CN117881778A - 用于产生原代免疫细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及用于制备用于过继细胞疗法的细胞群和组合物的方法、细胞和组合物。特别地，本文提供了用于使包括T细胞群的原代免疫细胞扩增和增殖的方法。

Description

用于产生原代免疫细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年8月24日提交的美国临时申请号63/236,443的优先权，该申请的披露内容通过引用以其全文并入。
技术领域
本披露涉及用于制备用于过继细胞疗法的细胞群和组合物的方法、细胞和组合物。特别地，本文提供了用于使包括T细胞群的原代免疫细胞扩增和增殖的方法。
背景技术
近年来，工程化过继细胞疗法为恶性血液病患者带来了变革，其中2017年FDA首次批准了基于嵌合抗原受体(CAR)的疗法(Larson和Maus,NatRev Cancer[自然评论癌症]21,145-161(2021)；Yu等人,Nature Reviews Drug Discovery[自然评论药物发现]19,583-584(2020))。自2017年以来，研究过继细胞疗法(如CAR-T细胞、CAR自然杀伤(NK)细胞和CAR-NKT细胞、T细胞受体(TCR)-T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肿瘤特异性抗原靶向T细胞)以及其他细胞疗法的临床试验数量增长迅速。最近，第一批CAR巨噬细胞(CAR-M)已进入临床用于治疗实体瘤(Mukhopadhyay,NatMethods[自然方法]17,561(2020)；Klichinsky等人,NatBiotechnol.[自然生物技术],8,947-953(2020)；Villanueva,Nature ReviewsDrug Discovery[自然评论药物发现]19,308(2020)；ClinicalTrials.gov识别符：NCT04660929)。
虽然细胞疗法对患者有很大的治愈潜力，但许多因素限制了这些药物的广泛开发和施用。目前，大多数细胞疗法以自体方式生产，并且关系到可变的细胞产品质量、细胞因子释放综合征和其他毒性、延长的制造时间、高成本以及这些疗法可以经基因修饰以提高其功效的有限时间(Larson和Maus,Nat Rev Cancer[自然评论癌症]21,145-161(2021))。
目前，在临床上测试的大多数细胞疗法均使用CAR-T或CAR-NK细胞，因为这些免疫细胞子集表现出强大的细胞毒性。用于这些疗法的成熟原代人类T细胞存在于人类的血液和次级淋巴器官中，在这里它们可以保护个体免受传染病和癌症的侵害。T细胞由αβ(“经典”T细胞)和γδ子集组成。αβT细胞由CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞组成。CD4+T细胞可进一步细分为TH1细胞、TH2细胞、TH9细胞、TH17细胞、TFH细胞和调节T细胞。许多αβT细胞子集表现出强大的细胞毒性功能，而这已被用于开发细胞疗法。
类似地，可用于细胞疗法的成熟原代人类NK细胞存在于血液、次级淋巴器官、肝脏和黏膜相关淋巴组织中，这些部位是NK细胞巡视病原体或转化细胞是否存在的部位(Jianhua等人,Trends in Immunology[免疫学趋势]34,573-582(2013))。与T细胞一样，NK细胞表现出强大的细胞毒性功能，并且对开发细胞疗法很有意义。
然而，原代人类免疫细胞(如T细胞和NK细胞)在体外和体内也具有有限的增殖潜力，这限制了它们用于产生广泛的非定制细胞疗法的能力。进一步地，成熟原代人类免疫细胞的这种有限的增殖能力削弱了它们进行基因编辑以减轻细胞因子释放综合征和其他潜在的细胞疗法相关毒性、克服肿瘤微环境相关挑战以及防止患者排斥同种异体细胞疗法产品的能力。
患者来源的白血病细胞系已经在细胞培养中进行了数十年的研究，其中它们的转化状态赋予了长期增殖能力，使其能够用于各种细胞测定。这继而又促进了许多疗法的发展。然而，这些细胞通常缺乏成熟原代人类T细胞和NK细胞的强大细胞毒性功能，因为它们通常不成熟或源自功能失调的T细胞克隆。这些细胞的转化性质可以映射到一组突变，这些突变也经常存在于T细胞急性淋巴细胞白血病患者中。此外，来自非人灵长类动物的成熟T细胞可以被疱疹病毒转化，其转化途径与患者体内原代人类T细胞转化所涉及的一些相同机制趋同(Biesinger等人,Proc NatlAcad Sci USA[美国国家科学院院刊]89,3116-3119(1992)；Weber等人,ProcNatlAcadSci USA[美国国家科学院院刊]90,11049-11053(1993)；Fickenscher H,Fleckenstein B.,Philos Trans R Soc LondB Biol Sci.[伦敦皇家学会B辑：生物科学哲学学报]356(1408):545-67(2001)；Tsygankov,JCellPhysiol.[细胞生理学杂志]203(2):305-18(2005))。
虽然先前的研究表明，原代人类T细胞可以通过以下方式而永生化，通过以下因子的过表达，例如端粒酶-逆转录酶(TERT)(Barsov,Methods Mol Biol.[分子生物学方法]511,143-58(2009)；Rufer等人,Blood[血液]98,597-603(2001)；Hooijberg等人,JImmunol.[免疫学杂志]165,4239-45(2000))和人类T细胞白血病病毒1型或人类T细胞白血病病毒2型(HTLV-1/HTLV-2)转录反式激活蛋白Tax(Akagi等人,Oncogene[致癌基因]14,2071-2080(1997)；Grassmann等人,Proc NatlAcad Sci USA[美国国家科学院院刊]86,3351-3355(1989)；Ren等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]287,34683-34693(2012))；或通过病毒如松鼠猴疱疹病毒(Herpesvirus saimiri)(Biesinger等人,Proc NatlAcad SciUSA[美国国家科学院院刊]89,3116-3119(1992)；Weber等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]90,11049-11053(1993))以及HTLV-1/HTLV-2，但是这些方法的可重复性不高，并且可能导致经修饰或感染细胞的重编程。另外，增殖寿命已通过TERT过表达得到增强的细胞仍需要使用饲养细胞或通过其T细胞受体进行广泛的外源刺激以驱动增殖(Rufer等人，Blood[血液]98,597-603(2001)；Hooijberg等人,J.Immunol.[免疫学杂志]165,4239-45(2000))。在建立成熟原代人类T细胞或NK细胞库时，使用同种异体饲养细胞和广泛的重复刺激是不可取的，因为这些方法对规模化存在挑战，并可能最终驱动细胞进入功能失调状态。进一步地，使用具有转化成熟原代人类T细胞或NK细胞能力的感染剂限制了这些细胞在细胞疗法开发中的使用，因为患者通常是免疫受损的。
鉴于这些挑战，迫切需要建立可替代的方法来延长原代人类免疫细胞的增殖寿命，使得能够大规模生产同种异体细胞毒性细胞。本披露描述了解决这种未满足需求的方法和细胞。
发明内容
本文的披露内容提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：(a)将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞；以及(b)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
本文的披露内容还提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：(a)抑制一种或多种内源性调节因子在原代免疫细胞中的表达，其中该内源性调节因子是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)；(b)抑制一种或多种内源性免疫相关基因在原代免疫细胞中的表达，其中该内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)；以及(c)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
本文的披露内容进一步提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：(a)抑制一种或多种内源性调节因子在原代免疫细胞中的表达，其中该内源性调节因子是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)；(b)抑制一种或多种内源性免疫相关基因在原代免疫细胞中的表达，其中该内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)；以及(c)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
本文的披露内容提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：(a)抑制一种或多种内源性调节因子在原代免疫细胞中的表达，其中内源性调节因子是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)；以及(b)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
本文的披露内容还提供了一种根据所述方法产生的工程化免疫细胞群。本文的披露内容进一步提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述工程化免疫细胞群和药学上可接受的载剂。本文的披露内容进一步提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。
本文的披露内容提供了一种工程化T细胞，该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)、S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)、β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)。
本文的披露内容提供了一种表达编码超大B细胞淋巴瘤(Bcl-XL)的转基因的工程化T细胞，其中该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)、S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)和/或磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)。
附图说明
图1A至1B说明了Bcl-xL插入赋予T细胞在长期培养中存活的选择性优势。如图2所述，将总原代人类T细胞(图1A)或纯化的原代人类CD8+T细胞(图1B)进行分离、刺激、转染和再刺激。
图2说明了用于在原代人类T细胞中鉴定提高存活率的转基因的方法。
图3A至3B说明了细胞周期调节分子表达的消除增强了T细胞在长期培养中的增殖能力。
图4A至4D说明了TREX+Bcl-xL细胞的再刺激可以增强它们在长期培养中的增殖。图4A示出了TREX+Bcl-xL细胞随时间的总扩增倍数。图4B至4D示出了TREX+Bcl-xL细胞和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞的总扩增倍数，用αCD3或αCD3/αCD28 Dynabeads对这些细胞再刺激3天然后将细胞去珠。对静息细胞和经处理细胞随时间的总扩增倍数进行跟踪并绘图。箭头表示再刺激的时间段。黑色箭头表示评估额外的再刺激方式的时间点。图4A至4D示出了对数标度。
图5A至5B说明了TREX+Bcl-xL细胞在细胞培养中的扩增和存活依赖于IL-2。评估了如图3中所建立的来自两个不同供体的3个TREX+Bcl-xL系的总扩增倍数(图5A)和细胞活力(图5B)，这些TREX+Bcl-xL系在增加量的重组人白细胞介素2(IL-2)的存在下生长6天。
