ES2884256T3 - Métodos y composiciones para la estabilización de ácidos nucleicos en una muestra de sangre a temperaturas ambientales - Google Patents
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Abstract
Una formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico se estabilizan en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después de su almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos cuatro días, en donde la formulación comprende: (i) un tampón de pH; (ii) un inhibidor de fosfatasa; (iii) una purina; (iv) un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y (v) un compuesto seleccionado entre: (v.a) un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa; y/o (v.b) un inhibidor de nucleasa; y en donde dicha formulación no comprende un agente quelante, tal como EDTA.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para la estabilización de ácidos nucleicos en una muestra de sangre a temperaturas ambientales
Referencia cruzada
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Núm. 62/010.164, presentada el 10 de junio de 2014.
Antecedentes de la invención
1. Campo técnico
La presente invención se refiere en general a la estabilización de una o más moléculas de ácido nucleico y/o polipéptidos o exosomas no desnaturalizados en una muestra de sangre a temperaturas ambientales. En particular, la invención se refiere a formulaciones, composiciones, artículos de fabricación, kits y métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico y/o polipéptidos o exosomas no desnaturalizados en una muestra de sangre a temperaturas ambientales.
2. Antecedentes
Las composiciones que comprenden un tampón de pH para el almacenamiento sustancial de ácidos nucleicos y polipéptidos en muestras biológicas sin refrigeración y sin el uso de donadores de formaldehído se conocen a partir del documento US 2013/209997 A1. Se conocen composiciones similares que comprenden EDTA como componente clave a partir de los documentos WO 2013/045458 A1 y WO 2008/111981 A1, mientras que la formulación de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas no comprende tal agente quelante. La sangre completa es una mezcla compleja de células, ácidos nucleicos, proteínas y varios otros analitos. En particular, los componentes sanguíneos incluyen, pero no se limitan a: células, tales como leucocitos (monocitos, linfocitos y granulocitos), eritrocitos, trombocitos y células tumorales en circulación; moléculas de ácido nucleico, tales como ADN libre en circulación (ADNlc); polipéptidos, tales como lipoproteínas, albúmina y proteínas séricas, y otros diversos analitos.
Existe una necesidad constante de donantes de sangre para sangre completa, en parte, debido a la semivida relativamente corta y los requisitos de almacenamiento de la sangre completa. Por ejemplo, la sangre completa recolectada para transfusión debe enviarse en hielo y almacenarse en condiciones de refrigeración fría con oscilación constante para mantener las células viables intactas y preservar los polipéptidos celulares y acelulares, las moléculas de ácido nucleico y otros analitos de la degradación química y enzimática. Este requisito para las condiciones de almacenamiento en frío puede limitar la disponibilidad de suministros de sangre completa en áreas que carecen de las instalaciones necesarias para el almacenamiento en frío, por ejemplo, debido a la falta de equipo suficiente o de energía eléctrica constante necesaria para mantener temperaturas adecuadas de almacenamiento en frío.
Se han investigado las composiciones y métodos para estabilizar, transportar y almacenar sangre completa y componentes sanguíneos a temperaturas ambientales. Si bien las composiciones utilizadas actualmente son capaces de prevenir la degradación de polipéptidos y moléculas de ácido nucleico, una limitación importante es que los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico estabilizados se mantienen en una conformación desnaturalizada, p. ej., ADN de hebra sencilla y proteínas desplegadas que carecen de estructura secundaria y/o terciaria apropiadas, debido a los componentes reactivos utilizados en las formulaciones y composiciones de almacenamiento. Una limitación adicional es que estas formulaciones pueden dar como resultado la lisis de las células sanguíneas liberando así el contenido celular en la muestra de sangre completa, lo que puede complicar la cuantificación y análisis de diagnóstico posteriores de polipéptidos y moléculas de ácido nucleico que circulan libremente debido a la contaminación del ADN genómico y las proteínas intracelulares.
Recientemente se han desarrollado pruebas de diagnóstico no invasivas para determinar anomalías de los fetos utilizando el ADN libre de células en circulación en la sangre materna (p. ej., prueba de anomalías fetales no invasivas MATERNIT21® PLUS, Sequenom, Inc.). El impacto de esta herramienta ha provocado que se realicen más investigaciones sobre el uso del ADN libre de células y los perfiles de aminoácidos libres de células para predecir estados patológicos y la progresión relativa de determinadas enfermedades. El uso de las muestras de sangre recolectadas en un breve período de tiempo previamente descrito es primordial, ya que los cambios en el perfil ocurren en un tiempo relativamente corto a temperaturas ambientales, y la exposición a 4°C puede causar cambios falsos en los marcadores de diagnóstico en las superficies celulares y aumentar la cantidades liberadas al plasma o fracciones de suero. Si bien existen tubos de recolección para estabilizar ácidos nucleicos libres de células hasta durante 7 días a temperaturas ambiente (Streck Labs), los componentes principales de las formulaciones provistas en los tubos son agentes liberadores de formaldehído (tales como imidazolinilurea o diazolidinilurea) que reaccionan para fijar las células y hacerlas menos permeables a los agentes que entran o salen de las células.
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevas formulaciones, composiciones y métodos para la estabilización de moléculas de ácido nucleico y polipéptidos, individualmente o juntos, en los que las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos sustancialmente estables se mantengan en la muestra de sangre en su forma nativa, conformación no
desnaturalizada a temperatura ambiente. Las formulaciones, composiciones y métodos de la presente divulgación superan ventajosamente las limitaciones antes mencionadas manteniendo la integridad de las células sanguíneas para evitar la contaminación de moléculas de ácido nucleico y polipéptidos en circulación por componentes celulares lisados, mientras que también conservan polipéptidos y moléculas de ácido nucleico funcionalmente activos en su conformación nativa a temperatura ambiente. Estas moléculas de ácido nucleico y polipéptidos estabilizados se pueden enviar y almacenar sin necesidad de refrigeración o congelación, y son estables a temperatura ambiente durante períodos de tiempo prolongados, p. ej., días, semanas, meses o incluso años, lo que facilita la cuantificación, el análisis y/o el uso de diversas moléculas de ácido nucleico y polipéptidos para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas potenciales.
