CN115389645A - 人工智能芯片与液质联用集成方法在同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用 - Google Patents
人工智能芯片与液质联用集成方法在同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种生物传感芯片结合UPLC‑MS的集成方法在同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用。具体包括：(1)以脑卒中炎症通路的关键蛋白为研究载体，构建关键蛋白修饰的生物传感器；(2)基于此生物传感器，采用电化学工作站测定待测样品与关键蛋白的相互作用强度；(3)采用非特异性和特异性洗脱剂，将结合于关键蛋白上的关键质量属性进行洗脱；(4)富集步骤3中的洗脱液，鉴定分析洗脱液中的化学成分，筛选其抗炎通路关键质量属性。该发明为同仁牛黄清心丸提供了干预脑卒中抗炎通路相关的关键质量属性及其在制备抗炎及治疗脑卒中制剂中的应用，为中药复方关键质量属性的辨识提供了重要方法指导。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种人工智能芯片与液质联用集成方法在同 仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用。
背景技术
《人用药物注册技术要求国际协调委员会药物研发指导原则》(ICHQ8)中 明确指出药品关键质量属性(critical quality attributes，CQAs)是指在适当的限 度、范围或分布之内，确保所需产品质量的物理、化学、生物或微生物性质或特 征。其中以临床疗效为指导的功效关键质量属性是中药及其制剂质量评价和控制 的前提基础。然而，目前中药行业普遍存在质量评价和过程控制指标与临床疗效 缺乏关联的行业痛点难题。
同仁牛黄清心丸作为同仁堂拳头产品之一，具有益气养血、活血化瘀、清 热解毒等功效，尤其适用于急性脑血管病、中风先兆及中风后遗症等。据统计， 其在2020年全国终端零售心血管类中成药中位居前十一，市场需求量大、增长 潜力大，在同类产品中销量始终处于领先地位。炎症是免疫系统维持机体正常 生理功能的重要环节，炎症免疫是导致脑血管病变的核心因素之一。炎症改变 血管内皮细胞的结构和功能，促使血脑屏障出现功能性障碍，造成局部炎症， 从而导致神经系统损害。因此，同仁牛黄清心丸干预脑卒中抗炎通路相关关键 质量属性的辨识研究具有重要的科学价值和产业价值。
基于中药复方成分复杂多样的特点，关键质量属性辨识对技术的灵敏度和检 准确性要求较高。基于半导体材料制备的AlGaAs/GaAs高电子迁移率晶体管 (HEMT)生物传感器，因其灵敏度高，检测速度快，为生物传感筛选所得化学 成分的分离、鉴定提供了重要技术支撑。前期研究发现巨噬细胞游走抑制因子 MIF为炎症相关的关键蛋白，并且构建了MIF功能化修饰的HEMT生物传感器。 然而，对于中药复杂体系中关键质量属性的筛选，生物传感的应用缺乏对关键质 量属性的分析、鉴定。本发明拟将MIF-HEMT生物传感器与UPLC-MS/MS技术 集成，建立一套中药复方关键质量属性辨识的集成方法，克服现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工智能芯片与液质联用集成方法在同仁牛黄 清心丸关键质量属性辨识中的应用。
为克服现有技术不足，一种人工智能芯片与液质联用集成方法在同仁牛黄清 心丸关键质量属性辨识中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1：以同仁牛黄清心丸主治疾病的关键蛋白为研究载体，构建关键蛋白 功能化修饰的生物传感器；
步骤2：基于此生物传感器，采用电化学工作站测定同仁牛黄清心丸样品与 关键蛋白的相互作用强度；
步骤3：采用非特异性和特异性洗脱剂，将结合于关键蛋白上的关键质量属 性进行洗脱；
步骤4：富集步骤3中的洗脱液，采用超高效液相色谱质谱联用技术，鉴定 分析洗脱液中的化学成分，并与同仁牛黄清心丸的全成分进行比对，筛选其关键 质量属性。
根据本发明的一些具体实施方案，生物传感芯片与UPLC-MS/MS的集成方 法在同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用中涉及同仁牛黄清心丸所治病 症的关键蛋白，由于同仁牛黄清心丸的功效包括益气养血、活血化瘀、清热解毒， 其中活血化瘀和清热解毒功效与抗炎关系密切，而研究发现MIF为抗炎相关的 关键蛋白，因此，本发明提供的关键蛋白功能化修饰的生物传感器为MIF-HEMT 生物传感器，构建的具体步骤如下：
