CN100463918C - 新型表皮生长因子蛋白和基因及其使用方法 - Google Patents
新型表皮生长因子蛋白和基因及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了对蛋白质水解具有抗性的各种类型的表皮生长因子。本发明还提供了编码这些表皮生长因子的基因序列,所述基因序列中包含适用于工业生产物种的最佳密码子。
Description
技术领域
本发明涉及表皮生长因子(epidermal growth factor,简称为EGF)蛋白质序列,与正常的人EGF相比,该蛋白质序列对蛋白质水解的抗性提高,而且在功能上与之相当。本发明还涉及基因序列,该基因序列中采用了适用于工业生产物种(industrialproduction organism)的最佳密码子。
背景技术
野生型全长人表皮生长因子(EGF,参见SEQ ID NO:1)是一个由53个氨基酸构成的蛋白质,其分子量为6217道尔顿,并且具有多种生物学功能(Karnes,W.,Epidermal growth factor andtransforming growth factor alpha,1994,Raven Press,New York)。已经报道了多种对C端氨基酸序列进行的修饰,这类修饰有的是来自重组DNA基因工程研究所构建的突变型,有的则是在从自然界分离到的EGF中观察到的。EGF对内源和外源的蛋白酶都很敏感。已经观察到由唾液腺分泌并被吞咽下去的EGF在胃内受到了蛋白水解酶的攻击,而且对于血液中的EGF也观察到了这种现象(Araki et al.,Chem.Pharm.Bull.37(2),404-406,1989;Playford et al.,Gastronenterology,108,92-101,1996)。
与链长等于或大于47个氨基酸的EGF相比,长度等于或小于46个氨基酸的EGF基本上丧失了其生物学活性。关于链长对生物学功能,例如对抗体的亲和力以及EGF在体内的清除速率,的确切影响方面有相互矛盾的数据。长度为47、48以及51个氨基酸的EGF(称为"EGF47","EGF48"等)可以抑制胃酸分泌(美国专利号3,917,824),例如,人EGF47与EGF53在抑制胃酸分泌方面具有同样的能力,但是该蛋白质仅保留了刺激成纤维细胞生长的能力(mitogenic activity;Hollenberg et al.,MolecularPharmacology 17,314-320,1980;Gregory et al.,Regulator Peptides22,217-226,1988)的约十分之一。正如这些参考文献中所表明的,在某一项生物学活性上表现出较高生物学活性的组合物(composition),并不意味着在所有生物学活性的量上都相当于全长组合物。
在抑制胃酸分泌和刺激细胞增殖方面,EGF52的活性相当于EGF53。如果链长小于48个氨基酸,小鼠EGF的促有丝分裂活性(mitogenic activity)将大部分丧失(Burgess et al.,Biochemistry 27,4977-4985,1988)。此外,hEGF51和EGF53表现出了相似的药代动力学(Kuo et al.,Drug Metabolism andDisposition 20,23-30,1992)。除了保留了免疫抑制活性以外(Koch et al.,J.Molecular Biochemistry 25,45-59,1984),EGF51与EGF53具有相似的活性(Calnan et al.,Gut 47,622-627,2000)。据报道,EGF48在蛋白质降解方面很稳定,并且保留了生物学活性(美国专利号5,434,135;Kuo et al.op.cit;Sizemore et al.Peptides17,1229-1236,1996)。但是,EGF48的活性比EGF53要明显低得多(Goodlad et al.,Clinical Science,91,503-507,1996)。
从N端将EGF缩短达5个氨基酸时,并未影响EGF中二硫键的正确形成及其生物学活性(Shin,S.et al.,Peptides 16,205-210,1995;DiAugustine et al.,Analytical Biochemistry 165,420-429,1987)。21号位点上甲硫氨酸残基的氧化并未影响由酵母生产出来的重组EGF的生物学活性(George-Nascimento et al.Biochemistry,27,797-802)。
在生产过程中,重组EGF会受到微生物蛋白酶的降解。由于发酵过程中蛋白酶的作用,在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中生产的重组EGF53被降解成长度为52个氨基酸的序列,然后被降解成长度为51个氨基酸的序列(George-Nascimento,Biochemistry,27,797-802,1988)。通过毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)生产的EGF被降解为含有48个氨基酸的形式,该降解产物很稳定,并且保留了较高的生物学活性(美国专利号5,102,789)。类似地,通过毕赤巴斯德酵母生产并分泌的小鼠EGF在发酵过程中被部分地降解为长度为51个氨基酸的序列(Clare et al.,Gene 105,205-212,1991)。
对这些数据的比较使人们在如下方面产生了一些问题,例如不同形式的EGF对蛋白质水解作用的敏感性,以及这些不同形式的EGF的长度和几种不同生物学活性的程度之间的关系。生物学活性是由一个受体家族所介导的,而该受体家族可以被不同地表达(differently expressed),也就是具有组织特异性,因此对于经修饰的EGF而言,任何相关的生物学活性都必须就该项活性进行测试,以确认其功能水平,因为一项生物学活性的水平不一定能从就另一项生物学活性所进行的试验所获得的数据中预见到。
已经表明,EGF和EGF受体配基例如TGFα可以用于治疗糖尿病(Nardi et al.,美国专利号5,885,956,1999年3月23日授权;Nardi et al.,美国专利号6,288,301,2001年9月11日授权)。糖尿病已经在美国和其他地区达到了流行的比例。
