CN108136023B - 血小板膜包覆的药物递送系统 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种血小板膜包覆的纳米载体，所述血小板膜包覆的纳米载体具有包含药物递送基质的内核以及包覆所述内核的外壳血小板膜。所述内核可以是能够将治疗剂递送至细胞的任何药物递送基质。所述外壳血小板膜可以是包含能够与癌细胞相互作用的血小板蛋白的天然或合成膜。本发明还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法涉及向所述受试者施用本文所公开的血小板膜包覆的纳米载体。本发明还公开了一种用于治疗受试者的血管疾病的方法，所述方法涉及向所述受试者施用本文所公开的血小板膜包覆的纳米载体。

Description

血小板膜包覆的药物递送系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年8月12日提交的美国临时申请No.62/204,084的权益，该美国临时申请据此全文以引用方式并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在政府支持下进行的，授权号TR001111，由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供资金。美国政府在本发明中享有部分权利。
背景技术
仿生药物递送系统提供新的机会来模拟生物颗粒(包括细胞、囊泡和病毒)以增强生物相容性并促进疗效(Sarikaya M等人(2003)Nat Mater.2(9):577-585；Yoo J-W等人(2011)Nat Rev Drug Discov.10(7):521-535；Gao W等人(2015)Nano letters 15(2):1403-1409；Wang Q等人(2014)Adv Drug Deliv Rev)。作为一种简单有效的仿生方法，目前正在大力推行包覆有细胞膜的递送载体以实现各种优点，诸如延长循环时间，减轻免疫原性和实现主动靶向能力。典型的示例包括红细胞(RBC)膜包覆的PLGA纳米颗粒(Hu C-MJ等人(2011)Proc Natl Acad Sci U S A.108(27):10980-10985；Hu C-MJ等人(2013)NatNanotechnol.8(5):336-340；Hu C-MJ等人(2013)Nat Nanotechnol.8(12):933-938；CoppJA等人(2014)Proc Natl Acad Sci U S A.111(37):13481-13486)，白细胞(WBC)膜修饰的二氧化硅颗粒(Parodi A等人(2013)Nat Nanotechnol.8(1):61)和癌细胞膜掩盖的纳米颗粒(Fang RH等人(2014)Nano letters 14(4):2181-2188)。然而，尚未开发出靶向于癌细胞的合适的药物递送系统。
发明内容
本文公开了血小板膜包覆的核-壳纳米载体(“PM-NV”)，该纳米载体可以有序地并且位点特异性地将细胞外活性药物和细胞内功能性药物递送至癌细胞。通过利用PM与癌细胞之间的高亲和力，PM-NV有效地聚集在癌细胞的表面上，从而可以促进细胞外活性药物的相互作用。内吞作用后，PM-NV可通过溶酶内吞体中的酸性降解，伴随包封的细胞内功能性药物的释放和进一步累积。此外，PM-NV可以体内消除循环肿瘤细胞(CTC)并显著抑制肿瘤转移。此外，血小板还通过形成封闭受伤血管并止血的栓塞，从而在几种生理和病理过程(诸如止血和血栓)中起着关键作用，因此该平台也可用于治疗血管相关的疾病。
因此，本文公开了一种血小板膜包覆的纳米载体，其具有包含药物递送基质的内核以及包覆内核的外壳血小板膜。内核可以是能够将治疗剂递送至细胞的任何药物递送基质。例如，治疗剂可以是亲水性或疏水性小分子化合物。在一些情况下，治疗剂是从细胞内的内核释放的细胞内活性小分子药物。例如，药物可以是疏水性或亲水性抗肿瘤药物。
外壳血小板膜可以是包含能够与癌细胞相互作用的血小板蛋白的天然或合成膜。在一些情况下，血小板膜是通过溶解血小板诸如来自待治疗的受试者的自体血小板而产生的。在其他情况下，外壳是合成膜诸如脂质体，其被设计成含有能够与癌细胞相互作用的血小板蛋白。例如，外壳血小板膜可以包含P-选择素蛋白。壳血小板膜可以包含整合素αIIbβ3。壳血小板膜可以包含选自CD47、CD55和CD59的自我识别的免疫调节蛋白。
无论是天然的还是合成的，外壳血小板膜都可以被设计成包含至少一种异源的细胞外活性蛋白。这种细胞外活性蛋白可以是在与癌细胞接触时将具有治疗效果的任何天然或合成的蛋白。例如，该细胞外活性蛋白可以是肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，其可以结合肿瘤细胞上的DR4和DR5死亡受体并诱导细胞凋亡。又如，该细胞外活性蛋白可以是治疗性抗体，诸如西妥昔单抗(Cetuximab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、易普利单抗(Ipilimumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、贝伦妥单抗-维多汀(Brentuximab vedotin)、Pembrolizumab(Keytruda)、nivolumab(Opdivo)或它们的组合。
本发明还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法涉及向受试者施用本文所公开的血小板膜包覆的纳米载体。在一些情况下，血小板膜是自体的，即由从受试者获得的血小板产生。在一些情况下，该方法可用于治疗过表达CD44的任何癌症。因此，在一些情况下，该方法进一步涉及测定来自受试者的样品的CD44表达，并且如果检测到升高的CD44水平，则用本发明公开的血小板膜包覆的纳米载体治疗受试者。在一些情况下，癌症是一种循环癌细胞。在一些情况下，癌症是一种转移性癌细胞。
本发明还公开了一种用于治疗受试者的血管疾病的方法，该方法涉及向受试者施用本文所公开的血小板膜包覆的纳米载体。在这些实施方案中，药物递送基质包封药物以治疗血管疾病，例如凝血或冠状动脉再狭窄。例如，药物可以是肝素或阿霉素。
在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据下面的描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将显而易见。
附图说明
图1A和1B示出了用于靶向和有序药物递送的载有药物的PM-NV的示意性设计。图1A示出了TRAIL-Dox-PM-NV的主要组分：来源于血小板的缀合TRAIL的血小板膜；载有Dox的纳米载体(Dox-NV)。I：全血离心；II：分离血小板；III：提取血小板膜。图1B示出了循环肿瘤细胞(CTC)的体内消除以及TRAIL和Dox的有序递送。TRAIL-Dox-PM-NV通过P-选择素的特异性亲和力和过表达的CD44受体捕获CTC，随后触发TRAIL/Dox诱导的细胞凋亡信号传导途径。I：TRAIL和死亡受体(DR)相互作用以触发细胞凋亡信号传导；II：TRAIL-Dox-PM-NV的内化；III：由溶酶内吞体的酸性介导的TRAILDox-PM-NV的解离；IV：Dox在细胞核中的释放和累积；V：由Dox触发的内源性细胞凋亡。
图2A至图2D示出了PM-NV的表征。图2A是示出了PMNV的流体动力学尺寸分布的TEM图像和柱状图。箭头指示存在血小板膜。比例尺：100nm；插图：50nm。图2B包含柱状图，其示出用PM包覆后NV的粒度和zeta电位的变化。误差条指示标准偏差(n＝3)。图2C是示出100％胎牛血清中NV和PM-NV的体外稳定性的曲线图。监测560nm处的吸光度。误差条指示标准偏差(n＝3)。图2D是示出在具有不同pH的PBS中从NV和PM-NV体外释放Dox的曲线图。误差条指示标准偏差(n＝3)。
图3A至图3E示出了PM-NV对TRAIL和Dox的体外位点特异性递送。图3A示出了温育2h后NV和PM-NV的细胞外分布。白色箭头指示若丹明标记的NV和PM-NV的位置。比例尺：20μm。图3B示出了使用APO-BrdU TUNEL测定法，用TRAIL-Dox-NV和TRAIL-Dox-PM-NV处理的MDA-MB-231细胞在温育12h后的诱导细胞凋亡。荧光指示Alexa Fluor 488染色的缺口末端标记DNA片段和PI染色的细胞核。比例尺：100μm。图3C示出了在CLSM观察的不同时间，TRAIL-Dox-PM-NV在MDA-MB-231细胞上的细胞内递送。用LysoTracker Green染色后期内吞溶酶体，并用Hoechst33342染色细胞核。比例尺：20μm。图3D示出了用Annexin V-FITC和PI染色后对MDA-MB-231细胞的流式细胞术分析。用TRAIL浓度为20ng/mL且Dox浓度为200ng/mL的TRAIL-Dox-NV、TRAIL-PM-NV、Dox-PM-NV和TRAIL-Dox-PM-NV处理细胞12h。将用无药DMEM温育的细胞用作对照。图3E示出了TRAIL-DOX-NV、TRAIL-PMNV、Dox-PM-NV和TRAIL-Dox-PM-NV在温育24h后的体外细胞毒性。误差条指示标准偏差(n＝3)。
图4A至图4D示出了PM-NV的体内靶向能力。图4A示出了MDA-MB-231荷瘤裸小鼠在20nmol/kg的Cy5.5剂量下静脉注射经Cy5.5标记的TRAIL-DOX-NV(i)和经Cy5.5标记的TRAIL-Dox-PM-NV(ii)后6、12、24h和48h的体内荧光影像。箭头指示肿瘤的位点。图4B示出了在注射后48h，切除肿瘤和正常组织的间接体内荧光影像。i，Cy5.5-TRAIL-Dox-NV；ii，Cy5.5-TRAIL-Dox-PM-NV。从上到下，1：肿瘤；2：肾脏；3：肺；4：脾脏；5：肝脏；6：心脏。图4C示出了对肿瘤和正常组织的荧光强度的感兴趣区域分析。误差条指示标准偏差(n＝3)。*P＜0.05(双尾学生t检验)。图4D示出了用TRAIL-DOX-NV和TRAIL-DOX-PM-NV治疗的肿瘤的体内荧光图像。比例尺：100μm。
图5A至图5D示出了体内抗肿瘤效力评估。图5A示出了在第16天用不同TRAIL/Dox制剂治疗后MDA-MB-231肿瘤的代表性图像(从上到下，1：盐水，2：TRAILDox-NV，3：TRAIL-PM-NV，4：Dox-PM-NV，5：TRAIL-Dox-PM-NV)，其中TRAIL剂量为1mg/kg，Dox剂量为2mg/kg。图5B示出了静脉内注射不同TRAIL/Dox制剂后的MDA-MB-231肿瘤生长曲线。误差条指示标准偏差(n＝5)。*P＜0.05(双尾学生t检验)。图5C示出了MDA-MB-231荷瘤小鼠在治疗期间的体重变化。误差条指示标准偏差(n＝5)。图5D示出了治疗后肿瘤组织的组织学观察和细胞凋亡检测。肿瘤切片用苏木精和伊红染色，荧光素-dUTP用于细胞凋亡，Hoechst用于细胞核。每个肿瘤的数字标签如下：1，生理盐水；2，TRAIL-Dox-NV；3，TRAIL-PMNV；4，Dox-PM-NV；5，TRAIL-Dox-PM-NV。比例尺：100μm。
图6A至图6C示出了循环肿瘤细胞(CTC)的体内消除。图6A示出了用MDA-MB-231细胞和不同TRAIL/Dox制剂静脉注射后8周肺组织的代表性图像。红色箭头指示可见的转移性结节。图6B示出了治疗后肺组织的组织学观察。肺切片用苏木精和伊红染色。黑色箭头指示肿瘤细胞。比例尺：200μm。图6C示出了可见的转移性结节的量化。i：盐水；ii：TRAILDox-NV；iii：TRAIL-Dox-PM-NV。误差条指示标准偏差(n＝3)。***P＜0.001(双尾学生t检验)。
