CN114487210B - 基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：S1、磁性固相萃取方法进行样本中类固醇激素的前处理，制备测试样：S2、构建标准曲线；S3、采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，结合构建的标准曲线得到测试样中的类固醇激素的含量。本发明提供的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，使用了磁性固相萃取方法进行样本中类固醇激素的前处理，其基于基质分散型固相萃取，藉由外部磁场将磁性固相萃取填料进行转移，整个实验流程易于实现自动化，能减轻实验人员负担；同时，还保留了固相萃取高选择性、高净化率的优点。
Description
技术领域
本发明涉及质谱检测技术领域，特别涉及一种基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
在临床质谱体外诊断试剂中，检测血清中类固醇激素常用的前处理方法有液液萃取法(LLE)、固相支持液液萃取法(SLE)、固相萃取法(SPE)等，其中液液萃取法应用最为广泛，该方法具有成本低的特点，但该法去除内源性干扰物的能力较差，容易堵塞色谱柱及污染质谱仪器，同时实验中使用了挥发性强的试剂，对实验人员存在健康隐患；固相支持液液萃取法实验机理为液液萃取机理，产品形式为96孔板，同样也属于高成本的实验耗材，实验中需要使用大量挥发性强的有机试剂，对实验环境及人员均不友好；固相萃取法利用固相萃取填料与目标物的作用力，选择性吸附目标物，可以达到良好的净化效果，但固相萃取法使用的固相萃取柱/固相萃取96孔板均为高成本实验耗材，实验中固相萃取填料接触到有机试剂之后会产生溶胀现象，会影响溶液通过固相萃取填料的流速，从而产生孔间均一性差的问题。以上三种方法，还均存在一个共同的问题，即不便于实现全自动化样品前处理。
所以，现在需要提供一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
S1、制备测试样：
S1-1、取样品管，向其中加入待测样本和内标溶液，混匀；
S1-2、活化：取另一样品管，加入磁珠，使用甲醇活化磁珠；
S1-3、平衡：使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-2处理后得到的磁珠移入高纯水中，平衡磁珠；
S1-4、使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-3处理后得到的磁珠移入S1-1样品管中，混匀；
S1-5、一次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入第一淋洗液中，混匀；
S1-6、二次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入第二淋洗液中，混匀；
S1-7、洗脱：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入洗脱液中，混匀，然后通过磁性固相萃取仪器移弃磁珠，移取样品管中的洗脱液，并稀释，混匀，得到测试样；
S2、构建标准曲线：
配置不同浓度的类固醇激素标准液，供液相色谱串联质谱法检测，以构建待测的类固醇激素的标准曲线；
S3、采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，结合构建的标准曲线得到测试样中的类固醇激素的含量。
优选的是，第一淋洗液为甲醇的体积分数占1-10％的甲醇水溶液。
优选的是，第二淋洗液为甲醇的体积分数占20-60％的甲醇水溶液。
优选的是，洗脱液为甲醇和乙酸乙酯的混合液。
优选的是，洗脱液中的甲醇和乙酸乙酯的体积比为1:2～2:8。
优选的是，所述步骤S1具体包括：
S1、制备测试样：
S1-1、取样品管，向其中加入300-700uL的待测样本和5-15uL的内标溶液，混匀1-5min；
S1-2、活化：取另一样品管，加入1-5mg磁珠，使用100-400uL甲醇活化磁珠；
S1-3、平衡：使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-2处理后得到的磁珠移入200-600uL高纯水中，平衡磁珠；
S1-4、使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-3处理后得到的磁珠移入S1-1样品管中，混匀1-5min；
S1-5、一次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入300-700uL的第一淋洗液中，混匀1-5min；
S1-6、二次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入300-700uL的第二淋洗液中，混匀1-5min；
S1-7、洗脱：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入25-100uL洗脱液中，混匀1-5min，然后通过磁性固相萃取仪器移弃磁珠，移取样品管中的洗脱液，并向洗脱液中加入25-100uL高纯水进行稀释，混匀1-5min，10000-20000转/分钟下离心2-10min，得到测试样。
优选的是，所述步骤S1具体包括：
S1、制备测试样：
S1-1、取样品管，向其中加入500uL的待测样本和10uL的内标溶液，混匀2min；
S1-2、活化：取另一样品管，加入1.5mg磁珠，使用200uL甲醇活化磁珠；
S1-3、平衡：使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-2处理后得到的磁珠移入400uL高纯水中，平衡磁珠；
S1-4、使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-3处理后得到的磁珠移入S1-1样品管中，混匀2min；
S1-5、一次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入500uL的第一淋洗液中，混匀2min；
S1-6、二次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入500uL的第二淋洗液中，混匀2min；
S1-7、洗脱：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入50uL洗脱液中，混匀2min，然后通过磁性固相萃取仪器移弃磁珠，移取样品管中的洗脱液，并向洗脱液中加入50uL高纯水进行稀释，混匀2min，14000转/分钟下离心5min，得到测试样。