Breve compendio
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no caen dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. La presente divulgación proporciona formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa no desnaturalizada en una muestra de sangre a temperatura ambiente, en donde los uno o más polipéptidos se estabilizan en una conformación nativa no desnaturalizada sustancialmente libre de polipéptidos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 3 días. Al menos 80% de los polipéptidos se puede estabilizar en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Los uno o más polipéptidos pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días o al menos 18 días. La formulación puede comprender: un tampón de pH; un azúcar no reductor; un trisacárido; y uno o más de un polímero soluble en agua; compuesto catiónico; compuesto de ion híbrido; un inhibidor de fosfatasa, o una combinación de los mismos. El azúcar no reductor puede ser sacarosa. El trisacárido se puede seleccionar del grupo que consiste en maltotriosa, isomaltotriosa, rafinosa, melecitosa, nigerotriosa y combinaciones de las mismas. El trisacárido puede ser melecitosa. El polímero soluble en agua puede ser poli(alcohol vinílico). El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato. El compuesto de ion híbrido puede ser un compuesto de fórmula (I):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), en donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y Z es CO2-, SO3- u
OPO3-. El compuesto catiónico se puede seleccionar del grupo que consiste en:
(a) un compuesto de fórmula (II):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente de alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; Z es CO2A; y X es un anión farmacéuticamente aceptable;
(b) un compuesto de fórmula (III):
en donde R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
(c) un compuesto de fórmula (IV):
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido; y X es un anión farmacéuticamente aceptable. R1 y R2 de un compuesto de fórmula (I), fórmula (II) o fórmula (III) pueden formar un anillo morfolino, un anillo pirrolidinio, un anillo piperidinio o un anillo oxazinio. El compuesto de ion híbrido se puede seleccionar entre los compuestos de ion híbrido que se muestran en la Tabla 1. El compuesto catiónico se puede seleccionar entre los compuestos catiónicos que se muestran en la Tabla 1. El compuesto de ion híbrido puede ser N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-3-amonio-propionato o N-etilpiperidinio-4-butilsulfonato. Los uno o más polipéptidos se pueden seleccionar del grupo que consiste en un anticuerpo, una enzima, una proteína plasmática, una proteína sérica y combinaciones de los mismos. La composición puede comprender: un tampón de pH; un almidón no iónico; y uno o más de un poliol; un inhibidor de fosfatasa; un aminoácido; o una combinación de los mismos. El poliol se puede seleccionar del grupo que consiste en glicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, ribitol, adonitol, manitol, sorbitol, galactitol, fucitol, iditol, inositol y combinaciones de los mismos. El poliol puede ser glicerol. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato. El aminoácido puede ser glicina. El aminoácido puede ser sarcosina. El azúcar no reductor puede ser sacarosa y el trisacárido se puede seleccionar del grupo que consiste en maltotriosa, isomaltotriosa, rafinosa, melecitosa y nigerotriosa, más preferiblemente melecitosa. El polímero soluble en agua puede ser poli(alcohol vinílico), el inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato y el compuesto bipolar puede ser una sal interna cuaternaria. El polímero soluble en agua puede ser poli(alcohol vinílico), el inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato y el compuesto de ion híbrido puede ser N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-3-amonio-propionato o N-etil-piperidinio-4-butilsulfonato. El poliol se puede seleccionar del grupo que consiste en glicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, ribitol, adonitol, manitol, sorbitol, galactitol, fucitol, iditol e inositol, el inhibidor de fosfatasa es 2-glicerol fosfato y el aminoácido puede ser glicina o sarcosina. El poliol puede ser glicerol, el inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato y el aminoácido puede ser glicina o sarcosina. La formulación se puede seleccionar entre las que se muestran en la Tabla 2. Se proporcionan composiciones de uno o más polipéptidos purificados no desnaturalizados, almacenados de manera sustancialmente estable, que comprenden uno o más polipéptidos purificados no desnaturalizados mezclados con cualquiera de las formulaciones anteriores.
En el presente documento se describen métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa no desnaturalizada en una muestra de sangre a temperatura ambiente, que comprenden: mezclar una muestra de sangre recolectada de un sujeto con una formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa no desnaturalizada en una muestra de sangre proporcionada en el presente documento, en donde los uno o más polipéptidos permanecen en un estado nativo no desnaturalizado después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. El polipéptido se puede seleccionar del grupo que consiste en un anticuerpo, una enzima, una proteína plasmática, una proteína sérica y una combinación de los mismos. Al menos 80% de los polipéptidos puede
permanecer en un estado nativo no desnaturalizado después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. El sujeto puede ser un animal. El sujeto puede ser un mamífero. El sujeto puede ser un ser humano.
Se proporcionan formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperatura ambiente, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico se estabilizan en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 3 días. Al menos 80% de las moléculas de ácido nucleico se puede estabilizar en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 3 días. La una o más moléculas de ácido nucleico pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días, o al menos 18 días. La formulación puede comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido; un compuesto catiónico; o una combinación de los mismos; y un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato. El compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria. La sal interna cuaternaria puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato. El compuesto de ion híbrido puede ser un compuesto de fórmula (I):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), en donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y Z es CO2-, SO3- u
OPO3-. El compuesto catiónico se puede seleccionar del grupo que consiste en:
(a) un compuesto de fórmula (II):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; Z es CO2A; y X es un anión farmacéuticamente aceptable;
(b) un compuesto de fórmula (III):
en donde R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A),
CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
(c) un compuesto de fórmula (IV):
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido; y X es un anión farmacéuticamente aceptable. R1 y R2 de un compuesto de fórmula (I), fórmula (II) o fórmula (III) pueden formar un anillo morfolino, un anillo pirrolidinio, un anillo piperidinio o un anillo oxazinio. El compuesto de ion híbrido se puede seleccionar entre los compuestos de ion híbrido mostrados en la Tabla 1. El compuesto catiónico se puede seleccionar entre los compuestos catiónicos mostrados en la Tabla 1. La formulación puede comprender adicionalmente un inhibidor de nucleasa. La purina puede ser adenina. El inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico. La composición puede comprender adicionalmente un agente seleccionado del grupo que consiste en un antibiótico, un derivado de purina y una combinación de los mismos. El antibiótico se puede seleccionar del grupo que consiste en rifampicina, actinomicina D, 5-hidroxi-1,4-naftoquinona y una combinación de los mismos. El derivado de purina puede ser 5-mercaptopurina. El inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH. Las una o más moléculas de ácido nucleico pueden ser una molécula de ADN libre en circulación. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, más preferiblemente 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de la apoptosis puede ser Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de la apoptosis puede ser el Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat. 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. Las formulaciones pueden comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto catiónico o un compuesto de ion híbrido; y un inhibidor de nucleasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, la purina puede ser adenina, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, el inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico y el tampón de pH puede ser MOPS. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, la purina puede ser adenina, el compuesto de ion híbrido puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico y el tampón de pH puede ser MOPS. La formulación puede comprender adicionalmente un disolvente polar y un agente quelante. La formulación puede comprender adicionalmente dimetilacetamida y EDTA tripotásico. La formulación se puede seleccionar entre las formulaciones mostradas en la Tabla 3. Se proporcionan composiciones de una o más moléculas de ácido nucleico purificadas, no desnaturalizadas, almacenadas de manera sustancialmente estable, que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico purificadas, no desnaturalizadas mezcladas con cualquier de las formulaciones anteriores.
En el presente documento se describen métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperatura ambiente, que comprenden: mezclar una muestra de sangre recolectada de un sujeto con una formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperatura ambiente proporcionada en el presente documento, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico permanecen en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. La molécula de ácido nucleico puede codificar un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, una enzima y una proteína sérica, un anticuerpo, una enzima, una proteína plasmática y una proteína sérica. Al menos 80% de las moléculas de ácido nucleico puede permanecer en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN libre en circulación. El sujeto puede ser un animal. El sujeto puede ser un mamífero. El sujeto puede ser un ser humano.
En el presente documento se describen formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más exosomas en un estado nativo en una muestra de sangre a temperatura ambiente, que comprenden: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido; un compuesto catiónico; o una combinación de los mismos; y un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa, en donde los uno o más exosomas se estabilizan después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Al menos
80% de los exosomas se puede estabilizar después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Los uno o más exosomas se pueden estabilizar después de su almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días o al menos 18 días. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato. El compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria. La sal interna cuaternaria puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato. El compuesto de ion híbrido puede ser un compuesto de fórmula (I):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), en donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y Z es CO2-, SO3- u OPO3-. El compuesto catiónico se puede seleccionar del grupo que consiste en:
(a) un compuesto de fórmula (II):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; Z es CO2A; y X es un anión farmacéuticamente aceptable;
(b) un compuesto de fórmula (III):
en donde R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
(c) un compuesto de fórmula (IV):
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido; y X es un anión farmacéuticamente aceptable. R1 y R2 de un compuesto de fórmula (I), fórmula (II) o fórmula (III) pueden formar un anillo morfolino, un anillo pirrolidinio, un anillo piperidinio o un anillo oxazinio. El compuesto de ion híbrido se puede seleccionar entre los compuestos de ion híbrido mostrados en la Tabla 1. El compuesto catiónico se puede seleccionar entre los compuestos catiónicos mostrados en la Tabla 1. La formulación puede comprender adicionalmente un inhibidor de nucleasa. La purina puede ser adenina. El inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico. La composición puede comprender adicionalmente un agente seleccionado del grupo que consiste en un antibiótico, un derivado de purina y una combinación de los mismos. El antibiótico se puede seleccionar del grupo que consiste en rifampicina, actinomicina D, 5-hidroxi-1,4-naftoquinona y una combinación de los mismos. El derivado de purina puede ser 5-mercaptopurina. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, más preferiblemente 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de la apoptosis puede ser Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat. 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de la apoptosis puede ser el Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat. 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. La formulación puede comprender un tampón de pH, un inhibidor de fosfatasa, una purina, un compuesto catiónico o un compuesto de ion híbrido; y un inhibidor de nucleasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, la purina puede ser adenina, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, el inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico y el tampón de pH puede ser MOPS. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, la purina puede ser adenina, el compuesto de ion híbrido puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico y el tampón de pH puede ser MOPS. La formulación puede comprender adicionalmente un disolvente polar y un agente quelante. La formulación puede comprender adicionalmente dimetilacetamida y EDTA tripotásico. La formulación se puede seleccionar entre las formulaciones mostradas en la Tabla 3. Se proporcionan composiciones de uno o más exosomas purificados almacenados de manera sustancialmente estable que comprenden uno o más exosomas purificados mezclados con cualquiera de las formulaciones anteriores.
