CN1379112A - 一种高效表达生产肽抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用DNA重组技术高效表达生产肽抗生素(Peptideantibiotics)的方法。还提供了一个可高效融合表达肽抗生素的承载蛋白(Carrier protein)序列,通过构建承载蛋白与肽抗生素的融合蛋白表达载体,转化微生物宿主细胞,培养转化细胞克隆并进行融合蛋白表达,表达的融合蛋白可占微生物宿主细胞总蛋白的40～45%。

Description

一种高效表达生产肽抗生素的方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及DNA重组技术高效表达肽抗生素及其融合体的方法。

细菌感染性疾病严重影响人类健康。人类对抗细菌感染的最有力武器是抗生素，传统的抗生素是由霉菌或放线菌产生的，故称为青霉素，链霉素，土霉素，卡那霉素等，霉菌或放线菌是寻找抗生素的传统领域，人类通过培养能产生抗生素的霉菌或放线菌来获得抗生素。但随着传统抗生素的广泛和长期使用，耐药菌株的不断出现给抗生素使用带来了极大的挑战，人类不得不断地去寻找新型抗生素(Sobel JD.Curr Infect Dis Rep，3(6)：546-549，2001)。

由于病原微生物对各种常规抗生素逐渐产生耐药性，并且由于耐药性的存在，临床上通过加大抗生素使用剂量来控制感染，抗生素对动物或人体的毒副作用也日益显现。因此，长期以来人们一直在不断开发新型抗生素，或将旧有的抗生素改造成耐药菌敏感的新一代抗生素，例如不断出现的新一代青霉素，新一代头孢类抗生素等。20世纪80年代以来的科学研究发现，昆虫、动物、植物和人体基因组中也存在编码能直接抑制或杀灭微生物的生物活性物质的基因，这些基因编码的产物为短肽，相对分子质量通常在1×10⁴以下，具有抗菌活性，称之为肽抗生素(peptide antibiotics)。1980年，Boman等人从美国天蚕蛹中分离得到了具有抗菌活性的肽抗生素——cecropins，并于次年在《Nature》上公布了其氨基酸序列；同在1980年，Lehrer等(Infect Immun，30：180-192，1980)从兔的巨噬细胞中分离到了另一种肽抗生素——defensins，并于3年后公布了其氨基酸序列。此后，人们相继从两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物、直至人类体内，发现了肽抗生素。目前发现，仅昆虫来源的肽抗生素，就达170余种(Welnberg A，et al.Crit Rev Oral Med，9(4)：399-414，1998)。

肽抗生素具有很强的抗菌活性，如纯化的小鼠mBD-3对D31株大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为16μg/ml，对PA01株铜绿假单胞菌之MIC为8μg/ml；通过基因工程重组的人HD-5对伤寒杆菌野生株的MIC仅为1μg/ml，对李斯特氏菌MIC为10μg/ml。肽抗生素除了具有抗细菌的活性外，还具有抗真菌的作用，如来源于蛙类的PGQ，dermaseptin和哺乳动物的defensins对能引起人类疾病的白色念珠菌具有杀伤作用，其中兔defensin NP-1对玉米的致病真菌也有作用。再者，肽抗生素可以杀灭寄生于人类或动物的寄生虫，如Shiva-I(一种昆虫肽抗生素cecropin的类似物)可以杀死疟原虫(Jaynes JM.et al，FASEB J.2：2878-2883，1989)。此外，肽抗生素还具有抗病毒和抗肿瘤的作用(Andreu D，etal.Biopolymers，47：413～33，1999)。

研究表明肽抗生素对热稳定，且不易引起细菌的耐药反应，故在医药及食品工业中有很好的应用前景。目前获得肽抗生素的方法主要有以下几种：

1、化学合成法  为了研究肽抗生素的活性、作用机制，许多天然肽抗生素及其类似物可通过固相合成的方法得到。例如，为了寻找具有更高抗菌活性或更广抗菌谱的肽抗生素，一些杂合肽相继被合成，如由cecropin和melititn的前13个氨基酸组成的杂合肽CN(1～13)MN(1～13)具有很强的抗菌活性而无溶血活性(Boman HG，et al.FEBS Letters，259：103～106，1989)。化学合成法可以方便地在合成过程中改变多肽的一级结构，加入特殊氨基酸，对多肽末端进行修饰，但是随着合成肽链的延长，昂贵的化学合成成本是限制该方法工业化应用的最大障碍。