(1)在HEMT生物传感芯片上加入60μL 3-巯基丙酸，于室温下浸泡17-24 h，在HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(2)待自主装单层形成后，用水洗去步骤1中多余的巯基试剂，于样品池 中加入20mM碳酰二亚胺盐酸盐EDC和50mM N-羟基丁二酰亚胺NHS的等 体积混合物，反应15min，生成稳定的胺类活化产物用于活化羧基；
(3)用磷酸盐缓冲溶液PBS清洗HEMT器件，加入MIF蛋白，置于4℃ 环境下反应，即得MIF功能化修饰的HEMT器件生物传感器；
(4)采用CHI660e电化学工作站测定MIF-HEMT生物传感器的Ids-Vds， 对蛋白功能化修饰时间进行考察。
生物传感器Ids-Vds随蛋白修饰时间变化如图1所示，由图可知，加入蛋白 0.5h时，Ids-Vds基本无变化，2小时为蛋白的最佳修饰时间，进一步优化生物传 感器中MIF蛋白功能化修饰时间为2h。
根据本发明的一些具体实施方案，步骤2中的电化学工作站包括但不限于 2400、CHI660e的提供电流和电压的设备，给定恒定电压为2-5V，且电流精度 需达μA级，扫描方式为电压偏压式。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明还提供了同仁牛黄清心丸样品的前 处理方法，具体步骤如下：
(1)取同仁牛黄清心丸样品15g于圆底烧瓶中，加入10倍量即150mL水， 采用水蒸气蒸馏法加热回流5h，收集挥发油和烧瓶中的水提取液；
(2)向烧瓶中的药渣加入150mL 50％甲醇进行加热回流1小时；
(3)合并水提液和50％甲醇提取液，作为同仁牛黄清心丸的非挥发油提取 液；
(4)取此提取液10-30mL，浓缩至1-2mL，采用制备液相，以水和乙醇 为洗脱液，对提取液进行分段分离，按照紫外吸收结果作为判断依据，将同仁牛 黄清心丸提取液分为三段。
本发明提供了基于MIF-HEMT生物传感器的同仁牛黄清心丸样品与MIF相 互作用强弱，3种洗脱液与MIF相互作用如图2所示，计算3种洗脱液与MIF 的相互作用强弱分别为5％乙醇洗脱段与MIF相互作用的解离常数Kd为 5.640×10^-9，45％乙醇洗脱段为1.288×10^-6，80％乙醇洗脱段为2.804×10^-6。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明还提供了基于UPLC-MS/MS技术 的洗脱成分鉴定分析，具体步骤如下：
步骤1：采用PBS作为非特异性洗脱剂，将结合于MIF-HEMT生物传感器 件之上的样品进行洗脱，3次，每次反应5分钟，合并洗脱液；进一步，采用5-O- 甲基维斯阿米醇苷进行洗脱，3次，每次反应5分钟，合并洗脱液；最后，采用 苦杏仁苷进行洗脱，3次，每次反应5分钟，合并洗脱液；
步骤2：采用固相萃取技术，洗去3种洗脱液中的磷酸盐，并对其进行富集， 作为样品溶液；
步骤3：采用超高效液相色谱质谱联用技术，以水和乙腈为流动相，设置色 谱和质谱条件如下：
色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18(2.1×100 mm，1.8μm)，批号为B16231，柱温为30℃，进样量为1μL，检测波长为280nm。 流动相比例和流速分别为A相0.1％甲酸水溶液，B相0.1％甲酸乙腈，梯度见表 1。
表1流动相梯度
质谱条件：质谱检测模式为ESI源Negative/Positive ion mode，质谱参数如 表2所示
表2质谱参数
3种洗脱液的测定结果如图3所示，比对同仁牛黄清心丸全方的成分信息， 鉴定3种洗脱液中所含的化学成分，确定同仁牛黄清心丸中5％乙醇洗脱段中的 关键质量属性为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、6-姜烯酚、 甘草酸、芒柄花素、甘草酸异构体、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、野黄芩苷、 甘草次酸、芒柄花素、甘草酸异构体；45％乙醇洗脱段中的关键质量属性为升麻 素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、6-姜烯酚、甘草酸；80％乙醇 洗脱段中的关键质量属性为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、 6-姜烯酚、甘草酸、甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷、 亥茅酚苷。
