CN105021740A

CN105021740A - N1,n1-二异丙基乙二胺的高效液相色谱分析方法

Info

Publication number: CN105021740A
Application number: CN201510499424.1A
Authority: CN
Inventors: 杜焕达; 周卫枫; 郑春燕
Original assignee: Hangzhou Xin Bosi Biological Medicine Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Xin Bosi Biological Medicine Co Ltd
Priority date: 2015-08-15
Filing date: 2015-08-15
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明涉及一种N₁,N₁-二异丙基乙二胺的高效液相色谱分析方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）配制不同浓度的N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，分别加入过量2，4-二硝基氟苯进行衍生化反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，以DNB-N₁,N₁-二异丙基乙二胺峰面积对应N₁,N₁-二异丙基乙二胺浓度绘制标准曲线；（2）将供试品配成溶液，加入过量2，4-二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，计算供试品中的N₁,N₁-二异丙基乙二胺含量。本发明方法准确、重现性好、灵敏度高，可用于盐酸阿考替胺及其片剂生产过程及放置过程中N₁,N₁-二异丙基乙二胺的检测，也可用于其他样品中N₁,N₁-二异丙基乙二胺的检测。

Description

N1,N1-二异丙基乙二胺的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明涉及一种N₁,N₁-二异丙基乙二胺的高效液相色谱分析方法。

技术背景

N₁,N₁-二异丙基乙二胺是一种比较重要的化工原料和优良的有机溶剂,也常用于有机合成，是合成盐酸阿考替胺(Acotiamide hydrochloride trihydrate)的重要中间体。

目前检测N₁,N₁-二异丙基乙二胺的分析方法有：酸碱滴定法、色谱法，由于N₁,N₁-二异丙基乙二胺是有机胺，采用酸直接滴定法可以测定N₁,N₁-二异丙基乙二胺的含量，但如果需要测定其他样品中N₁,N₁-二异丙基乙二胺的残留，该方法准确度和灵敏度比较差；由于N₁,N₁-二异丙基乙二胺的沸点较小，可以采用气相色谱法测定N₁,N₁-二异丙基乙二胺的残留，但样品中如果存在不溶性物质，会容易吸附样品，准确度比较差；N₁,N₁-二异丙基乙二胺本身无紫外吸收基团，无法采用常规的液相方法进行检测，如果选用示差检测器等不常规的检测器，方法重现性差。此外，目前还未有用液相分析的相关报道，使分析人员在方法的选择上也受到了一定的局限。

发明内容

本发明的目的在于弥补N₁,N₁-二异丙基乙二胺无紫外吸收基团，无法采用液相分析的缺陷，提供一种吸收干扰小、灵敏度高的N₁,N₁-二异丙基乙二胺液相分析方法。

为实现上述发明目的，本发明采用技术方案如下：

（1）N₁,N₁-二异丙基乙二胺液相分析方法，所述方法包括：（1）配制不同浓度的N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，分别加入过量2，4- 二硝基氟苯进行衍生化反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，以DNB- N₁,N₁-二异丙基乙二胺峰面积对应N₁,N₁-二异丙基乙二胺浓度绘制标准曲线；

（2）将供试品配成溶液，加入过量2，4- 二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，根据DNB-N₁,N₁-二异丙基乙二胺的峰面积和步骤（1）中的标准曲线计算供试品中的N₁,N₁-二异丙基乙二胺含量。进一步地，在测定供试品中N₁,N₁-二异丙基乙二胺含量之前还进行了定量限和检测限得确定，方法如下：取N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液适量，逐级稀释至限度溶液，加入过量2，4- 二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行液相色谱分析，考察DNB- N₁,N₁-二异丙基乙二胺峰的信噪比，确定定量限和检测限。

进一步地，为了验证分析方法的准确度，还进行了回收率的测定，方法如下：取适量供试品，加入不同浓度的N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，各自加入过量2，4- 二硝基氟苯于进行反应，反应结束后对反应液进行液相色谱分析，计算N₁,N₁-二异丙基乙二胺的回收率。

本发明对N₁,N₁-二异丙基乙二胺进行衍生化，在其氨基上引入二硝基苯基团增加吸收波长，其反应原理如下式所示：

进一步地，所述高效液相色谱条件为：

色谱柱： C18柱，规格为 4.6×150mm，5.0μm；

检测波长：360nm；

柱温：35~45℃；

流速：0.8~1.2 ml/min；

进样量：10~20μl；

流动相：乙腈-0.05mol/L醋酸钠溶液，其中乙腈与0.05mol/L醋酸钠溶液的比例为60:40~70:30。

进一步地，所述衍生化反应的温度为45℃~55℃，反应时间为20~40分钟，pH值为8~9。

进一步地，所述供试品为阿考替胺、盐酸阿考替胺或盐酸阿考替胺片剂。

进一步地，所述流动相中的0.05mol/L醋酸钠溶液与乙腈混合之前，先用稀醋酸调节pH至6.4。

进一步地，所加入的2，4- 二硝基氟苯为1%~2%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液；衍生化反应具体步骤为：取1ml 样品溶液、置5ml棕色量瓶中，加入1~2ml 0.04 ~0.06 mol/L碳酸钠溶液和0.8~1.2ml 1%~2%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液，于45℃~55℃下反应20~40分钟，反应结束后，冷却，用乙腈-水（体积比为50：50）定容到刻度，摇匀。

