CN103344719B - 一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法 - Google Patents

Abstract

一种应用于化学分析领域中的可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，所述方法包括如下步骤：色谱条件:色谱柱为聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱，流动相为稀酸水溶液；检测器为示差折光检测器；标准品溶液的制备:精密称取适量标准品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到标准品溶液；供试品溶液的制备:精密称取适量供试品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到供试品溶液；测定:将标准品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据标准品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量。该发明能够同时对古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇多项组分进行定性和定量分析、检测速度快、检测数据准确、重现性好、灵敏度高、操作方法简便。

Description

一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域中的同时对多组分进行检测，尤其是涉及一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法。

背景技术

维生素C是药品和食品工业中的重要原料，目前，工业上主要采用莱氏法或二步发酵法生产维生素C。在采用两步发酵法生产维生素C的过程中，对中间体古龙酸超滤液或古龙酸甲酯固体等进行古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的定性和定量对维生素C生产的过程控制和维生素C的成品质量至关重要。其中的古龙酸又叫2-酮基-L-古龙酸，古龙酸甲酯又叫做2-酮基-L-古龙酸甲酯。

传统上主要采用纸层析法和碘量法检测发酵液中的古龙酸，上述方法具有一定的局限性和繁琐性，个别微量物质无法检测出来，并且检测出的数据偏差较大。近年来，随着高效液相色谱（HPLC）的迅速发展，开始有学者专门研究针对古龙酸的高效液相方法。肖入峰等为了快速准确的检测维生素C生产工艺中维生素C的重要前体物古龙酸的浓度，采用高效液相色谱法进行测定，选用Carbohydrate分析柱，乙腈：磷酸二氢钾=60：40的流动相，在波长210nm处紫外光检测，控制流速为1ml/min和温度45℃，结果表明古龙酸在6min左右出峰，与VC具有较好分离度[文献来源：2-酮基-L-古龙酸的高效液相色谱测定方法和条件[J].环境科学与技术,2012,05:47-51.]。赵元芬等采用高效液相色谱法对古龙酸固体催化转化工艺过程的古龙酸甲酯、维生素C钠、古龙酸的含量进行了测定，其采用的条件为：色谱柱为Inertsil柱，流动相A相为乙腈，B相为0.20%TFA水溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温45℃[文献来源：高效液相色谱法测定古龙酸酯化转化工艺过程中多组分含量[J].中国药业,2010,22:36-37.]。

可以看出，目前的研究无法同时对维生素C生产中古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇进行定性和定量，因此，研制开发一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法一直是亟待解决的课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，该方法检测速度快、检测数据准确、重现性好、灵敏度高、操作方法简便、检测试剂和仪器应用广泛。

本发明的目的是这样实现的：一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，所述方法包括如下步骤：

（1）色谱条件

色谱柱为聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱，流动相为稀酸水溶液，流速为0.2-0.6ml/分钟，柱温25-85℃；检测器为示差折光检测器；

（2）标准品溶液的制备

精密称取适量标准品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到标准品溶液；

（3）供试品溶液的制备

精密称取适量供试品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到供试品溶液；

（4）测定

将标准品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到标准品溶液色谱图与供试品溶液色谱图，根据标准品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量；

所述的聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱选自Aminex HPX-87H、Aminex HPX-87C、Aminex HPX-87P、Aminex HPX-87N、Aminex HPX-87K、Aminex HPX-42A、AminexHPX-42C中的一种，优选Aminex HPX-87H、Aminex HPX-87C、Aminex HPX-87K中的一种；所述的稀酸水溶液选自稀硫酸水溶液、稀磷酸水溶液中的一种，所述的稀酸水溶液的摩尔浓度为0.03-0.08mol/L；所述的流速为0.4ml/分钟，所述的柱温为30-50℃，优选柱温为40℃；所述的标准品分为固体标准品和液体标准品，所述的固体标准品为古龙酸和古龙酸甲酯，所述的液体标准品为甲醇和乙醇，所述的供试品分为固体供试品和液体供试品；所述的固体标准品配制浓度为0.005～0.10mg/ml，所述的液体标准品的配制需稀释50-2500倍，所述的固体供试品的配制浓度为1.0～10mg/ml，所述的液体供试品的配制需稀释10-100倍；所述的供试品为古龙酸超滤液、古龙酸交换液、古龙酸母液、古龙酸甲醇洗液、古龙酸固体、古龙酸母干固体、酯化液、古龙酸甲酯固体、维生素C母液、维生素C洗液、维生素C钠母液；所述的过滤为通过微孔滤膜进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm；在步骤（4）中，所述的将标准品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测的进样量为5-30μl；所述的聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱的规格为300×7.8mm。