本发明提供了同仁牛黄清心丸关键质量属性，其特征在于，包括但不限于升 麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、6-姜烯酚、甘草酸、芒柄花 素、甘草酸异构体、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、野黄芩苷、甘草次酸、芒柄 花素、甘草酸异构体、甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷、异甘草 苷和亥茅酚苷。
本发明进一步提供了同仁牛黄清心丸关键质量属性在制备抗炎及治疗脑卒 中制剂中的应用。
根据本发明的一些具体实施方案，一种抗炎及治疗脑卒中制剂的形式为注射 剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释剂、缓释剂或 纳米制剂。
本发明的有益之处在于提供了一种人工智能芯片与液质联用的集成方法解 决中药复杂体系中与药效关联的关键质量属性解析的难题，相比现有技术，这种 集成不仅阐明了复杂体系与潜在靶点间的相互作用与否和相互作用强弱，检测浓 度低至pg级，并且还采用液质联用技术实现了中药复杂体系关键质量属性的解 析，克服了单一技术的不足，为中药大品种及中药复方关键质量属性解析提供了 重要参考。
附图说明
图1不同修饰时间下的生物传感器Ids-Vds曲线变化情况。
图2三种洗脱液与MIF相互作用，(a)不同浓度5％乙醇洗脱段(A段)与 MIF相互作用的Ids-Vds曲线；(b)各对数浓度下的相对电流变化(A段)；(c)不 同浓度45％乙醇洗脱段(B段)与MIF相互作用的Ids-Vds曲线；(d)各对数浓度 下的相对电流变化(B段)；(e)不同浓度80％乙醇洗脱段(C段)与MIF相互 作用的Ids-Vds曲线；(f)各对数浓度下的相对电流变化(C段)
图3同仁牛黄清心丸各段样品的5-O-甲基维斯阿米醇苷洗脱液总离子流图 ((a)A段正离子源模式；(b)A段负离子源模式；(c)B段正离子源模式；(d)B 段负离子源模式；(e)C段正离子源模式；(f)C段负离子源模式)；同仁牛黄清心 丸各段样品的苦杏仁苷洗脱液总离子流图；(g)A段正离子源模式；(h)A段负离 子源模式；(i)B段正离子源模式；(j)B段负离子源模式；(k)C段正离子源模式； (m)C段负离子源模式)。
具体实施方式
实施例1基于MIF-HEMT生物传感技术的同仁牛黄清心丸与MIF相互作用 研究
(1)同仁牛黄清心丸待测样品的制备：取同仁牛黄清心丸样品15g于圆底 烧瓶中，加入10倍量即150mL水，采用水蒸气蒸馏法加热回流5h，收集挥发 油和烧瓶中的水提取液；向烧瓶中的药渣加入150mL 50％甲醇进行加热回流1 小时；合并水提液和50％甲醇提取液，作为同仁牛黄清心丸的非挥发油提取液； 取此提取液10-30mL，浓缩至1-2mL，采用制备液相，以水和乙醇为洗脱液， 对提取液进行分段分离，按照紫外吸收结果作为判断依据，将同仁牛黄清心丸提 取液分为三段；每段样品分别按十倍梯度稀释10次，制备11个浓度梯度的样品 溶液，分别标记为A1，A2，......A11；B1，B2，......B11；C1，C2.......C11；作为待测样品；
(2)空白溶液影响测定：制备MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，以 0.1M的PBS溶液为空白溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度 (IDS-VDS)，将此信号作为空白信号；
(3)按浓度由低到高(1.0pg/mL-1.0g/mL)的依次向MIF-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入同仁牛黄清心丸各段样品，采用电化学装置记录不同浓度下 的Ids-Vds，各响应结果如图1所示，由图可知，当MIF蛋白修饰在自组装单层 之后，Ids-Vds发生显著变化，而PBS修饰后，其曲线和MIF蛋白修饰后类似， 这表明生物传感器构建成功；
(4)以同仁牛黄清心丸浓度的对数(Lg[Ag])为横坐标，以电流变化相对 值(I-I0)/I0(ΔI/I0)为纵坐标，进行线性拟合，判断生物传感器的线性范围； 结果如图2所示，由图可知，同仁牛黄清心丸A、B、C三段均与MIF具有较强 的结合，通过浓度[Ag]与[Ag]/ΔI的拟合结果计算A、B、C三段与MIF的相互作 用分别为A段Kd＝5.640×10^-9g/mL，B段Kd＝1.288×10^-6g/mL，C段Kd＝ 2.804×10^-6g/mL。
