CN1273976A - 一种重组人骨形态发生蛋白(rhOP－1)的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在大肠杆菌系统中重组人骨形态发生蛋白的表达和纯化方法,属基因工程制药技术领域。本发明利用RT－PCR方法从正常胎儿肾组织cDNA中,放大获得人骨形态发生蛋白(rhOP－1)的基因片段,通过DNA重组技术构建表达质粒,转化大肠杆菌在培养液不含诱导剂的条件下表达rhOP－1;通过离子交换柱层析,疏水柱层析和分子筛层析获得高纯度药用rhOP－1蛋白。这种rhOP－1不仅具有诱骨形成形力,且与胶原蛋白或珊瑚粉类材料复合,对骨损伤和骨缺失具有明显的疗效作用。
Description
本发明涉及人骨形态发生蛋白(hOP-1)基因的钓取，尤其是在大肠杆菌系统中重组人骨形态发生蛋白(rhOP-1)的表达和纯化，属基因工程制药技术领域。
hOP-1存在于正常人体，属细胞因子中的一种，其主要生理作用是诱导骨细胞的形成，尤其适用于骨损伤和骨缺失部位的快速愈合。现有技术中，骨损伤和骨缺失的治疗主要采用下述材料，但均存在明显缺陷：(1) 自体植骨：自体植骨的优点是植骨后无免疫排斥反应，且新骨形成较快。
但存在病人要面对二次手术的痛苦，如出现大面积骨缺失，来源受到限制。(2) 高分子合成材料，包括PGA和PLA及二者的混合材料PLGA，这些材料
对骨细胞的形成无任何促进作用，仅属物理性衍接。(3) 无机植骨材料：包括甲壳素、珊瑚制品、CPC等，在国内尚无任何厂家报
批。(4) 异种或异体骨：各种顽固性病毒包括疯牛病病毒的存在，人们不敢轻易使
用该种材料。
因此，用基因重组技术制备大量的rhOP-1药物及用其开发具有诱骨活性的复合材料，可以大大改善传统的自体植骨、高分子合成材料、无机植骨材料及各种异种或异体骨等各种治疗方法，给广大骨损伤和骨缺失病人带来福音。
人骨形态发生蛋白的发现起源于早期对骨组分的研究，1965年美国Urist[Urist MR.Science，150：893-399(1965)]发现，牛骨中的基质明胶中存在诱骨生成的物质。经过三十多年的努力，现已从人的各种组织cDNA文库中找到了十多个人骨形态发生蛋白基因，OP-1属其中之一，分子量为14000道儿顿，其中含有碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸多个，为一碱性蛋白。OP-1 cDNA encodes an osteogenicprotein in the TGF-β family//The EMBO Journal，1990；9；2085和Identification ofTGF-B family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone//Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：9843分别公开了BMP-5、6、7的克隆化研究。其基本程序是从骨基质中提取骨形态发生蛋白，纯化后用胰酶消化得到数个肽片段，进行氨基酸测序，以此为依据并参照氨基酸密码写出骨形态发生蛋白的核苷酸序列，分别合成数个寡核苷酸片段为探针，从基因库和cDNA文库进行阳性克隆的筛选。Process of producing osteogenic protein l using yeast//KR97043049公开了用酵母生产成骨蛋白的过程。成骨蛋白-1成熟蛋白编码区cDNA克隆与序列分析//牙体牙髓牙周病学杂志97，7(2)84-87公开了第四军医大口腔医学院陈文等用一步酸酚法从健康人胎盘组织中提取总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成胎盘cDNA文库，然后利用PCR技术，从cDNA文库中扩增出编码人OP-1成熟区的基因片段，将所得基因片段插入DGEM-3If(t)载体，转化大肠杆菌后挑选阳性克隆。克隆到的OP-1的成熟蛋白基因均为人骨形态发生蛋白的结构基因。在国外hOP-1曾在真核细胞CHO中表达，但产量低，成本高。目前未见采用大肠杆菌系统表达人骨形态发生蛋白的产品及其生产方法的报道。
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种重组人骨形态发生蛋白的生产方法，从而获得具有商业价值的药用植骨材料。
实现上述目的，本发明采用下述方案实现：
