию усиления иммунореактивности, предпочтительно на ограниченный срок, параллельно с вакцинацией, введением антигена можно индуцировать путем снижения экспрессии СЬ1-Ь в небольшой части циркулирующих Т-клеток. Можно получить РВМСк (мононуклеары периферической крови) из цельной крови и/или клеток крови из костного мозга и из самой опухолевой ткани (ТГБк) пациента, в идеале иммунизированного несколькими днями раньше, например пятью днями, и обработать их ίη νίίτο или ех νίνο препаратом СЬ1-Ь-специфичной ниРНК. Этот способ выполняется очень быстро. В идеальном случае такой препарат клеток можно снова ввести пациенту всего лишь через несколько минут после выделения. При желании перед реимплантацией клетки можно размножить или подрастить по методикам стимуляции ех-νίνο, пригодным для соответствующих клеток. При циркуляции в организме реципиента активированные ίη νίίτο Т-клетки, составляющие лишь несколько процентов от популяции Т-клеток пациента, сталкиваются с антигенпрезентирующими клетками в лимфатических узлах, где эти антигенпрезентирующие клетки захватили антигены вследствие произошедшей иммунизации и мигрировали туда. Поскольку обработанные ίη νίίτο Т-клетки не нуждаются в сигнале костимуляции, они пролиферируют сразу же после распознавания иммунизационного антигена и секретируют цитокины, которые систематически вносят свой вклад в индукцию иммунного ответа и на клеточном, и на гуморальном уровне. С этим препаратом даже слабоиммуногенные антигены вызывают продолжительный иммунитет. Более того, этим способом можно вызвать отторжение аутологичных опухолей у больных раком. При этом антагонист СЬ1-Ь усиливает иммунореактивность, если он применяется при исключительной и/или сопутствующей химиотерапии/радиотерапии в сочетании с пассивной иммунизацией, как то специфичными к опухолевым антигенам антителами.

Этот способ поэтому применяется для лечения врожденной или приобретенной иммунной недостаточности, в частности СПИДа, множественной миеломы, хронического лимфолейкоза, медикаментозной иммуносупрессии или рака, необязательно с подбором специфичных для заболевания антигенов. Особенно предпочтительно лечение рака, включающего солидные опухоли.

Для повышения вероятности успешного лечения, лечение рака предпочтительно проводится в комбинации с другой противоопухолевой терапией, в частности химиотерапией, радиотерапией, введением терапевтического биопрепарата или вакцинацией с помощью дендритных клеток (опухолевой вакцина

- 3 018966 цией). Ингибирование СЫ-Ь может применяться как часть вакцинации с помощью дендритных клеток, предпочтительно противоопухолевой вакцинации. В качестве альтернативы и/или в дополнение также возможно совместное культивирование ίη νίΐτο СЬ1-Ь-ингибированных клеток с дендритными клетками, полученными от пациента, предпочтительно насыщенными антигенами (клеток) опухоли, а также применение совместного культивирования в целях изобретения.

Усиление иммунореактивности ίη νίΐτο или ех νίνο может осуществляться в терапевтическом способе, как описано выше, при этом клетки подвергаются воздействию антигена по выбору до или после извлечения клеток.

При терапевтическом применении также важна хронологическая последовательность презентирования иммунизационных антигенов, их захвата антигенпрезентирующими клетками, а также миграции этих клеток в региональные лимфатические узлы, где захваченные вещества презентируются активированным Т-клеткам. Поэтому пациенту предпочтительно делают прививку антигеном, предпочтительно еще до выделения клеток, особенно предпочтительно по меньшей мере за 1, 2, 3, 4 или 5 дней и/или не более чем за 20, 16, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 неделю до выделения клеток. С другой стороны, также возможна последующая вакцинация или обработка клеток антигеном ίη νίΐτο или ех νίνο.

Кроме того, также возможно применение антигенпрезентирующих клеток, которые предпочтительно происходят от самого пациента и могут контактировать с соответствующим антигеном, а затем способствуют повышению специфической иммунореактивности либо совместно, либо до или после введения СЬ1-Ь-ингибированных иммунных клеток, предпочтительно Т-клеток.

Клетки предпочтительно специфичны к определенному антигену или же клетки, содержащие определенный антиген, отбираются по специфичности или по присутствию антигена, при этом иммунореактивность выбранных клеток возрастает. Посредством отбора определенного антигена и/или клеток, обладающих иммуностимулирующей специфичностью к нему, иммунный ответ может быть прицельно направлен на определенную мишень у пациента. Такой мишенью, в частности, могла бы быть опухоль (посредством отбора по меньшей мере одного или нескольких антигенов) или патоген.

