CN102787156B - 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明利用碱性蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抗氧化肽，属于生物技术领域。一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：（1）牦牛乳酪蛋白溶解；（2）加碱性蛋白酶水解；（3）灭活碱性蛋白酶；（4）沉淀酪蛋白；（5）离心；（6）超滤；（8）喷雾干燥。本发明制备的抗氧化肽，肽分子量小，结构简单，抗氧化活性高，1mg/mL的反应体系清除1,1～二苯基～2～苦基苯肼54.53%，清除羟自由基49.46%。
Description
技术领域
本发明利用碱性蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抗氧化肽，属于生物技术领域。
背景技术
人体自由基的来源有两种，一是生物在氧化反应或其伴随的次反应中产生，二是空气污染、食物中的脂肪腐败、吸烟和紫外线作用与生物体产生。生物有自身的清除自由基防御系统。但自身的防御系统不足以清除自由基时，自由基会造成DNA损伤、细胞膜磷脂过氧化和低密度脂蛋白的改变，启动慢性疾病的发生。目前认为有70多种病与自由基有关，包括心脏病、动脉硬化、静脉炎、关节炎、过敏、白内障、老年痴呆、冠心病及癌症。
人们需要抗氧化剂去抵抗氧化应激反应，合成的抗氧化剂虽然高效、廉价，但由于有副作用，人们更青睐于选择天然的抗氧化剂。食物来源的抗氧化剂很多，人们从植物和动物源的蛋白中都获得了抗氧化肽。其中包括：花生、米糠、玉米、苜蓿、山药、豆奶、鱼类、蛋黄蛋白、酪蛋白等。
牦牛乳酪蛋白是以西北特有的资源曲拉为原料，通过提取纯化制备的蛋白质，是无限量添加的食品添加剂和营养强化剂。由于酪蛋白疏水性氨基酸含量高，蛋白质含量在90%以上，牦牛乳酪蛋白不易溶于水，溶于弱碱液。
活性肽是包含在完成蛋白质结构中的特定序列，只有通过水解后，才能释放出各种生理功能，这些肽主要含2～20个氨基酸残基，分子量小于6000Da。表现出阿片肽、矿物质吸收、免疫调节、抗微生物、抗血栓、降血脂、抗氧化、降血压等特性。
抗氧化肽的活性主要和肽的结构、组成和疏水性有关。其中酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、胱氨酸和组氨酸的存在对抗氧化肽的活性影响最大。除此外氨基酸在肽中的位置、蛋白的种类、水解酶的种类、肽的分子量和肽的含量都对抗氧化活性有影响。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法。用碱性蛋白酶水解酪蛋白制备抗氧化肽，实现了牦牛乳酪蛋白的深加工，缓解食物源抗氧化肽市场供应不足的问题，工艺简单，抗氧化活性高，适合工业化推广生产。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g～40g，加水500mL，调节反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司
（2）加碱性蛋白酶水解：吸取250μL～500μL酶液，维持反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，反应1～4小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4L FG；
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至80℃～100℃，维持15～30分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.1～4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：4000g～10000g离心力，离心5～30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）喷雾干燥：取步骤（6）中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
还包括有：在步骤（6）超滤后还包括有纳滤步骤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；然后进行喷雾干燥步骤：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
所选用的酶制剂为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种。
对以上方法得到的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽进行抗氧化活性测定：
DPPH(1,1～二苯基～2～苦基苯肼)自由基清除测定方法：其操作步骤如下：
①分别吸取1mL待测液（10mg/mL）和1mL DPPH的无水乙醇溶液（1×10～4mol/L）置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ai；
②分别吸取1mL待测液（10mg/mL）和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Aj；
③分别吸取DPPH和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ac。结果计算：
羟自由基清除测定方法：其操作步骤如下
①试剂配制：
7.5mmol/L邻二氮菲的配制：称取0.1487g邻二氮菲溶于100ml蒸馏水中。
PH7.4,0.75mol/L磷酸缓冲液的配制：称取磷酸氢二钠106.5g，溶于1000mL蒸馏水中，用酸度计调两者于PH7.4。
0.1%过氧化氢的配制：取0.1ml过氧化氢加入99.9ml蒸馏水中。
7.5mmol/L硫酸亚铁的配制：取0.114g硫酸亚铁溶于100ml蒸馏水中。
②测定方法：
取3个反应试管，分别标号AP、Ab和As，按照表1，分别加入反应溶液，每加一管后迅速摇匀，在37℃温浴1小时。待反应完全后在波长536nm处测定吸光度。
羟自由基(HO·)清除率(d)按下式计算：
d(％)=[As—Ap／Ab～Ap]×100。
表1反应体系表
本发明的有益效果：
1.本发明采用牦牛乳酪蛋白为原料，原料蛋白含量高，价格低，间接降低了生产成本；同时酶水解牦牛乳酪蛋白，产物溶解性好，易吸收，不但提高了牦牛乳酪蛋白的营养价值，而且赋予产品抗氧化活性。
2.食源牦牛乳酪蛋白抗氧化性肽，与合成抗氧化产品相比，安全性高，与大分子蛋白类抗氧化产品如超氧化物歧化酶先比，结构简单，分子量小，稳定性高，易于吸收。
3.操作工艺简单，绿色环保，生产成本低，适合工业化生产和推广。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白25g，加水500mL，调节反应温度55℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。
（2）加碱性蛋白酶：碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4L FG，吸取250μL酶液,维持反应反应温度55℃，pH8.0，反应2小时。
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至85℃，维持30分钟。
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出。
（5）离心：4000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽。
（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸。
（8）喷雾干燥：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽，得到干粉18.3g，得率73.2%。
（9）抗氧化肽活性测定，1mg/mL的反应体系，清除1,1～二苯基～2～苦基苯肼清除率为54.53%，对羟自由基的清除率为49.46%。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
关于实施例进行抗氧化活性测定：
DPPH(1,1～二苯基～2～苦基苯肼)自由基清除测定方法：其操作步骤如下：
①分别吸取1mL待测液（10mg/mL）和1mL DPPH的无水乙醇溶液（1×10～4mol/L）置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ai；