实施例2基于UPLC-MS/MS的同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识
(1)仪器与方法
Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；AB Sciex Triple
4600高分辨质谱(SCIEX公司)；固相萃取仪；
Agilent ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)(批 号：B16231)；Grace PureTM SPE C18-LoW固相萃取小柱(500mg/3mL)；Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；R200D型电子分析天平(1/10万) (德国Sartorius公司)；甲酸(色谱纯，德国Merck公司)；甲醇、乙腈(质谱纯， 美国Thermo Fisher公司)。
(2)蛋白洗脱液样品前处理
以蛋白洗脱液为研究载体，采用固相萃取技术，采用5mL甲醇冲洗规格为 1mL的固相萃取小柱，用于柱子活化；上样，首先采用5mL甲醇，按1mL/min 的流速进行洗脱，去掉样品中的PBS；再加入5mL水，按1mL/min的流速进 行洗脱，采用离心浓缩仪将样品挥干，加入0.5mL初始流动相即0.1％乙腈-(0.1％ 甲酸)进行复溶，备用；
(3)基于UPLC-MS/MS技术的蛋白洗脱液成分鉴定分析
液相条件：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1×100mm， 1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μl；检测波长：280nm；流动相比例和流速： A相0.1％甲酸水溶液，B相0.1％甲酸乙腈，梯度见表1：
表1流动相梯度
质谱条件：
质谱检测模式：ESI源Negative/Positive ion mode
质谱参数：见表2。
表2 Mass parameters
两个洗脱液(5-O-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷)的正负模式下总离子流图 见图3。经鉴定分析，得A段的关键质量属性主要包括13种，具体为升麻素苷、 升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、6-姜烯酚、甘草酸、芒柄花素、甘草 酸异构体、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、野黄芩苷、甘草次酸，B段的关键质 量属性与A段较为一致，主要包括6种，具体为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基 维斯阿米醇苷、黄芩苷、6-姜烯酚、甘草酸，C段的关键质量属性主要包括14 种，具体为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、6-姜烯酚、甘草酸、芒柄花素、甘草酸异构体、甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花 苷、异甘草苷、亥茅酚苷。此19个关键质量属性裂解方式如下：
绿原酸(Chlorogenic acid)属于咖啡酰奎尼酸类成分，其分子式为C16H18O9。 在负离子模式下，化合物1的准分子离子峰为353.0878[M-H]-；保留时间与同仁 牛黄清心丸全方质谱分析结果一致，其酯键断裂失去C9H7O3，得到m/z 191.0566， 其裂解途径与文献报道结果一致，因此推测化合物1为绿原酸。
芍药内酯苷(Albiflorin)和芍药苷(Paeoniflorin)都属于单帖类成分，两者 具有相同的分子式C23H28O11。在负离子模式下，化合物2和化合物3的准分子 离子峰皆为525.1613[M+FA-H]-，在479.1572[M-H]-离子峰的基础上加上一个 HCOOH基团，两者的保留时间分别为11.81和12.79，均与同仁牛黄清心丸全方 质谱分析结果一致。化合物2的m/z283离子碎片是由葡萄糖基团和苯甲酸酯基 的六元环组合而成，m/z 121.0299离子碎片是连在蒎烷骨架上的苯甲酰基掉落形 成，其裂解途径与文献报道一致，故推测化合物2为芍药内酯苷。化合物3的 m/z 449.1485离子碎片是在479.1572[M-H]-离子峰基础上掉落了一个-CH2O基 团，进一步丢失一分子苯甲酸生成m/z 327.1104离子，m/z 121.0299离子碎片与化合物2形成途径相同，该化合物的离子碎片及裂解途径与文献报道一致，故 推测化合物3为芍药苷。