图6A至6K说明了TREX+Bcl-xL细胞在表型上类似于正常的原代人类CD8+T细胞。TREX+Bcl-xL细胞用可固定的活力染料以及一组针对CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RO、CCR7、PD1和TIGIT的抗体染色。TREX+Bcl-xL系表现出CD3的表达(图6A)，并包含高频率的CD8+细胞(图6B)。TREX+Bcl-xL系表现出供体或细胞系特异性属性，如通过标志物(如PD1和TIGIT(图6C)、CD28(图6D)、以及CCR7和CD45RO(图6E))的表达所例证的那样，而不论Bcl-xL过表达(GFP+细胞和GFP-细胞)如何。TREX+Bcl-xL系表现出CCR2(图6F)、CCR5(图6G)和CXCR3(图6J)的表达。CCR6(图6H)的表达是异质的，而CCR7(图6I)和CXCR5(图6K)的表达低至不存在。
图7A至7F说明了TREX+Bcl-xL细胞是具有细胞毒性的。在添加效应细胞和T细胞衔接器(engager)或对照抗体后12小时(图7A)和24小时(图7B)计算细胞溶解百分比。在添加效应细胞和T细胞衔接器后72小时，从共培养物中收集上清液并分析是否存在干扰素γ(IFN-γ)(图7C)、IL-2(图7D)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(图7E)和颗粒酶B(图7F)。
图8A至8G说明了TREX+Bcl-xL细胞可以产生功能性CAR-TREX+Bcl-xL细胞。转导后22天，使用流式细胞术来评估表面CAR表达(图8A)。在添加效应细胞后12小时(图8B)和24小时(图8C)计算细胞溶解百分比。CAR-TREX活性以CAR-T细胞和CAR-CD8+T细胞为基准。在添加效应细胞后72小时，从共培养物中收集上清液并分析是否存在IFN-γ(图8D)、IL-2(图8E)、TNF-α(图8F)和颗粒酶B(图8G)。
图9A至9C示出了TREX细胞运送到与原代CD8+T细胞相似的位置并且在体内应答于IL-2。
图10A至10B示出了CAR-TREX细胞在体内应答于IL-2和IL-15。
图11A至11D示出了CAR-TREX细胞在体内靶向实体瘤。
图12示出了相对于未经修饰的供体匹配的CD8+T细胞，REX编辑的可重复性赋予了增强的体外增殖。对于另外4名健康供体，对TREX细胞或供体匹配的原代(未经编辑的)CD8+T细胞随时间的扩增倍数进行跟踪。
图13A和图13B示出了CAR-TREX细胞与未经修饰的CAR-T细胞类似地靶向BCMA+肿瘤细胞。
图14示出了在CAR接合后，抗BCMA-TREX和抗HER2-TREX细胞产生的炎性细胞因子水平低于抗BCMA-CAR-T细胞和抗HER2-CAR-T细胞产生的炎性细胞因子水平。
图15示出了CAR-TREX细胞靶向BCMA+肿瘤细胞，在系列杀伤试验中持续存在，并应答于IL-2。
图16示出了可以使用不同的编辑组合产生TREX细胞表型。
图17示出了在预期的基因座处对TREX细胞进行编辑。
图18A、图18B和图18C示出了TREX细胞表现出细胞周期相关基因特征的富集。
图19示出了TREX细胞的存活和增殖依赖于IL-2。
图20A和图20B示出了CAR-TREX细胞与未经修饰的CAR-T细胞类似地靶向HER2hi肿瘤细胞，但是总体细胞因子产生更少。
图21示出了REX编辑增强了CD4+TREX细胞的增殖能力。
图22示出了可以使用REX编辑产生γδTREX细胞。
图23示出了在体外T细胞衔接器(TCE)测定中γδTREX细胞是有活性的。
图24示出了γδTREX细胞可以由多个γδT细胞子集产生，并且在CAR转导后保持多样性。
图25A和图25B示出了γδ-TREX细胞与未经修饰的CAR-T细胞类似地靶向BCMA+肿瘤细胞。
图26示出了NK细胞中的REX编辑支持NKREX细胞表型。
图27示出了NKREX细胞的增殖和存活依赖于细胞因子。
图28示出了NKREX细胞随时间维持CAR表达。
图29A至29C示出了NKREX细胞在体外是具有细胞毒性的并且CAR表达可以进一步增强效力。
图30示出了TREX细胞对T细胞消耗剂(T cell depleting agent)和化学疗法敏感。
图31示出了B2MKO TREX细胞对NK细胞介导的消耗敏感，并且这可以使用抗CD38抗体进行调节。
具体实施方式
本披露涉及用于制备用于过继细胞疗法的细胞群和组合物的方法、细胞和组合物。特别地，本文提供了用于使包括T细胞群的原代免疫细胞扩增和增殖的方法。
如根据本披露所使用的，除非另外指出，否则所有技术和科学术语应被理解为具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。
如本文所用，术语“包含(comprise)”和“包括(include)”及其变体(例如，“包含(comprises/comprising)”和“包括(includes/including)”)应理解为表示包括陈述的组分、特征、元素或步骤，或一组组分、特征、元素或步骤，但不排除任何其他组分、特征、元素或步骤，或一组组分、特征、元素或步骤。术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个替换，同时保留其普通含义。
如本文所用，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该”包括复数指示物。
本文披露的百分比可以与披露的值相差±10％、20％或30％的量，并且仍在预期披露的范围内。
除非另作说明或另外从上下文和本领域的普通技术人员所理解的明显可见，在本披露的不同方面中表示为范围的本文的值可以采取所陈述范围内的任何具体值或子范围，至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外明确指明。
如本文所用，范围和量可表示为“约”某个特定值或范围。术语“约”还包括该精确量。例如，“约5％”意指“约5％”并且也指“5％”。术语“约”还可以指给定值或值的范围的±10％。因此，例如，约5％也指4.5％-5.5％。除非另外从上下文清楚可见，本文提供的所有数值被该术语“约”修饰。
如本文所用，术语“或”和“和/或”可描述彼此组合或排斥的多个组分。例如，“x、y、和/或z”可指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y、和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”、或“x或y或z”。抗复制性衰老(RRS)是指对导致有限数量的群体倍增的复制性衰老(RS)具有抗性的原代免疫细胞。因此，本文所述的原代免疫细胞群有利地具有持续的增殖能力。
在一方面，本文的披露内容提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：i)将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞；以及ii)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
在一方面，本文的披露内容提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：i)将编码超大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)的转基因引入原代免疫细胞；ii)抑制一种或多种内源性调节因子在原代免疫细胞中的表达，该内源性调节因子选自周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)和S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)；以及iii)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。在一些方面，该方法包括抑制一种或多种内源性免疫相关基因在原代免疫细胞中的表达。在某些方面，内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)或T细胞受体α恒定区(TRAC)。在一些方面，该方法包括抑制CD38的表达。
在一方面，本文的披露内容提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：i)抑制一种或多种内源性调节因子在原代免疫细胞中的表达，该内源性调节因子选自周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)和S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)；以及ii)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。在一些方面，该方法包括抑制一种或多种内源性免疫相关基因在原代免疫细胞中的表达。在某些方面，内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)或T细胞受体α恒定区(TRAC)。在一些方面，该方法包括抑制CD38的表达。
基因编辑是指对原代免疫细胞的遗传物质的改变。基因编辑包括添加、去除或更改遗传物质。在特定方面，基因编辑包括将转基因引入原代免疫细胞和/或抑制基因在原代免疫细胞中的表达。在特定方面，引入一种或多种基因编辑包括将一种或多种编码抗凋亡因子或病毒衍生因子的转基因引入原代免疫细胞。
术语“一种或多种原代免疫细胞”可以是指参与初次免疫应答的一种或多种任何细胞，例如T细胞、B细胞和NK细胞、中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞。在一些方面，原代免疫细胞可以包括总T细胞、CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞、调节性T细胞、γ-δT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。
术语“转基因”是指通过实验操作引入细胞中的任何核酸序列。转基因可以是“内源性DNA序列”或“异源性DNA序列”。可以使用本领域熟知的一种或多种方法以合适的量分离和获得转基因。这些方法和其他可用于分离转基因的方法在以下文献中阐明：例如，Sambrook等人(同上)以及Berger和Kimmel(Methods in Enzymology:Guide to MolecularCloning Techniques[酶学方法：分子克隆技术指南],第152卷,Academic Press,Inc.[学术出版社公司],加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)(1987))。
可以将转基因掺入“转基因构建体”中，该构建体包含目的基因以及其他调节DNA序列，这些调节DNA序列对于目的转基因的时间性表达、或细胞特异性表达或增强的表达而言是必需的。
可以通过本领域已知的任何合适的方法或技术将转基因引入细胞中。在特定方面，使用基于质粒的DNA转座子、慢病毒平台或经由CRISPR的位点特异性整合引入转基因。转基因在细胞中的表达可以是组成型或诱导型。
在特定方面，转基因编码抗凋亡因子。“抗凋亡因子”是指蛋白质或寡核苷酸(其可以是编码蛋白质的寡核苷酸或沉默核苷酸)，其作用是防止细胞凋亡，特别是经历压力的细胞、接收到进行凋亡的信号的细胞或经历异常细胞增殖的细胞。在特定方面，抗凋亡因子是超大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)或B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)。
在特定方面，转基因编码病毒衍生因子。“病毒衍生因子”是指天然存在的病毒肽、多肽或蛋白质，以及展示出与病毒蛋白质有一定程度的序列同一性和/或相似性、和/或保持病毒蛋白质的一种或多种结构、机械学或抗原性质的肽、多肽或蛋白质。在特定方面，病毒衍生因子来自松鼠猴γ疱疹病毒(Saimiriine gammaherpesvirus)2StpA A11、松鼠猴疱疹病毒StpC、松鼠猴疱疹病毒Tip、或经修饰的蜘蛛猴疱疹病毒(HerpesvirusAteles)-爱泼斯坦-巴尔病毒Tio-LMP1。
在其他方面，转基因编码与细胞中的激活信号有关的蛋白质。
在一些方面，本披露的方法进一步包括抑制一种或多种内源性调节因子在原代免疫细胞中的表达，从而消除或降低内源性调节因子的活性。如本文所用，“调节因子”是指编码参与调节细胞周期停滞、细胞死亡或信号抑制的蛋白质的基因。可以通过本领域已知的任何合适的方法或技术下调或阻断内源性调节因子。已知的用于下调基因表达或降低因子活性的方法包括但不限于CRISPR/Cas(包括胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器)、微小RNA、shRNA、RNAi、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶、中和抗体、小分子抑制剂、阻断下游信号传导通路的化学抑制剂等。内源性调节因子的抑制可以是基因表达的完全抑制、部分抑制、下调或降低因子活性。在一些方面，内源性调节因子活性或基因表达降低了1％-100％(即1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％)。调节因子包括编码参与调节细胞周期停滞、细胞死亡或信号抑制的蛋白质的基因。在特定方面，一种或多种内源性调节因子是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)和/或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。在特定方面，一种或多种内源性调节因子是RB转录辅阻遏物1(RB1)、TP53、自噬和Beclin 1调节因子1(AMBRA1)、神经纤维瘤病1型(NF1)、酪氨酸蛋白磷酸酶非受体2型(PTPN2)或细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)。
