CN101923066B - 一种发酵液中苏氨酸含量的快速测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵液中苏氨酸含量的快速测定方法，首先将苏氨酸发酵液离心，取上清液加入醋酸酐、冰乙酸，搅拌均匀后，用自动电位滴定仪，按照高氯酸电位滴定法进行操作得到高氯酸电位滴定法测定的结果；再采用斐林试剂法测定离心后的上清液中的还原糖，得到斐林试剂法测定还原糖的结果；然后按高氯酸电位滴定法测定的苏氨酸和还原糖的含量-0.662×斐林试剂法测定还原糖的含量＝发酵液中苏氨酸的含量，单位为g/dl进行计算即可。本发明较纸层析法，大大缩短了检测时间；较氨基酸分析仪法，节省了检测费用；并打破了高氯酸电位滴定法的非水滴定限制。它具有快速、灵敏、准确、精密度高、省时省力的特点。
Description
技术领域 本发明属于苏氨酸检测技术领域，具体涉及一种发酵液中苏氨酸含量的快速测定方法。
背景技术 苏氨酸发酵液中主要含有一定量的酸和糖，另外还含有一些金属离子、维生素、和微量元素等，现在测量发酵液中苏氨酸含量的主要方法为纸层析法、氨基酸分析仪法等。纸层析法是行业内最常用的测定发酵液中苏氨酸含量的方法，但该方法存在检测时间长的缺点，从而不能迅速出具数据为发酵生产起指导作用。氨基酸分析仪法测定结果比较准确，但缺点是费用较高。
测定苏氨酸含量的方法还有高氯酸电位滴定法，此法是在非水介质(如冰乙酸)中，用高氯酸作滴定剂，结晶紫为指示剂准确滴定苏氨酸，产物为苏氨酸的高氯酸盐，呈酸性。结晶紫在强酸介质中为绿色，pH2左右为蓝色，pH＞3时为紫色，可以指示此反应的滴定终点。因此，高氯酸电位滴定法只能用于非水滴定测定苏氨酸，局限于测定固体样品，不能测定发酵液中苏氨酸的含量。
发明内容 本发明的目的是解决现有技术存在检测时间长、费用高和有局限性的技术问题，提供一种发酵液中苏氨酸含量的快速测定方法，此方法不仅费用低廉，而且能够为苏氨酸实际生产快速准确地提供所要求的检测数据。
本发明发酵液中苏氨酸含量的快速测定方法，按照以下步骤操作：
1)、0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液配制：在500ml的容量瓶中加入100ml冰醋酸，移取4.5ml高氯酸于容量瓶中，然后加入5ml醋酸酐，摇匀，用冰醋酸定容至500ml，静置过夜；
2)、自动电位滴定仪标定：精确称量0.15-0.2g已于105-110℃下干燥2h的基准试剂邻苯二甲酸氢钾，放入100ml烧杯中，用25ml的冰醋酸微热溶解，用配制好的0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液电位标定，按下式计算：
式中：V1---0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定样品用的体积数，ml
V2---0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定空白用的体积数，ml
m---邻苯二甲酸氢钾的质量，g
M----邻苯二甲酸氢钾的相对分子质量，204.21
F----0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液的标定值
3)、采用高氯酸电位滴定法测定苏氨酸和还原糖总含量：将苏氨酸发酵液在8000～10000r/min的转速下高速离心5～10min后，取1ml离心后的上清液注入烧杯中，然后再加入5ml醋酸酐、50ml冰乙酸，小心的将电极插入到烧杯中的液体中，启动搅拌装置，搅拌均匀后，按电位滴定仪面板上的样品键，选择测定苏氨酸的方法，输入样品体积，启动测定键，反应开始，样品自动测定，测定完成后，自动打印测定结果，测量完毕后先关闭搅拌，取出电极并及时将电极清洗，用干净的滤纸擦干放入无水甲醇氯化钾保护液中；
4)、采用斐林试剂法测定还原糖含量：准确吸取步骤3)中离心后的上清液5ml，用蒸馏水稀释定容至100ml待用，准确移取斐林甲、乙液各5ml于三角瓶内，混匀，吸取0.5ml上清液的稀释液注入此三角瓶中，混匀后，将此三角瓶放在电炉上，加入适量的0.1g/dl标准葡萄糖液，加热至沸腾，立即以每3秒1-2滴的速度继续用0.1g/dl标准葡萄糖液滴定三角瓶中的溶液，直至蓝色刚好消失，此滴定操作需在1min内完成，在同样条件下以蒸馏水代替离心后的上清液做空白对照试验，按下式计算还原糖的含量：
式中：X--还原糖含量，g/dl
V1--空白滴定时耗0.1g/dl标准葡萄糖液的体积，ml
V2--样品滴定时耗0.1g/dl标准葡萄糖液的体积，ml
5)、结果计算：采用高氯酸电位滴定法测定的苏氨酸和还原糖的总含量-0.662×采用斐林试剂法测定的还原糖的含量＝发酵液中苏氨酸的含量，单位为g/dl。
本发明方法只适用于以蔗糖或者葡萄糖为碳源发酵产生的苏氨酸发酵液。
本发明方法通过苏氨酸发酵液样品预处理，合理利用高氯酸电位滴定法和斐林试剂法，实现了测定发酵液中苏氨酸的含量。由于高氯酸电位滴定是非水滴定，因此通过加入醋酸酐能迅速与发酵液中的水分反应生成冰乙酸，冰乙酸作为高氯酸电位滴定中非水介质使用。在高氯酸电位滴定过程中，高氯酸同时与发酵液中的苏氨酸和还原糖反应，因此采用斐林试剂法测定还原糖。最终，通过高氯酸电位滴定法测定的结果和斐林试剂法测定还原糖的结果之间的换算可得到发酵液中苏氨酸的含量。
本发明与现有技术相比所具有的优点在于：
1)较于纸层析法，大大缩短了检测时间，在苏氨酸实际生产过程中能够快速准确地提供所要求的检测数据；