En el presente documento se describen métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más exosomas en un estado nativo en una muestra de sangre a temperatura ambiente, que comprenden: mezclar una muestra de sangre recolectada de un sujeto con una formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más exosomas en un estado nativo en una muestra de sangre a temperatura ambiente proporcionada en el presente documento, en donde los uno o más exosomas permanecen en un estado nativo después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. El sujeto puede ser un animal. El sujeto puede ser un mamífero. El sujeto puede ser un ser humano.
En el presente documento se describen artículos de fabricación que comprenden cualquiera de las formulaciones descritas en el presente documento, incluidas las mostradas en las Tablas 2 y 3, contenidas dentro de un tubo de recogida de sangre. El tubo de recogida de sangre puede ser un tubo de recogida de sangre por sistema de vacío.
En el presente documento se describen kits que pueden comprender cualquiera de los artículos de fabricación y un prospecto.
Descripción detallada
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no caen dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. La presente descripción se refiere a formulaciones, composiciones, artículos de fabricación, kits y métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico en una conformación nativa no desnaturalizada en una muestra de sangre a temperatura ambiente. La descripción también se refiere a formulaciones, composiciones, artículos de fabricación, kits y métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más exosomas en una muestra de sangre a temperatura ambiente. Las formulaciones pueden proporcionar un almacenamiento sustancialmente estable de polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico, en donde al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% de los polipéptidos y/o moléculas de
ácido nucleico permanecen en un estado nativo, no desnaturalizado después del almacenamiento a temperatura ambiente sustancialmente libre de componentes intracelulares contaminantes. Las formulaciones pueden proporcionar un almacenamiento sustancialmente estable de exosomas, en donde al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% de los exosomas son estables después del almacenamiento a temperatura ambiente.
Las formulaciones pueden proporcionar un almacenamiento sustancialmente estable de polipéptidos que conservan su conformación nativa y son funcionalmente activos. Las composiciones descritas en el presente documento también pueden proporcionar condiciones de almacenamiento sustancialmente estables para moléculas de ácido nucleico de longitud completa no desnaturalizadas, tales como ADN libre en circulación, libre de ADN intracelular contaminante para una cuantificación o análisis de diagnóstico mejorados.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente comprendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Como se emplea en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, las referencias al "método" incluyen uno o más métodos y/o etapas del tipo descrito en el presente documento que resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer esta divulgación y así sucesivamente.
Se pretende que "aproximadamente" como se emplea en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, abarque variaciones de ±20% o ±10%, o ±5%, o incluso ±1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para las composiciones divulgadas o para realizar los métodos divulgados.
Como se describe en el presente documento, una molécula de ácido nucleico se refiere a un polímero de dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos modificados y/o no modificados, ya sea en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción mayor. La molécula o moléculas de ácido nucleico, el oligonucleótido o los oligonucleótidos y el polinucleótido o los polinucleótidos, incluyen ARN o ADN (de hebra sencilla o de doble hebra, codificante, complementario o antisentido), o secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un nucleótido en forma de cadena sencilla o en forma de dúplex, análogos de ADN tales como PNA (ácido peptidonucleico) y cualquier modificación química de los mismos. El ADN puede ser un ADN de hebra sencilla o de doble hebra, ADNc o un ADN amplificado mediante cualquier técnica de amplificación, o cualquier polímero de ADN. La molécula de ácido nucleico puede ser un ADN libre en circulación (ADNlc). Como se emplea en el presente documento, ADNlc se refiere al ADN que está circulando en la sangre de un sujeto y no está contenido dentro de una célula. El ARN puede ser ARNm, ARNr, ARNt, ARNip, ARN total, ARN nuclear pequeño (ARNnp), iARN, microARN, ARN genómico, ARN aislado de células o tejidos, una ribozima o cualquier polímero de ARN. Se incluyen moléculas de ácido nucleico nativas, tales como las que se pueden aislar de fuentes naturales. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser formas, fragmentos y derivados obtenidos de fuentes naturales, así como formas recombinantes y moléculas artificiales, siempre que esté presente al menos una propiedad de las moléculas nativas. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar dentro de muestras biológicas y pueden ser aquellas que se pueden aplicar con fines analíticos, de diagnóstico y/o farmacéuticos, tales como, pero sin limitarse a, ácidos nucleicos y sus derivados (p. ej., oligonucleótidos, ADN, ADNc, productos de PCR, ADN genómico, plásmidos, cromosomas, cromosomas artificiales, vectores de transferencia de genes, ARN, ARNm, ARNt, ARNip, miARN, ARNhn, ribozimas, ARN genómico, ácido peptidonucleico (PNA) y cromosomas artificiales bacterianos (BAC)). La muestra biológica puede ser sangre.
El término "purificado", como se emplea en "polipéptido purificado" o "molécula de ácido nucleico purificado" o "exosoma purificado" se refiere a la recuperación de una molécula de ácido nucleico, un polipéptido o exosoma, respectivamente, que está purificado al menos 50%, en al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 98%, o al menos 99% con respecto a la eliminación de un contaminante, p. ej., componentes celulares tales como proteína, lípido o sal. El término "sustancialmente purificado" generalmente se refiere a la separación de la mayoría de proteínas celulares o contaminantes de reacción de la muestra de sangre, de modo que se eliminan los compuestos capaces de interferir en el uso posterior de la biomolécula aislada (tal como una molécula de ácido nucleico).
Como se describe en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente con el término polipéptido y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos de una secuencia de proteínas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El término "polipéptido" abarca fragmentos y variantes (incluidos fragmentos de variantes) del mismo, a menos que el contexto lo contradiga.
Los términos "proteína aislada" o "polipéptido aislado" representan una proteína o polipéptido que, en virtud de su origen (p. ej., una célula o muestra biológica) o fuente de obtención, no están asociados con componentes asociados
naturalmente que los acompañan en su estado nativo. Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente se "aislará" de sus componentes asociados de forma natural. Una proteína también se puede purificar o purificar sustancialmente haciéndola sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento purificando al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 98%,% o al menos 99% con respecto a eliminación de un contaminante, p. ej., componentes celulares tales como ácidos nucleicos, lípidos o sales utilizando mecanismos de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica.
Formulaciones y composiciones para estabilizar polipéptidos, ácidos nucleicos o exosomas en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales
Se pueden proporcionar formulaciones y composiciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación no desnaturalizada en una muestra de sangre a temperatura ambiental, en donde los uno o más polipéptidos se estabilizan en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Las formulaciones y composiciones se pueden proporcionar para polipéptidos sustancialmente estables en una conformación nativa no desnaturalizada en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde al menos 80% de los polipéptidos se estabiliza en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Los uno o más polipéptidos pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días o al menos 18 días.
El término "temperatura ambiental", como se emplea en el presente documento, se refiere a temperaturas habituales en interiores. La temperatura ambiental puede ser de 15 a 32°C. La temperatura ambiental puede ser de 20 a 27°C.