术语“内源性”是指在细胞、组织或生物体，或细胞、组织或生物体的一部分内发育或起源。
在一些方面，本披露的方法进一步包括抑制一种或多种内源性免疫相关基因在原代免疫细胞中的表达，从而消除或降低免疫相关基因的活性。如本文所用，“免疫相关基因”是指编码参与产生免疫应答的蛋白质的基因。在某些方面，免疫相关基因编码参与宿主抗移植物(HvG)和移植物抗宿主(GvH)同种异体免疫应答的蛋白质。可以通过本领域已知的任何合适的方法或技术下调或阻断免疫相关基因。已知的用于下调基因表达或降低免疫相关基因活性的方法包括但不限于CRISPR/Cas(包括胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器)、微小RNA、shRNA、RNAi、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶、中和抗体、小分子抑制剂、阻断下游信号传导通路的化学抑制剂等。内源性免疫相关基因的抑制可以是基因表达的完全抑制、部分抑制、下调或降低因子活性。在一些方面，内源性免疫相关基因活性或基因表达降低了1％-100％(即1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％)。免疫相关基因包括编码参与产生免疫应答的蛋白质的基因。免疫相关基因可以编码参与宿主抗移植物(HvG)和移植物抗宿主(GvH)同种异体免疫应答的蛋白质。在特定方面，该一种或多种内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)或T细胞受体α恒定区(TRAC)。在特定方面，该一种或多种内源性免疫相关基因是主要组织相容性复合物(MHC)的基因、人白细胞抗原I类基因(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C)、人白细胞抗原II类基因(HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)、T细胞受体(例如αβT细胞受体)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素23(IL-23)、干扰素-γ(IFNγ)、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL2、CXCL9-11、CCL17、CCL27、程序性死亡-1(PD-1)、TIM3或TIGIT。
在进一步的方面，本文披露的方法包括抑制分化簇38(CD38)在原代免疫细胞中的表达，从而消除或降低CD38的活性。可以通过本领域已知的任何合适的方法或技术下调或阻断CD38。已知的用于下调基因表达或降低CD38活性的方法包括但不限于CRISPR/Cas(包括胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器)、微小RNA、shRNA、RNAi、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶、中和抗体、小分子抑制剂、阻断下游信号传导通路的化学抑制剂等。在一些方面，CD38活性或基因表达降低了1％-100％(即1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％)。
在进一步的方面，本文披露的方法包括抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)在原代免疫细胞中的表达，从而消除或降低PTEN的活性。可以通过本领域已知的任何合适的方法或技术下调或阻断PTEN。已知的用于下调基因表达或降低PTEN活性的方法包括但不限于CRISPR/Cas(包括胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器)、微小RNA、shRNA、RNAi、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶、中和抗体、小分子抑制剂、阻断下游信号传导通路的化学抑制剂等。在一些方面，PTEN活性或基因表达降低了1％-100％(即1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％)。
术语“TREX”是指使用例如本文提供的技术和遗传修饰的“可延续扩增的T细胞”。更特别地，TREX细胞是指周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B CDKN2B和S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)中的一些或全部的表达减少或消除的细胞。
在一些方面，抑制一种或多种内源性调节因子的表达发生在将一种或多种转基因引入细胞后。在一些方面，在对一种或多种内源性调节因子进行抑制之前，将其中已经引入一种或多种转基因的原代免疫细胞培养至少2天、至少5天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天。在进一步的方面，抑制PTEN的表达发生在将一种或多种转基因引入细胞后。在一些方面，该方法包括以下连续步骤：i)将一种或多种转基因引入免疫细胞，然后将细胞培养至少2天、5天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天；ii)抑制一种或多种内源性调节因子，将细胞培养至少2天、5天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天；以及iii)抑制PTEN表达。
在适合促进增殖和扩增的条件下培养原代免疫细胞。使用培养步骤进行的体外扩增激活并诱导原代免疫细胞的增殖，以产生包含数量足以用于治疗的原代免疫细胞的扩增群体。
本文披露的方法是离体进行的，这意味着这些方法在生物体之外进行。离体处理免疫细胞意指优选在无菌条件下，在体外将细胞暴露于某些生物分子。在一些情况下，离体方法还包括培养已从人类分离的免疫细胞，然后再施用回相同或不同的人类受试者。
包括扩增群体的原代免疫细胞和/或本披露的工程化T细胞可以包含总T细胞、CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞、调节性T细胞、γ-δT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。将T细胞大致分为在其表面表达CD4的细胞(也称为CD4阳性细胞)和在其表面表达CD8的细胞(也称为CD8阳性细胞)。适合根据本文提供的方法使用的T细胞是源自人类供体的骨髓(BM)、外周血(PB)或脐带血(CB)的单核淋巴细胞。这些细胞可以直接从BM、PB或CB中收集，也可以在经由将生长因子和/或细胞因子如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)施用到同种异体或自体供体进行动员或刺激后进行收集。本领域技术人员将理解，有许多已建立的用于从外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)的方案。可以通过密度梯度分离方案来辅助PBMC的分离，通常采用使用-Hypaque或/>的密度梯度离心技术将淋巴细胞与血液中的其他元件分离。优选地，PBMC分离在无菌条件下进行。PBMC的分离也可以使用阴性选择试剂盒。可替代地，可以采用细胞淘析方法来分离单核细胞群。在一些方面，原代免疫细胞是人类细胞。
在一些情况下，本披露的方法进一步包括将基因工程化受体或嵌合抗原受体引入激活的T细胞，其中该方法由此产生包含表达基因工程化受体或嵌合抗原受体的T细胞的扩增群体。嵌合抗原受体(CAR)，也称为嵌合T细胞受体、人工T细胞受体和嵌合免疫受体，是工程化受体，可将特异性移植到免疫效应细胞上。通常，嵌合抗原受体是跨膜蛋白，其具有经由间隔子和跨膜结构域与信号传导内结构域融合的靶抗原结合结构域。当CAR结合其靶抗原时，激活信号会传递到T细胞。在一个实施例中，将编码嵌合抗原受体的多核苷酸引入原代细胞。在一个实施例中，将编码嵌合抗原受体或基因工程化受体的核酸载体引入T细胞，由此T细胞表达嵌合抗原受体。在一些方面，CAR结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、人表皮生长因子受体2((HER2)；也称为Erb-B2受体酪氨酸激酶2(ERBB2))、B细胞成熟抗原(BCMA)。在某些方面，CAR可以结合用于免疫疗法的任何靶标。
CAR构建体设计：本披露的CAR构建体可具有几种组分，其中许多组分可以基于所得CAR构建体的希望的或精确的功能来选择。除了抗原结合结构域，CAR构建体还可具有间隔子结构域、铰链结构域、信号肽结构域、跨膜结构域、以及一种或多种共刺激结构域。选择一种组分而不是另一种(即选择来自一种受体的特定共刺激结构域，相对于来自不同受体的共刺激结构域)可影响临床疗效和安全性。
抗原结合结构域：本文预期的抗原结合结构域可包括抗体或其一个或多个抗原-结合片段。在一个实施例中，CAR构建体靶向GPC3。在一个实施例中，CAR构建体靶向BCMA。在一个实施例中，CAR构建体靶向HER2。在一个实施例中，CAR构建体靶向可用于免疫疗法的任何分子。在某些方面，抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)，该scFv含有来自对GPC3、BCMA或HER2具有特异性的一种或多种抗体的轻链和重链可变区，这些可变区直接连接在一起或经柔性接头(例如，具有1、2、3或更多个重复序列的G4S的重复序列)连接在一起。
间隔子结构域：CAR构建体可具有间隔子结构域，以提供构象自由度，从而促进与靶细胞上的靶抗原结合。间隔子结构域的最佳长度可以取决于结合表位与靶细胞表面的接近度。例如，近端表位可能需要较长的间隔子，而远端表位可能需要较短的间隔子。除了促进CAR与靶抗原的结合以外，实现CAR细胞与癌细胞之间的最佳距离还可以有助于空间上阻塞大抑制分子进入CAR细胞和靶癌细胞之间形成的免疫突触。CAR可具有长间隔子、中等间隔子或短间隔子。长间隔子可包括免疫球蛋白G1(IgG1)或IgG4(天然的，或具有治疗性抗体中常见的修饰，如S228P突变)的CH2CH3结构域(约220个氨基酸)，而CH3区可单独用于构建中等间隔子(约120个氨基酸)。短间隔子可源自CD28、CD8α、CD3或CD4的区段(<60个氨基酸)。短间隔子也可源自IgG分子的铰链区。这些铰链区可源自任何IgG同种型，并且可以含有或可以不含有在治疗性抗体中常见的突变，如以上提及的S228P突变。
铰链结构域：CAR也可具有铰链结构域。柔性铰链结构域是提供构象自由度以促进与肿瘤细胞上的靶抗原结合的短肽片段。它可单独使用或与间隔子序列结合使用。术语“铰链”和“间隔子”经常可互换使用-例如，可将IgG4序列视为“铰链”序列和“间隔子”序列(即，铰链/间隔子序列)。
信号肽：CAR构建体可进一步包括包含信号肽的序列。信号肽的功能是促进细胞将CAR转移至细胞膜。实例包括IgG1重链信号多肽、Igκ或λ轻链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(GM-CSFR2或CSFR2)信号肽、CD8a信号多肽、或CD33信号肽。
跨膜结构域：CAR构建体可进一步包括包含跨膜结构域的序列。跨膜结构域可包括跨细胞膜的疏水α螺旋。跨膜结构域的特性没有如CAR构建体的其他方面一样经过细致地研究，但其可潜在地影响CAR表达并且与内源性膜蛋白的缔合。跨膜结构域可源自例如CD4、CD8α、或CD28。
共刺激结构域：CAR构建体可进一步包括形成共刺激结构域的一个或多个序列。共刺激结构域是能够增强或调节免疫效应细胞的应答的结构域。共刺激结构域可包括例如来自CD3ζ(或CD3z)、CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、CD27、GITR、CD2、IL-2Rβ和MyD88/CD40中的一种或多种的序列。共刺激结构域的选择影响CAR细胞的表型和代谢特征。例如，CD28共刺激产生具有高水平的细胞溶解能力、白细胞介素2(IL-2)分泌和糖酵解的有效的、但短暂的效应子样表型。相比之下，用携带4-1BB共刺激结构域的CAR修饰的T细胞往往在体内扩增和持续更长时间，具有增加的氧化代谢，不易耗竭，并且具有增加的产生中央记忆性T细胞的能力。