图7示出了针对缀合FITC的、抗CD45(白细胞标记物)和抗CD41(血小板标记物)的双重染色纯化血小板的FACS研究结果。
图8A和8B示出了经由DLS和TEM对NV的表征。图8A是NV的TEM图像。比例尺，100nm。图8B示出了NV的流体动力学尺寸分布。
图9示出了PM-NV的CLSM图像。用若丹明标记NV，用FITC标记PM以便于成像。比例尺：50μm。
图10示出了在各种内吞作用抑制剂存在的情况下MDA-MB-231细胞上的TRAIL-Dox-PM-NG的相对吸收效率。误差条指示标准偏差(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比(双尾学生t检验)。网格蛋白介导的内吞作用抑制剂：蔗糖(SUC)和氯丙嗪(CPZ)；脂筏抑制剂：甲基-β-环糊精(MCD)；巨吞饮作用抑制剂：阿米洛利(AMI)；小窝蛋白介导的内吞作用抑制剂：制霉菌素(NYS)。
图11A和图11B示出了Raw 264.7细胞对Dox-NV和Dox-PM-NV的吸收。图11A示出了在Dox浓度为200ng/mL的情况下Dox-NV和Dox-PM-NV摄取的荧光图像。比例尺：50μm。图11B示出了使用流式细胞术对Dox-NV和Dox-PM-NV的吸收效率的定量。
图12A和图12B示出了以5mg/kg的Dox剂量向小鼠静脉注射Dox-NV和Dox-PM-NV后，Dox的药代动力学。图12A示出了Dox-NV和Dox-PM-NV的血浆Dox浓度曲线。误差条指示标准偏差(n＝3)。图12B示出了Dox-NV和Dox-PN-NV的药代动力学参数。***P＜0.001(双尾学生t检验)。
图13示出了用不同的Dox制剂治疗后心脏组织的组织学观察。心脏切片用苏木精和伊红(H&E)染色。比例尺：200μm。
图14示出了治疗后在第16天从MDA-MB-231荷瘤小鼠收集的器官的组织学观察。用H&E将器官切片染色。每个器官的数字标签如下：1，肝脏；2，脾脏；3，肺；4，肾脏。比例尺：100μm。
具体实施方式
考虑由于不同种类的膜整合有不同的生物活性组分而导致生物实体的复杂性，预期将开发具有高特异性的多功能仿生药物递送系统。血小板是血流不可缺少的组分，具有靶向血管损伤位点以阻止血栓形成并维持血液循环的完整性的能力(Doshi N等人(2012)Adv Mater.24(28):3864-3869；Liu X等人(2014)Small 10(22):4677-4683；Gay LJ&Felding-Habermann B(2011)Nat Rev Cancer.11(2):123-134；Nguyen DX等人(2009)NatRev Cancer.9(4):274-284)。最近，血液中的血小板与循环肿瘤细胞的识别和相互作用引起了相当大的关注，因为它对肿瘤转移的重要贡献(Nash G等人(2002)Lancet Oncol.3(7):425-430；Labelle M等人(2011)Cancer Cell 20(5):576-590)。循环肿瘤细胞(CTC)周围的血小板聚集有助于CTC在血流中存活并蔓延到新组织(Chaffer CL&Weinberg RA(2011)Science 331(6024):1559-1564)。该特定聚集的基础机制包括生物分子结合，诸如P-选择素和CD44受体(Borsig L等人(2001)Proc Natl Acad Sci U S A.98(6):3352-3357；Stone J&Wagner D(1993)J Clin Invest.92(2):804)和基于结构的捕获(Jurasz P等人(2004)Br J Pharmacol.143(7):819-826；Labelle M等人(2014)Proc Natl Acad SciU S A.111(30):E3053-E3061)。
本文公开了用于靶向且有序地将细胞外活性蛋白和细胞内功能性小分子药物位点特异性地递送的血小板膜包覆的核-壳纳米载体(“PM-NV”)。如图1A所示，PM-NV可以由两种组分组成：1)用于装载细胞内功能性药物的内核部分；和2)用于修饰细胞外活性蛋白的基于血小板膜的外壳。血小板膜可以来源于血小板并被纯化以包覆NV的表面。配备有大量“自我识别”蛋白，预期这种PM-NV可以最大限度地减少体内免疫原性，延长循环时间(George D(2001)Seminars in oncology,(Elsevier)，第27至33页)。更重要的是，PM上过表达的P-选择素可特异性地结合至癌细胞表面上的上调CD44受体。总而言之，PM-NV可以主动靶向于肿瘤位点，并将抗癌治疗剂有序递送至其最具活性的目的地。
例如，使用两种抗癌治疗剂-TRAIL和Dox制备了PM-NV(命名为“TRAIL-Dox-PM-NV”)。作为细胞凋亡最重要的细胞外激活剂之一，TRAIL通过结合至细胞表面上的死亡受体(DR4,DR5)诱导肿瘤细胞凋亡(Jiang T等人(2014)Adv.Functional Mater.24(16):2295-2304；Jiang T等人(2014)Adv Mater.27(6):1021-8)；而Dox可以嵌入癌细胞的核DNA以触发内源性细胞凋亡信号传导途径(Mo R等人(2014)Nat Commun.5:3364；Sun W等人(2014)JAm Chem Soc.136(42):14722-14725；Bagalkot V等人(2006)Angew Chem Int Ed Engl.45(48):8149-8152)。
静脉内(i.v.)注射后，预期PM-NV通过被动增强渗透和滞留(EPR)效应的组合(Peer D等人(2007)Nat Nanotechnol.2(12):751-760；Farokhzad OC&Langer R(2009)ACSnano 3(1):16-20)以及基于PM和癌细胞上过表达的CD44受体之间的亲和力的主动靶向(图1B)而在肿瘤位点中累积。同时，P选择素的捕获能力使PM-NV在癌细胞表面上的聚集能够促进TRAIL与细胞膜之间的相互作用并随后发起外源性细胞凋亡信号传导。此外，P选择素和CD44的亲和力也预期容易消除CTC(图1B)，CTC在肿瘤转移中起关键作用的(Mitchell MJ等人(2014)Proc Natl Acad Sci U S A.111(3):930-935；Cristofanilli M等人(2004)NEngl J Med.351(8):781-791；Chambers AF等人(2002)Nat Rev Cancer.2(8):563-572)。在细胞内化之后，预期内吞溶酶体中的酸性会消化PM-NV中的酸应答模式，伴随包封的Dox释放，其将累积在癌细胞的细胞核中，以便协同地诱导细胞凋亡。
定义
术语“受试者”是指为施用或治疗的目标的任意个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类患者或兽医患者。术语“患者”是指接受临床医生(例如内科医生)治疗的受试者。
术语“治疗有效”是指所用的组合物的量具有足够的量以改善疾病或障碍的一种或多种病因或症状。这种改善只需要减少或改变，不一定是消除。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、变态反应或与合理的益/险比相称的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“载体”是指当与化合物或组合物组合时，根据其预期用途或目的而有助于或促进该化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其他特征的化合物、组合物、物质或结构。例如，可以选择载体以使活性成分的任何降解降至最低程度，并使受试者的任何不良副作用降至最低程度。
术语“来自受试者的样品”是指来自受试者的组织(例如组织活检)、器官、细胞(包括维持在培养中的细胞)、细胞溶解产物(或溶解产物部分)、来源于细胞或细胞物质的生物分子(例如多肽或核酸)或体液。体液的非限制性示例包括血液、尿液、血浆、血清、眼泪、淋巴液、胆汁、脑脊液、间质液、房水或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、渗出液、流出液和滑液。
术语“治疗”是指对患者进行的意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍的医疗管理。该术语包括积极治疗，即治疗特别指向疾病、病理状况或障碍的改善，并且还包括病因治疗，即治疗指向去除相关疾病、病理状况或障碍的病因。此外，该术语还包括姑息治疗，即为减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或障碍而设计的治疗；预防性治疗，即旨在尽量最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗；和支持治疗，即用于补充指向相关疾病、病理状况或障碍的改善的另一种特定疗法的治疗。
术语“小分子”是指分子量小于2,000道尔顿，更优选地小于1,500道尔顿、最优选地小于1,000道尔顿的分子，诸如有机或有机金属化合物。小分子可以是亲水性、疏水性或两亲性化合物。
术语“药物”是指可用于实现受试者的生理变化的化合物(或不同化合物的混合物)。如本文所用，药物包括小分子、多肽和核酸。
“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物(诸如本文所公开的拮抗剂和任选的化学治疗剂)递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。
术语“纳米颗粒”是指具有1至1000nm范围内的尺寸的溶解并稳定ITC的任何颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒具有在2至200nm的范围内、优选地在2至150nm的范围内、甚至更优选地2至100nm范围内的尺寸。本发明中使用的纳米颗粒包括纳米级材料诸如聚合物基纳米颗粒、脂质基纳米颗粒、乳液、水凝胶、胶束等。
纳米载体
本发明所公开的血小板膜包覆的纳米载体具有小于约5000nm的直径，诸如小于约4000nm、小于约3000nm、小于约2000nm、从约10nm至约2000nm、从约20nm至约2000nm、从约50nm至约2000nm、从约100nm至约2000nm、从约200nm至约2000nm、从约250nm至约2000nm、从约300nm至约2000nm、从约350nm至约2000nm、从约400nm至约2000nm、从约10nm至约1000nm、从约20nm至约1000nm、从约50nm至约1000nm、从约100nm至约1000nm、从约200nm至约1000nm、从约250nm至约1000nm、从约300nm至约1000nm、从约350nm至约1000nm、从约400nm至约1000nm、小于5000nm、小于4000nm、小于3000nm，小于2000nm、从10nm至2000nm、从20nm至2000nm、从50nm至2000nm、从100nm至2000nm、从200nm至2000nm、从250nm至2000nm、从300nm至2000nm、从350nm至2000nm、从400nm至2000nm、从10nm至1000nm、从20nm至1000nm、从50nm至1000nm、从100nm至1000nm、从200nm至1000nm、从250nm至1000nm、从300nm至1000nm、从350nm至1000nm、从400nm至1000nm等。颗粒的形状并不特别重要：球形颗粒是典型的。在使用非球形纳米颗粒的情况下，“直径”意指具有非球形纳米颗粒的相同体积的假想球体的直径。为了本发明的目的，当超过50％(例如，超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％等)具有特定直径或在特定的直径范围内的直径时，纳米颗粒的“大部分”被认为具有特定的直径或特定的直径范围。