2)较于氨基酸分析仪法，节省了检测费用；
3)打破了高氯酸电位滴定法的非水滴定，开创了利用高氯酸电位滴定法测定发酵液中苏氨酸含量的先河；
4)本发明方法快速、灵敏、准确、精密度高、省时省力。
具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细论述。
实施例1：
1)、0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液配制：在500ml的容量瓶中加入100ml冰醋酸，移取4.5ml高氯酸于容量瓶中，然后加入5ml醋酸酐，摇匀，用冰醋酸定容至500ml，静置过夜；
2)、自动电位滴定仪标定：精密称量0.2g已于110℃下干燥2h的基准试剂邻苯二甲酸氢钾，放入100ml烧杯中，用约25ml的冰醋酸微热溶解，用配制好的0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液电位标定，，按下式计算：
式中：V1---0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定样品用的体积数，ml
V2---0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定空白用的体积数，ml
m---邻苯二甲酸氢钾的质量，g
M----邻苯二甲酸氢钾的相对分子质量，204.21
F----0.1mol/L高氯酸的冰醋酸溶液的标定值
3)、采用高氯酸电位滴定法测定苏氨酸和还原糖总含量：取5ml苏氨酸发酵液样品1#，将其在10000r/min的转速下高速离心5min后，取1ml离心后的上清液注入烧杯中，然后再加入5ml醋酸酐、50ml冰乙酸，小心的将电极插入到烧杯中的液体中，启动搅拌装置，搅拌均匀后，按电位滴定仪面板上的样品键，选择测定苏氨酸的方法，输入样品质量，启动测定键，反应开始，样品自动测定，测定完成后，自动打印测定结果，测量完毕后先关闭搅拌，取出电极并及时将电极清洗，用干净的滤纸擦干放入保护液(无水甲醇氯化钾饱和溶液活化电极)中；
4)、采用斐林试剂法测定还原糖含量：准确吸取样品1#离心后的上清液5ml，用蒸馏水稀释定容至100ml待用，准确移取斐林甲、乙液各5ml于三角瓶内，混匀，吸取0.5ml上清液的稀释液注入此三角瓶中，混匀后，将此三角瓶放在电炉上，加入适量的0.1g/dl标准葡萄糖液，加热至沸腾，立即以每3秒1-2滴的速度继续用0.1g/dl标准葡萄糖液滴定三角瓶中的溶液，直至蓝色刚好消失(此滴定操作需在1min内完成)，在同样条件下以蒸馏水代替离心后的上清液做空白对照试验，，按下式计算：
式中：X--还原糖含量，g/dl
V1--空白滴定时耗0.1g/dl标准葡萄糖液的体积，ml
V2--样品滴定时耗0.1g/dl标准葡萄糖液的体积，ml
5)、结果计算：采用高氯酸电位滴定法测定的苏氨酸和还原糖的总含量-0.662×采用斐林试剂法测定的还原糖的含量＝发酵液中苏氨酸的含量，单位为g/dl；
6)、苏氨酸发酵液样品1#按照以上步骤重复测定5次；
7)、取苏氨酸发酵液样品2#、样品3#，均按照以上步骤进行测定。
测定苏氨酸发酵液样品1#、样品2#、样品3#中苏氨酸含量见下表：
表1重复试验测定结果(n＝5)单位：g/dl
| 样品名 | 第1次 | 第2次 | 第3次 | 第4次 | 第5次 |
| 样品1# | 4.68 | 4.70 | 4.68 | 4.66 | 4.69 |
| 样品2# | 7.67 | 7.70 | 7.69 | 7.70 | 7.66 |
| 样品3# | 6.87 | 6.82 | 6.84 | 6.85 | 6.85 |
表2精密度计算结果(n＝5)
| 样品名 | 样品1# | 样品2# | 样品3# |
| 平均值(g/dl) | 4.68 | 7.69 | 6.85 |
| 标准偏差(g/dl) | 0.0148 | 0.0182 | 0.0182 |
| 相对标准偏差(％) | 0.316 | 0.237 | 0.266 |
表2可见，以上实验结果相对标准偏差都小于0.5％，精密度较高。
实施例2：
分别取5ml苏氨酸发酵液样品4#、样品5#、样品6#，按照实施例1中步骤1)～5)操作，分别测得苏氨酸发酵液样品4#、样品5#、样品6#中苏氨酸的含量。同时采用纸层析法对苏氨酸发酵液样品4#、样品5#、样品6#进行对比测定，两种方法测定结果见表3：
表3两种方法测定结果对比
| 样品名 | 样品4# | 样品5# | 样品6# |
| 本发明方法(g/dl) | 2.32 | 3.49 | 6.93 |
| 纸层析法(g/dl) | 2.33 | 3.51 | 6.84 |
| 相对偏差(％) | -0.429 | -0.570 | 1.31 |
由表3可见，两种方法对苏氨酸发酵液样品4#、样品5#、样品6#的测定结果一致性较好。
实施例3：
分别取5ml苏氨酸发酵液样品7#、样品8#、样品9#，按照实施例1中步骤1)～5)操作，分别测得苏氨酸发酵液样品7#、样品8#、样品9#中苏氨酸的含量。同时采用氨基酸分析仪法对苏氨酸发酵液样品7#、样品8#、样品9#进行对比测定，两种方法测定结果见表4：
表4两种方法测定结果对比
| 样品名 | 样品7# | 样品8# | 样品9# |
| 本发明方法(g/dl) | 4.71 | 6.81 | 7.68 |
| 氨基酸分析仪法(g/dl) | 4.63 | 6.86 | 7.71 |
| 相对偏差(％) | 1.73 | -0.729 | -0.389 |