升麻素苷(Prim-O-glucosylcimifugin)和升麻素(Cimifugin)属于黄酮类成 分，分子式分别为C22H28O11、C16H18O6。在正离子模式下，化合物4的准分子 离子峰为469.1704[M+H]+，保留时间为13.93min；化合物8的准分子离子峰为 307.1176[M+H]+，保留时间为16.66min，与同仁牛黄清心丸全方质谱分析结果 一致。其中化合物4的m/z 397.1097离子碎片由准分子离子峰469.1704[M+H]+失去一个C4H8O基团形成，m/z 307.1163则在469.1704[M+H]+的基础上掉落一 个glu基团，m/z 397.1097二级碎片丢失一个glu基团生成m/z235.0574；而化合 物8的离子碎片信息包括259.0604[M+H-C2H6-H2O]+、 235.0627[M+H-C2H6-H2O-C2H2]+、221.0451[M+H-C2H6-H2O-C2H2-CH2]+，以上 裂解方式可推导出化合物8是化合物4脱去一个glu基团而形成，且裂解途径与 文献报道一致，故推测化合物4为升麻素苷，化合物8为升麻素。
甘草苷(Liquiritin)与异甘草苷(Isoliquiritin)属于黄酮类化合物，具有相 同的分子式C21H22O9。在负离子模式下，化合物5和化合物12的准分子离子峰 都是417.1191[M-H]-，保留时间分别为15.26min、21.68min，与同仁牛黄清心丸 全方质谱分析结果一致。在负离子模式下，化合物5的离子碎片包括 417.1191[M-H]-、255.0667[M-H-Glc]-、135.0095[M-H-Glc-C8H8O]-、 119.0505[M-H-Glc-C7H4O3]-，化合物12的离子碎片包括417.1178[M-H]-、255.0675[M-H-Glc]-、135.0088[M-H-Glc-C8H8O]-。两个化合物的离子碎片信息及 裂解方式与文献报道一致，故推测化合物5为甘草苷，化合物12为异甘草苷。
芹糖苷草苷(Liquiritin apioside)与芹糖异甘草苷(Isoliquiritin apioside)为 同分异构体，属黄酮类成分，分子式为C26H30O13。在负离子模式下，化合物6 与化合物10的准分子离子峰均为549.1613[M-H]-，保留时间分别是15.47min和 21.16min，与同仁牛黄清心丸全方质谱分析结果一致，说明化合物10比化合物6 极性小。两个化合物在负离子模式下离子碎片信息包括549.1620[M-H]-、 255.0664[M-H-APi-Glc]-、135.0084[M-H-APi-Glc-C8H8O]-，两个化合物的离子碎 片信息与文献报道一致，故推测化合物6为芹糖甘草苷，化合物10为芹糖异甘 草苷。
野黄芩苷(Scutellarin)和黄芩苷(Baicalin)属于黄酮类化合物，分子式分 别是C21H18O12、C21H18O11。在负离子模式下，化合物7与化合物13的准分子离 子峰分别为461.0725[M-H]-、445.0776[M-H]-，保留时间分别是16.27min、 22.02min，与同仁牛黄清心丸全方质谱分析结果一致。化合物7的离子碎片信息 主要包括285.0415[M-H-C6H8O6]-、267.0277[M-H-C6H8O6-H2O]-、175.0242[M-H- C15H10O6]-。化合物13的离子碎片信息主要包括269.0460[M-H-C6H8O6]-、113.0254 [M-H-C15H10O5-HCOOH-H2O]-。两者化合物的离子碎片信息与文献报道一致，故 推测化合物7为野黄芩苷，化合物13为黄芩苷。
5-O-甲基维斯阿米醇苷(4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol)属于黄酮类化合物，分子式为C22H28O10。在负离子模式下，化合物9的准分子离子 峰497.1664[M+FA-H]-，保留时间是18.74min，与同仁牛黄清心丸全方质谱分析 结果一致。化合物9的离子碎片信息主要包括451.1616[M-H]-、271.0976[M -H-C6H12O6]-，该化合物的离子碎片信息与文献报道一致，故推测化合物9为5-O- 甲基维斯阿米醇苷。