本方法的有益效果主要体现在：本发明方法准确、重现性好、灵敏度高，可用于盐酸阿考替胺及其片剂生产过程及放置过程中N1,N1-二异丙基乙二胺的检测，也可用于其他样品中N₁,N₁-二异丙基乙二胺的检测。

附图说明

图1：N₁,N₁-二异丙基乙二胺的标准曲线图。

图2：衍生化后得到的DNB- N₁,N₁-二异丙基乙二胺与衍生化试剂的色谱峰。

图3：N₁,N₁-二异丙基乙二胺的检测限HPLC图。

图4：N₁,N₁-二异丙基乙二胺的定量限HPLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

1、衍生化试剂和稀释剂的配置：

衍生化试剂：取1ml 2，4- 二硝基氟苯溶于乙腈中配成100ml的溶液，即浓度为1%的乙腈-水溶液；

稀释剂：乙腈与水按50:50的体积比混合。

2、衍生化反应：

取1ml 样品溶液、置5ml棕色量瓶中，加入2ml 0.05mol/L碳酸钠溶液和1ml衍生化试剂（1%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液），于50℃下反应30分钟，反应结束后，冷却，用稀释剂（体积比50:50的乙腈-水溶液）定容到刻度，摇匀。

3、色谱条件：

色谱柱：Agilent SB-C18 (4.6*150mm，5.0μm)

检测波长：360nm

柱温：40℃

流速：1.0ml/min

进样量：10μl

流动相：乙腈-0.05mol/L醋酸钠溶液（体积比65:35），其中0.05mol/L醋酸钠溶液先用稀醋酸调节pH至6.4再与已经混合。

4、本发明的仪器设备：

安捷伦1260液相色谱仪及配置的G1314F紫外检测器以及分析仪器配置的HPLC色谱工作站。

5、本发明的原材料规格如下：

乙腈（色谱级）；

乙酸、乙酸钠、碳酸钠、2，4- 二硝基氟苯（分析级）。

实施例1：N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准曲线绘制

取N₁,N₁-二异丙基乙二胺约20mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为N1,N1-二异丙基乙二胺标准贮备液；分别精密量取上述标准贮备溶液适量，用上述稀释剂定量稀释制成每1ml中约含0.4μg、0.8μg、4μg、8μg、12μg的线性溶液；

量取上述线性溶液各1ml，分别置5ml量瓶中，加0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，加衍生化试剂1ml，置于50oC水浴中衍生30分钟，冷却，再用稀释剂稀释至刻度。精密量取衍生化后的线性溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以DNB- N1,N1-二异丙基乙二胺峰面积为自变量，以N1,N1-二异丙基乙二胺浓度为应变量，得到标准曲线图如图1所示，其线性相关系数r为0.9995，其色谱图如图2所示。

实施例2：N₁,N₁-二异丙基乙二胺检测限和定量限检测的确定。

取N₁,N₁-二异丙基乙二胺约20mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为N₁,N₁-二异丙基乙二胺限度贮备液；在量取上述限度贮备液，用稀释剂逐级稀释，得限度溶液，量取上述限度溶液各1ml，分别置5ml量瓶中，加0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，加衍生化试剂2,4-二硝基氟苯乙腈溶液（1%，V/V）1ml，置于50oC水浴中衍生30分钟，冷却，再用稀释剂稀释至刻度。精密量取衍生化后的限度溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。测得N1,N1-二异丙基乙二胺检测限浓度为0.16μg/ml，见图3所示，N1,N1-二异丙基乙二胺定量限浓度为0.4μg/ml，见图4所示。

实施例3：N₁,N₁-二异丙基乙二胺回收率的测定

取N₁,N₁-二异丙基乙二胺约20mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液。

取适量供试品（相当于16mg盐酸阿考替胺），精密称定，分别置10个20ml量瓶中，加稀释剂溶解，其中3个加入1ml N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，其中3个加入2ml N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，其中3个加入4ml N1,N1-二异丙基乙二胺标准溶液，最后1个不加N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，后用稀释剂定容至刻度，摇匀。取上述溶液及对照各1ml，至5ml量瓶中，加1ml 1%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液、2ml 0.05mol/L的碳酸钠溶液，于50℃水浴中衍生30分钟，反应结束后，冷却，用稀释剂定容到刻度，摇匀；另取N₁,N₁-二异丙基乙二胺适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含0.008mg的溶液，精密量取1ml置5ml量瓶中，加0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，加衍生化试剂2,4-二硝基氟苯乙腈溶液（1%，V/V）1ml，置于50oC水浴中衍生30分钟，冷却，用上述稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。进行液相色谱分析，计算N₁,N₁-二异丙基乙二胺的回收率。计算得出的平均回收率为100.4%，具体结果见表1。