由表4可见，两种方法对苏氨酸发酵液样品7#、样品8#、样品9#的测定结果一致性较好。
Claims (1)
1.一种发酵液中苏氨酸含量的快速测定方法，其特征是按照以下步骤操作：
1)、将苏氨酸发酵液在8000～10000r/min的转速下高速离心5～10min后，取1ml离心后的上清液注入烧杯中，然后再加入5ml醋酸酐、50ml冰乙酸，搅拌均匀后，用自动电位滴定仪，按照高氯酸电位滴定法进行操作，当测定完成后，得到高氯酸电位滴定法测定的结果；
2)采用斐林试剂法测定离心后的上清液中的还原糖，得到斐林试剂法测定还原糖的含量；
3)结果计算：高氯酸电位滴定法测定的结果-0.662×斐林试剂法测定还原糖的含量＝发酵液中苏氨酸的含量，单位为g/dl。
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Owner name: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHANDONG FUFENG BIOLOGY SCIENCE + TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD. Effective date: 20110718 |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 276600 NORTH SECTION OF LONGSHAN ROAD, JU'NAN COUNTY, LINYI CITY, SHANDONG PROVINCE TO: 211600 NO. 188, SHENHUA AVENUE, JINHU COUNTY, HUAI'AN CITY, JIANGSU PROVINCE |
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Effective date of registration: 20110718 Address after: 211600 Jinhu, Jiangsu Province, Shenhua Road, No., No. 188 Applicant after: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 276600 Shandong city of Linyi province Junan County Long Road North Applicant before: Shandong Fufeng Bio-Technology Development Co.,Ltd. |
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Inventor after: Xu Xiaobin Inventor after: Jiang Shougang Inventor after: Guo Yingxi Inventor after: Wang Juncheng Inventor after: Qiao Liansheng Inventor after: Xu Guohua Inventor after: Liu Yuantao Inventor after: Zhang Chunyu Inventor before: Jiang Shougang Inventor before: Guo Yingxi Inventor before: Wang Juncheng Inventor before: Qiao Liansheng Inventor before: Xu Guohua Inventor before: Liu Yuantao Inventor before: Zhang Chunyu |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: JIANG SHOUGANG GUO YINGXI WANG JUNCHENG QIAO LIANSHENG XU GUOHUA LIU YUANTAO ZHANG CHUNYU TO: XU XIAOBIN JIANG SHOUGANG GUO YINGXI WANG JUNCHENG QIAO LIANSHENG XU GUOHUA LIU YUANTAO ZHANG CHUNYU |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170607 Address after: 161031 Qigihar city of Heilongjiang province Angangxi District 111 State Road 1558 km east Patentee after: QIQIHAR LONGJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 211600 Jinhu, Jiangsu Province, Shenhua Road, No., No. 188 Patentee before: Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co.,Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
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