Zeta电位是与纳米颗粒稳定性或在分散体中的聚集相关的另一个重要参数，并且可以对产品性能具有重大影响。本发明所公开的血小板膜包覆的纳米载体可以具有从-1mV至-40mV的平均zeta电位(表面电荷)，包括约-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39或-40mV。
本发明所公开的血小板膜包覆的纳米载体具有包含药物递送基质的内核以及包覆该内核的外壳血小板膜。
内核
内核可以是能够将治疗剂包封并递送至细胞的任何药物递送基质。例如，药物递送基质可以是聚合物凝胶颗粒、脂质颗粒或无机颗粒。在一些情况下，药物递送基质是可生物降解的。在一些情况下，药物递送基质对pH敏感。
可通过将溶解的血小板膜或合成膜组分与内核组合来使纳米载体与血小板膜组合。在一些实施方案中，组分可以在溶剂中组合。在某些实施方案中，使用亲水性内核。当使用疏水性内核时，可以用亲水性官能团使内核的外表面化学官能化以有利于用血小板膜包覆。在一些实施方案中，可以用亲水性基团使纳米载体官能化以有利于掺入血小板膜中。
聚合物凝胶颗粒
颗粒可以由一种或多种聚合物制成。在一些示例中，聚合物包括多元羧酸或其盐、羧酸酐(例如马来酸酐)与其他单体(例如(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物、亲水性乙烯基聚合物诸如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)，聚(乙烯吡咯烷酮-共-乙酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚己内酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)、纤维素衍生物诸如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等。在一个示例中，聚合物是50:50PLGA共聚物。在其他示例中，聚合物包括天然聚合物，诸如壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸盐、明胶、透明质酸和其无毒金属盐。在一些实施方案中，聚合物是水凝胶，例如海藻酸盐水凝胶。亲水性聚合物和其他载体可以单独或组合使用，并且可以通过部分结晶、离子键合、交联等赋予载体增强的结构完整性。
将药物包封成颗粒的方法在本领域中是已知的。常用的包封技术包括但不限于喷雾干燥、界面聚合、热熔胶囊化、相分离胶囊化(自发乳液微胶囊化、溶剂蒸发微胶囊化和溶剂去除微胶囊化)、凝聚、低温微球形成和相转化纳米胶囊化(PIN)。下面介绍这些方法的简要概述。
在某些实施方案中，掺入本文讨论的组合物中的纳米颗粒是多壁纳米颗粒。可用于本文所公开的组合物的多壁纳米颗粒可例如使用“有序相转化纳米胶囊化”(sPIN)来制备。
1.喷雾干燥
使用喷雾干燥技术形成微球/纳米球的方法描述于授予Mathiowitz等人的美国专利6,620,617中。在该方法中，聚合物溶于有机溶剂诸如二氯甲烷中或溶于水中。已知量的待掺入颗粒中的一种或多种活性剂在聚合物溶液中悬浮(在不溶性活性剂的情况下)或共溶解(在可溶性活性剂的情况下)。将溶液或分散体泵送通过由压缩气体流驱动的微粉化喷嘴，并且将所得到的气溶胶悬浮在加热的空气旋风分离器中，使得溶剂从微滴蒸发，形成颗粒。使用这种方法可以获得0.1至10微米范围内的微球/纳米球。
2.界面聚合
界面聚合也可用于包封一种或多种活性剂。使用该方法，将单体和活性剂溶解在溶剂中。将第二单体溶于与第一溶剂不混溶的第二溶剂(通常为水溶液)中。通过在第二溶液中搅拌，使第一溶液悬浮，形成了乳液。一旦乳液稳定，将引发剂加入到水相中，在每个乳液液滴的界面处引起界面聚合。
3.热熔微胶囊化
可以使用如Mathiowitz等人，Reactive Polymers,6:275(1987)中所述的热熔微胶囊化方法由聚合物诸如聚酯和聚酐形成微球。在该方法中，优选使用分子量在3至75,000道尔顿之间的聚合物。在该方法中，首先将聚合物熔化，然后与待掺入的已被筛分至小于50微米的一种或多种活性剂的固体颗粒混合。使混合物悬浮在不可混溶的溶剂(如硅油)中，并在连续搅拌下加热至高于聚合物熔点5℃。一旦乳液稳定后，将其冷却直到聚合物颗粒固化。通过用石油醚倾析来洗涤得到的微球，获得自由流动的粉末。
4.相分离微胶囊化
在相分离微胶囊化技术中，聚合物溶液被搅拌，任选地在一种或多种待包封的活性剂存在下进行。在通过搅拌继续使材料均匀悬浮的同时，将用于聚合物的非溶剂缓慢加入到溶液中以降低聚合物的溶解度。根据聚合物在溶剂和非溶剂中的溶解度，聚合物或者沉淀或者相分离成富聚合物相和贫聚合物相。在适当的条件下，富聚合物相中的聚合物将迁移到与连续相的界面，用聚合物外壳将活性剂包封在液滴中。
i.自发乳液微胶囊化
自发乳化涉及通过改变温度，蒸发溶剂或添加化学交联剂来固化上述形成的乳化液体聚合物液滴。包封剂的物理和化学性质以及任选地掺入新生颗粒中的一种或多种活性剂的性质决定了合适的包封方法。诸如疏水性、分子量、化学稳定性和热稳定性的因素影响着包封。
ii.溶剂蒸发微胶囊化
使用溶剂蒸发技术形成微球的方法在以下文献中有所描述：E.Mathiowitz等人，J.Scanning Microscopy，1990年第4期第329页；LR Beck等人，Fertil.Steril.，1979年第31期第545页；LR Beck等人，Am J Obstet Gynecol，1979年第135期第3页；S.Benita等人，J.Pharm.Sci.，1994年，第73期第1721页；以及授予Morishita等人的美国专利No.3,960,757。将聚合物溶于诸如二氯甲烷的挥发性有机溶剂中。任选地将一种或多种待掺入的活性剂加入到溶液中，并将混合物悬浮在含有表面活性剂(诸如聚(乙烯醇))的水溶液中。搅拌所得乳液直至大部分有机溶剂蒸发，留下固体微球/纳米球。该方法对于相对稳定的聚合物(诸如聚酯和聚苯乙烯)是有用的。然而，不稳定的聚合物(诸如聚酐类)在制造过程中可能因存在水而降解。对于这些聚合物，在完全无水的有机溶剂中进行的以下一些方法更为有用。
iii.溶剂去除微胶囊化
溶剂去除微胶囊化技术主要针对酸酐类而设计，并且在例如授予布朗大学研究基金会的WO 93/21906中有所描述。在该方法中，待掺入的物质分散或溶解于选定聚合物在挥发性有机溶剂(诸如二氯甲烷)中的溶液中。在有机油(诸如硅油)中搅拌该混合物，使之悬浮，从而形成乳液。通过该工序可以获得范围在1-300微米之间的微球。可以掺入微球中的物质包括药物、杀虫剂、营养素、显像剂和金属化合物。
5.凝聚
使用凝聚技术对各种物质进行包封的工序在本领域中是已知的，例如GB-B-929406、GB-B-929 40 1、和美国专利No.3,266,987、4,794,000和4,460,563中的工序。凝聚涉及将大分子溶液分成两个不混溶的液相。一个相是致密凝聚相，其含有高浓度的聚合物包封剂(和任选的一种或多种活性剂)，而第二相含有低浓度的聚合物。在致密凝聚相中，聚合物包封剂形成纳米级或微米级液滴。凝聚可以通过温度变化、添加非溶剂或添加微盐(简单凝聚)，或通过添加另一种聚合物从而形成互聚体复合物(复合凝聚)来诱导。
6.微球的低温铸造
用于受控释放微球的极低温铸造的方法在授予Gombotz等人的美国专利No.5,019,400中有所描述。在该方法中，将聚合物任选地与一种或多种溶解或分散的活性剂一起溶解在溶剂中。然后在低于聚合物物质溶液凝固点(使聚合物液滴冻结)的温度下，将该混合物雾化入含有液体非溶剂的容器中。随着聚合物液滴和非溶剂受到加热，液滴中的溶剂解冻并被提取到非溶剂中，导致微球硬化。
7.相转化纳米胶囊化(PIN)
也可以使用相转化纳米胶囊化(PIN)方法来形成纳米颗粒，其中将聚合物溶解在“良好”溶剂中，将待掺入物质(诸如药物)的细颗粒混合或溶解在聚合物溶液中，并将该混合物倒入用于聚合物的强非溶剂中，在有利条件下自发地产生聚合物微球，其中聚合物被颗粒包覆或者颗粒分散在聚合物中。参见，授予Mathiowitz等人的美国专利No.6,143,211。该方法可用于产生尺寸范围广泛的纳米颗粒和微粒的单分散群，包括例如约100纳米至约10微米。
有利的是，在沉淀之前不需要形成乳液。该方法可用于由热塑性聚合物形成微球。
8.有序相转化纳米胶囊化(sPIN)
多壁纳米颗粒也可以通过本文称为“有序相转化纳米胶囊化”(sPIN)的方法形成。sPIN特别适于形成纳米颗粒的单分散群，避免了需要额外的分离步骤来获得纳米颗粒的单分散群。
在sPIN中，核聚合物溶解在第一溶剂中。活性剂溶解或分散在核聚合物溶剂中。核聚合物、核聚合物溶剂和待包封的试剂形成具有连续相的混合物，其中核聚合物溶剂即为连续相。壳聚合物溶解在壳聚合物溶剂中，该壳聚合物溶剂是核聚合物的非溶剂。将核聚合物和壳聚合物的溶液混合在一起。由于壳聚合物溶剂的存在，使得核聚合物在其浊点处的溶解度降低，导致核聚合物发生优先相分离并且任选地导致试剂的包封。在将核聚合物和壳聚合物的非溶剂添加到这种不稳定的混合物中时，随着相转化完成，壳聚合物吞噬核聚合物，形成双壁纳米颗粒。
sPIN为制备多壁颗粒(诸如双壁纳米颗粒)提供了一步式工序，该工序几乎瞬间完成，并且不需要将溶剂乳化。Cho等人的美国专利公开No.2012-0009267中公开了用于形成多壁颗粒的方法。该专利的公开内容以引用的方式并入本文。
颗粒可以是树枝状体颗粒。树枝状体是一种三维聚合物，其通过将支化分子壳或支化分子层连续添加至中心核而生长。树枝状体具有超越线型聚合物的若干优点，这是因为它们具有可控的结构、具有单一分子量而不是分子量分布、具有大量可控的表面官能团，并且一旦达到一定尺寸就倾向于采用球状构象。它们通过将高度支化的单体在一起反应以产生单分散、树状和/或代结构型聚合结构来制备。单独的树枝状体由中央核心分子组成，每个功能位点附接有树枝状楔。根据制备过程中使用的组装单体，树枝状表层可以具有设置在其上的多种官能团。通常，树枝状体官能团决定了各个树枝状体类型的性质。因其设计的缘故，树枝状体核较为宽敞，通过改变核、壳、尤其是表层的化学性质，可以对其物理特性进行微调。可调性质包括溶解度、毒性、免疫原性和生物附着能力。
聚酰胺基胺、聚丙烯亚胺、聚芳醚和聚乙烯亚胺是已经研究用于生物制药应用的树枝状体的示例。聚酰胺基胺树枝状体基于乙二胺核以及酰胺基胺重复分支结构。它们能够以各种明确的分子量合成。其尺寸和表面官能度(伯胺)由单体单元的受控重复添加的数量限定，从而产生不同的半世代或全世代。其为水溶性的，据报道它们是唯一一种单分散的树枝状体。此外，它们表现出限制于分子表面的高电荷密度。
树枝状体已被用作治疗性化合物的载体，通过将药物包埋在树枝状体内的空腔中，或通过将药物分子共价连接到表面来使用。这在Svenson，S.，Eur J Pharm Biopharm，2009年第71期第445-462页和Cheng，Y.，J.Pharm.Sci.2007年第97期第123-143页中有所综述。包埋于树枝状体空腔内这一方式局限于小分子，并且共价连接方式方法迄今仅限于从树枝状体表面水解或酶促切割小药物的系统。
无机颗粒
通常，无机颗粒可以具有按总颗粒质量计至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的无机含量。示例性的无机材料包括例如，至少一种来自酸酐类的水难溶性无机材料，以及磷酸盐、硅酸盐、氧化物和氢氧化物的水合物。其中，可优选使用以下物质中的至少一种：氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、磷酸氢钙、二氧化硅、氢氧化铝、碳酸钙、硅酸钙和硅酸铝。无机颗粒可以是陶瓷材料、羟基磷灰石或生物活性玻璃。