②分别吸取1mL待测液（10mg/mL）和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Aj；
③分别吸取DPPH和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ac。结果计算：
羟自由基清除测定方法：其操作步骤如下
①试剂配制：
7.5mmol/L邻二氮菲的配制：称取0.1487g邻二氮菲溶于100ml蒸馏水中。
PH7.4,0.75mol/L磷酸缓冲液的配制：称取磷酸氢二钠106.5g，溶于1000mL蒸馏水中，用酸度计调两者于PH7.4。
0.1%过氧化氢的配制：取0.1ml过氧化氢加入99.9ml蒸馏水中。
7.5mmol/L硫酸亚铁的配制：取0.114g硫酸亚铁溶于100ml蒸馏水中。
②测定方法：
取3个反应试管，分别标号AP、Ab和As，按照表1，分别加入反应溶液，每加一管后迅速摇匀，在37℃温浴1小时。待反应完全后在波长536nm处测定吸光度。
羟自由基(HO·)清除率(d)按下式计算：
d(％)=[As—Ap／Ab～Ap]×100。
表1反应体系表
实施例2：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白40g，加水500mL，调节反应温度40℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。
（2）加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司，产品酶活1:2500，称取0.4g酶液,维持反应反应温度40℃，pH8.0，反应2小时。
（3）灭活胰蛋白蛋白酶，升温至80℃，维持15分钟。
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出。
（5）离心：4000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽。
（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸。
（8）喷雾干燥：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽，得到干粉29.7g，得率74.25%。
（9）抗氧化肽活性测定，1mg/mL的反应体系，对1,1～二苯基～2～苦基苯肼清除率为48.25%，对羟自由基的清除率为47.41%。
实施例3：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g，加水500mL，调节反应温度55℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；
（2）加木瓜蛋白酶：木瓜蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司，酶活800000U/g，称取0.4g酶粉，维持反应温度50℃，pH7.0，反应2小时；
（3）灭活木瓜蛋白酶，升温至95℃，维持30分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：4000g离心力，离心10分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）喷雾干燥：取超滤透过液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。得到干粉15.3g，得率76.50%。
（8）抗氧化肽活性测定，1mg/mL的反应体系，清除1,1～二苯基～2～苦基苯肼清除率为37.44%，对羟自由基的清除率为33.27%。
实施例4：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：牦牛乳酪蛋白，购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级，称取牦牛乳酪蛋白20g，加水500mL，调节反应温度45℃，pH7.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；
（2）加中性蛋白酶：中性蛋白酶购自木瓜蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司，酶活100000U/g，食品级，称取0.2g酶液，维持反应温度45℃，pH7.0，反应4小时；
（3）灭活中性蛋白酶，升温至90℃，维持15分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸食品级，调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：4000g离心力，离心10分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）喷雾干燥：取超滤透过液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽，得到干粉10.04g，得率50.2%。
（8）抗氧化肽活性测定，1mg/mL的反应体系，清除1,1～二苯基～2～苦基苯肼清除率为17.15%，对羟自由基的清除率为12.45%。
实施例5：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g，加水500mL，调节反应温度30℃，pH7.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司
（2）加碱性蛋白酶水解：吸取250μL～500μL酶液，维持反应温度30℃，pH7.0，反应1小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4L FG；
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至80℃，维持15分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：4000g离心力，离心5分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）喷雾干燥：取步骤（6）中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
实施例6：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白40g，加水500mL，调节反应温度60℃，pH9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司
（2）加碱性蛋白酶水解：吸取500μL酶液，维持反应温度60℃，pH9.0，反应4小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4L FG；
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至100℃，维持30分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：10000g离心力，离心30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）喷雾干燥：取步骤（6）中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
实施例7：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白30g，加水500mL，调节反应温度45℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司
（2）加碱性蛋白酶水解：吸取350μL酶液，维持反应温度45℃，pH8.0，反应2.5小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4LFG；
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至90℃，维持25分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.3，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：7000g离心力，离心20分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）喷雾干燥：取步骤（6）中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
