CN102183612B - 同时测定2-酮基-l-古龙酸、维生素c 和2-酮基-l-古龙酸甲酯含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法，包括：用流动相溶解并稀释对照品配制对照品溶液；流动相由有机溶剂与缓冲液组成，有机溶剂选自甲醇、乙腈或四氢呋喃，缓冲液选自磷酸、磷酸盐、乙酸或乙酸盐缓冲液；用流动相溶解并稀释样品，配制样品溶液；将等量的对照品溶液和样品溶液注入色谱柱，利用高效液相色谱法进行色谱分离和色谱检测，生成对照品溶液和样品溶液的液相色谱图；色谱柱选自碳八柱、碳十八柱或氨基柱，检测的波长为210nm；获取液相色谱图中被测成分的响应信号，采用外标法分别计算样品中被测成分的含量。本发明可以同时测定上述三种物质的含量，并且测量速度较快。

Description

同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C 和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，特别是涉及一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法。

背景技术

通常维生素C酯化转化工艺过程包括如下步骤：酯化反应步骤，将2-酮基-L-古龙酸(又名：2-酮基-L-古洛糖酸)在甲醇中用浓硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龙酸甲酯；转化反应步骤，用NaHCO₃将2-酮基-L-古龙酸甲酯转化为维生素C钠盐；酸化反应步骤，用维生素C钠盐中加入H₂SO₄，酸化成维生素C。

在上述工艺阶段中，有可能生成的产物有：维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯。酯化反应是可逆反应，而酯化、转化、酸化反应为连续整体单元生产操作。为了提高维生素C钠的质量和收率，必须对酯化转化反应的操作条件进行优化，对酯化转化反应的终点进行监控。必须监控的数据包括：酯化反应终点料液中生成的2-酮基-L-古龙酸甲酯的浓度、副产物维生素C(钠)的浓度、料液中残留的2-酮基-L-古龙酸钠浓度，以及转化反应终点母液中2-酮基-L-古龙酸甲酯残留浓度、维生素C钠的浓度等。故酯化、转化和酸化程度需要进行监测。

单独测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C的方法和报道很多，而2-酮基-L-古龙酸甲酯的检验方法并不多。但这些方法均不能满足维生素C生产过程中的酯化转化阶段的中间监控的需要，即：不能针对酯化转化阶段反应液，同时对上述三者进行测定，并且分析反应时间也较长。

2-酮基-L-古龙酸的单独检验方法主要有碘量法、酸碱滴定法、高效液相色谱法。一般碘量法为：精密称取样品约5g，于100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密移取2ml，于50ml干燥的试管中，用刻度吸管准确加入7.0mol/L硫酸溶液2ml，摇匀，在沸水浴中加热煮沸30分钟，取出稍冷后用水冲洗转移入250ml锥形瓶中，加淀粉指示液1～2ml，用0.05mol/L碘液滴定至溶液显蓝色(30秒内不退)为终点，根据消耗碘滴定液的体积计算2-酮基-L-古龙酸的含量。本方法适用于测定成品2-酮基-L-古龙酸，作为酯化转化阶段反应液的测定方法，则专属性差，受到酯化转化阶段的副产物维生素C、酯化产物2-酮基-L-古龙酸甲酯的严重影响。例如，专利号为200410020337.5的专利公开了一种2-酮基-L-古龙酸含量的分析方法，就是采用碘量法，同样存在类似问题，而且其方法分析时间长达80分钟以上，完全不能满足中间控制的及时性的要求。此外，由于硫酸是催化剂，会与酯化转化阶段的产物产生化学反应，因此，酸碱滴定法也不能用于酯化转化阶段反应液的监控。

维生素C的经典检验方法是碘量法，作为酯化转化阶段反应液的测定方法，同样受到酯化转化的副产物的严重影响，不能满足中间控制的需要。

2-酮基-L-古龙酸甲酯的业内检验方法是首先用氢氧化钠溶液调节样品溶液至弱碱性，加热使2-酮基-L-古龙酸甲酯水解为2-酮基-L-古龙酸和甲醇，然后再用氢氧化钠滴定液滴定至中性。此方法也适用于测定成品，专属性较差，不能准确测定酯化转化阶段2-酮基-L-古龙酸甲酯的含量。