脂质颗粒
药物递送基质颗粒也可以由脂质材料制成。脂质是指其中一部分分子是疏水性的、而另一部分是亲水性的分化型化合物。合适的脂质材料包括磷脂酰乙醇胺，诸如二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、神经节苷脂、lysoPC、PEG-脂质以及它们的混合物。
Bangham等人的原始脂质体制备(J.Mol.Biol.，1965年第13期第238-252页)涉及将磷脂悬浮在有机溶剂中，然后蒸发至干燥，在反应器上留下磷脂膜。接下来，加入适量的水相，使混合物“溶胀”，并且通过机械方式分散由多层囊泡(MLV)组成的所得脂质体。这种制备为Papahadjopoulos等人描述的小超声单层囊泡(Biochim.Biophys,Acta.，1967年第135期第624-638页)以及大单层囊泡的发展提供了基础。
用于产生大单层囊泡(LUV)的技术(诸如反相蒸发、输注工序和洗涤剂稀释)可用于生产脂质体。用于生产脂质体的这些方法和其它方法的综述可见于New York，MarcelDekker，Inc.，Marc Ostro编辑的“Liposomes”，1983，第1章，其相关部分以引用的方式并入本文。也参见Szoka,Jr.等人的文献(1980年，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，第9期第467页)，其相关部分也以引用的方式并入本文。
用于制备囊泡的其他技术包括形成反相蒸发囊泡(REV)的那些技术，如Papahadjopoulos等人的美国专利No.4,235,871所述。可以使用的另一类脂质体的特征在于具有基本等同的层状溶质分布。这类脂质体被命名为稳定的多层囊泡(SPLV)，如授予Lenk等人的美国专利No.4,522,803所定义的那样，并且包括如授予Fountain等人的美国专利No.4,588,578中所述的单相囊泡，以及如上所述的冷冻和解冻的多层囊泡(FATMLV)。
多种甾醇及其水溶性衍生物(诸如胆固醇半琥珀酸酯)已用于形成脂质体；具体参见Janoff等人1988年1月26日公布的名称为“Steroidal Liposomes”的美国专利No.4,721,612。Mayhew等人1985年3月14日公开的PCT专利公开No.WO 85/00968描述了一种通过将药物包封在包含α-生育酚及其某些衍生物的脂质体中来降低药物毒性的方法。同样，人们已经使用多种生育酚及其水溶性衍生物来形成脂质体，参见Janoff等人1987年4月23日公布的名称为“Alpha Tocopherol-Based Vesicles”的PCT专利公开No.87/02219。
在脂质体药物递送体系中，生物活性剂(诸如药物)被包埋在脂质体中，然后施用于待治疗的患者。例如，参见Rahman等人的美国专利No.3,993,754；Sears的美国专利No.4,145,410；Paphadjopoulos等人的美国专利No.4,235,871；Schneider的美国专利No.4,224,179；Lenk等人的美国专利No.4,522,803；和Fountain等人的美国专利No.4,588,578。作为另外一种选择，如果生物活性剂是亲脂性的，则它可能与脂质双分子层结合。
基于脂质的颗粒也可以是非脂质体形式。将疏水性药物掺入非脂质体脂质颗粒中通常比掺入脂质体形式的颗粒中更为容易，非脂质体脂质复合物由如下手段来表征，例如：(1)冷冻断裂电子显微照片(Deamer等人，Biochim.Biophys.Acta，1970年第219期第47-60页)，其证明物质为非脂质体复合物；(2)捕获的体积测量值(Deamer等人，Chem.Phys.Lipids，1986年第40期第167-188页)，其证明截留体积基本上为零，因此是非脂质体；(3)差示扫描量热法(DSC)(Chapman，D.，于Gregoriadis,G.编辑的“LiposomeTechnology”1984年，CRC Press，Boca Raton)，其显示了无脂质双分子层预过渡期或主要转变；(4)31P-NMR谱图(Cullis等人，于“Membrane Fluidity in Biology”，1982年，Academic Press,Inc.,London&N.Y.)，其表现出高固定化脂质(广泛的各向同性)的特征；以及(5)X射线衍射数据(Shipley等人，于Chapman,D.和Wallach,D.编辑的“Biomembranes”，1973年，第2卷第1期，Academic Press,Inc.,London&N.Y.)，其指示了凝胶相脂质。这些体系的特征还在于药物与脂质的完全缔合，如密度梯度离心法所证实的那样。在该技术中，梯度样在升高的力(约230000×g)下离心约24小时。这确保了梯度样中的所有组分均达到它们的平衡密度位置。这些体系的洗脱曲线显示出重叠的药物峰和脂质峰，这表明所有药物都与脂质相联。
外壳血小板膜
外壳血小板膜可以是包含能够与癌细胞相互作用的血小板蛋白的天然或合成膜。在一些情况下，血小板膜是通过溶解血小板诸如来自待治疗的受试者的自体血小板而产生的。在其他情况下，外壳是合成膜诸如脂质体，其被设计成含有能够与癌细胞相互作用的血小板蛋白。例如，外壳血小板膜可以包含P-选择素蛋白。壳血小板膜可以包含整合素αIIbβ3。壳血小板膜可以包含选自CD47、CD55和CD59的自我识别的免疫调节蛋白。
异源细胞外活性蛋白质
无论是天然的还是合成的，外壳血小板膜都可以被设计成包含至少一种异源的细胞外活性蛋白。这种细胞外活性蛋白可以是在与癌细胞接触时具有治疗效果的任何天然或合成的蛋白。例如，该细胞外活性蛋白可以是肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，其可以结合肿瘤细胞上的DR4和DR5死亡受体并诱导细胞凋亡。又如，细胞外活性蛋白可以是治疗性抗体，诸如西妥昔单抗、曲妥单抗或它们的组合。
细胞内活性药物
药物递送基质可以用于包封从靶细胞内的内核释放的细胞内活性药物。该药物可以是在细胞内具有治疗活性的任何类型的分子，诸如蛋白质、核酸(miRNA，RNAi，dsDNA等)或小分子化合物。药物递送基质可以基于待包封的期望的细胞内活性药物来选择。因此，细胞内活性药物可以是亲水的或疏水的。
抗癌药物
在一些实施方案中，细胞内活性药物是亲水性或疏水性抗肿瘤药物。例如，该药物可选自乙酸阿比特龙酯、Abitrexate(甲氨蝶呤)、Abraxane(白蛋白稳定化紫杉醇纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、Adcetris(色瑞替尼)、ADE、Ado-TrastuzumabEmtansine、Adriamycin(盐酸阿霉素)、Adrucil(氟尿嘧啶)、马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、阿仑单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥)、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿可达(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(阿那曲唑)、Aromasin(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(Ofatumumab)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)天冬酰胺酶、安维汀(贝伐单抗)、阿昔替尼、阿扎胞苷、BEACOPP、Becenum(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝伐单抗、贝沙罗汀、百克沙(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、Blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、Bosulif(博舒替尼)、博舒替尼、Brentuximab Vedotin、白消安、白舒非(白消安)、卡巴他赛、卡博替尼-S-苹果酸盐、CAF、Campath(阿仑单抗)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、卡铂、卡铂-紫杉醇、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入膜剂、康士得(比卡鲁胺)、CeeNU(洛莫司汀)、色瑞替尼、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、希瑞适(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP、顺铂、Clafen(环磷酰胺)、克罗拉滨、Clofarex(克罗拉滨)、Clolar(克罗拉滨)、CMF、Cometriq(卡博替尼-S-苹果酸盐)、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(放线菌素D)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、癌得星(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达珂(地西他滨)、放线菌素D、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素-2、狄诺塞麦、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、DepoFoam(阿糖胞苷脂质体)、盐酸右雷佐生、Dinutuximab、多西他赛、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、Efudex(氟尿嘧啶)、Elitek(拉布立酶)、Ellence(盐酸表阿霉素)、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕乙醇胺、Emend(阿瑞匹坦)、恩杂鲁胺、盐酸表阿霉素、EPOCH、尔必得舒(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、维莫德吉(Vismodegib)、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(菊欧文氏菌天冬酰胺酶)、凡毕复(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、易维特(盐酸雷洛昔芬)、依西美坦、Fareston(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、弗隆(来曲唑)、非格司亭、氟达拉滨(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、奥沙利铂、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(Obinutuzumab)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗、健择(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入膜剂)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入膜剂)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、赫赛汀(曲妥单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸拓扑替康)、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗、依鲁替尼、ICE、Iclusig(盐酸普纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、咪喹莫特、Inlyta(阿西替尼)、重组干扰素Alfa-2b、Intron