Вполне возможно, что параллельно с разделением клеток в те же самые стерильные одноразовые пробирки будет вноситься соответствующая ниРНК в смеси для трансфекции. Поэтому в другом аспекте настоящее изобретение касается предпочтительно стерильного контейнера типа одноразовых пробирок, содержащих ингибитор СЬ1-Ь, в частности для усиления иммунореактивности клеток иммунной системы к антигену.

Также настоящим изобретением предусмотрен набор, включающий контейнер, в частности одноразовые пробирки для хранения клеток иммунной системы, а также ингибитора СЬ1-Ь типа ниРНК, в частности для усиления иммунореактивности клеток иммунной системы к антигену способом по изобретению.

Контейнер и/или набор также может содержать иммуностимулирующие вещества, предпочтительно цитокины или лиганды других рецепторов (например, ТЬКк) либо антитела к поверхностным молекулам, предпочтительно СИЗ и/или СЭ28. чтобы дополнительно усилить стимуляцию. Также набор или контейнер может содержать стабилизирующие компоненты, среды или буфера (для стабилизации клеток), растворы для трансфекции или нуклеофекции, предпочтительно такие клеточные среды, как ΚΡΜΙ или Орйшеш.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими фигурами и примерами, но не ограничивается ими.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена упрощенная схема активации Т-клеток при совместной стимуляции (а) или, в случае подавления экспрессии СЬ1-Ь, только при стимуляции Т-клеточных рецепторов (с), которое обычно не приводит к активации (Ь).

На фиг. 2 представлен анализ экспрессии СЬ1-Ь методом вестерн-блоттинга. Клетки СИ8+ выделяли из РВМСк, трансфецированных ниРНК СЬ1-Ь, содержали в культуре и сравнивали с контрольной группой без стимуляции, после стимуляции анти-СИЗ или после стимуляции анти-СИЗ и анти-СЭ28. В качестве контроля на процедуру нагрузки использовали Еуп.

На фиг. 3 представлена секреция ΙΕΝ-γ клетками СЭ8+ человека через два дня после обработки ниРНК. Измеряли концентрацию ΙΕΝ-γ в супернатанте Т-клеток СИ8+ без стимуляции (среда) (слева) и после СИЗ-специфичной стимуляции (в центре) или после совместной СИЗ- и СИ28-специфичной стимуляции (справа). Сравнивали двухдневные популяции клеток, трансфецированных неспецифичной ниРНК (1-й столбец), СЬ1-Ь-специфичной ниРНК (2-й столбец), с-СЬ1-специфичной ниРНК (З-й столбец) и СЬ1-Ь-специфичной + с-СЬ1-специфичной ниРНК (4-й столбец).

На фиг. 4 представлена секреция 1Ь-2 клетками СЭ8+ человека через двадцать дней после обработки ниРНК. Измеряли концентрацию 1Ь-2 в супернатанте Т-клеток СЭ8+ без стимуляции (среда) (слева) и после СИЗ-специфичной стимуляции (в центре) или после совместной СИЗ- и СИ28-специфичной стимуляции (справа). Сравнивали двухдневные популяции клеток, трансфецированных неспецифичной ниРНК (1-й столбец), СЬ1-Ь-специфичной ниРНК (2-й столбец), с-СЬ1-специфичной ниРНК (З-й столбец)

- 4 018966 и СЫ-Ь-специфичной + с-СЫ-специфичной ниРНК (4-й столбец).

На фиг. 5 представлена хронологическая последовательность способа подавления экспрессии СЬ1-Ь ίη νίίτο для усиления иммунореактивности.

На фиг. 6 представлен захват ниРНК Т-клетками человека, выделенными из РВМСк (А), и захват ниРНК клетками РВМСк, истощенными по клеткам СЭ8 (В).

На фиг. 7 представлена экспрессия мРНК СЬ1-Ь после обработки иРНК (А) и количество вырабатываемого белка СЬ1-Ь после обработки иРНК на вестерн-блоте (В).

На фиг. 8 представлена продукция ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α, 1Ь-2 после ингибирования СЬ1-Ь.

На фиг. 9 представлена продукция ΙΡΝ-γ во времени после ингибирования СЬ1-Ь в виде графика от времени.

На фиг. 10 представлено усиление реактивности Т-клеток при измерении по экспрессии маркеров: СО107а + СЭ69 (А), СП107а, СО3, С040Е. 1САМ (В).

На фиг. 11А представлен рост опухолей у мышей после терапии с подавлением СЬ1-Ь в терапевтических клетках СЭ8 или без него.

Фиг. 11В - смертность у мышей с опухолями ΕΟ7ον;·ι после терапии.

Примеры

Пример 1. Последовательности.

Для ингибирования СЬ1-Ь использовали следующие последовательности ниРНК, одни или в комби нации.