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperatura ambiente pueden comprender: un tampón de pH; un azúcar no reductor; un trisacárido; y al menos uno de un polímero soluble en agua, un compuesto catiónico, un compuesto de ion híbrido y un inhibidor de fosfatasa. Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperatura ambiente, pueden comprender tampón de pH; un almidón no iónico; y uno o más de un poliol, un inhibidor de fosfatasa y un aminoácido, en donde los uno o más polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico se estabilizan en un estado nativo no desnaturalizado después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. El poliol se puede seleccionar del grupo que consiste en glicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, ribitol, adonitol, manitol, sorbitol, galactitol, fucitol, iditol e inositol, el inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato y el aminoácido puede ser glicina o sarcosina. El poliol puede ser glicerol, el inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato y el aminoácido puede ser glicina o sarcosina.
Se pueden proporcionar formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde una o más moléculas de ácido nucleico permanecen en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Se pueden proporcionar formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde al menos 80% de las moléculas de ácido nucleico se estabiliza en un estado nativo no desnaturalizado después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Las una o más moléculas de ácido nucleico pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días, o al menos 18 días.
Las formulaciones pueden comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, más preferiblemente 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de la apoptosis puede ser Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat. 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS.
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más ácidos nucleicos en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperatura ambiental pueden comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y un inhibidor de nucleasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, la purina puede ser adenina, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, más preferiblemente 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico y el tampón de pH puede
ser MOPS. Las formulaciones pueden comprender adicionalmente uno de los siguientes: un antibiótico, un derivado de purina, un inhibidor de apoptosis, un inhibidor de caspasa o una combinación de los mismos. La formulación puede comprender un disolvente polar y un agente quelante. La formulación puede comprender adicionalmente dimetilacetamida y EDTA tripotásico.
En el presente documento se proporcionan composiciones en las que la muestra de sangre se mezcla con el ácido nucleico, polipéptido o exosoma y la formulación de estabilización para producir uno o más ácidos nucleicos, polipéptidos o exosomas no desnaturalizados, respectivamente, en una preparación de sangre completa. Se puede proporcionarse una composición que comprende una o más moléculas de ácido nucleico, polipéptidos o exosomas purificados o sustancialmente purificados mezclados con una formulación de estabilización correspondiente.
Reactivos de formulación
A. Tampones de pH
Las formulaciones y composiciones descritas en el presente documento para el almacenamiento sustancialmente estable de una molécula de ácido nucleico, polipéptido o exosoma en una muestra de sangre a temperaturas ambientales pueden incluir uno o más tampones de pH. El tampón puede ser cualquiera de un gran número de compuestos conocidos en la técnica por su capacidad para resistir cambios en el pH de una solución, tal como una solución acuosa, en la que está presente el tampón de pH. La selección de uno o más tampones de pH concretos para su inclusión en una composición de almacenamiento estable se puede realizar basándose en la presente divulgación y de acuerdo con las prácticas de rutina en la técnica, y puede estar influenciada por una variedad de factores, incluido el pH que es deseable mantener, la naturaleza de la muestra que se va a estabilizar, las condiciones del disolvente que se va a emplear, los otros componentes de la formulación que se van a utilizar y otros criterios. Por ejemplo, típicamente se emplea un tampón de pH a un pH que está dentro de aproximadamente 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 unidad de pH de una constante de disociación de protones (pKa) que es una característica del tampón.
Los ejemplos no limitantes de tampones de pH incluyen ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido sulfosalicílico, ácido sulfoisoftálico, ácido oxálico, borato, CAPS (ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico), CAPSO (ácido 3-(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfónico), EPPS (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinopropanosulfónico), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazino-1-etanosulfónico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), MOPSO (ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfónico), PIPES (ácido 1,4-piperazinodietanosulfónico), TAPS (ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanosulfónico), TAPSO (ácido 2-hidroxi-3-[tris(hidroximetil)metilamino]-1 -propanosulfónico), TES (ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico), bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), tricina (N-[tris(hidroximetil)metil]glicina), tris (tris(hidroximetil)aminometano) y bis-tris (2-[bis(2-hidroxietil)amino] -2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol). Ciertos ejemplos contemplados en el presente documento, que incluyen varios de los mostrados en la Tabla 2 o la Tabla 3, pueden presentar una formulación que tiene un pH de aproximadamente 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 o 9,0.
B. Compuestos catiónicos y compuestos de ion híbrido
El compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria. Las sales internas cuaternarias para el almacenamiento sustancialmente estable de ácidos nucleicos pueden ser las divulgadas en el documento WO 2012/018638.
El compuesto de ion híbrido puede ser un compuesto de fórmula (I):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), en donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y Z es CO2-, SO3- u OPO3-. R1 y R2 pueden formar un anillo morfolino, un anillo pirrolidinio, un anillo piperidinio o un anillo oxazinio.
El compuesto catiónico se puede seleccionar del grupo que consiste en:
(a) un compuesto de fórmula (II):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; Z es CO2A; y X es un anión farmacéuticamente aceptable;
(b) un compuesto de fórmula (III):
en donde R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
(c) un compuesto de fórmula (IV):
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido; y X es un anión farmacéuticamente aceptable. R1 y R2 de un compuesto de fórmula (II) o fórmula (III) pueden formar un anillo morfolino, un anillo pirrolidinio, un anillo piperidinio o un anillo oxazinio.
Un grupo "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado alifático. El radical alquilo incluye un grupo "alquilo saturado", lo que significa que no contiene radicales alqueno o alquino. El radical alquilo también incluye un radical "alquilo insaturado", lo que significa que contiene al menos un radical alqueno o alquino. Un radical "alqueno" se refiere a un grupo que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono, y un radical "alquino" se refiere a un grupo que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. El radical alquilo, ya sea saturado o insaturado, incluye radicales de cadena ramificada, lineal o cíclicos. Dependiendo de la estructura, un grupo alquilo incluye un monorradical o un dirradical (es decir, un grupo alquileno), y si es un "alquilo inferior" tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Como se emplea en el presente documento, C1-Cx incluye C1-C2, C1-C3 ... C1-Cx. El radical "alquilo" tiene opcionalmente de 1 a 10 átomos de carbono (siempre que aparezca en el presente documento, un intervalo numérico tal como "1 a 10" se refiere a cada número entero en el intervalo dado; p. ej., "de 1 a 10 átomos de carbono" significa que el grupo alquilo se selecciona entre un radical que tiene 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta e incluyendo 10 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "alquilo" donde no se designa ningún intervalo numérico). El grupo alquilo de los compuestos descritos en el presente documento se puede
denominar "alquilo C1-C4" o denominaciones similares. Solo a modo de ejemplo, "alquilo C1-C4" indica que hay de uno a cuatro átomos de carbono en la cadena de alquilo, es decir, la cadena de alquilo se selecciona entre metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y t-butilo. Por tanto, alquilo C1-C4 incluye alquilo C1-C2 y alquilo C1-C3. Los grupos alquilo están opcionalmente sustituidos o no sustituidos. Los grupos alquilo típicos incluyen, pero sin limitarse a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo, etenilo, propenilo, butenilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares.
Como se emplea en el presente documento, el término "anillo" se refiere a cualquier estructura cerrada covalentemente. Los anillos incluyen, por ejemplo, carbociclos (p. ej., arilos y cicloalquilos), heterociclos (p. ej., heteroarilos y heterociclos no aromáticos), aromáticos (p. ej., arilos y heteroarilos) y no aromáticos (p. ej., cicloalquilos y heterociclos no aromáticos). Los anillos se pueden sustituir opcionalmente. Los anillos pueden ser monocíclicos o policíclicos.