本发明的要点在于一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法。其药学原理是：（1）经过大量实验，选择了由聚苯乙烯二乙烯苯树脂填装而成的美国伯乐（Bio-Rad）HPLC柱作为高效液相色谱柱，其型号选自Aminex HPX-87H、Aminex HPX-87C、Aminex HPX-87P、Aminex HPX-87N、Aminex HPX-87K、Aminex HPX-42A或Aminex HPX-42C中的一种。通过选择上述色谱柱并结合适宜的流动相、流速和柱温等，实现了同时对古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的定性和定量检测。（2）通过使用标准品进行对照分析，采用外标法进行计算，从而使得对供试品中古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的定性和定量检测结果更加准确。

一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法与现有技术相比，具有能够同时对古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇多项组分进行定性和定量分析、检测速度快、检测数据准确、重现性好、灵敏度高、操作方法简便、检测试剂和仪器应用广泛等特点，将广泛的应用于化学分析领域中。

附图说明

图1是实施例一古龙酸标准品溶液液相色谱图。

图2是实施例一古龙酸甲酯标准品溶液液相色谱图。

图3是实施例一甲醇标准品溶液液相色谱图。

图4是实施例一乙醇标准品溶液液相色谱图。

图5是实施例一酯化液液相谱图。

图6是实施例二古龙酸标准品溶液液相色谱图。

图7是实施例二古龙酸甲酯标准品溶液液相色谱图。

图8是实施例二甲醇标准品溶液液相色谱图。

图9是实施例二乙醇标准品溶液液相色谱图。

图10是实施例二古龙酸甲醇洗液液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，所述方法包括如下步骤：

（1）色谱条件

色谱柱为聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱，流动相为稀酸水溶液，流速为0.2-0.6ml/分钟，柱温25-85℃；检测器为示差折光检测器；

（2）标准品溶液的制备

精密称取适量标准品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到标准品溶液；

（3）供试品溶液的制备

精密称取适量供试品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到供试品溶液；

（4）测定

将标准品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到标准品溶液色谱图与供试品溶液色谱图，根据标准品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量；

所述的聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱选自Aminex HPX-87H、Aminex HPX-87C、Aminex HPX-87P、Aminex HPX-87N、Aminex HPX-87K、Aminex HPX-42A、AminexHPX-42C中的一种，优选Aminex HPX-87H、Aminex HPX-87C、Aminex HPX-87K中的一种；所述的稀酸水溶液选自稀硫酸水溶液、稀磷酸水溶液中的一种，所述的稀酸水溶液的摩尔浓度为0.03-0.08mol/L；所述的流速为0.4ml/分钟，所述的柱温为30-50℃，优选柱温为40℃；所述的标准品分为固体标准品和液体标准品，所述的固体标准品为古龙酸和古龙酸甲酯，所述的液体标准品为甲醇和乙醇，所述的供试品分为固体供试品和液体供试品；所述的固体标准品配制浓度为0.005～0.10mg/ml，所述的液体标准品的配制需稀释50-2500倍，所述的固体供试品的配制浓度为1.0～10mg/ml，所述的液体供试品的配制需稀释10-100倍；所述的供试品为古龙酸超滤液、古龙酸交换液、古龙酸母液、古龙酸甲醇洗液、古龙酸固体、古龙酸母干固体、酯化液、古龙酸甲酯固体、维生素C母液、维生素C洗液、维生素C钠母液；所述的过滤为通过微孔滤膜进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm；在步骤（4）中，所述的将标准品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测的进样量为5-30μl；所述的聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱的规格为300×7.8mm。