人们希望获得对蛋白质水解作用较为稳定的EGF蛋白质,这种EGF蛋白质要在安全、方便的生产物种中以单一分子种类的形式并且以较高的产率生产出来,其组成和纯度要能够重复,并且要符合批准药物时对组成和纯度的要求,而且这种EGF蛋白质要基本保留其生物学活性以用于此类治疗目的。
发明内容
本发明提供了一种组合物,其中包含长度为X的氨基酸序列,X为不小于48并且不大于53的整数,该序列(i)与SEQ IDNO:1的1号位点至X-1号位点之间的部分基本同源(substantiallyhomologous),并且(ii)在第X号位点上的氨基酸残基不同于SEQ ID NO:1中相应的氨基酸残基。例如,根据一个相关的实施方式,第X号位点上的氨基酸残基是天门冬酰胺。而且X是第51号位点。与SEQ ID NO:1相比,所述组合物对蛋白质水解的抗性提高。生物学活性至少为SEQ ID NO:1的75%,例如,生物学活性至少为SEQ ID NO:1的90%。所述生物学活性选自由如下成员所构成的组:致有丝分裂(mitogenesis)、细胞保护(cytoprotection)、抑制酸分泌、组织前体细胞的生长、组织前体细胞的分化以及组织前体细胞的生长和分化。致有丝分裂作用是通过该氨基酸序列对上皮细胞有丝分裂速度的影响而确定的。酸分泌是在胃瘘管动物(gastric fistulated animal)中确定的。分化是通过胰岛再生或粘膜细胞的形成而确定的。
根据相关的实施方式,X是疏水氨基酸,X是中性氨基酸,或者X是带电氨基酸。在一个相关的实施方式中,当X是中性氨基酸时,X可以从谷氨酰胺、丙氨酸以及丝氨酸中进行选择。
本发明另一方面提供了一种组合物,其中包含与SEQ ID NO:1基本同源的氨基酸序列,其中SEQ ID NO:1第51号位点上的氨基酸残基是除谷氨酸以外的氨基酸。所述组合物的生物学活性至少为SEQ ID NO:1的50%。例如,所述组合物的生物学活性至少为SEO ID NO:1的75%;例如,所述组合物的生物学活性至少为SEQ ID NO:1的90%。所述组合物的生物学活性基本相当于SEQ ID NO:1。根据一个相关的实施方式,在1至50号位点上的氨基酸残基至少有75%与SEQ ID NO:1的相应部分相同。
本发明另一方面提供了一种组合物,其中包含选自由SEQ IDNOs:2、3、4所构成的组的氨基酸序列。例如,在本发明的一种实施方式中提供了一种如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列组合物。此外,在本发明的另外一种实施方式中提供了一种长度为51个氨基酸的多肽,其中第1至50号残基与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列基本同源,并且第51号残基是天门冬酰胺残基。与SEQ ID NO:1相比,所述多肽对蛋白质水解的抗性提高。
在本发明的一个相关实施方式中提供了一种多肽,其中,第1至50号残基中至少有一个残基是SEQ ID NO:1所示序列中的氨基酸的保守取代(conservative substitution)。在一个相关实施方式中,所述多肽中还包含至少一个残基的删除,所述残基选自SEQ ID NO:1中所示的第1至5号位点。与SEQ ID NO:1中所示的人EGF相比,所述多肽具有至少50%的生物学活性。
本发明另一方面提供了一种组合物,其中包含人表皮生长因子(EGF),其氨基酸序列至少与SEQ ID NO:1中所示的第1至47号位点的氨基酸序列基本同源,并且EGF羧基端的第48至53号位点上至少有一个氨基酸的替换,所述氨基酸序列对蛋白质水解的抗性比SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列更强。在一个相关的实施方式中,第1至50号残基的氨基酸序列基本如SEQ IDNO:1所示,并且第51号残基是除谷氨酸以外的氨基酸。在一个相关的实施方式中,第51号位点上的残基选自由天门冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸以及丝氨酸构成的组,例如,第51号位点上的残基是天门冬酰胺。第1至50号位点上的氨基酸中,至少有75%如SEQ ID NO:1中所示。所述组合物的生物学活性为SEQID NO:1中所示氨基酸序列的至少50%。所述生物学活性选自由如下成员所构成的组:致有丝分裂、细胞保护、抑制酸分泌、组织前体细胞的生长、组织前体细胞的分化以及组织前体细胞的生长和分化。致有丝分裂作用是通过上皮细胞有丝分裂的速度而确定的。酸分泌是在胃瘘管动物中确定的。分化是通过胰岛再生或粘膜细胞的形成而确定的。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种药物组合物,其中包含有效剂量的任何一种本发明组合物,所述组合物位于药学上可以接受的载体中。在一个相关实施方式中,所述药物组合物中还包含另外的治疗剂。例如,所述的另外的治疗剂为生长因子受体配基。例如,所述配基为生长因子。例如,所述配基为胃泌素/缩胆囊素受体配基。
在一个相关实施方式中,本发明提供了一种编码本发明EGF组合物的核苷酸序列,该核苷酸序列中包含经调整的适用于工业上可以接受的生产物种的最佳(optimum)密码子。所述的工业上可以接受的生产物种是酵母。例如,所述酵母为毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)。
本发明的一个相关方面提供了一种多聚核苷酸,其含有编码长度为51个残基的多肽的核苷酸序列,所述多肽具有人EGF的生物学活性,所述序列中含有适于在毕赤属物种(a species ofPichia)中表达的优化(optimized)密码子,并且在羧基端具有使所述多肽具有抗蛋白质水解性质的氨基酸。在相关的实施方式中,本发明提供了携带有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的重组的毕赤属菌株(strain of Pichia);能够生产SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的重组的毕赤属菌株;以及编码SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明另一方面提供了一种用于获得组合物的方法,所述组合物中包含长度为X的氨基酸序列,X为不小于48并且不大于53的整数,该序列(i)与SEQ ID NO:1的1号位点至X-1号位点之间的部分基本同源,并且(ii)在第X号位点上的氨基酸残基不同于SEQ ID NO:1中相应的氨基酸残基;所述方法包括:设计一种编码所述组合物的基因,其中包含选出的适用于工业上可以接受的物种的最佳密码子;以及通过对所述物种进行发酵而在所述物种中生产所述组合物。