A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、易普利姆玛、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索利替尼)、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(Ado-Trastuzumab Emtansine)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、健痊得(Pembrolizumab)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、Levulan(氨基乙酰丙酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、阿糖胞苷脂质体、洛莫司汀、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-3Month(醋酸亮丙瑞林)、LupronDepot-4Month(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸甲基苄肼)、盐酸氮芥、Megace(醋酸甲地孕酮)、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、巯嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、马利兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥单抗)、纳米颗粒紫杉醇(白蛋白稳定化紫杉醇纳米颗粒制剂)、Navelbine(酒石酸长春瑞滨)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、尼罗替尼、Nivolumab、三苯氧胺(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、Obinutuzumab、Odomzo(Sonidegib)、OEPA、Ofatumumab、OFF、奥拉帕尼、高三尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Ontak(地尼白介素-2)、Opdivo(Nivolumab)、OPPA、奥沙利铂、紫杉醇、白蛋白稳定化紫杉醇纳米颗粒制剂、PAD、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、盐酸培唑帕尼、培门冬酶、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、PEG-Intron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、Pembrolizumab、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、顺氯氨铂(顺铂)、顺氯氨铂-AQ(顺铂)、Plerixafor、Pomalidomide、Pomalyst(Pomalidomide)、盐酸普纳替尼、Pralatrexate、泼尼松、盐酸甲基苄肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(狄诺塞麦)、Promacta(艾曲波帕乙醇胺)、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯嘌呤)、Purixan(巯嘌呤)、镭223二氯、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、瑞戈非尼、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、美罗华(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、Romidepsin、Romiplostim、红比霉素(盐酸柔红霉素)、磷酸鲁索利替尼、Sclerosol Intrapleural Aerosol(Talc)、Siltuximab、Sipuleucel-T、Somatuline Depot(醋酸兰瑞肽)、Sonidegib、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌Talc粉末(Talc)、Steritalc(Talc)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、Sylvant(Siltuximab)、Synovir(沙利度胺)、Synribo(高三尖杉酯碱)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、Talc、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼罗替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、西罗莫司脂化物、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、噻替哌、Toposar(依托泊苷)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(西罗莫司脂化物)、托西莫单抗和碘131托西莫单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲美替尼、曲妥单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(Dinutuximab)、Vandetanib、VAMP、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维罗非尼、VePesid(依托泊苷)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、Vismodegib、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Wellcovorin(亚叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(狄诺塞麦)、Xofigo(镭223二氯)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yervoy(易普利姆玛)、Zaltrap(Ziv-阿柏西普)、Zelboraf(维罗非尼)、Zevalin(Ibritumomab Tiuxetan)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)以及Zytiga(乙酸阿比特龙酯)。
血管疾病药物
在一些实施方案中，本公开的纳米载体可靶向到受损的血管内皮以用于治疗剂的位点选择性递送，用于凝血或冠状动脉再狭窄。例如，在一些情况下，细胞内活性药物可选自Adcirca(他达拉非)、Adempas(利奥西呱)、Agrylin(盐酸阿那格雷)、Angiomax(比伐努定)、Atacand(坎地沙坦酯)、Atryn(重建用重组抗凝血酶冻干粉末)、Azor(苯磺酸氨氯地平；奥美沙坦酯)、Baycol(辛伐他汀钠)、BiDil(硝酸异山梨酯/盐酸肼屈嗪)、倍林达(替格瑞洛)、Caduet(氨氯地平/阿托伐他汀)、甲巯丙脯酸、Cardizem(R)(注射用盐酸地尔硫卓)Monvial(R)、CellCept、Cleviprex(clevidipine)、Corlanor(伊伐布雷定)、Corlopam、Corvert注射液(富马酸伊布利特注射液)、Covera-HS(维拉帕米)、Crestor(瑞舒伐他汀钙)、盐酸地尔硫卓、代文(缬沙坦)、阿霉素、DynaCirc CR、Edarbi(阿齐沙坦酯)、Edarbyclor(阿齐沙坦酯和氯噻酮)、Efient(普拉格雷)、Eliquis(阿哌沙班)、Entresto(sacubitril和缬沙坦)、Epanova(ω-3羧酸)、非诺贝特、肝素、Innohep(tinzaparinsodium)注射剂、Integrilin、Juxtapid(lomitapide)、Kengreal(cangrelor)、Kynamro(mipomersen sodium)、Lescol(普伐他汀钠)、Lescol(普伐他汀钠)胶囊、Rx、Letairis(安倍生坦)、Levitra(伐地那非)、Lexxel(马来酸依那普利-非洛地平ER)、Lipitor(阿托伐他汀钙)、Liptruzet(依泽替米贝和阿托伐他汀)、Livalo(匹伐他汀)、Mavik(trandolapril)、Micardis(替米沙坦)、Micardis HCT(替米沙坦和氢氯噻嗪)、Microzide(氢氯噻嗪)、Multaq(决奈达隆)、Natrecor(nesiritide)、Niaspan、Normiflo、Nymalize(尼莫地平)、Opsumit(macitentan)、己酮可可碱、Pindolol、Plavix(硫酸氢氯吡格雷)、Plavix(硫酸氢氯吡格雷)、Posicor、Pradaxa(dabigatran etexilate mesylate)、Pravachol(普伐他汀钠)、Pravachol(普伐他汀钠)、Prestalia(培哚普利精氨酸和苯磺酸氨氯地平)、Prinivil或Zestril(赖诺普利)、ProAmatine(米多君)、Ranexa(ranolazine)、Remodulin(曲前列环素)、ReoPro、REPRONEX(注射用尿促性素，USP)、Retavase(瑞替普酶)、普罗帕酮、Savaysa(edoxaban)、Soliris(eculizumab)、Teczem(马来酸依那普利/苹果酸地尔硫
Figure BDA0001612703930000201
)、Tekamlo(aliskiren+氨氯地平)、Tekturna(aliskiren)、Teveten(eprosartan mesylate+氢氯噻嗪)、Teveten(eprosartan mesylate)、Tiazac(盐酸地尔硫卓)、Tiazac(盐酸地尔硫卓)、Tiazac(盐酸地尔硫卓)、Toprol-XL(琥珀酸美托洛尔)、Tribenzor(奥美沙坦酯+氨氯地平+氢氯噻嗪)、Tricor(非诺贝特)、Trilipix(非诺贝酸)、Tyvaso(曲前列环素)、Varithena(聚多卡醇注射用泡沫剂)、Vascepa(二十碳五烯酸乙酯)、Visipaque(碘克沙醇)、Xarelto(利伐沙班)、Xarelto(利伐沙班)、Zocor、Zontivity(vorapaxar)
药物组合物
本发明公开了含有治疗有效量的一种或多种已公开纳米载体和药学上可接受的载体的药物组合物。适于施用本文提供的化合物的药物载体包括本领域技术人员已知适合于特定施用模式的任何此类载体。