在大肠杆菌系统中，重组人骨形态发生蛋白的表达和纯化，包括利用RT-PCR方法从正常胎儿肾组织cDNA中，放大获得人骨形态发生蛋白(hOP-1)的基因片段；通过DNA重组技术构建表达质粒，转化大肠杆菌；在培养液不含诱导剂的条件下表达rhOP-1；通过离子交换柱层析，疏水柱层析和分子筛柱层析获得高纯度药用rhOP-1蛋白。
通过RT-PCR进行基因扩增，并改造获得rhOP-1基因片段，其目标蛋白基因序列和相应的氨基酸序列为：
5′ ATG AGA GGA TCC ACG GGG AGC AAA CAG CGC
Met Arg Gly Ser The Gly Ser Lys Gln ArgAGC CAG AAC CGC TCC AAG ACG CCC AAG AAC CAG GAA GCC CTG CGG ATGSer Gln Asn Arg Ser Lys The Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg MetGCC AAC GTG GCA GAG AAC AGC AGC AGC GAC CAG AGG CAG GCC TGT AAGAla Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys LysAAG CAC GAG CTG TAT GTC AGC TTC CGA GAC CTG GGC TGG CAG GAC TGGLys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp TrpATC ATC GCG CCT GAA GGC TAC GCC GCC TAC TAC TGT GAG GGG GAG TGTIle Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu CysGCC TTC CCT CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCC ACC AAC CAC GCC ATC GTGAla Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala The Asn His Ala Ile ValCAG ACG CTG GTC CAC TTC ATC AAC CCG GAA ACG GTG CCC AAG CCC TGCGln The Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu The Val Pro Lys Pro CysTGT GCG CCC ACG CAG CTC AAT GCC ATC TCC GTC CTC TAC TTC GAT GACCys Ala Pro The Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp AspAGC TCC AAC GTC ATC CTG AAG AAA TAC AGA AAC ATG GTG GTC CGG GCCSer Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg AlaTGT GGC TGC CAC TAG 3′Cys Gly Cys His
其中离子交换柱填料为DEAE、Q、QAE、SP或CM类型的阴离子交换剂；疏水柱填料为butyl-、phenyl-或octyl-基的疏水介质；分子筛填料为Sepha·ryl系列、Superdex系列或Sepharose系列的介质。
其中离子交换层析流动相I为20-50mM咪唑盐酸：巴比妥盐、Tris盐酸、硼砂-硼酸或磷酸缓冲液、pH的范围在6.0-9.0；流动相II为上述相应流动相I中加入0.01-0.5M NaCl梯度洗脱。
其中疏水柱层析流动相I为20-50mM咪唑盐酸、巴比妥盐酸、Tris盐酸、硼砂-硼酸或磷酸缓冲液，pH的范围在6.0-9.0，其中加入0.1-1.0M(NH4)2SO4或0.1-1.0M NaCl，流动相II分别以20-50mM pH范围在7.0-9.0的磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液或咪唑缓冲液及水顺序洗脱。
本发明在无诱导剂存在下表达rhOP-1，并通过层析精制纯化获得高纯度药用rhOP-1。这种rhOP-1不仅具有诱骨形成能力，且与胶原蛋白或珊瑚粉类材料复合，对骨损伤和骨缺失具有明显的疗效作用。本发明涉及的是用原核细胞对hOP-1进行表达，同真核细胞和酵母系统相比，具有表达量高、生产成本低、生产工艺简单等优点。该方法的特点是：