El término "arilo" utilizado solo o como parte de un radical más grande como en "arilalquilo", "arilalcoxi" o "ariloxialquilo", se refiere a un sistema anular carbonado monocíclico, bicíclico o tricíclico, que incluye anillos fusionados, en donde al menos un anillo del sistema es aromático. El término "arilo" se puede utilizar indistintamente con el término "anillo de arilo". En una realización, arilo incluye grupos que tienen de 6 a 12 átomos de carbono. En otra realización, arilo incluye grupos que tienen de 6 a 10 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, antracilo, fenantrenilo, naftacenilo, 1,2,3,4-tetrahidronaftalenilo, 1 H-indenilo, 2,3-dihidro-1 H-indenilo y similares. Un arilo concreto es el fenilo. En otra realización, arilo incluye indanilo, naftilo y tetrahidronaftilo, y similares, donde el radical o punto de anclaje está en un anillo aromático.
Los términos "opcionalmente sustituido" o "sustituido" significan que el grupo referenciado puede estar sustituido con uno o más grupos adicionales seleccionados individual e independientemente entre alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, alquilsulfóxido, arilsulfóxido, alquilsulfona, arilsulfona, ciano, halo, acilo, nitro, haloalquilo, fluoroalquilo, amino, incluidos los grupos amino mono y disustituidos, y los derivados protegidos de los mismos. A modo de ejemplo, los sustituyentes opcionales pueden ser LsRs, en donde cada Ls se selecciona independientemente entre un enlace, -O-, -C(=O)-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, S(=O)2NH-, -NHS(=O)2 , -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -(alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido), o -(alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido); y cada Rs se selecciona independientemente entre H, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, heteroarilo o heteroalquilo.
En ciertas formulaciones descritas en el presente documento, incluidas las que se muestran en la Tabla 2 o la Tabla 3, el compuesto catiónico o el compuesto de ion híbrido se puede seleccionar entre uno de los compuestos ilustrativos de la Tabla 1.
Tabla 1. Compuestos catiónicos y de ion híbrido ilustrativos
En ciertos ejemplos para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos, incluidos los mostrados en la Tabla 2, el compuesto de ion híbrido es una sal interna cuaternaria. La sal interna cuaternaria puede ser N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-3-amonio-propionato o N-etil-piperidinio-4-butilsulfonato, a concentraciones de aproximadamente 1,0 a 100 mg/mL, o 1,0 a 50 mg/mL o 10,0 a 50 mg/mL. En ciertos ejemplos para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico, incluidos las mostradas en la Tabla 3, la sal interna cuaternaria es 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato.
C. Azúcares no reductores
También se describen en el presente documento formulaciones que incluyen al menos un azúcar no reductor en la composición para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa en una muestra de sangre a temperaturas ambientales. Los azúcares no reductores son moléculas de carbohidratos que carecen de un grupo aldehído funcional. Los azúcares no reductores ilustrativos incluyen sacarosa y trehalosa. El azúcar no reductor puede ser trehalosa y puede estar presente a una concentración de aproximadamente 1,0 a 50 mM, o aproximadamente 10,0 a 30 mM, o aproximadamente 25 mM. En algunos ejemplos para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa, el azúcar no reductor es sacarosa presente a una concentración de aproximadamente 1,0 a 50 mM, o aproximadamente 1,0 a 30 mM, o aproximadamente 10 mM.
D. Trisacáridos
Como se describe en el presente documento, las formulaciones pueden incluir al menos un trisacárido en la formulación o composición para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa en una muestra de sangre completa a temperaturas ambientales. Los trisacáridos son oligosacáridos compuestos por tres monómeros monosacáridos con enlaces glicosídicos que los conectan. El enlace glicosídico se puede formar entre cualquier grupo hidroxilo en los monosacáridos componentes y diferentes combinaciones de enlaces (regioquímica) y estereoquímica (alfa o beta) dan como resultado trisacáridos que son diastereoisómeros con diferentes propiedades químicas y físicas. La selección de uno o más trisacáridos concretos para su inclusión en una composición de almacenamiento estable se puede realizar basándose en la presente divulgación y de acuerdo con las prácticas rutinarias en la técnica, y puede estar influenciada por una variedad de factores que incluyen otros componentes de la formulación. Los trisacáridos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, maltotriosa, isomaltotriosa, rafinosa, melecitosa y nigerotriosa. En ciertos ejemplos para estabilizar polipéptidos, incluidas las formulaciones indicadas en la Tabla 2, el trisacárido es melecitosa. La melecitosa puede estar presente a una concentración de aproximadamente 1% a 20% o aproximadamente 5,0 a 15%.
E. Polioles
También como se ha descrito en el presente documento, algunos ejemplos incluyen al menos un poliol en la composición para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa en una muestra de sangre completa a temperaturas ambientales. Los polioles son alcoholes polihidroxilados que contienen dos o más grupos hidroxilo y tienen la fórmula general H(CHOH)nH, en donde n es un número entero seleccionado entre 2 y 7, inclusive. Los polioles difieren en la longitud de la cadena y la mayoría de los polioles tienen cadenas de cinco o seis carbonos que se obtienen de pentosas (azúcares de cinco carbonos) y hexosas (azúcares de seis carbonos); sin embargo, también existen polioles de cadena carbonada más corta y más larga. Los polioles ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, glicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, ribitol, adonitol, manitol, sorbitol, galactitol, fucitol, iditol e inositol. La selección de uno o más polioles concretos para su inclusión en una composición de almacenamiento sustancialmente estable puede realizarse basándose en la presente divulgación y según las prácticas rutinarias en la técnica, y puede estar influenciada por una variedad de factores que incluyen otros componentes de la formulación. El poliol presente en la formulación, incluidos los de la Tabla 2, puede ser un poliol de pentosa y puede estar presente a una concentración entre 20 y 100 mM, o aproximadamente 25 y 75 mM. El poliol presente en la formulación, incluidos los de la Tabla 2, puede ser adonitol y puede estar presente a una concentración entre 20 y 100 mM o aproximadamente 25 y 75 mM.
F. Polímeros solubles en agua
Como se describe en el presente documento, ciertos ejemplos incluyen al menos un polímero soluble en agua en las formulaciones y composiciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación nativa en una muestra de sangre completa a temperaturas ambientales. Tales polímeros solubles en agua incluyen poli(alcohol vinílico). Se apreciará que a partir de la presente divulgación, el experto en la técnica puede seleccionar otros polímeros solubles en agua para su uso en formulaciones y composiciones de almacenamiento estable, ya que pueden variar en función de los otros componentes de la composición que se emplean, almacenando la muestra biológica concreta, si se busca recuperar moléculas de ácido nucleico o moléculas de polipéptido o ambas, y otros factores. Ciertos ejemplos, incluidos, pero sin limitarse a, los presentados en la Tabla 2, contemplan la inclusión de un polímero soluble en agua a una concentración (sobre una base volumétrica, es decir, vol/vol) de aproximadamente 0,1 a 10% (vol/vol), o de aproximadamente 0,1 a 5% (vol/vol), o 1,0% (vol/vol). El polímero soluble en agua puede ser poli(alcohol vinílico) con un intervalo de peso molecular de aproximadamente 30 a 70.000 dalton e hidrolizado aproximadamente 87 a 90%.
G. Inhibidores de fosfatasa
Las formulaciones descritas en el presente documento para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico o polipéptidos en un estado no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales pueden contener un inhibidor de fosfatasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser un inhibidor de la clase de fosfatasas de serina-treonina. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato. Para estabilizar polipéptidos, la concentración puede ser de aproximadamente 1,0 a 100 mM, o aproximadamente 25 a 75 mM, o aproximadamente 50 mM; y para moléculas de ácido nucleico puede ser de aproximadamente 1,0 a 200 mM, o aproximadamente 25 a 150 mM, o aproximadamente 125 mM; y para los exosomas puede ser de aproximadamente 1,0 a 200 mM, o aproximadamente 25 a 150 mM, o aproximadamente 125 mM.
H. Almidones no iónicos
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una conformación no desnaturalizada en una muestra de sangre a temperaturas ambientales pueden contener un almidón no iónico. El almidón no iónico puede ser hidroxietil almidón (HES). El hidroxietilalmidón es uno de los expansores de volumen más utilizados bajo los nombres comerciales HESPAN de B. Braun Medical Inc. E1HES puede estar presente a una concentración de aproximadamente 1,0 a 10%, o aproximadamente 1,0 a 5,0%, o aproximadamente 1,0 a 2,0%.