说明：

古龙酸超滤液是指发酵醪液经过膜过滤分离后得到的古龙酸水溶液。

古龙酸交换液是指古龙酸超滤液经过离子交换得到的液体。

古龙酸母液是指古龙酸固液分离后得到的液体。

古龙酸甲醇洗液是指甲醇洗涤湿品古龙酸得到的液体。

古龙酸固体是指维生素C生产中间体。

古龙酸母干固体是指古龙酸母液中回收的古龙酸。

酯化液是指古龙酸与甲醇发生酯化反应的溶液

古龙酸甲酯固体是指古龙酸酯化反应得到的古龙酸甲酯，固液分离后得到的固体部分。

维生素C母液是指维生素C结晶液固液分离后的液体。

维生素C洗液是指溶媒洗涤维生素C晶体得到的液体。

维生素C钠母液是指维生素C钠固液分离后得到的液体。

实施例一

酯化液的组分及含量的检测方法

仪器设备：Waters液相色谱仪，包括1525二元梯度泵、2414折光示差检测器、2707自动进样器、色谱柱HPX-87H（规格300×7.8mm）。工作站：Empower。

流动相：0.05mol/L稀硫酸水溶液；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量20μl。样品响应时间为40min。

固体标准品溶液的制备：分别精密称取古龙酸标准品10mg和古龙酸甲酯标准品10mg，使用流动相分别定量配制成浓度为0.05mg/ml的古龙酸溶液与浓度为0.05mg/ml的古龙酸甲酯溶液，使用0.22μm微孔滤膜过滤，得到浓度为0.05mg/ml古龙酸标准品溶液与0.05mg/ml古龙酸甲酯标准品溶液。

液体标准品溶液的制备：液体标准品稀释2500倍，步骤如下，准确吸取液体标准品1ml，使用流动相定容到50ml容量瓶a中，吸取1ml的容量瓶a中液体，定容到50ml容量瓶b中，吸取容量瓶b中的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到液体标准品溶液。分别将液体标准品色谱甲醇和色谱乙醇按照上述步骤进行操作，得到甲醇标准品溶液和乙醇标准品溶液。

液体供试品溶液的制备：液体供试品稀释50倍，步骤如下，准确吸取1ml酯化液，使用流动相定容到50ml容量瓶中，吸取定容后的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到酯化液稀释溶液。

将配制的甲醇标准品溶液、乙醇标准品溶液、古龙酸标准品溶液、古龙酸甲酯标准品溶液与配制的酯化液稀释溶液分别进行液相色谱检测并得到相应色谱图。

根据对色谱图的定性、定量分析，参见图1至图5，确定酯化液色谱图中11.4min峰的组分为古龙酸、14.1min峰的组分为古龙酸甲酯、28.4min峰的组分为甲醇。各待检测峰之间的分离度均大于4.2。

根据稀释倍数和峰面积的情况，并通过外标法计算的酯化液中待测组分的含量如下：

$=210.89(\mathrm{mg}/\mathrm{ml})$

标注：

A供试品—为供试品（与待计算含量组分的标准品相同保留时间）的峰面积；

A古龙酸标准品—为古龙酸标准品的峰面积；

A古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的峰面积；

A甲醇标准品—为甲醇标准品的峰面积；

W古龙酸标准品—为古龙酸标准品的精确称样量，单位为mg；

W古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的精确称样量，单位为mg；

实施例二

古龙酸甲醇洗液的组分及含量的检测方法

仪器设备：Waters液相色谱仪，包括1525二元梯度泵、2414折光示差检测器、2707自动进样器、色谱柱HPX-87H（规格300×7.8mm）。工作站：Empower。

流动相：0.05mol/L稀硫酸水溶液；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量20μl。样品响应时间为40min。

固体标准品溶液的制备：分别精密称取古龙酸标准品10mg和古龙酸甲酯标准品10mg，使用流动相分别定量配制成浓度为0.05mg/ml的古龙酸溶液与浓度为0.05mg/ml的古龙酸甲酯溶液，使用0.22μm微孔滤膜过滤，得到浓度为0.05mg/ml古龙酸标准品溶液与0.05mg/ml古龙酸甲酯标准品溶液。

液体标准品溶液的制备：液体标准品稀释2500倍，步骤如下，准确吸取液体标准品1ml，使用流动相定容到50ml容量瓶a中，吸取1ml的容量瓶a中的液体，定容到50ml容量瓶b中，吸取容量瓶b中的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到液体标准品溶液。分别将液体标准品色谱甲醇和色谱乙醇按照上述步骤进行操作，得到甲醇标准品溶液和乙醇标准品溶液。