2、基因工程法  利用基因工程的方法生产肽抗生素是降低生产成本的一条有效途径。真核表达系统的较低表达效率限制了其在工业化生产中的应用；而用原核表达系统生产肽抗生素又面临两大难题：一是肽抗生素本身对原核宿主细胞具有抑杀作用，难以通过构建工程菌直接生产；二是肽抗生素为短肽分子，分子量多在4000Da左右，目前用基因工程法生产这种小肽分子不稳定、产率低。为了克服肽抗生素对细菌细胞的毒性，人们采用融合表达。最早Jaynes于1989年在大肠杆菌中融合表达了Shiva-I基因；Piers等(Gene 134：7～13，1993)将defensin，HNP-1，cecropin/melittin杂合肽基因分别与4个不同的承载蛋白(Carrier protein)相融合，并在大肠杆菌中进行表达，结果表明不同的承载蛋白对肽抗生素的表达效率不同；Lee等(Biochemical and BiophysicalResearch，277：575-580，2000)将肽抗生素MSI-344融合于大肠杆菌截短的Purf承载蛋白上，结果使融合蛋白的表达产量提高到占细菌总蛋白的30％。由此可见，通过设计和筛选不同的承载蛋白分子，构建肽抗生素融合蛋白表达载体，转化微生物宿主细胞，既可实现肽抗生素在原核细胞中的稳定表达，还可进一步提高表达效率。

3、选择对肽抗生素具有抗性的株系进行原核表达

1993年，Maen等(Biosci Biotechnol Biochem，57：1206～1207，1993)利用链霉菌表达系统分泌表达了肽抗生素apidaecin的融合蛋白，裂解后得到了有活性的产物。

中国专利(专利号87106483)，公开了用东方诺卡氏菌株NRRL-18098，NRRL-18099和NRRL-18100生产新型糖肽抗生素A82846，包括A82846A，A82846B和A82846C的方法。

中国专利(专利号86105469)，通过培养新微生物Dolyangium brachysporum，制备了具有抗生素和抗肿瘤活性的结构式为新的肽抗生素。

这种通过筛选对肽抗生素具有抗性的株系，不仅工作量大，而且要筛选到高产率的株系更加困难。

因而，探索和研究既经济又能高效生产肽抗生素的方法具有现实意义。

本发明的发明人致力于解决肽抗生素生产过程中的低产率和高成本问题，成功地通过DNA重组技术实现了肽抗生素在原核微生物宿主细胞中的高效表达，从而大量生产肽抗生素。

本发明涉及的高效表达生产肽抗生素的方法包括以下步骤：(1)设计一个编码承载蛋白(carrier protein)的DNA序列，并克隆该DNA序列；(2)构建含有承载蛋白编码序列的表达载体，使这段编码序列处于表达载体启动子的控制之下；(3)将构建了承载蛋白编码序列的表达载体转化微生物宿主细胞，筛选并鉴定阳性重组子；(4))克隆编码肽抗生素(peptide antibiotics)的基因，将之插入到上述表达载体，使肽抗生素的编码产物处于承载蛋白的羧基端，使两者成为一个融合基因，处于表达载体启动子的控制之下；(5)将含融合基因的表达载体转化微生物宿主细胞；(6)培养含上述融合基因表达载体的微生物细胞并进行融合蛋白表达；(7)收集表达产物，纯化肽抗生素。

根据本发明这一方面的一个优选实验方案，所述的承载蛋白为一弱酸性多肽，该弱酸性多肽的长度不受严格限制，但应长于要表达的肽抗生素，且承载蛋白之负电荷可以有效中和肽抗生素的正电荷，以利于肽抗生素在原核细胞中的高效、稳定表达。