表1 ：N₁,N₁-二异丙基乙二胺回收率的测定结果

实施例4：盐酸阿考替胺中N₁,N₁-二异丙基乙二胺的检测

取盐酸阿考替胺20mg，至25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml置5ml量瓶中，加0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，加衍生化试剂2,4-二硝基氟苯乙腈溶液（1%，V/V）1ml，置于50oC水浴中衍生30分钟，冷却，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取N₁,N₁-二异丙基乙二胺适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含0.008mg的溶液，精密量取1ml置5ml量瓶中，加0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，加衍生化试剂2,4-二硝基氟苯乙腈溶液（1%，V/V）1ml，置于50oC水浴中衍生30分钟，冷却，用上述稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。再精密量取取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。在盐酸阿考替胺中未检出N₁,N₁-二异丙基乙二胺。

实施例5：盐酸阿考替胺片中N₁,N₁-二异丙基乙二胺的检测

与实施例4的不同之处在于对样品的前处理方法。盐酸阿考替胺片的前处理方法如下：取盐酸阿考替胺片细粉50mg（约相当于盐酸阿考替胺20mg），至25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；取适量用针头过滤器过滤，精密量取1ml续滤液置5ml量瓶中，加0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，加衍生化试剂2,4-二硝基氟苯乙腈溶液（1%，V/V）1ml，置于50oC水浴中衍生30分钟，冷却，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用针头过滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液。后续方法与实施例4中从“另取N₁,N₁-二异丙基乙二胺适量”到“记录色谱图”所述方法相同。在盐酸阿考替胺片中未检出N₁,N₁-二异丙基乙二胺。

实施例6：阿考替胺碱基中N₁,N₁-二异丙基乙二胺的检测

方法与实施例4相同，仅在于样品不同。测得N₁,N₁-二异丙基乙二胺的量为0.05%，同时也进行了回收率的测定，所得回收率为99.0%。

Claims

1.一种N₁,N₁-二异丙基乙二胺的高效液相色谱分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）配制不同浓度的N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，分别加入过量2，4-二硝基氟苯进行衍生化反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，以DNB- N₁,N₁-二异丙基乙二胺峰面积对应N₁,N₁-二异丙基乙二胺浓度绘制标准曲线；

（2）将供试品配成溶液，加入过量2，4-二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，根据DNB-N₁,N₁-二异丙基乙二胺的峰面积和步骤（1）中的标准曲线计算供试品中的N₁,N₁-二异丙基乙二胺含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还包括定量限和检测限的确定，其方法为：取N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液适量，逐级稀释至限度溶液，加入过量的2，4-二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，考察DNB- N₁,N₁-二异丙基乙二胺峰的信噪比，确定定量限和检测限。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还包括N₁,N₁-二异丙基乙二胺回收率的测定，其方法为：取适量供试品，加入不同浓度的N₁,N₁-二异丙基乙二胺标准溶液，分别加入过量2，4-二硝基氟苯进行反应，反应结束后对反应液进行高效液相色谱分析，计算N₁,N₁-二异丙基乙二胺的回收率。

4.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于：高效液相色谱条件为：

色谱柱： C18柱，规格为 4.6×150mm，5.0μm；

检测波长：360nm；

柱温：35～45℃；

流速：0.8～1.2 ml/min；

进样量：10～20μl；

流动相：乙腈-0.05mol/L醋酸钠溶液。

5.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于：所述衍生化反应的温度为45℃～55℃，反应时间为20～40分钟，pH值为8～9。

6.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于：所述供试品为阿考替胺、盐酸阿考替胺或盐酸阿考替胺片剂。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述流动相中的0.05mol/L醋酸钠溶液与乙腈混合之前，先用稀醋酸调节pH至6.4。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：乙腈与0.05mol/L醋酸钠溶液的体积比为60:40～70:30。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所加入的2，4-二硝基氟苯为1%～2%的2，4- 二硝基氟苯乙腈溶液；衍生化反应具体步骤为：取1ml 样品溶液、置5ml棕色量瓶中，加入1～2ml 0.04 ～0.06 mol/L碳酸钠溶液和0.8～1.2ml 1%～2%的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液，于45℃～55℃下反应20～40分钟，反应结束后，冷却，用乙腈-水（体积比为50：50）定容到刻度，摇匀。