I. Agentes quelantes
Los agentes quelantes o queladores no están incluidos en las formulaciones y composiciones descritas actualmente para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico en un estado no desnaturalizado en una muestra de sangre, y son conocidos por los familiarizados con la técnica por su capacidad para formar complejos y obstaculizar la reactividad de los cationes metálicos. Los agentes quelantes ilustrativos incluyen ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido trans-1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético (CDTA), ácido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido N-(2-hidroxietil)etilendiamino-N,N',N'-triacético, gluconato de sodio y ácido nitrilotriacético (NTA). Las concentraciones de agente quelante ilustrativas son EDTA disódico o tripotásico presente a una concentración de aproximadamente 1,0 a 100 mM o aproximadamente 10 a 90 mM, o aproximadamente 70 mM.
J. Inhibidores de nucleasa
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas en una muestra de sangre a temperaturas ambientales pueden contener un inhibidor de nucleasa. Los inhibidores de nucleasas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se puede utilizar cualquiera de tales inhibidores de nucleasa en las formulaciones, incluidas las de la Tabla 3, las composiciones y los métodos de la presente divulgación. El inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico.
K. Purina y derivados de purina
Se puede incluir una purina o un derivado de purina en la composición descrita actualmente para el almacenamiento sustancialmente estable de moléculas de ácido nucleico en una muestra de sangre. La purina puede ser adenina, guanina o una combinación de las mismas. La purina puede ser un derivado de purina. El derivado de purina puede ser 2-mercaptopurina.
L. Antibióticos
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas en una muestra de sangre a temperaturas ambientales pueden contener un antibiótico. Los antibióticos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se puede utilizar cualquiera de tales antibióticos en las formulaciones, composiciones y métodos de la presente divulgación. El antibiótico puede ser rifampicina, actinomicina D, 5-hidroxi-1,4-naftoquinona o una combinación de los mismos.
M. Disolventes polares
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas en una muestra de sangre a temperatura ambiente pueden contener un disolvente polar. El disolvente polar puede ser dimetilacetamida. El disolvente polar puede estar presente a una concentración de 25%. El disolvente polar puede ser dimetilacetamida y puede estar presente a una concentración de 25%.
Formulaciones para estabilizar polipéptidos nativos, moléculas de ácido nucleico o exosomas no desnaturalizados en una muestra de sangre a temperaturas ambientales
En el presente documento se describen formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos no desnaturalizados en una muestra de sangre a temperatura ambiental que pueden comprender: un tampón de pH; un azúcar no reductor; un trisacárido; y al menos uno de un polímero soluble en agua, un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o un inhibidor de fosfatasa, en donde los uno o más polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico permanecen en un estado nativo no desnaturalizado después del almacenamiento a temperatura ambiente durante una período de al menos tres días. Los uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada sustancialmente libre de polipéptidos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días, o al menos 18 días.
El disacárido puede ser sacarosa y el trisacárido se puede seleccionar del grupo que consiste en maltotriosa, isomaltotriosa, rafinosa, melecitosa y nigerotriosa, más preferiblemente melecitosa. El polímero soluble en agua puede ser poli(alcohol vinílico), el inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato y el compuesto de ion híbrido puede ser una amina cuaternaria, preferiblemente N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-3-amonio-propionato o N-etil-piperidinio-4-butilsulfonato.
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de polipéptidos no desnaturalizados en una muestra de sangre a temperaturas ambientales se pueden seleccionar de la Tabla 2.
Tabla 2. Formulaciones ilustrativas para estabilizar polipéptidos no desnaturalizados en una muestra de sangre a temperaturas ambientales
Las formulaciones se proporcionan para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico se estabilizan en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Las formulaciones pueden comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, el inhibidor de la apoptosis puede ser Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat.
178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de la apoptosis puede ser Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat. 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. La una o más moléculas de ácido nucleico pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días, o al menos 18 días.
Las formulaciones pueden comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y un inhibidor de nucleasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, la purina puede ser adenina, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, más preferiblemente 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico y el tampón de pH puede ser MOPS. Las formulaciones pueden comprender adicionalmente uno de los siguientes: un antibiótico, un derivado de purina, un inhibidor de apoptosis o un inhibidor de caspasa. La formulación puede comprender adicionalmente un disolvente polar y un agente quelante. La formulación puede comprender dimetilacetamida y EDTA tripotásico.
Las formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas en una muestra de sangre a temperaturas ambientales se pueden seleccionar de la Tabla 3.
Tabla 3. Formulaciones ilustrativas para estabilizar moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas en una muestra de sangre a temperaturas ambientales
Se proporcionan formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más exosomas en un estado nativo en una muestra de sangre a temperaturas ambientales durante un período de al menos tres días. Las formulaciones pueden comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, el inhibidor de la apoptosis puede ser Apoptosis Inhibitor (Calbiochem Núm. de Cat. 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, el compuesto de ion híbrido puede ser 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de la apoptosis puede ser el Apoptosis Inhibidor (Calbiochem Núm. de Cat. 178488), el inhibidor de caspasa puede ser Q-VD-OPH y el tampón de pH puede ser MOPS. El exosoma puede permanecer en un estado nativo después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días o al menos 18 días. Las formulaciones pueden comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido o un compuesto catiónico; y un inhibidor de nucleasa. El inhibidor de fosfatasa puede ser 2-glicerol fosfato, la purina puede ser adenina, el compuesto de ion híbrido puede ser una sal interna cuaternaria, más preferiblemente 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, el inhibidor de nucleasa puede ser ácido aurin tricarboxílico y el tampón de pH puede ser MOPS. Las formulaciones pueden comprender adicionalmente uno de los siguientes: un antibiótico y un derivado de purina. La formulación puede comprender adicionalmente un disolvente polar y un agente quelante. La formulación puede comprender dimetilacetamida y EDTA tripotásico.
La formulación para exosomas de almacenamiento sustancialmente estable en una muestra de sangre a temperaturas ambientales se puede seleccionar de la Tabla 3.
Métodos para preparar formulaciones para estabilizar moléculas de ácido nucleico y polipéptidos no desnaturalizados a temperaturas ambientales
Las presentes formulaciones se pueden preparar utilizando reactivos disponibles comercialmente y métodos bien
conocidos por los expertos en la técnica. Las formulaciones se pueden preparar como soluciones de partida concentradas de los reactivos de formulación, por ejemplo, 2X, 5X, 10X, 20X o similares, y mezclarse con la muestra de sangre a las concentraciones apropiadas. La muestra de sangre se puede mezclar con la provisión de partida de formulación a un volumen igual (1:1).
Moléculas de ácidos nucleicos y polipéptidos purificados
Los uno o más polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico sustancialmente estables en una muestra de sangre a temperaturas ambientales se pueden purificar adicionalmente utilizando métodos convencionales bien conocidos empleados rutinariamente por los expertos en la técnica. Los aparatos, kits y métodos para purificar moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la sangre son bien conocidos. Por ejemplo, los polipéptidos y ácidos nucleicos sustancialmente estabilizados se purifican, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad, electroforesis en gel o similares. Los uno o más polipéptidos o moléculas de ácido nucleico purificados se puede almacenar posteriormente en las formulaciones descritas en el presente documento durante períodos prolongados antes del análisis.
Artículos de fabricación
Se proporcionan artículos de fabricación en los que una de las formulaciones descritas en el presente documento, incluidas las mostradas en las Tablas 2 o 3, puede estar contenida dentro de un tubo, contenedor o recipiente de recogida de sangre adecuados. Estos artículos de fabricación se pueden utilizar para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más componentes sanguíneos estabilizando uno o más componentes sanguíneos en el momento de la recogida de sangre. El tubo de recogida de sangre puede ser un tubo para sangre al vacío que tenga una presión inferior a la atmosférica para extraer un volumen predeterminado de sangre completa. Estos artículos de fabricación se pueden utilizar en los kits y métodos descritos en el presente documento.