在本发明这方面的另一个优选实验方案中，设计的适用于高效表达肽抗生素的承载蛋白符合以下原则：(1)鉴于肽抗生素的分子量多在4000道尔顿(Da)左右，系小分子多肽，故承载蛋白分子要大于目的肽分子2倍以上，便于获得稳定的表达及在生产过程中利用层析方法分离承载蛋白和目的肽。(2)设计中使承载蛋白的等电点远离要表达的目的肽抗生素等电点，如设计承载蛋白的等电点pI在5.0-6.5之间，则该承载蛋白在中性(pH7.0)条件下带负电荷，可有效中和肽抗生素的正电荷，从而使融合蛋白的等电点趋于中性，便于其在宿主菌体内稳定存在，以及在随后的纯化过程中利用离子交换层析分离承载蛋白和目标肽。(3)设计中要使承载蛋白的亲水性好，以使融合蛋白有更好的水溶性，便于随后的蛋白复性、纯化等操作。(4)在承载蛋白与目的肽的连接处加上适当的蛋白酶酶切或化学裂解位点，以便在产物纯化阶段能方便地切割和分离出目的肽。例如，要用化学试剂CNBr(识别位点为蛋氨酸)作为裂解融合蛋白的方法，则除了要生产的目的肽分子内不能含蛋氨酸外，在承载蛋白的分子内也不能有(起始密码子编码的蛋氨酸除外)，只能在承载蛋白与肽抗生素的连接处含有一个唯一的蛋氨酸。

根据本发明这一方面的另一个优选的实验方案，承载蛋白的编码序列可以用合成法或用分子生物学方法克隆获得。对于一个符合上述设计原则而在现有的DNA序列库(如GenBank)中不存在的承载蛋白编码序列而言，化学合成法是很好的选择，利用合成法可以方便地加入特定的识别位点；而对于一个用上述设计原则从已知序列库中筛选出的承载蛋白编码序列而言，在编码序列较长及易于获得承载蛋白编码序列所在的DNA模板时，用分子生物学方法克隆为好，例如，用PCR方法扩增获得。利用PCR的引物设计可方便地在承载蛋白编码序列的3’-端加上一蛋白酶或化学裂解剂位点的编码序列。例如，在承载蛋白序列的3’-端加上CNBr识别位点蛋氨酸的编码序列ATG。

根据本发明这一方面的另一个优选实验方案，承载蛋白与目的肽之间的蛋白酶或化学裂解剂识别位点除上述方法中加在所设计的承载蛋白的羧基端外，还可以在克隆目的肽编码基因时加在目标肽的氨基端。例如，在克隆肽抗生素编码基因时在其5’-端加入CNBr的识别位点ATG。

在本发明的另一个优选的实验方案中，用于构建承载蛋白编码序列或承载蛋白与目的肽抗生素融合基因的表达载体选自pinponint Xa-3、pET-16、pQE-32、pFAST Hta、pYEAST-2。

在本发明的另一个优选的实验方案中，将承载蛋白的编码序列克隆进表达载体时可以采用直接连接到载体(阅读框正确)或通过一个Linker连接，以保证阅读框的正确。这是本领域的技术人员所熟悉的。

根据本发明这一方面的另一个优选的实验方案，融合蛋白的羧基端为肽抗生素，该肽抗生素编码基因可以单拷贝存在，也可以多拷贝串联存在，在各拷贝间含有与承载蛋白和肽抗生素间相同的蛋白酶或化学裂解剂的识别位点的编码序列，这样在表达的一个融合蛋白分子中可以切割出多个目的肽抗生素分子，提高生产效率。

在本发明这一方面的这一个优选的实验方案中，所说的单拷贝或多拷贝肽抗生素基因可以用合成法或用分子生物学方法获得。

在本发明的另一个优选的实验方案中，将目的肽抗生素基因插入已含承载蛋白编码序列的表达载体构建融合基因时，目的基因可以直接连接到承载蛋白序列的下游(阅读框正确)或通过一个Linker连接，以保证阅读框的正确。

根据本发明这一方面的另一个优选的实验方案，将构建好的含承载蛋白与目的肽抗生素融合基因的表达载体转化入微生物宿主细胞，例如大肠杆菌。培养所说的含融合基因表达载体的宿主细胞，表达融合蛋白，进一步用蛋白酶或化学裂解剂，例如CNBr处理融合蛋白，分离承载蛋白和肽抗生素。当设计了肽抗生素的多拷贝序列时则在融合蛋白裂解的同时被分割成单体。最后用离子交换柱或凝胶层析纯化目标肽抗生素。