芒柄花苷(Ononin)和芒柄花素(Formononetin)都属于黄酮类化合物，芒 柄花苷分子式为C22H22O9，芒柄花素是芒柄花苷水解脱掉一个C6H10O5分子的苷 元部分，分子式为C16H12O4。化合物11在负离子模式下的准分子离子峰为 475.1246[M+FA-H]-，保留时间为21.33min；化合物15在正离子模式下的准分子 离子峰为269.0808[M+H]+，保留时间为32.49min，与同仁牛黄清心丸全方质谱 分析结果一致。化合物11主要的离子碎片信息包括475.1336[M+FA-H]-、267.0682[M-H-C6H10O5]-、252.0428[M-H-C6H10O5-CH3]-；化合物15主要的离 子碎片信息包括269.0802[M+H]+、254.0548[M+H-CH3]+、237.0552[M+H-CH3OH] +、197.0566[M+H-CH3OH-C2O]+。综上所述，两个化合物的离子碎片信息及裂解 方式皆与文献报道一致，故推测化合物11为芒柄花苷，化合物15为芒柄花素。
亥茅酚苷(Sec-O-glucosylhamaudol)属于黄酮类化合物，亥茅酚苷分子式 为C21H26O10。在正离子模式下，化合物14的准分子离子峰为439.1599[M+H]+， 保留时间为25.58min，与同仁牛黄清心丸全方质谱分析结果一致。化合物14的 m/z 277.1089离子碎片是m/z 439.1599[M+H]+脱去一分子糖而形成的苷元部分， 进一步丢失一分子水生成m/z259.0974，再失去一个C4H6分子形成205.0481离 子碎片，该化合物的离子碎片信息及裂解方式皆与文献报道一致，故推测化合物 14为亥茅酚苷。
甘草酸(Glycyrrhizic acid)和甘草酸异构体(Glycyrrhizic acid isomer)属于三萜皂苷类成分，互为同分异构体，分子式均为C42H62O16；甘草次酸 (Glycyrrhetinicacid)是甘草酸的双糖链水解脱掉的苷元部分，分子式为 C30H46O4。在负离子模式下，化合物16、化合物17、化合物19的准分子离子峰 分别为821.3965[M-H]-、821.3965[M-H]-、469.3323[M-H]-，其保留时间分别是 37.35min、39.53min、45.19min，与同仁牛黄清心丸全方质谱分析结果一致，说 明化合物17和化合物19比化合物16极性小。化合物16和化合物17在负离子 模式下裂解途径相同，其中化合物16的离子碎片包括821.3917[M-H]-、351.0547[M-H-C30H46O4]-，化合物17的离子碎片包括821.3988[M-H]-、 351.0559[M-H-C30H46O4]-。m/z351离子在m/z821离子的基础上脱去了苷元部分 而产生的双葡萄糖醛酸碎片，属于甘草酸类物质的特征离子；化合物19的m/z 469.3359是化合物16的m/z 821.3917[M-H]-丢失双葡萄糖醛酸而形成的碎片， m/z 425.3431则由m/z 469.3359[M-H]-脱去一个羧基而形成。综上所述，三个化 合物的离子碎片信息及裂解方式皆与文献报道一致，故推测化合物16为甘草酸， 化合物17为甘草酸异构体，化合物19为甘草次酸。
6-姜烯酚(6-Shogaol)属于烷基酚类化合物，其分子式为C17H24O3。在正离 子模式下，化合物18的准分子离子峰为277.1798[M+H]+，保留时间是43.46min， 与同仁牛黄清心丸全方质谱分析结果一致。该化合物主要包含的离子碎片信息有 137.0589[M+H-C9H16O]+、122.0357[M+H-C9H16O-CH3]+，该化合物的离子碎片信 息与文献报道一致，故推测化合物18为6-姜烯酚。
实施例3同仁牛黄清心丸关键质量属性在制备抗炎及治疗脑卒中制剂中的 应用
一种抗炎及治疗脑卒中的片剂、胶囊剂、气雾剂、滴丸剂和纳米制剂，具体 制备方法如下：
(1)片剂、胶囊剂：取同仁牛黄清心丸干预脑卒中抗炎通路关键质量属性 作为药物，按此两种剂型的常规工艺制备，每片或每颗胶囊中含药物0.1～500mg， 经检验合格后，包装即得。
(2)气雾剂：取同仁牛黄清心丸干预脑卒中抗炎通路关键质量属性作为药 物，与适宜的抛射剂封装在具有特制阀门装置的耐压容器中，使用时借助容器内 的抛射剂的压力将内容物喷出呈细雾状、泡沫状或其他形状的制剂。可用于呼吸 道吸入、皮肤、粘膜或腔道给药等。