1. Смысловая последовательность:

С1А.А.С.А.и.С.А.С.А.О.С;А.С.и.А.и.С1А.и.и

Антисмысловая последовательность;

5’-р.и.с.А.и.А.аи.с.с.и.аи.б.А.и.аи.и.с.и.и

2. Смысловая последовательность:

аи.А.с.и.ааи.с.с.аи.и.А.о.с.А.А.А.и.и

Антисмысловая последовательность:

5’-р.и.и.о.с.и.А.А.с.о.о.А.с.с.А.о.и.А.с.и.и

3. Смысловая последовательность:

с.аи.с.о.А.А.и.и.и.и.аас.и.А.и.и.А.и.и

Антисмысловая последовательность:

5’-р.и.А.А.и.А.с.с.с.А.А.А.А.и.и.с.с.А.с.с.и.и.

4. Смысловая последовательность:

и.А.и.с.А.с.с.А.и.и.и.А.с.(1А.с.и.и.А.и.и

Антисмысловая последовательность:

5’-р.и.А.А.&и.с.аи.А.А.А.и.с.с.и.о.А.и.А.и.и (8ЕЦГО Νο. 1) (8ЕО ГО Νο. 2) (8ЕЦ ГО Νο. 3) (ЗЕЦГОКо. 4) (8ЕЦ ГО Νο. 5) (8 ЕС) ГО Νο. 6) (8ЕО ГО Νο. 7) (8ЕС) ГО Νο. 8)

Для ингибирования с-СЬ1 использовали следующие последовательности ниРНК, одни или в комбинации.

1. Смысловая последовательность:

А.А.и.с.А.А.с.и.с.и.с.А.А.с.аа.А.А.А.и.и

Антисмысловая последовательность:

5’-р.в.и.и.с.с.аи.и.с.А.СА.аи.и.о.А.и.и.и.и

2. Смысловая последовательность:

аА.с.А.А.в.с.с.с.и.с.А.с.А.А.и.А.А.А.и.и

Антисмысловая последовательность:

5’-р.в.и.и.А.и.и.аи.б.А.о.<1аА.и.и.С1и.с.и.и

3. Смысловая последовательность:

и.А.ас.с.с.А.с.с.и.и.А.и.А.и.с.и.и.А.и.и

Антисмысловая последовательность:

5’-р.и.А.А.о.А.и.А.и.А.А.о.аи.о.с.о.с.и.А.и.и

4. Смысловая последовательность:

а.о.А.о.А.с.А.с.А.и.и.и.с.о.о.А.и.и.А.и.и

Антисмысловая последовательность:

5’-р.и.А.А.и.с.с.о.А.А.А.и.с.и.аи.с.и.с.с.и.и (ЯЕ<2 ГО Νο. 9) (8Εζ>ΤΓ)Νο. 10) (8Ες>ΙϋΝο. 11) (8Ε()ΙϋΝο. 12) (8ЕО ΙϋΝο. 13) (8Ε(,)ΙΝΝο. 14) (8ΕΟΙΓ)Νο. 15) (8Ε<21ΠΝο. 16)

- 5 018966

Пример 2. Кратковременное снижение экспрессии СЫ-Ь.

В данном примере будет показано, что на иммунореактивность Т-клеток можно повлиять ех νίνο.

Цельную кровь брали у доноров, используя пробирки СРТ (Уаси1ашег), и отделяли клетки РВМС центрифугированием. На следующей стадии из этого препарата концентрировали клетки СЭ8+. Одну партию клеток трансфецировали СЬ1-Ь-специфичной ниРНК с помощью аппарата для трансфекции клеток Атаха (см. детальный протокол в примере 3), а затем культивировали. Аналогичную партию клеток трансфецировали неспецифической ниРНК по идентичной методике, а затем культивировали в качестве контроля. Поскольку предполагается возможное перекрывание функций СЬ1-Ь и с-СЬ1, две другие партии клеток обрабатывали с-СЬ1-специфичной ниРНК и комбинацией из с-СЬ1-специфичной + СЬ1-Ьспецифичной ниРНК. Все партии клеток культивировали в течение двух дней. То, что трансфекция ведет к искомому подавлению экспрессии СЬ1-Ь, демонстрировали при последующем анализе методом вестерн-блоттинга. Чтобы индуцировать экспрессию СЬ1-Ь, культуры клеток стимулировали СЭ3. а другую партию клеток - СЭЗ-специфичными и С.'Э28-специфичными антителами. Во всех экспериментах экспрессия СЬ1-Ь в трансфецированных препаратах подавлялась до менее 5% от интенсивности при контрольной трансфекции, как видно из фиг. 2. Поскольку стабильность ниРНК и, следовательно, эффективное подавление экспрессии имеет ограниченную продолжительность и не передается другим клеткам, то отобранные образцы представляют кратковременное подавление экспрессии СЬ1-Ь, которое напрямую связано с присутствием ниРНК СЬ1-Ь.