实施例8：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g，加水500mL，调节反应温度30℃，pH7.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司
（2）加碱性蛋白酶水解：吸取250μL酶液，维持反应温度30℃，pH7.0～9.0，反应1小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4LFG；
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至80℃，维持15；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：4000g离心力，离心5分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸
（8）喷雾干燥：取步骤（7）中收集回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
实施例9：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白40g，加水500mL，调节反应温度60℃，pH9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司
（2）加碱性蛋白酶水解：吸取500μL酶液，维持反应温度60℃，pH9.0，反应4小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4L FG；
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至100℃，维持30分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：10000g离心力，离心30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸
（8）喷雾干燥：取步骤（7）中收集回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
实施例10：（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g～40g，加水500mL，调节反应温度45℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司
（2）加碱性蛋白酶水解：吸取350μL酶液，维持反应温度45℃，pH8.0，反应2.5小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4LFG；
（3）灭活碱性蛋白酶，升温至90℃，维持20分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.3，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：7000g离心力，离心20分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸
（8）喷雾干燥：取步骤（7）中收集回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。
实施例11：与实施例5相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为木瓜蛋白酶。
实施例12：与实施例6相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为木瓜蛋白酶。
实施例13：与实施例7相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为木瓜蛋白酶。
实施例14：与实施例8相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为木瓜蛋白酶。
实施例15：与实施例9相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为木瓜蛋白酶。
实施例16：与实施例10相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为木瓜蛋白酶。
实施例17：与实施例5相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为胰蛋白酶。
实施例18：与实施例6相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为胰蛋白酶。
实施例19：与实施例7相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为胰蛋白酶。
实施例20：与实施例8相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为胰蛋白酶。
实施例21：与实施例9相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为胰蛋白酶。
实施例22：与实施例10相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为胰蛋白酶。
实施例23：与实施例5相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为中性蛋白酶。
实施例24：与实施例6相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为中性蛋白酶。
实施例25：与实施例7相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为中性蛋白酶。
实施例26：与实施例8相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为中性蛋白酶。
实施例27：与实施例9相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为中性蛋白酶。
实施例28：与实施例10相同，不同的是步骤（2）中使用的酶制剂为中性蛋白酶。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g～40g，加水500mL，调节反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；
（2）加酶制剂水解：吸取250μL～500μL酶液，维持反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，反应1～4小时；
（3）灭活所述的酶制剂，升温至80℃～100℃，维持15～30分钟；
（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.1～4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；
（5）离心：4000g～10000g离心力，离心5～30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；
（7）喷雾干燥：取步骤（6）中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽；
在步骤（6）超滤后还包括有纳滤步骤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；然后进行喷雾干燥步骤：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽；
所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；
所述的盐酸为食用级盐酸；
所述步骤（2）中所选用的酶制剂为碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或中性蛋白酶；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶。
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