本发明的一个相关方面提供了一种方法,用于制造用于治疗需要组织再生的受试者(subject)的治疗组合物,所述治疗组合物中包含长度为X的氨基酸序列,X为不小于48并且不大于53的整数,该序列(i)与SEQ ID NO:1的1号位点至X-1号位点之间的部分基本同源,并且(ii)在第X号位点上的氨基酸残基不同于SEQ ID NO:1中相应的氨基酸残基;以及给予受试者所述组合物,所述组合物的量要足以影响前体细胞的再生,并以此作为对需要组织再生的受试者的治疗手段。因此,给予所述组合物时还给予另外的治疗剂。例如,所述的另外的治疗剂为生长因子受体配基。例如,所述配基为生长因子。例如,所述配基为胃泌素/缩胆囊素受体配基。在相关的实施方式中,X是整数51。位于第X号位点上的氨基酸残基为中性氨基酸。例如,所述氨基酸残基为天门冬酰胺。所述组合物对蛋白质水解的抗性要强于包含SEQ ID NO:1中所示序列的组合物。在相关的实施方式中,所述受试者需要胰岛细胞再生,例如所述受试者患有糖尿病;或者所述受试者需要粘膜细胞再生。
本发明另一方面提供了一种方法,用于获得经修饰的EGF氨基酸序列,所述经修饰的EGF氨基酸序列对蛋白质水解的抗性要强于等同天然EGF(nature identical EGF),并且基本保留了其生物学活性,所述方法包括:鉴定出等同天然EGF序列中的至少一个残基,该残基会受到工业上有用的物种中的蛋白质水解作用;设计经修饰的氨基酸序列,其中被鉴定为是蛋白质水解目标的残基被删除或替换为不同的氨基酸;以及提供所述经修饰的氨基酸序列,测试蛋白质水解作用并与等同天然EGF进行比较,以获得对蛋白质水解的抗性强于等同天然EGF的经修饰的EGF。相应的,所述的等同天然EGF来自人。在一个相关的实施方式中,所述经修饰的氨基酸序列的设计是,利用至少一个氨基酸替换至少一个羧基端残基,以获得新的羧基端氨基酸序列,从而使得经修饰的EGF对蛋白质水解的抗性增强。在一个相关的实施方式中,对作为蛋白质水解目标的残基的鉴定是,在对工业上有用物种的重组细胞进行培养以生产等同天然EGF的过程中,确定蛋白质水解的位点。在一种相关的方法中,在对所述经修饰的氨基酸序列进行设计之后,在提供所述经修饰的EGF之前,所述方法还包括:设计一种编码所述经修饰的氨基酸序列的核苷酸序列,该核苷酸序列中含有经选择的适用于工业上有用物种的最佳密码子。在一种相关的方法中,在对所述经修饰的核苷酸序列进行设计之后,在提供所述经修饰的EGF之前,所述方法还包括:将所述经修饰的核苷酸序列导入至载体中,并将所述载体转化到工业上有用物种的细胞中。在一个实施方式中,提供所述经修饰的EGF是指提供一种具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质。所述的工业上有用的物种是,例如酵母,例如毕赤属酵母,例如毕赤巴斯德酵母(P.pastors)。其他工业上有用的真菌物种包括:脉孢菌属(Neurospora)、黑麹菌属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、圆酵母属(Torula)以及人体酵母菌属(Schizosaccharomyces)的物种。本发明另一方法提供了一种按照前面的方法所获得的重组毕赤属菌株(a recombinant strainof Pichia)。在一个相关实施方式中,所述的有用物种为细菌,例如所述细菌为链霉菌属(Streptomyces)的菌株,例如S.lividans、S.coelicolor、S.rimosus,或者其他有用的放射菌类(actinomycetes)菌株,例如马杜拉放线菌属(Actinomadura)以及诺卡氏菌属(Nocardia)。其他的工业上有用的非放线菌类细菌包括:杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)以及Xanthobacter。
本发明还提供了一种试剂盒,其中包括位于药学上可以接受的载体中的至少一个单位剂量的本发明组合物。根据本发明一个相关实施方式的这种试剂盒中还包含另外的治疗剂。例如,所述的另外的治疗剂为生长因子受体配基;例如,所述生长因子受体配基为胃泌素/缩胆囊素受体配基,例如,所述配基为胃泌素。该单位剂量对于治疗需要组织再生的受试者而言是足量的。所述组织为胰岛或胃粘膜(a pancreatic islet or a gastric mucosa)。
本发明另一方面提供了一种转基因动物,该转基因动物携带有编码本发明组合物的核苷酸序列,其中包含经调整的适用于工业上可以接受的物种的最佳密码子,所述工业上可以接受的物种是动物。在一个相关实施方式中,所述核苷酸序列中含有另外的调控序列信息,用于在特定组织中表达。在所述动物的编码内源等同天然EGF的基因中,还可以进一步含有插入突变,从而使得所述动物对内源EGF的生产被有效地停止(knocked out)。
附图说明
图1的组A、B、C、D分别示出了编码EGF51N(SEQ ID NO:2)、EGF51A(SEQ ID NO:3)、EGF51Q(SEQ ID NO:4)和EGF51S(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列以及核苷酸序列。这些序列均为经修饰的EGF类型,每一个序列的链长均为51个氨基酸,并且其C端残基分别为天门冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸。编码的基因分别为SEQ ID NOs:6、7、8、9。
图2示出了毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)对EGF51N的生产。长度分别为49、51以及50个氨基酸残基的三种异型(isoform)的产量分别被标记为A、B和C,并且作为生产过程中对时间的函数而示出。此外,也同样地示出了hEFG的总量。只观察到了非常少的A和C这两种异型(长度分别为49或50个氨基酸残基),而长度为51个氨基酸残基的EGF则被持续而稳定地生产出来,其产量为细胞生长的函数。