优选的是，所述洗脱液中的甲醇和乙酸乙酯的体积比为2:8。
优选的是，其中，类固醇激素包括睾酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、可的松，雄酮、雄烯二酮中的一种或多种。
优选的是，所述步骤S3中，液相色谱检测条件为：
色谱柱：十八烷基硅胶填料柱；
流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：初始，30％B；0-1min，45％B；1-7min，60％B；7-8.5min，100％B；8.5-10min，100％B；10-10.1min，30％B；10.1-11.5min，30％B；
流速：0.5mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃。
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
检测方式：多反应监测；
气帘气15psi，喷雾器60psi，辅助加热气25psi，温度350℃，离子化电压5500V，碰撞气9psi。
本发明的有益效果是：
本发明提供的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，使用了磁性固相萃取方法进行样本中类固醇激素的前处理，其基于基质分散型固相萃取，藉由外部磁场将磁性固相萃取填料进行转移，整个实验流程易于实现自动化，能减轻实验人员负担；同时，还保留了固相萃取高选择性、高净化率的优点；
本发明通过磁性固相萃取填料分散吸附增加接触面积，能提高吸附速率及富集效果，缩短平衡时间；
本发明能够避免SPE流速差异、填料溶胀等误差，降低质谱检测变异性；
本发明能避免使用大量挥发性溶剂，环境友好，可减少对实验人员的危害；
本发明的样品处理步骤能够去除内源性磷脂、蛋白质等物质的干扰，降低基质效应与仪器污染风险。
附图说明
图1为本发明的实施例中的磁性固相萃取填料转移示意图；
图2为本发明的实施例中的目标物色谱图；
图3为本发明的实施例中的目标物标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
试剂来源说明
标准品：睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、脱氢表雄酮(DHEA)、17-羟孕酮(17-OHP)、孕酮(P)、皮质醇(F)、皮质酮(B)、11-脱氧皮质醇(11S)、11-脱氧皮质酮(11-DOC)、可的松(E)购自Sigma-Aloric公司，雄酮(A)购自上海甄准生物科技有限公司、雄烯二酮(AD)购自北京振翔科技有限公司；
孕酮-d9、睾酮-d3购自Sigma-Aloric公司、雄烯二酮-d7购自上海甄准生物科技有限公司，双氢睾酮-13C3、雄酮-d4、脱氢表雄酮-d6、17-羟孕酮-d8、皮质醇-d4、皮质酮-d4、11-脱氧皮质醇-d5、11-脱氧皮质酮-d7、可的松-d8购自上海谱芬生物技术有限公司。磁珠购买于天津博蕴生物；
甲醇、乙酸乙酯购买于天津康科德公司；
吸附处理牛血购买于杭州四季青公司；
高纯水是符合国际GB/T 6682-2008的一级水。
实施例1
本实施例提供一种基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
S1、制备测试样：
S1-1、取样品管，向其中加入500uL的待测样本和10uL的内标溶液，混匀2min；
S1-2、活化：取另一样品管，加入1.5mg磁珠，使用200uL甲醇活化磁珠；
S1-3、平衡：使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-2处理后得到的磁珠移入400uL高纯水中，平衡磁珠；
S1-4、使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-3处理后得到的磁珠移入S1-1样品管中，混匀2min；
S1-5、一次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入500uL的第一淋洗液中，混匀2min；
S1-6、二次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入500uL的第二淋洗液中，混匀2min；
S1-7、洗脱：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入50uL洗脱液中，混匀2min，然后通过磁性固相萃取仪器移弃磁珠，移取样品管中的洗脱液，并向洗脱液中加入50uL高纯水进行稀释，混匀2min，14000转/分钟下离心5min，得到测试样。
其中，可通过磁力架或磁性固相萃取仪器施加外加磁场进行磁性固相萃取填料的转移，本实施例中采用磁性固相萃取仪器，磁性固相萃取填料为亲磁性微球或磁珠等水亲脂平衡型磁性固相萃取填料。
参照图1，为磁性固相萃取填料转移示意图，其中采用磁性固相萃取仪器为磁棒，磁棒外套有搅拌套，通过磁棒的磁性收集磁珠(磁性固相萃取填料)。
S2、构建标准曲线：
配置不同浓度的类固醇激素标准液，供液相色谱串联质谱法检测，以构建待测的类固醇激素的标准曲线。
取标准品睾酮、双氢睾酮、雄酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、可的松母液1mg/mL，雄烯二酮母液100ug/mL用甲醇进行稀释，得到的睾酮T浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL、10ng/mL，双氢睾酮DHT浓度分别为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL，雄酮A浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL、10ng/mL，雄烯二酮AD浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL、10ng/mL，脱氢表雄酮DHEA浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL，17-羟孕酮17-OHP浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL、10ng/mL，孕酮P浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，皮质醇F浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL，皮质酮B浓度分别为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，11-脱氧皮质醇11S浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL、10ng/mL，11-脱氧皮质酮11-DOC浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.15ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL，可的松E浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、50ng/mL。