Kits
Se proporcionan kits que comprenden una cualquiera de los artículos de fabricación que comprenden las formulaciones de la presente divulgación y un prospecto. Los componentes del kit se pueden suministrar en un contenedor, tal como una caja de plástico compartimentada. El recipiente puede tener una tapa herméticamente sellable de modo que el contenido del kit se pueda esterilizar y sellar para su almacenamiento antes de su uso.
Métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de componentes sanguíneos
Se pueden proporcionar métodos para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos, moléculas de ácido nucleico o exosomas en una muestra de sangre en una conformación o estado nativo no desnaturalizado.
Los métodos pueden comprender mezclar una muestra de sangre con una formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde los uno o más polipéptidos se estabilizan en un estado nativo, no desnaturalizado después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Al menos 80% de los polipéptidos puede permanecer en un estado nativo no desnaturalizado durante un período de al menos tres días. La formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más polipéptidos no desnaturalizados en una muestra de sangre a temperaturas ambientales puede comprender: un tampón de pH; un azúcar no reductor; un trisacárido; y al menos uno o más de un polímero soluble en agua, un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o un inhibidor de fosfatasa. La formulación puede ser una de las formulaciones mostradas en la Tabla 2. En el método, los uno o más polipéptidos pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días o al menos 18 días.
Los métodos pueden comprender mezclar una muestra de sangre con formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico se estabilizan en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos tres días. Al menos 80% de los ácidos nucleicos puede permanecer en un estado nativo no desnaturalizado durante un período de al menos tres días. La formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas en una muestra de sangre a temperatura ambiental puede comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa. La formulación puede comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido o un compuesto catiónico; y un inhibidor de nucleasa. La formulación puede comprender adicionalmente: un disolvente polar y un agente quelante. La formulación puede comprender adicionalmente dimetilacetamida y EDTA tripotásico. La formulación puede ser una de las formulaciones mostradas en la Tabla 3. Las una o más moléculas de ácido nucleico pueden permanecer en una conformación nativa no desnaturalizada después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11
días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días o al menos 18 días.
Los métodos pueden comprender mezclar una muestra de sangre con formulaciones para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más exosomas en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde los uno o más exosomas se estabilizan durante un período de al menos tres días a temperatura ambiental. Al menos 80% de los exosomas se puede estabilizar durante un período de al menos tres días. La formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de uno o más exosomas en una muestra de sangre a temperatura ambiental puede comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa. La formulación puede comprender: un tampón de pH; un inhibidor de fosfatasa; una purina; un compuesto de ion híbrido o un compuesto catiónico; y un inhibidor de nucleasa. La formulación puede comprender adicionalmente: un disolvente polar y un agente quelante. La formulación puede comprender adicionalmente dimetilacetamida y EDTA tripotásico. La formulación puede ser una de las formulaciones mostradas en la Tabla 3. Los uno o más exosomas pueden estabilizarse después del almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días, o al menos 18 días.
Los tubos, bolsas, contenedores y recipientes de recogida de sangre son bien conocidos en la técnica y han sido empleados por los facultativos durante décadas. La sangre se puede recolectar utilizando cualquier método o aparato comúnmente empleado por los expertos en la técnica, tal como venopunción o pinchazo en el dedo. Cuando la sangre se recolecta por venopunción, las formulaciones de la invención se pueden ubicar dentro del tubo de recogida de sangre, p. ej., un tubo de vacío (tubo de recogida de sangre VACUTAINER, Becton Dickenson o VACUETTE, Greiner) en el momento en que se obtiene la muestra de sangre del sujeto, o las formulaciones se pueden añadir a una muestra de sangre completa ya obtenida, preferiblemente inmediatamente o poco después de su extracción.
Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizar los artículos de fabricación y kits divulgados en el presente documento.
Los siguientes Ejemplos se presentan a modo de ilustración y no de limitación. El Ejemplo 1 no ilustra la invención reivindicada.
Ejemplo 1
Estabilización de polipéptidos funcionalmente activos en una muestra de sangre humana durante un período de al menos nueve días a temperaturas ambientales
Este Ejemplo demostró formulaciones, incluidas las expuestas para preparar un almacenamiento sustancialmente estable de polipéptidos nativos funcionalmente activos en una conformación nativa no desnaturalizada en una muestra de sangre durante un período de al menos nueve días a temperaturas ambientales.
Se examinó la capacidad de las formulaciones ilustrativas A - G mostradas en la Tabla 2 para estabilizar una pluralidad de polipéptidos, p. ej., un estudio de 29 citocinas y quimiocinas, a temperaturas ambientales utilizando el kit del panel de quimiocinas/citocinas humanas Millipex MAP HCYTOMAG-60K-PX29 de Luminex Corp de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Brevemente, se recogieron muestras de sangre humana completa de donantes y se fraccionó la sangre y se analizó la capa de plasma. Se añadió una alícuota de plasma de 75 o 135 (muestras 9:1 en la Tabla 2) a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL al que se añadió una solución de 29 citocinas diferentes para enriquecer las muestras con un patrón interno de 400 pg/mL, y el volumen se ajustó a 150 microlitros. Las muestras de control que contenían el patrón interno en ausencia (almacenadas a -80°C) o presencia de plasma (fresco el día del ensayo) se prepararon y procesaron simultáneamente con las muestras de prueba. Además, se preparó una curva patrón utilizando 16, 80, 400, 2.000 y 10.000 pg/mL, para asegurar la linealidad del ensayo y ayudar en la cuantificación adecuada de las concentraciones de citocinas y quimiocinas unidas.
Las muestras de control y de prueba se colocaron a temperatura ambiente y se retiraron alícuotas de 25 microlitros el Día 0, el Día 3 y el Día 6. Las muestras del Día 0 y del Día 3 se almacenaron a -80°C hasta que se procesaron el Día 6. Para cada alícuota de 25 mL, se añadieron 25 microlitros de Tampón de Ensayo seguido de la adición de una cantidad de 25 microlitros de cuentas magnéticas con anticuerpo humano contra citocinas/quimiocinas inmovilizado recubiertas con uno de los 29 anticuerpos dirigidos contra cada miembro del panel de citocinas/quimiocinas. Los anticuerpos reconocen sólo polipéptidos de citocinas y quimiocinas no desnaturalizados y los polipéptidos desnaturalizados no se unirán a las cuentas. Las mezclas se incubaron durante la noche a 4°C con agitación. La placa de 96 pocillos se colocó contra un imán para secuestrar las cuentas magnéticas unidas, se eliminó el sobrenadante y las cuentas se lavaron dos veces con tampón de lavado.
A las cuentas lavadas, se les añadió una alícuota de 25 microlitros de una solución de Anticuerpo de Detección para cada muestra y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Se añadió una alícuota de 25 microlitros de
una solución de estreptavidina-ficoeritrina y las muestras se almacenaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se colocó un imán junto a la placa de 96 pocillos para secuestrar las cuentas, se eliminaron los sobrenadantes y las muestras se lavaron dos veces y se resuspendieron en 150 microlitros de tampón de lavado.
La cantidad de citocinas/quimiocinas unidas de cada muestra de plasma se determinó utilizando el aparato Luminex Bio-Tek ELx405 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se calculó la cantidad de cada uno de los 29 miembros de las citocinas y quimiocinas no desnaturalizadas para cada muestra. Los resultados para un subconjunto de citocinas se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
NP: control no protegido
Ejemplo 2
Estabilización de ácidos nucleicos libres en circulación en una muestra de sangre humana durante un período de al menos ocho días a temperaturas ambientales
Este ejemplo demostró formulaciones, incluidas las que se muestran en la Tabla 3, para preparar un almacenamiento sustancialmente estable de moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre mientras se evita la contaminación sustancial de los ácidos nucleicos intracelulares de las células sanguíneas lisadas durante un período de al menos ocho días a temperaturas ambientales.
