CN104478988A - 一种非酶切的胶原肽段制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种可用于胶原蛋白的非酶切肽段的制备方法。属于生物技术领域。主要解决目前胶原蛋白酶法分解时对制品纯度的干扰问题，克服传统胶原肽段由于酶解造成对测试结果干扰或对生物材料制备纯化的影响。

Description

一种非酶切的胶原肽段制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于胶原蛋白的非酶切肽段的制备方法，制备的肽段可用于胶原分型、电泳和架桥分析，也可用于生物材料的制备。
背景技术
无论是在胶原蛋白一级结构分析中，还是在胶原类生物材料的制备中，由于反应定量性的限制或材料性质的特殊要求，常需要对胶原蛋白进行切断处理，传统方法一般是利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶解切断，但由于酶也是一种特殊的蛋白质，其作用完成后的残留即成为制品中的杂质，对后期的分析和使用都会带来干扰和纯化的困难。本发明则利用CNBr与蛋白质中蛋氨酸残基反应，生成含有甲基硫氰酸和带有高丝氨酸内酯的肽段(位于C末端)，以及结合在蛋氨酸残基C段的氨基酸残基(成为新的N末端)形成的肽段。而副产物主要包括甲基硫氰酸、溴化氢和过量的CNBr，这些副产物极易挥发，通过简单的冻干处理即可除去。这样形成的肽段有利于后期分析测试和材料制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白非酶切肽段的制备方法。其步骤如下：
1、取市售或自制胶原溶于1～50ml的50～80％(v/v)甲酸溶液中，通氮气5～20min除氧；
2、加入CNBr固体10～80mg或浓度为90～99％(w/v)CNBr的甲酸溶液(所用甲酸浓度与上步骤一致)10～150ml，再次通氮气1～5min；
3、密封容器中搅拌反应2～40小时，控制反应温度为4～35℃，反应后，加入2～15倍的去离子水稀释并冻干；
4、冻干样品再加2～15倍的去离子水稀释并冻干，可如此反复多次，直至过量反应物和副产物脱除干净；
5、样品分离：使用市售羧甲基纤维素或磷酸纤维素层析填料。起始缓冲液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠(PH2.0～4.5)缓冲液。洗脱缓冲液为0.10～0.33mol/L枸橼酸钠(PH2.0～4.5)缓冲液。柱清洗缓冲液为0.01～0.5mol/L NaOH缓冲液；
6、填柱温度为35～50℃，填柱缓冲液为柱清洗缓冲液，柱平衡用起始缓冲液进行，直至PH值达到2.0～4.5；
7、将冷冻干燥样品10～100mg溶解于2～200ml起始缓冲液中，30～50℃条件下加热处理8～20min后上柱，起始缓冲液与洗脱缓冲液梯度洗脱；
8、以226nm测定样品吸光度，分别收集峰I、峰II、峰III，冻干即为三个肽段。
具体实施方式
实施例一
取10mg市售或自制胶原溶于20ml的70％(v/v)甲酸溶液中，通氮气10min除氧。加入CNBr固体40mg，再次通氮气2min。密封容器中搅拌反应4小时，控制反应温度为30℃，反应完成后，加入8倍的去离子水稀释并冻干。冻干样品再加5倍的去离子水稀释并冻干，如此反复2次。使用市售羧甲基纤维素层析填料。起始缓冲液为0.02mol/L枸橼酸钠(PH3.6)缓冲液。洗脱缓冲液为0.18mol/L枸橼酸钠(PH3.6)缓冲液。柱清洗缓冲液为0.01mol/L NaOH缓冲液。填柱温度为45℃，填柱缓冲液为柱清洗缓冲液，柱平衡用起始缓冲液进行，直至PH值达到3.6。将冷冻干燥样品10mg溶解于2ml起始缓冲液中，50℃条件下加热处理10min后上柱，起始缓冲液与洗脱缓冲液梯度洗脱。以226nm测定样品吸光度，分别收集峰I、峰II、峰III，冻干即为三个肽段。
实施例二
取10mg市售或自制胶原溶于50ml的50％(v/v)甲酸溶液中，通氮气15min除氧。加入CNBr固体70mg，再次通氮气5min。密封容器中搅拌反应8小时，控制反应温度为10℃，反应完成后，加入10倍的去离子水稀释并冻干。冻干样品再加8倍的去离子水稀释并冻干，如此反复2次。使用市售磷酸纤维素层析填料。起始缓冲液为0.05mol/L枸橼酸钠(PH2.2)缓冲液。洗脱缓冲液为0.23mol/L枸橼酸钠(PH2.2)缓冲液。柱清洗缓冲液为0.1mol/L NaOH缓冲液。填柱温度为35℃，填柱缓冲液为柱清洗缓冲液，柱平衡用起始缓冲液进行，直至PH值达到2.2。将冷冻干燥样品10mg溶解于5ml起始缓冲液中，35℃条件下加热处理8min后上柱，起始缓冲液与洗脱缓冲液梯度洗脱。以226nm测定样品吸光度，分别收集峰I、峰II、峰III，冻干即为三个肽段。
实施例三
取100mg市售或自制胶原溶于50ml的80％(v/v)甲酸溶液中，通氮气20min除氧。加入浓度98％CNBr甲酸溶液90ml，再次通氮气3min。密封容器中搅拌反应18小时，控制反应温度为4℃，反应完成后，加入9倍的去离子水稀释并冻干。冻干样品再加2倍的去离子水稀释并冻干，如此反复1次。使用市售磷酸纤维素层析填料。起始缓冲液为0.01mol/L枸橼酸钠(PH4.5)缓冲液。洗脱缓冲液为0.17mol/L枸橼酸钠(PH4.5)缓冲液。柱清洗缓冲液为0.3mol/L NaOH缓冲液。填柱温度为50℃，填柱缓冲液为柱清洗缓冲液，柱平衡用起始缓冲液进行，直至PH值达到4.5。将冷冻干燥样品100mg溶解于100ml起始缓冲液中，40℃条件下加热处理15min后上柱，起始缓冲液与洗脱缓冲液梯度洗脱。以226nm测定样品吸光度，分别收集峰I、峰II、峰III，冻干即为三个肽段。