睾酮-d3、双氢睾酮-13C3、雄酮-d4、雄烯二酮-d7、脱氢表雄酮-d6、17-羟孕酮-d8、孕酮-d9、皮质醇-d4、皮质酮-d4、11-脱氧皮质醇-d5、11-脱氧皮质酮-d7、可的松-d8通过稀释得到的浓度分别为100ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、100ng/mL、1500ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、100ng/mL、100ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。
S3、采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，结合构建的标准曲线得到测试样中的类固醇激素的含量。
(1)液相色谱检测条件为：
色谱柱：十八烷基硅胶填料柱(2.1×100mm，3.5μm)；
流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：初始，30％B；0-1min，45％B；1-7min，60％B；7-8.5min，100％B；8.5-10min，100％B；10-10.1min，30％B；10.1-11.5min，30％B；
流速：0.5mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃。
(2)质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI+)；
检测方式：多反应监测(MRM)；
气帘气(CUR)15psi，喷雾器(GS1)60psi，辅助加热气(GS2)25psi，温度(TEM)350℃，离子化电压(IS)5500V，碰撞气(CAD)9psi。每种化合物的母离子、子离子、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。
表1质谱采集参数
参照图2，为目标物色谱图，其中：(a)T的色谱图；(b)DHT的色谱图(9.92min)；(c)A的色谱图；(d)AD的色谱图；(e)DEHA的色谱图；(f)17-OHP的色谱图(9.67min)；(g)P的色谱图；(h)F的色谱图；(i)B的色谱图(8.12min)；(j)11S的色谱图(8.43min)；(k)11-DOC的色谱图(9.44min)；(l)E的色谱图。
参照图3，为目标物标准曲线图，其中：(a)T的线性图；(b)DHT的线性图；(c)A的线性图；(d)AD的线性图；(e)DEHA的线性图；(f)17-OHP的线性图；(g)P的线性图；(h)F的线性图；(i)B的线性图；(j)11S的线性图；(k)11-DOC的线性图；(l)E的线性图。
实施例2
1、本实施例中，对磁性固相萃取填料的添加量进行了详细优化，通过采用不同添加量的磁性固相萃取填料(磁珠)进行实验，并综合考量整体检测方法，确定了磁性固相萃取填料的添加量。不同添加量下，对比洗脱液峰面积数据如下表2：
表2
由实验数据可见，在1mg-3mg的磁珠质量范围内，几乎所有检测物在洗脱液中的峰面积都呈现出先增加后下降的趋势。这是由于当磁珠量较少时，填料中的位点不够以吸附所有目标物，这会导致部分物质在上样或淋洗阶段损失掉，因此洗脱液中目标物的峰面积偏小。而随着磁珠数量的增加，洗脱剂的体积一定时，磁珠越多洗脱进行得越不充分，同样会造成目标物质的损失。通过对比，大多数指标在磁珠用量为1.5mg时，洗脱液中的峰面积最大。因此经过优化，使用微球的质量为1.5mg。
2、本实施例还对第二淋洗液的浓度进行了详细优化，采用不同浓度的甲醇水作为淋洗液二进行目标物的强淋洗，对比洗脱液峰面积数据如下表3：
表3
由实验数据可见，在10％-50％比例范围内，随着甲醇含量的增加，洗脱液中分析物的峰面积同样呈现出先上升(20％-50％)后下降(50％之后)的趋势。这是由于甲醇含量较少时，淋洗强度低，不能有效去除磷脂、多肽等干扰分子，从而产生基质效应，抑制目标物的洗脱、离子化等。但甲醇含量过高时，过强的洗脱能力会导致目标分子在该步骤的损失。通过对比，大多数指标在甲醇含量为50％时，洗脱液中的峰面积最大。因此经过优化，实验中淋洗二使用50％甲醇水溶液。
3、本实施例中，还对洗脱液的成分与浓度进行了详细的优化，采用不同洗脱液进行目标物洗脱，对比洗脱液峰面积数据如下表4：
表4
本实施例中尝试了甲醇、甲醇/乙腈、甲醇/异丙醇、甲醇/乙酸乙酯、0.1％甲酸甲醇/乙酸乙酯混合试剂的洗脱效果，实验发现甲醇作为洗脱剂时，对目标物的洗脱效果较差，同时甲醇/乙腈混合试剂的结果类似。对比显示，在甲醇中引入异丙醇或乙酸乙酯可以获得较好的洗脱效果，其中相同比例时(2/8)，甲醇/乙酸乙酯体系的洗脱效果最好，但在该体系加入甲酸后，会导致洗脱液中DHEA、A、DHT、P峰面积的明显下降。因此本实施例中确定了优化条件为：使用甲醇/乙酸乙酯(2/8)进行洗脱。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (8)
1.一种基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备测试样：
S1-1、取样品管，向其中加入待测样本和内标溶液，混匀；
S1-2、活化：取另一样品管，加入磁珠，使用甲醇活化磁珠；
S1-3、平衡：使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-2处理后得到的磁珠移入高纯水中，平衡磁珠；
S1-4、使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-3处理后得到的磁珠移入S1-1样品管中，混匀；