在特定方面，本文披露的方法损害原代免疫细胞的早期刺激以确保在将一种或多种基因编辑引入细胞之前细胞处于循环中。在其他方面，本文披露的方法损害原代免疫细胞的晚期刺激(也称为“再刺激”)。一旦原代免疫细胞退出细胞周期，这些细胞就会被再刺激，从而导致细胞重新进入细胞周期(即增殖)。
在特定方面，本文披露的方法进一步包括在将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞之前刺激原代免疫细胞。在特定方面，在将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞之前至少1天、至少2天、至少5天、至少10天、至少15天、至少20天、或至少30天之前刺激原代免疫细胞。因此，在特定方面，本文提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：i)刺激原代免疫细胞；ii)将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞；iii)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
在特定方面，本文披露的方法进一步包括在将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞之后刺激原代免疫细胞。在特定方面，在将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞之后至少1天、至少2天、至少5天、至少10天、至少15天、至少20天、或至少30天之后刺激原代免疫细胞。因此，在特定方面，本文提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：i)将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞；ii)在培养基中培养原代免疫细胞；iii)刺激原代免疫细胞；以及iv)在培养基中培养原代免疫细胞；其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。在进一步的方面，对原代免疫细胞进行再刺激至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次。因此，在特定方面，本文提供了一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：i)将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞；ii)在培养基中培养原代免疫细胞；iii)刺激原代免疫细胞；iv)在培养基中培养原代免疫细胞；v)再刺激原代免疫细胞；以及vi)在培养基中培养原代免疫细胞，其中该培养诱导原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。可以使用本领域已知的任何合适的刺激物刺激免疫细胞。
在特定方面，原代免疫细胞在培养期间经历至少约50倍扩增、至少约500倍扩增、至少约5000倍扩增、至少约250,000倍扩增、至少约500,000倍扩增、至少约106倍扩增、至少约107倍扩增、至少约108倍扩增、至少约109倍扩增或至少约1010倍扩增。在特定方面，扩增的原代免疫细胞群对复制性衰老具有抗性。此外，这些细胞在长期扩增后不会功能耗竭，并且可以通过T细胞衔接器抗体与其TCR接合或通过嵌合抗原受体(CAR)的接合(或通过天然或经基因引入的TCR)被引导以执行细胞毒性功能。
在特定方面，将原代免疫细胞在包括一种或多种支持性细胞因子但不包括原代免疫细胞刺激物的培养基中培养。在特定方面，在不存在饲养细胞或通过CD3和/或其抗原受体刺激的情况下，原代免疫细胞在培养期间经历扩增。在没有广泛的T细胞再刺激或饲养细胞的情况下，所披露的方法产生免疫细胞的能力有利地消除了使方法规模化和产生功能失调的免疫细胞群的问题。
本文披露的方法有利地提供了扩增的原代免疫细胞群，包括人类CD8+T细胞、人类CD4+T细胞、人类调节T细胞、人类γ-δT细胞或人类自然杀伤T细胞，这些细胞在没有通过其T细胞受体(TCR)进行再刺激的情况下能够长时间增殖，从而在长期培养中扩增数百万倍。在特定方面，将原代免疫细胞群培养至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天、至少150天、至少200天、至少300天或至少400天。
在进一步的方面，本文提供了表达编码超大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)的转基因的工程化T细胞，该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)和/或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。
在进一步的方面，本文提供了一种工程化T细胞，该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)和/或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。
在进一步的方面，本文提供了表达编码超大B细胞淋巴瘤(Bcl-XL)的转基因的工程化T细胞，该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)、S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)和/或磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)。
在某些方面，如本文披露的工程化T细胞在原代免疫细胞中不表达一种或多种内源性免疫相关基因。在一些方面，内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)或T细胞受体α恒定区(TRAC)。
在某些方面，如本文披露的工程化T细胞不表达分化簇38(CD38)。
在进一步的方面，本文的披露内容提供了一种工程化T细胞，该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)、S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)、β-2微球蛋白(B2M)、T细胞受体α恒定区(TRAC)、分化簇38(CD38)和/或磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)。
在某些方面，如披露的工程化T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。在一些方面，CAR结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、B细胞成熟抗原(BCMA)或人表皮生长因子受体2((HER2)；也称为Erb-B2受体酪氨酸激酶2(ERBB2))。
在某些方面，如本文披露的工程化T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或其组合。
在一些方面，工程化T细胞对复制性衰老(RRS)具有抗性。在一些方面，工程化T细胞是CD8+T细胞。在一些方面，工程化T细胞是CD4+T细胞。在一些方面，工程化T细胞是人类细胞。
本文披露的扩增的T细胞群可用于细胞免疫疗法，包括但不限于T细胞疗法、过继细胞疗法(ACT)和CAR T细胞疗法。
本文披露的扩增的T细胞群可用于治疗或预防各种障碍，例如癌症(例如，血液恶性肿瘤如淋巴瘤或白血病，或实体瘤如黑素瘤或肾癌)、自身免疫性疾病或传染病，例如HIV。
如本文所用，术语“治疗(treatment或treat)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的受试者包括患有癌症的那些以及易于患上癌症的那些或要预防癌症的那些。在一些方面，本文披露的方法、组合物和组合可以用于治疗癌症。在其他方面，需要治疗的受试者包括患有肿瘤的那些以及易于患上肿瘤的那些或要预防肿瘤的那些。在某些方面，本文披露的方法、组合物和组合可以用于治疗肿瘤。在其他方面，肿瘤的治疗包括抑制肿瘤生长、促进肿瘤减小、或既抑制肿瘤生长又促进肿瘤减小。
在一些情况下，根据本文提供的方法获得的T细胞可以作为药物组合物施用，该药物组合物包含治疗有效量的T细胞作为治疗剂(即，用于治疗应用)。
如本文所用，术语“药物组合物”或“治疗性组合物”是指当适当地向受试者施用时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。在一些方面，本披露提供了药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和治疗有效量的至少一种本披露的免疫细胞。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”或“生理上可接受的载剂”是指适合于完成或增强本披露的一种或多种免疫细胞的递送的一种或多种配制品材料。
术语“受试者”旨在包括人和非人动物，特别是哺乳动物。在某些方面，受试者是人类患者。
如本文所用，术语“施用(administration或administering)”是指通过任何适当的途径提供、接触和/或递送一种或多种化合物以实现所需效果。施用可以包括但不限于口服、舌下、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射)、透皮、局部、颊、直肠、阴道、鼻、眼、经由吸入以及植入物。
在不限制本披露内容的情况下，本文出于说明目的描述了本披露内容的多个方面。
实例
以下实例说明了本披露内容的特定方面及其各种用途。阐述它们仅出于解释目的并且不应以任何方式解释为限制本披露的范围。
实例1：抗凋亡因子或病毒衍生因子的过表达可以为长期培养的转染T细胞提供选择性存活优势。
使用流式细胞术在66-137天的时间段内评估T细胞子集中的转座子频率。从健康供体的血液中分离出总的原代人类T细胞，用Dynabeads(人T-激活剂CD3/CD28)激活72小时，然后用含有转座子的质粒转染，这些转座子编码抗凋亡因子、病毒衍生因子、突变细胞因子受体、突变信号传导分子和/或突变细胞周期调节分子以及荧光报告子。同时将编码转座酶的mRNA转染到细胞中，以使转座元件能够进行染色体整合。在各种筛选中测试了共计52个转座子构建体。转染后4至8天，使用流式细胞术评估细胞的基线转座子掺入。用Dynabeads定期再刺激细胞以驱动它们保持增殖，并且使用流式细胞术评估转座子富集。如CD8+T细胞和CD4+T细胞所证明的那样，使扩增T细胞存活增强的分子预计会在总T细胞池内超出其起始频率进行富集。
(图1，图2)。这些筛选揭示，抗凋亡因子超大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)在CD4+T细胞和CD8+T细胞二者中始终富集，这些细胞在延长的体外培养时间段内被驱动进行多轮增殖，这表明该因子可能会增强过度表达它的成熟T细胞的存活(图1)。其他因子，如Bcl-2和病毒衍生蛋白StpA A11(松鼠猴γ疱疹病毒2)、StpC和Tip(松鼠猴疱疹病毒)以及经修饰的Tio-LMP1(蜘蛛猴疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒)也表现出在T细胞子集中的富集(图1)。
虽然表达编码内源性抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-xL)或病毒衍生因子(StpA A11、StpC和Tip，以及经修饰的Tio-LMP1)的转基因的细胞在长期培养中通过其TCR反复刺激，相对于相同孔中未转染的对照细胞，表现出增强的存活能力，但这些细胞的增殖能力没有表现出大的、持续的增强。这些数据表明，可能需要额外的编辑来赋予所需的TREX细胞表型。
实例2：CDKN2A、CDKN2B和MTAP表达的消除显著增加了长期培养中原代人类T细胞的增殖能力。
多年来，在实验室中使用患者来源的白血病细胞系进行各种细胞分析。这些细胞的转化性质可以映射到一组突变，这些突变也经常存在于T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者中(表1)。可以将T-ALL患者中的突变分解为几个大类，每一类都可能有助于T-ALL细胞的表型和产生：激活信号的增加、信号抑制因子的丧失、细胞周期停滞调节因子的丧失以及多效性因子(例如转录因子、表观遗传调节因子和其他细胞机器(cellularmachinery))的修饰。