图3示出了链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的治疗结果。以40μg/kg/天的剂量给予糖尿病大鼠人胃泌素和EGF51N中的每一种,腹膜内给药(delivered intraperitoneally),连续注射14天。在治疗之后,对大鼠在口服葡萄糖胁迫(oral glucose challenge)之后将血糖恢复至静息水平(resting level)的能力进行评估,作为时间的函数示于纵坐标中,其中,横坐标为时间,单位为分钟。血糖浓度迅速恢复至静息水平表明了EGF51N的生物学活性。
具体实施方式
人EGF是从人的尿液中发现的,并且由于其抑制胃酸分泌的能力而被命名为尿抗溃疡素(urogastrone)(Gregory,H.et al.Hoppe Seylers.Z Physiol Chem.356,1765-1774,1975)。此外,EGF具有促有丝分裂活性,也就是说,它刺激多种细胞和组织的生长(Karnes supra;Carpenter,G.et al.J Cell Physiol 88,227-237,1976;Gasslander,T.et al.Eur.Surg.Res.29,142-149,1997)。还发现EGF具有细胞保护作用,刺激细胞向体内的伤口或者单层细胞培养物中所引入的间隙处迁移,以促进伤口的愈合。这些生物学活性对于一个在结构上相互关联的生长因子家族具有特异性,该生长因子家族中包括EGF、TGF-α、双调蛋白(amphiregulin)以及肝素结合EGF样生长因子(heparin-binding EGF-like growth factor)(Karnes,supra)。该生长因子家族的成员在氨基酸序列上有11个残基是相同的,其中的六个残基是半胱氨酸,它们之间形成了二硫键。
天然的(正常的或野生型)全长人表皮生长因子(EGF)是一个由53个氨基酸构成的蛋白质,其分子量为6217道尔顿,并且在体内和体外具有多种生物学功能(Karnes,W.,Epidermalgrowth factor and trans forming growth factor alpha,1994,RavenPress,New York)。本文中所使用的术语“天然EGF”是指正常的全长人EGF,如SEQ ID NO:1所示。在本申请的说明书以及权利要求中所使用的术语“表皮生长因子”或“EGF”是指多肽产物或者其药学上可以接受的盐,其表现出了与天然的人表皮生长因子(hEGF;SEQ ID No:1)相似的生物学活性,这可以通过一种或多种生物学试验进行测定。
EGF受体配基包括一个蛋白质家族,其中包括EGF和TGFα,它们能够与细胞上的多种EGF受体相结合,所述细胞可以是不同组织中的,并且可以是多种细胞类型;它们还能将信号传递到那些细胞中,并在特定类型的细胞中引起生长发育上的变化。
如本文中所述,已经工程化并表征了多种形式的“经修饰的EGF”,它们在链长和氨基酸序列上与天然EGF不同。已经证明这些修饰影响了EGF的生物学活性及其清除速率。此外,该术语还包括与hEGF具有相同或相似氨基酸序列的肽,例如,在不同残基处具有保守氨基酸替换的肽。C端最后5个氨基酸中的一个或多个可以被替换为一个或多个其他氨基酸,或者也可以被删除。
已经描述了其21号位点上的甲硫氨酸被替换为亮氨酸残基的重组EGF(美国专利号4,760,023)。在存储过程中,重组hEGF11号位点上的天冬氨酸残基被转化为isoaspartyl形式,并且其生物学活性显著减弱(George-Nascimento et al.,Biochemistry,29,9584-9591,1990)。已经描述了一系列核酸分子,这些核酸分子编码与EGF和TGFα有较大相似性的蛋白质家族(WO 00/29438)。已经描述了其16号位点上的组氨酸残基被替换为中性或酸性氨基酸的EGF突变体(突变的EGF)(WO 93/03757),这种类型在低pH值时保持活性。EGF和TGFα的化学类似物及片段保留了与EGF受体家族的不同成员相结合的能力(美国专利号4,686,283)。此外,全长EGF以及其他形式的EGF在体内和体外对氧化和蛋白质水解作用都较为敏感。
本发明的实施方式基于如下发现:对EGF C端氨基酸序列的某些修饰可能会产生某些类型的EGF,它们对内源以及外源蛋白酶的作用具有抗性,并且保留了完整的生物学活性,其中EGF的C端是指从48号位点到53号位点的氨基酸残基。这些类型中包括某些氨基酸被删除或替换的EGF,例如48号位点(天然EGF中为赖氨酸)以及53号位点(精氨酸)上的碱性氨基酸,49号位点(色氨酸)以及50号位点(色氨酸)上的芳香氨基酸,以及52号位点上的脂肪族氨基酸(亮氨酸)。此处,实施方式包括本文中所述的经修饰的EGF类型的药学上可以接受的盐。
“药学上可以接受的载体”包括任何以及所有溶剂、分散介质、涂层、抗微生物剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂以及吸附延迟剂等生理上相容的物质。所述载体最好适于静脉给予、肌肉注射、口服、腹膜内给药、透皮给药或皮下给药。参见"Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Sytems",M.Rosoff,Ed.,John Wiley,Inc.,NY(1989)。
本文中所使用的术语“药学上可以接受的盐”是指保留了母体化合物理想的生物学活性并且不会带来任何不想要的毒性作用的盐。此类盐的实例包括:(a)与无机酸,例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸等,所形成的加酸盐(acid addition salt);以及与有机酸,例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、双羟萘酸(pamoic acid)、褐藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸,所形成的盐;(b)与多价金属阳离子,例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等,所形成的盐;或者(c)与由N,N′-dibenzylethylenediamine or乙撑二胺形成的有机阳离子所形成的盐;或者(d)(a)与(b)或(c)的组合,例如锌的鞣酸盐等。