S1-5、一次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入第一淋洗液中，混匀；
S1-6、二次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入第二淋洗液中，混匀；
S1-7、洗脱：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入洗脱液中，混匀，然后通过磁性固相萃取仪器移弃磁珠，移取样品管中的洗脱液，并稀释，混匀，得到测试样；
S2、构建标准曲线：
配置不同浓度的类固醇激素标准液，供液相色谱串联质谱法检测，以构建待测的类固醇激素的标准曲线；
S3、采用液相色谱串联质谱法对测试样进行检测，结合构建的标准曲线得到测试样中的类固醇激素的含量；
所述步骤S1具体包括：
S1、制备测试样：
S1-1、取样品管，向其中加入300-700uL的待测样本和5-15uL的内标溶液，混匀1-5min；
S1-2、活化：取另一样品管，加入1-5mg磁珠，使用100-400uL甲醇活化磁珠；
S1-3、平衡：使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-2处理后得到的磁珠移入200-600uL高纯水中，平衡磁珠；
S1-4、使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-3处理后得到的磁珠移入S1-1样品管中，混匀1-5min；
S1-5、一次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入300-700uL的第一淋洗液中，混匀1-5min；
S1-6、二次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入300-700uL的第二淋洗液中，混匀1-5min；
S1-7、洗脱：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入25-100uL洗脱液中，混匀1-5min，然后通过磁性固相萃取仪器移弃磁珠，移取样品管中的洗脱液，并向洗脱液中加入25-100uL高纯水进行稀释，混匀1-5min，10000-20000转/分钟下离心2-10min，得到测试样；
所述步骤S3中，液相色谱检测条件为：
色谱柱：十八烷基硅胶填料柱；
流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：初始，30% B；0-1 min，45% B；1-7 min，60% B；7-8.5 min，100% B；8.5-10 min，100% B；10-10.1 min，30% B；10.1-11.5 min，30% B；
流速：0.5mL/min；进样量：20µL；柱温：40℃；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
检测方式：多反应监测；
气帘气15psi，喷雾器60psi，辅助加热气25psi，温度350℃，离子化电压5500V，碰撞气9psi。
2.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，第一淋洗液为甲醇的体积分数占1-10%的甲醇水溶液。
3.根据权利要求2所述的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，第二淋洗液为甲醇的体积分数占20-60%的甲醇水溶液。
4.根据权利要求3所述的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，洗脱液为甲醇和乙酸乙酯的混合液。
5.根据权利要求4所述的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，洗脱液中的甲醇和乙酸乙酯的体积比为1:2~2:8。
6.根据权利要求1所述的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：
S1、制备测试样：
S1-1、取样品管，向其中加入500uL的待测样本和10uL的内标溶液，混匀2min；
S1-2、活化：取另一样品管，加入1.5mg磁珠，使用200uL甲醇活化磁珠；
S1-3、平衡：使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-2处理后得到的磁珠移入400uL高纯水中，平衡磁珠；
S1-4、使用磁性固相萃取仪器将步骤S1-3处理后得到的磁珠移入S1-1样品管中，混匀2min；
S1-5、一次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入500uL的第一淋洗液中，混匀2min；
S1-6、二次淋洗：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入500uL的第二淋洗液中，混匀2min；
S1-7、洗脱：使用磁性固相萃取仪器将磁珠移入50uL洗脱液中，混匀2min，然后通过磁性固相萃取仪器移弃磁珠，移取样品管中的洗脱液，并向洗脱液中加入50uL高纯水进行稀释，混匀2min，14000转/分钟下离心5min，得到测试样。
7.根据权利要求6所述的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述洗脱液中的甲醇和乙酸乙酯的体积比为2:8。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的基于磁性固相萃取的类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，其中，类固醇激素包括睾酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、17-羟孕酮、孕酮、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、可的松，雄酮、雄烯二酮中的一种或多种。
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| 气相色谱―质谱联用法在体内药物分析中的应用;陈琴华;李鹏;彭林;朱军;李志浩;;中国医院药学杂志;20100215(第03期);全文 * |
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