液体供试品溶液的制备：液体供试品稀释100倍，步骤如下，准确吸取0.5ml古龙酸甲醇洗液，使用流动相定容到50ml容量瓶中，吸取定容后的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到古龙酸甲醇洗液稀释溶液。

将配制的甲醇标准品溶液、乙醇标准品溶液、古龙酸标准品溶液、古龙酸甲酯标准品溶液与配制的古龙酸甲醇洗液稀释溶液分别进行液相色谱检测并得到相应色谱图。

根据对色谱图的定性、定量分析，参见图6至图10，确定古龙酸甲醇洗液色谱图中11.4min峰的组分为古龙酸、14.1min峰的组分为古龙酸甲酯、28.4min峰的组分为甲醇、31.5min峰的组分为乙醇。各待检测峰之间的分离度均大于2.8。

根据稀释倍数和峰面积的情况，并通过外标法计算的古龙酸甲醇洗液中待测组分的含量如下：

标注：

A供试品—为供试品（与待计算含量组分的标准品相同保留时间）的峰面积；

A古龙酸标准品—为古龙酸标准品的峰面积；

A古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的峰面积；

A甲醇标准品—为甲醇标准品的峰面积；

A乙醇标准品—为乙醇标准品的峰面积；

W古龙酸标准品—为古龙酸标准品的精确称样量，单位为mg；

W古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的精确称样量，单位为mg；

实施例三

维生素C钠母液的组分及含量的检测方法

仪器设备：Waters液相色谱仪，包括1525二元梯度泵、2414折光示差检测器、2707自动进样器、色谱柱HPX-87H（规格300×7.8mm）。工作站：Empower。

流动相：0.03mol/L稀硫酸水溶液；流速：0.4ml/min；柱温：25℃；进样量20μl。样品响应时间为40min。

固体标准品溶液的制备：分别精密称取古龙酸标准品10mg和古龙酸甲酯标准品10mg，使用流动相分别定量配制成浓度为0.10mg/ml的古龙酸溶液与浓度为0.10mg/ml的古龙酸甲酯溶液，使用0.45μm微孔滤膜过滤，得到浓度为0.10mg/ml古龙酸标准品溶液与0.10mg/ml古龙酸甲酯标准品溶液。

液体标准品溶液的制备：液体标准品稀释50倍，步骤如下，准确吸取液体标准品1ml，使用流动相定容到50ml容量瓶中，进行微孔滤膜过滤，孔径0.45μm，得到液体标准品溶液。分别将液体标准品色谱甲醇和色谱乙醇按照上述步骤进行操作，得到甲醇标准品溶液和乙醇标准品溶液。

液体供试品溶液的制备：液体供试品稀释10倍，步骤如下，准确吸取5ml维生素C钠母液，使用流动相定容到50ml容量瓶中，吸取定容后的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.45μm，得到维生素C钠母液稀释溶液。

将配制的甲醇标准品溶液、乙醇标准品溶液、古龙酸标准品溶液、古龙酸甲酯标准品溶液与配制的维生素C钠母液稀释溶液分别进行液相色谱检测并得到相应色谱图。

根据对色谱图的定性、定量分析，确定维生素C钠母液色谱图中11.8min峰的组分为古龙酸、29.0min峰的组分为甲醇、32.0min峰的组分为乙醇。各待检测峰之间的分离度均大于2.7。

根据稀释倍数和峰面积的情况，并通过外标法计算的维生素C钠母液中待测组分的含量如下：

标注：

A供试品—为供试品（与待计算含量组分的标准品相同保留时间）的峰面积；

A古龙酸标准品—为古龙酸标准品的峰面积；

A甲醇标准品—为甲醇标准品的峰面积；

A乙醇标准品—为乙醇标准品的峰面积；

W古龙酸标准品—为古龙酸标准品的精确称样量，单位为mg；

实施例四

古龙酸甲酯固体的组分及含量的检测方法

仪器设备：Waters液相色谱仪，包括1525二元梯度泵、2414折光示差检测器、2707自动进样器、色谱柱HPX-87C（规格300×7.8mm）。工作站：Empower。