医师或者本领域普通技术人员可以很容易地确定并规定药物组合物所需的“有效剂量”。例如,为了获得所期望的治疗效果,例如缓解I型或II型糖尿病或者链脲佐菌素(streptozotocin)诱导的糖尿病,医师可以在开始阶段以低于获得上述治疗效果所需的剂量水平来给予包含在药物组合物中的本发明化合物,并随着时间的推移而增加剂量,直到获得预期的效果,也就是缓解(remediation)糖尿病。
为了获得最佳的预期反应(例如治疗反应,此处特别是指某种类型的糖尿病的缓解),可以对治疗中所用的剂量进行调整。可以给予单一剂量例如一个大药丸(bolus),可以在一定时间内分几次给予几个分剂量,也可以根据病情的严重程度而成比例地减少或增加剂量。医师或者具有药理学领域常规知识的其他从业人员可以很容易地确定并规定所需的药物组合物的有效剂量。例如,医师可以在开始阶段以低于获得预期的治疗效果所需的剂量水平来给药,并随着时间的推移而增加剂量,以获得预期的效果,特别是I型、II型糖尿病或者链脲佐菌素(streptozotocin)诱导的糖尿病症状的缓解。一般来讲,经修饰的EGF组合物适当的有效剂量是能够缓解症状,例如通过生产胰岛素并降低血糖浓度而缓解不能对葡萄糖胁迫(glucose challenge)做出反应的症状,的最低剂量。
在另一种实施方式中,本发明的药物组合物也包括另外的治疗剂。这样,根据本发明的一种方法,包含经修饰的EGF的药物组合物可以作为组合治疗(combination therapey)的一部分与其他的药剂组合在一起而给予患者,例如与缩胆囊素受体配基组合在一起。
与未经治疗、未接受上述组合物的受试者相比,治疗上有效的剂量使受试者的症状缓解至少约20%,至少约40%,至少约60%,或者至少约80%。
出现在本说明书中提到的各种氨基酸序列中的氨基酸具有常规的三字母或一字母的缩写形式,这些缩写形式在本领域中是很常用的。“疏水”氨基酸包括芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸,以及脂肪族氨基酸亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸。“带电”氨基酸包括酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸,以及碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸。其他不带电的氨基酸是“中性”氨基酸。
“保守”氨基酸取代突变是指在EGF或相关分子的某一具体位点上的氨基酸被替换为化学性质相似的另一个氨基酸。保守氨基酸取代的实例有:带电氨基酸被带有同种电荷的不同氨基酸所替代,例如Asp被Glu所替代;或者芳香族疏水氨基酸例如Trp被不同的芳香族疏水氨基酸例如Phe所替代(参见美国专利号6,207,154,2001年3月27日授权)。还含有一个或多个保守氨基酸取代的经修饰的EGF,例如EGF51N,被认为包括在等同的实施方式中,这些实施方式在各种经修饰的EGF组合物的含义上是等同的,正如本发明的说明书和权利要求中所描述的那样。
对于两个氨基酸序列而言,如果组成第一个氨基酸序列的特定类型的氨基酸残基与第二个序列的氨基酸大部分是相同的,那么这两个氨基酸序列组合物就是“基本同源的”,其中在比较的时候,这两个氨基酸序列被线性地排列在一起,从而使得可以对其进行位点对位点的比较。例如,序列中至少50%、至少75%、至少85%、至少90%或者至少95%的氨基酸是相同的。对于长度为51个残基的蛋白质而言,当其与同样长度的另一个序列进行比较时,至少50%意味着序列中至少有26个氨基酸必须是相同的;至少75%意味着序列中至少有39个氨基酸必须是相同的;至少85%意味着序列中至少有43个氨基酸必须是相同的;至少90%意味着序列中至少有46个氨基酸必须是相同的;至少95%意味着序列中至少有48个氨基酸必须与进行比较的第一个序列相同。
表1 氨基酸的三字母和一字母缩写形式
Nardi等人(美国专利号5,885,956以及6,288,301)最近指出EGF的一种活性是:将EGF受体配基与胃泌素/缩胆囊素(CCK)受体配基共同给予受试者时,使得受试者体内的胰岛前体细胞(precursor cell)分化并成熟为分泌胰岛素的细胞。因此,当EGF受体配基单独存在或者与另一种试剂例如CCK受体配基共同存在时,可能在引发未分化的祖细胞(progenitor cell)发生分化方面起到了一定作用。“祖”细胞具有分裂若干代的能力,可以分化成多种不同的细胞类型。
EGF和其他的EGF受体配基具有促有丝分裂活性,并且能够刺激细胞数目的增长,特别是对培养物中或体内的上皮细胞系。EGF受体配基的另一种活性是抑制酸的分泌,这一点已经在实验动物中得到了证明,例如在瘘管(fistulated)动物例如瘘管大鼠中。EGF还能刺激组织前体细胞的生长和/或分化。
本发明经修饰的EGF组合物还可以被进一步修饰,在一个或多个氨基酸位点上引入化学类似物,以便抑制额外的蛋白质水解,而所述蛋白质水解作用可能减弱该经修饰的EGF在体内的药理学功能。虽然本发明所述的经修饰的EGF组合物抗蛋白质水解的能力显然比等同天然(nature identical)hEGF更强,但是可以预见,进一步的理想化学改变已经被此处所描述的本发明的实施方式所预见到。这样的进一步修饰包括:例如,在某一个(些)特定位点上,至少有一个天然L-氨基酸被替换为一个D-氨基酸,或者至少有一个丙氨酸或另一个氨基酸残基被替换为诸如正缬氨酸、乙酰半胱氨酸或甲基苯基甘氨酸(methylphenylglycine)等化合物。氨基酸修饰也可以是肽骨架氮原子的N-甲基化。
本文中所使用的术语“蛋白质水解”(proteolysis)是指蛋白酶或肽酶水解肽键的过程,存在于一组被称为水解酶的酶类中。本说明书以及权利要求中所使用的术语蛋白质水解包括外肽酶(exopeptidase)处理活性以及内肽酶切割活性,外肽酶从蛋白质底物的端部顺序释放单个的氨基酸,而内肽酶则在对底物进行消化后产生两个或更多个多肽、寡肽或氨基酸片段。