上述方法均是针对单一成品进行测量，不能满足工艺生产过程中对中间监控的需要。目前，人们提出了高效液相色谱法(HPLC，High PerformanceLiquid Chromatography)，以应用在化学工艺过程中的含量测定。

目前公开的高效液相色谱法，仅提出了其应用于2-酮基-L-古龙酸的测定。例如，2005年10月出版的《生物技术》第15卷第5期公开了“2-酮基-L-古龙酸的高效液相色谱分析”，适用于鉴定发酵液中的产物是2-酮基-L-古龙酸。具体方法是：用高效液相色谱法测定氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)混合发酵液中的2-酮基-L-古龙酸。采用AnlinexA27柱46X250mm～流动相为十二烷基硫酸钠(0.01mol/L)/乙腈(3％)＝2/3，流速1.0mL/min，柱温30℃；用L-7420uv检测器检测。从该文中可以看出，此方法不适用于维生素C生产过程中的酯化转化阶段反应液的2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯含量测定。

根据《河北化工》第30卷第7期(2007年07月)第70页“HPLC-ELSD法测定维生素C酯化过程中的古龙酸和古龙酸甲酯”介绍：“高效液相色谱法检测古龙酸的方法很多，大多是采用紫外检测器，由于古龙酸的吸收系数￡很低(￡＝70)，所以更适合干品检测。而实际生产中酯化反应到达终点时，料液中的古龙酸含量较低，料液经必要的稀释处理后待检浓度更低，母液中古龙酸含量极低，用紫外检测器无法准确检测。古龙酸甲酯的液相法检测未见报道。”并且，该文献中仅公开了利用高效液相色谱法测定维生素C生产过程中两种成分(古龙酸和古龙酸甲酯)的方法。

总之，需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够在维生素C酯化转化工艺过程中，同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯这三种物质的含量，并且测量速度较快。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法，能够在维生素C酯化转化工艺过程中，以较快的速度同时测量上述三种物质的含量。

为了解决上述问题，本发明公开了一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法，包括：

用流动相溶解并稀释2-酮基-L-古龙酸对照品、维生素C对照品和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品，配制对照品溶液；其中，流动相由有机溶剂与缓冲液组成，有机溶剂选自甲醇、乙腈或四氢呋喃，缓冲液选自磷酸、磷酸盐、乙酸或乙酸盐缓冲液；

缓冲液为磷酸盐缓冲液时，所述磷酸盐选自：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二铵；

缓冲液为乙酸盐缓冲液时，所述乙酸盐选自：乙酸钠或乙酸铵；

用所述流动相溶解并稀释酯化液样品、转化液样品或酸化液样品，配制样品溶液；

分别将等量的对照品溶液和样品溶液注入色谱柱，利用高效液相色谱法进行液相色谱分离和色谱检测，生成对照品溶液和样品溶液的液相色谱图；其中，所述色谱柱选自碳八柱、碳十八柱或氨基柱，色谱检测的波长为210nm；

分别获取对照品溶液、样品溶液的液相色谱图中被测成分的响应信号，采用外标法分别计算样品中被测成分的含量；其中，所述响应信号为峰面积或峰高；被测成分为2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯；

所述对照品溶液为：单一的2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液；

或者，所述对照品溶液为：2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液的混合溶液；

采用外标法分别计算样品中的2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量，包括：

从对照品溶液和样品溶液的液相色谱图中，获取被测成分的响应信号的比例关系；

依据所述比例关系和对照品溶液中被测成分的含量，计算该被测成分在样品中的含量。

优选的，以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂的色谱柱。

优选的，所述色谱柱的参数为：内径4.6mm、柱长100～250mm、粒径5μm。

优选的，对照品溶液和样品溶液注入色谱柱的流速为：0.1～2.0ml/min。

优选的，所述流动相为体积比为50∶950的乙腈-0.4％磷酸二氢钾缓冲液。

优选的，所述缓冲液还包括：四乙基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、正辛铵。

优选的，采用外标法分别计算样品中的2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量，包括：

从被测成分含量不同的多个对照品溶液的液相色谱图中获得该被测成分的响应信号，并生成响应信号与含量的对应关系的校正曲线；

依据样品溶液的液相色谱图中被测成分的响应信号，从所述校正曲线上查找对应的含量，作为该被测成分在样品中的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提出的方法适用于在维生素C酯化、转化或酸化阶段反应液的反应程度监控，在0.0005％-100％较大范围内可同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯的含量。