另外，化合物还可被配制为组合物中唯一的药物活性成分，或者可以与其他活性成分组合。例如，化合物可与已知的NSAID、抗炎化合物、类固醇和/或抗生素一起配制或组合。
方法
本发明还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法涉及向所述受试者施用本文所公开的血小板膜包覆的纳米载体。在一些情况下，血小板膜是自体的，即由从受试者获得的血小板产生。
在一些情况下，该方法可用于治疗过表达CD44的任何癌症。因此，在一些情况下，该方法进一步涉及测定来自受试者的样品的CD44表达，并且如果检测到升高的CD44水平，则用本发明公开的血小板膜包覆的纳米载体治疗受试者。
癌症可能是实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可起源于膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。在某些实施方案中，癌症是卵巢癌。在特定方面，癌症可能是抗化疗癌症。在一些情况下，癌症是一种循环癌细胞。
癌症可能特别是以下组织学类型，但不限于以下这些：赘生物，恶性；恶性上皮细胞肿瘤；恶性上皮细胞肿瘤，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体肿瘤；类癌肿瘤，恶性；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包围性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；顶浆分泌腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；伴随鳞状化生的腺癌；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；男性细胞瘤，恶性；塞尔托利氏细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；肾小球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维性组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；子宫中胚叶混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦内罗氏瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞性牙骨肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始性神经外胚层肿瘤；小脑肉瘤；节细胞性神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
本发明还公开了一种用于治疗受试者的血管疾病的方法，该方法涉及向受试者施用本文所公开的血小板膜包覆的纳米载体。在这些实施方案中，药物递送基质包封药物以治疗血管疾病，例如凝血或冠状动脉再狭窄。例如，药物可以是肝素或阿霉素。
施用
本发明所公开的药物组合物可以静脉内、皮内、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸腔内、气管内、玻璃体内、阴道内、直肠内、瘤内、肌内、腹腔内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、鞘内、局部、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、经由导管或经由灌洗来施用。例如，该组合物可通过注射或输注来施用。
在一些实施方案中，药物组合物通过将该组合物注射到肿瘤位点附近而进行非肠道给药。如本文所用，“肿瘤位点附近”意指将组合物局部靶向并递送至肿瘤位点，并且意在包括直接注射到肿瘤中以及注射到距肿瘤约1cm(例如，在1cm内、在约5mm内、在5mm内、在约2mm内、在2mm内等)的范围内。药物组合物可以例如经由单次注射或经由多次注射来施用，例如在通过将药物组合物注射到肿瘤中和肿瘤边缘周围的方式来施用药物组合物的情况下。在一些实施方案中，如在静脉内施用药物组合物的情况下，例如通过将组合物注射到受试者的循环系统中，向受试者全身性施用药物组合物。在一些实施方案中，将药物组合物肠内施用，例如以灌注胃肠道中的肿瘤。
为了拥有更好的治疗益处，组合物可以与选自放射治疗剂、激素治疗剂、免疫治疗剂、化学治疗剂、冷冻治疗剂和基因治疗剂的至少一种另外的试剂组合施用。
为实现安全和有效的剂量，可将组合物以约1至约200mg/kg体重、约1至约100mg/kg体重、1至约50mg/kg体重、约1至约20mg/kg体重、约3至约10mg/kg体重、约3至约6mg/kg体重或可衍生自其中的任何范围的剂量施用给受试者。
试剂盒
本发明还公开了一种用于制备本发明所公开的纳米载体的试剂盒。由于纳米载体可以由自体血小板产生，因此该试剂盒可包括用于从来自受试者的血液样品中提取血小板膜的试剂。合适试剂的示例包括裂解缓冲液、ACD缓冲液(酸-柠檬酸盐-葡萄糖)、CPD缓冲液(柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖)、血小板洗涤缓冲液(10mM柠檬酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA、1％(w/v)葡萄糖，pH 7.4)、HEPES缓冲液、Tyrode's缓冲液、PBS缓冲液或它们的任何组合。该试剂盒还可包括载有药物的内核颗粒。或者，该试剂盒可包括用于制备这些颗粒的试剂。该试剂盒还可包括用于使用从受试者分离的血小板膜包覆内核颗粒的试剂。合适试剂的示例包括二甲基丙烯酸甘油酯、阴离子1,4-双-2-乙基己基磺基琥珀酸钠(AOT)、聚(乙二醇)十二烷基醚(Brij-30)、过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺(TMEDA)、Traut’s试剂、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)溶液、乙醇或它们的任何组合。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地，其他实施方案在以下权利要求的范围内。
实施例
实施例1：抗癌血小板膜包覆的纳米载体
方法
分离血小板。通过梯度离心从全血中分离血小板(Donovan LE等人(2013年)，Alzheimers Res Ther，第5卷第32期，第10.1186页)。简单来讲，将10mL小鼠全血以100×g离心20分钟，不进行制动。之后，向上清液中加入PGE1至最终浓度为1μM，并以800×g离心20分钟。用柠檬酸盐缓冲液洗涤血小板并重复离心。为了评估分离的血小板的纯度，在使用抗血小板特异性标记物CD41和白细胞标记物CD45的抗体双重标记后进行流式细胞术分析。
制备PM-NV。使用单一乳液法制备包封有Dox的NV。简单来讲，将含有46mg丙烯酰胺(AAm)、2mg N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APMAAm)和16mg二甲基丙烯酸甘油酯(GDA)的500μL水相加入含有己烷(5mL)和两种表面活性剂的混合物的有机相中：1,4-双-2-乙基己基磺基琥珀酸钠(AOT，178mg)、聚(乙二醇)十二烷基醚(Brij-30，344mg)和过硫酸铵(APS)。搅拌10分钟后，向混合物中加入四甲基乙二胺(TMEDA)以引发聚合并保持2小时。然后，在蒸发己烷后，沉淀NV并用乙醇洗涤。通过用不可降解的N,N’-亚甲基-双丙烯酰胺(MBA)替代可降解的交联剂GDA，制成不可降解的NV。
为了获得纯化的血小板膜，将得到的血小板加入裂解缓冲液中并保持30分钟。之后，将混合物以18,000×g离心10分钟。超声处理后，将得到的PM和Dox-NV混合物搅拌并保持过夜。为了在PM表面上修饰TRAIL，首先将PM与Traut’s试剂反应以生成另外的硫醇基团，该试剂通过磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)进一步与TRAIL的胺连接。为了获得PM上TRAIL的量，将TRAIL与FITC-NHS或Cy5.5-NHS反应过夜，并通过使用G-25柱(PD midiTRAPTM，GE医疗公司(GE Healthcare))进行纯化。通过经由酶标仪(Infinite M200PRO，帝肯公司(Tecan))测量FITC/Cy5.5的荧光强度，确定TRAIL的量。通过在200kV下运行的Zetasizer(Nano ZS，马尔文公司(Malvern))和透射电子显微镜(TEM)(JEM-2000FX，日立公司(Hitachi))表征TRAILDox-PM-NV。
PM-NV的体外稳定性和从PM-NV释放的Dox。为了分析PM-NV的体外稳定性，将PM-NV和NV加入100％FBS(Hyclone公司)中。使用酶标仪以预定时间间隔获取60nm处的吸光度测量值。为了分析体外Dox释放，将0.5mL Dox-PMNV和Dox-NV加入内嵌在14mL不同pH的PBS缓冲溶液(含有0.1％Tween-80)中的透析管(10KMWCO)(Slide-A-Lyzer，赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))中，并于37℃下在振荡器(New Brunswick Scientific公司)中以100rpm轻轻振荡。在预定的时间间隔处，取出全部缓冲溶液，随后用14mL具有相同pH的新鲜缓冲溶液替代。通过酶标仪，以480nm的激发波长，在596nm处测量释放的Dox的荧光强度。
细胞培养。从UNC Lineberger综合癌症中心的组织培养设施获得MDA-MB-231细胞和Raw 264.7，并在含10％(v:v)FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco's改良伊格尔培养基(DMEM)中培养。
TRAIL和Dox的位点特异性递送。将MDA-MB-231细胞(1×105个细胞/孔)接种在共聚焦显微镜皿(MatTek公司)中。培养24小时后，将细胞与TRAIL-PMNV和TRAIL-NV一起温育2小时。之后，用PBS洗涤细胞，然后用Alexa Fluor 488标记的小麦胚芽凝集素(WGA)染色10分钟。用PBS洗涤两次后，立即对细胞进行CLSM(LSM 710，蔡司公司(Zeiss))观察。为了进行细胞内Dox观察，将MDA-MB-231细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在共焦显微镜皿中。24小时后，将细胞暴露于Dox-PM-NV。温育1小时和4小时后，用PBS洗涤细胞，再用溶酶体示踪剂和Hoechst染色，并通过CLSM观察。
PM-NV的体内靶向能力。根据北卡罗来纳大学教堂山分校和北卡罗来纳州立大学的动物管理和使用委员会(IACUC)批准的实验动物护理和使用指南，对所有动物进行处理。为了建立荷MDA-MB-231瘤小鼠模型，为雌性裸鼠(6周龄，J:NU，美国杰克逊实验室(TheJackson Laboratory))皮下植入在100μL盐水中的1×107个MDA-MB-231细胞。当肿瘤体积达到400-600mm3时，为小鼠静脉内注射Cy5.5标记的TRAIL-Dox-NV和Cy5.5标记的TRAIL-Dox-PM-NV，Cy5.5剂量为20nmol/kg。在注射后6、12、24和48小时，在IVIS Lumina成像系统(美国Caliper公司)上采集小鼠图像。之后，在注射后48小时，对小鼠执行安乐死。收集肿瘤和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)，并进行离体成像。利用Living Image软件分析感兴趣区域(ROI)的荧光强度。对于肿瘤位点处的Dox分布，经由尾静脉将Dox-NV和Dox-PM-NV静脉内注射到荷MDA-MB-231瘤小鼠中，Dox剂量为2mg/kg。然后对小鼠执行安乐死，在注射后3小时，取出肿瘤进行冷冻切片。使用Hoechst 33342进行核染色。通过荧光显微镜观察染色的肿瘤载玻片。