“工业上有用的物种”是指一般被认为较为安全的微生物株或者细胞系,可以在其中生产用于给人或动物服用的治疗剂,而且该物种不会产生另外的可能会引发副作用或后遗症的分子。在工业生产上已经使用过多种细菌,例如链霉菌(参见美国专利号4,745,056,1988年5月17日授权)。对于那些对蛋白质降解作用较为敏感的蛋白质而言,某些种类的真菌,例如某些种类的酵母属(Saccharomyces)物种(例如酿酒酵母S.cerevisiae)以及某些种类的毕赤属(Pichia)物种(例如毕赤巴斯德酵母P.pastoris),在治疗用蛋白质的大规模生产和制备方面是特别有用的,而且它们不会大量产生其他不想要的分子。
此外,本文中所描述的经修饰的EGF类型例如EGF51N,可以在转基因动物中制造,例如哺乳动物或鸟类,并将其置于调控元件的控制之下,从而使得异位(ectopic)EGF的表达可以被导向至方便的生产介质中,例如在转基因哺乳动物的乳汁中生产,或者在转基因鸟类的卵的白蛋白中生产。而且,可以通过敲除突变使所述转基因动物的内源基因失活,从而使得经修饰的人EGF是所述转基因动物所生产的唯一一种EGF。参见美国专利号6,242,666,2001年6月5日授权;以及美国专利号6,271,436,2001年8月7日授权。
在说明书以及权利要求中使用的术语“异位”(ectopic)是指从某一种类型的物种的细胞,例如人细胞,中分离出来的基因,通过基因工程技术而被引入到不同类型的物种例如酵母或者异源哺乳动物例如猪的细胞中。
在说明书以及权利要求中使用的术语“最佳密码子的使用”(optimum codon usage)是指将工程化重组基因的核苷酸序列进行调整,以反映出在不同物种基因组的基因中所发现的编码同样氨基酸的多种不同三核苷酸密码子在频率上的差异。除trp和met以外的所有氨基酸都可以被多种密码子所编码。更具体地说,术语最佳密码子的使用是指一种程序,其中,编码蛋白质或多肽并且有待于被插入到异源细胞中以在该细胞中通过体内方法生产所述蛋白质的工程化核苷酸序列被改变,该工程化核苷酸序列与等同天然基因的不同之处在于,它们通过不同的密码子编码基本相同的天然氨基酸序列。根据生产细胞中各种密码子的使用频率选择在工程化基因中所指定的不同的密码子集合,从而使得生产细胞翻译系统的组成要素不会限制产物的产率。
本文中所使用的术语“蛋白质”、“肽”以及“多肽”具有相同的含义。
此处以引用的方式将提及的全部专利文献以及公开出版物的内容包括在本文中。虽然在实施本发明时可以使用与本文中所描述的相似或等同的方法和材料,但下面仍然描述了合适的方法和材料。前面已经对本发明进行了充分的描述,下面通过实施例和权利要求对其进行进一步的解释,这些实施例和权利要求不应当理解为对本发明的限制。
实施例
实施例1 含有适于生产的最佳密码子的EGF基因
的设计和合成,稳定性提高的氨基酸序列修饰
可以在适于工业生产的酵母毕赤巴斯德酵母中,通过使用载体,例如从Invitrogen,Carlsbad,CA所获得的载体,而对外源基因进行克隆和表达。含有细胞、载体和介质的试剂盒可以购得。实验方案可以从Invitrogen获得。P.pastoris密码子的优化可以通过1998年10月27日授权的美国专利号5,827,684中描述的方法确定,并且可以作为一种商业服务从Aptamer,Inc.(Rockville,MD)获得。
全长EGF的C端氨基酸序列,也就是48至53号残基,为KWWELR,其中使用了前面所定义的一字母代码(参见图1的组A以及SEQ ID No:1)。令人吃惊的是,这5个C端氨基酸中至少一个氨基酸的删除以及至少一个氨基酸的替换结合起来之后,所产生的经修饰的EGF类型(form)保持了其生物学功能并且对蛋白质水解具有抗性。对这些氨基酸的修饰包括:48号位点(在天然EGF中为赖氨酸,K)以及53号位点(精氨酸,R)上的碱性氨基酸、49号位点(色氨酸,W)以及50号位点(色氨酸,W)上的芳香族氨基酸以及52号位点(亮氨酸,L)上的脂肪族氨基酸的删除或替换。
此处所描述的这些氨基酸是可以在胃液、循环系统以及生产用微生物,例如毕赤巴斯德酵母,的培养基中发现的各种类型的外切蛋白酶或内切蛋白酶(exo and endo proteases)的目标底物。等同天然EGF(nature identical EGF)的羧基端氨基酸之间的肽键会受到多种特异性已知的蛋白酶和肽酶的消化。例如,在52和53号残基leu-arg之间的键会受到羧肽酶B的攻击;在49和50号残基之间的键(trp-trp)以及50和51号残基之间的键(trp-glu)都会受到胰凝乳蛋白酶的消化(参见"ProteolyticEnzymes",Ed.Beynon,R.and Bond J.,IRL Press at Oxford,Appendix II,p.232.)。当另外的蛋白酶具有其他偏好或者没有特异性时,中性氨基酸例如gln通常不是优选的底物。一个例外是枯草杆菌蛋白酶,它是格兰氏阳性土壤细菌枯草杆菌(Bacillussubtilis)的产物。由于这种原因,按照本发明所描述的方法在枯草杆菌中生产具有中性或酸性残基的经修饰EGF不是优选的。
本发明的一种实施方式是一种组合物,该组合物是一种肽,包含长度为51个氨基酸的人EGF的氨基酸序列,其中51号位点上的残基是除谷氨酸以外的氨基酸,例如天门冬酰胺(称为EGF51N)。一种相关的实施方式是一种核苷酸序列,编码经修饰的EGF组合物EGF51N(SEQ ID NO:2)的基因,如图1的组B所示。该核苷酸序列的设计目的是,在工业上可以接受的生产物种例如毕赤巴斯德酵母中,将该核苷酸序列插入到载体(vector)例如表达载体中,以生产用作治疗剂的所述组合物。相似地,EGF51A、EGF51Q和EGF51S是经修饰的EGF类型的另外的实施方式。如本文中所述,这些经修饰的类型对于蛋白质水解具有抗性(分别参见图1的组B、C和D)。
本发明的编码经修饰EGF的基因序列的设计方法中,还进一步使用了在生产物种的蛋白质合成过程中对于识别而言最佳的密码子(codon)。这些密码子替换了在编码EGF的天然人核苷酸序列中所发现的那些密码子,以便在所述物种的细胞生长过程中获得更高的产率。