Пример 3. Методика трансфекции.

Нуклеофекция Т-клеток человека с помощью ниРНК.

Нуклеофекция осуществляется при совместной работе с другим лаборантом. Один человек пипеткой вносит олигонуклеотиды ниРНК, а другой переносит образцы в культуральную среду. Это значительно ускоряет процедуру.

1. Приготовить клеточную среду ЯРМ1 (+реп/йгер., +Ь-д1и1, +10% РС8).

2. Внести пипеткой культуральную среду по меньшей мере в две пробирки/конструкции Ра1сои на 50 мл (одна для сбора нуклеофецированных клеток и одна для среды промывки клеток), по 1 мл образца для нуклеофекции в каждую пробирку. Довести пробирки до 37°С.

3. Пометить микропробирки (ЕррепбогТ) для каждого образца нуклеофекции.

4. Центрифугировать подлежащие нуклеофекции клетки (410хд) в течение 7 мин и удалить супернатант. Добавить среду ОрИтет (О1Ьсо, #31985-047) так, чтобы плотность клеток составила 40х10⁶ клеток/мл.

5. Внести по 100 мкл (= 4х 10⁶ клеток) в каждую микропробирку.

6. Добавить 1,5-2,5 мкМ олигонуклеотидов ниРНК в микропробирки, содержащие клетки, точно перед нуклеофекцией. Перемешать с помощью пипетки и перенести раствор в кювету (избегая образования воздушных пузырьков). Постучать кюветой по столу для удаления пузырьков.

7. Закрыть крышкой и поставить кювету в устройство для трансфекции Атаха (электропоратор). (Программа И-14, а не У-24, так как это лучший вариант при использовании раствора ОрИтет Νυс1ео1ес!ог). Нажать кнопку X и убрать кювету после сигнала ОК. (Нажать кнопку X снова перед следующей электропорацией).

8. Немедленно добавить 500 мкл ЯРМ1 (37°С) в кювету для трасфекции и осторожно перемешать с помощью пипетки Пастера. Перенести клетки в пробирку для сбора Ра1соп. Промыть кювету один раз 500 мкл подогретой среды КРМ1 и перенести оставшиеся клетки в пробирку для сбора Ра1соп.

9. Повторить операции 5-7 для каждого образца.

10. Поставить пробирки Ра1соп в инкубатор до завершения нуклеофекции всех проб.

11. Внести по 4 мл суспензии клеток в лунки 6-луночного планшета (=2 образца) и поставить планшеты в инкубатор.

12. На следующий день собрать клетки, посчитать их и запустить культивирование через 24 ч после проведения нуклеофекции, как описано выше. Взять порцию клеток для выделения РНК с целью проверки того, что ген-мишень подвергался понижающей регуляции в момент активации. Пробы белка берутся на основе динамики экспрессии белка.

Пример 4. Эффективность нуклеофекции.

СЭ8+ выделяли из периферической крови человека, как описано выше. Отрицательный отбор осуществляли с помощью гранул.

Результаты (сравнение с Атаха):

чистота популяции: 97% СЭ8+ (РАС8)

Метод	Жизнеспособность через 3,5 ч по исключению трипанового синего (%)	Жизнеспособность через 24 ч по исключению трипанового синего (%)	Эффективность по наличию ϊίΟΙο методом РАС8 (%)
Ашаха У-24	94	93	96
Без обработки	100	99	0

- 6 018966

Эксперимент со средой Орйтет:

Нуклеофекция в:	Программа	Клетки во время и после в:	Жизнеспособность через 3,5 ч по исключению трипанового синего (%)	Жизнеспособность через 24 ч по исключению трипанового синего (%)	Эффективность по наличию зЮ1о методом РАС5(%)
Раствор ИиНеоГесЮг	ν-24	ьтс	99	92	96
Орйтет	ν-24	ΚΜΡΙ	92	67	96
Орйтет	и-14	ΚΜΡΙ	95	92	96

Таким образом, методами белковой химии обнаружено явное снижение экспрессии СЫ-Ь.

Пример 5. Кратковременное усиление реактивности Т-клеток - измерение ΙΡΝ-γ.