附图说明：附图1  承载蛋白编码序列合成示意图。附图2  承载蛋白表达载体的构建示意图。附图3  肽抗生素融合蛋白表达载体构建示意图。附图4  融合蛋白表达的SDS-PAGE分析。如图中所示，左起第一泳道为低分子量蛋白Mrker，从上至下各条带代表的分子量大小分别为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kDa；第二泳道为正常JM109株大肠杆菌；第三泳道为转化了含承载蛋白编码序列表达载体的JM109株大肠杆菌；第四、五、六泳道分别为转化了含承载蛋白和肽抗生素rBD-1、mBD-1及hNP-4融合蛋白基因表达载体的JM109株大肠杆菌，箭头所示的为融合蛋白，经凝胶扫描仪分析，rBD-1融合蛋白占细菌总蛋白的比例为42.4％、mBD-1融合蛋白占40.7％、hNP-4融合蛋白占45％。

本发明将通过下列实例作进一步说明，但不是以此来限制本发明。实例1：承载蛋白的设计及其同源序列检索。

根据上述承载蛋白的设计原则，利用DNAStar软件包的Editseq和Protean软件设计一489bp的承载蛋白编码序列(序列编号7)，该序列编码163个氨基酸组成的承载蛋白(序列编号8)，分子量17668.80Da，等电点为5.621，含103个亲水性氨基酸，60个疏水性氨基酸，用Protean软件观察，承载蛋白的亲水性良好。

将设计的序列编号7送入GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)序列库用blastn进行DNA同源序列检索，结果检索到8段均为19bp的序列与序列编号7有同源性，检索结果附后。Distribution of 8 Blast Hits on the Query Sequence

                                                           Score    ESequences producing significant alignments：                   (bits) Valuegi|15292278|gb|AY051984.1|Drosophila melanogaster LD45365...      38  7.1gi|14280141|gb|AC008004.5|AC008004 Drosophila melanogaster，...   38  7.1gi|13270541|gb|AC007697.5|AC007697 Drosophila melanogaster，...   38  7.1gi|6679091|ref|NM_008714.1| Mus musculus Notch gene homolog...    38  7.1gi|10727480|gb|AE003802.2|AE003802 Drosophila melanogaster...     38  7.1gi|7141240|gb|AF220364.1|AF220364 Drosophila melanogaster P...    38  7.1gi|13488747|dbj|AP000639.4|AP000639 Homo sapiens genomic DN...    38  7.1gi|288502|emb|Z11886.1|MMNOTCHA M.musculus notch-1 mRNA           38  7.1Alignments＞gi|15292278|gb|AY051984.1|Drosophila melanogaster LD45365 full length cDNA

        Length＝3149Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery：107    tgtagctgcatctaatgat 125

          |||||||||||||||||||Sbjct：2361   tgtagctgcatctaatgat 2343＞gi|14280141|gb|AC008004.5|AC008004 Drosophila melanogaster，chromosome 2R，region54B-54C，BAC clone，BACR21A09，complete sequence

      Length＝175506Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery：107    tgtagctgcatctaatgat 125

          |||||||||||||||||||Sbjct：162991 tgtagctgcatctaatgat 162973＞gi|13270541|gb|AC007697.5|AC007697 Drosophila melanogaster，chromosome 2R，region54D4-54E7，BAC clone，BACR12C23，complete sequence

       Length＝194897Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery：107   tgtagctgcatctaatgat 125

         |||||||||||||||||||Sbjct：19971 tgtagctgcatctaatgat 19953＞gi|6679091|ref|NM_008714.1|Mus musculus Notch gene homolog 1，(Drosophila)(Notch1)，mRNA

        Length＝8064Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝22/23(95％)Strand＝Plus/MinusQuery：94   gagtggtaagttctgtagctgca 116

        |||||||||||||||  ||||||Sbjct：7221 gagtggtaagttctgtggctgca 7199＞gi|10727480|gb|AE003802.2|AE003802 Drosophila melanogaster genomic scaffold142000013386047 section 41 of 52，complete sequence

      Length＝262395Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery：107   tgtagctgcatctaatgat 125

         |||||||||||||||||||Sbjct：32424 tgtagctgcatctaatgat 32406＞gi|7141240|gb|AF220364.1|AF220364 Drosophila melanogaster Plenty of SH3s(POSH)mRNA，complete cds，Length＝3123Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery：107  tgtagctgcatctaatgat 125

        |||||||||||||||||||Sbjct：2362 tgtagctgcatctaatgat 2344＞gi|13488747|dbj|AP000639.4|AP000639 Homo sapiens genomic DNA，chromosome 11q，clone：CMB9-26D11，complete sequences，Length＝103758Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery：69    gactatgagagaatttggg 87

         |||||||||||||||||||Sbjct：40122 gactatgagagaatttggg 40104＞gi|288502|emb|Z11886.1|MMNOTCHA M.musculus notch-1 mRNA