(1)通过大量载体和宿主的筛选，确保载体、目的基因和宿主之间达到高
度的协调，使所转化的大肠杆菌把rhOP-1蛋白视为自身的内源性物
质，以至于可以在无诱导剂的存在下高产量表达生产出rhOP-1，表
达量可达30％以上。
(2)纯化过程利用了阴离子交换树脂。其原理是将目标蛋白通过静电相互
作用，结合于填料表面，经洗脱去除非结合非特异性组分后，用高盐
浓度将rhOP-1洗脱下来。
(3)为精制rhOP-1使其浓度达到医用目的，经过阴离子交换树脂纯化后
的粗品rhOP-1，再通过疏水柱层析和分子筛进行纯化，所得到的目
标蛋白纯度大于98％，可以直接用于制剂的配制。
(4)精制纯化获得的rhOP-1与胶原蛋白或珊瑚粉等混合后，进行透析，
经冷冻干燥即可获得具有商业价值的植骨材料。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。
图1是表达载体SWP-1的组成与特性图。
图2是离子交换层析图谱。
图3是疏水层析图谱。
图4是分子筛层析图谱。
图5是重组工程菌的SDS-PAGE电泳图。
图6是rhOP-1冻干产品样品照片。
参见附图，本发明提供一种在大肠杆菌系统中，重组人骨形态发生蛋白的表达和纯化方法。利用RT-PCR技术钓取得到hOP-1基因，经DNA重组技术，获得可以转化大肠杆菌且具有rhOP-1高效表达功能的质粒SWP-1，见图1。在培养液不含诱导剂的条件下表达rhOP-1，通过离子交换柱析、疏水柱层析和分子筛柱层析获高纯度药用rhOP-1蛋白。
具体实施方式如下：
1、rhOP-1工程菌的构建
从医院取华人胎儿的肾细胞，直接用异硫氰酸胍/酚氯仿抽提出总RNA。以总RNA为模板，合成的反义3’端寡核苷酸为引物进行反转录，在反转录液中加入合成的5’端和反义链3’端寡核苷酸引物，用聚合酶链式反应法(RT-PCR)合成rhOP-1结构基因。经2％琼脂糖凝胶电泳分离开合成引物，切取λHind III分子标准564bp处的DNA条带。用第二次RT-PCR后的反应液，经纯化后以粘性末端方法和质粒载体pUC19直接重组连接，并转化到E.coli DH5 α宿主菌中得到转化体，按单菌落扩大培养，抽提重组质粒DNA，作DNA测序，确证含有hOP-1的结构基因，其DNA序列与Genbank Accession No.115078中的结构基因完全一致。
本方法所用的5’端和3’端DNA寡聚核苷酸引物分别为：
N端引物：5’ATC CGG TCC ACGG3’
C端引物：5’GAG GAG CTA GTG GCA3’
本方法所用的RT-PCR条件为：
第一次反应：37℃2min℃→72℃2min→90℃1min循环5次
再42℃2min→72℃2min→90℃1min循环30次
再72℃保温5min
第二次反应：55℃1min→72℃2min℃→90℃1min→循环30次
72℃保温5min
本方法所用的表达型重组质粒的构建，是利用引物寡核苷酸引入结构基因两端的pst I和EcoR I酶切位点，酶切回收OP-1基因，插入连接到以pUC为基础，T7噬菌体启动子启动转录的质粒载体SWP-1上，转化进行入宿主菌E.coli DH5α，然后筛选获得rhOP-1的无诱导高表达重组体。
2、rhOP-1在无诱导剂存在下的表达
以平板上挑选出来的高表达单菌落为发酵种子，在500ml三角瓶中加入100mlLB液体培养基，接入5-10％的对数生长期的种子，于37℃恒温条件下，150rpm摇瓶发酵24h。rhOP-1的表达量可达菌体总蛋白的30％以上，如图5所示。
3、药用rhOP-1的精制和纯化
用pH7.0-9.0的20mMTris-HCl平衡CM-Sephadex C-50柱，以100cm/h上样，用离子交换流动相I加0.01-0.5M NaCl进行梯度洗脱，收集A峰，如图2所示。
在离子交换目标峰收集液中加入0.1-1.0(NH4)2SO4，上Octyl-SepharoseFF柱，用20-50mM硼砂-硼酸缓冲液，在pH7.0-9.0洗脱，再用pH7.0-9.0的20mMTris-HCl洗脱，收集洗脱峰B，如图3所示。在疏水层析目标峰收集液中加入(NH4)2SO4，4℃透析过夜，低温下10000rpm离心10min收集沉淀，用pH4.0的5-50mMNaAc-Hac溶解沉淀，上Sephacyl S-100柱，洗脱，收集目标峰流出液，如图4所示。
将分子筛层析洗脱目标峰流出液，经超滤浓缩，填充、冷冻干燥得到如图6所示的样品。
Claims (5)