体内抗肿瘤效力测定。当肿瘤体积达到60mm3时，对25只荷瘤小鼠称重，并随机分成5组(n＝5)。从第0天起，每隔一天为小鼠静脉内注射一次TRAIL-Dox-NV(TRAIL：1mg/kg，Dox：2mg/kg)、TRAIL-PM-NV、Dox-PM-NV、TRAIL-Dox-PM-NV和盐水(作为对照)，持续12天。每两天测量一次肿瘤大小和体重。在第16天，收集肿瘤和器官，用PBS洗涤三次并固定以便进一步切片。对于苏木精和伊红(H&E)染色，通过光学显微镜(DM5500B，徕卡公司(Leica))观察肿瘤和器官的载玻片。对于TUNEL细胞凋亡测定，根据制造商的方案，通过原位细胞死亡检测试剂盒(Roche Applied Science公司)对固定的肿瘤切片染色，并通过荧光显微镜观察。
体内消除CTC。使用异氟烷麻醉小鼠，随后经由尾静脉以15μg/mL的TRAIL浓度静脉内注射盐水、TRAIL-Dox-NV和TRAIL-Dox-PM-NV。30分钟后，经由尾静脉为小鼠静脉内注射在100μL盐水中的1×107个MDA-MB-231细胞。之后，用墨汁对小鼠的肺组织进行染色，并在注射后8周取出进行成像和染色。对于苏木精和伊红染色，通过光学显微镜观察肺载玻片。
材料。所有化学品均购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，并按原样使用。异硫氰酸荧光素(FITC)-NHS、罗丹明-NHS和Cy5.5-NHS购自美国纽约州的生命科技公司(Life Technologies(Grand Island,NY,USA))。二甲基丙烯酸甘油酯购自日本东京的Tokyo Chemical Industry有限公司(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(Tokyo,Japan))。
内吞途径测定。将MDA-MB-231细胞(1×105个细胞/孔)接种在6孔板中并培养24小时。为了研究内吞途径，将细胞与各种类型的内吞抑制剂(包括网格蛋白介导的内吞作用：蔗糖(SUC，450mM)(Mo R等人(2012年)，Advanced Materials，第24卷第27期，第3659-3665页)和氯丙嗪(CPZ，10μM)(Zhang X-X等人(2011年)，Molecular pharmaceutics，第8卷第3期，第758-766页)；小窝蛋白介导的内吞作用的抑制剂：制霉菌素(NYS，25μg/mL)(urRehman Z等人(2011年)，Journal of Controlled Release，第156卷第1期，第76-84页)；微胞饮抑制剂：阿米洛利(AMI，1mM)(Koivusalo M等人(2010年)，The Journal of cellbiology，第188卷第4期，第547-563页)；脂筏抑制剂：甲基-β-环糊精(MCD，3mM)(Chiu YL等人(2010年)，Journal of Controlled Release，第146卷第1期，第152-159页))分别在37℃预先温育1小时。之后，在抑制剂存在的情况下，将细胞与Dox-PM-NV以200ng/mL的Dox浓度再温育2小时。用PBS洗涤细胞两次后，经由流式细胞术测量细胞中Dox的荧光强度。
通过Raw 264.7细胞评估Dox-PM-NG吸收。将Raw 264.7细胞(1×10 5个细胞/孔)接种在6孔板中并培养24小时。之后，向细胞中加入Dox-NV和Dox-PM-NV并温育2小时。然后用PBS洗涤细胞并进行荧光显微镜观察。为进行定量分析，对细胞执行流式细胞术分析以进行荧光信号定量。
细胞凋亡测定。分别使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences公司)和APO-BrdU TUNEL测定试剂盒(生命科技公司(Life Technologies))检测MDA-MB-231细胞的凋亡。将细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中。培养48小时后，将细胞与无药物DMEM、TRAIL-Dox-NV、TRAIL-PM-NV、Dox-PM-NV和TRAIL-Dox-PM-NV一起温育12小时。后续工序根据制造商方案执行。对于Annexin V-FITC细胞凋亡检测，通过流式细胞术(BD FACSCalibur)分析细胞。而对于TUNEL测定，通过荧光显微镜(IX71，奥林巴斯(Olympus))观察细胞。
体外细胞毒性。将MDA-MB-231细胞(5×103个细胞/孔)接种在96孔板中。24小时后，用不同TRAIL/Dox浓度的TRAIL-Dox-NV、TRAIL-PM-NV、Dox-PM-NV和TRAIL-Dox-PMNV处理细胞并温育24小时。然后向细胞中加入20μL MTT溶液(5mg/mL)。温育4小时后，用150μL二甲基亚砜(DMSO)替代培养基。通过酶标仪在570nm波长处测量吸光度。
体内药代动力学研究。使用Sprague-Dawley(SD)大鼠(200±20g)研究Dox-NV和Dox-PM-NV的体内药代动力学。将6只SD大鼠随机分成两组(n＝3)。经由尾静脉以5mg/kg的Dox剂量向大鼠静脉内注射Dox-NV和Dox-PM-NV。在预定的时间间隔(0.25、0.5、1、3、6、12、24和48小时)处，收集血液样品并以800g离心10分钟。然后通过测量Dox的荧光强度，分析上清液。
统计。呈现的所有结果均为平均值±标准偏差。采用Student's t检验进行统计分析。当p值<0.05时，实验组与对照组之间的差异被认为具有统计学意义。
结果
血小板膜包覆的纳米载体(TRAIL-Dox-PM-NV)的制备和表征。为了制备TRAIL-Dox-PM-NV，通过梯度离心收集纯化的血小板(Qureshi AH等人(2009年)，PLoS One，第4卷第10期，第e7627页；Donovan LE等人(2013年)，Alzheimers Res Ther，第5卷第32期，第10.1186页)。通过荧光激活细胞分选(FACS)研究，通过用抗血小板特异性标记物CD41(Boilard E等人(2010年)，Science，第327卷第5965卷，第580-583页)和白血细胞(WBC)标记物CD45(Aicher A等人(2003年)，Nat Med.，第9卷第11期，第1370-1376页)的抗体进行标记，以验证所得到的血小板。观察到与CD41相关的强荧光信号，几乎观察不到与CD45相关的信号(图7)，表明分离的血小板是高度纯化的并且未被WBC污染。经由在NV的表面上包覆纯化的血小板膜，制备PM-NV。通过动态光散射(DLS)表征，所得到的单分散NV具有105nm的粒度和-2.0mV的ζ电位(图8)。用PM包覆后，所得的PM-NV表现为核-壳结构，平均直径为120.9nm，ζ电位为-21.3mV(图2A)。尺寸增大和表面电荷减少表明NV的表面上存在PM(FangRH等人(2014年)，Nano letters，第14卷第4期，第2181-2188页)(图2B)。此外，通过对FITC标记的PM和罗丹明标记的NV的共定位，进一步证实了PM的成功包覆(图9)。为了研究PM-NV的稳定性，通过吸光度法监测NV和PM-NV的尺寸变化(Popielarski SR等人(2005年)，Bioconjug Chem.，第16卷第5期，第1063-1070页；Fang RH等人(2010年)，Langmuir，第26卷第22期，第16958-16962页)。在560nm处测量的吸光度值表明，与NV相比，PM-NV的血清稳定性更高(图2c)。
为了表征来自PM-NV的Dox的pH响应性释放行为，使用不可降解的交联剂亚甲基双(丙烯酰胺)(Cohen JA等人(2008年)，Bioconjug Chem.，第20卷第1期，第111-119页)替代二甲基丙烯酸甘油酯(GDA)，以制备不可降解的NV作为对照。分别在pH 5.4和7.4监测可降解和不可降解的PM-NV的Dox体外释放曲线。仅约23％的Dox在6小时内从可降解的和不可降解的PM-NV两者中释放，并且大约65％的Dox在pH 7.4下在48小时内被释放。相比之下，可降解PM-NV在pH 5.4下显示出比不可降解PM-NV高得多的累计Dox释放。超过40％的TRAIL在前6小时内从可降解PM-NV释放，约88％的Dox在48小时内释放(图2d)。此外，同样值得注意的是，PM的包覆可以降低Dox的释放速率，表明PM可以抑制NV的药物突释。总而言之，结果证明酸性环境加速了PM-NV的解离和包封Dox的随后释放。
通过PM-NV对TRAIL和Dox进行位点特异性递送。为了研究PM-NV对TRAIL和Dox的递送效力，将人乳腺癌(MDA-MB-231)细胞(Sheridan C等人(2006年)，Breast Cancer Res，第8卷第5期，第R59页)与NV和PM-NV一起温育2小时，随后通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行观察。记录通过NV和PM-NV递送的TRAIL分布的明显差异。如图3A所示，罗丹明标记的PM-NV的分布位于细胞膜和细胞质上。相比之下，所有罗丹明标记的非包覆NV都存在于细胞质中，表明NV表面上的直接修饰的TRAIL可以容易地转运到细胞中。由PM-NV介导的TRAIL向质膜的有效递送可归因于血小板和癌细胞的选择性亲和力。在血小板的表面上过表达的P-选择素蛋白可以特异性地结合至CD44，其是癌细胞膜上的上调受体。总而言之，血小板与癌细胞之间的选择性结合相互作用导致TRAIL的有效细胞外递送，随后触发后面的外源性细胞凋亡途径。
接下来，使用CLSM评估通过PM-NV进行的Dox细胞内递送。已证实PM-NV经由网格蛋白依赖性内吞作用并参与脂筏，而被MDA-MB-231细胞内化(图10)。如图3C所示，通过温育1小时后的重叠黄色荧光可见，在用绿色荧光标记的内吞溶酶体中发现大部分内化PM-NV。相比之下，通过温育4小时后的重叠品红荧光证明，大量内吞的PM-NVs定位于用蓝色荧光染色的细胞核中。Dox在细胞核中累积增加，表明Dox的有效细胞核递送是由酸性内吞溶酶体中的GDA基质的解离导致。此外，Dox-PM-NV在Raw 264.7细胞上的吸收效率显著低于Dox-NV的吸收效率，表明PM上存在的“自我识别”蛋白能够抑制巨噬细胞的摄取，这是造成体内药物递送系统(DDS)快速清除的主要原因(图11)。
进一步使用末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定法(Mo R等人(2014年)，Nat Commun.第5卷，第3364页)和Annexin-V/PI双染色测定法(Hu Q等人(2013年)，Biomaterials，第34卷第4期，第1135-1145页)证实PM-NV的协同性细胞凋亡诱导能力。与TRAIL-Dox-NV相比，TRAIL-Dox-PM-NV显示出更强的绿色荧光，表明凋亡DNA片段增加(图3B)。此外，流式细胞术定量结果显示，与TRAIL-Dox-PM-NV一起温育12小时后，MDAMB-231细胞的早期和晚期凋亡率分别为31.8％和12.3％，显著高于TRAIL-Dox-NV的22.0％和0.4％、Dox-PM-NV的17.4％和4.4％以及TRAIL-PM-NV的12.6％和5.6％(图3D)。