具体的，本发明创造性地提出使用适宜的流动相和色谱参数组合，用于同时测定维生素C生产过程中三种成分的含量，具体包括：选用合适组分的流动相、选用碳八柱、碳十八柱或氨基柱作为色谱柱，色谱检测的波长为210nm等。上述关键参数组合在一起，使得本发明克服了现有的高效液相色谱法检测中，2-酮基-L-古龙酸、2-酮基-L-古龙酸甲酯保留时间较长(一般在10分钟以上)的弱点。本发明提出的含量测定方法简便，操作方便，分析时间短，测量速度较快，一般测定一个样品仅需10min左右，其中，2-酮基-L-古龙酸保留时间一般不到3分钟，维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯保留时间一般不到4分钟，而且保证了三个被测成分的分离情况良好。

附图说明

图1是本发明一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法实施例的流程图；

图2是本发明一种优选实施例中，对照品溶液的液相色谱图；

图3是本发明一种优选实施例中，酯化阶段反应液的液相色谱图；

图4是本发明一种优选实施例中，转化阶段反应液的液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

参照图1，示出了本发明一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法实施例的流程图，包括：

步骤101，用流动相溶解并稀释2-酮基-L-古龙酸对照品、维生素C对照品和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品，配制对照品溶液；

精密称定2-酮基-L-古龙酸对照品、维生素C对照品、2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品(均为纯物质)各适量分别置于不同的量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，配制三份对照品溶液；或者，还可以将上述三份对照品共同置于量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，配制混合的对照品溶液。也就是说，本发明实施例所述对照品溶液可以是单一的2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液，也可以是2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液的混合溶液。

进一步，流动相由有机溶剂与缓冲液组成，有机溶剂选自甲醇、乙腈或四氢呋喃，缓冲液选自磷酸、磷酸盐、乙酸或乙酸盐缓冲液；缓冲液为磷酸盐缓冲液时，所述磷酸盐选自：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二铵；缓冲液为乙酸盐缓冲液时所述乙酸盐选自：乙酸钠或乙酸铵。通常地，缓冲液中除了包括磷酸、磷酸盐、乙酸或乙酸盐，还包括：四乙基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、正辛铵中的一种或者几种。

在本发明的一个优选实施例中，所述流动相为体积比为50∶950的乙腈-0.4％磷酸二氢钾缓冲液。

步骤102，用所述流动相溶解并稀释酯化液样品、转化液样品或酸化液样品，配制样品溶液；

取酯化液样品、转化液样品、酸化液样品中的其中一种配置样品溶液，所述酯化液样品为维生素C制备过程中酯化反应生成2-酮基-L-古龙酸甲酯后所得到的溶液，所述转化液样品为转化反应生成维生素C钠盐后所得到的溶液，所述酸化液样品为酸化反应生成维生素C后所得到的溶液。则取上述样品精密称定其质量，置于适宜量瓶中，用步骤101所用的流动相溶解并稀释到刻度，配制样品溶液。

步骤103，分别将等量的对照品溶液和样品溶液注入色谱柱，利用高效液相色谱法进行液相色谱分离和色谱检测，生成对照品溶液和样品溶液的液相色谱图；

本发明通过高效液相色谱法(HPLC)进行含量测定，采用液相色谱仪进行检测，液相色谱仪主要包括输液泵、检测器和数据记录系统等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有填充剂(固定相)的色谱柱，注入的供试品(本发明为对照品溶液或样品溶液)也被流动相带入色谱柱内，供试品中的被测成分(本发明中为2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯)因极性差异或相对于固定相的吸附及解吸能力差异，在色谱柱内被分离，之后各被测成分先后进入检测器进行色谱检测，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果，从而实现对样品的分析。其中，本发明所述色谱柱选自碳八柱、碳十八柱或氨基柱。在本发明的一个优选实施例中，以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂的色谱柱，色谱柱的参数可选择：内径4.6mm、柱长100～250mm、粒径5μm。