*表示功能的获得，例如通过蛋白质的突变、易位或启动子/增强子区域的突变，这可能是蛋白质如TERT会出现的情况。缺少星号表示功能丧失(缺失、功能丧失突变、插入缺失、截断等)。
如上所述，据推测，除了提供存活因子例如Bcl-XL外，可能有必要修饰上述基因集合的T细胞表达，以重建所需的表型(表1)。因此，从健康供体的血液中分离出总CD8+T细胞，使用αCD3/αCD28Dynabeads激活，并且72小时后，将编码Bcl-XL的转基因插入纯化的CD8+T细胞的集合池中。然后将这些细胞扩增17天的时间段，然后使用αCD3/αCD28 Dynabeads重新激活，随后消除从白血病T细胞系和T-ALL患者中鉴定的因子的表达。增加的增殖能力是要被工程化到TREX细胞中的主要特征之一，因此，在这些细胞中测试了消除来自以下“细胞周期停滞”组的分子表达的影响：周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)和CDKN2B(图3A)。S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)在染色体上与CDKN2A和CDKN2B相邻，并且在CDKN2A和CDKN2B缺失的患者中也经常丢失。因此，测试了消除MTAP连同CDKN2A和CDKN2B表达的影响(图3A)。这些Bcl-XL和CDKN2A/CDKN2B/MTAP编辑的细胞随后被称为“TREX+Bcl-xL”细胞(表2)，而CDKN2A/CDKN2B/MTAP编辑(没有Bcl-XL)被称为“TREX”细胞。
使Bcl-xL编辑的细胞、Bcl-xL和CDKN2A/CDKN2B编辑的细胞以及TREX+Bcl-xL细胞在培养中保持近100天，其中没有通过其TCR进行额外的刺激，并且评估了每个群体的总扩增倍数(图3A)。在引入这些编辑后大约31天，TREX+Bcl-xL细胞的增殖与其他组不同，并且在没有额外的TCR刺激的情况下，TREX+Bcl-xL细胞的扩增得以持续，在此期间实现了超过400,000倍的扩增。相比之下，Bcl-xL编辑的CD8+T细胞和Bcl-xL/CDKN2A/CDKN2B编辑的CD8+T细胞在此时间内仅实现了低73-286倍的扩增水平(图3A，表3)。此外，即使当使用αCD3/αCD28Dynabeads通过其TCR反复再刺激未经编辑的细胞或Bcl-xL编辑的细胞以驱动增殖时，它们也仅实现了低水平的总扩增倍数(图1A，表3)，远低于TREX+Bcl-xL细胞的总扩增倍数。
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虽然TREX+Bcl-xL细胞相对于来自同一供体的对照CD8+T细胞表现出显著增强的增殖能力，但进行了进一步的实验以测试这些编辑是否可以在其他供体中赋予相似的表型，以及是否有可能通过消除在T-ALL患者中经常发生突变的信号抑制因子的表达进一步增强TREX+Bcl-xL表型(表1)。磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)基因座在患者来源的白血病细胞系和T-ALL患者中表现出频繁的功能丧失突变，并且已知该基因座可负调节细胞周期进程(表1)。如上所述，TREX+Bcl-xL细胞从两种不同的供体(40A30和40B30)产生，并且在“三重”编辑后大约2周，消除了PTEN在这些TREX+Bcl-xL系之一(40B32)中的表达(图3B)。在不存在额外的TCR刺激的情况下，两组健康供体来源的TREX细胞(缺乏CDKN2A/CDKN2B/MTAP)均表现出显著的增殖能力，在培养的第118天实现>3.7e8和>1.8e7的总扩增倍数。此外，与其已确立的通过控制AKT信号传导在负调节细胞周期进程中的作用一致，TREX+Bcl-xL细胞中PTEN表达的消除进一步增强了供体B-2TREX+Bcl-xL细胞的增殖能力，使这些细胞在培养的第118天达到>2.0e8的总扩增倍数(图3B)。PTEN表达消除的附加效应需要49天才能出现，这反映了初始编辑效率低或这种编辑在细胞已扩增>3e6倍后的后期竞争优势。
虽然具有完整PTEN表达的TREX+Bcl-xL细胞在没有额外的TCR刺激的情况下显著扩增，但是最终它们的增殖相对于PTEN表达缺陷的TREX+Bcl-xL细胞会减慢(图3B)。此外，即使是PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞最终也表现出降低的增殖率(图3B)。为了确定在存在或不存在共刺激的情况下再刺激TREX+Bcl-xL细胞是否可以作为消除PTEN表达的可行替代或补充方法，测试了αCD3或αCD3/αCD28Dynabeads是否可以将细胞快速启动重回细胞周期(图4)。TREX+Bcl-xL细胞或PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞保持未处理或如上用Dynabeads再刺激，去珠，并跟踪每个群体的总扩增倍数(图4)。再刺激显著增强了TREX+Bcl-xL系和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL系的扩增能力。
实例3：TREX+Bcl-xL细胞在细胞因子依赖性和细胞表型方面类似于原代人类T细胞。
原代T细胞在体外和体内的存活和增殖依赖于细胞因子例如IL-2，然而，一些白血病细胞系的生长独立于IL-2。TREX+Bcl-xL细胞和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞在含有IL-2的培养基中产生。在培养的6天时间段内，通过跟踪在一系列IL-2浓度下的细胞增殖和存活，研究了这些细胞在细胞因子依赖性方面是否仍然类似于正常原代人类T细胞(图5)。与正常T细胞一致，TREX+Bcl-xL细胞和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞的增殖和存活高度依赖于IL-2。
还测试了TREX+Bcl-xL细胞和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞在修饰和延长体外培养后是否保持与正常T细胞相似的表型，或者这些条件是否驱动TREX+Bcl-xL细胞至耗竭的表型(图6)。所有三个TREX+Bcl-xL系都保持细胞表面CD3和CD8的表达(图6A和图6B)。此外，这些TREX+Bcl-xL系表达了不同水平的激活标志物，例如PD1和TIGIT(图6C)，并以供体依赖性方式保持CD28的表达(图6D)。最后，这些TREX+Bcl-xL系表现出由CD45RO和CCR7的表面表达定义的分化表型，CD45RO和CCR7的表面表达以供体依赖性方式示踪(图6E)。这些数据表明，尽管进行了大量增殖和延长时间的体外培养，TREX+Bcl-xL细胞仍与正常T细胞相似，并且不表现出与功能失调状态相关的表面表型。
趋化因子受体对于将免疫细胞运送到炎症部位很重要。因此，使用流式细胞术分析了TREX+Bcl-xL细胞、PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞、再刺激的TREX+Bcl-xL细胞和再刺激的PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞的趋化因子受体CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CXCR3和CXCR5的表达(图6F至6K)。TREX+Bcl-xL系和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL系表现出CCR2(图6F)、CCR5(图6G)和CXCR3(图6J)的表达。CCR6(图6H)的表达是异质的，而CCR7(图6I)和CXCR5(图6K)的表达低至不存在。因此，TREX+Bcl-xL细胞和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞保持关键趋化因子受体的表达，这些关键趋化因子受体将使这些细胞能够被运送到炎症部位。
实例4：TREX+Bcl-xL细胞是具有细胞毒性的。
已经确定TREX+Bcl-xL系与正常原代人类T细胞相似后，确定TREX+Bcl-xL细胞在长期培养和扩增后是否保持有效的细胞毒性功能。在存在靶肿瘤细胞和基于阻抗的xCELLigence平台的情况下使用T细胞衔接器来定量TREX+Bcl-xL细胞的细胞毒性功能(图7)。在T细胞衔接器存在的情况下，第80天TREX+Bcl-xL系表现出与未经修饰的原代总T细胞和未经修饰的原代CD8+T细胞相当的裂解靶肿瘤细胞的能力(图7A和图7B)。在添加效应细胞和活性T细胞衔接器或对照T细胞衔接器分子后72小时收集来自这些共培养物的上清液，并分析是否存在干扰素γ(IFN-γ)、IL-2、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和颗粒酶B(图7C至7F)。相对于未经修饰的原代T细胞，TREX+Bcl-xL系产生了较低水平的这些细胞因子，尽管它们以抗原依赖性方式裂解靶细胞的能力相似。这些数据表明，即使在培养80天和大量扩增后，TREX+Bcl-xL细胞也未在功能上耗竭并保持其细胞毒性潜力。
实例5：TREX+Bcl-xL细胞可以产生功能性CAR-TREX细胞。
为了将TREX+Bcl-xL细胞开发为潜在的细胞疗法，这些细胞必须能够表达靶向分子，例如嵌合抗原受体(CAR)，以引导其细胞毒性功能。如上文所述产生的三个TREX+Bcl-xL细胞系用编码识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的CAR的慢病毒进行转导。随后使用流式细胞术测量GPC3 CAR的表面表达(图8A)。发现每个TREX+Bcl-xL系都能以与正常原代总T细胞和正常原代CD8+T细胞相似的水平成功表达GPC3 CAR(图8A)。
通过使用以下具有不同程度抗原表达的靶肿瘤细胞(OE21(抗原-阴性)、HuH-7(抗原-中等)和Hep3B(抗原-高等))进行基于阻抗的xCELLigence测定，评估了TREX+Bcl-xL细胞的CAR引导的细胞毒性功能(图8B和图8C)。TREX+Bcl-xL细胞以CAR特异性和抗原特异性方式以与正常CAR-T细胞和正常CAR-CD8+T细胞相似的水平快速裂解靶肿瘤细胞(图8B和图8C)。在添加T细胞72小时后，从这些共培养物中收获上清液，随后分析IFN-γ、IL-2、TNF-α和颗粒酶B的分泌(图8D至8G)。与其强大的细胞毒性功能一致，CAR-TREX+Bcl-xL细胞表现出与正常CAR-T细胞和正常CAR-CD8+T细胞相当的分泌效应细胞因子的能力(图8D至8G)。然而，总体而言，发现CAR-TREX+Bcl-xL细胞中的IFN-γ和TNF-α水平较低。
这些数据证实，即使在显著体外扩增后，TREX+Bcl-xL细胞和PTEN缺陷型TREX+Bcl-xL细胞也能够表达CAR并以抗原依赖性方式执行CAR引导的细胞毒性功能。
实例6：TREX细胞运送到与原代CD8+T细胞相似的位置并且在体内应答于IL-2。
细胞因子信号(cytokine cues)可用于调节人和鼠T细胞的活性和扩增(Zhang等人,Science Translational Medicine[科学转化医学],2021年12月22日,第13卷,第625期；Aspuria等人,Science Translational Medicine[科学转化医学],2021年12月22日,第13卷,第625期)，因此评估了TREX细胞在体内对不同的人细胞因子应答的能力。简而言之，用萤光素酶报告基因标记原代人类CD8+T细胞或278日龄的TREX细胞，并将3E6个表达萤光素酶的细胞输注到补充或不补充有重组人IL-2融合蛋白的NSG小鼠中。使用IVIS光学成像系统对小鼠进行成像以检测表达萤光素酶的T细胞(图9A和图9B)。如图9A所示，216小时时的成像表明小鼠中的原代人类CD8+T细胞和TREX细胞的定位相似。进一步地，补充有重组人IL-2融合蛋白的小鼠表现出增强的TREX细胞增殖(图9A，右侧)。对随时间的腹侧辐射进行绘图(图9B)，并且腹侧辐射类似地证明了TREX细胞在体内对外源补充的IL-2应答的能力。在过继细胞转移后10天处死小鼠，并评估它们的血液、脾脏和骨髓中是否存在原代CD8+T细胞或TREX细胞(图9C)。虽然在与原代CD8+T细胞相似的器官中发现了TREX细胞(图9C)，但它们表现出较慢的衰变动力学，并且施用重组人IL-2融合蛋白可以进一步增加经治疗小鼠的血液和骨髓中的TREX细胞数量。这些数据表明，TREX细胞归巢至与原代CD8+T细胞相似的部位，并保持对外源细胞因子信号的应答性。