        Length＝8064Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝22/23(95％)Strand＝Plus/MinusQuery：94   gagtggtaagttctgtagctgca 116

        |||||||||||||||| ||||||Sbjct：7221 gagtggtaagttctgtggctgca 7199Database：All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase 0，1or 2 HTGS sequences).Posted date：Nov 28，2001 3：39AMNumber of letters in database：60,694,059Number of sequences in database：1,029,146实例2承载蛋白编码序列的合成

根据实例1设计的承载蛋白编码序列及其DNA同源性检测结果，表明序列编号7为目前GenBank序列库中没有收录的新序列。由于目前的合成法尚无法一次性合成长度达489bp的DNA序列，故为获得所设计的序列，我们将序列编号7分成5段来合成，这5段寡核苷酸序列分别称为序列编号1、2、3、4和5，简称Seq1～5，相邻序列的3’-端或5’-端有15bp的互补序列，其中序列编号1的5’-端除3个保护性碱基(ccg)及一个SmaI限制性酶切位点(cccggg)外，其余序列与序列编号7的5’-端相同；序列编号2和序列编号4与序列编号7的对应序列反向互补；序列编号3与序列编号7的对应序列相同；序列编号5除3’-端有一KpnI酶切位点(ggtacc)及3个保护碱基(gcg)外，其余序列与序列编号7的3’-端相同，各寡核苷酸的对应关系见附图1。

为用引物延伸法(Lee JH，et al.Geneticanalysis：biomolecularengineering，13：139-145，1996)生成承载蛋白编码序列(序列编号7)，则还需合成一条与序列编号5的3’-端互补的引物P(序列编号6)。

将合成的5段寡核苷酸(Seq1～5)和引物P分别溶解于pH8.0的TE缓冲液中，取等摩尔各寡核苷酸分子混合，加水至14μl，70℃温育5分钟，加2μl 10×Klenow buffer，降温至50℃并保持60分钟(退火)，再加2μl 4×dNTP，5μl Klenow酶，30℃3小时，继续补加T4 DNA连接酶2μl，22℃2小时，最后加2μl 0.5M EDTA终止反应，获得承载蛋白编码序列。实例3：承载蛋白表达载体的构建

将表达质粒pQE-32用BamHI酶切后用大肠杆菌Klenow酶补平，回收线性化产物，再用KpnI酶切，回收备用。

用SmaI和KpnI酶切实例2所生成的承载蛋白编码序列、回收，进一步将酶切产物与线性化的pQE-32质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子，其构建策略见附图2，将阳性重组子命名为pQE-CP。实例4：肽抗生素基因的准备

为利用所设计的承载蛋白来表达肽抗生素，合成了小鼠肽抗生素mBD-1(序列编号9，Bals R，et al.Infect Immuno 16：1225-32；1998)的成熟肽基因(序列编号10)，在该肽抗生素基因的5’-端加有平端EheI酶切位点及一个蛋氨酸的编码子ATG，在3’-端加有粘端HindIII酶切位点及终止密码子TGA。

将合成的两段寡核苷酸(3’-端有20bp的互补序列)溶解于pH8.0的TE缓冲液中，利用实例3所述的引物延伸法生成mBD-1全基因。

为进一步证实所设计的承载蛋白在高效表达肽抗生素分子中的作用，我们用上述同样的方法合成了大鼠肽抗生素rBD-1(序列编号11)的成熟肽(序列编号12)编码序列以及人肽抗生素hNP-4(序列编号13)的成熟肽(序列编号14)编码序列。实例5：肽抗生素融合蛋白表达载体的构建