具体的，分别吸取等量的对照品溶液和样品溶液注入色谱柱，进行液相色谱分离，其中，注入色谱柱的流速为0.1～2.0ml/min，优选流速为1.0ml/min。之后，利用紫外检测器对分离出的色谱进行测定，检测色谱的波长保证能够同时满足2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯吸光度要求的波长，在本发明的优选实施例中，采用210nm的波长进行检测。

需要说明的是，当对照品溶液为单一的2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液时，依次选取上述三种对照品溶液注入三个色谱柱中，获得三幅色谱图，包括：2-酮基-L-古龙酸对照品溶液的液相色谱图、维生素C对照品溶液的液相色谱图和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液的液相色谱图。当所述对照品溶液为2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液的混合溶液时，注入色谱柱中获得一幅色谱图，该色谱图中同时示出了2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的色谱。

步骤104，分别获取对照品溶液、样品溶液的液相色谱图中被测成分的响应信号，采用外标法分别计算样品中被测成分的含量。

其中，所述响应信号为峰面积或峰高；被测成分即2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯。本发明所述的外标法需要在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把对照品溶液得到的响应信号与样品溶液的响应信号进行比较，即可求得被测成分在样品中的含量，其可分为校正曲线法和校正因子求解法两种方法。

所述校正曲线法具体包括如下步骤：

A1，从被测成分含量不同的多个对照品溶液的液相色谱图中获得该被测成分的响应信号，并生成响应信号与含量的对应关系的校正曲线；

A2，依据样品溶液的液相色谱图中被测成分的响应信号，从所述校正曲线上查找对应的含量，作为该被测成分在样品中的含量。

需要说明的是，校正曲线法需要配制具有不同被测成分含量的多个对照品溶液，并且需要在相同的色谱检测条件下、相同的进样量下，获得对照品溶液的液相色谱图。

所述校正因子求解法的基本思想是：从对照品溶液和样品溶液的液相色谱图中，获取被测成分的响应信号的比例关系；依据所述比例关系和对照品溶液中被测成分的含量，计算该被测成分在样品中的含量。包括如下步骤：

B1，将对照品溶液中被测成分的质量除以其响应信号，获得被测成分的校正因子；

B2，将所述校正因子乘以样品溶液中被测成分的响应信号，之后除以样品的质量获得该被测成分在样品中的含量。

本发明提出的方法可以适用于在维生素C酯化、转化阶段反应液的反应程度监控，在质量含量为0.0005％～100％的较大范围内可同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯的含量。需要说明的是，针对转化反应生的维生素C钠盐、以及酸化反应生成的维生素C的含量测定，均以溶液中Vc的含量进行表示。

进一步，本发明创造性地提出使用适宜的流动相和色谱参数组合，用于同时测定维生素C生产过程中三种成分的含量，具体包括：选用碳八柱、碳十八柱或氨基柱作为色谱柱，色谱检测的波长为210nm等。上述关键参数组合在一起，使得本发明克服了现有的高效液相色谱法检测中，2-酮基-L-古龙酸、2-酮基-L-古龙酸甲酯保留时间(即从进样到出现色谱峰最高值所需的时间)较长(一般在10分钟以上)的弱点。本发明建立的同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯含量测定方法简便，操作方便，分析时间短，一般测定一个样品仅需10min左右。通过本发明提出的方法，2-酮基-L-古龙酸保留时间一般不到3分钟，维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯保留时间一般不到4分钟，而且保证了三个被测成分的分离情况良好。

此外，经验证，本发明建立的分析方法测定维生素C生产过程中的酯化反应液含量的相对标准偏差如下：2-酮基-L-古龙酸为1.1％，维生素C为0.2％，2-酮基-L-古龙酸甲酯为0.4％，分析精密度和准确度均较高。

下面，给出本发明一个优选实施例进行具体说明。

1、本发明优选实施例的工艺环境如下：

1.1采用的设备与仪器包括：由日本岛津公司制造的岛津LC-10AT型液相色谱仪；CDMC-21色谱工作站(V3.0上海计算所)；电子分析天平(Sartorius CPA225D)，感量为0.01mg。