实例7：CAR-TREX细胞在体内应答于IL-2和IL-15
评估了靶向GPC3的CAR-TREX+Bcl-xL细胞在体内对不同的人细胞因子应答的能力。用表达GPC3的Hep3B肿瘤细胞接种NSG、hIL-2NOG或hIL-15NOG小鼠。一旦肿瘤建立，小鼠不经处理或用10E6个靶向GPC3的CAR-TREX+Bcl-xL细胞进行处理。在输注时CAR-TREX+Bcl-xL细胞为121日龄。CAR-TREX+Bcl-xL细胞输注后8天处死小鼠并测量体重(图10A)，没有观察到明显差异，这表明没有毒性。收获肿瘤、血液和脾脏并分析是否存在CAR-TREX+Bcl-xL细胞(图10B)。荷瘤hIL-2NOG小鼠和荷瘤hIL-15NOG小鼠中的CAR-TREX+Bcl-xL细胞数量增加，这表明CAR-TREX+Bcl-xL细胞能够在体内对外源细胞因子信号作出应答。扩增曲线特定于所提供的特定细胞因子支持(图10B)。
实例8：CAR-TREX细胞在体内靶向实体瘤
测定了靶向GPC3的CAR-TREX细胞控制实体瘤的能力。在NSG小鼠中建立Hep3B肿瘤，然后将92日龄的纯化CAR-TREX细胞(图11A)输注到小鼠体内。输注10E6个CAR-TREX细胞或2E6个CAR-T细胞，然后随时间对肿瘤体积进行测量并绘图(图11B，左侧)。CAR-TREX细胞表现出对Hep3B肿瘤的肿瘤生长抑制和控制。CAR-TREX细胞转移后18天处死小鼠并收获肿瘤、血液和脾脏用于进一步分析(图11B、图11C和图11D)。检查了肿瘤内CAR-TREX细胞表型(图11B)，并测定了这些不同组织中的CAR-TREX细胞数量(图11C)。在小鼠肿瘤中发现的CAR-TREX细胞数量最多，并且这些细胞表现出正活跃分泌效应细胞因子并脱颗粒的激活表型(图11D)。TREX细胞还表现出增强的体外增殖能力，并且可以扩增数百万倍并在培养中保持超过100天，而无需通过其TCR进行额外刺激(图12)。此外，当使用CRISPR/Cas9在健康供体CD8+T细胞中同时编辑上述靶基因时，这些编辑在不同供体间可重复地赋予REX表型(图12)。
实例9：针对临床特征的另外的基因编辑虽然REX编辑赋予了TREX细胞产品增强的增殖，但在B2M和CD38基因座处进行了额外的编辑，以延迟患者免疫系统对TREX细胞产品的排斥。B2M是119个氨基酸组成的蛋白质，由人类15号染色体上的基因编码。它也是主要组织相容性(MHC)I类分子的组分，并且还与非经典的MHC I样分子(例如CD1、MR1、新生儿Fc受体和Qa-1)相关。虽然位于MHC基因座之外，但B2M是经典和非经典MHC I分子在有核细胞表面成功表达所必需的。通过使用CRISPR/Cas9消除B2M在TREX细胞中的表达，这些细胞将与患者CD8+T细胞隔离。另外，TREX细胞产品消除B2M表达并因此消除MHC-I表达将使其对患者NK细胞的排斥反应敏感。TREX细胞产品中，B2M的敲除与靶向(例如GPC3、HER2、BCMA)的CAR的敲入同时进行。
在某些癌症患者(例如多发性骨髓瘤患者，接受抗CD38单克隆抗体如达雷木单抗(daratumumab)和艾萨妥昔单抗(isatuximab))中，NK细胞表达高水平的CD38并被消耗。为了延长这种同种异体细胞群在患者中的持久性，使用CRISPR/Cas9敲除TREX细胞的CD38，并且达雷木单抗或艾萨妥昔单抗可以与TREX细胞一起共同施用(参见图30和31)。
作为同种异体CD8+T细胞群，预期TREX细胞能够通过其TCR靶向HLA错配的患者健康细胞，从而导致GvHD。为了预防这种病理的发展，在编码TCRα链的T细胞受体α恒定区(TRAC)基因座处对TREX细胞群进行了编辑。TRAC的CRISPR/Cas9编辑导致TCRα链的表达丧失，这反过来阻止了TREX细胞表面表达TCR。
表4.细胞编辑的总结
基因 编辑类型 目的
CDKN2A CRISPR/Cas9缺失 抗复制性衰老
CDKN2B CRISPR/Cas9缺失 抗复制性衰老
MTAP3 CRISPR/Cas9缺失 抗复制性衰老
B2M CRISPR/Cas9缺失 限制HvG
TRAC CRISPR/Cas9缺失 避免GvHD
CD38 CRISPR/Cas9缺失 抗达雷木单抗
实例10：抗BCMA-TREX同种异体细胞疗法。
靶向BCMA的CAR在TREX细胞(即缺乏CDKN2A/CDKN2B/MTAP的细胞)中表达(图13A)。分别通过灭活B2M和TRAC基因进一步编辑抗BCMA-TREX细胞的基因组以消除人类白细胞抗原(HLA)I类和αβT细胞受体(TCR)的表达，分别以最大限度地减少宿主抗移植物(HvG)和移植物抗宿主(GvH)同种异体应答。另外，使用CRISPR/Cas9使抗BCMA-TREX细胞中的CD38基因失活，以使细胞对抗CD38消耗性单克隆抗体具有抗性。这三种基因的失活增强了外周血CD8+T细胞的总体外扩增潜力，使得下游细胞群数量远远超过未经编辑的外周血CD8+T细胞可达到的数量。这些细胞保留了原代T细胞的标志性增殖特征(扩增/存活依赖于TRAC失活前的抗CD3刺激和IL-2)，但具有更大的扩增潜力。与由混合的CD4+T细胞群和CD8+T细胞群组成的常规CAR-T细胞制剂相比，抗BCMA-TREX细胞保持细胞毒性功能，但表现出减少的细胞因子释放。
对抗BCMA-TREX细胞的评估表明，这些细胞可能与原代抗BCMA-CAR-T细胞类似地控制表达BCMA的肿瘤，同时以减少细胞因子释放和潜在降低CRS风险的形式表现出潜在改善的安全性(图13B)。简而言之，将抗BCMA-TREX细胞和抗BCMA-CAR-T细胞与表达BCMA的肿瘤细胞一起培养。在共培养开始后的不同时间点以不同的效应子:靶细胞比率测量肿瘤细胞裂解(图13B，顶行)。共培养开始后72小时收集上清液，并通过MSD测定IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平(图13B，底行)。
将抗BCMA-TREX细胞(培养82天)或抗BCMA-CAR-T细胞与表达BCMA的肿瘤细胞一起培养。在共培养开始后72小时收集上清液，并使用MSD试剂盒评估上清液中的IFN-γ水平(图14，左侧)。数据表明，尽管对肿瘤细胞的控制相似，但含抗BCMA-TREX细胞的共培养物(培养83天)比含抗BCMA-CAR-T细胞的共培养物中的IFN-γ水平降低了90％。这些数据表明，与CAR-T细胞相比，CAR-TREX细胞表现出可能会降低CRS风险的细胞因子分泌特征。
在有或没有IL-2支持的情况下，评估了抗BCMA-TREX细胞(培养112天)在系列杀伤试验中持续存在的能力。简而言之，将抗BCMA-TREX细胞或抗BCMA-CAR-T细胞与表达BCMA的JJN3细胞以1:1的效应子:靶细胞比率进行连续培养。在每轮共培养后测量肿瘤细胞对照(％细胞溶解)、效应细胞数量和效应细胞因子分泌并绘图(图15)。在该系列杀伤试验中，抗BCMA-TREX细胞与抗BCMA-CAR-T细胞保持相当的轮数，并且在细胞培养基中包含IL-2进一步增加了抗BCMA-TREX细胞和抗BCMA-CAR-T细胞可以控制肿瘤细胞生长的轮数。抗BCMA-TREX细胞和抗BCMA-CAR-T细胞表现出应答于IL-2的增强的增殖，并且在培养基中包括IL-2的共培养物中效应细胞因子的分泌持续更长时间(图15，顶行相比于底行)。这些数据表明，抗BCMA-TREX细胞在体外表现出与抗BCMA-CAR-T细胞相似的细胞毒性，并且还表现出相似的对外源IL-2应答的能力。进一步地，尽管对肿瘤的控制相当，但抗BCMA-TREX细胞在CAR接合后分泌的效应细胞因子水平低于抗BCMA-CAR-T细胞。
实例11：抗HER2-TREX同种异体细胞疗法。
靶向HER2的CAR在TREX细胞或原代T细胞中表达(图20A)以产生CAR-TREX细胞和CAR-T细胞。评估了抗HER2-TREX细胞和抗HER2-CAR-T细胞以不同的效应子:靶细胞比率靶向过表达HER2的OE21细胞的能力(图20B，左侧)。相对于由三种不同的原代T细胞供体产生的抗HER2-CAR-T细胞，抗HER-TREX细胞表现出对表达HER2的肿瘤细胞的相当的或改善的控制。在共培养开始后72小时收集上清液，随后检查效应细胞因子是否存在(图20B，右侧)。如先前所观察到的，尽管对肿瘤细胞的控制相当或有改善，但抗HER2-TREX细胞分泌的细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)水平低于抗HER2-CAR-T细胞，这表明CAR-TREX细胞在患者中引起CRS的倾向可能较低。另外，如上文对于抗BCMA-TREX细胞所示，如与来自含有抗HER2-CAR-T细胞的共培养物的上清液相比，在取自表达HER2的肿瘤细胞和抗HER2-TREX细胞的共培养物的上清液中也观察到IFN-γ的分泌减少(图14，右侧)。这些数据再次表明，与CAR-T细胞相比，CAR-TREX细胞表现出可能会降低CRS风险的细胞因子分泌特征。
实例12：可以使用不同的编辑组合产生TREX细胞表型。
在来自两种供体(表示为G和H)的分离的CD8+T细胞中评估了对过表达Bcl-xL和各种REX靶基因以赋予REX表型的要求。简而言之，CD8+T细胞被阴性选择，然后用αCD3/αCD28Dynabeads激活3天。将Bcl-xL引入一些细胞，同时培养其他细胞，并且使用CRISPR/Cas9敲除REX靶基因的各种组合(图16)。对细胞随时间的扩增进行监测并绘图。(CDKN2A和CDKN2A'反映了单个与多个同种型的靶向)。发现Bcl-xL对于REX表型是非必需的，而三个REX靶基因在供体之间产生了一致的表型(图16，右侧)。
实例13：在靶向基因座处对TREX细胞进行编辑。
通过蛋白质印迹分析检查TREX细胞和γδTREX细胞的REX靶基因表达的消除(图17，左图和中图)。如所预期的那样，这些细胞表现出MTAP、CDKN2A(p14)、CDKN2A(p16)和CDKN2B(p15)的表达丧失。相反，这些基因在供体匹配的、未经编辑的对照细胞中保持表达。进一步地，桑格(Sanger)测序数据表明，在经编辑的TREX细胞中的这三个基因座处的插入缺失的发生率很高(图17，右)。
实例14：TREX细胞表现出细胞周期相关基因特征的富集。
随时间对过表达Bcl-xL的TREX细胞和供体匹配的、未经编辑的对照CD8+T细胞进行培养。对不同点处产生的细胞沉淀进行RNAseq分析，并在Bcl-xL TREX细胞和对照细胞中评估基因特征；如所预期的那样，TREX细胞示出了与细胞周期相关的基因特征(例如E2F靶基因和G2M检查点靶基因)的富集(图18A)。Bcl-xL TREX细胞也示出了更高水平的MYC靶基因表达(图18B)，这与观察到的这些细胞的增殖率一致。进一步地，Bcl-xL TREX细胞示出了多个细胞周期相关基因表达的调节(图22C)。这些数据证实REX表型与细胞周期进程和增殖增加有关。
实例15：TREX细胞的存活和增殖依赖于IL-2。
TREX细胞与不同量的IL-2一起培养12-14天的时间段。对细胞在此期间的扩增进行跟踪并绘图(图19)。如上文对于Bcl-xL TREX细胞所示(参见例如，图5)，TREX细胞在体外增殖和存活高度依赖于IL-2。TREX细胞表现出应答于IL-2的剂量依赖性增殖；在不存在IL-2的情况下，TREX细胞的存活率迅速下降，其中超过60％的TREX细胞在前4天内被消除。
实例17：REX编辑增强了CD4+TREX细胞的增殖能力。
REX编辑可重复地赋予CD8+T细胞对复制性衰老的增强的抗性。确定了REX靶基因(CDKN2A、CDKN2B和MTAP)的表达的消除增强CD4+T细胞对复制性衰老的抗性的能力。CD4+T细胞从三个健康供体中分离出来，使用αCD3/αCD28 Dynabeads对其进行刺激，然后在这些基因座处进行编辑。对CD4+TREX细胞和供体匹配的、未经编辑的CD4+T细胞对照随时间的增殖进行跟踪并绘图。(图21)。正如之前用CD8+T细胞所证明的那样，靶向CD4+T细胞中的REX基因可重复地增强了这些细胞的增殖能力并使其对复制性衰老具有抗性。
实例18：可以使用REX编辑产生γδTREX细胞。
γδT细胞是T细胞的另一个细胞毒性子集。使用来自八个不同供体的γδT细胞研究了REX编辑在γδT细胞中赋予TREX细胞表型的能力(图22)。将γδT细胞分离并用αCD3/αCD28 Dynabeads或αCD3抗体进行刺激，随后使用CRISPR/Cas9在REX基因座处进行编辑。对γδT细胞和γδTREX细胞随时间的增殖进行监测并绘图。REX编辑可重复地增强γδT细胞对复制性衰老的抗性，并导致产生γδTREX细胞表型。