此外,本发明的数据(见下文)表明,为了获得对蛋白质水解的抗性而对经修饰的EGF所进行的设计,例如删除在52和53号位点上的两个末端氨基酸以及将51号位点上天然存在的谷氨酸替换为天门冬酰胺,在实现这一目标方面是成功的。而且,我们还发现,经修饰的类型EGF51N具有理想的生物学活性,特别是其具有在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中刺激胰岛再生(isletneogenesis)以获得胰岛素的能力。
实施例2 在重组物种中通过合成基因生产EGF,其
中该合成基因中采用了对该物种而言最佳的密码子
图1中所示的基因序列用于在毕赤巴斯德酵母中生产EGF51N,并且在发酵生产介质中获得了令人意外的高产率(参见图2)。该产率与此前所报道的数据相当(美国专利号5,102,789,1992年4月7日授权)。
实施例3 EGF51N对蛋白质水解的抗性
对产物所进行的分子量测定以及对EGF51N消化后所获得的肽所进行的分析证实,该产物是单一种类,其分子量与预测的分子量一致,并且与天然EGF相比具有两个氨基酸的删除。这些数据确认了该材料是什么,并且证实了在生产过程中获得了单一种类的EGF蛋白质。在生产EGF51N的过程中,我们观察到所获得的高产率EGF被表征为(characterized as)单一分子量的种类(参见图2)。因此在发酵介质中,我们没有观察到经修饰的hEGF的显著水解。
表2示出了采用另一种标准所获得的数据,这些数据表明EGF51N对蛋白酶活性具有抗性,也就是说,在体外具有对羧肽酶B消化作用的抗性。这些数据表明,在与羧肽酶B共同温育一段时间之后,与天然人EGF53相比,保留下来的具有活性的EGF51N要多6到30倍。这些数据证实,对C端所进行的目的在于除去作为酶解作用底物的残基的设计,在微生物生产过程中以及在EGF暴露于其他酶类时(例如受试者体内的羧肽酶B),能够有效地保护EGF。
表2 EGF51N对羧肽酶B的抗性
酶的相对浓度 | %保留下来的EGF53 | %保留下来的EGF51N |
0.01 | 75 | 75 |
0.1 | 1 | 30 |
1(过量的酶) | 1 | 6 |
酶的相对浓度是羧肽酶与EGF的比例。
实施例4 EGF51N的生物学活性
按照上述方法生产的EGF51N被用在试验中,以测定其对体内胰岛再生的刺激作用。测定过程中采用糖尿病大鼠,对经较低血糖浓度(a lower blood concentration)处理的动物施以葡萄糖胁迫(challenge by glucose)并进行测定。这样,我们发现hEGF具有与阳性对照TGFα相当的能力(potency),如同3所示,其中TGFα是另外一种EGF受体配基(美国专利号6,288,301,2001年9月11日授权)。
此外我们还发现,EGF51N能够在麻醉的胃瘘管大鼠(anaesthetized gastric fistula rats)体内抑制胃酸分泌。在静脉药丸注射(intravenous bolus injection)8μg EGF51N之后,我们发现在注射后10到20分钟之内,胃酸分泌开始受到抑制,并且这种抑制作用持续20到50分钟。抑制胃酸分泌的起始时间以及持续时间与阳性对照——商业上可以购得的全长TGF-α相当。
这些数据表明,本文中所描述的各种类型EGF中所包含的C端修饰起到了如下作用:保护EGF使之免于被水解,并保持了至少两种在治疗上很重要的不同的生物学活性——抑制酸分泌以及胰岛再生治疗。
实施例5 EGF51N在链霉菌(Streptomyces
lividans)菌丝体中的表达
通过标准方法制备链霉菌的原生质体(Hopwood et al.,1985,Genetic manipulation of Streptomyces"Norwich,England;TheJohn Innes Foundation),并通过携带有编码EGF51N的基因的质粒对其进行转化。从CANGENE(Winnipeg,Manitoba)获得链霉菌载体pCAN46。该质粒中采用了携带有pIJ101复制子的链霉菌-大肠杆菌穿梭载体(Streptomyces-E.coli shuttle vector),它是一种高拷贝数的多拷贝质粒(参见美国专利号4,745,056),可以在很多种类的宿主链霉菌细胞中复制。该质粒中携带有可选择的(selectible)编码硫链丝菌肽抗性的抗生素抗性基因。EGF51N的表达中采用了一种启动子,该启动子来自编码氨基糖苷磷酸转移酶(aph)的S.fradiae基因,所述氨基糖苷磷酸转移酶用于蛋白质表达。该构建物中还进一步将EGF51N的氨基端天门冬酰胺与来自S griseus的蛋白酶B的信号序列进行基因融合,以获得蛋白质的分泌。
我们观察到,在携带有这种构建物的菌株的菌丝体生长过程中,产生了大量有用的EGF51N。
序列表
<110>西拉·G·玛吉尔
苏珊·D·琼斯
加里·W·佩斯
斯蒂芬·J·布兰德
<120>新型表皮生长因子蛋白和基因及其使用方法
<130>24492-005-061
<140>尚未给予
<141>2002-10-22
<150>US 10/000,840
<151>2001-10-23
<160>9
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>53
<212>PRT
<213>人EGF(表皮生长因子)
<400>1
<210>2
<211>51
<212>PRT
<213>重组人EGF51N
<400>2
<210>3
<211>51
<212>PRT
<213>重组人EGF51A
<400>3
<210>4
<211>51
<212>PRT
<213>重组人 EGF51Q
<400>4
<210>5
<211>51
<212>PRT
<213>重组人EGF51S
<400>5
<210>6
<211>161
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码EGF51N的DNA
<400>6
<210>7
<211>161
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码EGF51A的DNA
<400>7
<210>8
<211>161
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码EGF51Q的DNA
<400>8
<210>9
<211>161