(3)滴丸剂：取同仁牛黄清心丸干预脑卒中抗炎通路关键质量属性作为药 物，以单硬脂酸甘油酯、硬脂酸等作为基质，将基质加热熔融，然后将药物溶解、 混悬或乳化于熔融的基质中，保温下滴入不相混溶的冷却液里，在表面张力的作 用下，熔融基质收缩成球状，冷却固化成丸，每1g滴丸含药物为0.1～500mg， 经检验合格后，包装即得。
(4)纳米制剂：取同仁牛黄清心丸干预脑卒中抗炎通路关键质量属性作为 药物，与聚氰基丙烯酸酯(PACA)生物可降解的合成高分子材料按照纳米制剂 常规工艺一起制备成纳米制剂，作为靶向药物制剂，直接到达病灶部位，提高疗 效，降低毒性作用，每粒含药物为0.1～500mg，经检验合格，包装即得。
Claims (10)
1.一种人工智能芯片与液质联用集成方法在同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1：以同仁牛黄清心丸主治疾病的关键蛋白为研究载体，构建关键蛋白功能化修饰的生物传感芯片；
步骤2：基于此生物传感芯片，采用电化学工作站结合人工智能算法测定同仁牛黄清心丸样品与关键蛋白的相互作用强度；
步骤3：采用非特异性和特异性洗脱剂，将结合于关键蛋白上的关键质量属性进行洗脱；
步骤4：富集步骤3中的洗脱液，采用超高效液相色谱质谱联用技术，鉴定分析洗脱液中的化学成分，并与同仁牛黄清心丸的全成分进行比对，筛选其关键质量属性。
2.根据权利要求1所述的一种人工智能芯片与液质联用集成方法在同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用，其特征在于，步骤1中生物传感芯片为同仁牛黄清心丸主治疾病的关键蛋白功能化修饰的生物传感器，包括但不限于表面等离子共振生物传感芯片、高电子迁移率场效应晶体管生物传感芯片。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，权利要求1步骤2中的电化学工作站包括但不限于2400、CHI660e的提供电流和电压的设备，给定恒定电压为2-5V，且电流精度不低于μA级。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，权利要求1步骤2中的同仁牛黄清心丸样品的前处理具体步骤如下：
步骤1：取同仁牛黄清心丸样品于圆底烧瓶中，加入6-14倍量水，采用水蒸气蒸馏法加热回流，收集挥发油和烧瓶中的水提取液；
步骤2：向烧瓶中的药渣加入6-14倍量的甲醇水溶液，进行加热回流0.5-2小时；
步骤3：合并水提液和甲醇水溶液提取液，作为同仁牛黄清心丸的非挥发油部位提取液；
步骤4：取此提取液浓缩，采用层析柱分离的方式，对提取液进行分段分离，将同仁牛黄清心丸提取液分段收集。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，权利要求1步骤3中的非特异性洗脱剂为反应体系用到的缓冲溶液，特异性洗脱剂包括关键蛋白的特异性配体溶液，且洗脱次数不低于3次。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，权利要求1步骤4中化学成分的具体检测步骤如下：
步骤1：采用固相萃取技术，洗去洗脱液中的磷酸盐，并对其进行富集，作为样品溶液；
步骤2：集成超高效液相色谱质谱联用技术，对样品洗脱液进行分离分析；
步骤3：比对同仁牛黄清心丸的成分信息，鉴定洗脱液中所含的化学成分，作为同仁牛黄清心丸的关键质量属性。
7.同仁牛黄清心丸关键质量属性，其特征在于，包括但不限于升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、6-姜烯酚、甘草酸、芒柄花素、甘草酸异构体、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、野黄芩苷、甘草次酸、芒柄花素、甘草酸异构体、甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷、异甘草苷和亥茅酚苷。
8.同仁牛黄清心丸关键质量属性在制备抗炎及治疗脑卒中制剂中的应用。
9.根据权利要求9所述的一种抗炎及治疗脑卒中制剂，其特征在于，包括权利要求7所述的同仁牛黄清心丸关键质量属性和药用辅料。
10.根据权利要求9所述的一种抗炎及治疗脑卒中制剂，其特征在于，所述的制剂形式为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释剂、缓释剂或纳米制剂。
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