Таким образом, было показано, что экспрессия СЬ1-Ь в клетках СЭ8+ человека может быть подавлена с эффективностью не менее 95%. В качестве другого результата теперь будет показано, что реактивность популяции Т-клеток также может быть усилена. Чтобы удостовериться, что искомый эффект специфичен исключительно к СЬ1-Ь и не может быть обойден в случае подавления экспрессии СЬ1-Ь с помощью с-СЬ1, в другом препарате также подавляли с-СЬ1, а в третьем подавляли с-СЬ1 и СЬ1-Ь. Все эти культуры клеток СЭ8+ культивировали 2 дня и стимулировали с помощью СЭ3, а также СЭ3 и СЭ28, и сравнивали с нестимулированными клетками. В норме Т-клеткам для пролиферации необходима указанная совместная стимуляция СЭ3 и СЭ28, которую легко определить по секреции воспалительных цитокинов в супернатантах культур. Для выявления этой активации Т-клеток измеряли титры ΙΡΝ-γ в супернатантах. На фиг. 3 представлен график влияния подавления экспрессии путем обработки ниРНК на реактивность Т-клеток. Через два дня после трансфекции все культуры клеток СЭ8+ трансфецировали СЬ1Ь- и/или с-СЬ1-специфичными ниРНК, стимулировали, как описано, и сравнивали с контрольной группой, которую трансфецировали неспецифической ниРНК. Нестимулированные клетки практически не проявляли экспрессии ΙΡΝ-γ. После стимуляции только одним СЭ3 все культуры проявляли повышенную реактивность, так что в супернатантах определялось по меньшей мере 500 пг/мл ΙΡΝ-γ. Сигналы у клеток, трансфецированных с-СЬ1-специфичной и неспецифичной ниРНК, были очень близкими (низкими). И только клетки, трансфецированные СЬ1-Ь-специфичными ниРНК, проявляли гораздо большую реактивность, которая сочеталась с титром ΙΡΝ-γ примерно в 3 нг/мл. Однако реактивность клеток, совместно трансфецированных СЬ1-Ь- и с-СЬ1-специфичными ниРНК, была ниже, чем после обработки СЬ1Ь-специфичными ниРНК, достигая лишь 1,2 нг/мл. Во всех случаях совместная СЭ3- и СО28специфичная стимуляция давала, как и ожидалось, существенно большие сигналы, чем только одна СЭ3специфичная стимуляция. Контрольный препарат, обработанный неспецифической ниРНК, проявлял титр ΙΡΝ-γ на уровне 1,2 нг/мл, тогда как культура, обработанная СЬ1-Ь-специфичной ниРНК, проявляла концентрацию ΙΡΝ-γ 3,8 нг/мл. Примечательно, что культура с совместным специфическим подавлением СЬ1-Ь и с-СЬ1 проявляла титр в 1,7 нг/мл, что было значительно ниже, чем титры в группе с подавлением СЬ1-Ь. Также неожиданно оказалось, что популяция клеток, обработанная СЬ1-Ь-специфичной ниРНК, имела значительно меньшую реактивность, а в супернатанте определялось лишь 500 пг/мл ΙΡΝ-γ. Эта концентрация значительно ниже, чем в контрольной группе с неспецифической обработкой и совместной стимуляцией, и сравнима с уровнем контрольной группы, стимулированной только одним анти-СЭ3. Таким образом, в отличие от мышиной системы избыточность СЬ1-Ь и с-СЬ1 в Т-клетках СЭ8+ человека была исключена экспериментально, и для усиления иммунореактивности целесообразным является терапевтический подход через СЬ1-Ь (и его вышележащие регуляторы), но не через комбинации СЬ1-Ь/с-СЬ1. Однако ингибирование с-СЬ1 способствует иммунносупрессии при других показаниях, как то при лечении воспаления или аллергии.

Такой сопутствующий терапевтический подход либо в виде монотерапии, либо в сочетании с вакцинацией также способен распознавать диссеминированные раковые клетки на периферии и в конце концов противодействовать им путем выработки иммунного ответа. К тому же при его применении сразу же после диагностики рака предотвращается распространение первичной опухоли.

Пример 6. Кратковременное усиление реактивности Т-клеток - измерение ΙΤ-2.

Очень близкий результат был получен при измерении концентрации ΙΤ-2 в тех же супернатантах, как видно из фиг. 4. Без стимуляции не было никакого измеримого ответа, тогда как анти-СЭ3специфическая обработка давала хорошо измеримые сигналы во всех группах. Так, в группе с подавлением СЬ1-Ь определялось >200 пг/мл. Концентрация ΙΤ-2 в популяции клеток с совместным подавлением СЬ1-Ь и с-СЬ1 опять же была значительно ниже и составляла <100 пг/мл. Совместная анти-СЭ3- и антиСО28-специфичная стимуляция давала еще более высокие сигналы. Концентрации ΙΤ-2 в >800 пг/мл определялись во всех группах независимо от обработки ниРНК. Контрольная группа проявляла титры, очень близкие к титрам групп с подавлением СЬ1-Ь в 1,3 и 1,4 нг/мл. Интересно, что концентрации Ш-2 после специфического подавления с-СЬ1 были значительно ниже и достигали лишь 800 пг/мл независимо от того, использовали при этом только один с-СЬ1 или же с-СЬ1 вместе с СЬ1-Ь.

- 7 018966

Пример 7. Кратковременное усиление иммунореактивности.