已经确定了γδTREX细胞系表现出对复制性衰老的增强的抗性后，确定γδTREX细胞在长期培养和扩增后是否保持有效的细胞毒性功能。在存在靶肿瘤细胞和基于阻抗的xCELLigence平台的情况下使用T细胞衔接器来定量γδTREX细胞的细胞毒性功能(图23)。在T细胞衔接器存在的情况下，第79天和第88天γδTREX细胞系表现出与未经修饰的原代CD8+T细胞相当的裂解靶肿瘤细胞的能力(图23，顶部)。在添加效应细胞和活性T细胞衔接器或对照T细胞衔接器分子后72小时收集来自这些共培养物的上清液，并分析是否存在IFN-γ、IL-2和TNF-α(图23，底部)。γδTREX细胞系产生的这些细胞因子水平低于未经修饰的原代CD8+T细胞，尽管它们以抗原依赖性方式裂解靶细胞的能力相似。这些数据表明，即使在培养79天和大量扩增后，γδTREX细胞也未在功能上耗竭并保持其细胞毒性潜力。
γδT细胞典型地由多个子集组成，这些子集包括Vδ1、Vδ2、Vδ3和Vδ5等(Lawand等人,Front.Immunol.[免疫学前沿],2017年6月30日)。在人类中，Vδ1和Vδ2构成了大部分γδT细胞，其中Vδ2细胞主要存在于血液中，而Vδ1细胞存在于组织中。
对γδTREX细胞、γδCAR-TREX细胞和供体匹配的、未经编辑γδT细胞进行染色，并分析Vδ1和Vδ2的表达(图24)。FACS分析揭示，γδTREX细胞由多个γδT细胞亚型(Vδ1、Vδ2和Vδ1-Vδ2-)组成，这表明REX编辑可以增强多个γδT细胞亚型对复制性衰老的抗性。进一步地，在γδCAR-TREX细胞中保持了γδT细胞亚型的多样性(图28，底部)。
接下来研究γδTREX细胞接受来自靶向肿瘤部分(如靶向BCMA的CAR)的指令的能力(图25)。将γδTREX细胞进行转导以表达靶向BCMA的CAR(图25A)，并且这些细胞与表达BCMA的肿瘤细胞在不同的效应子:靶细胞比率下共培养。使用xCELLigence平台对肿瘤细胞随时间的裂解进行监测(图25B)，并在共培养开始后72小时收获上清液。γδTREX细胞表现出与原代CAR-T细胞对照类似的控制表达BCMA的肿瘤细胞的能力，然而γδTREX细胞通常分泌较低水平的效应细胞因子，包括IFN-γ、TNF-α和IL-2(图25B，底部)。这些数据表明γδCAR-TREX细胞能够接受来自靶向肿瘤的CAR的引导，并且也可能以比原代CAR-T细胞更低的可能性引起CRS。
实例19：NK细胞中的REX编辑支持NKREX细胞表型。
REX编辑增强了T细胞对复制性衰老的抗性，然而尚不清楚它们是否会支持NKREX细胞表型。因此，将NK细胞从三个不同的供体中分离出来，并在含有IL-2或IL-2和IL-15组合的培养基中培养。然后使用CRISPR/Cas9在REX基因座处对NK细胞进行编辑，并对NKREX和供体匹配的、未经编辑NK细胞随时间的增殖进行监测(图26)。在所有供体和细胞因子条件下，REX编辑能够可重复地增强NKREX细胞对复制性衰老的抗性(图26)。NKREX细胞可以培养超过90天，扩增>106->1010倍，而未经编辑的NK细胞未能扩增并在80天内死亡。
鉴于对复制性衰老的抗性增强，确定NKREX细胞是否保持其对细胞因子支持的依赖性是重要的。在含有IL-2或IL-2和IL-15组合的培养基中产生了NKREX细胞。在实验(其中从生长培养基中撤除细胞因子，并在持续37天时间段中对NKREX细胞数量进行监测)中确定了NKREX细胞对这些细胞因子的依赖性。NKREX细胞在细胞因子撤除后未能增殖，并且尽管对REX基因进行了编辑，这些细胞表现出细胞活力和活细胞直径的快速下降，对细胞因子支持的依赖性增强(图27)。
将NKREX细胞进行转导以表达靶向BCMA的CAR以确定这些细胞是否能够稳定地表达靶向肿瘤的CAR(图28)。CAR-NKREX细胞中的CAR表达随时间保持不变，并且表达水平(平均荧光强度，MFI)与纯化的CAR-T细胞中的表达水平相似。这些数据表明，CAR-NKREX细胞可以稳定地表达CAR，并且表达水平与标准CAR-T细胞的表达水平相当。
虽然NKREX细胞可以在培养中长时间扩增，但尚不清楚：1)它们的细胞毒性潜力在持续增殖后是否得以保持；以及2)他们是否可以接受靶向肿瘤的CAR的引导。因此，CAR-NKREX细胞从两种不同的NKREX系产生(图29A)。基于CAR表达纯化这些CAR-NKREX系之一以产生>95％CAR+CAR-NKREX系(图29A，右下)。在xCELLigence测定中测试了来自供体50-1和47-1的NKREX和CAR-NKREX系裂解表达BCMA的肿瘤细胞的能力(图29B)。即使在培养78天和86天后，NKREX和CAR-NKREX细胞仍具有强大的细胞毒性。这些细胞系快速地裂解表达BCMA的靶细胞，从而比CAR-TREX细胞更快地实现了更高水平的控制(图29B)。虽然NKREX细胞能够独立于CAR表达而裂解肿瘤细胞(这可能是由于NKREX和CAR-NKREX细胞上的激活受体的参与)，但在较低的效应子:靶细胞比率下，可以观察到CAR引导的细胞毒性对两个供体50-1和47-1的贡献。共培养48小时后收集上清液，并使用MSD测定IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平(图29C)。NKREX细胞分泌的这些细胞因子水平低于CAR-NKREX细胞，而CAR-TREX细胞分泌的这些因子水平最高(图29C)。这些数据表明，CAR-NKREX细胞能够稳定地表达并接受来自靶向肿瘤的CAR的引导。进一步地，这些细胞快速地裂解肿瘤细胞并在共培养上清液中积累较低水平的IFN-γ、IL-2和TNF-α。
实例20：TREX细胞对T细胞消耗剂和化学疗法敏感。
TREX细胞已被修饰以增加其对复制性衰老的抗性。然而，这些细胞表现出了正常T细胞的特征。为了更好地了解控制TREX细胞的能力，确定了相对于被激活进入细胞周期的、未经编辑的总T细胞而言，它们对标准T细胞消耗剂和化学疗法的易感性(图30)。将未经编辑的、最近激活的总T细胞或TREX细胞与10μg/mL的抗CD52和10％人补体(图30，左上)或10％兔补体(图30，左下)一起孵育。3小时后，使用Cell Titer Glo测定法评估细胞存活率。也将未经编辑的、最近激活的总T细胞或TREX细胞也与指定量的美法仑(图30，右上)或苯丁酸氮芥(图30，右下)一起孵育，并在2天后使用Cell Titer Glo测定法测量细胞存活率。在所有情况下，TREX细胞对这些药剂表现出与未经编辑的、最近激活的总T细胞相当的易感性。
实例21：B2MKO TREX细胞对NK细胞介导的消耗敏感，并且这可以使用抗CD38抗体进行调节。
作为同种异体细胞产品，TREX细胞在B2M基因座处被修饰，这增加了它们对NK细胞介导的消耗的易感性。这些细胞可以在CD38基因座处被进一步修饰，以通过抗CD38抗体限制其消耗。使用CRISPR/Cas9产生TREX细胞系和CD38KOB2MKO TREX细胞系。将TREX细胞和CD38KOB2MKO TREX细胞与从健康供体分离的PBMC共培养。当与PBMC共培养时，TREX细胞没有表现出数量下降，而CD38KOB2MKO TREX细胞对NK细胞介导的裂解易感，如所预期的那样(图31，顶部)。NK细胞表达高水平的CD38，并且当NK细胞在与CD38KOB2MKO总T细胞或CD38KOB2MKO TREX细胞共培养之前与靶向CD38的抗体达雷木单抗(Dara)预孵育时，这使得细胞溶解减少了>50％。这些数据表明CD38KOB2MKO TREX细胞对NK细胞介导的裂解易感，并且这种对消耗的敏感性可以通过施用抗CD38抗体进行调节。

Claims (96)

1.一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：
(a)将一种或多种基因编辑引入原代免疫细胞；以及
(b)在培养基中培养这些原代免疫细胞；
其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
2.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括在将该一种或多种基因编辑引入这些原代免疫细胞之前刺激这些原代免疫细胞。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，该方法进一步包括在将该一种或多种基因编辑引入这些原代免疫细胞之后刺激这些原代免疫细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制一种或多种内源性调节因子在这些原代免疫细胞中的表达。
5.如权利要求4所述的方法，其中该内源性调节因子是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制一种或多种内源性免疫相关基因在这些原代免疫细胞中的表达。
7.如权利要求6所述的方法，其中该内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中引入一种或多种基因编辑包括将一种或多种编码抗凋亡因子或病毒衍生因子的转基因引入这些原代免疫细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中该抗凋亡因子是超大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)或B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)。
10.如权利要求8所述的方法，其中该病毒衍生因子是松鼠猴γ疱疹病毒2StpA A11、松鼠猴疱疹病毒StpC、松鼠猴疱疹病毒Tip或修饰的蜘蛛猴疱疹病毒-爱泼斯坦-巴尔病毒Tio-LMP1中的任何一种。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制分化簇38(CD38)的表达。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的表达。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含总T细胞。
14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含CD8+T细胞。
15.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含CD4+T细胞。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含γ-δT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或自然杀伤T(NKT)细胞。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞是人类细胞。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，该方法进一步包括引入编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中可以在有或没有TCR刺激的情况下将该原代免疫细胞群培养至少100天。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞在培养期间经历至少约106倍的扩增。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中将这些原代免疫细胞在不包括原代免疫细胞刺激物的培养基中培养。
22.如权利要求2或权利要求3所述的方法，该方法进一步包括(c)再刺激这些原代免疫细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中这些原代免疫细胞在培养期间经历至少约108倍的扩增。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中使用基于质粒的DNA转座子引入该转基因。
25.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中使用慢病毒平台引入该转基因。
26.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中使用经由CRISPR的位点特异性整合引入该转基因。
27.一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：
(a)抑制一种或多种内源性调节因子在这些原代免疫细胞中的表达，
其中该内源性调节因子是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)；
(b)抑制一种或多种内源性免疫相关基因在这些原代免疫细胞中的表达，
其中该内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)；以及
(c)在培养基中培养这些原代免疫细胞；
其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