为构建融合蛋白表达载体，分别将合成的肽抗生素rBD-1，mBD-1和hNP-4之成熟肽基因插入实例3所构建表达载体之承载蛋白的C-端，并确保阅读框的正确。

以构建小鼠mBD-1融合蛋白表达载体为例，先将阳性重组子pQE-CP(实例3)分别用SmaI和HindIII酶切，合成的小鼠mBD-1成熟肽基因(实例4)则分别用EheI和HindIII酶切，回收两组酶切产物并用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子。融合蛋白表达载体的构建策略见附图3，并将筛选到的阳性重组子命名为pQE-CM。实例6：肽抗生素的表达

为利用实例5构建的表达载体表达承载蛋白与肽抗生素的融合蛋白，将质粒pQE-CM纯化后转化JM109大肠杆菌，挑取具有氨苄青霉素(AMP)抗性菌落，扩大培养于2ml含100μg/ml AMP的LB培养基中，37℃培养过夜(16-18小时)，次日取50μl过夜菌培养于5ml LB培养基中(1％，V/V)，37℃振荡培养至OD600为0.5～0.6时，加IPTG(终浓度为1mM/L)诱导培养4小时，用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达情况(见附图4)，融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的40～45％。

以上这些实例展示了本发明的实际应用，这些技术也是本领域的技术人员所熟悉的。正如上所述，本发明设计了一个承载蛋白编码序列，提供了含该承载蛋白编码序列的表达载体，利用该表达载体可进行肽抗生素的高效表达生产，生产的融合蛋白占菌体总蛋白的40～45％。由此可见，本发明通过将肽抗生素融合到所设计的承载蛋白分子上，从而将肽抗生素对原核微生物宿主细胞的毒性降到最低限度，实现了肽抗生素的高效表达；此外，本发明设计的承载蛋白也适用于表达其它具有生物学活性的短肽。

本发明有关的序列表：1、为合成序列编号7所设计的5段寡核苷酸及引物P5’-ccgcccgggctcctatctaagagcctagaggatcatgaggcgggggtatgccctttgggctgcccctactgcttagctgactatgagagaatttggggtgtacgagtggtaagttctgt-3’  (序列编号1，简称Seq1)5’-tcgaagatgattccaacatccaccttgcccttatcgagcttagcccccggatctcctgctttgattccattgggatccacctctaccttatcattagatgcagctacagaacttaccact-3’(序列编号2，简称Seq2)5’-tggaatcatcttcgaagcgttcccgagagctctttatgcggtggcacaagttgctaacttcggagcaagcaaatatagtcgcgggggttggaggttcgtcgagaacggaatacagcgata-3’(序列编号3，简称Seq3)5’-gctagggcgttccaaacttcgtgataccggtggggtaaactactttgggggtccaaaacctcacccttgtgtcgctcaaggaggtgtcgtccgaaggcagcatcatatcgctgtattccg-3’(序列编号4，简称Seq4)5’-ttggaacgccctagcagccctagagctggtaatccaacaagaggagggttctaatggaacttctactggatccga