Claims (1)

1.一种用于胶原蛋白的非酶切肽段的制备方法，制备的肽段可用于胶原分型、电泳和架桥分析，也可用于生物材料的制备，其特征在于制备过程包括下列各步骤：
(1)取市售或自制胶原溶于1～50ml的50～80％(v/v)甲酸溶液中，通氮气5～20min除氧；
(2)加入CNBr固体10～80mg或浓度为90～99％(w/v)CNBr的甲酸溶液(所用甲酸浓度与上步骤一致)，再次通氮气1～5min；
(3)密封容器中搅拌反应2～40小时，控制反应温度为4～35。℃，反应完成后，加入2～15倍的去离子水稀释并冻干；
(4)冻干样品再加2～15倍的去离子水稀释并冻干，可如此反复多次，直至过量反应物和副产物脱除干净；
(5)样品分离：使用市售羧甲基纤维素或磷酸纤维素层析填料，起始缓冲液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠(PH2.0～4.5)缓冲液，洗脱缓冲液为0.10～0.33mol/L枸橼酸钠(PH2.0～4.5)缓冲液，柱清洗缓冲液为0.01～0.5mol/L NaOH缓冲液；
(6)填柱温度为35～50℃，填柱缓冲液为柱清洗缓冲液，柱平衡用起始缓冲液进行，直至PH值达到2.0～4.5；
(7)将冷冻干燥样品10～100mg溶解于2～200ml起始缓冲液中，30～50℃条件下加热处理8～20min后上柱，起始缓冲液与洗脱缓冲液梯度洗脱；
(8)以226nm测定吸光度，分别收集峰I、峰II、峰III，冻干即为三个肽段。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1379112A (zh) * 2001-12-21 2002-11-13 中国人民解放军第三军医大学 一种高效表达生产肽抗生素的方法
CN101275156A (zh) * 2008-05-09 2008-10-01 上海水产大学 胶原蛋白活性肽及其制备方法和用途

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