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码EGF51S的DNA
<400>9
Claims (36)
1.一种组合物,其中包含长度为X的氨基酸序列,X为不小于48并且不大于53的整数,该序列(i)与SEQ ID NO:1的1号位点至47号位点之间的部分至少75%是相同的,并且(ii)在位点X上的氨基酸残基不同于SEQ ID NO:1中相应的氨基酸残基,与SEQ ID NO:1相比,所述组合物对蛋白质水解的抗性提高。
2.如权利要求1所述的组合物,所述组合物的生物活性至少是序列为SEQ ID NO:1的多肽的生物活性的50%,所述生物学活性选自由如下成员所构成的组:致有丝分裂、刺激细胞生长、刺激组织生长、细胞保护、抑制酸分泌、刺激迁移、伤口愈合、组织前体细胞的生长、组织前体细胞的分化以及组织前体细胞的生长和分化,以及EGF受体结合。
3.如权利要求1或2所述的组合物,其中所述的位点X上的氨基酸残基是中性氨基酸。
4.如权利要求1或2所述的组合物,其中所述的位点X上的氨基酸残基是天门冬酰胺。
5.如权利要求3所述的组合物,其中所述的X为第51号位点。
6.如权利要求1或2所述的组合物,其中位点X上的氨基酸残基是疏水氨基酸。
7.如权利要求1或2所述的组合物,其中位点X上的氨基酸残基是带负电的氨基酸。
8.如权利要求1或2所述的组合物,其中位点X上的氨基酸残基选自谷氨酰胺、丙氨酸以及丝氨酸所组成的组。
9.一种组合物,其中包含选自由SEQ ID NOs:2、3、4所构成的组的氨基酸序列。
10.如权利要求9的组合物,其中包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
11.一种组合物,其中包含人表皮生长因子(EGF),所述人表皮生长因子的氨基酸序列至少与SEQ ID NO:1中所示的第1至47号位点的氨基酸序列基本同源,并且EGF羧基端的第48至53号位点上至少有一个氨基酸的替换,所述氨基酸序列对蛋白质水解的抗性比SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列更强。
12.如权利要求11所述的组合物,其中所包含的第1至50号残基的氨基酸序列基本如SEQ ID NO:1所示,并且第51号残基是除谷氨酸以外的氨基酸。
13.如权利要求11所述的组合物,其中第51号位点上的残基选自由天门冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸以及丝氨酸构成的组
14.如权利要求11所述的组合物,其中第51号位点上的残基是天门冬酰胺。
15.如权利要求11,12,13或14所述的组合物,其中,第1至50号位点上的氨基酸中至少有75%如SEQ ID NO:1所示。
16.如前述任何一项权利要求所述的药物组合物,所述组合物进一步包括生长因子受体配基。
17.如权利要求16所述的药物组合物,其中所述配基为生长因子。
18.如权利要求16所述的药物组合物,其中所述配基为胃泌素/缩胆囊素受体配基。
19.如权利要求18所述的药物组合物,其中所述配基为胃泌素。
20.一种长度为51个氨基酸的多肽,其中第1至50号残基与SEQID NO:1中所示的氨基酸序列基本同源,并且第51号残基是天门冬酰胺残基。
21.如权利要求20所述的多肽,与SEQ ID NO:1相比,所述多肽对蛋白质水解的抗性提高。
22.如权利要求20或21所述的多肽,其中,第1至50号残基中至少有一个残基是SEQ ID NO:1所示序列中的氨基酸的保守取代。
23.编码SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
24.一种用于获得前述权利要求中任一项的组合物的方法,其包括:
设计一种编码所述组合物的基因,其中包含选出的适用于工业上可以接受的物种的最佳密码子;以及
通过对所述物种进行发酵而在所述物种中生产所述组合物。
25.前述权利要求中任一项的组合物在制造用于治疗需要组织再生的受试者的药物中的应用。
26.如权利要求25所述的应用,其中所述受试者需要胰岛细胞再生。
27.如权利要求25所述的应用,其中所述受试者需要粘膜细胞再生。
28.如权利要求25所述的应用,其中所述受试者患有糖尿病。
29.一种方法,用于获得经修饰的EGF氨基酸序列,所述经修饰的EGF氨基酸序列对蛋白质水解的抗性要强于等同天然EGF,并且基本保留了其生物学活性,所述方法包括:
鉴定出所述等同天然EGF序列中的至少一个残基,该残基会受到工业上有用的物种中的蛋白质水解作用;
设计经修饰的氨基酸序列,其中被鉴定为是蛋白质水解目标的残基被删除或替换为不同的氨基酸;以及
提供所述经修饰的氨基酸序列,测试蛋白质水解作用并与所述等同天然EGF进行比较,以获得对蛋白质水解的抗性强于等同天然EGF的经修饰的EGF。
30.如权利要求29所述的方法,其中所述的等同天然EGF来自人。
31.如权利要求29所述的方法,其中所述经修饰的氨基酸序列的设计是,利用至少一个氨基酸替换至少一个羧基端残基,以获得新的羧基端氨基酸序列,从而使得经修饰的EGF对蛋白质水解的抗性增强。
32.如权利要求29所述的方法,其中对作为蛋白质水解目标的残基的鉴定是,在对工业上有用物种的重组细胞进行培养以生产等同天然EGF的过程中,确定蛋白质水解的位点。
33.如权利要求29所述的方法,其中,在对所述经修饰的氨基酸序列进行设计之后,在提供所述经修饰的EGF之前,还包括:设计一种编码所述经修饰的氨基酸序列的核苷酸序列,该核苷酸序列中含有经选择的适用于工业上有用物种的最佳密码子。
34.如权利要求33所述的方法,其中,在对所述经修饰的核苷酸序列进行设计之后,在提供所述经修饰的EGF之前,还包括:将所述经修饰的核苷酸序列导入至载体中,并将所述载体转化到工业上有用物种的细胞中。
35.如权利要求29、30或31所述的方法,其中,提供所述经修饰的EGF是指提供一种具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质。
36.一种试剂盒,其中包括位于药学上可以接受的载体中的至少一个单位剂量的根据前述权利要求之中任一项的组合物。
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