28.如权利要求27所述的方法，该方法进一步包括将编码超大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)或B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的转基因引入这些原代免疫细胞。
29.如权利要求27或权利要求28所述的方法，该方法进一步包括在将该一种或多种基因编辑引入这些原代免疫细胞之前刺激这些原代免疫细胞。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，该方法进一步包括在将该一种或多种基因编辑引入这些原代免疫细胞之后刺激这些原代免疫细胞。
31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制分化簇38(CD38)的表达。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的表达。
33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含总T细胞。
34.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含CD8+T细胞。
35.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含CD4+T细胞。
36.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含γ-δT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或自然杀伤T(NKT)细胞。
37.如权利要求27-36中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞是人类细胞。
38.如权利要求27-37中任一项所述的方法，该方法进一步包括引入编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。
39.如权利要求27-38中任一项所述的方法，其中可以将该原代免疫细胞群培养至少100天。
40.如权利要求27-39中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞在培养期间经历至少约106倍的扩增。
41.如权利要求27-40中任一项所述的方法，其中将这些原代免疫细胞在不包括原代免疫细胞刺激物的培养基中培养。
42.如权利要求27-41中任一项所述的方法，该方法进一步包括(d)再刺激这些原代免疫细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其中这些原代免疫细胞在培养期间经历至少约108倍的扩增。
44.如权利要求27-43中任一项所述的方法，其中使用基于质粒的DNA转座子引入该转基因。
45.如权利要求27-43中任一项所述的方法，其中使用慢病毒平台引入该转基因。
46.如权利要求27-43中任一项所述的方法，其中使用经由CRISPR的位点特异性整合引入该转基因。
47.一种产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群的方法，该方法包括：
(a)抑制一种或多种内源性调节因子在这些原代免疫细胞中的表达，
其中内源性调节因子是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)；以及
(b)在培养基中培养这些原代免疫细胞；
其中该培养诱导这些原代免疫细胞增殖以产生抗复制性衰老(RRS)的原代免疫细胞群。
48.如权利要求47所述的方法，该方法进一步包括在将该一种或多种基因编辑引入这些原代免疫细胞之前刺激这些原代免疫细胞。
49.如权利要求47或权利要求48所述的方法，该方法进一步包括在将该一种或多种基因编辑引入这些原代免疫细胞之后刺激这些原代免疫细胞。
50.如权利要求47-49中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制一种或多种内源性免疫相关基因在这些原代免疫细胞中的表达。
51.如权利要求50所述的方法，其中该内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)。
52.如权利要求47-51中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制分化簇38(CD38)的表达。
53.如权利要求47-52中任一项所述的方法，该方法进一步包括抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的表达。
54.如权利要求47-53中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含总T细胞。
55.如权利要求47-53中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含CD8+T细胞。
56.如权利要求47-53中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含CD4+T细胞。
57.如权利要求47-53中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞包含γ-δT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或自然杀伤T(NKT)细胞。
58.如权利要求47-57中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞是人类细胞。
59.如权利要求47-58中任一项所述的方法，该方法进一步包括引入编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。
60.如权利要求47-59中任一项所述的方法，其中可以将该原代免疫细胞群培养至少100天。
61.如权利要求47-60中任一项所述的方法，其中这些原代免疫细胞在培养期间经历至少约106倍的扩增。
62.如权利要求47-61中任一项所述的方法，其中将这些原代免疫细胞在不包括原代免疫细胞刺激物的培养基中培养。
63.如权利要求47或权利要求48所述的方法，该方法进一步包括(c)刺激这些原代免疫细胞。
64.如权利要求63所述的方法，其中这些原代免疫细胞在培养期间经历至少约108倍的扩增。
65.如权利要求47-64中任一项所述的方法，其中使用基于质粒的DNA转座子引入该转基因。
66.如权利要求47-64中任一项所述的方法，其中使用慢病毒平台引入该转基因。
67.如权利要求47-64中任一项所述的方法，其中使用经由CRISPR的位点特异性整合引入该转基因。
68.一种工程化免疫细胞群，该工程化免疫细胞群根据如权利要求1-67中任一项所述的方法产生。
69.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求68所述的工程化免疫细胞群以及药学上可接受的载剂。
70.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求69所述的药物组合物。
71.一种工程化T细胞，该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)和/或S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。
72.如权利要求71所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞进一步包含编码超大B细胞淋巴瘤(Bcl-xL)或B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的转基因。
73.如权利要求71或72所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞在原代免疫细胞中不表达一种或多种内源性免疫相关基因。
74.如权利要求73所述的工程化T细胞，其中该内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)。
75.如权利要求71-74中任一项所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞不表达分化簇38(CD38)。
76.如权利要求71-75中任一项所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。
77.如权利要求71所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或其组合。
78.如权利要求71所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD8+T细胞。
79.如权利要求71所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD4+T细胞。
80.如权利要求71-79中任一项所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是人类细胞。
81.一种工程化T细胞，该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)、S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)、β-2微球蛋白(B2M)和/或T细胞受体α恒定区(TRAC)。
82.如权利要求81所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞不表达分化簇38(CD38)。
83.如权利要求81或权利要求82所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。
84.如权利要求81所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是γ-δT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或其组合。
85.如权利要求81所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD8+T细胞。
86.如权利要求81所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD4+T细胞。
87.如权利要求81-86中任一项所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是人类细胞。
88.一种工程化T细胞，该工程化T细胞表达编码超大B细胞淋巴瘤(Bcl-XL)的转基因，其中该工程化T细胞不表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B)、S-甲基-5'-硫腺苷磷酸化酶(MTAP)和/或磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)。
89.如权利要求88所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞在原代免疫细胞中不表达一种或多种内源性免疫相关基因。
90.如权利要求89所述的工程化T细胞，其中该内源性免疫相关基因是β-2微球蛋白(B2M)或T细胞受体α恒定区(TRAC)。
91.如权利要求88-90中任一项所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞不表达分化簇38(CD38)。
92.如权利要求88-91中任一项所述的工程化T细胞，该工程化T细胞进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。
93.如权利要求88所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、δγT细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)T细胞、自然杀伤(NK)T细胞或其组合。
94.如权利要求88所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD8+T细胞。
95.如权利要求88所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是CD4+T细胞。
96.如权利要求88-95中任一项所述的工程化T细胞，其中该工程化T细胞是人类细胞。
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