通过使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)测定来评估TRAIL-Dox-PM-NV对MDA-MB-231细胞的体外细胞毒性(Mo R等人(2014年)，Nat Commun.第5卷，第3364页)。在研究的所有TRAIL和Dox浓度下，与TRAIL-Dox-NV、TRAIL-PM-NV和Dox-PM-NV相比，TRAIL-Dox-PM-NV表现出显著增强的细胞毒性(图3E)。值得注意的是，TRAIL-Dox-PM-NV表现出增加的细胞毒性，降低的IC50值分别为20ng/mL(TRAIL浓度)和193ng/mL(Dox浓度)，比TRAIL-Dox-NV的浓度低2.17倍，比Dox-PM-NV的浓度低2.61倍，并且比TRAIL-PM-NV的浓度低7.8倍。总的来说，这些结果验证了通过PMNV实现的TRAIL和Dox的有序和位点特异性递送通过TRAIL和Dox的组合效力有效启动了细胞凋亡的协同诱导。
PM-NV的体内靶向能力和抗肿瘤效力。为了评估PM-NV的肿瘤靶向能力，经由尾静脉将Cy5.5标记的TRAIL-Dox-PM-NV静脉内施用至荷MDA-MB-231瘤裸鼠中。在注射后6小时，PM-NV在肿瘤位点处表现出强荧光信号(图4a)，验证了PM-NV的显著靶向能力，其能够选择性地结合至MDA-MB-231细胞表面上的过表达的CD44受体。随着时间延长，在12小时、24小时和48小时，与用NV处理的小鼠相比，在用PM-NV处理的小鼠的肿瘤位点处发现荧光强度升高(图4A)，表明通过血小板膜介导的活性靶向能力比EPR效应更加优越。另外，在注射后48小时通过PM-NV在肿瘤位点实现的滞留时间延长。成像48小时后，取出肿瘤和正常组织进行体外成像。肿瘤位点处的PM-NV荧光强度比NV和其他器官高得多(图4B)。通过感兴趣区域(ROI)定量分析证实了结果，其示出荧光强度比NV高1.9倍，并且比肝和肾高3.0倍和4.5倍(图4C)。此外，通过Dox的分布进一步验证了PM-NV在肿瘤位点处的累积增加，其显示出与NV相比Dox的红色荧光信号增加(图4E)。通过定量监测血浆中的Dox浓度来评估静脉内施用的PMNV的药代动力学。消除半衰期(t1/2)和AUC(曲线下面积)显著高于NV，表明PM-NV具有保持延长的循环时间的能力(图12)。这些体内研究结果进一步证实，用含有“自我识别”蛋白的血小板膜包覆NV(HuC-MJ等人(2011年)，Proc Natl Acad Sci U S A.，第108卷第27期，第10980-10985页)可以抑制巨噬细胞摄取，这与体外巨噬细胞摄取结果非常相符。
然后使用荷MDA-MB-231瘤裸鼠评估体内抗肿瘤效力。与盐水对照组相比，用不同TRAIL/Dox制剂(包括TRAIL-Dox-NV、TRAIL-PM-NV、Dox-PM-NV和TRAIL-Dox-PM-NV)处理后，肿瘤的生长受到显著抑制(图5A、图5B)。与TRAIL-PM-NV和Dox-PM-NV相比，用TRAIL-Dox-PM-NV处理的肿瘤显示出明显更小的体积，这表明通过PM-NV与TRAIL和Dox的组合实现了协同抗肿瘤效力。此外，通过TRAIL-Dox-PM-NV实现的最强抗肿瘤效力表明，TRAIL和Dox有序和位点特异性递送至其最活跃的目的地可增强协同抗肿瘤效力。同时，接受不同药物制剂的小鼠的体重在治疗期间保持稳定(图5C)。通过苏木精和伊红(H&E)染色的肿瘤切片的组织学图像显示，经TRAIL-Dox-PM-NV处理后大量癌细胞缓解(图5d)，而正常器官上未观察到明显的病理学异常(图14)。此外，对于TRAIL-Dox-NV、Dox-PM-NV和TRAIL-Dox-PM-NV(图13)，未在心脏中发现明显的病理学异常，例如心肌病(Dox癌症治疗中的主要毒性效应)。此外，使用原位TUNEL测定获得的荧光图像呈现出，从用TRAIL-Dox-PM-NV处理的小鼠收集的肿瘤具有最高水平的细胞凋亡(图5D)。
通过PM-NV体内消除循环肿瘤细胞(CTC)。为了进一步评估该PM包覆的组合药物递送平台的效力，通过为裸鼠注射MDA-MB-231细胞(1×106个细胞/100μL盐水)来研究体内消除CTC的能力。这些循环肿瘤细胞可以扩散到各个器官，特别是肺部中(Price JE等人(1990年)，Cancer Res.第50卷第3期，第717-721页)。如图6A和6C所示，用盐水处理的小鼠表现出显著的肺转移，如转移性结节所示。然而，用TRAIL-Dox-NV处理的小鼠显示出肺转移略微减少，与盐水组相比没有显著差异。与之形成鲜明对比的是，在用TRAIL-Dox-PMNV处理的小鼠的肺部发现显著减少的转移性结节，其通过H&E染色进一步证实(图6B)，表明在血流中有效消除了CTC，这归因于PM上的P-选择素的选择性捕获和随后通过TRAIL与死亡受体的结合和Dox在细胞核中的累积而导致的细胞凋亡的激活(Mitchell MJ等人(2014年)，Proc NatlAcad Sci U S A.，第111卷第3期，第930-935页)。
总之，已开发血小板膜包覆的纳米制剂用于TRAIL和Dox的有序和位点特异性递送。通过利用血小板与癌细胞之间的特异性亲和力，PM-NV可以将TRAIL向癌细胞膜有效递送，以激活外源性细胞凋亡信号传导通路。PM-NV配备有酸响应性包封基质，可以在内吞后被消化，并增强Dox在细胞核处的累积以激活内源性细胞凋亡途径。TRAIL-Dox-PM-NV实现了很有前景的协同抗肿瘤效力。由于血清稳定性、靶向特异性和生成便利性，该PM-NV还可以通过其他细胞内治疗剂的组合一起来递送作用于肿瘤细胞膜上的其他蛋白质，例如西妥昔单抗和曲妥单抗，以实现协同抗肿瘤效力。重要的是，由于转移性癌细胞需要血小板聚集在其周围以帮助癌细胞在血液中存活并扩散到新组织(Borsig L等人(2001年)，Proc NatlAcad Sci U S A.，第98卷第6期，第3352-3357页；Borsig L(2008年)，Expert RevAnticancer Ther.，第8卷第8期，第1247-1255页)，该PM-NV可以进一步适于鉴定和消除具有转移潜能的肿瘤细胞。最后，由于血小板通过形成封闭受伤血管并止血的栓塞，从而还在几种生理和病理过程(诸如止血和血栓)中起着关键作用(Ruggeri ZM(2002年)，Nat Med.，第8卷第11期，第1227-1234页；DavìG&Patrono C(2007年)，N Engl J Med.，第357卷第24期，第2482-2494页)，因此该平台也有望用于治疗血管疾病。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明确地以引用方式并入。
本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

Claims (27)

1.一种血小板膜包覆的纳米载体，包含
a)内核，所述内核包含药物递送基质，其中所述药物递送基质包括抗肿瘤药物；以及
b)外壳血小板膜，所述外壳血小板膜包覆所述内核，其中所述外壳血小板膜还包含肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)。
2.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述抗肿瘤药物包含疏水性小分子。
3.根据权利要求2所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述抗肿瘤药物选自紫杉醇、喜树碱和多西他赛。
4.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述抗肿瘤药物包含亲水性小分子。
5.根据权利要求4所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述抗肿瘤药物选自阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶。
6.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述外壳血小板膜包含内源性P-选择素蛋白。
7.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述外壳血小板膜包含整合素αIIbβ3。
8.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述外壳血小板膜包含选自CD47、CD55和CD59的自我识别免疫调节蛋白。
9.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述外壳血小板膜还包含异源性细胞外活性蛋白。
10.根据权利要求9所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述细胞外活性蛋白包括治疗性抗体。
11.根据权利要求10所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述治疗性抗体包括西妥昔单抗、曲妥单抗或它们的组合。
12.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述药物递送基质包括聚合物凝胶。
13.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述药物递送基质包括无机颗粒。
14.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述药物递送基质包括脂质颗粒。
15.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述药物递送基质包括树枝状体颗粒。
16.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述纳米载体具有10nm至1000nm的平均直径。
17.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述纳米载体具有-1mV至-40mV的平均ζ电位。
18.根据权利要求1所述的血小板膜包覆的纳米载体，其中所述纳米载体对pH敏感。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的血小板膜包覆的纳米载体在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述血小板膜是自体的。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症过表达CD44。
22.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症是循环癌细胞。
23.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症是转移性癌细胞。
24.根据权利要求1至18中任一项所述的血小板膜包覆的纳米载体在制备用于治疗受试者的血管疾病的药物中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述药物递送基质包含用于治疗血管疾病的药物。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物包括用于治疗凝血的肝素。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物包括用于治疗冠状动脉再狭窄的阿霉素。
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