流动相：0.08mol/L稀磷酸水溶液；流速：0.2ml/min；柱温：85℃；进样量20μl。样品响应时间为50min。

固体标准品溶液的制备：分别精密称取古龙酸标准品10mg和古龙酸甲酯标准品10mg，使用流动相分别定量配制成浓度为0.005mg/ml的古龙酸溶液与浓度为0.005mg/ml的古龙酸甲酯溶液，使用0.22μm微孔滤膜过滤，得到浓度为0.005mg/ml古龙酸标准品溶液与0.005mg/ml古龙酸甲酯标准品溶液。

液体标准品溶液的制备：液体标准品稀释50倍，步骤如下，准确吸取液体标准品1ml，使用流动相定容到50ml容量瓶中，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到液体标准品溶液。分别将液体标准品色谱甲醇和色谱乙醇按照上述步骤进行操作，得到甲醇标准品溶液和乙醇标准品溶液。

固体供试品溶液的制备：精密称取古龙酸甲酯固体100mg，使用流动相定容到50ml容量瓶中，使用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，得到浓度为2mg/ml的古龙酸甲酯固体稀释溶液。

将配制的古龙酸标准品溶液、古龙酸甲酯标准品溶液、甲醇标准品溶液、乙醇标准品溶液、与配制的古龙酸甲酯固体稀释溶液分别进行液相色谱检测并得到相应色谱图。

根据对色谱图的定性、定量分析，确定古龙酸甲酯固体稀释溶液色谱图中14.2min峰的组分为古龙酸、18.7min峰的组分为古龙酸甲酯。各待检测峰之间的分离度均大于2.5。

根据稀释倍数和峰面积的情况，并通过外标法计算的古龙酸甲酯固体中待测组分的含量如下：

$=\frac{19682\×10.2}{40\×1823\×100.1}\×100\%=2.75\%$

$=\frac{548274\×10.1}{40\×1438\×100.1}\×100\%=96.18\%$

标注：

A供试品—为供试品（与待计算含量组分的标准品相同保留时间）的峰面积；

A古龙酸标准品—为古龙酸标准品的峰面积；

A古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的峰面积；

W古龙酸标准品—为古龙酸标准品的精确称样量，单位为mg；

W古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的精确称样量，单位为mg；

W供试品—为固体供试品的精确称样量，单位为mg。

实施例五

古龙酸超滤液的组分及含量的检测方法

仪器设备：Waters液相色谱仪，包括1525二元梯度泵、2414折光示差检测器、2707自动进样器、色谱柱HPX-87K（规格300×7.8mm）。工作站：Empower。

流动相：0.03mol/L稀硫酸水溶液；流速：0.6ml/min；柱温：40℃；进样量20μl。样品响应时间为40min。

固体标准品溶液的制备：分别精密称取古龙酸标准品10mg和古龙酸甲酯标准品10mg，使用流动相分别定量配制成浓度为0.05mg/ml的古龙酸溶液与浓度为0.05mg/ml的古龙酸甲酯溶液，使用0.22μm微孔滤膜过滤，得到浓度为0.05mg/ml古龙酸标准品溶液与0.05mg/ml古龙酸甲酯标准品溶液。

液体标准品溶液的制备：液体标准品稀释2500倍，步骤如下，准确吸取液体标准品1ml，使用流动相定容到50ml容量瓶a中，吸取1ml的容量瓶a中的液体，定容到50ml容量瓶b中，吸取容量瓶b中的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到液体标准品溶液。分别将液体标准品色谱甲醇和色谱乙醇按照上述步骤进行操作，得到甲醇标准品溶液和乙醇标准品溶液。

液体供试品溶液的制备：液体供试品稀释100倍，步骤如下，准确吸取0.5ml古龙酸甲醇洗液，使用流动相定容到50ml容量瓶中，吸取定容后的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到古龙酸超滤液稀释溶液。