1.2采用的量具包括：50mL的量瓶。

1.3采用的试剂包括：乙腈(HPLC级)；磷酸二氢钾(AR级)；纯化水；2-酮基-L-古龙酸对照品；2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品；维生素C对照品；样品为维生素C生产中的酯化液样品、转化液样品。

1.4色谱系统及条件：

紫外检测器，检测波长为210nm；

色谱柱为Thermo Aquasil C18色谱柱，其参数为4.6mm×250mm×5μm；

流动相为体积比为50∶950的乙腈-0.4％磷酸二氢钾缓冲液。

输液泵提供的流速为1.0mL/min；进样量为20μL；

色谱记录时间为10min。

2、被测成分(2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯)含量的测定具体如下：

2.1对照品溶液的配制

用电子分析天平精密称定2-酮基-L-古龙酸对照品约50mg、维生素C对照品10mg、2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品50mg，将上述对照品共同置于50mL的量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，做为对照品溶液。平行配制两份上述对照品溶液。

2.2样品(供试品)溶液的配制

取酯化液样品或转化液样品约0.25mL，精密称定其质量，之后置于50mL的量瓶中，用流动相溶解并稀释到刻度，作为供试品溶液。平行配制两份上述样品溶液。

2.3采用高效液相色谱法进行液相色谱分离和色谱检测

精密量取对照品溶液和样品溶液各20μl，通过输液泵注入色谱仪，通过紫外检测器进行色谱检测，生成对照品溶液和样品溶液的液相色谱图。其中，对照品溶液每份进样2次，样品溶液每份进样一次。

2.4采用外标法分别计算样品中被测成分的含量

2.4.1校正因子f的计算

$f_i=\frac{m_{\mathrm{is}}}{A_{\mathrm{is}}}\×\frac{P_{\mathrm{is}}}{100}$

式中：

f_i为被测成分i的校正因子；i代表2-酮基-L-古龙酸、维生素C或2-酮基-L-古龙酸甲酯；

m_is为对照品溶液中，被测成分i对照品的质量，单位为g；

A_is为对照品溶液的液相色谱图中，与被测成分i对应的峰面积；

P_is为被测成分i对照品的质量含量，单位为％；

100为百分含量换算为小数表示的含量换算因子。

需要说明的是，此步骤中需要计算两份对照品溶液的校正因子f，保证对照品溶液各有关色谱峰各自单位峰面积质量的相对标准偏差应不大于2.0％。否则，标样无效。

2.4.2按外标法计算样品的含量

计算公式如下：

$X_i=f_i\×\frac{A_{\mathrm{is}}}{m}\×100$

式中：

X_i为被测成分i样品的质量含量，单位为％；

A_i为样品溶液的液相色谱图中，与被测成分i对应的峰面积；

f_i为被测成分i的校正因子；

m为所称取的样品的质量，单位为g；

此步骤中需要分别计算两份被测成分i样品的含量，保证相对偏差应不大于2％。

本发明优选实施例中涉及的色谱图如图2～4所示。其中，图2是对照品溶液的液相色谱图，出峰顺序依次为：2-酮基-L-古龙酸、维生素C(Vc)、2-酮基-L-古龙酸甲酯。对照品溶液中，相应的参数如下表所示：

图3是酯化阶段反应液(即酯化液样品)的液相色谱图，出峰顺序依次为：2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯。其中：

图3(a)为酯化反应加温前的液相色谱图，2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：2.72min、3.13min和3.43min。

图3(b)为酯化反应1小时(加温至65度)的液相色谱图，2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：2.72min、3.13min和3.43min。

图3(c)为酯化反应2小时(加温至68度)的液相色谱图，2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：2.71min、3.06min和3.43min。

图3(d)为酯化反应4小时的液相色谱图，2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：2.70min、3.03min和3.43min。

从图3(a)～(d)可以看出，随着酯化反应时间的延长，2-酮基-L-古龙酸的峰高在较大范围内逐渐降低，维生素C的峰高在较小范围内逐渐升高，2-酮基-L-古龙酸甲酯的峰高在较大范围内逐渐升高。