La capacidad de las Formulaciones 1 - 10 ilustrativas mostradas en la Tabla 3 para estabilizar una pluralidad de ácidos nucleicos libres en circulación que están sustancialmente libres de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes en una muestra de sangre se examinó en dos experimentos separados. Brevemente, se colocaron 1,0 mL de la formulación en tres tubos Eppendorf de 5 mL para cada formulación, respectivamente. Los tubos no protegidos a temperatura ambiente y a 4°C no recibieron formulación. Se extrajo sangre completa humana fresca de un donante sano. La sangre se reunió, se mezcló y a continuación, se colocaron alícuotas de 4,0 mL en cada tubo. Después de cargar 10 tubos con sangre, los tubos se cerraron y se mezclaron por inversión 10 veces antes de añadir sangre a más tubos. La sangre se volvió a mezclar antes de añadirla al siguiente conjunto de tubos. Una vez que todos los tubos se cargaron y se mezclaron, los tubos de tiempo cero se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos. Se extrajeron dos alícuotas de plasma de 1,25 mL sin alterar los leucocitos y los glóbulos rojos, se transfirieron a tubos de microcentrífuga Eppendorf individuales de 1,5 mL y se centrifugaron a 16.000 g durante 10 min a 4°C. La sangre NP a temperatura ambiente de tiempo cero se preparó mediante la adición de 1 mL de 1X PBS de pH 7,4. El tubo se mezcló por inversión 10 veces y a continuación, se preparó el plasma como se ha descrito anteriormente. Las dos alícuotas de plasma libre de células de 1 mL para cada formulación probada se extrajeron utilizando el kit de aislamiento de ácido nucleico MagNA Pure Compact 1, gran volumen (número de catálogo de Roche 03730972001)
en el aparato Roche MagNA Pure Compact de Roche Molecular Systems. Los ácidos nucleicos se eluyeron en 100 pl de tampón de elución. Las muestras de tiempo cero se mantuvieron a 4°C hasta que se prepararon las muestras del día 4 como se ha descrito anteriormente. El ADN extraído de cada muestra se analizó mediante qPCR en un Bio-Rad CFX96 Real Time System (C1000 Touch Thermal Cycler) utilizando un conjunto de cebadores de ARNr 18s de Qiagen (Núm. de Cat. PPH05666E-200) y Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix (Núm. de Cat. 170-8882). Se utilizaron 5 pl de cada muestra y se generó el siguiente gráfico. Además, se preparó una dilución 1:10 del ADN aislado y también se amplificaron 5 pl de la dilución mediante qPCR.
Tabla 5
Estabilización de ácidos nucleicos libres en circulación sustancialmente libres de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes en una muestra de sangre a temperaturas ambientales utilizando las formulaciones de la Tabla 3. Rendimiento (pg/mL)
Tabla 6
Estabilización de ácidos nucleicos libres en circulación sustancialmente libres de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes en una muestra de sangre a temperaturas ambientales utilizando las formulaciones de la Tabla 3. Rendimiento (pg/mL)
Como se muestra en las Tablas 5 y 6, la adición de las formulaciones ilustrativas de la Tabla 3 a sangre humana dio como resultado la recuperación de ácidos nucleicos libres en circulación que permanecieron sustancialmente libres de ADN intracelular contaminante. El Día 0, la cantidad de ácidos nucleicos libres en circulación presentes en las muestras de prueba fue esencialmente idéntica a los controles y a otras muestras de prueba; sin embargo, el Día 8, la sangre almacenada a 4°C o temperatura ambiente mostró un aumento significativo del nivel de ácidos nucleicos libres en circulación mostrado por el mayor rendimiento en estas muestras de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes de células sanguíneas lisadas. Por el contrario, las formulaciones 1-10 mantuvieron los ácidos nucleicos libres en circulación sustancialmente libres de ácidos nucleicos intracelulares mostrando solo aumentos modestos el Día 8 y todas estas formulaciones se comportaron tan bien o mejor que las muestras no protegidas almacenadas durante 8 días a 4°C.
A menos que el contexto requiera lo contrario, a lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y variaciones de la misma, tales como "comprende" y "que comprende", que se utilizan indistintamente con "que incluye", "que contiene" o "se caracteriza por", es un lenguaje inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de método adicionales no citados. La frase "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación. La frase "que consiste esencialmente en "limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la invención reivindicada.
Claims (12)
1. Una formulación para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico se estabilizan en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después de su almacenamiento a temperatura ambiente durante un período de al menos cuatro días, en donde la formulación comprende:
(i) un tampón de pH;
(ii) un inhibidor de fosfatasa;
(iii) una purina;
(iv) un compuesto de ion híbrido, un compuesto catiónico o una combinación de los mismos; y
(v) un compuesto seleccionado entre:
(v.a) un inhibidor de la apoptosis o un inhibidor de caspasa; y/o
(v.b) un inhibidor de nucleasa;
y en donde dicha formulación no comprende un agente quelante, tal como EDTA.
2. La formulación de la Reivindicación 1, en donde el inhibidor de fosfatasa es 2-glicerol fosfato.
3. La formulación de las Reivindicaciones 1 o 2,
i) en donde el compuesto de ion híbrido es una sal interna cuaternaria, 2-(bencil(2-hidroxietil)(metil)amonio)acetato, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-3-amonio-propionato, o N-etil-piperidinio-4-butilsulfonato; o un compuesto de fórmula (I):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), en donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y Z es CO2-, SO3- u OPO3-; o
ii) donde el compuesto catiónico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un compuesto de fórmula (II):
en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; Z es CO2A, y X es un anión farmacéuticamente aceptable;
(b) un compuesto de fórmula (III):
en donde R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido, o R1 y R2 forman opcionalmente un anillo, Y es CH2 , CH(A), CH(A)-CH(A), CH(A)-CH(A)-CH(A), donde A es un alquilo, arilo, arilalquilo no sustituido o sustituido o cualquier cadena lateral que se encuentre típicamente en uno de los 20 aminoácidos naturales; y X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
(c) un compuesto de fórmula (IV):
en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente entre alquilo no sustituido o sustituido, arilo no sustituido o sustituido, arilalquilo no sustituido o sustituido; y X es un anión farmacéuticamente aceptable.
4. La formulación de la Reivindicación 3, en donde R1 y R2 de un compuesto de fórmula (I), fórmula (II) o fórmula (III) forman un anillo morfolino, un anillo pirrolidinio, un anillo piperidinio o un anillo oxazinio.
5. La formulación de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde
• el inhibidor de nucleasa es el ácido aurin tricarboxílico;
• la purina es adenina; y/o
• el inhibidor de caspasa es Q-VD-OPH.
6. La formulación de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente un agente seleccionado del grupo que consiste en un antibiótico, un derivado de purina y una combinación de los mismos.
7. La formulación de la Reivindicación 6, en donde
• el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, actinomicina D, 5-hidroxi-1,4-naftoquinona y una combinación de los mismos;
• el derivado de purina es 5-mercaptopurina.
8. La formulación de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico son una molécula de ADN libre en circulación.
9. Una composición de una o más moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas, purificadas, almacenadas de manera sustancialmente estable, que comprende una o más moléculas de ácido nucleico no desnaturalizadas, purificadas, mezcladas con una formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un método para el almacenamiento sustancialmente estable de una o más moléculas de ácido nucleico en un estado nativo no desnaturalizado en una muestra de sangre a temperaturas ambientales, que comprende: mezclar una muestra de sangre recolectada de un sujeto con una formulación de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde las una o más moléculas de ácido nucleico permanecen en un estado nativo no desnaturalizado sustancialmente libre de ácidos nucleicos intracelulares contaminantes después del almacenamiento a temperatura
ambiente durante un período de al menos tres días.
11. El método de la Reivindicación 10, en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, una enzima y una proteína sérica, un anticuerpo, una enzima, una proteína plasmática y una proteína sérica.
12. El método de una cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 11, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN libre en circulación.
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