将配制的甲醇标准品溶液、乙醇标准品溶液、古龙酸标准品溶液、古龙酸甲酯标准品溶液与配制的古龙酸超滤液稀释溶液分别进行液相色谱检测并得到相应色谱图。

根据对色谱图的定性、定量分析，确定古龙酸超滤液色谱图中9.3min峰的组分为古龙酸。

根据稀释倍数和峰面积的情况，并通过外标法计算的古龙酸超滤液中待测组分的含量如下：

标注：

A供试品—为供试品（与待计算含量组分的标准品相同保留时间）的峰面积；

A古龙酸标准品—为古龙酸标准品的峰面积；

W古龙酸标准品—为古龙酸标准品的精确称样量，单位为mg；

实施例六

古龙酸固体的组分及含量的检测方法

仪器设备：Waters液相色谱仪，包括1525二元梯度泵、2414折光示差检测器、2707自动进样器、色谱柱HPX-87H（规格300×7.8mm）。工作站：Empower。

流动相：0.08mol/L稀硫酸水溶液；流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样量5μl。样品响应时间为50min。

固体标准品溶液的制备：分别精密称取古龙酸标准品10mg和古龙酸甲酯标准品10mg，使用流动相分别定量配制成浓度为0.10mg/ml的古龙酸溶液与浓度为0.10mg/ml的古龙酸甲酯溶液，使用0.45μm微孔滤膜过滤，得到浓度为0.10mg/ml古龙酸标准品溶液与0.10mg/ml古龙酸甲酯标准品溶液。

液体标准品溶液的制备：液体标准品稀释200倍，步骤如下，准确吸取液体标准品1ml，使用流动相定容到50ml容量瓶a中，吸取2.5ml的容量瓶a中的液体，定容到10ml容量瓶b中，吸取容量瓶b中的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.45μm，得到液体标准品溶液。分别将液体标准品色谱甲醇和色谱乙醇按照上述步骤进行操作，得到甲醇标准品溶液和乙醇标准品溶液。

固体供试品溶液的制备：精密称取古龙酸固体100mg，使用流动相定容到100ml容量瓶中，使用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤，得到浓度为1mg/ml的古龙酸固体稀释溶液。

将配制的古龙酸标准品溶液、古龙酸甲酯标准品溶液、甲醇标准品溶液、乙醇标准品溶液与配制的古龙酸固体稀释溶液分别进行液相色谱检测并得到相应色谱图。

根据对色谱图的定性、定量分析，确定古龙酸固体色谱图中12.8min峰的组分为古龙酸、15.6min峰的组分为古龙酸甲酯、31.3min峰的组分为甲醇、33.8min峰的组分为乙醇。各待检测峰之间的分离度均大于2.9。

根据稀释倍数、比重和峰面积的情况，并通过外标法计算的古龙酸固体中待测组分的含量如下：

$=\frac{195\×10.4}{7190\×100.3}\×100\%=0.28\%$

$=\frac{1016\×0.793\×1000}{46301\×100.3\×2}\×100\%=8.67\%$

$=\frac{208\×0.8\×1000}{142820\×100.3\×2}\×100=0.58\%$

标注：

A供试品—为供试品（与待计算含量组分的标准品相同保留时间）的峰面积；

A古龙酸标准品—为古龙酸标准品的峰面积；

A古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的峰面积；

A甲醇标准品—为甲醇标准品的峰面积；

A乙醇标准品—为乙醇标准品的峰面积；

W古龙酸标准品—为古龙酸标准品的精确称样量，单位为mg；

W古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的精确称样量，单位为mg；

W供试品—为固体供试品的精确称样量，单位为mg。

实施例七

古龙酸母干固体的组分及含量的检测方法

仪器设备：Waters液相色谱仪，包括1525二元梯度泵、2414折光示差检测器、2707自动进样器、色谱柱HPX-87H（规格300×7.8mm）。工作站：Empower。

流动相：0.03mol/L稀磷酸水溶液；流速：0.6ml/min；柱温：60℃；进样量30μl。样品响应时间为50min。

固体标准品溶液的制备：分别精密称取古龙酸标准品10mg和古龙酸甲酯标准品10mg，使用流动相分别定量配制成浓度为0.02mg/ml的古龙酸溶液与浓度为0.02mg/ml的古龙酸甲酯溶液，使用0.22μm微孔滤膜过滤，得到浓度为0.02mg/ml古龙酸标准品溶液与0.02mg/ml古龙酸甲酯标准品溶液。