В результате обработки ίη νίίτο или ех νίνο эффективно возрастает реактивность Т-клеток, так что через стимуляцию одних лишь Т-клеточных рецепторов можно индуцировать пролиферацию Т-клеток. Это является необходимой предпосылкой терапевтического подхода, описанного в настоящем изобретении. Такое подавление имеет кратковременный характер вследствие применения технологии РНКинтерференции.

Такое применение этих модифицированных клеток служит для усиления иммуногенности вакцин и усиления реактивности иммунной системы в целом. Через 5 дней после базовой иммунизации у пациентов брали цельную кровь в пробирки СРТ. Примерно через 20 мин выделяли РВМСк центрифугированием. Выделенные клетки трансфецировали СЬ1-Ь-специфичными ниРНК и реимплантировали пациенту сразу же после этого. На 10-й день снова брали цельную кровь и отделяли сыворотку. Измеряли титры провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и сравнивали с контрольной группой. Характер индуцированного иммунного ответа также анализировали в отношении клеточной направленности Т111контролируемого иммунного ответа (повышение титров ΙΡΝ-γ, 1Ь-2 и 1Ь-12) или гуморальной направленности Т112-ориентированного иммунного ответа (повышение титров 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-10). При необходимости с интервалом в 14 дней проводится повторная иммунизация (бустер) вместе с терапией клетками РВМС или без неё (фиг. 5).

Пример 8. Нуклеофекция Т-клеток СЭ4 и В-клеток СЭ19.

Клетки РВМС выделяли, как описано выше, и трансфецировали при тех же условиях, что и в примере 3 (И14). Для трансфекции использовали олигонуклеотид К1СЬО красный в концентрации 2 мкМ, а специфический захват определяли методом РЛС8; дифференциальное определение клеток СЭ4 и СЭ8 осуществляли при одновременном двойном окрашивании с помощью СЭ8-ПТС и СЭ3-ЛРС (фиг. 6А).

Клетки РВМС получали, как описано выше, и из них выделяли клетки СЭ8. Затем оставшиеся клетки СЭ8-минус тоже трансфецировали К1СЬО красным, как описано выше (но при концентрации олигонуклеотида в 3,3 мкМ). Специфический захват определяли методом с помощью РАС8 при одновременном двойном окрашивании СЭ3-Р1ТС и СЭ19-АРС (фиг. 6В). Интересно, что в этом эксперименте также наблюдалось то, что эффективный захват используемого олигонуклеотида происходит и во фракции лимфоцитов СЭ3/СЭ19-минус. которая в основном содержит ΝΚ-клетки.

Таким образом, данный пример свидетельствует, что другие иммунные клетки также могут быть трансфецированы с высокой эффективностью при тех же условиях трансфекции, что и клетки СЭ8.

Пример 9. Кратковременное снижение экспрессии СЬ1-Ь в клетках СЭ4 человека на уровне мРНК и белка.

Клетки СЭ4 выделяли из РВМС5 путем истощения клеток СЭ8 и культивировали со стимуляцией РНА/анти-СЭ3/28. Через 2 недели эти клетки СЭ4 трансфецировали СЬ1-Ь-специфичной ниРНК по методике трансфекции фирмы Атаха (см. примеры 3 и 8). Идентичную порцию клеток трансфецировали неспецифической ниРНК по такой же методике в качестве контрольной группы. После трансфекции клетки культивировали с 1Ь-2 (5 нг/мл) еще один день и стимулировали анти-СЭ3/28 на следующий день.

Экспресия мРНК СЬ1-Ь в трансфецированном препарате снижалась приблизительно на 85% по сравнению с контрольной трансфекцией в клетках СЭ4, стимулированных в течение 24 ч (фиг. 7А). Резкое снижение мРНК СЬ1-Ь коррелировало со сравнительно сильным сокращением количества белка СЬ1Ь, обнаруженным на вестерн-блоте (фиг. 7В).

Пример 10. Усиление реактивности Т-клеток СЭ4-измерение цитокинов с противоопухолевой активностью.

Одной из основных задач клеток СЭ4 в опосредованном Т-клетками иммунном ответе является выработка воспалительных цитокинов. В частности, в литературе упоминаются цитокины 1Ь-2, ΙΡΝ-γ и ΪΝ1-α.

Поэтому определяли экспрессию этих трех цитокинов методом ЕЬ18А. Через 24 ч после стимуляции анти-СЭ3/28 содержание этих трех цитокинов в Т-клетках СЭ4 человека при подавлении СЬ1-Ь значительно возрастало (фиг. 8).

Пример 11. Кратковременное течение усиления реактивности Т-клеток СЭ4 через повышение продукции цитокинов с противоопухолевой активностью.