图4是转化阶段反应液(即转化液样品)的液相色谱图，图4(a)的出峰顺序依次为：2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯，图4(b)～(d)的出峰顺序依次为：维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯。其中：

图4(a)为转化反应(加碳酸氢钠后)10分钟的液相色谱图，2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：2.72min、3.05min和3.44min。

图4(b)为转化反应2.5小时的液相色谱图，大部分古龙酸甲酯转化为Vc-Na，故古龙酸的峰消失，古龙酸甲酯的峰亦很低，因Vc-Na迅速结晶沉淀，故Vc的峰逐渐降低。维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：3.06min和3.45min。

图4(c)为转化反应3.5小时的液相色谱图，维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：3.05min和3.44min。

图4(d)为转化反应4.5小时的液相色谱图，维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间依次为：3.04min和3.43min。

在本发明优选实施例中，因2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯这三种成分相对于固定相的极性和吸附、解吸附能力不同，在适宜配比的流动相(即体积比为50∶950的乙腈-0.4％磷酸二氢钾缓冲液)的输送作用下先后得以分离，从色谱图可以看出2-酮基-L-古龙酸、维生素C、2-酮基-L-古龙酸甲酯三个色谱峰分离良好；三个被测成分的保留时间较短，2-酮基-L-古龙酸的保留时间在2.70～2.73min范围内，维生素C的保留时间3.03～3.13min范围内，2-酮基-L-古龙酸甲酯的保留时间在3.43～3.46min范围内，均小于4分钟。

以上对本发明所提供的一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (3)

1.一种同时测定2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量的方法，其特征在于，包括：

用流动相溶解并稀释2-酮基-L-古龙酸对照品、维生素C对照品和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品，配制对照品溶液；其中，流动相由有机溶剂与缓冲液组成，有机溶剂选自甲醇、乙腈或四氢呋喃，缓冲液选自磷酸、磷酸盐、乙酸或乙酸盐缓冲液；

缓冲液为磷酸盐缓冲液时，所述磷酸盐选自：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二铵；

缓冲液为乙酸盐缓冲液时，所述乙酸盐选自：乙酸钠或乙酸铵；

所述缓冲液还包括：四乙基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、正辛铵；

用所述流动相溶解并稀释酯化液样品、转化液样品或酸化液样品，配制样品溶液；

分别将等量的对照品溶液和样品溶液注入色谱柱，利用高效液相色谱法进行液相色谱分离和色谱检测，生成对照品溶液和样品溶液的液相色谱图；其中，所述色谱柱选自碳八柱、碳十八柱或氨基柱，色谱检测的波长为210nm，所述色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂的色谱柱，对照品溶液和样品溶液注入色谱柱的流速为：0.1～2.0ml/min，所述色谱柱的参数为：内径4.6mm、柱长100～250mm、粒径5μm；

分别获取对照品溶液、样品溶液的液相色谱图中被测成分的响应信号，采用外标法分别计算样品中被测成分的含量；其中，所述响应信号为峰面积或峰高；被测成分为2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯；

所述对照品溶液为：单一的2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液；

或者，所述对照品溶液为：2-酮基-L-古龙酸对照品溶液、维生素C对照品溶液和2-酮基-L-古龙酸甲酯对照品溶液的混合溶液；

采用外标法分别计算样品中的2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量，包括：

从对照品溶液和样品溶液的液相色谱图中，获取被测成分的响应信号的比例关系；

依据所述比例关系和对照品溶液中被测成分的含量，计算该被测成分在样品中的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述流动相为体积比为50：950的乙腈-0.4%磷酸二氢钾缓冲液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用外标法分别计算样品中的2-酮基-L-古龙酸、维生素C和2-酮基-L-古龙酸甲酯含量，包括：

从被测成分含量不同的多个对照品溶液的液相色谱图中获得该被测成分的响应信号，并生成响应信号与含量的对应关系的校正曲线；

依据样品溶液的液相色谱图中被测成分的响应信号，从所述校正曲线上查找对应的含量，作为该被测成分在样品中的含量。

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