液体标准品溶液的制备：液体标准品稀释1000倍，步骤如下，准确吸取液体标准品1ml，使用流动相定容到100ml容量瓶a中，吸取1ml的容量瓶a中的液体，定容到10ml容量瓶b中，吸取容量瓶b中的液体，进行微孔滤膜过滤，孔径0.22μm，得到液体标准品溶液。分别将液体标准品色谱甲醇和色谱乙醇按照上述步骤进行操作，得到甲醇标准品溶液和乙醇标准品溶液。

固体供试品溶液的制备：精密称取古龙酸母干固体100mg，使用流动相定容到10ml容量瓶中，使用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，得到浓度为10mg/ml的古龙酸母干固体稀释溶液。

将配制的古龙酸标准品溶液、古龙酸甲酯标准品溶液、甲醇标准品溶液、乙醇标准品溶液与配制的古龙酸母干固体稀释溶液分别进行液相色谱检测并得到相应色谱图。

根据对色谱图的定性、定量分析，确定古龙酸母干固体色谱图中10.7min峰的组分为古龙酸、13.2min峰的组分为古龙酸甲酯、26.4min峰的组分为甲醇、29.5min峰的组分为乙醇。各待检测峰之间的分离度均大于1.5。

根据稀释倍数、比重和峰面积的情况，并通过外标法计算的古龙酸母干固体中待测组分与含量如下：

$=\frac{11305\×10.4}{8249\×100.1\×50}\×100\%=0.28\%$

$=\frac{72297\×0.793\×1000}{55549\×100.1\×100}\×100\%=10.31\%$

$=\frac{1931\×0.8\×1000}{171098\×100.1\×100}\×100\%=0.09\%$

标注：

A供试品—为供试品（与待计算含量组分的标准品相同保留时间）的峰面积；

A古龙酸标准品—为古龙酸标准品的峰面积；

A古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的峰面积；

A甲醇标准品—为甲醇标准品的峰面积；

A乙醇标准品—为乙醇标准品的峰面积；

W古龙酸标准品—为古龙酸标准品的精确称样量，单位为mg；

W古龙酸甲酯标准品—为古龙酸甲酯标准品的精确称样量，单位为mg；

W供试品—为固体供试品的精确称样量，单位为mg。

Claims (11)

1.一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)色谱条件

色谱柱为聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱，流动相为稀酸水溶液，流速为0.2-0.6ml/分钟，柱温25-85℃；检测器为示差折光检测器；

(2)标准品溶液的制备

精密称取适量标准品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到标准品溶液；

(3)供试品溶液的制备

精密称取适量供试品，使用流动相稀释成一定浓度后，过滤，得到供试品溶液；

(4)测定

将标准品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到标准品溶液色谱图与供试品溶液色谱图，根据标准品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量。

2.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱选自AminexHPX-87H、Aminex HPX-87C、Aminex HPX-87P、Aminex HPX-87N、Aminex HPX-87K、Aminex HPX-42A、Aminex HPX-42C中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的稀酸水溶液选自稀硫酸水溶液、稀磷酸水溶液中的一种，所述的稀酸水溶液的摩尔浓度为0.03-0.08mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的流速为0.4ml/分钟，所述的柱温为30-50℃。

5.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的柱温为40℃。

6.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的标准品分为固体标准品和液体标准品，所述的固体标准品为古龙酸和古龙酸甲酯，所述的液体标准品为甲醇和乙醇，所述的供试品分为固体供试品和液体供试品。

7.根据权利要求6所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的固体标准品配制浓度为0.005～0.10mg/ml，所述的液体标准品的配制需稀释50-2500倍，所述的固体供试品的配制浓度为1.0～10mg/ml，所述的液体供试品的配制需稀释10-100倍。

8.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的供试品为古龙酸超滤液、古龙酸交换液、古龙酸母液、古龙酸甲醇洗液、古龙酸固体、古龙酸母干固体、酯化液、古龙酸甲酯固体、维生素C母液、维生素C洗液、维生素C钠母液。

9.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的过滤为通过微孔滤膜进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

10.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述的将标准品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测的进样量为5-30μl。

11.根据权利要求1所述的一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法，其特征在于：所述的聚苯乙烯二乙烯苯树脂柱的规格为300×7.8mm。