gggcggtaccgcg-3’(序列编号5，简称Seq5)5’-cgcggtaccgccctcg-3’(序列编号6，简称引物P)2、本发明设计的承载蛋白编码序列(489bp)ctcctatctaagagcctagaggatcatgaggcgggggtatgccctttgggctgcccctactgcttagctgactatgagagaatttggggtgtacgagtggtaagttctgtagctgcatctaatgataaggtagaggtggatcccaatggaatcaaagcaggagatccgggggctaagctcgataagggcaaggtggatgttggaatcatcttcgaagcgttcccgagagctctttatgcggtggcacaagttgctaacttcggagcaagcaaatatagtcgcgggggttggaggttcgtcgagaacggaatacagcgatatgatgctgccttcggacgacacctccttgagcgacacaagggtgaggttttggacccccaaagtagtttaccccaccggtatcacgaagtttggaacgccctagcagccctagagctggtaatccaacaagaggagggttctaatggaacttctactggatccgagggc(序列编号7)3、承载蛋白的氨基酸序列LLSKSLEDHEAGVCPLGCPYCLADYERIWGVRVVSSVAASNDKVEVDPNGIKAGDPGAKLDKGKVDVGIIFEAFPRALYAVAQVANFGASKYSRGGWRFVENGIQRYDAAFGRHLLERHKGEVLDPQSSLPHRYHEVWNALAALELVIQQEEGSNGTSTGSEG(序列编号8)4、小鼠肽抗生素mBD-1基因序列atgaaaactcattactttctcctggtgatgatatgttttcttttctcccagatggagccaggtgttggcattctcacaagtcttggacgaagaacagatcaatacaaatgccttcaacatggaggattctgtctccgctccagctgcccatctaataccaaactacagggaacctgtaaaccagataagcccaactgttgtaagagctgacagtag(序列编号9)5、小鼠肽抗生素mBD-1成熟肽序列GILTSLGRRTDQYKCLQHGGFCLRSSCPSNTKLQGTCKPDKPNCCKS(序列编号10)6、大鼠肽抗生素rBD-1基因序列atgaaaac tcattacttt ctcctggtga tgttattttt tctcttctcc cagatggagc tgggtgctgg cattctcacaagtcttggac gcagaacaga tcaataccga tgcctccaaa atggaggatt ctgtctccgc  tccagctgcccatctcatac caaactacaa ggaacatgta aaccagataa gcccaactgt tgcaggagtt ga(序列编号11)7、大鼠肽抗生素rBD-1成熟肽序列TDQYRCLQNGGFCLRSSCPSHTKLQGTCKPDKPNCCRS(序列编号12)8、人肽抗生素hNP-4基因序列atgaggatt atcgccctcc tcgctgctat tctcttggta gccctccagg tccgggcagg cccactccaggcaagaggtg atgaggctcc aggccaggag cagcgtgggc cagaagacca ggacatatct atttcctttgcatgggataa aagctctgct cttcaggttt caggctcaac aaggggcatg gtctgctctt gcagattagtattctgccgg cgaacagaac ttcgtgttgg gaactgcctc attggtggtg tgagtttcac atactgctgcacgcgtgtcg attaa(序列编号13)9、人肽抗生素hNP-4成熟肽序列VCSCRLVFCRRTELRVGNCLIGGVSFTYCCTRVD(序列编号14)

Claims (7)

1.一种高效表达生产肽抗生素的方法，其具体步骤为：

(a)设计并克隆一个承载蛋白(carrier protein)编码序列；

(b)将(a)所述的承载蛋白序列插入一表达载体，使该基因处于表达载体启动子的控制之下；

(c)将(b)所述的构建了承载蛋白的表达载体转化微生物宿主细胞，筛选并鉴定阳性重组子；

(d)克隆准备生产的肽抗生素(peptide antibiotics)编码基因；

(e)将(d)所述的肽抗生素编码基因插入(c)所述的阳性重组子中，使肽抗生素位于承载蛋白的羧基端，并与承载蛋白编码序列融合成为一个融合基因；

(f)将(e)所述的构建了融合基因的表达载体转化微生物宿主细胞，筛选并鉴定阳性细胞克隆；

(g)培养(f)所述的阳性微生物细胞克隆并进行融合蛋白表达；

(h)收集表达产物，纯化肽抗生素。

2.如权利要求1所述的承载蛋白，其特征在于，它为一段弱酸性多肽，等电点(pI)为5.621，分子量为17668.80Da；

3.如权利要求1和2所述承载蛋白，其特征在于，它为一段不含蛋氨酸的多肽。

4.如权利要求1所述的承载蛋白的编码序列，其特征在于，该序列编码具有权利要求2和3所述的多肽。

5.一种表达载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的承载蛋白编码序列或承载蛋白与肽抗生素的融合基因。该载体选自下组中的一组：

(a)含权利要求1所述承载蛋白编码序列或承载蛋白与肽抗生素融合基因的pinponint Xa-3；

(b)含权利要求1所述承载蛋白编码序列或承载蛋白与肽抗生素融合基因的pET-16；

(c)含权利要求1所述承载蛋白编码序列或承载蛋白与肽抗生素融合基因的pQE-32；

(d)含权利要求1所述承载蛋白编码序列或承载蛋白与肽抗生素融合基因的pFAST HTa；

(e)含权利要求1所述承载蛋白编码序列或承载蛋白与肽抗生素融合基因的pYEAST-2。

6.如权利要求1所述的承载蛋白与肽抗生素之融合基因，它包含至少一个裂解位点，以利于用蛋白酶或化学裂解剂裂解融合基因编码的融合蛋白。

7.一种遗传工程化的微生物宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种微生物细胞：

(a)用权利要求5所述的载体转化或转导的微生物细胞；

(b)用权利要求1所述的融合基因转化或转导的宿主细胞。

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