Для достижения эффективной противоопухолевой активности Т-клеток при подавлении СЬ1-Ь также важно, чтобы в течение определенного времени после стимуляции Т-клеток поддерживалась повышенная продукция цитокинов. Однако такой период времени также должен быть ограниченным, чтобы минимизировать риск возникновения постоянного нежелательного аутоиммунитета по отношению к нераковым тканям пациента.

Поэтому также анализировали продукцию ΙΡΝ-γ методом ЕАС8 по внутриклеточному окрашиванию в различные моменты времени. Из диаграммы на фиг. 9 четко видно, что заметное повышение ΙΡΝ-γ сохранялось по меньшей мере в течение 48 ч, но через шесть дней после стимуляции оно вернулось к уровню, сравнимому с уровнем в контроле.

Пример 12. Усиление реактивности Т-клеток СЭ4 - повышение экспрессии поверхностных молекул

- 8 018966 с функциональными свойствами и/или функцией маркеров стимуляции.

Определение продукции соответствующих цитокинов в качестве маркеров функционально успешного подавления СЫ-Ь в Т-клетках человека технически более сложно и поэтому вряд ли может быть выполнено точно в срок. Поэтому также определяли экспрессию функционально важных поверхностных маркеров методом ЕЛС8.

СЭ107а описан в литературе как поверхностный маркер секреторной активности цитотоксических Т-лимфоцитов, поэтому его определяли при подавлении СЬ1-Ь в Т-клетках СЭ8 через 24 ч после стимуляции анти-СОЗ/28. При этом Т-клетки, трансфецированные ниРНК СЬ1-Ь, проявляли сильное повышение секреторной активности (фиг. 10 А).

Поскольку в Т-клетках молекула СЭ107а участвует в везикулярном транспорте, её тоже можно использовать в качестве основного маркера секреторной активности Т-клеток СЭ4. Из фиг. 10В видно, что экспрессия СЭ107а в трансфецированных ниРНК СЬ1-Ь клетках также была значительной при сравнении с экспрессией в контрольных клетках, во всем остальном обработанных таким же образом.

СИ40Ь и 1САМ - две другие поверхностные молекулы, которые могут индуцироваться при стимуляции Т-клеток. Эти две молекулы имеют функциональное значение, в частности, СИ40Ь - для взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками и для стимуляции/пролиферации В-клеток, а 1САМ - для взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками и миграции из сосудистой системы в (злокачественную) ткань. Из фиг. 10В видно, что экспрессия этих двух поверхностных молекул существенно возрастает в трансфецированных ниРНК СЬ1-Ь Т-клетках СЭ4 человека.

Один из механизмов, описанный в настоящем изобретении как отвечающий за повышение реактивности Т-клеток, заключается в менее выраженном подавлении рецепторов СИЗ на поверхности клеток. Из фиг. 10В видно, что количество рецепторов СИЗ, все еще находящихся на поверхности клетки, также значительно повышается в трансфецированных ниРНК СЬ1-Ь Т -клетках СЭ4 человека.

Интересно, что экспрессия на поверхности клеток СЭ9 - традиционного маркера активации Тклеток тоже существенно повышалась, тогда как экспрессия СО25 оставалась без изменений. Это может иметь определенное функциональное значение, так как, хотя СО25 и описан как маркер стимуляции, его функция особенно связана с присутствием и выживанием так называемых Т-регуляторных клеток.

В целом из фиг. 10 следует, что при трансфекции ниРНК СЬ1-Ь на поверхности клеток в достаточно больших количествах обнаруживаются дополнительные функционально важные молекулы или молекулы, служащие поверхностными маркерами.

Пример 13. Совместная пересадка СЬ1-Ь-дефицитных Т-клеток и дендритных клеток является эффективной терапевтической процедурой на модели опухолей ίη νίνο.

У мышей дикого типа вызывали опухоли подкожной инъекцией 0,1 млн. клеток ЕС7ома. Затем на 5-й и 6-й день делали инъекции Т-клеток СЭ8 и дендритных клеток и непрерывно отслеживали эффект этой адоптивной терапии по измерениям роста опухоли. Из фиг. 11А видно, что рост опухоли подавляется намного сильнее и на более длительный период времени при пересадке СЬ1-Ь-дефицитных Т-клеток, чем Т-клеток дикого типа.