1、一种重组人骨形态发生蛋白(rhOP-1)的生产方法，其特征在于：利用RT-PCR方法从正常胎儿肾组织cDNA中，放大获得人骨形态发生蛋白(rhOP-1)的基因片段；通过DNA重组技术构建表达质粒，转化大肠杆菌；在培养液不含诱导剂的条件下表达rhOP-1；通过离子交换柱层析，疏水柱层析和分子筛柱层析获得高纯度药用rhOP-1蛋白。
2、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：通过RT-PCR进行基因扩增，并改造获得rhOP-1基因片段，其目标蛋白基因序列和相应的氨基酸序列为：
5′ ATG AGA GGA TCC ACG GGG AGC AAA CAG CGC
Met Arg Gly Ser The Gly Ser Lys Gln ArgAGC CAG AAC CGC TCC AAG ACG CCC AAG AAC CAG GAA GCC CTG CGG ATGSer Gln Asn Arg Ser Lys The Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg MetGCC AAC GTG GCA GAG AAC AGC AGC AGC GAC CAG AGG CAG GCC TGT AAGAla Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys LysAAG CAC GAG CTG TAT GTC AGC TTC CGA GAC CTG GGC TGG CAG GAC TGGLys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp TrpATC ATC GCG CCT GAA GGC TAC GCC GCC TAC TAC TGT GAG GGG GAG TGTIle Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu CysGCC TTC CCT CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCC ACC AAC CAC GCC ATC GTGAla Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala The Asn His Ala Ile ValCAG ACG CTG GTC CAC TTC ATC AAC CCG GAA ACG GTG CCC AAG CCC TGCGln The Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu The Val Pro Lys Pro CysTGT GCG CCC ACG CAG CTC AAT GCC ATC TCC GTC CTC TAC TTC GAT GACCys Ala Pro The Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp AspAGC TCC AAC GTC ATC CTG AAG AAA TAC AGA AAC ATG GTG GTC CGG GCCSer Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg AlaTGT GGC TGC CAC TAG 3′Cys Gly Cys His
3、如权利要求1所述的生产方法，其中离子交换柱填料为DEAE、Q、QAE、SP或CM类型的阴离子交换剂；疏水柱填料为butyl-、phenyl-或octyl-基的疏水介质；分子筛填料为Sepharyl系列、Superdex系列或Sepharose系列的介质。
4、如权利要求1所述的生产方法，其中离子交换层析流动相1为20-50mM咪唑盐酸、巴比妥盐、Tris盐酸、硼砂-硼酸或磷酸缓冲液、pH的范围在6.0-9.0；流动相II为上述相应流动相I中加入0.01-0.5MNaCl梯度洗脱。
5、如权利要求1所述的生产方法，其中疏水柱层析流动相I为20-50mM咪唑盐酸、巴比妥盐酸、Tris盐酸、硼砂的硼酸或磷酸缓冲液，pH的范围在6.0-9.0，其中加入0.1-1.0M(NH4)2SO4或0 1-1.0M NaCl，流动相II分别以20-50mM pH范围在7.0-9.0的磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液或咪唑缓冲液及水顺序洗脱。
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