Из фиг. 11В также видно, что обработка СЬ1-Ь-дефицитными Т-клетками обеспечивает долгосрочную выживаемость у значительной части обработанных мышей вплоть до конца 80-дневного периода наблюдения. В противоположность этому, обработка Т-клетками дикого типа приводила только к небольшому увеличению продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой. Таким образом, из фиг. 11В видно, что обработка СЬ1-Ь-дефицитными или ингибированными Т-клетками имеет существенное преимущество по сравнению с обработкой нормальными Т-клетками.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ усиления иммунореактивности у пациента, включающий выделение по меньшей мере одной клетки иммунной системы пациента;

обработку этой клетки ίη νίΐτο или ех νίνο по меньшей мере одним ингибитором или антагонистом СЬ1-Ь для увеличения иммунореактивности клетки и возвращение клетки в организм пациента;

причем ингибитор или антагонист СЬ1-Ь выбирают из группы, состоящей из последовательности ДНК с короткой цепью, комплементарной части СЬ1-Ь мРНК последовательности, и последовательности РНК с короткой цепью, комплементарной части СЬ1-Ь мРНК последовательности; указанная клетка, при необходимости, контактирует с антигеном, а иммунореактивность к антигену у пациента увеличивается путем снижения или ингибирования функции СЬ1-Ь клетки.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что функция СЬ1-Ь снижается или ингибируется путем снижения или ингибирования экспрессии СЬ1-Ь.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что снижение или ингибирование функции СЬ1-Ь является кратковременным.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что экспрессия СЬ1-Ь снижается или ингибируется с помощью антисмысловой РНК или ниРНК СЬ1-Ь.

- 9 018966
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что экспрессия СЫ-Ь снижается или ингибируется с помощью антагонистов, ингибиторов, аптамеров или интрамеров СЬ1-Ь.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что клетки уже захватили антиген и предпочтительно презентируют фрагмент антигена или, что еще лучше, распознают фрагмент антигена в контексте НЬЛ и при этом активировались.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что клетки включают антигенпрезентирующие клетки, мононуклеары периферической крови (РВМСк), Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, ΝΚ-клетки, ΝΚΤ-клетки и/или дендритные клетки, в частности Т-лимфоциты, предпочтительно Тлимфоциты СЭ8+ или СЭ4+.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что клетки обрабатываются иммуностимулирующим веществом, предпочтительно иммуностимулирующим цитокином, или лигандом других иммуностимулирующих рецепторов, или антителом к поверхностным молекулам, предпочтительно СЭ3 и/или СО28.
9. Применение ингибиторов или антагонистов СЬ1-Ь, выбранных из группы, состоящей из последовательности ДНК с короткой цепью, комплементарной части СЬ1-Ь мРНК последовательности, и последовательности РНК с короткой цепью, комплементарной части СЬ1-Ь мРНК последовательности, для изготовления фармацевтической композиции для усиления иммунореактивности к антигену у пациента путем выделения клеток иммунной системы пациента, повышения иммунореактивности клеток ίη νίίτο или ех νίνο с помощью ингибиторов или антагонистов СЬ1-Ь и реимплантации клеток пациенту, причем иммунореактивность повышается путем снижения или ингибирования функции СЬ1-Ь этих клеток.
10. Применение по п.9 для лечения врожденной или приобретенной иммунной недостаточности, в частности СПИД, множественной миеломы, хронического лимфолейкоза, медикаментозной иммуносупрессии или рака.
11. Применение по п.10, отличающееся тем, что рак образует солидные опухоли.
12. Применение по п.10 или 11 для лечения рака в комбинации с другой противоопухолевой терапией, предпочтительно химиотерапией, радиотерапией, введением биопрепарата или вакцинацией с помощью дендритных клеток, в частности опухолевой вакцинацией.
13. Применение по любому из пп.9-12, отличающееся тем, что пациент подвергался вакцинации антигеном предпочтительно до выделения клеток, особенно предпочтительно не менее чем за 2 дня и/или не более чем за 8 недель до выделения клеток.
14. Применение по любому из пп.9-13, отличающееся тем, что клетки подвергаются контакту с антигеном ίη νίίτο или ех νίνο.
15. Применение по любому из пп.9-14, отличающееся тем, что повышение иммунореактивности клеток ίη νίίτο или ех νίνο определяется по пп.1-8.
16. Применение по любому из пп.9-15, отличающееся тем, что клетки специфичны к определенному антигену либо клетки, содержащие определенный антиген, отбираются по специфичности к антигену или по присутствию антигена, при этом иммунореактивность выбранных клеток возрастает.
17. Применение по п.16, отличающееся тем, что антиген является опухолевым антигеном.
18. Применение по любому из пп.9-17, отличающееся тем, что перед реимплантацией клетки размножают.
19. Контейнер, предпочтительно одноразовые пробирки, содержащие ингибитор СЬ1-Ь, используемый в способе для усиления иммунореактивности клеток иммунной системы к антигену по любому из пп.1-8 или в применении по любому из пп.9-18.
20. Набор для выполнения способа по пп.1-8 или применение по пп.9-18, включающий контейнер по п.19.
21. Контейнер по п.19 или набор по п.20, дополнительно включающий иммуностимулирующее вещество, предпочтительно иммуностимулирующий цитокин, или лиганд других иммуностимулирующих рецепторов, или антитело к поверхностным молекулам, предпочтительно СЭ3 и/или СО28.